ES2617258T3 - Preparación de muestras genéricas - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para aislar y determinar, de una forma simultánea, la presencia, la no presencia y / o la cantidad, de por lo menos un primer y un segundo ácido nucleico diana, seleccionado de entre bacterias, virus DNA y virus RNA, procedentes de una pluralidad de diferentes tipos de muestras de fluidos, comprendiendo, el citado procedimiento, las etapas automatizadas de a. añadir un tampón de lisis idéntico, el cual tiene un valor pH comprendido entre 5,5 y 6,5, y el cual comprende un agente caotrópico, una substancia tampón, un alcohol, y un agente reductor, a los miembros de dicha pluralidad de diferentes tipos de muestras de fluidos, y así, de este modo, liberar muestras de ácido nucleico, a partir del entorno medioambiental celular y / o vírico, mediante el lisado de cápsidas víricas, potencialmente presentes en una pluralidad de diferentes tipos de muestras de fluido, y combinar conjuntamente, partículas magnéticas y la citada pluralidad de diferentes tipos de muestras de fluido, en un gran número de recipientes, correspondientes al número de muestras de fluido, durante un período de tiempo, y bajo unas condiciones suficientes, como para permitir que, los ácidos nucleicos los cuales comprenden los ácidos nucleicos diana, se inmovilicen, en las partículas magnéticas. b. aislar las partículas magnéticas, del otro material presente en las muestras de fluido, en una estación de separación, la cual comprende uno o más imanes, c. purificar los ácidos nucleicos, en una estación de separación, mediante la separación de la muestra de fluido, de las partículas magnéticas, y lavar las partículas magnéticas, una o más veces, con un tampón de lavado, mediante la aspiración y la dispensación de la suspensión, la cal comprende el tampón de lavado y las partículas magnéticas, una o más veces, mediante la utilización de una pipeta, d. eluir los ácidos nucleicos procedentes de la partículas magnéticas, mediante un tampón de elución, e. transferir los ácidos nucleicos purificados y, opcionalmente, las citadas partículas magnéticas, a una pluralidad de recipientes de reacción, f. amplificar los ácidos nucleicos diana, en donde, las condiciones físicas y el citado período de tiempo, son idénticos, para los miembros de la citada pluralidad de diferentes tipos de muestras de fluido, y en donde, el primer y / o el segundo ácido nucleico, es un ácido nucleico bacteriano. De una forma especial, pero no únicamente para laboratorios clínicos, con un alto flujo de muestras, es altamente favorable el que éstos se encuentren provistos de un procedimiento mejorado de este tipo, para un rápido, fácil y fidedigno aislamiento simultáneo, de múltiples ácidos nucleicos diana, a partir de una pluralidad de diferentes tipos de muestras de fluido.

Description

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El término “material de soporte sólido”, tal y como éste se utiliza, aquí, en este documento de solicitud de patente, comprende cualesquiera de los materiales sólidos, los cuales se han mencionado anteriormente, arriba, conjuntamente con la inmovilización de ácidos nucleicos, tales como, por ejemplo, las partículas de vidrio

5 magnéticas, la fibras de vidrio, los filtros de fibras de vidrio, el papel de filtro, etc., mientras que, el material de soporte, sólido, no se encuentra limitado a estos materiales.

El material de soporte sólido, comprende partículas de unión al ácido nucleico, de una forma preferible, uno o más de los materiales seleccionados de entre la sílice, el metal, los óxidos metálicos, el plástico, los polímeros, y los

10 ácidos nucleicos. En una forma de presentación muy preferida de la presente invención, el material de soporte sólido, es el consistente en partículas de vidrio magnéticas.

“Inmovilizar”, en el contexto de la presente invención, significa capturar objetos, tales como, por ejemplo ácidos nucleicos, de una forma reversible o de una forma irreversible. De una forma particular, “inmovilizad sobre el material 15 de soporte sólido”, significa el hecho consistente en que, el objeto o los objetos de la presente invención, se encuentran asociados con el material de soporte sólido, para el propósito de su separación, de cualquier medio circundante, y que puede(n) recuperarse, por ejemplo, mediante la separación del material de soporte sólido, en un punto ulterior. En este contexto, “inmovilización”, puede comprender, por ejemplo, la adsorción de ácidos nucleicos, en vidrio, u otras superficies apropiadas de materiales sólidos, de la forma la cual se describe anteriormente, arriba,

20 en este documento de solicitud de patente. De una forma adicional, los ácidos nucleicos, pueden “inmovilizarse”, de una forma específica, mediante el enlace o unión a sondas de captura., en donde, los ácidos nucleicos, se unen a ácidos nucleicos esencialmente complementarios, unidos a un soporte sólido, mediante apareamiento de bases. En el último caso, tal tipo de inmovilización específica, conduce a una unión predominante de ácidos nucleicos objetivizados como diana.

25 “Simultáneamente” (o “de una forma simultánea”), en el sentido de la presente invención, significa el hecho de que, dos acciones, tales como las consistente en amplificar un primer, un segundo, o más ácidos nucleicos, se llevan a cabo al mismo tiempo, y bajo las mismas condiciones físicas. En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, la amplificación simultánea de por lo menos un primer y un segundo ácidos nucleicos diana, se

30 realiza en un recipiente. En otra forma de presentación, en concordancia con la presente invención, la amplificación simultánea, se lleva a cabo con por lo menos un ácido nucleico, en un recipiente, y por lo menos un segundo ácido nucleico, en un segundo recipiente, al mismo tiempo, y bajo las mismas condiciones físicas, de una forma particular, con respecto a la temperatura y al tiempo de incubación.

35 El “primer ácido nucleico diana” y el “segundo ácido nucleico diana”, son ácidos nucleicos diferentes.

Una “muestra de fluido”, es cualquier material fluido, el cual pueda someterse a ensayos de diagnóstico que objetivicen ácidos nucleicos como diana, y que se derive, de una forma preferente, de una fuente biológica. Así mismo, también, de una forma preferible, la citada muestra de fluido, se deriva de un humano, y ésta es un líquido

40 corporal. En una forma preferida de presentación de la presente invención, la muestra de fluido, es la consistente en la sangre humana, en la orina, en el esputo, en la sudoración, en las muestras de hisopados, en las heces pipeteables, o en el fluido espinal. De la forma mayormente preferible, la muestra de fluido, es la sangre humana.

El término “recipiente de reacción”, tal y como éste se utiliza aquí, en este documento de solicitud de patente,

45 comprende, si bien no de una forma limitativa en cuanto a éstos, a los tubos, o los pozos de placas, tales como las consistentes en las placas de micropozos, de pozos hondos, u otros tipos de placas de múltiples pozos, en los cuales tiene lugar una reacción, para el análisis de la muestras de fluido, tales como las consistentes en, por ejemplo, la transcripción inversa, o la reacción en cadena de la polimerasa. Los límites exteriores o paredes de tales tipos de recipientes, son químicamente inertes, de tal forma que, éstos, no interfieren con la reacción analítica la cual

50 tiene lugar en su interior. De una forma preferible, el aislamiento de los ácidos nucleicos, tal y como éste se describe anteriormente, arriba, se lleva también a cabo, en una placa de múltiples placas.

En este contexto, las placas de múltiples pozos, en sistemas analíticos, permiten la separación paralela y análisis o almacenaje de múltiples muestras. Las placas múltiples, pueden optimizarse para una captura máxima de líquido, o

55 para una transferencia de calor máxima. Una placa de múltiples pozos preferida, para su uso en el contexto de la presente invención, se optimiza, para incubar o separar un analito, en un analizador automático. De una forma preferible, la placa de múltiples pozos, se construye y se organiza en un orden de disposición, para contactar con un dispositivo magnético y / un dispositivo de calentamiento.

60 La citada placa de múltiples pozos preferida, a la cual se la denomina, de una forma intercambiable, como “placa de procesado”, en el contexto de la presente invención, comprende:

-una superficie superior, la cual comprende múltiples pozos, con aperturas, en la parte superior, organizadas en un orden de disposición consistente en filas. 65 9

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forma preferible, la placa de procesado (101). A este modelo patrón único, se le hace así mismo, referencia, también, aquí, en este documento de solicitud de patente, como “geometría de superficie” única. Los identificadores de “hardware” informático”, (102) y (115), aseguran el hecho de que, el usuario, pueda únicamente cargar la placa de procesado (101), en la apropiada posición apiladora, de un instrumento analítico, en la orientación apropiada. En

5 los lados de la placa de procesado (101), se encuentran comprendidos elementos de guiado (116, 117), (Fig. 3, Fig 4). Éstos previenen o evitan la inclinación de la placa de procesado (101). Los elementos de guiado (116, 117), permiten, al usuario, el cargar las placas de procesado (101), con elementos de guiado (116, 117), como un apilado, en, en un instrumento analítico, el cual, subsiguientemente, se transfiere verticalmente, en el interior de una apiladora, sin inclinar o ladear las placas.

