ES2331305T3

ES2331305T3 - Peptidos de wt1 de tipo sustituido.

Info

Publication number: ES2331305T3
Application number: ES03797688T
Authority: ES
Inventors: Haruo Sugiyama; Masashi Gotoh; Hideo Takasu; Fumio Samizo; Naoto Kusunose; Masashi Nakatsuka
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd; Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd; International Institute of Cancer Immunology Inc
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd; International Institute of Cancer Immunology Inc; Sumitomo Pharma Co Ltd
Priority date: 2002-09-20
Filing date: 2003-09-19
Publication date: 2009-12-29
Anticipated expiration: 2023-09-19
Also published as: US7378384B2; EP1548028A4; DE60329201D1; JP4480580B2; EP1548028B1; ATE442378T1; WO2004026897A1; EP1548028A1; JPWO2004026897A1; US20060205667A1; AU2003264514A1; AU2003264514A8

Abstract

Un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula: X-Y-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu (SEQ ID NO: 4) donde X representa Ser, Ala, Abu, Arg, Lys, Orn, Cit, Leu, Phe, o Asn, e Y representa Tyr o Met, y que tiene una actividad inductora de los CTL.

Description

Péptidos de WT1 de tipo sustituido.

Campo técnico

La presente invención se refiere a péptidos de WT1 de tipo sustituido novedosos. Específicamente, la invención se refiere a péptidos de WT1 de tipo sustituido donde el resto cisteína está sustituido con un resto aminoácido definido, al uso de los mismos como vacunas contra el cáncer, y similares.

Técnica antecedente

Un resto cisteína comprendido en un péptido puede ser oxidado en solución para producir un enlace disulfuro. Un péptido que comprende un resto cisteína reducido y un péptido que comprende uno oxidado son drásticamente diferentes entre sí en estructura, y, en el transcurso del uso de los mismos como vacunas para el cáncer, los CTL específicos para uno de los péptidos no siempre son reactivos con el otro (Immunity 1997; 6: 273-281). De este modo, cuando un péptido antigénico canceroso que comprende un resto cisteína es diseñado como una composición farmacéutica de una vacuna contra el cáncer, se podría creer que proporcionaría la ventaja de desarrollar un péptido en el que un resto cisteína comprendido en el péptido antigénico canceroso estaría sustituido por otro resto aminoácido en lugar del péptido antigénico. Sin embargo, un péptido en el que un resto cisteína está sustituido por otro resto aminoácido no funciona necesariamente como péptido antigénico canceroso, y tales péptidos de tipo sustituido proporcionan una eficacia en gran parte diferente (J. Immunol., 1998; 161:6985-6992, J. Immunol., 1998; 160:2099-2106).

WT1_{235-243} (Cys-Met-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu; SEQ ID NO: 2), que es un péptido que abarca las posiciones 235 a 243 de la proteína antigénica cancerosa, WT1 (SEQ ID NO: 1, Cell., 60:509, 1990), es un péptido antigénico canceroso que tiene actividad inductora de los CTL de una manera restringida a HLA-A24 (documento WO 00/18795, Clin. Cancer. Res. 8: 2626, 2002, y documento WO 00/06602). El péptido alterado (Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu; SEQ ID NO: 3, en adelante puede ser referido como WT1_{235-243} (2M\rightarrowY)) donde la metionina de la posición 2 de WT1_{235-243} es alterada a tirosina tiene una actividad de unión superior al antígeno HLA-A24 que el péptido de tipo natural (documento WO 02/079253, fecha de publicación internacional: 10 de Octubre de 2002). Se espera que el péptido de tipo natural, WT1_{235-243}, y el péptido alterado, WT1_{235-243} (2M\rightarrowY), se conviertan ambos en un agente activo para la inmunoterapia del cáncer. Se describen péptidos WT1 alterados adicionales en Tsuboi et al., Cancer Immunol. Immunother. 51 (11-12) y en el documento WO 03/028758.

Descripción de la invención

La presente invención pretende proporcionar péptidos de WT1 de tipo sustituido novedosos donde el resto cisteína está sustituido con un resto aminoácido definido, al uso de los mismos como vacunas para el cáncer, y similares.

Los autores de la presente solicitud llevaron a cabo la sustitución del resto cisteína de la posición 1 de WT1_{235-243} y WT1_{235-243} (2M\rightarrowY) (en adelante, el péptido también puede ser referido como "péptido de tipo no sustituido") por diferentes restos aminoácido para preparar diversos péptidos de tipo sustituido, y examinaron su inmunogenicidad in vivo utilizando ratones transgénicos HLA-A2402/K^{b} (documento WO 02/47474, en adelante, también pueden ser referidos como "ratones transgénicos que expresan HLA-A24"). Como resultado, los autores de la presente invención descubrieron sorprendentemente que un péptido de tipo sustituido en el que un resto cisteína es sustituido por un resto serina (Ser), un resto alanina (Ala), un resto arginina (Arg), un resto lisina (Lys), un resto leucina (Leu), un resto fenilalanina (Phe), o un resto asparagina (Asn), todos los cuales son diferentes de un resto cisteína en estructura y propiedades, tiene una actividad inductora de los CTL (una inmunogenicidad) equivalente a la del péptido de tipo no sustituido. Incluso más sorprendentemente, los autores de la presente invención descubrieron que un péptido de tipo sustituido en el que el resto cisteína de la posición 1 es sustituido por un resto ácido 2-aminobutírico (resto ácido \alpha-aminobutírico, Abu), un resto ornitina (Orn), o un resto citrulina (Cit), todos los cuales no son un aminoácido proteinogénico de origen natural (un resto aminoácido inusual), también tiene actividad inductora de CTL (inmunogenicidad) equivalente a la del péptido de tipo no sustituido. Basándose en esos descubrimientos, los autores de la presente invención mantienen la convicción de que los péptidos de tipo sustituido mostrados antes deben estar disponibles como vacunas contra el cáncer en diversas formas. Los péptidos de tipo sustituido no producen un enlace disulfuro puesto que no comprenden resto cisteína, y de este modo tienen ventajas tales como una fácil normalización de los productos médicos. La presente invención ha sido completada basándose en los descubrimientos descritos antes.

De este modo, la presente invención hace referencia a:

(I): un péptido que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos de formula:

X-Y-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu: (SEQ ID NO: 4)

\quad: donde X representa Ser, Ala, Abu, Arg, Lys, Orn, Cit, Leu, Phe, o Asn, e Y representa Tyr o Met, y que tiene actividad inductora de CTL; preferiblemente, el péptido de acuerdo con el apartado (I) anterior que comprende o consiste en una cualquiera de las secuencias de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste en:

Ser-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu: (SEQ ID NO: 5),

Ala-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu: (SEQ ID NO: 6),

Abu-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu: (SEQ ID NO: 7),

Arg-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu: (SEQ ID NO: 8),

Lys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu: (SEQ ID NO: 9),

Orn-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu: (SEQ ID NO: 10),

Cit-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu: (SEQ ID NO: 11),

Leu-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu: (SEQ ID NO: 12),

Phe-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu: (SEQ ID NO: 13),

Asn-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu: (SEQ ID NO: 14),

Ser-Met-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu: (SEQ ID NO: 15), y

Ala-Met-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu: (SEQ ID NO: 16),

\quad: así como un procedimiento para preparar esos péptidos;

(II): un polinucleótido que codifica el péptido de acuerdo con el apartado (I) anterior, un vector de expresión que contiene el polinucleótido, y una célula que comprende el vector de expresión;

(III): un anticuerpo que se une específicamente a un péptido de acuerdo con el apartado (I) anterior;

(IV): una célula presentadora de antígenos sobre la cual se presenta un complejo entre un péptido antigénico canceroso de acuerdo con el apartado (I) anterior y un antígeno HLA-A24;

(V): una composición farmacéutica que comprende el péptido de acuerdo con el apartado (I) anterior, el polinucleótido de acuerdo con el apartado (II) anterior, el vector de expresión, la célula, o la célula presentadora de antígenos de acuerdo con el apartado (IV) anterior, junto con un portador farmacéuticamente aceptable, y la composición farmacéutica utilizada como vacuna contra el cáncer;

(VI): el uso del péptido de acuerdo con el apartado (I) anterior, el polinucleótido de acuerdo con el apartado (II) anterior, el vector de expresión, la célula, o la célula presentadora de antígenos de acuerdo con el apartado (IV) anterior, en la fabricación de una vacuna contra el cáncer;

(VII): un método para el tratamiento o la prevención de un cáncer, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente o profilácticamente eficaz del péptido de acuerdo con el apartado (I) anterior, el polinucleótido de acuerdo con el apartado (II) anterior, el vector de expresión, la célula, o la célula presentadora de antígenos de acuerdo con el apartado (IV) anterior, a un paciente con cáncer que lo necesita, que es positivo para un HLA-A24, y positivo para WT1.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es un gráfico que demuestra que se indujeron CTL específicos cuando se inmunizó un ratón transgénico que expresaba HLA-A24 con péptido A donde el aminoácido de la posición 2 del péptido antigénico derivado de WT1 humano (WT1_{235-243}) está sustituido por un resto tirosina. En la figura, el eje vertical muestra actividad citotóxica (% de Lisis Específica), y el eje horizontal muestra la razón E/D. Asimismo, en la figura, el círculo opaco muestra los resultados obtenidos utilizando células diana pulsadas con péptido A, y el círculo vacío muestra los resultados obtenidos utilizando células no pulsadas con ningún péptido.

La Fig. 2 es un gráfico que demuestra que se indujeron CTL específicos cuando se inmunizó un ratón transgénico que expresaba HLA-A24 con péptido B donde el resto cisteína de la posición 1 del péptido A es sustituido por un resto serina. En la figura, el eje vertical muestra actividad citotóxica (% de Lisis Específica), y el eje horizontal muestra la razón E/D. Asimismo, en la figura, el círculo opaco muestra los resultados obtenidos utilizando células diana pulsadas con péptido B, y el círculo vacío muestra los resultados obtenidos utilizando células no pulsadas con ningún péptido.

La Fig. 3 es un gráfico que demuestra que se indujeron CTL específicos cuando se inmunizó un ratón transgénico que expresaba HLA-A24 con péptido C donde el resto cisteína de la posición 1 del péptido A está sustituido por un resto alanina. En la figura, el eje vertical muestra actividad citotóxica (% de Lisis Específica), y el eje horizontal muestra la razón E/D. Asimismo, en la figura, el círculo opaco muestra los resultados obtenidos utilizando células diana pulsadas con péptido C, y el círculo vacío muestra los resultados obtenidos utilizando células no pulsadas con ningún péptido.

La Fig. 4 es un gráfico que demuestra que se indujeron CTL específicos cuando se inmunizó un ratón transgénico que expresaba HLA-A24 con péptido D donde el resto cisteína de la posición 1 del péptido A está sustituido por un resto ácido 2-aminobutírico. En la figura, el eje vertical muestra actividad citotóxica (% de Lisis Específica), y el eje horizontal muestra la razón E/D. Asimismo, en la figura, el círculo opaco muestra los resultados obtenidos utilizando células diana pulsadas con péptido D, y el círculo vacío muestra los resultados obtenidos utilizando células no pulsadas con ningún péptido.

La Fig. 5 es un gráfico que demuestra que se indujeron CTL específicos cuando se inmunizó un ratón transgénico que expresaba HLA-A24 con péptido E donde el resto cisteína de la posición 1 del péptido A está sustituido por un resto arginina. En la figura, el eje vertical muestra actividad citotóxica (% de Lisis Específica), y el eje horizontal muestra la razón E/D. Asimismo, en la figura, el círculo opaco muestra los resultados obtenidos utilizando células diana pulsadas con péptido E, y el círculo vacío muestra los resultados obtenidos utilizando células no pulsadas con ningún péptido.

