ES2617062T3

ES2617062T3 - Péptidos VEGF quiméricos

Info

Publication number: ES2617062T3
Application number: ES12170985.1T
Authority: ES
Inventors: Pravin Kaumaya; David Cohn
Original assignee: Ohio State University Research Foundation
Current assignee: Ohio State University Research Foundation
Priority date: 2004-02-05
Filing date: 2005-02-07
Publication date: 2017-06-15
Anticipated expiration: 2025-02-07
Also published as: WO2005076972A3; EP1730182A4; CA2555274A1; US20130230546A1; AU2005213457A1; EP2561884A1; US8080253B2; EP2561884B1; US20120121626A1; WO2005076972A2; ES2541779T3; EP1730182B1; EP1730182A2; US20050233964A1

Abstract

Péptido quimérico que comprende: (a) al menos un epítopo de VEGF humano constituido por KCECRPKKDRARQENPCG; (b) un epítopo de células T colaboradoras seleccionado del grupo constituido por NSVDDALINSTIYSYFPSV (TT), PGINGKAIHLVNNQSSE (TT1), QYIKANSKFIGITEL (P2), FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (P30), LSEIKGVIVHRLEGV (MVF), FFLLTRILTIPQSLN (HBV) y TCGVGVRVRSRVNAANKKPE (CSP); y (c) un conector de 2 a 15 aminoácidos de longitud que une al menos un epítopo de VEGF al epítopo de células T colaboradoras, en el cual el conector está unido operativamente al C terminal de al menos un epítopo de VEGF y al N terminal del epítopo de células T colaboradoras.

Description

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DESCRIPCION

Peptidos VEGF quimericos

Esta solicitud de patente reclama la prioridad de la solicitud provisional de patente U.S. n° 60/542,041 presentada el 5 de febrero de 2004.

AMBITO TECNICO DE LA PRESENTE INVENClON

La presente invencion se refiere a composiciones para tratar pacientes con malignidades relacionadas con la sobre- expresion del VEGF, en particular el cancer ovarico. Las composiciones de la presente invencion incluyen los peptidos definidos en la reivindicacion 1 o 4.

ANTECEDENTES DE LA PRESENTE INVENCION

El cancer ovarico es la malignidad ginecologica mas letal, de la cual se espera que casi 14.000 mujeres mueran en los Estados Unidos durante 2003 [Jemal]. Desgraciadamente no hay medios efectivos para la deteccion precoz del cancer ovarico y mas del 75% de los casos se diagnostican cuando la enfermedad ya se ha extendido al abdomen superior o a los nodos linfaticos. A pesar de la quimioterapia citotoxica intensiva tras la cirugfa radical para reducir el volumen del cancer ovarico, la supervivencia media de las mujeres con cancer ovarico avanzado de gran volumen es inferior a 40 meses [McGuire].

Recientes estudios han demostrado el papel cntico de la angiogenesis en el desarrollo del tumor y en la formacion de depositos tumorales metastasicos. La inhibicion de la angiogenesis tumoral ha surgido como una modalidad terapeutica nueva y prometedora. Se han identificado varias actividades biologicas involucradas en este complejo proceso, aunque ahora ya se sabe que el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) es uno los factores pro- angiogenicos mas potentes y espedficos, responsable de la angiogenesis inducida por tumores [Leung], y es la diana mas prometedora para la inhibicion de la angiogenesis inducida por tumores. El VEGF se sobreexpresa en varias malignidades solidas humanas, incluyendo el cancer ovarico [Boocock, Olson]. La sobreexpresion del VEGF tambien se ha visto en mujeres con cancer ovarico y ha resultado ser un factor de pronostico malo [Hollingsworth, Paley, Tempfer]. Por tanto el VEGF es una diana logica contra la cual la inmunizacion puede tener un papel en el tratamiento o prevencion del cancer ovarico.

Para inhibir la funcion del VEGF se han empleado diversas estrategias, incluyendo el receptor de VEGF (VEGFR) como diana, el uso de tecnicas de terapia genetica que producen oligonucleotidos antisentido, el uso de VEGFR soluble, el desarrollo de inhibidores de los receptores de tirosina quinasa (RTK) y los anticuerpos monoclonales (Mab) dirigidos contra VEGF [Kim]. El enfoque mas prometedor parece ser una version humanizada recombinante de un Mab murino anti-VEGF humano (rhuMab VEGf, Bevacizumab). Este Mab se ha probado en pacientes con cancer metastasico [Gordon, Margolin]. Sin embargo el uso de terapia de anticuerpos tiene varios inconvenientes. Las estrategias de inmunizacion pasiva implican de manera significativa la transferencia de anticuerpos al paciente, pero la inmunidad es effmera, porque los anticuerpos son eliminados de la circulacion. Probablemente los propios anticuerpos son con frecuencia inmunogenicos, lo cual limita su empleo a largo plazo. Ademas una inmunizacion efectivamente sostenida requiere grandes volumenes de anticuerpos.

El uso de vacunas para prevenir o tratar el cancer ovarico es un procedimiento muy atractivo porque los efectos secundarios que produce la terapia vacunal son mmimos. Muchos canceres expresan antfgenos asociados al tumor (AAT) que sirven de dianas para las vacunas contra el cancer. Las estrategias de inmunizacion han incluido vacunas de celulas enteras, vacunas de protemas y de ADN, asf como vacunas de peptidos; cada tipo de vacuna antitumoral tiene sus ventajas y limitaciones. Como vacunas contra el cancer los peptidos son interesantes porque son seguros (libres de patogenos y potencial oncogenico), estables, faciles de construir y rentables como sistema de vacunacion [Dakappagari, Peoples, Kaumaya]. Cabe destacar que las vacunas de peptidos producen respuestas y memoria inmunologica sostenidas, al contrario que la inmunizacion pasiva. Las limitaciones de las vacunas de peptidos incluyen el hecho de que los peptidos no modificados raramente son inmunogenicos; por tanto el diseno racional de los peptidos es imprescindible para el desarrollo de una vacuna antitumoral eficaz.

La patente WO 9839037 (A1) revela una preparacion inmunologica que comprende la adicion de no menos de dos tipos de moleculas conjugadas para la union espedfica simultanea a una region espacialmente expuesta del factor de permeabilidad vascular (VPF) unido in vivo a un vaso sangumeo asociado a un tumor. Cada tipo de molecula conjugada comprende al menos una porcion fijadora de un anticuerpo espedfico para un epftopo presente en una region espacialmente expuesta de vPf unido, y una porcion efectora unida covalentemente a la porcion fijadora espedfica. La preparacion inmunologica tiene amplios usos y aplicaciones, incluyendo estudios analfticos, ensayos diagnosticos in vivo y tratamientos terapeuticos in vivo.

RESUMEN DE LA PRESENTE INVENCION

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La presente invencion aporta nuevos compuestos (es decir, peptidos) como los definidos en la reivindicacion 1 o 4 y composiciones como las definidas en la reivindicacion 10 u 11, para estimular el sistema inmunitario y tratar malignidades relacionadas con la sobreexpresion de la protema VEGf. Ademas la presente invencion proporciona polinucleotidos como los definidos en la reivindicacion 12 o 13. En las reivindicaciones 2, 3 y 5 a 9 se definen otras formas de ejecucion beneficiosas. Los compuestos son epftopos inmunogenicos de la protema VEGF humana y de la protema EG-VEGF humana, y peptidos quimericos y multivalentes que comprenden dichos epftopos.

En lo sucesivo se alude colectivamente al primer grupo de compuestos como “epftopos de VEGF”. Los epftopos de VEGF comprenden aproximadamente 15 hasta 50 aminoacidos, preferiblemente 17 hasta 40 aminoacidos, con mayor preferencia 18 hasta 35 aminoacidos. En un aspecto el epftopo de VEGF mostrado en la siguiente tabla 1 o un equivalente antigenico o funcional del mismo:

Tabla 1

Inmunogeno Restos_____Secuencia de aminoacidos_______Estructura secundaria

VEGF 127-144 KCECRPKKDRARQENPCG Giro-helice-giro

EG-VEGF 50-67______CTPLGREGEECHPGSHKV Giro-helice-giro__________

En otro aspecto el epftopo de VEGF comprende el aminoacido 4 hasta el aminoacido 21 del VEGF humano (tal como se indica abajo), los aminoacidos 24-38 del VEGF humano, el aminoacido 127 hasta el aminoacido 144 del VEGF humano, el aminoacido 102 hasta el aminoacido 122 del VEGF, el aminoacido 162 hasta el aminoacido 175 del VEGF humano o el aminoacido 76 hasta el aminoacido 96 del VEGF.

La secuencia del VEGF humano es:

1 mnfllswvhwslalllylhhakwsqaapmaegggqnhhevvkfmdvyqrsychpietld

61 ifqeypdeieyifkpscvplmrcggcsndeglecvpteesnitmqimrikphqgqhigem

121 SFLQHNKCECRPKKDRARQENPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTHSRCKARQLELN 181 ERTCRCDKPRR191

En otro aspecto el presente epftopo de VEGF comprende el aminoacido 5 hasta el aminoacido 15 de la protema EG- VEGF humana (tal como se indica abajo), el aminoacido 24 hasta el aminoacido 34 de la EG-VEGF humana, el aminoacido 50 hasta el aminoacido 75 de la EG-VEGF humana o el aminoacido 86 hasta el aminoacido 102 de la EG-VEGF humana.

La secuencia de la EG-VEGF humana es:

1 MRGATRVSIMLLLVTVSDCAVITGACERDVQCGAGTCCAISLWLRGLRMCTPLGREGEE CHPGSHKVPFFRKRKHHTCPCLPNLLCSRFPDGRYRCSMDLKNINF105

En lo sucesivo se alude a los peptidos quimericos como “peptidos de VEGF quimericos”, los cuales comprenden al menos uno de los presentes epftopos de VEGF o un equivalente antigenico o funcional del mismo. Los peptidos de VEGF quimericos tienen preferiblemente una longitud aproximada de 35 hasta 150, con mayor preferencia de 35 hasta 70 aminoacidos. Los peptidos de VEGF quimericos poseen tres unidades. La primera unidad comprende el epftopo de VEGF o un equivalente antigenico o funcional del mismo. La segunda unidad es un epftopo de linfocitos T colaboradores (Th), preferiblemente un epftopo promiscuo de celulas Th. Tal como se emplea aqm, un “epftopo promiscuo de celulas Th” es aquel que promueve la liberacion de citocinas que ayudan a evitar la restriccion del MHC. La segunda unidad tiene una longitud aproximada de 14 hasta 22, preferiblemente de 15 hasta 21, con mayor preferencia de 16 aminoacidos. El epftopo de celulas Th tiene una de las siguientes secuencias de aminoacidos:

N-S-V-D-D-A-L-I-N-S-T-I-Y-S-Y-F-P-S-V, designado en lo sucesivo como “TT”;

P-G-I-N-G-K-A-I-H-L-V-N-N-Q-S-S-E, designado en lo sucesivo como “TT1”;

Q-Y-1-K-A-N-S-K-F-I-G-I-T-E-L, designado en lo sucesivo como “P2”; F-N-N-F-T-V-S-F-W-L-R-V-P-K-V-S-A-S-H-L-E, designado en lo sucesivo como“P30”; L-S-E-I-K-G-V-I-V-H-R-L-E-G-V, designado en lo sucesivo como “MVF”;

F-F-L-L-T-R-I-L-T-I-P-Q-S-L-N, designado en lo sucesivo como “HBV”; T-C-G-V-G-V-R-V-R-S-R-V-N-A-A-N-K-K-P-E, designado en lo sucesivo como “CSP”.

La tercera unidad del peptido quimerico une las unidades primera y segunda del peptido. La tercera unidad es un aminoacido o, preferiblemente, un peptido con una longitud aproximada de 2 hasta 15 aminoacidos, con mayor preferencia de 2 hasta 10 aminoacidos, sobre todo de 2 hasta 6 aminoacidos. El conector mas preferido comprende la secuencia de aminoacidos Gly-Pro-Ser-Leu, SEQ ID n° 20.

La presente invencion tambien proporciona peptidos de VEGF multivalentes, tal como se definen en la reivindicacion 4, que comprenden varios, es decir al menos dos, de los presentes epftopos de VEGF o equivalentes antigenicos o

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funcionales del mismo y un epftopo de celulas Th. Los epftopos de VEGF y el epftopo de celulas Th estan unidos a una estructura central de laminas p. Esta estructura comprende dos cadenas de restos alternantes de leucina y lisina unidas por un conector. El conector es un aminoacido o, preferiblemente, un peptido con una longitud aproximada de 2 hasta 15 aminoacidos, con mayor preferencia de 2 hasta 10 aminoacidos, sobre todo de 2 hasta 6 aminoacidos. El conector mas preferido comprende la secuencia de aminoacidos Gly-Pro-Ser-Leu, SEQ ID n° 20.