La parte central (120) de los recipientes (103), tiene una sección transversal, la cual tiene una forma casi rectangular (Fig. 6, Fig. 7) . Éstas se encuentran separadas, a lo largo del lado más largo (118), de la forma casi rectangular, mediante una pared común (113) (Fig. 3). La fila de recipientes (103), formada de este modo, tiene la ventaja consistente de que, a pesar el limitado espacio disponible, éstos tienen un mayor volumen, siendo éste, de una

15 forma preferible, de 4 ml. Otra ventaja de esta configuración, es la consistente en que, debido al hecho del espesor esencialmente constante, la producción, es muy económica. Una ventaja adicional de esta configuración, resido en el hecho de que, los recipientes (103), se refuerzan y fortalecen, conjuntamente, entre ellos y, así, de este modo, puede obtenerse una alta estabilidad de la forma.

Entre las filas de recipientes (103), se encuentra localizado un espacio continuo (121), (Fig. 6, Fig. 7). El espacio

(121) en cuestión, puede acomodar imanes (202, 203), o dispositivos de calentamiento (128), (Fig. 11). Estos imanes (202, 203), y dispositivos de calentamiento (128), de una forma preferible, son dispositivos sólidos. Así, es de este modo, las partículas magnéticas (216), las cuales se encuentran comprendidas en líquidos (215), y la cuales pueden encontrarse sostenidas en los recipientes (103), pueden separarse del líquido (215), ejerciendo una campo

25 magnético sobre los recipientes (103), cuando los imanes (202, 203), en cuestión, se llevan a las proximidades de los recipientes (103). Así, de este modo, los contenidos de los recipientes (103), pueden incubarse a una temperatura elevada, y controlada, cuando la placa de procesado (101), se emplaza sobre el dispositivo de calentamiento (128). Puesto que, los imanes (202, 203), o los dispositivos de calentamiento (128), pueden ser sólidos, puede alcanzarse una alta densidad de energía. La forma casi rectangular de la parte central (120), de los recipientes (103), (Fig. 10), optimiza así mismo, también, el contacto entre la pared del recipiente (109) y el imán de forma plana (202) del dispositivo de calentamiento (128), mediante la optimización de la superficie de contacto entre el recipiente (103), y el imán (202), o el dispositivo de calentamiento (128), y así, de este modo, mejora e intensifica la transferencia de energía al interior del recipiente.

35 En el área del fondo cónico (111) de los recipientes, el espacio (121), es incluso más pronunciado, y ése puede acomodar imanes adicionales (203). La combinación de los imanes grandes (202) y el área superior de los imanes más pequeños (203), en el área cónica de los recipientes, permite la separación de las partículas magnéticas (216), en volúmenes pequeños o en volúmenes más grandes de líquido (215). Los imanes pequeños (203), posibilitan así, de este modo, el hecho de que sea más fácil, el secuestrar las partículas magnéticas (216), durante el pipeteado del eluido. Esto hace posible el pipetear el eluido, con una mínima pérdida, mediante la reducción del volumen muerto del gránulo de partículas magnéticas (216). De una forma adicional, se minimiza la presencia de partículas magnéticas (216), en el eluido transferido.

En el extremo superior de los recipientes (103), una de las paredes laterales más cortas (109) del recipiente (103),

45 comprende un canal de salida del reactivo (105), el cual se extiende a la nervadura circunferencial (104) (Figuras 3, 4, 7). Los reactivos, se pipetean en canal de entrada de reactivos, (105), y se drenan hacia fuera del canal (105), haca el interior del recipiente (103). Así, de este modo, se previene o evita el contacto entre la aguja o punta de la pipeta, (3, 4), y el líquido contenido en el recipiente. De una forma adicional, se previenen y evitan las salpicaduras resultantes del hecho consistente en que, el líquido, se dispense directamente al interior de otro líquido (215) contenido en los recipientes (103, el cual podría provocar la contaminación de la aguja o punta de pipeta (3, 4), o de los recipientes vecinos (103). El pipeteado secuencial al interior del canal de entrada del reactivo, (105), de pequeñas cantidades de reactivos, seguido del mayor volumen de otro reactivo, asegura el hecho de que, los reactivos, los cuales se añaden únicamente en pequeñas cantidades, se drenen completamente al interior dl recipiente (103). Así, de este modo, el pipeteado de pequeños volúmenes de reactivos, es posible, sin pérdidas de

55 precisión o de fiabilidad del test de ensayo a realizar.

En el interior, sobre el fondo de los recipientes (111, 112), la forma se convierte en cónica (111), y finaliza con un fondo esférico (112) (Fig. 6, Fig. 7). La forma del interior del recipiente, (114), incluyen la parte central particular, (120), es redondeada. La combinación del fondo esférico (112), de la forma interior redondeada (114), de la parte cónica (111), y de la superficie refinada de los recipientes (103), conduce a fluídicos, lo cual facilita una separación y purificación efectiva de los analitos, en la placa de procesado (101). El fondo esférico (112), permite un uso esencialmente completo del eluido separado y de una reducción del volumen muerto, los cual reduce el remanente por arrastre de los reactivos, o una contaminación cruzada de las muestras.

65 El ribete o borde, sobre la base (129) del placa de precipitado (101), comprende cavidades (107), para el engrane

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Los primeros imanes, de una forma preferible, se encuentran construidos y ordenadamente dispuestos, para interactuar con los recipientes de una placa de múltiples pozos, para ejercer un campo magnético, sobre un amplio volumen de líquido, imanes éstos, los cuales comprenden partículas magnéticas, sostenidas en los citados

5 recipientes. Los citados segundos imanes, se encuentran construidos y ordenadamente dispuestos, de una forma preferible, para interactuar con los recipientes de una placa de múltiples pozos, para ejercer un campo magnético, sobre un pequeño volumen de líquido, los cuales comprenden partículas magnéticas sostenidas los citados recipientes. Los citados primer y segundo imanes, pueden moverse, a diferentes posiciones Z.

Es de utilidad, en el contexto de la presente invención, y de la citada estación de separación, de una forma adicional, un procedimiento para la purificación del ácido nucleico. El procedimiento, comprende las etapas de unir un ácido nucleico, a partículas magnéticas, en un recipiente de múltiples pozos. El recipiente, comprende una apertura superior, una parte central y una parte del fondo. El material enlazado o unido, se separa, a continuación, del material no enlazado o unido, contenido en un líquido, cuando la parte mayor del líquido, se encuentra localizada por

15 encima de la sección, en donde, la parte cónica del recipiente, se reemplaza por la parte central, con la forma rectangular, procediendo a mover un imán, desde una segunda posición, a una primera posición y, en la citada primera posición, aplicando un campo magnético, a la parte central y, de una forma adicional, aplicando un campo magnético, a la parte del fondo del citado recipiente. Las partículas magnéticas, pueden lavarse, de una forma opcional, con una solución de lavado. Un pequeño volumen de líquido, en donde, la mayor parte del líquido, se encuentra localizado por debajo de la sección, en donde, la parte cónica del recipiente, se encuentra reemplazada por la parte central, con la forma rectangular, se separa de las citadas partículas magnéticas, procediendo a aplicar, selectivamente, un campo magnético, a la parte del fondo del citado recipiente.

Es también de utilidad, en el contexto de la presente invención, así mismo, una estación de separación magnética,

25 para separar el ácido nucleico unido a las partículas magnéticas, comprendiendo, la citada estación de separación, unos primeros imanes, los cuales se encuentran construidos y ordenadamente dispuestos, para interactuar con los recipientes de una placa de múltiples pozos, para ejercer un campo magnético, sobre un amplio volumen de líquido, que comprenden partículas magnéticas, sostenidas en los citados recipientes, y unos segundos imanes, construidos y ordenadamente dispuestos, para interactuar con recipientes de una placa de múltiples pozos, para ejercer un campo magnético, sobre un pequeño volumen de líquido, que comprenden partículas magnéticas, sostenidas en los citados recipientes, y en donde, los citados primeros y segundos imanes, pueden moverse a diferentes posiciones Z. Las formas preferidas de presentación, en concordancia con la presente invención, de la estación de separación magnética, se describen abajo, a continuación.