La Fig. 6 es un gráfico que demuestra que se indujeron CTL específicos cuando se inmunizó un ratón transgénico que expresaba HLA-A24 con péptido F donde el resto cisteína de la posición 1 del péptido A está sustituido por un resto lisina. En la figura, el eje vertical muestra actividad citotóxica (% de Lisis Específica), y el eje horizontal muestra la razón E/D. Asimismo, en la figura, el círculo opaco muestra los resultados obtenidos utilizando células diana pulsadas con péptido F, y el círculo vacío muestra los resultados obtenidos utilizando células no pulsadas con ningún péptido.

La Fig. 7 es un gráfico que muestra los resultados del ensayo de reactividad cruzada de las células efectoras inducidas por el péptido de tipo sustituido, péptido B con respecto al péptido de tipo no sustituido, péptido A. En la figura, el eje vertical muestra la actividad inductora de CTL (% de Lisis Específica), y el eje horizontal muestra la razón E/D. Asimismo, en la figura, el círculo opaco muestra los resultados obtenidos utilizando células diana pulsadas con péptido B, el cuadrado opaco muestra los resultados obtenidos utilizando células diana pulsadas con péptido A, y el círculo vacío muestra los resultados obtenidos utilizando células no pulsadas con ningún péptido.

La Fig. 8 es un gráfico que muestra los resultados del ensayo de reactividad cruzada de las células efectoras inducidas por el péptido de tipo sustituido, péptido C con respecto al péptido de tipo no sustituido, péptido A. En la figura, el eje vertical muestra la actividad inductora de CTL (% de Lisis Específica), y el eje horizontal muestra la razón E/D. Asimismo, en la figura, el círculo opaco muestra los resultados obtenidos utilizando células diana pulsadas con péptido C, el cuadrado opaco muestra los resultados obtenidos utilizando células diana pulsadas con péptido A, y el círculo vacío muestra los resultados obtenidos utilizando células no pulsadas con ningún péptido.

La Fig. 9 es un gráfico que muestra los resultados del ensayo de reactividad cruzada de las células efectoras inducidas por el péptido de tipo sustituido, péptido D con respecto al péptido de tipo no sustituido, péptido A. En la figura, el eje vertical muestra la actividad inductora de CTL (% de Lisis Específica), y el eje horizontal muestra la razón E/D. Asimismo, en la figura, el círculo opaco muestra los resultados obtenidos utilizando células diana pulsadas con péptido D, cuadrado opaco muestra los resultados obtenidos utilizando células diana pulsadas con péptido A, y el círculo vacío muestra los resultados obtenidos utilizando células no pulsadas con ningún péptido.

La Fig. 10 es un gráfico que muestra los resultados del ensayo de reactividad cruzada de las células efectoras inducidas por el péptido de tipo sustituido, péptido E con respecto al péptido de tipo no sustituido, péptido A. En la figura, el eje vertical muestra la actividad inductora de CTL (% de Lisis Específica), y el eje horizontal muestra la razón E/D. Asimismo, en la figura, el círculo opaco muestra los resultados obtenidos utilizando células diana pulsadas con péptido E, el cuadrado opaco muestra los resultados obtenidos utilizando células diana pulsadas con péptido A, y el círculo vacío muestra los resultados obtenidos utilizando células no pulsadas con ningún péptido.

La Fig. 11 es un gráfico que muestra los resultados del ensayo de reactividad cruzada de las células efectoras inducidas por el péptido de tipo sustituido, péptido F con respecto al péptido de tipo no sustituido, péptido A. En la figura, el eje vertical muestra la actividad inductora de CTL (% de Lisis Específica), y el eje horizontal muestra la razón E/D. Asimismo, en la figura, el círculo opaco muestra los resultados obtenidos utilizando células diana pulsadas con péptido F, el cuadrado opaco muestra los resultados obtenidos utilizando células diana pulsadas con péptido A, y el círculo vacío muestra los resultados obtenidos utilizando células no pulsadas con ningún péptido.

La Fig. 12 es un gráfico que demuestra que se indujeron CTL específicos cuando se inmunizó un ratón transgénico que expresaba HLA-A24 con péptido G donde el resto cisteína de la posición 1 de WT1_{235-243} está sustituido por un resto serina. En la figura, el eje vertical muestra actividad citotóxica (% de Lisis Específica), y el eje horizontal muestra la razón E/D. En la figura, el círculo opaco muestra los resultados obtenidos utilizando células diana pulsadas con péptido G, y el círculo vacío muestra los resultados obtenidos utilizando células no pulsadas con ningún péptido.

La Fig. 13 es un gráfico que demuestra que se indujeron CTL específicos cuando se inmunizó un ratón transgénico que expresaba HLA-A24 con péptido H donde el resto cisteína de la posición 1 de WT1_{235-243} está sustituido por un resto alanina. En la figura, el eje vertical muestra actividad citotóxica (% de Lisis Específica), y el eje horizontal muestra la razón E/D. En la figura, el círculo opaco muestra los resultados obtenidos utilizando células diana pulsadas con péptido H, y el círculo vacío muestra los resultados obtenidos utilizando células no pulsadas con ningún péptido.

La Fig. 14 es un gráfico que demuestra que se indujeron CTL específicos cuando se inmunizó un ratón transgénico que expresaba HLA-A24 con péptido I donde el resto cisteína de la posición 1 del péptido A está sustituido por un resto ornitina. En la figura, el eje vertical muestra actividad citotóxica (% de Lisis Específica), y el eje horizontal muestra la razón E/D. En la figura, el círculo opaco muestra los resultados obtenidos utilizando células diana pulsadas con péptido I, y el círculo vacío muestra los resultados obtenidos utilizando células no pulsadas con ningún péptido.

La Fig. 15 es un gráfico que demuestra que se indujeron CTL específicos cuando se inmunizó un ratón transgénico que expresaba HLA-A24 con péptido J donde el resto cisteína de la posición 1 del péptido A está sustituido por un resto citrulina. En la figura, el eje vertical muestra actividad citotóxica (% de Lisis Específica), y el eje horizontal muestra la razón E/D. En la figura, el círculo opaco muestra los resultados obtenidos utilizando células diana pulsadas con péptido J, y el círculo vacío muestra los resultados obtenidos utilizando células no pulsadas con ningún péptido.

La Fig. 16 es un gráfico que demuestra que se indujeron CTL específicos cuando se inmunizó un ratón transgénico que expresaba HLA-A24 con péptido K donde el resto cisteína de la posición 1 del péptido A está sustituido por un resto leucina. En la figura, el eje vertical muestra actividad citotóxica (% de Lisis Específica), y el eje horizontal muestra la razón E/D. En la figura, el círculo opaco muestra los resultados obtenidos utilizando células diana pulsadas con péptido K, y el círculo vacío muestra los resultados obtenidos utilizando células no pulsadas con ningún péptido.

La Fig. 17 es un gráfico que demuestra que se indujeron CTL específicos cuando se inmunizó un ratón transgénico que expresaba HLA-A24 con péptido L donde el resto cisteína de la posición 1 del péptido A está sustituido por un resto fenilalanina. En la figura, el eje vertical muestra actividad citotóxica (% de Lisis Específica), y el eje horizontal muestra la razón E/D. En la figura, el círculo opaco muestra los resultados obtenidos utilizando células diana pulsadas con péptido L, y el círculo vacío muestra los resultados obtenidos utilizando células no pulsadas con ningún péptido.

La Fig. 18 es un gráfico que demuestra que se indujeron CTL específicos cuando se inmunizó un ratón transgénico que expresaba HLA-A24 con péptido M donde el resto cisteína de la posición 1 del péptido A está sustituido por un resto asparagina. En la figura, el eje vertical muestra actividad citotóxica (% de Lisis Específica), y el eje horizontal muestra la razón E/D. En la figura, el círculo opaco muestra los resultados obtenidos utilizando células diana pulsadas con péptido M, y el círculo vacío muestra los resultados obtenidos utilizando células no pulsadas con ningún péptido.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

Según se utiliza en la memoria y en los dibujos de la presente solicitud, se emplean las siguientes abreviaturas para cada resto aminoácido.

Ala:: resto alanina

Arg:: resto arginina

Asn:: resto asparagina

Asp:: resto ácido aspártico

Cys:: resto cisteína

Gln:: resto glutamina

Glu:: resto ácido glutámico

Gly:: resto glicina

His:: resto histidina

Ile:: resto isoleucina

Leu:: resto leucina

Lys:: resto lisina

Met:: resto metionina

Phe:: resto fenilalanina

Pro:: resto prolina

Ser:: resto serina

Thr:: resto treonina

Trp:: resto triptófano

Tyr:: resto tirosina

Val:: resto valina

Abu:: resto ácido 2-aminobutírico (también puede ser referido como resto ácido \alpha-aminobutírico)

Orn:: resto ornitina

Cit:: resto citrulina

Puede existir un isómero óptico para los restos aminoácido mostrados antes, y semejante aminoácido puede ser un isómero L y D, prefiriéndose el isómero L.

Según se utiliza en la presente memoria, la secuencia de aminoácidos de un péptido se representa de acuerdo con el método convencional, en el que el resto aminoácido del extremo N se describe a la izquierda, mientras el resto aminoácido del extremo C se describe a la derecha.

(I) Péptidos de acuerdo con la presente invención

Los péptidos de la presente invención derivan de WT1 humano (Cell., 60:509, 1990, Núm. de Acceso de la base de datos NCBI XP_034418, SEQ ID NO: 1), y tienen una actividad inductora de los CTL (una inmunogenicidad) de una manera restringida a HLA-A24.

Los péptidos de la invención pueden experimentar posiblemente un procesamiento en una célula presentadora de antígenos para generar péptidos antigénicos cancerosos, que se unen después a un antígeno HLA-A24, y se presentan después sobre la célula presentadora de antígenos, induciendo de ese modo los CTL. Semejante propiedad puede ser examinada utilizando modelos animales para un HLA-A24 descritos en el documento WO 02/47474, y en Int J. Cancer: 100, 565-570 (2002).

El péptido de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula:

X-Y-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu: (SEQ ID NO: 4)

donde X representa Ser, Ala, Abu, Arg, Lys, Orn, Cit, Leu, Phe, o Asn, e Y representa Tyr o Met, y tiene una actividad inductora de los CTL. Específicamente, el péptido de la invención comprende una cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas de un grupo que consiste en:

Ser Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 5),

Ala Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 6),

Abu Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 7),

Arg Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 8),

Lys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 9),

Orn Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 10),

Cit Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 11),

Leu Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 12),

Phe Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 13),

Asn Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 14),

Ser Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 15),

Ala Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 16),

Abu Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 17),

Arg Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 18),

Lys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 19),

Orn Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 20),

Cit Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 21),

Leu Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 22),

Phe Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 23), y

Asn Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 24),

y tienen una actividad inductora de los CTL. Entre ellos se prefiere un péptido que comprende una cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionada de un grupo que consiste en: SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, y 16.

Los péptidos de la invención que comprenden una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 4 no están limitados en ningún sentido con tal que los péptidos tengan la propiedad de que el péptido antigénico canceroso derivado del péptido sea presentado sobre una célula presentadora de antígenos para inducir los CTL. La longitud típica de los restos aminoácido del péptido es normalmente de 9 a 100, preferiblemente de 9 a 50, más preferiblemente de 9 a 30, aún más preferiblemente de 9 a 20, e incluso más preferiblemente de 9 a 11. En este contexto, un péptido antigénico canceroso se define como un péptido que provoca una actividad inductora de CTL cuando se une a un antígeno HLA, y se presenta sobre una célula presentadora de antígenos.