La presente invencion tambien se refiere a una composicion inmunogenica, como la definida en la reivindicacion 10 u 11, que contiene una mezcla de epftopos de VEGF, un peptido quimerico de VEGF o un peptido multivalente de VEGF y un vehmulo farmacologicamente aceptable. En un aspecto, el vehmulo es una microesfera biodegradable. Estas composiciones inmunogenicas sirven para tratar malignidades asociadas a la sobreexpresion de la protema VEGF.

La presente invencion tambien se refiere a polinucleotidos como los definidos en la reivindicacion 12 o 13, que codifican al menos uno de los epftopos de VEGF arriba descritos. Dichos polinucleotidos sirven para preparar el epftopo mediante tecnicas de recombinacion. La presente invencion tambien se refiere a polinucleotidos aislados que poseen una secuencia codificadora de un peptido celular quimerico de VEGF. Dichos polinucleotidos tambien son utiles en una composicion inmunogenica (como p.ej. una vacuna de ADN) para tratar o prevenir malignidades relacionadas con la sobreexpresion de la protema VEGF. Estas composiciones inmunogenicas se administran preferiblemente por via intramuscular.

DESCRIPCION BREVE DE LAS FIGURAS

La figura 1 muestra sueros de alto tftulo que reconocen el epftopo de celulas B (VEGF) y el inmunogeno (MVF- VEGF) resultante de la inmunizacion activa con peptidos VEGF. ELISA de sueros de conejo blanco de Nueva Zelanda contra VEGF que pone de manifiesto tftulos > 1:500.000 a las 4 semanas de la segunda vacunacion de recuerdo (3y+4).

La figura 2 demuestra que los anticuerpos del peptido VEGF reconocen rhVEGF por ELISA. Comparacion entre sueros preinmunes de conejo antes de la vacunacion (barra 1) y sueros de ratones vacunados con peptidos VEGF (barras 2-4). Las barras 2 y 3 representan sueros de conejo 1 a las 3 y 4 semanas de la segunda vacunacion de recuerdo (3y+3 y 3y+4, respectivamente). La barra 4 representa sueros de conejo 2 a un similar sangrado.

La figura 3 muestra un Western blot de rhVEGF identificado con (A) anticuerpo del peptido VEGF o (B) Ab-4, un anticuerpo monoclonal de VEGF, que demuestra el reconocimiento del apropiado dfmero proteico recombinante a 42kDa.

La figura 4 demuestra por citometna de flujo con el empleo de celulas HUVEC que los anticuerpos del peptido VEGF interrumpen la interaccion normal VEGF-VEGFR, posiblemente por disminucion de VEGF. (A) Evaluacion de los controles positivo (PC), negativo (NC) y de anticuerpo inhibidor (IC) en el ensayo de Fluorokine® y (B) el mismo PC y NC de (A) mas el empleo de anticuerpos de raton o de conejo contra el peptido VEGF, que pone de manifiesto la interrupcion de la interaccion normal VEGF-VEGFR. El anticuerpo de conejo, etiquetado como “combo”, representa anticuerpos de conejo contra el peptido VEGF tras la inmunizacion, tanto con el inmunogeno MVF-VEGF como con otro inmunogeno no descrito en esta investigacion.

La figura 5 demuestra que los anticuerpos del peptido VEGF interrumpen la angiogenesis en Matrigel®. Se inyectaron ratones C57BL/6 por via subcutanea con Matrigel® incubada con rhVEGF y con o sin anticuerpos de VEGF. A los 10 dfas se retiraron los tapones, se tineron y se conto la invasion vascular sangumea. Comparada con el control de PBS, la adicion de anticuerpos del peptido VEGF interrumpe significativamente la angiogenesis in vivo. Ampliacion 40x, tincion con Hoechst 33342.

La figura 6 demuestra que los anticuerpos del peptido VEGF interrumpen la angiogenesis en Matrigel®. Se inyectaron ratones C57BL/6 por via subcutanea con Matrigel® incubada con rhVEGF y con o sin anticuerpos del peptido VEGF. A los 10 dfas se retiraron los tapones, se tineron y se conto la invasion vascular sangumea. Comparada con el control de PBS, la adicion de anticuerpos del peptido VEGF interrumpe significativamente la angiogenesis in vivo. Cada barra representa el promedio (± ESM) de un grupo de tres ratones.

La figura 7 es un grafico que muestra anticuerpos anti-peptido de conejo contra epftopos inmunogenicos de (A) VEGF y (B) EGVEGF, con y sin la adicion de la protema de fusion del virus del sarampion (MVF).

La figura 8 muestra la interrupcion (A) y el acortamiento (B) de los ciclos estrogenicos, asf como (C) un descenso del numero de foftculos primordiales en la inmunizacion pasiva con anticuerpos anti-VEGF en un modelo murino. La figura 9 demuestra que los anticuerpos (A) anti-peptido VEGF y (B) anti-peptido EG-VEGF reconocen rhVEGF y rhEG-VEGF.

La figura 10 muestra Western blots de rhVEGF (A y B) identificados con anticuerpo (A) anti-peptido VEGF y (B) Ab-4, un anticuerpo monoclonal anti-VEGF. Western blot de rhEG-VEGF (C y D) identificado con (C) anticuerpo de conejo anti-peptido EG-VEGF y (D) anticuerpo de conejo “combinado” anti-peptido VEGF/anti-peptido EGVEGF, demostrando todos ellos el reconocimiento de la protema recombinante apropiada.

La figura 11 muestra los resultados de un ensayo de Fluorokine para evaluar las propiedades funcionales de los anticuerpos anti-peptido VEGF. (A) Evaluacion de los controles positivo (PC), negativo (NC) y de anticuerpo inhibidor (IC) en el ensayo de Fluorokine y (B) el mismo PC y NC de (A) mas el empleo de anticuerpos de raton o de conejo contra el peptido VEGF, asf como el anticuerpo combinado anti-peptido VEGF/anti-peptido EG-VEGF, que pone de manifiesto la interrupcion de la interaccion VEGF-receptor de VEGF.

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La figura 12 muestra la inyeccion subcutanea de (A) matrigel y (B) matrigel combinada con rhVEGF, tenida con anticuerpo conjugado con CD31: ficoeritrina, que demuestra el aumento de angiogenesis en ratones C57/BL6.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA PRESENTE INVENCION

La presente invencion se describe seguidamente haciendo referencia a formas de ejecucion mas detalladas y de manera ocasional a las figuras adjuntas. No obstante la presente invencion puede adoptar otras formas de ejecucion y no debe interpretarse como limitada a las que aqrn se exponen, las cuales se ofrecen para que esta revelacion resulte minuciosa y completa y transmita plenamente el alcance de la presente invencion a los especialistas en la materia.

A no ser que se definan de otra manera, todos los terminos tecnicos y cientfficos aqrn utilizados tienen el significado comunmente entendido por el especialista en la materia a la cual pertenece la presente invencion. La terminologfa empleada en la exposicion de la presente invencion solo sirve para describir formas de ejecucion particulares y no pretende limitarla. Tal como se usan en la descripcion de la presente invencion y en las reivindicaciones adjuntas las formas en singular “un”, “una” y “el”, “la” tambien incluyen las formas en plural, si el contexto no indica claramente lo contrario.

Si no se indica lo contrario, todos los numeros que expresan cantidades de ingredientes, condiciones de reaccion, etc. utilizados en la descripcion y en las reivindicaciones deben entenderse como modificables en todos los casos por el termino “aproximadamente”. Por tanto, de no indicarse lo contrario, los parametros numericos expuestos en la siguiente descripcion y en las reivindicaciones adjuntas son aproximaciones que pueden variar en funcion de las propiedades que deseen obtenerse mediante la presente invencion. Por lo menos y sin pretender limitar la aplicacion de la doctrina de equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parametro numerico debe ser interpretado segun el numero de dfgitos significativos y las aproximaciones corrientes por redondeo.

Aunque los intervalos y parametros numericos que establecen el amplio alcance de la presente invencion sean aproximaciones, los valores numericos revelados en los ejemplos espedficos estan indicados con la mayor precision posible. No obstante cualquier valor numerico contiene ciertos errores inherentes derivados inevitablemente de la desviacion estandar encontrada en sus respectivas mediciones de los ensayos. Cada intervalo numerico indicado a lo largo de esta exposicion incluira el rango mas estrecho comprendido en el intervalo numerico mas amplio, como si todos los rangos numericos mas estrechos figuraran expresamente escritos en dicho intervalo.

A lo largo de esta revelacion se hara referencia a compuestos conforme a la presente invencion. La referencia a tales compuestos en la descripcion y en las reivindicaciones incluye esteres y sales de dichos compuestos. Asf, aunque no esten enumerados expftcitamente, dichos esteres y sales se consideran contemplados y englobados por la referencia a los propios compuestos.

Asimismo, tal como se usan aqrn, “peptido”, “polipeptido” y “protema” son terminos intercambiables y se emplearan indistintamente. “Peptido/polipeptido/protema” se puede emplear para referirse a cualquiera de los tres y la mencion de uno de ellos contempla los otros dos, es decir, no se pretende limitar el tamano del poftmero de aminoacidos (peptido, polipeptido o protema) que puede expresarse con el uso de la presente invencion. Ademas la mencion de “protema” se refiere globalmente a enzimas, hormonas, receptores, canales, moleculas de senalizacion intracelular y protemas con otras funciones. Las protemas multimericas tambien se pueden preparar segun la presente invencion.

Aunque a lo largo de esta revelacion se habla de aminoacidos de procedencia natural tambien se contemplan y caen dentro del alcance de la presente invencion aminoacidos no naturales o modificados. En efecto, tal como se usa aqrn “aminoacido” se refiere a aminoacidos naturales, aminoacidos no naturales y analogos de aminoacidos, todos ellos en sus formas estereoisomeras D y L. Los aminoacidos naturales incluyen alanina (A), arginina (R), asparagina (N), acido aspartico (D), cistema (C), glutamina (Q), acido glutamico (E), glicina (G), histidina (H), isoleucina (I), leucina (L), lisina (K), metionina (M), fenilalanina (F), prolina (P), serina (S), treonina (T), triptofano (W), tirosina (Y), valina (V), hidroxiprolina (O y/o Hyp), isoditirosina (IDT) y di-isoditirosina (di-IDT). La hidroxiprolina, la isoditirosina y la di-isoditirosina se forman postranslacionalmente. Se prefiere el uso de aminoacidos naturales, en particular de los 20 aminoacidos codificados geneticamente.

La presente invencion proporciona peptidos como los definidos en la reivindicacion 1 o 4, los cuales son epftopos inmunogenicos de la protema VEGF humana y de la protema EG-VEGF humana, y se designan colectivamente de aqrn en adelante como “epftopos de VEGF”.

Los epftopos de VEGF y sus equivalentes antigenicos son capaces de provocar una respuesta humoral que tiene como consecuencia la produccion de anticuerpos inmunorreactivos con la protema VEGF humana recombinante y/o con la protema EG-VEGF humana. Los epftopos de VEGF comprenden peptidos que tienen una de las secuencias designadas en lo sucesivo “secuencias de referencia”, tal como las descritas anteriormente. Las secuencias de referencia se seleccionaron y registraron mediante analisis asistido por ordenador, utilizando seis correlatos de antigenicidad: (a) los perfiles de flexibilidad y movilidad de cadena de cada secuencia se calcularon conforme a Karplus y Schultz, Naturwiss 72:212-213, 1985; (b) los perfiles hidrofobos se generaron sobre un tramo limitado de

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siete residuos y al final se nivelaron con un tramo de tres residuos, usando la escala de Kyte y Doolittle, J. Mol. Biol. 157:105-132, 1982; (c) los perfiles hidrofilos se generaron sobre una ventana de 6 residuos, usando el programa de Hopp y Woods, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3824-3828, 1981; (d) el analisis de la exposicion al agua de un resto de aminoacido, usando una sonda de 1,4 A, se realizo por el algoritmo de Rose de exposicion al disolvente, Science 229:834-838, 1985; (e) los indices de protrusion que predicen las porciones de las protemas que son accesibles y protruyen al disolvente se calcularon por el metodo de Thornton, EMBO J. 5:409-413, 1986; (f) la probabilidad de que una secuencia de cinco residuos fuera antigenica se determino por el metodo de Welling, FEBS Lett 188:215218, 1985. La premisa basica es que los algoritmos utilizados en las predicciones siempre localizaran regiones de superficie expuesta en la protema y por tanto con mayor probabilidad de implicarse en la fijacion de anticuerpos.