35 Una primera forma de presentación, en concordancia con la presente invención, de una estación de separación, (201), de utilidad en la presente invención, es la que se describe abajo, a continuación. La primera forma de presentación, en concordancia con la presente invención, de la estación de separación (201), comprende por lo menos dos tipos de imanes (202, 203). El primer tipo de imán, largo, (202), se encuentra construido y ordenadamente dispuesto, para encajar en el interior del espacio (121) de la placa de procesado (101). El imán (202), ejerce así, de este modo, un campo magnético, sobre el líquido (215), en el recipiente (103), para secuestrar las partículas magnéticas (216), en el interior de la pared del recipiente. Esto permite la separación de las partículas magnéticas (216), en cualquier material unido a éstas y al líquido (215), en el interior del recipiente (103), cuando se encuentra presenta un gran volumen de líquido (215). El imán (202), tiene una estructura alargada, y éste se encuentra construido y ordenadamente dispuesto, para interactuar con la parte central, esencialmente rectangular

45 (120), del recipiente. Así, de este modo, el imán (202), se utiliza, cuando la mayor parte del líquido (215), se encuentra localizada por encima de la sección, en donde, la parte cónica (111) del recipiente (103), se encuentra reemplazada por la parte central (120), con una forma rectangular. Tal y como se muestra en la figura 40, la construcción preferida de los imanes (202), comprende elementos o accesorios (204, 204 a), los cuales comprenden imanes (202), los cuales encajan en el espacio (121), entre las filas de recipientes (103), en la placa de procesado (101). Otra forma de presentación, en concordancia con la presente invención, de los imanes (202), comprende imanes (202), ordenadamente dispuestos en elementos o accesorios (204, 204 a). Los imanes (203) de la estación de separación preferida, (201), son más pequeños, y éstos pueden interactuar con la parte cónica (111) del recipiente (103). Esta configuración, se muestra en la figura 10. Los imanes (203), se encuentran ordenadamente dispuestos, sobre una base (205), la cual puede moverse al interior del espacio (121) de la placa de procesado

55 (101). Cada imán, (202, 203), se encuentra construido, de una forma preferible, para interactuar con dos recipientes (103), en dos filas contiguas. En una forma preferida de presentación, en concordancia con la presente invención, la placa de procesado (101), tiene 6 filas de 8 recipientes (103). Una estación de separación (201), la cual puede interactuar con la placa preferida de procesado (101), tiene dos elementos o accesorios (204, 204 a), los cuales comprenden imanes (202) y cuatro bases (205), que comprenden imanes (203). Se encuentra también incluida, una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, en donde, la estación de separación, tiene cuatro elementos de accesorios magnéticos (204, 204 a), que comprende imanes (202) y tres bases magnéticas (205), las cuales comprenden imanes (203).

Los imanes (202, 203), son móviles. La estación de separación (201), comprende un mecanismo para mover los 65 elementos o accesorios (204, 204 a), y la bases (205). La totalidad de los elementos o accesorios (204, 204 a), se

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encuentran interconectados mediante una base (217), y así, de este modo, éstos se mueven de una forma coordinada. La totalidad de los imanes (203), se encuentran unidos a una base (218), de tal forma que, y así, de este modo, se muevan de una forma coordinada. El mecanismo para mover las placas magnéticas (202) y (203), se encuentra construida y ordenadamente dispuesta, para mover los dos tipos de placas magnéticas (202, 203) a un

5 total de cuatro posiciones finales.

En las figuras 40 a – c, los imanes (203), se encuentran localizados en las proximidades de la parte cónica de los recipientes (103), de la placa de procesado (101). Esta es la posición más superior (superior extrema) de los imanes (203), y es la posición de separación. En esa figura, los imanes (202), se encuentran localizados en la posición superior. Éstos no se encuentran involucrados en la separación, cuando éstos se encuentran en esta posición.

En la forma preferida de presentación, en concordancia con la presente invención, la cual se muestra en la figura 10, la base (217) de los imanes (202), se encuentra conectada a una de posicionamiento (206). La base (217), comprende un extremo del fondo (207), el cual es flexible, el cual se encuentra en contacto con elemento de 15 conexión (208), mediante un elemento móvil (209). Tal tipo de elemento móvil, se encuentra construido y ordenadamente dispuesto, para mover el elemento de conexión (208), a lo largo de un raíl (212), desde un lado hasta el otro lado. El citado elemento móvil (209), se encuentra fijado al elemento de conexión (208), mediante un perno o clavija (220). El citado elemento de conexión (208), se encuentra conectado, así mismo, también, a un eje (211). Tal tipo de elemento de conexión (208), de una forma preferible, es una etapa rectangular. Cuando la rueda de posicionamiento (206), se mueve excéntricamente, alrededor del eje (211), de tal forma que, el husillo helicoidal (210), se mueve desde un punto por encima del eje excéntrico, a un punto situado por debajo del eje excéntrico, entonces, el elemento móvil (209) y el final del fondo (207) de la base (204), con los imanes (202), unidos a éstos, se mueven entonces, desde la posición más superior, a la posición más inferior. La base (218), se encuentra montada sobre la parte del fondo (219), y su extremo inferior, con el perno (213), a un elemento de móvil (214), el cual, de 25 una forma preferible, se trata de una rueda o volante, la cual interactúa con la rueda de posicionamiento (206). Cuando la rueda de posicionamiento (206), gira alrededor del eje (211), entonces, la rueda (214), se mueve a lo largo de la rueda de posicionamiento (206). Si la rueda (214), se encuentra localizada en una sección de la rueda de posicionamiento (206), en donde la distancia, desde el eje (211), es corta, entonces, los imanes (203), se encuentran en su posición más inferior (posición inferior extrema). Cuando la rueda (214), se encuentra localizada (ubicada), en una sección de la rueda de posicionamiento (206), en donde, la distancia desde el eje (211), se encuentra en un máximo, entonces, los imanes (203), se encuentran en su posición más superior (posición superior extrema). Así, de este modo, en una forma preferida de presentación de la primera forma de presentación, en concordancia con la presente invención, de la estación de separación, los imanes de localización o ubicación (203), se controlan mediante la forma de la rueda o volante de posicionamiento (206). Cuando el elemento móvil (209), se

35 mueve a lo largo de la parte central, redondeada, superior o inferior (212 a), del raíl (212), entonces, el tipo pequeño de imanes (203), se mueven hacia arriba y hacia abajo. Cuando el elemento móvil (209), se encuentra localizado en el lado (212 b) del extremo del fondo (207), y éste se mueve hacia arriba o hacia abajo, entonces, los imanes (202), se mueven en dirección hacia arriba, o en dirección hacia abajo. La rueda de posicionamiento, puede hacerse girar, en sentido rotativo, mediante cualquier tipo de motor (224).

En una forma preferida de presentación, en concordancia con la presente invención, un resorte (225), se encuentra unido a la base (222), de la estación de separación y la base (218) de los imanes (203), para asegurar el hecho consistente en que, los imanes (203), se muevan a la posición más inferior, cuando éstos se mueven en dirección descendente.

45 El término “perno”, tal y como éste se utiliza aquí, en este documento de solicitud de patente, se refiere a cualquier elemento de fijación, incluyendo a los tornillo o pernos.

En una segunda forma de presentación, en concordancia con la presente invención, la estación de separación (230), comprende por lo menos un elemento o accesorio (231), el cual comprende por lo menos un imán (232), comprendiendo ésta, de una forma preferible, un número de imanes, el cual es igual al número de recipientes (103), en una fila (123). De una forma preferible, la estación de separación (230), comprende un número de elemento o accesorios (231), igual al número de filas (123) de la placa de múltiples pozos (101), la cual se ha descrito anteriormente, arriba, en este documento de solicitud de patente. De una forma más preferible, se encuentran

55 montados seis elementos o accesorios (231), en la estación de separación (230). Se encuentra montado por lo menos un imán (232), en un elemento o accesorio (231). De una forma preferible, el número de imanes (232), es igual al número de recipientes (103), en una fila (123). De la forma mayormente preferible, se encuentran montados ocho imanes (232), en un elemento o accesorio (231). De una forma preferible, se encuentra comprendido un tipo de imán (232), en el citado elemento o accesorio (231). De una forma más preferible, el imán (232), se encuentra montado en un lado orientado hacia los recipientes, con los cuales actúa el imán en cuestión.