Los péptidos de la invención se pueden preparar de acuerdo con un método utilizado normalmente en la química de los péptidos. Los ejemplos de tales preparaciones se describen en las publicaciones incluyendo "Peptide Synthesis", Interscience, Nueva York, 1966; "The Proteins", Vol. 2, Academic Press Inc., Nueva York, 1976; "Pepuchido-Gosei", Maruzen Co. Ltd., 1975; "Pepuchido-Gosei-no-Kiso-to-Jikkenn", Maruzen Co. Ltd., 1985; y "Iyakuhin-no-Kaihatu, Zoku, vol. 14, Peputido-Gosei", Hirokawa Shoten, 1991.

Los péptidos de la invención también se pueden preparar basándose en la información de la secuencia del polinucleótido que codifica el péptido de la invención de acuerdo con la síntesis de ADN convencional y los procedimientos de ingeniería genética. Los procedimientos tales como la síntesis de ADN, las construcciones de diferentes plásmidos, la transfección de los mismos en células anfitrionas, el cultivo de los transformantes, y la recuperación de las proteínas del cultivo se pueden llevar a cabo de acuerdo con los métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, los métodos descritos en las publicaciones (Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)), o el método descrito en el apartado (II) más adelante.

Las ilustraciones específicas de los péptidos de acuerdo con la invención se proporcionan más abajo.

Como se ha descrito antes, la presente invención se basa en el nuevo descubrimiento de que los péptidos de tipo sustituido en los que el resto cisteína de la posición 1 de un péptido de tipo natural derivado de WT1, WT1_{235-243} (SEQ ID NO: 2), o un péptido alterado en la posición 2 del péptido, WT1_{235-243}(2M\rightarrowY) (SEQ ID NO: 3) está sustituido por un resto serina, un resto alanina, un resto arginina, un resto lisina, un resto leucina, un resto fenilalanina, un resto asparagina, un resto ácido 2-aminobutírico (resto ácido \alpha-aminobutírico), un resto ornitina, o un resto citrulina, tienen actividad inductora de los CTL in vivo. Los péptidos de acuerdo con la invención que comprenden uno cualquiera de esos péptidos de tipo sustituido son útiles como ingrediente activo comprendido en una composición para inducir los CTL o en una vacuna para el cáncer utilizados en la inmunoterapia para el cáncer.

Los ejemplos de los péptidos más específicos de acuerdo con la invención incluyen los péptidos mostrados en los apartados (1-1) a (1-4) más abajo. (1-1) Péptidos antigénicos cancerosos que consisten en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

Los ejemplos específicos de los péptidos de acuerdo con la invención incluyen péptidos antigénicos cancerosos que consisten en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Los péptidos antigénicos cancerosos que consisten en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 incluyen específicamente un péptido antigénico canceroso que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en

Ser Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 5),

Ala Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 6),

Abu Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 7),

Arg Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 8),

Lys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 9),

Orn Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 10),

Cit Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 11),

Leu Thr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 12),

Phe Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 13),

Asn Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 14),

Ser Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 15),

Ala Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 16),

Abu Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 17),

Arg Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 18),

Lys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 19),

Orn Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 20),

Cit Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 21),

Leu Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 22),

Phe Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 23), y

Asn Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 24).

Entre ellos, se prefieren un péptido antigénico canceroso que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 5, un péptido antigénico canceroso que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 6, un péptido antigénico canceroso que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 7, un péptido antigénico canceroso que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 8, un péptido antigénico canceroso que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 9, un péptido antigénico canceroso que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 10, un péptido antigénico canceroso que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 11, un péptido antigénico canceroso que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 12, un péptido antigénico canceroso que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 13, un péptido antigénico canceroso que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 14, un péptido antigénico canceroso que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 15, y un péptido antigénico canceroso que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 16.

Esos péptidos se pueden preparar de acuerdo con métodos comunes para la síntesis peptídica como se ha descrito antes. La actividad de esos péptidos para inducir los CTL se puede determinar en modelos animales para humanos descritos en el documento WO 02/47474, y en Int J. Cancer. 100, 565-570 (2002).

(1-2) Péptidos antigénicos cancerosos que comprenden una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 4, y que contienen la estructura motivo

Se ha sabido que existen muchos subtipos en las moléculas de HLA, y que las secuencias de aminoácidos de péptidos antigénicos que se unen a cada subtipo obedecen a una cierta regla (motivo de unión). También se ha sabido que, en lo que se refiere al motivo de unión para HLA-A24, el resto aminoácido de la posición 2 es un resto tirosina (Tyr), un resto fenilalanina (Phe), un resto metionina (Met), o un resto triptófano (Trp), y el aminoácido del extremo C es un resto fenilalanina (Phe), un resto leucina (Leu), un resto isoleucina (Ile), un resto triptófano (Trp), o un resto metionina (Met) en los péptidos que consisten en 8 a 11 restos aminoácido. (J. Immunol., 152, p3913, 1994, Immunogenetics, 41, p178, 1995, J. Immunol., 155, p4307, 1994).

Basándose en la regla, los ejemplos de los péptidos de acuerdo con la invención también incluyen péptidos antigénicos cancerosos que comprenden una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 4, y que contienen una estructura motivo. Específicamente, incluyen péptidos que consisten en 10 restos aminoácido donde Phe, Leu, Ile, Trp, o Met se añaden al extremo C de péptido mostrado en el SEQ ID NO: 4, o péptidos que consisten en 11 restos aminoácido donde Phe, Leu, Ile, Trp, o Met se añaden adicionalmente al extremo C de uno cualquiera de dichos péptidos que consisten en 10 restos aminoácido, todos los cuales tienen actividad inductora de los CTL.

Los ejemplos más específicos incluyen péptidos que consisten en 10 restos aminoácido donde Phe, Leu, Ile, Trp, o Met se añaden al extremo C de un péptido que consiste en 9 restos aminoácido mostrados a continuación:

Ser Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 5),

Ala Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 6),

Abu Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 7),

Arg Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 8),

Lys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 9),

Orn Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 10),

Cit Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 11),

Leu Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 12),

Phe Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 13),

Asn Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 14),

Ser Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 15),

Ala Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 16),

Abu Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 17),

Arg Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 18),

Lys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 19),

Orn Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 20),

Cit Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 21),

Leu Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 22),

Phe Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 23), o

Asn Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu: (SEQ ID NO: 24),

o péptidos que consisten en 11 restos aminoácido donde Phe, Leu, Ile, Trp, o Met se añaden adicionalmente al extremo C de uno cualquiera de dichos péptidos que consisten en 10 restos aminoácido, todos los cuales tienen actividad inductora de los CTL.

Los péptidos preferidos incluyen aquellos que consisten en 10 restos aminoácido donde Phe, Leu, Ile, Trp, o Met se añaden al extremo C de un péptido mostrado en los SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 16, o péptidos que consisten en 11 restos aminoácido donde Phe, Leu, Ile, Trp, o Met se añaden adicionalmente al extremo C de una cualquiera de dichos péptidos que consisten en 10 restos aminoácido, todos los cuales tienen actividad inductora de los CTL.

Aquellos péptidos mostrados antes también pueden ser preparados de acuerdo con métodos comunes para la síntesis peptídica como se ha descrito antes. La actividad de esos péptidos para inducir los CTL puede ser determinada en modelos animales para humanos descritos en el documento WO 02/47474, y en Int J. Cancer. 100, 565-570 (2002).

(1-3) Péptidos epitópicos que comprende una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 4

Recientemente, se ha demostrado que un péptido en el que muchos epítopos de CTL (péptidos antigénicos) están unidos entre sí (péptido epitópico) tiene actividad para inducir eficazmente los CTL. Por ejemplo, en Journal of Immunology 1998, 161: 3186-3194 se describe que el péptido de aproximadamente 30 unidades en el que los epítopos de CTL restringidos a HLA-A2, -A3, -A11, B53-derivados de una proteína antigénica cancerosa, PSA, están unidos entre sí indujo CTL específicos para el epítopo de los CTL relevantes in vivo.

Asimismo, se ha demostrado que un péptido (péptido epitópico) en el que un epítopo de CTL y un epítopo coadyuvante están unidos entre sí indujo eficazmente los CTL. El epítopo coadyuvante hace referencia a un péptido que tiene actividad activadora de las células T CD4 positivas (Immunity., 1:751, 1994), y se sabe que incluyen HBVc128-140 derivado del virus de la hepatitis B y TT947-967 derivado de la toxina del tétanos. Se cree que las células T CD4 positivas activadas por el epítopo coadyuvante son importantes en las respuestas inmunitarias para destruir tumores debido a que ejercen acciones tales como la inducción de la diferenciación de los CTL y el mantenimiento de los CTL, y la activación de los efectores incluyendo un macrófago. Como ejemplos de tales péptidos en los que un epítopo coadyuvante y un epítopo de CTL están unidos entre sí, en Journal of Immunology 1999, 162: 3915-3925, por ejemplo, se describe que un ADN que codifica el péptido unido a los seis péptidos antigénicos restringidos a HLA-A2, los tres péptidos antigénicos restringidos a HLA-A 11 derivados de HBV, y un epítopo coadyuvante (minigen) indujeron eficazmente los CTL en respuesta a los epítopos relevantes in vivo. Además, el péptido donde el epítopo de CTL (péptido antigénico canceroso que consiste en las posiciones 280 a 288 de un antígeno de melanoma, gp 100) y el epítopo coadyuvante (epítopo coadyuvante T derivado de la toxina del tétanos) están unidos entre si ha sido sometido a ensayo en una prueba clínica (Clinical Cancer Res., 2001, 7: 3012-3024).

Basándose en estos hechos, también es ejemplificado como péptido de acuerdo con la invención un péptido (péptido epitópico) donde diversos epítopos que incluyen los péptidos antigénicos cancerosos de la presente invención como se muestra en los apartados (1-1) o (1-2) anteriores están unidos, que tiene actividad inductora de los CTL in vivo.

En este contexto, un péptido epitópico hace referencia a un péptido donde muchos epítopos de CTL (péptidos antigénicos) están unidos entre sí (1), o donde un epítopo de CTL y un epítopo coadyuvante están unidos entre sí (2), ambos los cuales experimentan el procesamiento en una célula presentadora de antígenos para generar péptidos antigénicos cancerosos, que después son presentados sobre la célula presentadora de antígenos, induciendo de ese modo los CTL.

En caso de que el epítopo que se va a unir con el péptido antigénico canceroso de la invención sea un epítopo de CTL, los epítopos de CTL utilizables incluyen aquellos derivados de WT1 que están restringidos a HLA-A1, -A0201, - A0204, -A0205, -A0206, -A0207, -A11, -A24, -A31, -A6801, -B7, -B8, - B2705, -B37, -Cw0401, -Cw0602, o similar. Se pueden unir entre sí dos o más epítopos de CTL, y un epítopo de CTL puede tener de 8 a 14 restos aminoácido de longitud basándose en el análisis de péptidos antigénicos unidos a las diferentes moléculas de HLA (Immunogenetics, 41:178, 1995).

En caso de que el epítopo que se va a unir con el péptido antigénico canceroso de la invención sea un epítopo coadyuvante, se pueden ejemplificar HBVc128-140 derivado del virus de la hepatitis B y TT947-967 derivado de la toxina del tétanos como se ha descrito antes. La longitud del epítopo coadyuvante puede ser de aproximadamente 13 a aproximadamente 30, preferiblemente de aproximadamente 13 a aproximadamente 17 restos aminoácido.