A las secuencias se les asigno una puntuacion de 1 hasta 6 basada en los valores de sus respectivos indices y se clasificaron del siguiente modo: las secuencias de rango mas alto obtuvieron la mayor puntuacion en los analisis examinados (6/6) y las sucesivas opciones la subsiguiente puntuacion mas elevada (5/6), etc. A continuacion los epftopos mejor puntuados se clasificaron por correlacion con sus atributos estructurales secundarios; se prefiere p.ej. una secuencia anfifflica a-helicoidal o una region bucle de giro p antes que un fragmento de espiral aleatoria. Para predecir la estructura secundaria (helice a, lamina/hebra p, bucle de 3 giros, espiral aleatoria) y el momento anfifflico helicoidal se usaron programas de ordenador de Chou y Fasman, Adv. Enzymol. Relat. Subj. Biochem. 47: 45-148, 1978. Tambien se tuvieron en cuenta los pares electrostaticos ionicos y la interaccion helice-dipolo en el segmento helicoidal (p.ej. el balance hidrofobo / hidrofilo). El balance hidrofobo / hidrofilo es preferiblemente de 2/2 hasta 4/1.

Tal como se ha expuesto aqrn, los epftopos celulares de VEGF tambien comprenden peptidos que son antigenicos y equivalentes funcionales de los peptidos arriba descritos. Estos equivalentes funcionales tienen una secuencia alterada por sustitucion, eliminacion o adicion de uno o mas aminoacidos en la respectiva secuencia de referencia. Por ejemplo los residuos de cistema se pueden eliminar o sustituir por otros aminoacidos, a fin de evitar la formacion de puentes disulfuro intramoleculares incorrectos tras la renaturalizacion.

Aunque es posible tener sustituciones no conservadoras de aminoacidos, se prefiere, exceptuando las sustituciones hechas para reemplazar la cistema, que los cambios de aminoacidos sean conservadores, de tal manera, que el aminoacido sustituyente tenga propiedades estructurales o qmmicas analogas al correspondiente aminoacido de la secuencia de referencia. Por ejemplo, las sustituciones conservadoras de aminoacidos implican el cambio de un aminoacido alifatico o hidrofobo, como p.ej. alanina, valina, leucina e isoleucina, por otro analogo; la sustitucion de un aminoacido hidroxilado, como p.ej. serina y treonina, por otro analogo; la sustitucion de un residuo acido, como p.ej. acido glutamico o acido aspartico, por otro analogo; la sustitucion de un residuo airftdico, como p.ej. asparagina y glutamina, por otro analogo; la sustitucion de un residuo aromatico, como p.ej. fenilalanina y tirosina, por otro analogo; la sustitucion de un residuo basico, como p.ej. lisina, arginina e histidina, por otro analogo y la sustitucion de un aminoacido corto, como p.ej. alanina, serina, treonina, metionina y glicina, por otro analogo.

Las eliminaciones y adiciones estan localizadas preferiblemente junto al grupo amino terminal, junto al grupo carboxilo terminal, o ambos, de una de las secuencias mostradas anteriormente. Como resultado de las alteraciones el equivalente funcional del epftopo de VEGF tiene una secuencia de aminoacidos identica a las correspondientes secuencias de referencia en al menos un 70%, preferiblemente en al menos un 80%, con mayor preferencia en al menos un 90%, sobre todo en al menos un 95%. Las secuencias que son al menos un 90% identicas no tienen mas de una alteracion - es decir cualquier combinacion de eliminaciones, adiciones o sustituciones - por 10 aminoacidos de la secuencia de referencia. El porcentaje de identidad se determina comparando la secuencia de aminoacidos de la variante con la secuencia de referencia, utilizando el proyecto MEGALIGN del programa DNA STAR.

Para los equivalentes funcionales de longitud superior a la correspondiente secuencia de referencia se prefiere que su secuencia sea al menos un 90% identica a la secuencia de referencia y a las secuencias que flanquean la secuencia de referencia en el VEGF natural o en la protema de EG-VEGF. Ademas de ser un equivalente antigenico del epftopo del VEGF humano de origen natural, el equivalente funcional tambien es capaz de inducir anticuerpos que interrumpen la union del VEGF humano o de la EG-VEGF al receptor de VEGF.

Preparacion de epftopos y peptidos quimericos colineales

Los epftopos de VEGF, los peptidos de VEGF quimericos de la presente invencion y los peptidos multivalentes de VEGF se sintetizan de modo preferente mediante el uso de sintetizadores de peptidos comercialmente disponibles. Se emplean preferiblemente los metodos qrnmicos descritos en Kaumaya y otros, “DE NOVO” ENGINEERING OF PEPTIDE IMMUNOGENIC AND ANTIGENIC DETERMINANTS AS POTENTIAL VACCINES [Ingenieria de inmunogenos peptidicos y determinates antigenicos como vacunas potenciales], in Peptides, Design, Synthesis and Biological Activity (1994), pp 133-164, que se incorpora espedficamente aqrn como referencia.

Los epftopos y peptidos quimericos de VEGF tambien se pueden producir mediante sistemas de traduccion libres de celulas y moleculas de ARN derivadas de constructos de ADN que codifican el epftopo o peptido. Alternativamente los epftopos o peptidos quimericos de VEGF se preparan transfectando celulas huesped con vectores de expresion que comprenden una secuencia de ADN codificadora del respectivo epftopo o peptido quimerico e induciendo luego

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la expresion del polipeptido en las celulas huesped. Para la produccion recombinante se introducen en las celulas huesped constructos recombinantes que comprenden una o mas de las secuencias codificadoras del epftopo, del peptido quimerico o de una variante de ellos, empleando metodos convencionales tales como la transfeccion con fosfato calcico, transfeccion mediada por DEAE-dextrano, transveccion, microinyeccion, transfeccion cationica mediada por ftpidos, electroporacion, transduccion, carga por raspado, introduccion baftstica o infeccion.

Los epftopos y peptidos quimericos de VEGF se pueden expresar en celulas huesped adecuadas tales como, por ejemplo, celulas de mairnferos, levaduras, bacterias, celulas de insectos u otro tipo de celulas bajo el control de promotores apropiados, empleando tecnicas convencionales. Como huespedes adecuados cabe mencionar, sin limitarse a ellas, E. coli, P. pastoris, celulas Cos y celulas 293 HEK. Despues de transformar la cepa huesped idonea y cultivarla hasta una densidad celular apropiada, las celulas se recogen por centrifugacion, se rompen por medios ffsicos o qmmicos y el extracto crudo resultante se retiene para la posterior purificacion del epftopo o del peptido quimerico.

Para aislar protemas recombinantes de celulas huesped transformadas se pueden emplear metodos convencionales tales como el aislamiento mediante la extraccion inicial del precipitado celular o del medio de cultivo de las celulas, seguido de precipitacion salina y una o mas etapas cromatograficas, incluyendo cromatograffa de intercambio ionico acuoso, cromatograffas de exclusion de tamanos, cromatograffa ffquida de alto rendimiento (HPLC) y cromatograffa de afinidad. Para producir epftopos y peptidos quimericos glicosilados es preferible utilizar tecnicas recombinantes. Para producir epftopos y peptidos quimericos glicosilados que contienen lo mismo es preferible utilizar celulas de marnffero como Cos-7 y Hep-G2 en las tecnicas recombinantes.

Las variantes naturales de epftopos de VEGF arriba citadas tambien se pueden aislar, por ejemplo, cribando un ADNc apropiado o una biblioteca genomica con una secuencia de ADN que codifique el polipeptido.

Identificacion de equivalentes funcionales del peptido de VEGF

Los equivalentes funcionales de los epftopos de VEGF arriba indicados pueden identificarse en general modificando la secuencia del epftopo y ensayando luego la capacidad del polipeptido resultante para estimular una respuesta inmunitaria, como p.ej. la produccion de anticuerpos. Por ejemplo, estos ensayos se pueden realizar preparando un peptido quimerico que comprenda el polipeptido modificado y un epftopo promiscuo de celulas Th, inyectando el peptido quimerico en un animal de experimentacion y buscando los anticuerpos. Dichos anticuerpos se pueden encontrar en varios fluidos corporales, incluyendo sueros y ascitis. Resumiendo, se extrae una muestra de fluido corporal de un animal de sangre caliente, tal como un humano, del cual se quiere determinar si lleva anticuerpos espedficos de VEGF humano. El fluido corporal se incuba con la protema humana VEGF o EGVEGF en condiciones y tiempo suficiente para permitir la formacion de inmunocomplejos entre el polipeptido y los anticuerpos espedficos de la protema y luego se analiza, preferiblemente mediante una tecnica ELISA. En esta tecnica se mide el cambio colorimetrico a 490 nm. Se prefieren los epftopos inductores de la produccion de anticuerpos que presentan un tftulo igual a 10.000 o superior para la protema humana VEGF o EGVEGF. Tal como se usa aqrn, un tftulo de 10.000 se refiere a un valor de absorbancia de 0,2 por encima del fondo.

Los equivalentes funcionales del epftopo de VEGF tambien se identifican determinando si el peptido puede usarse para inducir anticuerpos que interrumpan la union del VEGF humano al receptor de VEGF humano, tal como se describe mas abajo en el ejemplo 1.

Determinacion de las dosis optimas para inhibir la angiogenesis o tratar el cancer

Tambien se pueden usar metodos in vivo para caracterizar los equivalentes funcionales de los presentes epftopos o para determinar las dosis optimas de los peptidos quimericos y multivalentes de VEGF. En un aspecto se puede usar un modelo de injerto heterologo. En este modelo se crean tumores subcutaneos con una lmea celular de cancer ovarico (SKOV3), inyectando 2 x 106 celulas tumorales mezcladas con matrigel en el flanco derecho de ratones BALB/c affmicos desnudos. Se deja que los tumores alcancen un tamano de 150-200 mm3 y despues los ratones se distribuyen al azar para que reciban una inyeccion intraperitoneal de anticuerpos anti-VEGF o anti-EG-VEGF o de anticuerpos IgG no espedficos (control) cada 3 dfas. Cada dos semanas se miden y se calculan los volumenes de los tumores. La permeabilidad tumoral se valora mediante el ensayo de Miles, en el cual los ratones tratados y los de control reciben una inyeccion intracardiaca con solucion de azul de Evans. Luego se sacrifican los animales, se fotograffan, y se compara la proporcion de permeabilidad entre los ratones tratados y los de control. Se extrae el tapon de matrigel y se examina la densidad vascular por inmunohistoqdmica con CD31.

Luego se investiga in vivo la inmunizacion activa con las vacunas pepffdicas de VEGF y EG-VEGF. La investigacion anterior ha demostrado que la introduccion de celulas de cancer ovarico SKOV3 (10 X 106 celulas en 200 pl de PBS) en la cavidad peritoneal de ratones hembra inmunodeficientes (BALB/c nu/nu) conduce a un estado clmico identico al encontrado en mujeres con cancer ovarico avanzado, incluyendo la formacion de tumores que cubren la superficie de organos intraperitoneales y el desarrollo de ascitis muy voluminosas a las 4 semanas de la inoculacion [9]. La inyeccion subcutanea de celulas SKOV3 (10 x 106 celulas en 50 pl de PBS) produce probablemente un tumor medible a los 10 dfas de la inoculacion. Para determinar la eficacia in vivo de la inmunizacion pepffdica contra los

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tumores ovaricos se puede estudiar una combinacion de ambas inyecciones - subcutanea e intraperitoneal - de celulas SKOV3.

Se vacunan grupos de 10 ratones con los epftopos de VEGF y EG-VEGF, tres veces, a intervalos de 3 semanas. Los tftulos de los anticuerpos se controlan por ELISA. Tres semanas despues de la tercera vacunacion los ratones se exponen a celulas SKOV3. Los tumores subcutaneos se miden semanalmente con calibradores y sus volumenes se estiman basandose en la suposicion de que sean esfericos. Como el crecimiento de los tumores intraperitoneales no se puede medir directamente, los ratones se matan por sobredosis de anestesia aproximadamente 4 semanas despues de la inoculacion y se registra la localizacion y el tamano del tumor, y la presencia de ascitis.