El elemento o accesorio (231), se encuentra montado sobre una base (233). De una forma preferible, dicho montaje

o montura, es flexible. La base (233), comprende resortes (234), montados sobre ésta. El número de resortes (234),

es el correspondiente a por lo menos un resorte por elemento o accesorio (231), montados sobre la citada base 65 (233). La base en cuestión, comprende, de una forma adicional, un bisel o chaflán (236), el cual limita el movimiento

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del muelle y, por consiguiente, el elemento a accesorio (231), comprende los imanes (232). De una forma preferible, uno cualquiera de los citados resortes 234), se encuentra construido y ordenadamente dispuesto, para interactuar con el elemento o accesorio (231). De una forma preferible, el citado resorte (234), es un resorte de estribos o yugos. Dicha interacción, controla el movimiento de interacción de los elementos o accesorios (231). De una forma

5 adicional, la estación de separación (230), comprende un bastidor (235). La base (233) con los elementos o accesorios (231), se encuentra conectada al bastidor (235), mediante un mecanismo móvil, tal y como se encuentra descrito, anteriormente, arriba, en este documento de solicitud de patente, para los imanes (232), de la primera forma de presentación, en concordancia con la presente invención.

De una forma preferible, la citada base (233), y elemento o accesorio (231), se encuentra construido y ordenadamente dispuesto, para moverse verticalmente (en la dirección Z).

La placa de múltiples pozos (101), la cual se ha descrito anteriormente, arriba, aquí, en este documento de solicitud de patente, se inserta en la estación de separación (230). El elemento o accesorio (231), el cual comprende los

15 imanes (232), se mueve verticalmente. Cada uno de los elementos o accesorios (232), se mueve así, de este modo, en el ámbito de un espacio (121), entre los filas (123) de recipientes (103). El movimiento vertical, lleva a los imanes (232), montados sobre un elemento o accesorio (231), a ponerse en contacto con los recipientes (103). La posición Z, se elige en dependencia del volumen de líquido (215) existente en el interior de los recipientes (103). Para grandes volúmenes, los imanes (232), contactan con los recipientes (103), en una posición central (120), en donde, los recipientes (103) en cuestión, son de una forma casi rectangular. Para pequeños volúmenes de líquido (215), en donde, la mayor parte del líquido (215), se encuentra localizado por debajo de la parte central (120) de los recipientes (103), los imanes (232), contactan, de una forma preferible, con la parte cónica (111) de los recipientes (103).

25 Se encuentra montado un resorte, a la base (233) de cualquier bastidor (231) (Fig. 9 a), b). El resorte, presiona sobre los imanes (232), contra los recipientes (103). Esto asegura un contacto entre los imanes (232) y los recipientes (103), durante la separación magnética. De una forma preferible, los imanes (232), contactan con el recipiente (103), sobre la pared lateral (109), localizada por debajo de la entrada (105). Esta configuración, tiene la ventaja consistente en que, el líquido el cual se añade mediante un pipeteado, fluye sobre las partículas magnéticas secuestradas, y asegura el hecho de que, las partículas, se vuelvan a suspender, y que, la totalidad de las muestras, en los recipientes, se traten de una forma idéntica.

Esta forma de presentación, en concordancia con la presente invención, es particularmente apropiada para separar un líquido (215), el cual se encuentre comprendido en la placa de múltiples pozos (101), tal y como se ha descrito

35 anteriormente, arriba, en este documento de solicitud de patente, de la partículas magnéticas (216), cuando se encuentran contenidos diferentes niveles de líquido (215), en los recipientes (103) de la citada placa de múltiples pozos (101).

Un “tampón de lavado”, es un fluido, el cual se encuentra concebido para eliminar o retirar componentes no deseados, de una forma especial, en un procedimiento de purificación. Tales tipos de tampones, son bien conocidos, en el arte especializado de la técnica. En el contexto de la purificación de ácidos nucleicos, el tampón de lavado, es apropiado para lavar el material de soporte sólido, con objeto de separar el ácido nucleico inmovilizado, de cualesquiera componentes no deseados. El tampón de lavado en cuestión, puede contener, por ejemplo, etanol y / o agentes caotrópicos, en una solución tamponada, o soluciones con un valor pH ácido, sin etanol y / o agentes

45 caotrópicos, de la forma la cual se ha descrito anteriormente, arriba, aquí, en este documento de solicitud de patente. A menudo, la solución de lavado, u otras soluciones, se proporcionan como soluciones stock (soluciones madre), las cuales deben diluirse antes de proceder a su uso.

El lavado, en el procedimiento en concordancia con la presente invención, requiere un contacto más o menos intensivo, del material de soporte sólido, y de los ácidos nucleicos inmovilizados en éste, con el tampón de lavado. Son posibles diferentes procedimientos, con objeto de conseguir este objetivo, tales como, por ejemplo, la acción de agitar el tampón de lavado, con el material de soporte sólido, en los respectivos recipiente o recipientes, o conjuntamente con éstos. El procedimiento el cual se utiliza en el procedimiento el cual se describe aquí, en este documento de solicitud de patente, es el consiste en aspirar y dispensar la suspensión que comprende el tampón de 55 lavado y el material de soporte sólido, una o más veces. Este procedimiento, se lleva a cabo, de una forma preferible, mediante la utilización de una pipeta, en donde, la pipeta en cuestión, comprende, de una forma preferible, una punta o boquilla desechable, en cuyo interior, se aspira la citada suspensión, y a partir de la cual, ésta se dispensa de nuevo. Tal tipo de punta o boquilla de la pipeta, puede utilizarse varias veces, antes de proceder a desecharla y a reemplazarla. Las puntas o boquillas desechables de las pipetas, las cuales son de utilidad para la presente invención, tienen, de una forma preferible, un volumen de por lo menos 10 μl, teniendo éstas, de una forma más preferible, un volumen de por lo menos 15 μl, de una forma todavía más preferible, un volumen de por lo menos 100 μl, de una forma aún todavía más preferible, un volumen de por lo menos 500 μl, de una forma aún todavía mucho más preferible, un volumen de por lo menos 1 ml, y de una forma mayormente preferible, un volumen de aproximadamente 1 ml. Las pipetas utilizadas en el contexto de la presente invención, pueden también ser, así

65 mismo, agujas de pipeteado.

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Así, por lo tanto, el citado proceso de lavado, en la etapa c, comprende la aspiración y la dispensación del tampón de lavado, el cual comprende el material de soporte sólido.

5 En vistas a la consecución de un fácil uso y de facilitar la automatización, es preferible el hecho de combinar los recipientes los cuales se han mencionado anteriormente, arriba, en este documento de solicitud de patente, en un orden de disposición integral, de tal forma que, éstos, puedan manipularse conjuntamente.

Así, por consiguiente, un aspecto preferido de la presente invención, es el consistente en el procedimiento el cual se ha descrito anteriormente, arriba, en este documento de solicitud de patente, en donde, los recipientes, se encuentran combinados en un orden de disposición integral.

Los órdenes de disposición integral, pueden ser, por ejemplo, viales o tubos, unidos de una forma reversible, o unidos de una forma irreversible, los unos con los otros, u ordenadamente dispuestos en un bastidor. De una forma

15 preferible, el orden de disposición integral, es el consistente en una placa de múltiples pozos. De una forma más preferible, la placa de múltiples pozos, es una placa de pozos profundos.

El procedimiento en concordancia con la presente invención, es particularmente de utilidad, cuando se procede a preparar diferentes tipos de ácidos nucleicos, ya que, la disposición de un proceso de trabajo individual, en los mismos reactivos, anula la necesidad de aislar diferentes tipos de ácidos nucleicos, tales como los consistentes en el DNA y el RNA, de una forma individual, debido a sus diferentes propiedades.

Así, por lo tanto, un aspecto preferido de la presente invención, es el consistente en procedimiento el cual se ha mencionado arriba, en este documento de solicitud de patente, en donde, el primer ácido nucleico objetivizado como

25 diana, comprende RNA y, el segundo ácido nucleico objetivizado como diana, comprende DNA.

De una forma adicional, múltiples muestras de muestras de fluidos, pueden comprender diferentes organismos, o bien, éstas se derivan de diferentes organismos. Así mismo, también, es entonces ventajoso, el hecho de proporcionar los respectivos ácidos nucleicos, de una forma simultánea, con el mismo proceso de trabajo y los mismos reactivos. La presente invención, permite, para tal tipo de preparación simultánea de ácidos nucleicos, tales como, por ejemplo, las bacterias, los virus DNA, y los virus RNA, a pesar de sus diferentes estructuras y sus diferentes propiedades.

Así, de este modo, un aspecto preferido de la presente invención, es procedimiento el cual se ha descrito

35 anteriormente, arriba, aquí, en este documento de solicitud de patente, en donde, el primer ácido nucleico objetivizado como diana, y el segundo ácido nucleico objetivizado como diana, son de diferentes organismos.