Los ejemplos específicos de los péptidos epitópicos de acuerdo con la invención incluyen péptidos epitópicos en los que uno o más péptidos que consisten en una secuencia de aminoácidos uno cualquiera de los SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, y 24 están unidos con un epítopo coadyuvante. Más específicamente, se ejemplifican un péptido epitópico donde uno o más péptidos que consisten en una secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, y 16 están unidos con un epítopo coadyuvante derivado de la toxina del tétanos (por ejemplo, Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu; SEQ ID NO: 25), y un péptido epitópico donde uno o más péptidos de una secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, y 16 están unidos con Ala Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu (SEQ ID NO: 26, Clinical Cancer Res., 2001, 7: 3012-3024).

Aquellos péptidos epitópicos en los que diferentes epítopos están unidos entre sí se pueden preparar de acuerdo con los métodos comunes de síntesis peptídica como se ha descrito antes. Los péptidos también se pueden preparar basándose en la información de la secuencia del polinucleótido que codifica el péptido en el que diferentes epítopos están unidos entre sí de acuerdo con la síntesis convencional de ADN y los procedimientos de ingeniería genética. A saber, los péptidos epitópicos pueden ser preparados insertando el polinucleótido en un vector de expresión bien conocido, transformando una célula anfitriona con el vector de expresión recombinante resultante, cultivando los transformantes, y recuperando del cultivo el péptido epitópico en el que los diferentes péptidos epitópicos previstos están unidos entre sí. Esos procedimientos se pueden llevar a cabo de acuerdo con los métodos descritos en las publicaciones (Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)), o el método descrito más adelante en el apartado (II).

La actividad de los péptidos epitópicos preparados en los que diferentes epítopos están unidos entre sí puede ser determinada en busca de la actividad inductora de los CTL por medio de un análisis utilizando modelos animales para humanos descritos en el documento WO 02/47474, y en Int J. Cancer. 100, 565-570 (2002).

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(1-4) Péptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 4 donde el grupo amino del aminoácido N-terminal o el grupo carboxilo del aminoácido C-terminal está modificado

Adicionalmente, es posible modificar el grupo amino del aminoácido N-terminal o el grupo carboxi del aminoácido C-terminal en los péptidos de la invención como se ha descrito en los apartados (1-1) a (1-3) anteriores.

En este contexto, los grupos modificadores del grupo amino del aminoácido N-terminal incluyen un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo fenilo, un grupo cicloalquilo, un grupo acilo, y similares, de los cuales se pueden seleccionar de 1 a 3 grupos. Los ejemplos del grupo acilo incluyen un grupo alcanoílo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo alcanoílo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono sustituido con un grupo fenilo, un grupo carbonilo sustituido con un grupo cicloalquilo que tiene de 5 a 7 átomos de carbono, un grupo alquilsulfonilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo fenilsulfonilo, un grupo alcoxicarbonilo que tiene de 2 a 6 átomos de carbono, un grupo alcoxicarbonilo sustituido con un grupo fenilo, un grupo carbonilo sustituido con un cicloalcoxi que tiene de 5 a 7 átomos de carbono, un grupo fenoxicarbonilo, y similares.

Los péptidos en los que el grupo carboxilo del aminoácido C-terminal está modificado incluyen ésteres y amidas. Los ésteres específicos incluyen un éster alquílico C_{1}-C_{6}, un éster alquílico C_{0}-C_{6} sustituido con un grupo fenilo, un éster cicloalquílico C_{5}-C_{7}, y similares, mientras las amidas específicas incluyen una amida, una amida sustituida con uno o dos grupos alquilo C_{1}-C_{6}, una amida sustituida con uno o dos grupos alquilo C_{0}-C_{6} sustituida con un grupo fenilo, una amida que forma un azacicloalcano de 5 a 7 miembros que contiene el átomo de nitrógeno de la amida, y similares.

Los péptidos de la invención son útiles, por ejemplo, 1) como ingrediente activo comprendido en una composición para inducir los CTL o una vacuna para el cáncer descrita más adelante, o 2) en la preparación de células presentadoras de antígenos descrita más adelante.

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(II) Polinucleótidos, vectores de expresión, y transformantes de la presente invención

La presente invención también proporciona los polinucleótidos que codifican los péptidos de la invención descritos antes. Los polinucleótidos que codifican los péptidos de la invención pueden estar en forma de ADN o ARN. Esos polinucleótidos se pueden preparar fácilmente basándose en la información de las secuencias de aminoácidos de los péptidos de la invención, y en los ADN que los codifican. Específicamente, pueden ser preparados de acuerdo con los métodos comunes de síntesis de ADN, o amplificación mediante PCR.

Los ejemplos de los polinucleótidos de la invención incluyen un polinucleótido que codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 4, y que tiene actividad inductora de los CTL. Los ejemplos específicos de los polinucleótidos incluyen un polinucleótido que codifica un péptido que comprende una cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, y 24, y que tiene actividad inductora de los CTL. Entre ellos, se prefiere un polinucleótido que codifica un péptido que comprende una cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, y 16, y que tiene actividad inductora de los CTL.

Específicamente, se ejemplifica un polinucleótido que codifica un péptido epitópico que comprende una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 4 como se describe en el apartado (1-3) anterior. Más específicamente, se ejemplifica un polinucleótido que codifica un péptido epitópico que comprende una secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, y 24. Aún más preferiblemente, se ejemplifican polinucleótidos que codifican un péptido epitópico donde uno o más péptidos que consisten en secuencias de aminoácidos de uno cualquiera de los SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, y 16 están unidos con un epítopo coadyuvante, incluyendo un polinucleótido que codifica un péptido donde uno o más péptidos que consisten en una secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, y 16 están unidos a un epítopo coadyuvante derivado de la toxina del tétanos (por ejemplo, Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu; SEQ ID NO: 25), y un péptido donde uno o más péptidos que consisten en una secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, y 16 están unidos a Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu (SEQ ID NO: 26, Clinical Cancer Res., 2001, 7: 3012-3024).

Los polinucleótidos de la presente invención así preparados se pueden insertar en un vector de expresión para preparar vectores de expresión recombinantes para la expresión de los péptidos de la invención.

Los vectores de expresión según se utilizan en la presente memoria se pueden seleccionar como apropiados dependiendo del anfitrión y del propósito de su uso, e incluyen un plásmido, un vector de fago, y un vector de virus.

Los ejemplos de vectores utilizados para anfitriones de Escherichia coli incluyen vectores plasmídicos tales como pUC118, pUC 119, pBR322, y pCR3, y vectores de fagos tales como AZAPII, y \lambdagt11. Los ejemplos de los vectores utilizados para anfitriones de levadura incluyen pYES2, y pYEUra3. Los ejemplos de los vectores utilizados para anfitriones de células de insecto incluyen pAcSGHisNT-A. Los ejemplos de los vectores utilizados para anfitriones de células animales incluyen vectores plasmídicos tales como pKCR, pCDM8, pGL2, pcDNA3.1, pRc/RSV, y pRc/CMV, y vectores de virus tales como un vector de retrovirus, un vector de adenovirus, y un vector de virus adenoasociado.

Esos vectores pueden comprender un factor tal como un promotor capaz de inducir la expresión, un gen que codifica una secuencia señal, un gen marcador de selección, un terminador, o similar, si fuera necesario.

Asimismo, los vectores pueden comprender una secuencia adicional para expresar una proteína como proteína de fusión con tiorredoxina, etiqueta His, o GST (glutation-S-transferasa) para un fácil aislamiento y purificación. En este caso, se pueden utilizar un vector para la expresión de una proteína de fusión con GST que comprende un promotor (lac, tac, trc, trp, CMV, promotor temprano de SV40, o similar) que funciona adecuadamente en una célula anfitriona (esto es, pGEX4T), un vector que comprende una secuencia etiqueta tal como Myc, His (esto es, pcDNA3.1/Myc-His), y un vector que expresa una proteína de fusión que comprende tiorredoxina o una etiqueta His (pET32a).

La actividad inductora de los CTL de los polinucleótidos de la presente invención o los vectores de expresión que los comprenden puede ser determinada en modelos animales para seres humanos descritos en el documento WO 02/47474, y en Int J. Cancer: 100, 565-570 (2002).

Los polinucleótidos o los vectores de expresión que los comprenden de la invención son útiles, por ejemplo, 1) en la preparación de los péptidos de la invención como se describe más adelante, 2) en la terapia génica como se describe más adelante, o 3) en la preparación de células presentadoras de antígenos como se describe más adelante.

Los vectores de expresión de la invención preparados de este modo se pueden transformar en anfitriones para preparar transformantes que comprenden los vectores de expresión.

Los anfitriones utilizados en la presente memoria incluyen Escherichia coli, una levadura, una célula de insecto, y una célula animal. Escherichia coli incluye las líneas K-12 de E. coli tales como la cepa HB101, la cepa C600, la cepa JM109, la cepa DH5\alpha, y la cepa AD494(DE3). Las levaduras incluyen Saccharomyces cerevisiae. Las células animales incluyen las células L929, las células BALB/c3T3, las células C127, las células CHO, las células COS, las células Vero, y las células Hela. Las células de insecto incluyen sf9.

Se pueden utilizar métodos comunes para la transformación adecuada de las respectivas células anfitrionas para transformar las células anfitrionas con un vector de expresión. Los métodos específicos incluyen el método del fosfato, el método de DEAE-dextrano, la electroporación, y un método en el que se utiliza un lípido para la transferencia génica (Lipofectamine, Lipofectin; Gibco-BRL). Después de la transformación, se pueden incubar los transformantes en un medio convencional que contiene un marcador de selección para seleccionar los transformantes en los que se ha transformado el vector de expresión descrito antes en una célula anfitriona.

Los transformantes preparados de este modo se pueden incubar en unas condiciones apropiadas para preparar los péptidos de la invención. El polipéptido puede ser aislado adicionalmente y purificado de acuerdo con los procedimientos comunes para las purificaciones bioquímicas. Los ejemplos de los procedimientos para la purificación incluyen la precipitación por adición de sal, la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de adsorción, la cromatografía de afinidad, y la cromatografía de filtración en gel. Cuando un polipéptido de la invención es expresado en forma de una proteína de fusión que comprende tiorredoxina, etiqueta His, GST, o similar, el polipéptido puede ser aislado y purificado mediante un método de purificación basado en una propiedad de semejante proteína de fusión o etiqueta.

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(III) Anticuerpos de la presente invención

La presente invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a un péptido de acuerdo con la invención. Los anticuerpos de la invención no están limitados a un anticuerpo específico, y puede ser un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal dirigido a un péptido de la invención como antígeno inmunitario.

Como se ha mencionado antes, los anticuerpos de la invención no están limitados a un anticuerpo específico con tal que se unan específicamente al péptido de la invención, y los ejemplos específicos incluyen un anticuerpo que se une específicamente a un péptido que consiste en una cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas entre los SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, y 24, y que tienen actividad inductora de los CTL. Entre ellos, se prefieren los anticuerpos que se unen específicamente a un péptido que consiste en una cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas entre los SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, y 16.

Las preparaciones para anticuerpos son bien conocidas, y los anticuerpos de la invención se pueden preparar de acuerdo con los métodos comunes bien conocidos en la técnica (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Sección 11.12 a 11.13, Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H, D. et al. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press Publisher, Nueva York 1989).