Otra prueba del efecto anti-angiogenico de los anticuerpos anti-VEGF educidos es la inhibicion por el anticuerpo de la ovulacion subsiguiente a la estimulacion mediante gonadotropinas. Como la ovulacion se regula a traves de estfmulos angiogenicos 18], se cree que la eficacia anti-angiogenica de los anticuerpos anti-peptido interrumpina la ovulacion. En este experimento se inmunizan grupos de ratas Sprague-Dawley hembra de 24 dfas de edad con anticuerpos anti-peptido contra VEGF, EG-VEGF, VEGF y EG-VEGf, o con anticuerpo no espedfico (control). A las cuatro de las inmunizacion las ratas se tratan con 20 UI de gonadotropina de suero de yegua prenada (PMSG) y 24 horas mas tarde con 20 UI de gonadotropina corionica humana (hCG), la secuencia hormonal estimulante que conduce a la ovulacion. Despues de 5 dfas se matan las ratas y se valora la eficacia inhibidora de la ovulacion. Se cree que en las ratas tratadas con anticuerpos anti-peptido la ovulacion se inhibira eficientemente y en comparacion con los animales de control se vera una disminucion del peso ovarico, alteraciones del ciclo estrogenico, un menor crecimiento folicular y una menor inmunotincion con CD31.

La actividad in vivo de las vacunas peptfdicas de VEGF tambien se puede valorar en un modelo murino transgenico que exprese VEGF humano bajo el control del promotor de insulina de rata (Rip1 VEGF-A) [20]. En este modelo se demostro que la sobreexpresion de VEGF aceleraba la aparicion de angiogenesis tumoral y que se desarrollaban tumores espontaneos en un periodo de 10 semanas (raton transgenico simple, RIP1Tag2) y 14 semanas (raton transgenico doble, Rip1Tag2/Rip1 VEGF-A). En este estudio los ratones se inmunizan con epftopos de VEGF o EG- VEGF en un programa comprimido para coincidir con el desarrollo tumoral del raton transgenico (inmunizacion inicial a las 5 semanas con refuerzo a las 7 y 9 semanas). Despues se sacrifican los ratones y se calculan los volumenes de los tumores. Los tumores se fijan embebidos en OCT, se congelan rapidamente y se analizan por tincion H&E. La densidad vascular se puede determinar por inmunotincion con CD31. Cabe esperar que la vacunacion peptfdica de VEGF contribuya a evitar o inhibir la formacion de tumores en este modelo murino transgenico que sobreexpresa VEGF y que disminuyan las angiogenesis alternativas.

Polinucleotidos

La presente invencion tambien proporciona polinucleotidos aislados que codifican los epftopos de VEGF y los peptidos quimericos de la presente invencion. Estos polinucleotidos tambien incluyen los que tienen secuencias capaces de hibridarse a las secuencias nucleotidas en condiciones rigurosas, preferiblemente muy rigurosas. Las condiciones de hibridacion estan basadas en la temperatura de fusion (Tf) del complejo de union o sonda del acido nucleico, tal como esta descrito en Berger y Kimmel (1987) Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, vol 152, Academic Press. Tal como se emplea aqrn, la expresion “condiciones rigurosas” se refiere a la “rigurosidad” en un margen aproximado de Tf -5 (5° por debajo de la temperatura de fusion de la sonda) hasta 20°C por debajo de Tf. Tal como se emplea aqrn, la expresion condiciones “muy rigurosas” se refiere al uso de al menos un tampon SSC 0,2 x y al menos 65°C. Tal como se admite en el estado tecnico, las condiciones rigurosas se pueden conseguir variando una serie de factores como la longitud y la naturaleza, es decir ADN o ARN, de la sonda; la longitud y la naturaleza de la secuencia diana, la concentracion de las sales y de otros componentes tales como formamida, sulfato de dextrano y polietilenglicol en la solucion de hibridacion. Todos estos factores se pueden variar para crear unas condiciones de rigurosidad equivalentes a las condiciones arriba mencionadas.

Los polinucleotidos que comprenden secuencias codificadoras de un epftopo de VEGF o de un peptido quimerico de la presente invencion se pueden sintetizar en su totalidad o en parte mediante metodos qrnmicos o, preferiblemente, metodos recombinantes conocidos en el estado tecnico. Los polinucleotidos que codifican un VEGF se pueden obtener cribando una biblioteca genomica o de ADNc con anticuerpos espedficos, para identificar los clones que contienen el polinucleotido en cuestion.

Los polinucleotidos sirven para producir un epftopo de VEGF B, un peptido quimerico o un peptido multivalente. Por ejemplo, una molecula de ARN codificadora de un peptido quimerico se usa en sistemas de traduccion libres de celulas para preparar dicho polipeptido. Como alternativa, una molecula de ADN codificadora de un epftopo de VEGF o de un peptido quimerico se introduce en un vector de expresion y se utiliza para transformar las celulas. Los vectores de expresion adecuados incluyen, por ejemplo, secuencias de ADN cromosomico, no cromosomico y sintetico, p.ej. derivados de SV40, plasmidos bacterianos, ADN fagicos, plasmidos de levaduras, vectores derivados de combinaciones de plasmidos y ADN fagicos, ADN virales tales como virus vacuna, adenovirus, virus de la viruela aviar, pseudorrabia, baculovirus y retrovirus. La secuencia de ADN se introduce en el vector de expresion mediante procedimientos convencionales.

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Por tanto, la presente descripcion tambien se refiere a constructos recombinantes que comprenden una o mas de las presentes secuencias de polinucleotidos. Como constructos adecuados cabe citar, por ejemplo, vectores tales como un plasmido, fagemido o vector viral en los cuales se ha insertado una secuencia que codifica el epftopo de VEGF o el peptido quimerico. En el vector de expresion la secuencia de ADN que codifica el epftopo o el peptido quimerico se une operativamente a una secuencia de control de expresion, es decir a un promotor que dirige la smtesis de ARNm. Como ejemplos representativos de tales promotores cabe citar el promotor LTR o SV40, el promotor E. coli lac or trp, el promotor fago lambda PL y otros promotores conocidos que controlan la expresion de genes en celulas procariotas o eucariotas o en virus. El vector de expresion tambien contiene preferiblemente un sitio de union de ribosoma para iniciar la traduccion y un terminador de transcripcion. Los vectores de expresion recombinantes tambien incluyen preferiblemente un origen de replicacion y un marcador seleccionable, como por ejemplo el gen de resistencia a la ampicilina de E. coli para permitir la seleccion de celulas transformadas, es decir las celulas que estan expresando las secuencias de ADN heterologo. La secuencia polinucleotida que codifica el epftopo de VEGF o el peptido quimerico se incorpora al vector en un marco con secuencias de inicio y final de traduccion. Ademas el polinucleotido codifica preferiblemente una secuencia senalizadora que esta unida operativamente al extremo amino del epftopo de VEGF o del peptido quimerico.

Los polinucleotidos que codifican el epftopo de VEGF o EG-VEGF o los peptidos quimericos que comprenden tales epftopos se emplean para expresar peptidos recombinantes, utilizando tecnicas bien conocidas del estado tecnico. Dichas tecnicas estan descritas en Sambrook, J. y otros (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. y en Ausubel, F. M. y otros (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wile & Sons, New York, NY. Los polinucleotidos que codifican el epftopo de VEGF o EG-VEGF o los peptidos quimericos que comprenden tales epftopos tambien se usan para inmunizar animales.

Composiciones farmaceuticas

Las composiciones farmaceuticas que comprenden mezclas de epftopos de VEGF y/o de epftopos de EG-VEGF, peptidos quimericos de VEGF o de EG-VEGF y peptidos multivalentes de VEGF o de EG-VEGF o los polinucleotidos que los codifican se formulan preferentemente para uso como composicion farmaceutica (p.ej. una composicion inmunogena o una vacuna). Estas composiciones llevan en general uno o mas de los presentes epftopos de VEGF y/o de EG-VEGF, uno o mas de los presentes peptidos quimericos de VEGF y/o de EG-VEGF o uno o mas de los presentes peptidos multivalentes de VEGF o de EG-VEGF o los polinucleotidos que los codifican, en combinacion con un vehftculo, excipiente o diluyente farmaceuticamente aceptable. A las dosis y concentraciones empleadas dichos vehfculos no debe ser toxicos para los receptores.

Ademas de los epftopos, de los peptidos multivalentes y de los peptidos quimericos (que actuan como antfgenos) o del polinucleotido que los codifica se incluyen preferiblemente en la composicion farmaceutica otros componentes tales como un vehfculo para la administracion del antfgeno y sustancias inmunoestimulantes para potenciar la inmunogenicidad de la protema. Como ejemplos de vehfculos para la administracion de antfgenos cabe mencionar sales de aluminio, emulsiones agua-en-aceite, vehfculos oleosos biodegradables, emulsiones aceite-en-agua, microcapsulas biodegradables y liposomas. Para las vacunas que llevan el peptido quimerico un vehfculo potencial de administracion de antfgenos es una microesfera biodegradable formada preferiblemente por poli(D,L-lactida-co- glicolida) (PLGA).

Aunque en las composiciones farmaceuticas de la presente invencion se puede usar cualquier vehfculo adecuado conocido de los especialistas, el tipo de vehfculo puede variar en funcion del modo de administracion y de si se desea una liberacion sustancial. Para una administracion parenteral tal como la inyeccion subcutanea el vehfculo comprende preferiblemente agua, suero fisiologico, alcohol, una grasa, una cera o un tampon. Como vehfculo de las composiciones farmaceuticas de la presente invencion tambien se pueden usar microesferas biodegradables (p.ej. galactida polilactica). Opcionalmente la composicion farmaceutica incluye un adyuvante.

Las mezclas de epftopos de VEGF, los peptidos quimericos y multivalentes y los polinucleotidos que los codifican sirven para potenciar o educir una respuesta humoral en un sujeto o en una lrnea celular y preferiblemente una respuesta inmunitaria celular (p.ej. la produccion de celulas T citolfticas espedficas del antfgeno). Tal como se emplea aqrn, el termino “sujeto” se refiere a cualquier animal de sangre cliente, preferiblemente un humano. Puede tratarse de un sujeto afectado de un cancer como el ovarico o de un sujeto normal (es decir, sin enfermedad e infeccion detectables). La composicion farmaceutica es especialmente util para tratar mujeres que tienen antecedentes familiares de cancer ovarico o que han sido diagnosticadas de este cancer.

Metodos de tratamiento

Tambien se proporcionan metodos para tratar un cancer relacionado con la sobreexpresion del VEGF. Por “tratamiento” se entiende la inhibicion o la ralentizacion o el retardo del crecimiento del tumor. Dichos canceres incluyen el ovarico. El metodo consiste en administrar a un sujeto una composicion farmaceutica que lleve una mezcla de epftopos de VEGF y/o de EG-VEGF, uno o mas peptidos quimericos de VEGF o uno o mas peptidos multivalentes de VEGF de la presente invencion. Para administrar la composicion farmaceutica es preferible utilizar inyecciones intramusculares a intervalos de tres semanas.

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Tambien se proporcionan metodos para inhibir la angiogenesis en los tejidos de crecimiento rapido de un sujeto. Los metodos consisten en administrar al sujeto una mezcla de epttopos de VEGF y/o de EG-VEGf de la presente invencion, uno o mas peptidos quimericos de VEGF y/o de EG-VEGF de la presente invencion, uno o mas polipeptidos multivalentes de VEGF y/o de EG-VEGF de la presente invencion o polinucleotidos que los codifiquen.

Los peptidos de la presente invencion se refieren a los peptidos representativos arriba descritos y a variantes antigenicamente relacionadas de estos peptidos. Las “variantes antigenicamente relacionadas” de estos peptidos pueden ser variantes naturales o variantes modificadas de manera artificial que imitan inmunologicamente el epttopo de VEGF o de EG-VEGF arriba descrito. Estas variantes modificadas artificialmente se pueden preparar por smtesis qrnmica o por tecnicas mutagenicas de ADN recombinante bien conocidas de los expertos en la materia (vease por ejemplo el capftulo 15 de Sambrook y otros, “Molecular Cloning a Laboratory Manual” (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Las variantes antigenicamente relacionadas de los peptidos deben tener una identidad minima del 75% con uno de los epftopos de VEGF o de EG-VEGF anteriormente descritos (con mayor preferencia del 85% y sobre todo del 95%, como mmimo) y mantener la capacidad de imitar inmunologicamente el correspondiente sitio determinante de la antigenicidad de la protema VEGF o EG-VEGF humana.