Un aspecto adicionalmente preferido de la presente invención, es el procedimiento el cual se ha descrito anteriormente, arriba, aquí, en este documento de solicitud de patente, en donde, el primer y / o el segundo ácido nucleico, es un ácido nucleico, no vírico.

Así mismo, también, en el procedimiento el cual se ha descrito anteriormente, arriba, aquí, en este documento de solicitud de patente, el primer y / o el segundo ácido nucleico objetivizado como diana, es un ácido nucleico bacteriano.

45 Un “organismo”, tal y como éste se utiliza aquí, en este documento de solicitud de patente, significa una forma de vida multicelular o de célula individual, viva. En el contexto de la presente invención, el virus, es un organismo.

La presente invención, es también de utilidad, cuando diferentes ácidos nucleicos, deben ser de una procedencia correspondiente a una pluralidad de diferentes tipos de muestras de fluido. Así, de este modo, pueden aislarse diferentes ácidos nucleicos, en extracciones simultáneas, paralelas, bajo las mismas condiciones físicas, y pueden entonces, por ejemplo, procesarse de una forma adicional, analíticamente, en diferentes recipientes.

Así, por lo tanto, un aspecto preferido de la presente invención, es el consistente en el procedimiento el cual se ha

55 descrito anteriormente, arriba, en este documento de solicitud de patente, en donde, el primer ácido nucleico, se encuentra presente en una primera muestra de fluido, y el segundo ácido nucleico, se encuentra presente en una segunda muestra de fluido.

Tal tipo de forma de presentación, es particularmente de utilidad, cuando, los citados diferentes ácidos nucleicos, no se encuentran en contacto, el uno con el otro, y éstos pueden procesarse por separado. Así, por lo tanto, un aspecto preferido de la presente invención, es el procedimiento el cual se ha descrito anteriormente, arriba, en donde, el segundo ácido nucleico, se encuentra ausente de la primera muestra de fluido.

Sin embargo, no obstante, puede también encontrarse presentes, así mismo, diferentes ácidos nucleicos, en el 65 ámbito de la misma muestra, si bien, no obstante, no necesariamente la totalidad de éstos, deben procesarse de una

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forma adicional, después del aislamiento. La presente invención, es también de utilidad, así mismo, en esos casos.

Así, de este modo, un aspecto preferido de la presente invención, es el procedimiento el cual se ha descrito anteriormente, arriba, aquí, en este documento de solicitud de patente, en donde, el segundo ácido nucleico, se 5 encuentra también presente, así mismo, en la primera muestra de fluido.

En el caso de un procesado posterior, especialmente, cuando se utilizan técnicas de diagnóstico, tales como las consistentes en los procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos, es entonces a menudo deseable, o incluso se requiere, el hecho de incluir uno más ácido nucleicos de control. Así, de este modo, o bien la reacción analítica, puede contralarse, cuando se añade el control, al ácido nucleico purificado, o bien, así mismo, también, la preparación de la muestra, puede controlarse, cuando se procede a añadir el control, previamente a la extracción del ácido nucleico, o bien durante la extracción del ácido nucleico en cuestión. Es también usual, y preferible, el incluir ambos tipos de controles.

15 En este respecto, un aspecto de la presente invención, es el procedimiento el cual se ha descrito anteriormente, arriba, en este documento de solicitud de patente, en donde, un ácido nucleico de control, se añade a la muestra de fluido y / o, al ácido nucleico purificado, en una cualquiera de las etapas.

Para la unión de los ácidos nucleicos, al material de soporte sólido, y en el caso de que ésta sea aplicable, la lisis de células y virus, ha probado ser ventajoso, el hecho de incubar, a una temperatura correspondiente a un valor de hasta 50 °C.

Así, de este modo, un aspecto de la presente invención, es el procedimiento el cual se ha descrito anteriormente, arriba, aquí, en este documento de solicitud de patente, en donde, la etapa a., se lleva a cabo a una temperatura

25 correspondiente a un valor de hasta 50 °C, de una forma preferible, a una temperatura comprendida dentro de unos márgenes situados entre los 35 °C y los 45 °C, de una forma más preferible, a una temperatura de 40 °C.

Para el procesado posterior de los ácidos nucleicos aislado, puede ser ventajoso el hecho de separarlos del material de soporte sólido, antes de someterlos, por ejemplo, a amplificación.

Así, por lo tanto, un aspecto preferido de la presente invención, es el procedimiento el cual se ha descrito anteriormente, arriba, aquí, en este documento de solicitud de patente, en donde, el procedimiento, comprende, de una forma adicional, después de la etapa c., la siguiente etapa:

35 d. eluir los ácidos nucleicos del material de soporte sólido, con un tampón de elución.

Un “tampón de elución”, en el contexto de la presente invención, es un líquido apropiado para separar los ácidos nucleicos, del soporte sólido. Tal tipo de líquido, puede consistir, por ejemplo, en agua destilada o en soluciones de sales, acuosas, tales como, por ejemplo, las consistentes en los tampones Tris, como el Tris HCl ó el HEPES, u otros tampones apropiados, los cuales son conocidos, por parte de aquéllas personas expertas en el arte especializado de la técnica. El valor pH de tal tipo de tampón de elución, de una forma preferible, es alcalino o neutro. Tal tipo de tampón de elución, puede contener, así mismo, también, otros componentes, tales como los consistentes en, por ejemplo, quelatos, tales como el EDTA, el cual estabiliza a los ácidos nucleicos, mediante la inactivación de las enzimas de degradación.

45 La elución, se lleva a cabo, de una forma preferible, a temperaturas elevadas, de tal forma que, una forma preferida de presentación de la presente invención, es el procedimiento el cual se ha descrito anteriormente, arriba, aquí, en este documento de solicitud de patente, en donde, la etapa d, se lleva a cabo a una temperatura correspondiente a un valor comprendido dentro de unos márgenes, los cuales van desde los 70 °C hasta los 90 °C, de una forma preferible, a una temperatura correspondiente a un valor de 80 °C.

Tal y como se ha mencionado arriba, aquí, en este documento de solicitud de patente, es a menudo deseable, el hecho de analizar los ácidos nucleicos aislados mediante el procedimiento el cual se ha descrito anteriormente, arriba, aquí, en este documento de solicitud de patente. Para llevar a cabo este cometido, puede resultar ventajoso,

55 el hecho de incrementar la cantidad de material de partida, para el análisis.

Así, por lo tanto, el procedimiento el cual se ha descrito anteriormente, arriba, aquí, en este documento de solicitud de patente, comprende, después de la etapa d., las siguientes etapas:

e. transferir los ácidos nucleicos purificados y, de una forma opcional, el citado material de soporte sólido, a una pluralidad de recipientes de reacción

f. amplificar los ácidos nucleicos diana.

65 En este contexto, es especialmente ventajoso, el hecho de emplear procedimientos de amplificación y de detección,

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En el caso en el que, el ácido nucleico molde, se trate de un ácido nucleico de doble hebra, es entonces necesario el separar las dos hebras, antes de que, éste, pueda utilizarse como un molde, en la PCR. La separación de las hebras, puede llevarse a cabo mediante cualquier tipo de desnaturalización, el cual sea apropiado, incluyendo a 5 medios físicos, químicos, o enzimáticos. Un procedimiento para la separación de las hebras del ácido nucleido, involucra el calentamiento del ácido nucleico, hasta que éste se encuentre predominantemente desnaturalizado (tal como, por ejemplo, un 50 % desnaturalizado, un 60 % desnaturalizado, un 70 % desnaturalizado, un 80 % desnaturalizado, un 90 % desnaturalizado, o un 95 % desnaturalizado). La condiciones del calentamiento, las cuales son necesarias para desnaturalizar el ácido nucleico molde, dependerán, por ejemplo, de la concentración de la sal tampón, y de la longitud de la composición de los nucleótidos de los ácido nucleicos que se estén desnaturalizando, pero, de una forma típica, ésta es la correspondiente a un rango comprendido dentro de unos márgenes, los cuales van desde los 90 °C hasta los 105 °C, durante un transcurso de tiempo dependiente de las características de la reacción, tales como las consistente en la temperatura y en y en la longitud del ácido nucleico. La desnaturalización, se lleva a cabo, de una forma típica, durante un transcurso de tiempo que va desde los aproximadamente 5

15 segundos, hasta los aproximadamente 9 minutos. Con objeto de no exponer las respectiva polimerasa, tal como, por ejemplo, la Z05 DNA Polimerasa, a tales tipos de altas temperaturas, durante un transcurso de tiempo demasiado prolongado, y arriesgar así, de este modo, la pérdida de enzima funcional, es preferible la utilización de cortas etapas de desnaturalización.