Específicamente, los anticuerpos se pueden preparar utilizando los péptidos de la invención (por ejemplo, un péptido antigénico canceroso que consiste en una cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas entre los SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, y 16) como inmunógeno para inmunizar un animal no humano tal como un conejo, seguido de la obtención de los anticuerpos a partir del suero del animal inmunizado de la manera convencional. Por otra parte, se pueden preparar anticuerpos monoclonales inmunizando un animal no humano tal como un ratón con un péptido de la invención (por ejemplo, un péptido antigénico canceroso que consiste en una cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas entre los SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, y 16), y preparando un hibridoma a partir de los esplenocitos obtenidos y de células de mieloma mediante fusión celular, seguido de la obtención de los anticuerpos a partir del hibridoma (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Sección 11.4 a 11.11).

Los anticuerpos dirigidos a los péptidos de la invención se pueden preparar de manera que la reacción inmunológica se intensifique utilizando diversos coadyuvantes adecuados para el anfitrión. Los ejemplos de los coadyuvantes incluyen coadyuvante de Freund, geles minerales tal como hidróxido de aluminio, tensioactivos tales como lisolecitina, poliol Pluronic, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, Hemocianina de Lapa Ojo de Cerradura, y dinitrofenol, y coadyuvantes humanos tales como BCG (Bacillo Calmette Guerin) y Corynebacterium-parvum.

Como se ha descrito antes, los anticuerpos que reconocen el péptido, así como los anticuerpos que neutralizan la actividad del péptido se pueden preparar fácilmente inmunizando apropiadamente un animal con los péptidos de la invención de una manera convencional. Tales anticuerpos se pueden utilizar en una cromatografía de afinidad, diagnosis inmunológica, y similares. La diagnosis inmunológica se puede seleccionar apropiadamente entre inmunotransferencia, radioinmunoanálisis (RIA), análisis de inmunoabsorción con enzima ligada (ELISA), análisis fluorescente o luminescente, y similares. La diagnosis inmunológica es útil para diagnosticar cánceres en los que se expresa el gen WT1, tales como cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer embrionario, cáncer de piel, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de útero, cáncer cervical, y cáncer de ovario.

(IV) Células presentadoras de antígenos de la presente invención

La invención proporciona células presentadoras de antígenos sobre las cuales se presenta un complejo entre un péptido antigénico canceroso de acuerdo con la invención y un antígeno HLA-A24.

Los ejemplos descritos más adelante demuestran que la administración de los péptidos de la invención induce los CTL, demostrando que las células presentadoras de antígenos sobre las cuales se presenta un complejo entre un péptido antigénico canceroso de acuerdo con la invención y un antígeno HLA-A24, existen en las células mononucleares de sangre periférica, y después los CTL son inducidos, reconociendo específicamente las células que presentan semejante complejo. Aquellas células presentadoras de antígenos sobre las cuales se presenta un complejo entre un antígeno HLA-A24 y un péptido antigénico canceroso de acuerdo con la invención, son útiles en la terapia celular (terapia de DC) como se describe más adelante.

Las células presentadoras de antígenos de acuerdo con la presente invención no están limitadas a una célula específica con tal que presenten sobre sus superficies un complejo entre un péptido antigénico canceroso de acuerdo con la invención y un antígeno HLA-A24. Incluyen específicamente células presentadoras de antígenos de células dendríticas sobre las cuales se presenta un complejo entre un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, y 24 y que tienen actividad inductora de los CTL, y un antígeno HLA-A24. Preferiblemente, incluyen células presentadoras de antígenos de células dendríticas sobre las cuales se presenta un complejo entre un péptido antigénico canceroso que consiste en una secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, y 16 y un antígeno HLA-A24.

Con el fin de preparar células presentadoras de antígenos como las utilizadas en la terapia celular (terapia de DC), se aíslan células que tienen una capacidad presentadora de antígenos de un paciente con cáncer, y se pulsan ex vivo con un péptido de la invención, o se transforman con un polinucleótido de la invención o un vector de expresión que los comprende para presentar un complejo entre un antígeno HLA-A24 y el péptido antigénico canceroso de la invención. En este contexto, la "célula que tiene una capacidad presentadora de antígenos" no está limitada a una célula específica con tal que sea una célula que exprese sobre su superficie un antígeno HLA-A24 que permita que un péptido de la invención sea presentado, y se ejemplifican las células dendríticas, que se cree que tienen especialmente una capacidad presentadora de antígenos elevada.

Las sustancias que se van a pulsar a las células que tienen una capacidad presentadora de antígenos pueden ser péptidos de la invención, así como polipéptidos que codifican los péptidos de la presente invención, y vectores de expresión que los comprenden.

Las células presentadoras de antígenos de la presente invención se pueden preparar, por ejemplo, aislando células que tienen una capacidad presentadora de antígenos de un paciente con cáncer, pulsando las células ex vivo con un péptido de la invención (p. ej., el péptido antigénico canceroso que consiste en una secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, y 16), y preparando un complejo entre un antígeno HLA-A24 y el péptido antigénico canceroso de la invención (Cancer Immunol. Immunother.,46: 82,1998, J. Immunol., 158: p1796, 1997, Cancer Res.,59: p 1184, 1999). Cuando se utilizan células dendríticas, se pueden preparar células presentadoras de antígenos de la presente invención, por ejemplo, aislando linfocitos de sangre periférica de un paciente con cáncer utilizando el método con Ficoll, separando las células no adherentes, incubando las células adherentes en presencia de GM-CSF e IL-4 para inducir células dendríticas, e incubando y pulsando las células dendríticas resultantes con un péptido de la invención, o similar.

Cuando las células presentadoras de antígenos de la invención se preparan transformando las células que tienen una capacidad presentadora de antígenos descrita antes con un polinucleótido que codifica el péptido de la invención (p. ej., un polinucleótido que codifica el péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, y 16), o con un vector de expresión que los comprende, semejante preparación del polinucleótido en forma de ADN, se puede llevar a cabo consultando, por ejemplo, Cancer Res., 56:p5672, 1996, o J. Immunol., 161: p5607, 1998. De un modo similar, semejante preparación del polinucleótido en forma de ARN también permite preparar células presentadoras de antígenos, y después por ejemplo se puede consultar J. Exp. Med., 184:p465, 1996.

Las células presentadoras de antígenos preparadas de este modo descrito antes son útiles como ingrediente activo comprendido en una composición para inducir los CTL o una vacuna para el cáncer, o en la terapia celular (terapia de DC) como se describe más adelante.

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(V) CTL

También se describen en la presente memoria los CTL que reconocen un complejo entre un péptido antigénico canceroso de la invención y un antígeno HLA-A24.

Los ejemplos descritos más adelante demuestran que la administración de los péptidos de la invención inducen los CTL, demostrando que las células presentadoras de antígenos sobre las cuales se presenta un complejo entre un péptido antigénico canceroso de la invención y un antígeno HLA-A24, existen en células mononucleares de sangre periférica, y después los CTL son inducidos, reconociendo específicamente las células sobre las cuales se presenta un complejo. Aquellos CTL que reconocen específicamente un complejo entre un antígeno HLA-A24 y un péptido antigénico canceroso de la invención son útiles en la inmunoterapia adaptativa como se describe más adelante.

Los CTL no están limitados a CTL específicos con tal que reconozcan específicamente un complejo entre un péptido antigénico canceroso de la invención y un antígeno HLA-A24, y particularmente incluyen CTL que reconocen específicamente un complejo entre un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, y 24 y que tiene una actividad inductora de los CTL, y un antígeno HLA-A24. Entre ellos están los CTL que reconocen específicamente un complejo entre un péptido antigénico canceroso que consiste en una secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, y 16 y un antígeno HLA-A24.

Con el fin de preparar CTL utilizados en la inmunoterapia adaptativa, por ejemplo, se aíslan linfocitos periféricos de un paciente, y se estimulan in vitro con un péptido de la invención (p. ej. un péptido antigénico canceroso que consiste en una secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, y 16), o un polinucleótido que codifica el péptido de la invención (p. ej. un polinucleótido que codifica el péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, y 16) o un vector de expresión que lo comprende (Journal of Experimental Medicine 1999, 190: 1669).

Los CTL preparados como se describe antes son útiles como ingrediente activo comprendido en una vacuna para el cáncer, o en inmunoterapia adaptativa.

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(VI) Composiciones farmacéuticas utilizables como vacunas para el cáncer

Los péptidos de la presente invención, los polinucleótidos de la presente invención, los vectores de expresión de la presente invención, las células presentadoras de antígenos de la presente invención, y los CTL descritos antes se pueden utilizar como ingrediente activo comprendido en una composición para inducir CTL o en una vacuna para el cáncer, cuando se formula en una forma apropiada para las respectivas sustancias, que se ilustran más abajo.

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(6-1) Vacunas contra el cáncer que comprenden un péptido de la presente invención como ingrediente activo

Los CTL inducidos por los péptidos de la invención, que tienen actividad inductora de los CTL, pueden destruir cánceres por medio de su actividad citotóxica y de la producción de linfoquinas. De este modo, los péptidos de la presente invención se pueden utilizar como ingrediente activo comprendido en una vacuna contra el cáncer para el tratamiento o la prevención de los cánceres. En una realización, la invención proporciona una vacuna contra el cáncer que comprende como ingrediente eficaz un péptido de la invención (una composición farmacéutica utilizable como vacuna contra el cáncer). Cuando la vacuna contra el cáncer de la invención se administra a un paciente con cáncer positivo para HLA-A24 y positivo para WT1, el péptido (p. ej. un péptido antigénico canceroso que consiste en una secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, y 16) se presenta sobre un antígeno HLA-A24 de las células presentadoras de antígenos, y después los CTL específicos para el complejo presentado que comprende el antígeno HLA-A24 y el péptido proliferan eficazmente, y destruyen las células cancerosas. De este modo, se logra el tratamiento o la prevención del cáncer. Las vacunas contra el cáncer de la invención se pueden utilizar para tratar o presentar cánceres en los que el nivel de expresión del gen WT1 es elevado, incluyendo cánceres de la sangre tales como leucemia, síndrome mielodisplásico, mieloma múltiple y linfoma maligno, y cánceres sólidos tales como cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer embrionario, cáncer hepático, cáncer cutáneo, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de útero, cáncer cervical, y cáncer de ovario.

Con respecto a esto, como otra realización, la invención proporciona la aplicación de las vacunas contra el cáncer de la presente invención para el tratamiento o la prevención del cáncer en un paciente con cáncer que lo necesite, que es positivo para HLA-A24, y positivo para WT1.

Las vacunas contra el cáncer que comprenden un péptido de la presente invención como ingrediente activo pueden comprender un único epítopo de CTL (p. ej. un péptido antigénico canceroso que consiste en una secuencia de aminoácidos de uno cualquiera de los SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, y 16) como ingrediente activo, o un péptido epitópico unido a otro péptido (un epítopo de CTL o un epítopo coadyuvante) como ingrediente activo. Recientemente, se ha demostrado que un péptido epitópico donde muchos epítopos de CTL (péptidos antigénicos) están unidos entre sí tiene actividad inductora de CTL eficazmente in vivo. Por ejemplo, en Journal of Immunology 1998, 161: 3186-3194 se describe que un péptido epitópico de aproximadamente 30 unidades donde los epítopos de CTL restringidos por HLA-A2, A3, A11, B53 (péptidos antigénicos) derivados de una proteína antigénica de cáncer PSA, están unidos entre sí indujo CTL específicos para el epítopo de CTL relevante in vivo. Asimismo, se ha demostrado que un péptido epitópico donde un epítopo de CTL y un epítopo coadyuvante están unidos entre sí indujo eficazmente los CTL. Cuando un péptido de la invención es administrado en forma de semejantes péptidos epitópicos, el péptido es introducido en células presentadoras de antígenos, y después sometido a degradación intracelular para generar los respectivos péptidos antigénicos, que se unen a un antígeno HLA para formar complejos. Los complejos se presentan de forma compacta sobre la superficie celular de las células presentadoras de antígenos, y después los CTL específicos para los complejos proliferan eficazmente, y destruyen las células cancerosas. De este modo, se logra el tratamiento o la prevención de los cánceres.