Para la presente invencion, la expresion “imitar inmunologicamente el correspondiente sitio determinante de la antigenicidad de la protema VEGF o EG-VEGF” se refiere a un (variante) peptido capaz de inducir anticuerpos que reconozcan espedficamente una de las secuencias de epftopos naturales arriba descritas y/o en el caso de la protema VEGF o EG-VEGF entera se refiere a un (variante) peptido capaz de ser reconocido por el mismo anticuerpo inmunoespedfico que reconoce uno de los epftopos de VEGF o EG-VEGF anteriormente descritos. En la primera definicion la variante del peptido debe ser capaz de inducir dichos anticuerpos por sf misma o junto con una molecula vehicular. En la segunda definicion la variante debe ser capaz de ser reconocida por sf misma o junto con una molecula vehicular. Las variantes relacionadas antigenicamente pueden tener aminoacidos anadidos, insertados, sustituidos o eliminados. Se prefieren aquellas variantes que difieren de los referentes por sustituciones conservadoras de aminoacidos (preferiblemente una sola).

Los polipeptidos de la presente invencion se pueden preparar de cualquier manera adecuada. Estos polipeptidos incluyen los producidos de modo recombinante, sintetico o por combinacion de estos metodos. Los medios para preparar dichos polipeptidos son bien conocidos en el estado tecnico; no obstante se presentan modelos del metodo en la seccion de los ejemplos.

Polinucleotidos de la presente invencion

Los polinucleotidos de la presente invencion definidos en la reivindicacion 12 o 13 tambien se refieren a secuencias de ADN que pueden obtenerse de las secuencias de aminoacidos de los peptidos y polipeptidos segun la presente invencion, teniendo en cuenta la degeneracion del uso de codones. Esto es bien sabido en el estado tecnico, pues se trata de una informacion sobre el uso de codones en diferentes huespedes de expresion, que ayuda a optimizar la expresion recombinante de los peptidos y polipeptidos de la presente invencion.

Tambien se proporcionan polinucleotidos complementarios de todos los polinucleotidos arriba descritos.

Cuando los polinucleotidos de la presente invencion se usan para la produccion recombinante de polipeptidos de la presente invencion, el polinucleotido puede incluir la secuencia codificadora del polipeptido por sf sola o dentro de un marco de lectura con otras secuencias codificadoras tales como las que codifican una secuencia lfder o secretora, una secuencia pre-, pro- o preproproteica u otras porciones de peptidos de fusion. Por ejemplo, se puede codificar una secuencia marcadora que facilite la purificacion del polipeptido fusionado. En algunas formas de ejecucion preferidas de este aspecto de la presente invencion la secuencia marcadora es un peptido de hexahistidina como el incluido en el vector pQE (Qiagen, Inc.), descrito en Gentz y otros, Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86:821-824, o es un marcador HA o glutation-S-transferasa. el polinucleotido tambien puede contener secuencias 5' y 3' no codificadoras tales como secuencias transcritas no traducidas, senales de empalme y poliadenilacion, sitios de union de ribosoma y secuencias estabilizantes de ARNm.

Vectores, celulas huesped, expresion

La presente invencion tambien describe vectores que comprenden un polinucleotido o polinucleotidos segun la presente invencion y celulas huesped modificadas mediante ingeniena genetica con los vectores descritos en la presente invencion, asf como a la produccion de peptidos y polipeptidos de la presente invencion por tecnicas recombinantes. Para producir estas protemas tambien se pueden emplear sistemas de traduccion libres de celulas, utilizando ARN derivados de los constructos de ADN de la presente invencion.

Para la produccion recombinante, las celulas huesped se pueden manipular geneticamente a fin de incorporar sistemas de expresion (o porciones de ellos) de los polinucleotidos de la presente invencion. La introduccion de polinucleotidos en las celulas huesped se puede efectuar por metodos descritos en muchos manuales corrientes de laboratorio - por ejemplo Davis y otros, bAsIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1986), y Sambrook y otros,

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MOLECULAR CLONING: A LABORATORYMANUAL, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) - tales como la transfeccion con fosfato calcico, transfeccion mediada por DEAE-dextrano, transveccion, microinyeccion, transfeccion cationica mediada por ffpidos, electroporacion, transduccion, carga por raspado, introduccion baffstica o infeccion.

Como ejemplos representativos de celulas huesped apropiadas cabe citar celulas bacterianas como meningococos, estreptococos, estafilococos, E. coli, Streptomyces y Bacillus subtilis; celulas fungicas como las de levaduras y Aspergillus; celulas de insectos como las de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; celulas de animales tales como CHO, cOs, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK 293 y celulas del melanoma de Bowes; y celulas de vegetales.

Se puede usar una gran variedad de sistemas de expresion, incluyendo entre otros los sistemas cromosomicos, episomicos y los sistemas derivados de virus, p.ej. vectores derivados de plasmidos bacterianos, de bacteriofagos, de transposones, de episomas de levaduras, de elementos de insercion, de elementos cromosomicos de levaduras, de virus tales como los baculovirus, papovavirus como SV40, virus vacuna, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de pseudorrabia y retrovirus, y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como los derivados de elementos geneticos de plasmidos y bacteriofagos, como los cosmidos y fagemidos. Los sistemas de expresion pueden contener regiones de control que regulan y tambien generan expresion. Para producir un polipeptido en un huesped se puede utilizar generalmente cualquier sistema o vector capaz de mantener, propagar o expresar polinucleotidos. La secuencia nucleotida apropiada se puede insertar en un sistema de expresion por cualquiera de varias tecnicas bien conocidas y rutinarias, como por ejemplo las descritas en Sambrook y otros, MOLECULAR CLONING: A LABORATORYMANUAL (arriba citado).

Para secretar la protema traducida en el lumen del reffculo endoplasmatico, en el espacio periplasmatico o en el entorno extracelular se pueden incorporar senales de secrecion adecuadas al polipeptido deseado. Estas senales pueden ser endogenas respecto al polipeptido o pueden ser senales heterologas.

Purificacion de peptidos/polipeptidos expresados de manera recombinante

Los peptidos y polipeptidos de la presente invencion se pueden recuperar y purificar a partir de cultivos celulares recombinantes mediante metodos bien conocidos, incluyendo precipitacion con sulfato amonico o etanol, extraccion con acido, cromatograffa de intercambio anionico o cationico, cromatograffa en fosfocelulosa, cromatograffa de interaccion hidrofoba, cromatograffa de afinidad, cromatograffa de hidroxiapatito y cromatograffa de lecitina. Para la purificacion se usa con mayor preferencia cromatograffa ffquida de alto rendimiento. Se pueden usar tecnicas bien conocidas para replegar protemas, a fin de regenerar la conformacion activa cuando el polipeptido se desnaturaliza durante el aislamiento y o la purificacion.

Aunque la secuencia genetica del polipeptido quimerico del VEGF en el vector se puede marcar con una secuencia de histidina que ayuda a purificar el polipeptido, ello no es un elemento esencial de la presente invencion, ya que los polipeptidos sin el marcador de histidina todavfa se pueden purificar mediante una de las tecnicas arriba citadas.

Anticuerpos

Los peptidos y polipeptidos de la presente invencion o las celulas que los expresan tambien se pueden usar como inmunogenos para producir anticuerpos inmunoespedficos del VEGf o de la EG-VEGF de tipo natural. El termino “inmunoespedfico” significa que los anticuerpos tienen basicamente mayor afinidad por los peptidos o polipeptidos de la presente invencion que por otros polipeptidos afines del estado tecnico.

Los anticuerpos generados contra los peptidos o polipeptidos se pueden obtener administrando estos a un animal, preferiblemente no humano, empleando protocolos rutinarios en la inmunizacion de un animal con un anffgeno, recogiendo la sangre, aislando los anticuerpos del suero y utilizando los que reaccionan con el peptido. El suero o la fraccion de IgG que contiene los anticuerpos se pueden usar para analizar la protema. Para preparar anticuerpos monoclonales se puede emplear cualquier tecnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos continuos de lmeas celulares. Como ejemplos cabe citar la tecnica del hibridoma (Kohler, G. y Milstein, C., Nature (1975) 256:495497), la tecnica del trioma, la tecnica del hibridoma de celulas B humanas (Kozbor y otros, Immunology Today (1983) 4:72) y la tecnica del hibridoma de EBV (Cole y otros, MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985).

Las tecnicas para producir anticuerpos de cadena simple (patente U.S. n° 4,946,778) tambien se pueden adaptar para anticuerpos de cadena simple contra los peptidos o polipeptidos de la presente invencion. Asimismo se pueden usar ratones transgenicos u otros organismos, incluyendo otros mairffferos, para expresar anticuerpos humanizados.

Los anticuerpos arriba descritos se pueden utilizar para aislar o identificar clones que expresan el peptido, o para purificar los peptidos o polipeptidos de la presente invencion por cromatograffa de afinidad.

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Una composicion de vacuna contiene una cantidad inmunogenica de al menos un peptido o polipeptido de la presente invencion. La composicion tambien debena incluir preferiblemente un excipiente farmaceuticamente aceptable. La preparacion de la vacuna esta descrita de manera general en Vaccine Design (“The subunit and adjuvant approach” [El procedimiento de subunidad y adyuvante] (eds. Powell M.F. & Newman MJ). (1995) Plenum Press Nueva York).

Ademas los peptidos y polipeptidos de la presente invencion van preferiblemente coadyuvados en la formulacion de vacuna segun la presente invencion. Como coadyuvantes adecuados cabe mencionar una sal de aluminio tal como el gel de hidroxido de aluminio (alumbre) o el fosfato alummico, pero tambien puede ser una sal de calcio, hierro o cinc, o una suspension insoluble de tirosina acilada, o azucares acilados, derivados cationicos o anionicos de polisacaridos, o polifosfazenos. Otros coadyuvantes conocidos son oligonucleotidos que contienen CpG. Estos oligonucleotidos se caracterizan porque el dinucleotido CpG no esta metilado. Dichos oligonucleotidos son bien conocidos y estan descritos por ejemplo en la patente WO 96/02555.

Otros coadyuvantes preferidos son aquellos que inducen una respuesta inmunitaria, preferentemente del tipo TH1. Los niveles elevados de citocinas del tipo Th1 tienden a favorecer la induccion de respuestas inmunitarias mediadas por celulas al antfgeno dado, mientras que los niveles elevados de citocinas del tipo Th2 tienden a favorecer la induccion de respuestas inmunitarias humorales al antigeno. Los sistemas coadyuvantes adecuados incluyen, por ejemplo, monofosforil lfpido A, preferiblemente monofosforil lfpido A 3-des-O-acilado (3DMPL), o una combinacion de 3DMPL con una sal de aluminio. Los oligonucleotidos con CpG tambien inducen preferentemente una respuesta TH1. Un sistema potenciado implica la combinacion de un monofosforil lfpido A con un derivado de saponina, en particular la combinacion de QS2l y 313- MPL, tal como revela la patente WO 94/00153, o una combinacion menos reactogenica en que el QS21 se mitiga con colesterol, tal como revela la patente WO 96/33739. En la patente WO 95/17210 se describe una formulacion preferida de coadyuvante, especialmente potente, que comprende QS21 3D- MPL y tocoferol en una emulsion del tipo aceite en agua.

Un metodo para inducir una respuesta inmunologica en un mairnfero, que consiste en inocularle un peptido o polipeptido de la presente invencion que sea adecuado para producir anticuerpos capaces de inhibir la angiogenesis o el crecimiento de los tumores, entre otras cosas. Otro metodo para inducir una respuesta inmunologica en un mam^era consiste en suministrar un peptido o polipeptido de la presente invencion mediante un vector que dirige la expresion de un polinucleotido de la presente invencion in vivo, a fin de inducir una respuesta inmunologica que produzca anticuerpos para proteger dicho animal de enfermedades.

Otro aspecto de la presente invencion se refiere a una formulacion (composicion) inmunologica/vacuna, que al introducirla en un huesped marnffero induce una respuesta inmunologica al peptido VEGF o EG-VEGF en este mamffero, de modo que la composicion comprende un polinucleotido codificador de un epttopo de VEGF o de EG- VEGF o el propio epftopo de VEGF o EG-VEGF. Ademas la formulacion de la vacuna puede comprender un vehfculo adecuado. La composicion de la vacuna de VEGF se administra preferiblemente por via oral, intranasal o parenteral (incluyendo la inyeccion subcutanea, intramuscular, intravenosa, intradermica, transdermica). Las formulaciones adecuadas para la administracion parenteral incluyen soluciones esteriles, acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostaticos y solutos que vuelven la formulacion isotonica con la sangre del receptor; y suspensiones esteriles, acuosas y no acuosas, que pueden incluir agentes suspensores o espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en dosis unitarias o en recipientes multidosis, por ejemplo en ampollas y viales sellados, y se pueden almacenar liofilizadas, de manera que solo requieran la adicion del lfquido esteril inmediatamente antes del uso. La formulacion de la vacuna tambien puede incluir coadyuvantes, tal como se ha descrito anteriormente. La dosis dependera de la actividad espedfica de la vacuna y se puede establecer facilmente mediante experimentacion rutinaria.