En una forma preferida de presentación, en concordancia con la presente invención, la etapa de desnaturalización, es de un transcurso de tiempo de hasta 30 segundos, siendo éste, de una forma preferible, de un transcurso de tiempo de hasta 20 segundos, de una forma adicionalmente preferible, de un transcurso de tiempo de hasta 10 segundos, de una forma aún todavía más preferible, de un transcurso de tiempo de hasta 5 segundos, y de una forma mayormente preferible, de un transcurso de tiempo de aproximadamente 5 segundos.

25 En el caso de que, el ácido nucleico molde de doble hebra, se desnaturalice mediante calor, entonces, la mezcla de reacción, se deja enfriar a una temperatura, la cual fomente la reasociación de cada cebador, a su secuencia objetivizada como diana, en los ácidos nucleicos diana.

La temperatura para la reasociación, de una forma preferible, es la correspondiente a un valor comprendido dentro de unos márgenes que van desde los aproximadamente 35 °C, hasta los aproximadamente 70 °C, siendo dicha temperatura, de una forma preferible, la correspondiente a un valor comprendido dentro de unos márgenes los cuales van desde los aproximadamente 45 °C hasta los aproximadamente 65 °C, de una forma más preferible, la correspondiente a un valor comprendido dentro de unos márgenes los cuales van desde los aproximadamente 50 °C 35 hasta los aproximadamente 60 °C, y de una forma mayormente preferible, la correspondiente a un valor comprendido dentro de unos márgenes los cuales van desde los aproximadamente 55 °C hasta los aproximadamente 58 °C. Los tiempos de reasociación, pueden ser de un transcurso de tiempo que va desde los aproximadamente 10 segundos, hasta aproximadamente 1 minuto (tal como, por ejemplo, de un transcurso de tiempo que va desde los aproximadamente 20 segundos hasta los aproximadamente 50 segundos; desde los aproximadamente 30 segundos hasta los aproximadamente 40 segundos). En este contexto, puede resultar ventajoso, el hecho de utilizar diferentes temperaturas de reasociación, con objeto de incrementar la inclusividad del respectivo ensayo. En resumen, esto significa el hecho de que, a temperaturas de reasociación relativamente reducidas, los cebadores , pueden también enlazarse a dianas objetivizadas, las cuales tengan desajustes individuales, de tal forma que puedan amplificarse así mismo, también, variantes de determinadas frecuencias. Esto 45 puede ser deseable, en el caso de que, determinados organismos, tengan variantes genéticas conocidas o no conocidas, las cuales deben también detectarse. Por otro lado, relativas temperaturas de reasociación, aportan la ventajas de proporcionar una alta especificidad, puesto que a medida que se utilizan mayores temperaturas, decrece continuamente la probabilidad de que, la unión a los cebadores, no coincida de una forma exacta con secuencias objetivizadas como diana. Con objeto de beneficiarse de ambos fenómenos, en algunas formas de presentación, en concordancia con la presente invención, es preferible el hecho de que, el procedimiento anteriormente descrito, arriba, en este documento de solicitud de patente, comprenda la reasociación a diferentes temperaturas, de una forma preferible, en primer lugar, a una baja temperatura y, después, a una alta temperatura. En el caso en el que tenga lugar muna primera incubación, a una temperatura de 55 °C, durante aproximadamente 5 ciclos, pueden (pre)amplificarse secuencias diana que no coincidan exactamente. A este proceso, le puede seguir por ejemplo, una

55 serie de aproximadamente 45 ciclos, a una temperatura de 58 °C, proporcionando un especificidad más alta, durante la mayor parte del experimento. Así, de este modo, no se pierden variantes genéticas potencialmente importantes, al mismo tiempo que, la especificidad, permanece relativamente alta.

Se procede, a continuación, a ajustar la mezcla de reacción a la temperatura a la cual se fomenta o se optimiza, la actividad de la polimerasa, a saber, a un temperatura la cual sea suficiente como para que acontezca la extensión, a partir del cebador reasociado, para generar productos complementarios al ácido nucleico a ser analizado. La temperatura, debe ser lo suficientemente alta, como para sintetizar el producto de extensión, a partir del cebador el cual se esté reasociando, a un molde de ácido nucleico, pero, ésta, no debe ser tan alta como para desnaturalizar un producto de extensión procedente de su molde complementario (así, por ejemplo, la temperatura la extensión, es 65 generalmente la correspondiente a un valor comprendido dentro de unos márgenes, los cuales van desde los

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aproximadamente 40 °C hasta los aproximadamente 80 °C – [tal como, por ejemplo, desde los aproximadamente 50 °C, hasta los aproximadamente 70 °C; como por ejemplo, una temperatura de 60 °C ] -). Los tiempos de extensión, pueden ser los correspondientes a un rango comprendido dentro de unos márgenes que van desde los 10 segundos hasta los 5 minutos, siendo dicho rango, de una forma preferible, el correspondiente a un tiempo comprendido 5 dentro de unos márgenes, los cuales van desde los aproximadamente 15 segundos hasta los aproximadamente 2 minutos, de una más preferible, el correspondiente a un tiempo comprendido dentro de unos márgenes, los cuales van desde los aproximadamente 20 segundos hasta los aproximadamente 1, y de una forma mucho más preferible, el correspondiente a un tiempo comprendido dentro de unos márgenes, los cuales van desde los aproximadamente 25 segundos hasta los aproximadamente 35 segundos. Las hebras nuevamente sintetizadas, forman una molécula de doble hebra, la cual puede utilizarse en las etapas sucesivas de la reacción. Las etapas de la separación de las hebras, de la reasociación y del alargamiento, pueden repetirse tantas veces como sea necesario, para producir la deseada cantidad de los productos de amplificación, correspondientes a los ácidos nucleicos objetivizados como diana. Los factores limitativos, en la reacción, son los correspondientes a las cantidades de cebadores, la enzima termoestable, y los nucleósidos trifosfatos los cuales se encuentran presentes en la reacción. La etapas de ciclación

15 (a saber, la desnaturalización, la reasociación y la extensión), de una forma preferible, se repiten por lo menos una vez. Para su uso en la detección, el número de etapas de ciclación, dependerá, por ejemplo, de la naturaleza de la muestra. Si la muestra es una mezcla compleja, de ácidos nucleicos, se necesitarán más etapas de ciclación, para amplificar la secuencia diana, de una forma suficiente, para la detección. Generalmente, las etapas de ciclación, se repiten por lo menos un número de 20 veces, pero éstas, pueden repetirse, tantas veces como las correspondientes a un número de 40 veces, de 60 veces, o incluso de 100 veces.

En el ámbito de la presente invención, puede llevarse a cabo una PCR, en la cual, las etapas de reasociación y de extensión, se llevan a cabo en la misma etapa (PCR de una etapa) o, tal y como se ha descrito anteriormente, arriba, en este documento de solicitud de patente (PCR de dos etapas). La realización de la reasociación y de la

25 extensión, conjuntamente, y así, de este modo, bajo las mismas reacciones físicas y químicas, con una enzima apropiada, tal como, por ejemplo, la consistente en la Z05 DNA polimerasa, aporta la ventaja consistente en el ahorro de tiempo, para una etapa adicional, en cada ciclo, y así mismo, también, de abolir la necesidad para un ajuste adicional de la temperatura, entre la reasociación y la extensión. Así, de este modo, la PCR de una etapa, reduce la complejidad total del ensayo respectivo.

En general, se prefieren reducidos tiempo para la amplificación total, ya que, así, de este modo, se reduce el tiempo para la obtención de los resultados, y ello conduce a una diagnosis posiblemente más temprana.