Las vacunas contra el cáncer que comprenden el péptido de la presente invención como ingrediente activo también pueden ser administradas junto con un portador farmacéuticamente aceptable tal como un coadyuvante adecuado, o en una forma de dosificación particulada con el fin de establecer eficazmente la inmunidad celular. Para cada fin, son aplicables aquellos coadyuvantes descritos en las publicaciones (Clin. Microbiol. Rev., 7:277-289, 1994), y específicamente incluyen componentes derivados de bacterias, citoquinas, componentes derivados de plantas, geles minerales tal como hidróxido de aluminio, tensioactivos tales como lisolecitina y poliol Pluronic, polianiones, péptidos, y emulsiones oleosas (formulaciones en emulsión). Asimismo, también son posibles formulaciones liposomales, formulaciones particuladas en las cuales el ingrediente está unido a cuentas que tienen un diámetro de varios \mum, o formulaciones en las cuales el ingrediente está anclado a lípidos.

La administración se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante inyección intradérmica, subcutánea, intramuscular o intravenosa. Aunque la dosis de un péptido de la presente invención en las formulaciones puede variar dependiendo de la enfermedad que se vaya a tratar, la edad y el peso del paciente, y similares, es típico administrar de 0,0001 mg a 1000 mg, preferiblemente de 0,001 mg a 1000 mg, más preferiblemente de 0,1 mg a 10 mg de un péptido de la invención de cada varios días a cada varios meses.

(6-2) Vacunas de ADN que comprenden un polinucleótido que codifica un péptido de la presente invención o un vector de expresión como ingrediente activo

Se pueden utilizar no sólo los péptidos de la presente invención descritos antes, si no también un polinucleótido que codifica el péptido y un vector de expresión que comprende el polinucleótido como ingrediente activo en una vacuna con ADN para el tratamiento o la prevención de cánceres. En la realización, la invención proporciona una vacuna contra el cáncer (una composición farmacéutica utilizable como vacuna contra el cáncer) que comprende como ingrediente eficaz un polinucleótido que codifica el péptido de la invención, o un vector de expresión que comprende el polinucleótido. En otra realización, la invención también proporciona la aplicación de la vacuna con ADN de acuerdo con la invención para el tratamiento o la prevención de un cáncer en un paciente positivo para un HLA-A24, y positivo para WT1.

Recientemente, se ha demostrado que un polinucleótido que codifica un péptido epitópico en el que muchos epítopos de CTL (péptidos antigénicos) están unidos entre sí o un polinucleótido que codifica un péptido epitópico en el que un epítopo de CTL y un epítopo coadyuvante están unidos entre sí tiene actividad inductora de los CTL eficazmente in vivo. En Journal of Immunology 1999, 162: 3915-3925, por ejemplo, se describe que un ADN (minigen) que codifica un péptido epitópico unido a los seis péptidos antigénicos restringidos por HLA-A2 y los tres péptidos antigénicos restringidos por HLA-A 11 derivados de HBV, y un epítopo coadyuvante ha inducido eficazmente CTL en respuesta a los epítopos relevantes in vivo.

De este modo, se puede utilizar como ingrediente activo en una vacuna contra el cáncer un vector de expresión apropiado que tiene incorporado un polinucleótido preparado uniendo uno o más polinucleótidos que codifican el péptido de la presente invención entre sí, o uniendo el polinucleótido de la invención a un polinucleótido que codifica otro péptido.

Los siguientes métodos se pueden utilizar para permitir que un polinucleótido de la invención actúe como ingrediente activo de las vacunas contra el cáncer (vacunas con ADN).

La introducción del polinucleótido de la presente invención en las células se puede llevar a cabo utilizando vectores virales, o de acuerdo con cualquier otro procedimiento (Nikkei-Science, Abril, 1994, págs. 20-45; Gekkan-Yakuji, 36(1), 23-48 (1994); Jikken-Igaku-Zokan, 12(15), 1994, y referencias allí citadas).

Los ejemplos de los métodos en los que se utilizan vectores virales incluyen métodos en los que un ADN de la presente invención se incorpora a un virus con ADN o ARN tal como un retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociado, herpesvirus, virus vaccinia, poxvirus, poliovirus, virus Sindbis, y se introduce en las células. Entre estos métodos, se prefieren particularmente aquellos que utilizan retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociados, o virus vaccinia.

Otros métodos incluyen un método en el que se inyecta directamente un plásmido de expresión intramuscularmente (vacunación con ADN), un método con liposomas, un método con Lipofectina, microinyección, método con fosfato de calcio y electroporación, y son particularmente preferidos la vacunación con ADN y el método con liposomas.

Para permitir que un polinucleótido de la presente invención actúe como medicamento en la práctica, existe un método in vivo en el cual el polinucleótido se introduce directamente en el organismo, y un método ex vivo en el que se obtienen ciertas células de seres humanos, y después de introducir ADN en dichas células extracorpóreamente, se reintroducen las células en el organismo (Nikkei-Science, Abril, 1994, págs. 20-45; Gekkan-Yakuji, 36(1), 23-48 (1994); Jikkenn-Igaku-Zokan, 12(15), 1994; y referencias allí citadas). Es más preferido un método in vivo.

En el caso de los métodos in vivo, las vacunas con ADN se pueden administrar mediante cualquier ruta apropiada dependiendo de la enfermedad y los síntomas que se vayan a tratar y de otros factores. Por ejemplo, se puede administrar por vía intravenosa, intraarterial, subcutánea, intradérmica, por ruta intramuscular, o similar. En el caso de los métodos in vivo, las composiciones se puede administrar en diversas formas de dosificación tal como en solución, y se formulan típicamente, por ejemplo, en forma de inyectable que contiene un polinucleótido de la presente invención como ingrediente activo, al cual también se pueden añadir portadores convencionales, si fuera necesario. Si se incluye un polinucleótido de la invención en liposomas o liposomas fusionados a la membrana (tales como los liposomas con virus Sendai (HVJ)), las composiciones pueden estar en forma de formulaciones de liposomas tales como suspensión, fármaco congelado, fármaco congelado concentrado por centrifugación, o similar.

Aunque la dosis de polinucleótido de la invención comprendida en las formulaciones puede variar dependiendo de la enfermedad que se vaya a tratar, la edad y el peso del paciente, y similares, es típico administrar de 0,0001 mg a 100 mg, preferiblemente de 0,001 mg a 10 mg, de un polinucleótido de la invención de cada varios días a cada varios meses.

Cuando un polinucleótido de la invención se administra a un paciente con cáncer, el polipéptido correspondiente al polinucleótido es altamente expresado en sus células presentadoras de antígenos. Después, los respectivos péptidos antigénicos cancerosos que se generan por la degradación celular se unen a un antígeno HLA para formar complejos, cuyos complejos son presentados compactamente sobre la superficie celular de las células presentadoras de antígenos. Después, los CTL específicos para los complejos proliferan eficazmente, y destruyen las células cancerosas. De este modo, se logra el tratamiento o la prevención de los cánceres. Las vacunas contra el cáncer que comprenden un polinucleótido de la invención o un vector de expresión que comprende el polinucleótido como ingrediente activo se pueden utilizar para tratar o prevenir cánceres en los que el nivel de expresión del gen WT1 es elevado, incluyendo cánceres de la sangre tales como leucemia, síndrome mielodisplásico, mieloma múltiple y linfoma maligno, y cánceres sólidos tales como cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer embrionario, cáncer hepático, cáncer cutáneo, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de útero, cáncer cervical, y cáncer de ovario.

(6-3) Vacunas contra el cáncer que comprenden una célula presentadora de antígenos de la presente invención como ingrediente activo

La invención proporciona una vacuna contra el cáncer que comprende una célula presentadora de antígenos de la presente invención como ingrediente activo.

Recientemente, se ha informado sobre la terapia celular (terapia de DC) en la que se aíslan linfocitos de sangre periférica de un paciente con cáncer, y las células dendríticas inducidas a partir de los linfocitos se pulsan in vitro con un péptido o similar para preparar células presentadoras de antígenos, que después se hacen volver al paciente mediante inyección subcutánea o similar (Cancer Immunol. Immunother., 46: 82, 1998, J. Immunol., 158: p1796, 1997, Cancer Res., 59: p1184, 1999, Cancer Res., 56: p5672, 1996, J. Immunol., 161: p5607, 1998, J. Exp. Med., 184: p465, 1996). De este modo, las células presentadoras de antígenos de la presente invención se pueden utilizar como ingrediente activo en una vacuna contra el cáncer en la terapia celular.

La vacuna contra el cáncer que comprende las células presentadoras de antígenos de la invención como ingrediente activo contiene preferiblemente solución salina fisiológica, solución salina tamponada con fosfato (PBS), medio, o similar para mantener establemente las células presentadoras de antígenos. Se puede administrar, por ejemplo, intravenosamente, subcutáneamente, o intradérmicamente. La dosis se ejemplifica mediante aquellas descritas en las publicaciones anteriormente mencionadas.

Reintroduciendo la vacuna contra el cáncer en el organismo del paciente, se inducen eficazmente los CTL específicos en los pacientes positivos para HLA-A24, y positivos para WT1 con el fin de lograr el tratamiento o la prevención del cáncer. La vacuna contra el cáncer que comprende las células presentadoras de antígenos de la invención como ingrediente activo se puede utilizar para tratar o prevenir los cánceres en los que el nivel de expresión del gen WT1 es elevado, incluyendo cánceres de la sangre tales como leucemia, síndrome mielodisplásico, mieloma múltiple y linfoma maligno, y cánceres sólidos tales como cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer embrionario, cáncer hepático, cáncer cutáneo, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de útero, cáncer cervical, y cáncer de ovario.

(6-4) Vacunas contra el cáncer que comprenden un CTL como ingrediente activo

También se describe en la presente memoria una vacuna contra el cáncer que comprende como ingrediente eficaz un CTL como se ha descrito antes (una composición farmacéutica utilizable como vacuna contra el cáncer). Los CTL descritos en la presente memoria son útiles en la inmunoterapia adaptativa más adelante.

Para los melanomas, se ha observado que una inmunoterapia adaptativa logra un efecto terapéutico en el que las células T que infiltran el tumor aisladas del propio paciente se cultivan ex vivo en grandes cantidades, y después se hacen volver al paciente (J. Natl. Cancer. Inst., 86:1159, 1994). Del mismo modo, en melanoma de ratón, se ha observado la supresión de metástasis mediante estimulación in vitro de esplenocitos con péptido antigénico canceroso TRP-2, proliferando de ese modo los CTL específicos para el péptido antigénico canceroso, y administrando dichos CTL en un ratón injertado con melanoma (J. Exp. Med., 185:453, 1997). Esta resultaba de la proliferación in vitro de los CTL que reconocen específicamente el complejo entre un antígeno HLA y el péptido antigénico canceroso sobre las células presentadoras de antígenos. Por consiguiente, se cree que es útil un tratamiento para tratar el cáncer que comprende estimular in vitro linfocitos de sangre periférica de un paciente utilizando un péptido, o un polinucleótido o un vector de expresión de acuerdo con la presente invención para hacer proliferar CTL específicos de tumores in vitro, y devolviendo con posterioridad los CTL al paciente. De este modo, los CTL descritos antes se pueden utilizar como ingrediente activo comprendido en una vacuna contra el cáncer utilizada en inmunoterapia adaptativa.