Otros aspectos adicionales se refieren a una formulacion inmunologica/vacuna que comprende el polinucleotido de la presente invencion. Estas tecnicas son conocidas del estado tecnico; vease por ejemplo Wolff y otros, Science, (1990) 247: 1465-8.

Ejemplos

A continuacion se describen ejemplos de metodos, aunque en la practica o ensayo de los peptidos, composiciones y metodos de la presente invencion se pueden emplear metodos y materiales similares o equivalentes a los aqrn descritos.

Los materiales, metodos y ejemplos solo son ilustrativos y no pretenden ser limitativos.

EJEMPLO 1

Resumen

Los epftopos de VEGF se identificaron mediante un analisis asistido por ordenador, con el empleo de correlatos espedficos de antigenicidad. Estos epftopos se sintetizaron, purificaron y combinaron con la protema de fusion del

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virus del sarampion (MVF), un epftopo de celulas T. Los anticuerpos del peptido de VEGF se edujeron en ratones y conejos tras la vacunacion primaria y la de refuerzo. La especificidad de los anticuerpos se determino por ELISA y Western blot. La funcion de los anticuerpos del peptido de VEGF se evaluo mediante el ensayo de interaccion de Fluorokine® con el receptor de VEGF. La invasion vascular, un marcador de angiogenesis, se determino inyectando a ratones C57BL/6 por via subcutanea Matrigel® (una membrana basal derivada de sarcoma de raton) incubado con y sin protema VEGF humana recombinante en presencia o ausencia de anticuerpos del peptido de VEGF y de anticuerpos monoclonales de VEGF murino. La angiogenesis en Matrigel® se determino por tincion de Hoechst y cuantitativamente contando los vasos sangumeos que invadieron la Matrigel®. Las diferencias de angiogenesis relativa se compararon mediante la prueba t de Student.

Los peptidos de VEGF de la region antigenica predicha edujeron anticuerpos de tftulo elevado en ratones y conejos (1:500.000 a 3y+4). Mediante ELISA y analisis Western blot se demostro que estos anticuerpos eran espedficos de rhVEGF. Los anticuerpos del peptido de VEGF produjeron in vitro una interrupcion significativa de la interaccion normal entre el VEGF y el receptor de VEGF, en comparacion con el control, mediante el ensayo Fluorokine®. El ensayo de invasion en Matrigel® revelo in vivo que los anticuerpos del peptido de VEGF produdan una profunda disminucion cuantitativa de la invasion de vasos sangumeos en la matriz, en comparacion con el control (invasion vascular de VEGF solo = 118,2 frente a los anticuerpos de los peptidos de VEGF + VeGF = 26,4, P = 0,005).

Conclusion: los anticuerpos del peptido de VEGF educidos de las regiones antigenicas del VEGF son inmunogenos, espedficos y antiangiogenicos. Por tanto se espera que la inmunizacion activa con una vacuna de peptido de VEGF sea un tratamiento biologicamente importante para las mujeres con cancer ovarico epitelial.

Materiales y metodos

Seleccion de epftopos de VEGF

La seleccion de posibles epftopos celulares B de VEGF se realizo mediante un analisis asistido por ordenador, con el empleo de correlatos espedficos de antigenicidad (Peptide Companion, PeptiSearch), utilizando los perfiles de flexibilidad y movilidad de la cadena, la hidropatia, los indices de protrusion y la antigenicidad [Kaumaya 1994]. A las secuencias se les asigno una puntuacion de 1 a 6 basada en los respectivos valores de sus indices y se clasificaron segun ella. Los epftopos con la mejor puntuacion se clasificaron de nuevo segun la correlacion con sus atributos estructurales secundarios, prefiriendo una secuencia anfifflica alfa-helicoidal o una region bucle de giro beta antes que un fragmento de espiral aleatoria. Por ultimo se tuvo en cuenta la secuencia individual de aminoacidos. Tambien se consideraron los pares electrostaticos ionicos y la interaccion helice-dipolo en el segmento helicoidal (balance hidrofobo / hidrofilo). Las secuencias que obtuvieron las mayores puntuaciones fueron seleccionadas para seguir investigandolas. Nuestro grupo ha evaluado una serie de peptidos antigenicos que contienen epftopos de celulas T derivados de fuentes no humanas, identificados como “promiscuos” por su reconocimiento relacionado con muchas moleculas del MHC y su capacidad de educir respuestas de TH [Kaumaya 1993]. La secuencia 288-302 de la protema de fusion del virus del sarampion (MVF) se escogio como epftopo promiscuo para superar el reto de la tolerancia y del polimorfismo del MHC. El epftopo de MVF se junto linealmente con el epftopo de VEGF mediante un conector de cuatro restos (GPSL) en un sintetizador de peptidos. Los restos de glicina y prolina del conector potencian un giro beta en el oligopeptido, mientras que la serina favorece los enlaces de hidrogeno con los grupos NH libres del esqueleto. La naturaleza flexible del conector permite el plegamiento independiente de los epftopos de las celulas T y B. Los peptidos se purificaron mediante HPLC de fase inversa para asegurar una pureza > 95%. Los peptidos se identificaron mediante desorcion/ionizacion laser asistida por matriz con analizador del tiempo de vuelo (MALDI-TOF).

Vacunacion y educcion de anticuerpos del peptido de VEGF

Para generar anticuerpos del VEGF se inmunizaron conejos blancos de Nueva Zelanda (Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA) y ratones BALB/c (Harlan, Indianapolis, IN) por via subcutanea en varios sitios con un total de 1 mg de cada peptido emulsionado en un vehmulo de Squaline/Arlacel que contema nor-MDP (N-acetil-glucosamin- 3-il-acetil L-alanil-D-isoglutamina). Tras la inmunizacion primaria (1y) se pusieron inyecciones de refuerzo a las 3 semanas (inmunizacion secundaria, 2y) y a las 6 semanas (inmunizacion terciaria, 3y). Los sueros de conejo y de raton se recogieron semanalmente y el complemento se inactivo calentando a 56°C. Los sueros de tftulo alto se purificaron en una columna de protema A/G-agarosa (Pierce, Rockford, IL) y los anticuerpos eluidos se concentraron e intercambiaron en PBS, utilizando unidades de filtracion con centnfuga de Mr 100.000 como ftmite (Millipore, Bedford, MA). La concentracion de anticuerpos se cuantifico por ELISA.

Caracterizacion de los anticuerpos del peptido de VEGF

Se efectuaron analisis Western blot para determinar si los anticuerpos del peptido de VEGF reconodan la protema VEGF. Las protemas, incluyendo el rhVEGF, se separaron en SDS-PAGE al 15%, se transfirieron a nitrocelulosa y se hibridaron con anticuerpos del peptido de VEGF o con un anticuerpo monoclonal murino del VEGF (Ab-4, Neoprobe, Inc., Fremont, CA). La trasferencia de las protemas se controlo con patrones de peso molecular tenidos

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previamente. Las bandas inmunorreactivas se detectaron por quimioluminiscencia mejorada (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL), utilizando inmunoglobulinas de cabra anti-conejo conjugadas con peroxidasa de rabano picante.

En un intento de determinar el efecto de nuestros anticuerpos del peptido de VEGF en la interaccion del VEGF con el receptor de VEGF utilizamos el ensayo de Fluorokine® (R&D Systems, Minneapolis, MN). En resumen, 5 x 105 celulas HUVEC se lavaron e incubaron con el rhVEGF biotinilado, que a su vez se une a las celulas mediante el VEGFR. Luego las celulas se incuban directamente con avidina-fluorescema, la cual se fija al VEGF biotinilado unido al receptor. La citocina libre participa en una reaccion de amplificacion con la citocina fijada, que produce una senal intensificada sin comprometer la especificidad. Las celulas que expresan el VEGFR se tinen de forma fluorescente con una intensidad de tincion proporcional a la densidad de los receptores. La densidad relativa de los receptores se determina luego por citometna de flujo. Mediante este experimento normalizamos inicialmente el componente de citometna de flujo del ensayo, en el cual se identificaron distintas poblaciones celulares mediante el uso de los controles positivos (rhVEGF) y negativos (sin estimulacion) suministrados, y tambien con un anticuerpo inhibidor proporcionado con el kit. Tras la normalizacion se usaron varias concentraciones de anticuerpos de raton o conejo del peptido de VEGF en lugar del anticuerpo inhibidor suministrado, a fin de determinar la densidad proporcional de VEGFR.

Determinacion de las propiedades anti-angiogenicas de los anticuerpos del peptido de VEGF

La invasion de vasos sangumeos se analizo en un modelo murino, utilizando Matrigel®, una matriz solubilizada de membrana basal extrafda del sarcoma murino EHS [Passiniti]. La Matrigel® es lfquida a 4°C, pero tambien polimeriza a 4°C, lo cual permite retirarla de un animal huesped con fines analfticos. Se inyectaron grupos de 5 ratones hembra C57BL/6 (Harlan, Indianapolis, IN) por via subcutanea con un volumen total de 500 pl, incluyendo Matrigel®, varias concentraciones de rhVEGF y varias concentraciones de anticuerpos (anticuerpo monoclonal del VEGF (MAB293, R&D Systems, Minneapolis, Mn) o anticuerpos del peptido de VEGF). A los 10 dfas se sacrificaron los ratones. Los tapones de Matrigel® se quitaron, se seccionaron y se tineron con hematoxilina y eosina y con el colorante nuclear Hoechst 33342. La invasion en el tapon se comprobo con un microscopio fluorescente invertido a 40x aumentos. Los vasos sangumeos en la periferia del tapon se identificaron y contaron circunferencialmente alrededor del mismo y tambien a ciegas mediante analisis asistido por ordenador. Las comparaciones estadfsticas entre grupos se hicieron con la prueba t de Student.

Resultados

El analisis de los posibles epttopos de celulas B del VEGF se empleo para seleccionar los residuos 127-144 (KCECRPKKDRARQENPCG), el cual tiene correlacion con una estructura secundaria de giro-helice-giro como potencial inmunogeno y antigenico. Este epftopo se unio linealmente con el epftopo promiscuo de celulas T de la protema de fusion del virus del sarampion (MVF) mediante el conector de cuatro restos GPSL en un sintetizador de peptidos. Los peptidos se purificaron y su identidad fue confirmada por MALDITOF. Los conejos y los ratones se inmunizaron por via subcutanea con el inmunogeno de MVF-VEGF y los sueros obtenidos se purificaron. Los tftulos elevados de anticuerpos del peptido de VEGF (1:500.000 a las 4 semanas de la inmunizacion terciaria, 3y+4) se identificaron por ELISA tal como se muestra en la figura 1 para los conejos.

Por ELISA (figura 2) y Western blot (figura 3A) se demostro que los anticuerpos del peptido de VEGF reconocen la protema rhVEGF. Como control positivo en el Western blot se uso Ab-4, un anticuerpo monoclonal contra el VEGF, y el homodfmero esperado de la protema rhVEGF se confirmo a 42kDa (figura 3B).

Tras la demostracion de las propiedades antigenicas e inmunogenicas de los anticuerpos del peptido de VEGF se evaluaron sus propiedades funcionales. Se demostro que estos anticuerpos del peptido de VEGF interrumpen de manera significativa la interaccion normal entre el VEGF y el receptor de VEGF (VEGFR), tal como se determina en el ensayo de Fluorokine® (figura 4). En este experimento la adicion de los anticuerpos del peptido de VEGF produce la fijacion del VEGF y por lo tanto un descenso de la interaccion normal VEGF-VEGFR.