Otros procedimientos de amplificación de ácido nucleicos, los cuales se utilizan en el contexto de la presente

35 invención, comprenden a los consistentes en los Reacción en cadena de la ligasa (LCR, de sus iniciales en idioma inglés, correspondientes a Ligase Chain Reaction; Wu D. Y. y Wallace R. B., Genomics 4 (1989) 560 -69; y Barany F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 189 -193); Reacción en cadena de la polimerasa ligasa -Polymerase Ligase Chain Reaction -(Barany F., PCR Methods and Applic. 1 (1991) 5 -16); Gap-LCR (documento de patente internacional WO 90 / 01 069); Reacción en cadena de reparación -Repair Chain Reaction -(documento de patente europea EP 0 439 182 A2), 3SR (Kwoh D.Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 1173 -1177; Guatelli J.C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 1874 -1878; documento de patente internacional WO 92 / 08 808), y NASBA (documento de patente estadounidense U S 5. 130. 238). Adionalmente, además, existe la Amplificación de desplazamiento de hebras (SDA – de sus iniciales, en idioma inglés, correspondientes a Strand displacement amplification); la Amplificación mediatizada por transcipción (TMA – de sus iniciales, en idioma inglés,

45 correspondientes a Transcription mediated amplification), y la (TMA), and Qb-amplification, -Amplificacion de la replicasa Qb -, (para una revision, véase, por ejemplo, Whelen A. C. y Persing D. H., Annu. Rev. Microbiol. 50 (1996) 349 -373; Abramson R. D. y Myers T. W., Curr Opin Biotechnol 4 (1993) 41 -47).

Una “polimerasa con actividad transcriptasa inversa”, es una ácido nucleico polimerasa, capaz de sintetizar DNA, en base a un molde de RNA. Ésta es así mismo, también capaz de la formación de un DNA de doble hebra, una vez que, el RNA, se haya transcrito inversamente, convirtiéndose en un cDNA de hebra individual. En una forma preferida de presentación de la presente invención, la polimerasa con actividad transcriptasa inversa, es termoestable.

55 En una forma preferida de presentación, el procedimiento de la presente invención, comprende incubar una muestra la cual comprende un molde de RNA, con un cebador oligonucleótido, lo suficientemente complementario al citado molde de RNA, como para hibridar con éste último, y una DNA polimerasa, preferiblemente termoestable, en presencia de por lo menos todos los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfatos naturales, o modificados, en un tampón apropiado, el cual comprenda un tampón de ion metálico, el cual, en una forma preferida de presentación, tapona a ambos, el valor pH y la concentración del ion metálico. La incubación, se lleva a cabo a una temperatura suficiente como para que, el citado cebador, hibride al citado molde de RNA, y que la citada DNA polimerasa, catalice la polimerización de los citados desoxirribonucleótidos trifosfatos, para forma una secuencia de cDNA polimerasa, complementaria a la secuencia del citado molde de RNA.

65 Tal y como éste se utiliza aquí, en este documento de solicitud de patente, el término “cDNA”, se refiere a una

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molécula de DNA, complementaria (es decir, un DNA complementario), la cual se ha sintetizado mediante la utilización de una hebra de ácido ribonucleico (RNA), como un molde. El RNA, puede ser, por ejemplo, el consistente en un mRNA, en un tRNA, en un cRNA, o en cualquier otra forma de RNA, tal como la consistente en un RNA vírico. El cDNA, puede ser de hebra individual, de doble hebra, o éste puede ser de tipo de hidrógeno unido a

5 una molécula de RNA complementario, tal como en un híbrido de RNA / cDNA.

Un cebador apropiado para reasociación a un molde de RNA, puede también ser así mismo apropiado para la amplificación mediante PCR. Para la PCR, un segundo cebador, complementario a la hebra de DNA, inversamente transcrita, proporciona un sitio de iniciación, para la síntesis de un producto de extensión.

En la amplificación a una molécula de RNA, mediante una DNA polimerasa, la primera reacción de extensión, es una transcripción inversa, mediante la utilización de un molde de RNA, y se produce una hebra de DNA. La segunda reacción de extensión, mediante la utilización de un molde de DNA, produce una molécula de DNA de doble hebra. Así, de este modo, la síntesis de una hebra de DNA complementaria, a partir de un molde de RNA, mediante una

15 DNA polimerasa, proporciona un material de partida, para la amplificación.

Las DNA polimerasas termoestables, pueden utilizarse en una reacción de amplificación / transcripción inversa de enzimas, acoplada. El término “homogéneo”, en este contexto, se refiere a una reacción de adición individual, de dos etapas, para la transcripción inversa y la amplificación del RNA objetivizado como diana. Mediante el término homogéneo, tal y como éste se utiliza aquí, en este documento de solicitud de patente, se pretende dar a entender el hecho consistente en que, a continuación de la etapa de la transcripción inversa (RT – [de sus siglas, en idioma inglés, correspondientes a reverse transcription] -), no hay ninguna necesidad de abrir el recipiente de reacción, o de otro modo, de ajustar los componentes de reacción, previamente a la etapa de amplificación. En una reacción de RT / PCR, no homogénea, a continuación de la transcripción inversa, y previamente a la amplificación de uno o de más

25 componentes de reacción, tales como los consistentes en los reactivos de amplificación, por ejemplo, se ajustan, se añaden o se diluye, para lo cual, el recipiente de reacción, debe abrirse, o por lo menos, debe procederse a la manipulación de sus contenidos. Mientras que, ambas formas de presentación, en concordancia con la presente invención, la homogénea, y la no homogénea, se encuentran comprendidas en el ámbito de la presente invención, el formato homogéneo, para la RT / PCR, es la que forma de presentación la cual se prefiere.

La transcripción inversa, es una etapa importante, en un procedimiento de RT / PCR. Se conoce, por ejemplo, en el arte especializado de la técnica, el hecho consistente en que, los moldes de RNA, muestran una tendencia hacia formación de estructuras secundarias, la cuales pueden impedir o dificultar la unión y / o el alargamiento de los cebadores, de la hebra de cDNA, mediante la respectiva transcriptasa inversa. Así, de este modo, unas

35 temperaturas relativamente altas, para una reacción de RT, son ventajosas, con respecto a la eficacia de la transcripción. Por otro lado, el aumento de la temperatura de incubación, implica así mismo, también, un alta especificidad, a saber, los cebadores de RT, no se reasociarán, a las secuencias las cuales exhiben una discrepancia o desajuste, con respecto a la secuencia o a las secuencias esperadas. De una forma particular, en el caso de mútiples RNAs diana diferentes, puede ser deseable, así mismo, también, el transcribir y, subsiguientemente, amplificar y detectar, secuencias con discrepancias individuales, tal como, por ejemplo, en el caso de una posible presencia de subhebras no conocidas o raras, o subespecies de organismos, en el muestra de fluido.

Con objeto de beneficiarse de ambas ventajas las cuales se han descrito anteriormente, arriba, a saber, de la

45 reducción de estructuras secundarias, y de la transcripción inversa de moldes con discrepancias, es un aspecto de la presente invención, el llevar a cabo la incubación de la RT (transcriptasa inversa), a más de una diferente temperatura.

Así, por lo tanto, un aspecto preferido de la presente invención, es el procedimiento el cual se ha descrito anteriormente, arriba, en este documento de solicitud de patente, en donde, en la etapa ii, la incubación de la polimerasa, con actividad transcriptasa inversa, se lleva a cabo a diferentes temperaturas, correspondientes a un rango comprendido dentro de unos márgenes, los cuales van desde los 30 °C hasta los 75 °C, llevando a cabo, de una forma preferible en un rango de temperaturas comprendido dentro de unos márgenes, los cuales van desde los 45 °C hasta los 70 °C, y de una forma más preferible, en un rango de temperaturas comprendido dentro de unos

55 márgenes, los cuales van desde los 55 °C hasta los 65 °C.

Como un importante aspecto adicional de la transcripción inversa, las etapas de RT prolongadas, pueden dañar los moldes de DNA, los cuales puedan encontrarse presentes en la muestra de fluido. Si la muestra de fluido contiene ambas, las especies de RNA y de DNA, es entonces favorable, el hecho de mantener la duración de las etapas de RT, tan reducida como sea posible, pero, al mismo tiempo, asegurando la síntesis de suficientes cantidades de cDNA, para la subsiguiente amplificación y la opcional detección de los amplificados (productos de amplificación).

Así, de este modo, un aspecto preferido de la presente invención, es el procedimiento el cual se ha descrito anteriormente, arriba, en donde, en la etapa ii, el período de tiempo, es de hasta 30 minutos, de hasta 20 minutos,

65 de hasta 15 minutos, de hasta 12,5 minutos, de hasta 10 minutos, de hasta 5 minutos, o de hasta 1 minuto.