Una vacuna contra el cáncer que comprende los CTL descritos antes como ingrediente activo contiene preferiblemente solución salina fisiológica, solución salina tamponada con fosfato (PBS), medio, o similar para mantener establemente los CTL. Esta se puede administrar, por ejemplo, intravenosamente, subcutáneamente, o intradérmicamente. La dosis se ejemplifica por medio de aquellas descritas en las publicaciones anteriormente mencionadas.

Reintroduciendo la vacuna contra el cáncer en el organismo del paciente, se potencia el efecto citotóxico de los CTL sobre las células cancerosas en un paciente positivo para HLA-A24 y positivo para WT1, y se destruyen las células cancerosas, con el fin de lograr el tratamiento de los cánceres. La vacuna contra el cáncer que comprende los CTL anteriores como ingrediente activo se puede utilizar para tratar o prevenir los cánceres en los que el nivel de expresión génica de WT1 es elevada, incluyendo cánceres de la sangre tales como leucemia, síndrome mielodisplásico, mieloma múltiple y linfoma maligno, y cánceres sólidos tales como cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer embrionario, cáncer hepático, cáncer cutáneo, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de útero, cáncer cervical, y cáncer de ovario.

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Ejemplos

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.

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Ejemplo 1

Actividades inductoras de CTL de los Péptidos de Tipo sustituido en el resto de cisteína (1)

Los péptidos de tipo sustituido en los que el resto cisteína de la posición 1 del péptido A estaba sustituido por un resto serina, un resto alanina, un resto ácido 2-aminobutírico, un resto arginina, o un resto lisina (péptidos B, C, D, E, y F) fueron sintetizados, y fueron examinados en cuanto a su inmunogenicidad in vivo, donde el péptido A era un péptido en el que el resto metionina de la posición 2 del péptido compuesto por las posiciones 235 a 243 de la secuencia de aminoácidos de WT1 (SEQ ID NO: 1) (WT1_{235-243}, SEQ ID NO: 2) estaba sustituido por un resto tirosina. Las secuencias de aminoácidos del péptido no sustituido, péptido A (puede ser referido como péptido de tipo no sustituido), y los péptidos de tipo sustituido, péptidos B a F, se muestran más abajo:

péptido A:	Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu	(SEQ ID NO: 3)

péptido B:	Ser-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu	(SEQ ID NO: 5)

péptido C:	Ala-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu	(SEQ ID NO: 6)

péptido D:	Abu-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu	(SEQ ID NO: 7)

péptido E:	Arg Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu	(SEQ ID NO: 8), y

péptido F:	Lys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu	(SEQ ID NO: 9).

Se evaluó la inmunogenicidad in vivo de cada péptido antigénico utilizando los ratones transgénicos HLA-A2402/
K^{b}. La preparación de los ratones transgénicos y la determinación de la inmunogenicidad in vivo se llevaron a cabo de acuerdo con el documento WO 02/47474, y con Int J. Cancer: 100, 565-570 (2002) que las describen con detalle.

1) Preparación y administración de las composiciones farmacéuticas de los péptidos

El péptido del tipo no sustituido y los péptidos de tipo sustituido descritos antes se sintetizaron utilizando el método del Fmoc. Los péptidos sintetizados se ajustaron cada uno a 40 mg/ml en DMSO, y se diluyeron cada uno con agua esterilizada a 2,4 mg/ml. Después se mezclaron con 1,27 partes de coadyuvante incompleto de Freund (ISA51) utilizando una jeringa de vidrio para preparar una emulsión de agua en aceite. La emulsión resultante (200 \mul) se inyectó en el ratón transgénico HLA-A2402/K^{b} subcutáneamente en la base de la cola para su inmunización.

2) Preparación de esplenocitos

Siete días después de la inmunización, se separó el bazo y se trituró sobre la parte congelada de un porta de vidrio, y se recuperaron y se prepararon los esplenocitos. Una porción de los esplenocitos se trató para la hemólisis con un tampón ACK (NH_{4}Cl 0,15 M, KHCO_{3} 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,2-7,4) se pulsó con las composiciones de péptidos mencionadas anteriormente a 100 \mug/ml durante 1 hora, y se sembró en una placa de 24 pocillos a 7\times10^{5}/pocillo. Simultáneamente, los esplenocitos no pulsados con ningún péptido (7\times10^{6}/pocillo) se añadieron juntos, y se estimularon in vitro y se incubaron a 37ºC durante 5 a 6 días. La estimulación in vitro se llevó a cabo en medio RPMI 1640 con un suplemento de FCS al 10%, HEPES 10 mM, L-glutamina 20 mM, piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales en MEM 1 mM, vitamina en MEM al 1% y 2-mercaptoetanol 55 \muM.

3) Ensayo de la actividad citotóxica

El ensayo de actividad citotóxica se llevó a cabo de acuerdo con la manera convencional. Se utilizaron células EL4-A2402/K^{b} obtenidas transformando células EL-4 (DAINIPPON PHARMACEUTICAL CO., LTD., Catalogue No. 06-039) con un vector de expresión que codificaban HLA-A2402/K^{b}, y las células EL4-A2402/K^{b} pulsadas con péptido A, B, C, D, E, o F como células diana (D). Las células EL4-A2402/K^{b} se prepararon de una manera similar a la preparación de células Jurkat-A2402/K^{b} descrita en el documento WO 02/47474.

Estas células se marcaron con Cr^{51} (3,7 MBq/10^{6} células) y se pulsaron con el péptido a 100 \mug/ml durante una hora (El marcaje se llevó a cabo a lo largo de 2 horas, y 1 hora después del inicio del marcaje, se añadió el péptido). Los esplenocitos estimulados in vitro e incubados se utilizaron como células efectoras (E). Se combinaron con las células diana a diferentes razones, y se realizó el análisis de liberación de Cr^{51} (J. Immunol., 1997; 159: 4753) para determinar la actividad citotóxica de las células efectoras. Los resultados se muestran en las Figs. 1 a 6, donde el eje vertical muestra la actividad citotóxica, y el eje horizontal muestra la razón E/D.

Estas figuras demuestran que los péptidos en los que el resto cisteína de la posición 1 del péptido A está sustituido por un resto serina, un resto alanina, un resto ácido 2-aminobutírico, un resto arginina, o un resto lisina, tienen una inmunogenicidad (actividad inductora de los CTL) equivalente a la del péptido de tipo no sustituido.

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Ejemplo 2

Actividades citotóxicas de los Péptidos de Tipo Sustituido en el resto Cisteína

Se sometió a ensayo la actividad cruzada de las células efectoras inducidas por los péptidos de tipo sustituido (péptidos B, C, D, E, y F) con respecto al péptido de tipo no sustituido (péptido A). Las células efectoras (E) inducidas mediante inmunización de los ratones con el péptido B, C, D, E, o F se pulsaron con el péptido B, C, D, E, o F, y con el péptido de tipo no sustituido (péptido A), o las células EL4-A2402/K^{b} no pulsadas con ningún péptido se hicieron reaccionar como células diana (D). Seguido de la determinacion de la actividad citotóxica de las células efectoras mediante análisis de liberación de Cr^{51}. Los resultados se muestran en las Figs. 7 a 11.

Las figuras demuestran que los CTL inducidos por los péptidos B a F donde el resto cisteína de la posición 1 del péptido A está sustituido por un resto serina, un resto alanina, un resto ácido 2-aminobutírico, un resto arginina, o un resto lisina, mostraban una reactividad cruzada con el péptido de tipo no sustituido, péptido A.

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Ejemplo 3

Actividad inductora de los CTL de los Péptidos de Tipo sustituido en el resto Cisteína (2)

Se sintetizaron los péptidos de tipo sustituido en los que el resto cisteína de la posición 1 del péptido de tipo natural compuesto por las posiciones 235 a 243 de WT1 (WT1_{235}-_{243}, SEQ ID NO: 2) fue sustituido por un resto serina o un resto alanina (péptidos G y H), y los péptidos de tipo sustituido en los que el resto cisteína de la posición 1 del péptido A (el péptido donde el resto metionina de la posición 2 de WT1_{235-243} está sustituido por un resto tirosina, SEQ ID NO: 3) fue sustituido por un resto ornitina o un resto citrulina (péptidos I y J), y se examinaron en cuanto a su inmunogenicidad in vivo. Las secuencias de aminoácidos de los péptidos de tipo sustituido, péptidos G a J, se muestran más abajo:

péptido G:	Ser Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu	(SEQ ID NO: 15)

péptido H:	Ala Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu	(SEQ ID NO: 16)

péptido I:	Orn Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu	(SEQ ID NO: 10)

péptido J:	Cit Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu	(SEQ ID NO: 11).

Se evaluó la inmunogenicidad in vivo utilizando los ratones transgénicos HLA-A2402/K^{b}.

Los péptidos de tipo sustituido descritos antes se sintetizaron utilizando el método de Fmoc. Cada uno de los péptidos sintetizados se ajustó a 40 mg/ml en DMSO, y cada uno se diluyó con un tampón fosfato 10 mM (pH 7,5) a 2,4 mg/ml. Simultáneamente, se añadió KLH (Hemocianina de Lapa Ojo de Cerradura) a las diluciones a 0,24 mg/ml. Luego se mezclaron con 1,27 partes de coadyuvante incompleto de Freund (ISA51) utilizando una jeringa de vidrio para preparar una emulsión de agua en aceite. La emulsión resultante (200 \mul) se inyectó en el ratón transgénico HLA-A2402/K^{b} subcutáneamente en la base de la cola para su inmunización.

2) Preparación de esplenocitos

Siete días después de la inmunización, el bazo se separó y se trituró sobre la parte congelada de un porta de vidrio, y los esplenocitos se recuperaron y se prepararon. Una porción de los esplenocitos que había experimentado tratamiento de hemólisis con un tampón ACK (NH_{4}Cl 0,15 M, KHCO_{3} 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,2-7,4) se pulsó con las composiciones de péptidos anteriormente mencionadas a 100 \mug/ml durante 1 hora, y se sembró en una placa de 24 pocillos a 7\times10^{5}/pocillo. Simultáneamente, se añadieron juntos los esplenocitos no pulsados con ningún péptido (7\times10^{6}/pocillo), y se estimularon in vitro y se incubaron a 37ºC durante 5 a 6 días. La estimulación in vitro se llevó a cabo en medio RPMI 1640 con un suplemento de FCS al 10%, HEPES 10 mM, L-glutamina 20 mM, piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales de MEM 1 mM, vitamina de MEM al 1% y 2-mercaptoetanol 55 \muM.

3) Ensayo de actividad citotóxica

El ensayo de actividad citotóxica se realizó de la manera convencional. Las células EL4-A2402/K^{b} obtenidas transformando células EL-4 (DAINIPPON PHARMACEUTICAL CO., LTD., Núm. de Catálogo 06-039) con un vector de expresión que codifica HLA-A2402/K^{b}, y las células EL4-A2402/K^{b} pulsadas con el péptido G, I, o J se utilizaron como células diana (D). Asimismo, se utilizaron células Jurkat-A2402/K^{b} (documento WO 02/47474), y células Jurkat-A2402/K^{b} pulsadas con el péptido H.

Estas células se marcaron con Cr^{51} (3,7 MBq/10^{6} células) y se pulsaron con el péptido a 20 \mug/ml a lo largo de media hora. Se utilizaron los esplenocitos estimulados in vitro e incubados como células efectoras (E). Se combinaron con las células diana a diferentes razones, y se realizó el ensayo de liberación de Cr^{51} (J. Immunol., 1997; 159: 4753) para determinar la actividad citotóxica de las células efectoras. Los resultados se muestran en las Figs. 12 a 15, donde el eje vertical muestra la actividad citotóxica, y el eje horizontal muestra la razón E/D. Estas figuras demuestran que todos los péptidos G, H, I y J tienen inmunogenicidad (actividad inductora de los CTL).