Continuamos determinando si estos anticuerpos del peptido de VEGF teman propiedades anti-angiogenicas como consecuencia de la inhibicion de la funcion del VEGF. En comparacion con los tapones subcutaneos de Matrigel® incubados con rhVEGF antes de inyectarlos en los ratones C57BL/6, en los tapones incubados simultaneamente con anticuerpos del peptido de rhVEGF y VEGF se observo un descenso importante de la angiogenesis en la Matrigel® P= 0,005, figuras 5 y 6). Las caractensticas anti-angiogenicas de los anticuerpos del peptido de VEGF fueron equivalentes a las del anticuerpo monoclonal de VEGF utilizado como control positivo (P = NS al comparar los anticuerpos del peptido de VEGF con los anticuerpos monoclonales de VEGF, datos no representados).

Discusion

Demostramos que mediante el diseno racional de peptidos, utilizando epftopos de celulas B del VEGF, se educen anticuerpos espedficos de VEGF. Estos anticuerpos reconocen la protema completa a partir de la cual se ha disenado el peptido e inhiben la funcion proteica esperada. La inmunoterapia para el tratamiento del cancer ha evolucionado mucho durante las pasadas decadas. Anteriormente los pacientes se trataban con estimulantes

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inmunitarios no espedficos, mientras que la terapia actual se dirige a la identificacion de antigenos espedficos asociados al tumor (TAAs) como dianas de la inmunoterapia. La inmunoterapia tumoral espedfica se clasifica en pasiva, donde los anticuerpos se env^an directamente a las celulas tumorales, y activa, donde se usa la vacunacion con peptidos, celulas tumorales, lisados de celulas tumorales, carbohidratos, constructos geneticos y anticuerpos anti-idiotipo que imitan los TAAs en un huesped que organiza una respuesta inmunitaria espedfica.

Historicamente la inmunizacion activa con peptidos ha tenido una eficacia limitada a causa de su inmunogenicidad restringida. Los anticuerpos educidos en animales por inmunizacion con peptidos sinteticos han demostrado en general poca afinidad por la protema natural, en parte porque los sitios de reconocimiento del anticuerpo suelen ser conformacionales y los inmunogenos peptfdicos carecen de estructura definida en solucion. La accion estimulante geneticamente restringida de los peptidos tambien era un gran obstaculo en el desarrollo de metodos de vacunacion para una poblacion humana exogama [Dulofeut]. La conjugacion covalente de peptidos epftopos de celulas B con moleculas grandes de vetftculo se utilizo a veces para abordar este problema, pero a menudo dio como resultado hipersensibilidad, cambios conformacionales, aparicion de estructuras indefinidas, perdida de epftopos, presentacion inapropiada de epftopos y variabilidad de conjugacion entre lotes. Hemos abordado varios de estos problemas en nuestro metodo racional de diseno de vacunas peptfdicas de subunidades [Dakappagari].

Nuestra estrategia consistio en el diseno nuevo de determinantes topograficos centrados en preservar la secuencia proteica natural y facilitar el plegamiento del peptido hacia una conformacion estable que imitara la estructura de la protema natural [Kobs, Kaumaya 1990]. Hemos demostrado la eficacia de incorporar a estos constructos epftopos promiscuos de linfocitos T colaboradores, derivados de moleculas no humanas, a fin de superar el polimorfismo genetico del MHC humano [Kaumaya 1993]. Nuestro trabajo anterior en varios sistemas de modelos ha demostrado que con este metodo se pueden educir anticuerpos de tftulo elevado capaces de reconocer la protema natural en una poblacion exogena, lo cual se ha confirmado en esta investigacion de epftopos de VEGF.

Cabe destacar que las vacunas peptfdicas de subunidades pueden dirigir respuestas inmunitarias a los epftopos biologicamente activos. La necesidad de vacunas basadas en epftopos proviene del hecho de que la tolerancia a autoantfgenos tales como el VEGF puede limitar una respuesta inmunitaria funcional a las vacunas basadas en la protema completa, debido a la activacion de celulas T supresoras que mantienen la tolerancia a antfgenos huesped o a mecanismos reguladores alternos [Sakaguchi]. La capacidad de centrar estrechamente la respuesta inmunitaria es de particular importancia para el VEGF, donde la interaccion del anticuerpo con los sitios espedficos puede inhibir el crecimiento. Al contrario que en la terapia pasiva se puede asegurar a bajo coste la continua disponibilidad de anticuerpos dirigidos al tumor.

Investigadores anteriores han desarrollado estrategias similares de terapia anti-VEGF del cancer. El interes del VEGF como antfgeno modelo para explorar la terapia inmunogenica se ha demostrado mediante la construccion de un ADN plasmido que codifica VEGF homologo de Xenopus [Wei]. Este grupo comprobo que la terapia tumoral inmunogenica mediante esta vacuna produda el desarrollo de anticuerpos espedficos de VEGF que eran anti- angiogenicos e inhidan la formacion de tumores. Cabe destacar que el tratamiento de ratones con el inmunogeno no produjo efectos toxicos importantes. En otro trabajo se ha demostrado que la vacunacion con celulas dendrfticas transfectadas con ARNm de VEGF induce respuestas de linfocitos T citotoxicos (CTL), interrumpe la angiogenesis y tiene eficacia antitumoral sin morbosidad o mortalidad significativa in vivo en un modelo murino [Nair]. Por tanto los trabajos anteriores han demostrado que es factible la inmunizacion activa con VEGF como TAA.

Esta investigacion esta limitada por el hecho de que el antfgeno elegido para el estudio, el VEGF, se expresa de manera ubicua en estados normales y patologicos, y por tanto su inhibicion puede tener consecuencias biologicas potencialmente graves. Aunque el desarrollo fetal esta controlado fuertemente por la angiogenesis, en el huesped adulto la angiogenesis solo controla la reproduccion, la curacion de heridas y el cancer. Por consiguiente creemos que el control relativo de la sobreexpresion del VEGF en los casos de malignidad puede proporcionar una tasa terapeutica aceptable en el tratamiento de los tumores solidos, lo cual esta apoyado por la investigacion previa de otros metodos de disminucion del VEGF (p.ej. mediante vacunas de ADN o inhibicion del VEGFR) que no tuvieron una toxicidad importante.

La mayona de mujeres con cancer ovarico son diagnosticadas con la enfermedad avanzada y a pesar de que la mayor parte obtiene una respuesta cftnica completa tras la induccion quimioterapeutica, el 80% recae y sucumbe a su enfermedad. Este escenario sugiere que tras la terapia inicial queda una enfermedad microscopica residual que es la responsable de la recurrencia. Por este motivo un enfoque actual de la investigacion cftnica del tratamiento del cancer ovarico consiste en tener en cuenta el mantenimiento de la quimioterapia. En este caso se ha demostrado que los pacientes con una respuesta cftnica completa tras el tratamiento inicial tienen una mejor supervivencia sin enfermedad, si se prolonga inmediatamente dicho tratamiento [Markman].

Es interesante que la investigacion del papel de la inmunizacion activa con el anticuerpo anti-idiotipo ACA125 (que imita el antfgeno CA125 asociado al tumor en el cancer ovarico) como quimioterapia de mantenimiento en el cancer ovarico ha demostrado un impacto positivo en la supervivencia general [Wagner]. Por tanto la inmunizacion activa como quimioterapia de mantenimiento para evitar la recurrencia sintomatica del cancer ovarico es una idea atractiva. Se ha demostrado que la angiogenesis influye en el crecimiento del cancer de manera variable segun las fases de la

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proliferacion maligna. De manera importante, se piensa que los estados neoplasicos premalignos y los pequenos tumores malignos crecen por influencia directa de mitogenos endoteliales tales como el VEGF, mientras que los tumores malignos mas grandes pueden crecer y metastatizar independientemente de los factores angiogenicos [Hanahan and Folkman]. La idea de que los factores angiogenicos controlan el crecimiento temprano del tumor ha sido aplicada al tratamiento clmico del cancer ovarico. Los esfuerzos de la investigacion actual se dirigen al estudio de agentes quimioterapeuticos capaces de actuar como citostaticos anti-angiogenicos. Estos compuestos, como por ejemplo el tamoxifeno y la talidomida, estan siendo evaluados en mujeres con cancer ovarico asintomatico de recurrencia temprana, para comprobar si la terapia anti-angiogenica puede prevenir un desarrollo clmicamente significativo de la enfermedad sintomatica. En tal caso la terapia anti-angiogenica mediante la inmunizacion activa con epftopos de VEGF servina como terapia de mantenimiento racional que tendna un impacto importante en el tratamiento del cancer ovarico.

A partir de esta investigacion demostramos que el diseno racional de vacunas peptfdicas contra el VEGF educe anticuerpos de tftulo alto contra el peptido de VEGF, que son espedficos y anti-angiogenicos.

Documentos citados para el ejemplo 1

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EJEMPLO 2

Seleccion de epdopos de VEGFy EG-VEGF

Los posibles epftopos de celulas B del VEGF y de la EG-VEGF se han seleccionado mediante un analisis asistido por ordenador, con el uso de correlatos espedficos de antigenicidad, utilizando los perfiles de flexibilidad y movilidad de la cadena, la hidropatfa, los indices de protrusion y la antigenicidad. A las secuencias se les asigno una puntuacion de 1 hasta 6 basada en los respectivos valores de sus indices y se clasificaron segun ella. Los epftopos con la mejor puntuacion se clasificaron de nuevo segun la correlacion con sus atributos estructurales secundarios, prefiriendose una secuencia anfifflica alfa-helicoidal o una region bucle de giro beta antes que fragmentos de espiral aleatoria. Por ultimo se tuvo en cuenta la secuencia individual de aminoacidos. Tambien se consideraron los pares electrostaticos ionicos y la interaccion helice-dipolo en el segmento helicoidal (balance hidrofobo / hidrofilo). Las secuencias que obtuvieron las mayores puntuaciones fueron seleccionadas para seguir investigandolas. La tabla 1

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presenta las secuencias y la estructura secundaria de los epftopos de VEGF y de EG-VEGF seleccionados para la investigacion.

Tabla 1: secuencia de los mejores candidatos para la smtesis de inmunogenos

Estructura del inmunogeno Restos Secuencia de aminoacidos Secundaria

VEGF 127-144 KCECRPKKDRARQENPCG Giro-Helice-Giro

EG-VEGF 50-67 CTPLGREGEECHPGSHKV Giro-Helice-Giro

Nuestro grupo ha evaluado una serie de peptidos antigenicos que contienen epftopos de celulas T derivados de fuentes no humanas y que han sido identificados como “promiscuos” por su reconocimiento en asociacion con muchas moleculas del mHc y por su capacidad de educir respuestas de TH. La secuencia 288-302 de la protema de fusion del virus del sarampion (MVF) fue escogida como el epftopo promiscuo para superar el reto de la tolerancia y del polimorfismo del MHC. El epftopo de MVF se junto linealmente con el epftopo de VEGF o de EG-VEGF mediante un conector de cuatro restos (GPSL) en un sintetizador de peptidos (tabla 3). Los restos de glicina y prolina del conector potencian un giro beta en el oligopeptido, mientras que la serina favorece los enlaces de hidrogeno con los grupos NH libres del esqueleto. La naturaleza flexible del conector permite el plegamiento independiente de los epftopos de las celulas T y B. Los peptidos se purificaron mediante HPLC de fase inversa para asegurar una pureza > 95%. Los peptidos se identificaron por espectrometna de desorcion/ionizacion laser asistida por matriz-tiempo de vuelo.

Para generar anticuerpos anti-VEGF y anti-EG-VEGF se inmunizaron conejos por via subcutanea en varios sitios con un total de 1 mg de cada peptido emulsionado en un vehmulo de Squaline/Arlacel que contema nor-MDP (N- acetil-glucosamin-3-il-acetil L-alanil-D-isoglutamina). Tras la inmunizacion primaria se dieron inyecciones de refuerzo a las 3 semanas y 6 semanas. Los sueros de conejo se recogieron semanalmente, se purificaron y se cuantificaron por ELISA (figura 1).

Despues de purificar los anticuerpos anti-VEGF y anti-EG-VEGF continuamos determinando si los anticuerpos educidos teman propiedades anti-angiogenicas. Los datos previos demuestran que la funcion ovarica es regulada estrechamente por estfmulos angiogenicos y se ha visto que el VEGF es importante en el reclutamiento y seleccion de foftculos. Por consiguiente supusimos que si los anticuerpos actuaban como moleculas anti-angiogenicas, con la neutralization del VEGF cabna esperar la inhibicion de la seleccion y crecimiento de los foftculos y la interrupcion del ciclo estrogenico.