23

Un aspecto adicionalmente preferido de la presente invención, es el procedimiento el cual se ha descrito anteriormente, arriba, en donde, la polimerasa con actividad transcriptasa inversa, y que comprende una mutación, se selecciona de entre el grupo consistente en

5

a.

una CS5 DNA polimerasa

b.

una CS6 DNA polimerasa

c.

una Thermotoga maritima DNA polimerasa

d.

una Thermus aquaticus DNA polimerasa

e.

una Thermus thermophilus DNA polimerasa 15

f.

una Thermus flavus DNA polimerasa

g.

una Thermus filiformis DNA polimerasa

h.

una Thermus sp. sps17 DNA polimerasa

i.

una Thermus sp. Z05 DNA polimerasa

j.

una Thermotoga neapolitana DNA polimerasa 25

k.

una Termosipho africanus DNA polimerasa

l.

una Thermus caldophilus DNA polimerasa

Son particularmente apropiados, para estos requerimientos, las enzimas las cuales portan una mutación en el dominio de la polimerasa, la cual mejore e intensifique la eficacia de la transcripción inversa, en una tasa de extensión más rápida.

Así, por lo tanto, un aspecto de la presente invención, es el consistente en el procedimiento el cual se ha descrito

35 anteriormente, arriba, en este documento de solicitud de patente, en donde, la polimerasa con actividad transcriptasa inversa, es una polimerasa la cual comprende una mutación, la cual confiere una tasa de extensión de ácido nucleico incrementada y / o una actividad transcriptasa inversa mejorada, con relación a la respectiva polimerasa del tipo salvaje.

En una forma más preferida de presentación, en el procedimiento descrito anteriormente, en concordancia con la presente invención, la polimerasa con actividad transcriptasa inversa, es una polimerasa, la cual comprende una mutación que confiere actividad transcriptasa inversa incrementada, con relación a la respectiva polimerasa del tipo salvaje.

45 Las polimerasas las cuales portan mutaciones puntuales, para convertirla en particularmente de utilidad, en el contexto de la presente invención, se dan a conocer en el documento de patente internacional WO 2008 / 046 612. De una forma particular, las polimerasas preferidas a ser utilizadas en el contexto de la presente invención, son DNA polimerasas mutadas, las cuales comprenden por lo menos el siguiente motivo o formación, en el dominio de la polimerasa:

T-G-R-L-S-S-Xb7-Xb8-P-N-L-Q-N; en donde, Xb7, es un aminoácido, seleccionado de entre S ó T, y en donde, Xb8, es un aminoácido, seleccionado de entre G, T, R, K, ó L, y en donde, la actividad exonucleasa 3’-5’, tiene una tasa de extensión del ácido nucleico incrementada y / o una eficacia de la actividad transcriptasa inversa mejorada, con relación a la respectiva polimerasa del tipo salvaje, y en donde, en la citada DNA polimerasa del tipo salvaje, Xb8, es

55 un aminoácido, seleccionado de entre D, E ó N.

Un ejemplo particularmente preferido, en concordancia con la presente invención, es el consistente en los mutantes de DNA polimerasa termoestable, de la especie Thermus Z05 (especie ésta, la cual se encuentra descrita, por ejemplo, en el documento de patente estadounidense U S 5. 455. 170), comprendiendo, las citadas variaciones, mutaciones en el dominio de la polimerasa, si se compara con la respectiva enzima Z05 del tipo salvaje. Se prefiere, de una forma especial, en el procedimiento en concordancia con la presente invención, una DNA polimerasa Z05, mutante, en donde, el aminoácido, en la posición 580, se selecciona de entre el grupo consistente en G, T, R, K y L.

Para la transcriptasa inversa, mediante la utilización de una polimerasa termoestable, se prefiere el Mn2+, como el 65 catión diferente, y éste se incluye, de una forma típica, como una sal, tal como, por ejemplo, una sal consistente en

24

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Continuación tabla

Reactivo R2

Concentración / 50 µl -PCR

SEQ ID NO 42

0,6 µM

SEQ ID NO 43

0,6 µM

SEQ ID NO 44

0,15 µM

Z05D Polimerasa

35

Uracil-N-Glicosilasa

2 (U / reacción)

Azida sódica

0,027 (U / reacción)

% (masa / volumen)

Reactivo R1

Concentración / 50 µl -PCR

H2O

100 %

MgOAc

2,5 mM

MnOAc pH 6,1

2,5 mM

Azida sódica

0,018 % (masa / volumen)

Para la CT

Reactivo R1

Concentración / 50 µl -PCR

Agua (grado PCR)

Mn(AC)2 (pH 6,5 en 0,02 % (volumen /volumen ácido acético glacial

2,7 mM

NaN3

0,0135 % (peso volumen)

Reactivo R2

Concentración / 50 µl -PCR

NaN3 / Ri (tamponado con 10 mM Tris a un valor pH de 7 (%)

0,0315 %

Acetato potásico

112,4 mM

Glicerol (%)

3,5 %

Tricina

61 mM

Hidróxido potásico

28,4 mM

dGTP

525 µM

dATP

525 µM

dCTP

525 µM

dUTP

1,05 mM

SEQ ID NO 39

750 mM

SEQ ID NO 40

600 mM

SEQ ID NO 41

116 nM

Aptámero NTQ – 46 A

175 mM

Uracil-N-Glicosilasa

5 U / reacción

ZO-D-polimerasa

31 U / reacción

Para los procesos de amplificación y de detección, se procedió a sellar la placa de múltiples pozos, de una forma hermética, mediante un sellador de placas automatizado (véase, anteriormente, más arriba, en este documento de 10 solicitud de patente y, la placa en cuestión, se transfirió a un ciclador del tipo LightCycler 480 (véase anteriormente, más arriba, en este documento de solicitud de patente.

Se procedió a utilizar el siguiente perfil de la PCR:

15 Perfil de la termociclación

Nombre del programa

Diana (°C) Modo de adquisición Retención (horas, minutos, segundos ) Tasa de rampa (°C / seg.) Ciclos Modo de análisis

Pre-PCR

50 94 55 60 65 Ninguno Ninguno Ninguno Ninguno Ninguno 00 : 02 : 00 00 : 00 : 05 00 : 02 : 00 00 : 06 : 00 00 : 04 : 00 4,4 4,4 2,2 4,4 4,4 1 Ninguno

1ª medición

95 55 Ninguno Individual 00 : 00 : 05 00 : 00 : 30 4,4 2,2 5 Cuantificación

2ª medición

91 58 Ninguno Individual 00 : 00 : 05 00 : 00 : 25 4,4 2,2 45 cuantificación

42

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Continuación Tabla

Diana (°C)

Modo de adquisición Meseta (horas, minutos, segundos ) Medición (horas, minutos, segundos ) Tasa de rampa (°C / seg.)

Etapa de RT

55 ninguno 00 : 02 : 00 00 : 00 :00 2,2

60

ninguno 00 : 06 : 00 00 : 00 :00 4,4

65

ninguno 00 : 04 : 00 00 : 00 :00 4,4

1ª medición

95 ninguno 00 : 00 : 05 00 : 00 :00 4,4

55

individual 00 : 00 : 30 00 : 00 :08 2,2

2ª medición

91 ninguno 00 : 00 : 05 00 : 00 :00 4,4

58

individual 00 : 00 : 25 00 : 00 :08 2,2

Enfriamiento

40 ninguno 00 : 02 : 00 00 : 00 :00 2,2

Nombre

Ciclos

Pre-PCR

1

1ª medición

5

2ª medición

45

Enfriamiento

1

5 De una forma detallada, se procedió a llevar a cabo los siguientes experimentos:

1. Análisis multiplex cualitativo de los HBV, HCV y HIV a.Mezcla matriz

10

R1

Concentración en 50 µl – PCR (µM)

Mn(AC)2 * 4H2O (pH 6,1, ajustado con ácido acético)

3.300

NaN3 / Ri, tamponado con 10 mM Tris, a un pH 7)

0,018

pH: 6.41

R2

Reactivo

Concentración en 50 µl – PCR (µM)

DMSO (%)

5,4

NaN3 / Ri, tamponado con 10 mM Tris, a un pH 7)

0,027

KOAc (pH 7,0

120.000

Glicerol (%)

3

Tween 20 (%)

0,015

Tricina pH 8,0

60.000

NTQ21 -46 A – Aptámero

0,2222

Uracil-N-glicosilasa (U / µl)

0,2

DGTP

400,0

DATP

400,0

DCTP

400,0

dUTP

800,0

ZO5-D Polimerasa (U / µl)*

0,9

Cebadores / sondas, seleccionadas de entre las SEQ ID NOs 1 – 35

0,125 – 0,3

SEQ ID NO 36

0,100

SEQ ID NO 37

0,100

SEQ ID NO 38

0,150

Cebadores / sondas, seleccionadas de entre las SEQ ID NOs 60 -76

0,050 – 0,250

SEQ ID NO 42

0,200

SEQ ID NO 43

0,200

SEQ ID NO 44

0,100

Sensibilidad analítica / LOD

44

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Claims (1)

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