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Ejemplo 4

Actividades inductoras de CTL de Péptidos de Tipo sustituido en el resto Cisteína (3)

Se sintetizaron péptidos de tipo sustituido en los que el resto cisteína de la posición 1 del péptido A (el péptido donde el resto metionina de la posición 2 de WT1_{235-243} está sustituido por un resto tirosina, SEQ ID NO: 3) estaba sustituido por un resto leucina, un resto fenilalanina, o un resto asparagina (péptidos K, L y M), y se examinaron en cuanto a su inmunogenicidad in vivo. Las secuencias de aminoácidos de los péptidos de tipo sustituido, péptidos K a M, se muestran más abajo:

péptido K:	Leu-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu	(SEQ ID NO: 12)

péptido L:	Phe-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu	(SEQ ID NO: 13)

péptido M:	Asn-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu	(SEQ ID NO: 14)

Los péptidos de tipo sustituido fueron sintetizados utilizando el método de Fmoc. Cada uno de los péptidos sintetizados se ajustó a 40 mg/ml en DMSO, y cada uno se diluyó con solución salina fisiológica a 2,4 mg/ml. Después se mezclaron con 1,27 partes de coadyuvante incompleto de Freund (ISA51) utilizando una jeringa de vidrio para preparar una emulsión de agua en aceite. La emulsión resultante (200 \mul) se inyectó en el ratón transgénico HLA-A2402/K^{b} subcutáneamente en la base de la cola para su inmunización.

2) Preparación de esplenocitos

Siete días después de la inmunización, se separó el bazo y se trituró sobre la parte congelada de un porta de vidrio, y se recuperaron los esplenocitos y se prepararon. Una porción de los esplenocitos que habían sufrido tratamiento de hemólisis con tampón ACK (NH_{4}Cl 0,15 M, KHCO_{3} 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,2-7,4) se pulsó con las composiciones de péptidos anteriormente mencionadas a 100 \mug/ml durante 1 hora, y se sembró en una placa de 24 pocillos a 7 x 10^{5}/pocillo. Simultáneamente, se añadieron juntos los esplenocitos no pulsados con ningún péptido (7 \times 10^{6}/pocillo), y se estimularon in vitro y se incubaron a 37ºC durante 5 a 6 días. La estimulación in vitro se llevó a cabo en medio RPMI 1640 con un suplemento de FCS al 10%, HEPES 10 mM, L-glutamina 20 mM, piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales de MEM 1 mM, vitamina de MEM al 1% y 2-mercaptoetanol 55 \muM.

3) Ensayo de actividad citotóxica

El ensayo de la actividad citotóxica se llevó a cabo de la manera convencional. Se utilizaron como células diana (D) células EL4-A2402/K^{b} obtenidas transformando células EL-4 con un vector de expresión que codifica HLA-A2402/K^{b}, y las células EL4-A2402/K^{b} pulsadas con el péptido K, L, o M.

Estas células se marcaron con Cr^{51} (3,7 MBq/10^{6} células) y se pulsaron con el péptido a 100 \mug/ml durante una hora. (El marcaje se llevó a cabo a lo largo de 2 horas, y 1 hora después del inicio del marcaje, se añadió el péptido). Los esplenocitos estimulados in vitro e incubados se utilizaron como células efectoras (E). Estas se combinaron con las células diana a diferentes razones, y se realizó el análisis de liberación de Cr^{51} (J. Immunol., 1997; 159: 4753) para determinar la actividad citotóxica de las células efectoras. Los resultados se muestran en las Figs. 16 a 18, donde el eje vertical muestra la actividad citotóxica, y el eje horizontal muestra la razón E/D. Estas figuras demuestran que todos los péptidos K, L, y M tienen inmunogenicidad (actividad inductora de los CTL).

Aplicabilidad industrial

De acuerdo con la presente invención, se proporcionan un péptido novedoso de tipo sustituido de WT1 donde el resto cisteína está sustituido por un resto aminoácido definido, un polinucleótido que codifica dicho péptido, una vacuna contra el cáncer que comprende el péptido o el polinucleótido, y similares. La vacuna contra el cáncer de la invención se puede utilizar para tratar a muchos pacientes con cáncer, y tiene ventajas tales como la fácil normalización de los productos médicos.

Texto libre de la lista de secuencias

La secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2 muestra un péptido sintetizado.

La secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 3 muestra un péptido sintetizado.

En la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 4, el primer resto aminoácido Xaa es un resto serina (Ser), un resto alanina (Ala), un resto ácido 2-aminobutírico (Abu), un resto arginina (Arg), un resto lisina (Lys), un resto ornitina (Orn), un resto citrulina (Cit), un resto leucina (Leu), un resto fenilalanina (Phe), o un resto asparagina (Asn), y el segundo resto aminoácido Xaa es un resto tirosina (Tyr), o un resto metionina (Met).

La secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 5 muestra un péptido sintetizado.

La secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 6 muestra un péptido sintetizado.

En la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 7, el primero resto aminoácido es un resto ácido 2-aminobutírico (Abu).

La secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 8 muestra un péptido sintetizado.

La secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 9 muestra un péptido sintetizado.

En la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 10, el primer resto aminoácido es un resto (Orn).

En la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 11, el primer resto aminoácido es un resto citrulina (Cit).

La secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 12 muestra un péptido sintetizado.

La secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 13 muestra un péptido sintetizado.

La secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 14 muestra un péptido sintetizado.

La secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 15 muestra un péptido sintetizado.

La secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 16 muestra un péptido sintetizado.

En la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 17, el primer resto aminoácido es un resto ácido 2-aminobutírico (Abu).

La secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 18 muestra un péptido sintetizado.

La secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 19 muestra un péptido sintetizado.

En la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 20, el primer resto aminoácido es un resto ornitina (Orn).

En la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 21, el primer resto aminoácido es un resto citrulina (Cit).

La secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 22 muestra un péptido sintetizado.

La secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 23 muestra un péptido sintetizado.

La secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 24 muestra un péptido sintetizado.

La secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 25 muestra un péptido sintetizado.

La secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 26 muestra un péptido sintetizado.

<110> Haruo Sugiyama

\hskip1cm

Chugai Seiyaku Kabusikikaisha

\hskip1cm

Sumitomo Pharmaceuticals Co., Ltd.

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<120> Péptidos de tipo sustituido de WT1

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<130> L 1430 EP

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<140> PCT/JP2003/011974

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<141> 2003-09-19

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<150> JP 2002-275264

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<151> 2002-09-20

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<160> 26

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 449

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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1

2

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<210> 2

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético

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<400> 2

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3

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<210> 3

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético

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<400> 3

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4

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<210> 4

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220> Rasgo

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<223> Otra información: Xaa de la posición 1 es Ser, Ala, Abu, Arg, Lys, Orn, Cit, Leu, Phe o Asn; Xaa de la posición 2 es Tyr o Met.

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<400> 4

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5

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<210> 5

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético

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<400> 5

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6

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<210> 6

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético

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<400> 6

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7

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<210> 7

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220> Rasgo

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<223> Otra información: Xaa as Abu.

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<400> 7

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8

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<210> 8

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético

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<400> 8

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9

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<210> 9

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético

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<400> 9

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10

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<210> 10

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220> Rasgo

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<223> Otra información: Xaa es Orn.

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<400> 10

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11

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<210> 11

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220> Rasgo

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<223> Otra información: Xaa es Cit.

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<400> 11

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12

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<210> 12

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético

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<400> 12

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13

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<210> 13

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético

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<400> 13

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14

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<210> 14

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético

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<400> 14

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15

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<210> 15

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético

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<400> 15

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16

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<210> 16

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético

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<400> 16

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17

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<210> 17

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220> Rasgo

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<223> Otra información: Xaa es Abu.

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<400> 17

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18

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<210> 18

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético

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<400> 18

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19

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<210> 19

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético

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<400> 19

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20

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<210> 20

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220> Rasgo

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<223> Otra información: Xaa es Orn.

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<400> 20

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21

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<210> 21

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220> Rasgo

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<223> Otra información: Xaa es Cit.

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<400> 21

\hskip1cm

22

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<210> 22

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético

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<400> 22

\hskip1cm

23

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<210> 23

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético

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<400> 23

\hskip1cm

24

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<210> 24

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético

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<400> 24

\hskip1cm

25

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<210> 25

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<211> 21

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético

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<400> 25

\hskip1cm

26

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<210> 26

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Sintético

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<400> 26

\hskip1cm

27

Claims

1. Un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula:

X-Y-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu: (SEQ ID NO: 4)

donde X representa Ser, Ala, Abu, Arg, Lys, Orn, Cit, Leu, Phe, o Asn, e Y representa Tyr o Met, y que tiene una actividad inductora de los CTL.

2. El péptido de acuerdo con reivindicación 1 que comprende una cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en:

Ser-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu: (SEQ ID NO: 5),

Ala-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu: (SEQ ID NO: 6),

Abu-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu: (SEQ ID NO: 7),

Arg-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu: (SEQ ID NO: 8),

Lys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu: (SEQ ID NO: 9),

Orn-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu: (SEQ ID NO: 10),

Cit-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu: (SEQ ID NO: 11),

Leu-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu: (SEQ ID NO: 12),

Phe-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gin-Met-Asn-Leu: (SEQ ID NO: 13),

Asn-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu: (SEQ ID NO: 14),

Ser-Met-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu: (SEQ ID NO: 15), y

Ala-Met-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu: (SEQ ID NO: 16).

3. Un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 4, y que tiene actividad inductora de los CTL.

4. El péptido de acuerdo con reivindicación 3, que consiste en una cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, y 16.

5. Un polinucleótido que codifica el péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Un vector de expresión que contiene el polinucleótido de acuerdo con reivindicación 5.

7. Una célula que comprende el vector de expresión de acuerdo con reivindicación 6.

8. Un procedimiento para preparar un péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende cultivar la célula de acuerdo con reivindicación 7 en una condición operable para la expresión de los péptidos.

9. Un anticuerpo que se une específicamente al péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

10. Una célula presentadora de antígenos sobre la cual se presenta un complejo entre un péptido antigénico canceroso de acuerdo con reivindicación 1 o 2 y un antígeno HLA-A24.

11. La célula presentadora de antígenos de acuerdo con reivindicación 10, sobre la cual se presenta un complejo entre un péptido antigénico canceroso que consiste en el péptido de acuerdo con la reivindicación 3 o 4 y un antígeno HLA-A24.

12. Una composición farmacéutica que comprende el péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 5, el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 6, la célula de acuerdo con la reivindicación 7, o la célula presentadora de antígenos de acuerdo con la reivindicación 10 u 11 junto con un portador farmacéuticamente aceptable.

13. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 12, en la que la composición se utiliza como vacuna contra el cáncer.

14. El uso del péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 5, el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 6, la célula de acuerdo con la reivindicación 7, o la célula presentadora de antígenos de acuerdo con la reivindicación 10 u 11 en la fabricación de una vacuna contra el cáncer.

15. El uso de la reivindicación 14, donde la vacuna contra el cáncer se aplica para el tratamiento de un paciente con cáncer que lo necesita que es positivo para un HLA-A24, y positivo para WT1.