Trece ratones C57BL/6 hembra se inyectaron por via intraperitoneal con 25 |jg de anticuerpo anti-VEGF purificado cada 3 dfas durante 15 dfas. Los ciclos estrogenicos se controlaron diariamente tomando frotis vaginales y los ciclos estrogenicos de los ratones tratados se compararon con los de ratones de control inyectados con anticuerpos IgG no espedficos. Conforme al efecto anti-angiogenico de los anticuerpos anti-VEGF educidos se observo una interrupcion importante del ciclo estrogenico establecido, a partir del 3er dfa desde la inmunizacion (figura 2A). La duracion media de los ciclos estrogenicos tambien disminuyo significativamente mas del 66% (figura 2B). El crecimiento de los foftculos primordiales se valoro a los dfas 3 y 7 de la inmunizacion recogiendo los ovarios de los ratones sacrificados. En los ratones tratados con anticuerpos anti-VEGF se comprobo una reduccion importante y persistente del numero de foftculos primordiales (p < 0,05 para ambas comparaciones), lo cual sugiere una potente eficacia anti-angiogenica de los anticuerpos de VEGf (figura 2C).

Estos datos demuestran en conjunto que los epftopos inmunogenicos de VEGF y EG-VEGF se pueden identificar y sintetizar, y que la inmunizacion induce la produccion de anticuerpos anti-VEGF y anti-EG-VEGF. Estos anticuerpos son biologicamente activos y actuan como moleculas anti-angiogenicas.

Determinacion de la inmunogenicidad de los anticuerpos anti-VEGF y anti-EG-VEGF educidos de la inmunizacion activa con vacunas pept^dicas

Se comprobo mediante ELISA que los anticuerpos peptfdicos anti-VEGF y anti-EG-VEGF reconodan la respectiva protema humana recombinante VEGF (figura 3A) o EG-VEGF (figura 3B). En este experimento se usaron protemas recombinantes para recubrir las placas de ELISA y se empleo el anticuerpo anti-peptido apropiado.

Ademas demostramos que los anticuerpos peptfdicos anti-VEGF y anti-EG-VEGF reconocen el rhVEGF por Western blot, con las bandas resultantes en el sito esperado (42 kD, dfmero) para el VEGF analizado con un anticuerpo peptfdico anti-VEGF (figura 4A) y un anticuerpo monoclonal de VEGF (NeoMarkers Ab-4, figura 4B). Asimismo, un Western blot con rhEGVEGF analizado con anticuerpos peptfdicos anti-EG-VEGF (figura 4C) y una combinacion de anticuerpos peptfdicos anti-VEGF/anti-EG-VEGF (figura 4d) dio una banda en el sito esperado (22 kD, dfmero) para el rhEG-VEGF.

Evaluacion in vitro del efecto biologico de los anticuerpos pepddicos anti-VEGFy anti-EG-VEGF

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Despues de demostrar las propiedades antigenicas e inmunogenicas de nuestros anticuerpos anti-peptido seguimos evaluando las propiedades funcionales de estas moleculas. Para determinar el efecto de nuestros anticuerpos peptidicos anti-VEGF en la interaccion del VEGF con el receptor de VEGF utilizamos el ensayo de Fluorokine. En resumen, las celulas lavadas se incuban con la citocina biotinilada, que a su vez se une a las celulas por medio de receptores espedficos de la superficie celular. Luego las celulas se incuban directamente con avidina-fluorescema, la cual se fija a la citocina biotinilada unida al receptor. La citocina libre participa en una reaccion de amplificacion con la citocina fijada, que produce una senal intensificada sin comprometer la especificidad.

Las celulas que expresan los receptores espedficos de citocina se tinen de forma fluorescente con una intensidad de tincion proporcional a la densidad de los receptores. La densidad relativa de los receptores se determina luego por citometna de flujo mediante excitacion con laser de 488 nm de longitud de onda. Mediante este experimento normalizamos inicialmente el componente de citometna de flujo del ensayo (A), en el cual se identificaron distintas poblaciones celulares empleando los controles positivos y negativos del kit suministrado. Tras la normalizacion utilizamos celulas HUVEC que proliferan bajo la influencia del VEGF, a fin de determinar la eficacia de fijacion de nuestros anticuerpos anti-peptido al VEGF, produciendo la interrupcion de la interaccion normal VEGF-receptor de VEGF. Como puede verse en la figura 5B, se observa un desplazamiento de la poblacion hacia una menor densidad de receptor cuando se usan anticuerpos peptfdicos anti-VEGF, lo cual sugiere una interrupcion de la interaccion normal VEGF-receptor de VEGF.

Evaluacion in vivo del efecto biologico anti-angiogenico de las vacunas pepddicas anti-VEGF

Aunque ya hemos demostrado la interaccion entre el VEGF y nuestros anticuerpos anti-peptido de VEGF, aun es importante determinar si el efecto de esta interaccion produce una modificacion de las propiedades angiogenicas del VEGF. Para determinar las propiedades anti-angiogenicas de nuestros anticuerpos inyectamos matrigel (membrana basal generada a partir de sarcoma EHS) por via subcutanea a ratones C57/BL6 inmunocompetentes, con o sin rhVEGF. A los 7 dfas se retiro la matrigel y las secciones criostatizadas se cortaron y tineron con un conjugado de CD31 (que se une a celulas endoteliales) y ficoeritrina. La angiogenesis se determino cualitativa y cuantitativamente por microscopia confocal de fluorescencia. La adicion de rhVEGF a la matrigel produjo un aumento significativo de la angiogenesis respecto al control.

Esta descripcion se entiende mas a fondo atendiendo a las instrucciones de las referencias citadas en ella.

En esta descripcion las formas de ejecucion ilustran las materializaciones de la presente invencion y no se deben interpretar como ftmite de su alcance. El especialista reconoce que la invencion reivindicada puede incluir muchas otras formas de ejecucion y que la descripcion y los ejemplos solo se contemplan como un modelo, estando el verdadero alcance y espftitu de la presente invencion indicado por las reivindicaciones adjuntas.

Esta solicitud de patente es divisional de la solicitud de patente europea n° 05722777.9 (la “solicitud original de patente”), tambien publicada con el n° EP 1730182. El contenido de las reivindicaciones iniciales de la solicitud original de patente se repite a continuacion en esta descripcion y forma parte de su contenido, tal como sigue:

1. Un polipeptido aislado o purificado que comprende un epftopo de VEGF, de unos 10 hasta 50 aminoacidos, y todo un polipeptido o una porcion contigua del mismo seleccionada entre a) KCECRPKKDRARQENPCG, b) CTPLGREGEECHPGSHKV, c) los aminoacidos 4 hasta 21 del VEGF humano, d) los aminoacidos 24 hasta 38 del VEGF humano, e) los aminoacidos 127 hasta 144 del VEGF humano, f) los aminoacidos 102 hasta 122 del VEGF humano, g) los aminoacidos 162 hasta 175 del VEGF humano, h) los aminoacidos 76 hasta 96 del VEGF humano, i) los aminoacidos 5 hasta 15 de la EG-VEGF humana, j) los aminoacidos 24 hasta 34 de la EG-VEGF humana, k) los aminoacidos 50 hasta 75 de la EG-VEGF humana y los aminoacidos 86 hasta 105 de la EG- VEGF humana.

2. Un peptido quimerico de VEGF, de unos 35 hasta 150 aminoacidos, que comprende a) al menos un epftopo de VEGFo un equivalente antigenico o funcional del mismo, b) un epftopo de celulas T colaboradoras y c) un peptido de unos 2 hasta 10 aminoacidos que une los elementos a) y b).

3. El peptido quimerico de VEGF segun el punto 2, que tiene aproximadamente 35 hasta 70 aminoacidos.

4. El peptido quimerico de VEGF segun el punto 2, en el cual el epftopo de celulas T colaboradoras es un epftopo promiscuo de celulas Th.

5. El peptido quimerico de VEGF segun el punto 2, en el cual el epftopo de celulas T colaboradoras comprende aproximadamente 14 hasta 22 aminoacidos.

6. El peptido quimerico de VEGF segun el punto 2, en el cual el epftopo de celulas T colaboradoras comprende una secuencia escogida entre TT, TT1, P2, P30, MVF, HBV y CSP.

7. El peptido quimerico de VEGF segun el punto 2, en el cual el peptido que une los elementos a) y b) contiene la secuencia Gly-Pro-Ser-Leu.

8. Un peptido multivalente de VEGF que comprende a) varios epftopos de VEGF segun el punto 1 o equivalentes funcionales del mismo y b) al menos un epftopo de celulas Th, estando a) y b) conectados por una estructura central de laminas p.

9. El peptido multivalente de VEGF segun el punto 8, en el cual la estructura central de laminas p comprende dos cadenas alternantes de restos de leucina y lisina.

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Peptido quimerico que comprende:

(a) al menos un epftopo de VEGF humano constituido por KCECRPKKDRARQENPCG;

(b) un epftopo de celulas T colaboradoras seleccionado del grupo constituido por NSVDDALINSTIYSYFPSV (TT), PGINGKAIHLVNNQSSE (TT1), QYIKANSKFIGITEL (P2), FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (P30), LSEIKGVIVHRLEGV(MVF), FFLLTRILTIPQSLN (HBV) y TCGVGVRVRSRVNAANKKPE (CSP); y

(c) un conector de 2 a 15 aminoacidos de longitud que une al menos un epftopo de VEGF al epftopo de celulas T colaboradoras,

en el cual el conector esta unido operativamente al C terminal de al menos un epftopo de VEGF y al N terminal del epftopo de celulas T colaboradoras.
2. El peptido quimerico segun la reivindicacion 1, en el cual el epftopo de celulas T colaboradoras es LSEIKGVIVHRLEGV (MVF).
3. El peptido quimerico segun la reivindicacion 1, en el cual el conector es Gly-Pro-Ser-Leu.
4. Un peptido que comprende:

(a) un primer epftopo de VEGF constituido por KCECRPKKDRARQENPCG, unido operativamente a por lo menos un segundo epftopo de VEGF seleccionado del grupo formado por

los aminoacidos 4 hasta 21 de la SEQ ID n°: 1, los aminoacidos 24 hasta 38 de la SEQ ID n°: 1, los aminoacidos 76 hasta 96 de la SEQ ID n°: 1, los aminoacidos 102 hasta 122 de la SEQ ID n°: 1,

los aminoacidos 126 hasta 143 de la SEQ ID n°: 1,

los aminoacidos 162 hasta 175 de la SEQ ID n°: 1,

los aminoacidos 5 hasta 15 de la SEQ ID n°: 2,

los aminoacidos 24 hasta 34 de la SEQ ID n°: 2, los aminoacidos 50 hasta 67 de la SEQ ID n°: 2, los aminoacidos 50 hasta 75 de la SEQ ID n°: 2, y los aminoacidos 86 hasta 102 de la SEQ ID n°: 2;

(b) al menos un epftopo de celulas T colaboradoras; y

(c) un primer conector que une operativamente el primer y segundo epftopos de VEGF con al menos un epftopo de celulas T colaboradoras,

en el cual el primer conector consta de dos cadenas de restos alternantes de leucina y lisina que estan unidas por un segundo conector, y

en el cual el primer conector esta unido operativamente al C terminal del primer y segundo epftopos de VEGF unidos operativamente y tambien unido operativamente al N terminal de al menos un epftopo de celulas T colaboradoras.
5. El peptido segun la reivindicacion 4, en el cual el epftopo de celulas T colaboradoras se selecciona del grupo constituido por NSVDDALINSTIYSYFPSV (TT), PGINGKAIHLVNNQSSE (TT1), QYIKANSKFIGITEL (P2), FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (P30), LSEIKGVIVHRLEGV (MVF), FFLLTRILTIPQSLN (HBV) y TCGVGVRVRSRVNAANKKPE (CSP).
6. El peptido segun la reivindicacion 5, en el cual el epftopo de celulas T colaboradoras es LSEIKGVIVHRLEGV (MVF).
7. El peptido segun la reivindicacion 4, en el cual el primer conector es Gly-Pro-Ser-Leu.
8. El peptido segun la reivindicacion 4, en el cual el segundo conector es un peptido de 2 a 15 aminoacidos.
9. El peptido segun la reivindicacion 8, en el cual el segundo conector es Gly-Pro-Ser-Leu.
10. Una composicion inmunogenica que comprende el peptido segun la reivindicacion 1 y al menos un vehfculo

farmacologicamente aceptable.
11. Una composicion inmunogenica que comprende el peptido segun la reivindicacion 4 y al menos un vehfculo farmacologicamente aceptable.
12. Un polinucleotido que codifica el peptido segun la reivindicacion 1.
13. Un polinucleotido que codifica el peptido segun la reivindicacion 4.