ES2615978T3

ES2615978T3 - Moléculas de anticuerpo que tienen especificidad de unión por IL-13 humana

Info

Publication number: ES2615978T3
Application number: ES10714046.9T
Authority: ES
Inventors: Neil Gozzard; Alastair David Griffiths Lawson; Daniel John Lightwood; Roger Thomas Palframan; Bryan John Smith; Kerry Louise Tyson
Original assignee: UCB Biopharma SRL
Current assignee: UCB Biopharma SRL
Priority date: 2009-03-11
Filing date: 2010-03-10
Publication date: 2017-06-09
Anticipated expiration: 2030-03-10
Also published as: GB0904214D0; CN102388066A; AU2010222693B2; RS55734B1; US9957320B2; CN102388066B; CA2754539C; MX2011009390A; EA032222B1; JP2012520067A; DK2406283T3; US8691233B2; PT2406283T; US20160289323A1; HUE031923T2; LT2406283T; AR075849A1; BRPI1009576A2; JP2016025856A; PL2406283T3

Abstract

Un anticuerpo antagonista que se une a IL-13 humana que comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO:31 y, adicionalmente, que comprende una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO:23.

Description

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secuencia humana VH2 3-12-26 junto con JH4, entonces las regiones marco aceptoras de la cadena pesada comprenden, además de una o varias CDR donantes, un residuo donante en al menos una de las posiciones 49 y 71 (de acuerdo con Kabat et al., (supra)) (ver la Figura 12).

Por consiguiente, se proporciona un anticuerpo injertado con CDR, en donde al menos los residuos en las posiciones 49 y 71 del dominio variable de la cadena pesada son residuos donantes.

Los residuos donantes son residuos del anticuerpo donante, es decir, el anticuerpo del que se derivan originalmente las CDR. Con preferencia, los residuos son Glicina y Arginina en las posiciones 49 y 71, respectivamente.

En una realización, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 31

Se apreciará que se puedan hacer una o varias sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácidos a los dominios variables de anticuerpo, proporcionados por la presente invención, sin alterar significativamente la capacidad del anticuerpo de unirse con IL-13 y neutralizar la actividad de IL-13. El efecto de cualquier sustitución, adición y/o deleción de aminoácido puede ser ensayado con facilidad por un experto en la técnica, por ejemplo, usando los métodos descritos en los Ejemplos para determinar la unión de IL-13 y/o el bloqueo de ligando/receptor.

El anticuerpo puede comprender una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia que tiene al menos el 70%, el 80%, el 90%, el 95% o el 98% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO: 31.

En una realización, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 23.

El anticuerpo puede comprender una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia que tiene al menos el 70%, el 80%, el 90%, el 95% o el 98% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO: 23.

En una realización, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO:31 y una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO:23.

El anticuerpo puede comprender una cadena pesada y una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia que tiene al menos el 60% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO:31 y el dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia que tiene al menos el 60% de identidad

o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO:23. Apropiadamente, el anticuerpo comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia que tiene al menos el 70%, el 80%, el 90%, el 95% o el 98% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO:31 y una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia que tiene al menos el 70%, el 80%, el 90%, el 95% o el 98% de identidad o similitud con la secuencia dada en la SEQ ID NO:23.

Las moléculas de anticuerpo de la presente invención pueden comprender una molécula de anticuerpo completa con cadenas pesadas y ligeras de longitud completa o uno de sus fragmentos y pueden ser, pero sin limitación, Fab, Fab modificado, Fab’, Fab’ modificado, F(ab’)2, Fv, anticuerpos de dominio simple (por ejemplo, VH o VL o VHH), scFv, anticuerpos bi-, tri-o tetravalentes, Bis-scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y fragmentos de unión a epítope de cualquiera de los anteriores (ver, por ejemplo, Holliger y Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136; Adair y Lawson, 2005, Drug Design Reviews -Online 2(3), 209-217). Los métodos para crear y fabricar estos fragmentos de anticuerpo son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181). Otros fragmentos de anticuerpo para usar en la presente invención incluyen los fragmentos de Fab y Fab’ descritos en las solicitudes de patente internacionales WO 2005/003169, WO 2005/003170 y WO 2005/003171 y fragmentos de Fab-dAb descritos en la solicitud de patente internacional WO 2009/040562. Los anticuerpos multivalentes pueden comprender múltiples especificidades o pueden ser monoespecíficos (ver, por ejemplo, los documentos WO 92/22853 y WO 05/113605).

Los dominios de región constante de la molécula de anticuerpo de la presente invención, de estar presentes, se pueden seleccionar teniendo en cuenta la función propuesta de la molécula de anticuerpo y en particular las funciones efectoras que puedan requerirse. Por ejemplo, los dominios de región constante pueden ser los dominios de IgA, IgD, IgE, IgG o IgM humana. En particular, los dominios de IgG humana de región constante se pueden usar, en especial los isotipos de IgG1 e IgG3 cuando la molécula de anticuerpo está destinada para usos terapéuticos y se requieren funciones efectoras de anticuerpo. De modo alternativo, los isotipos de IgG2 e IgG4 se pueden usar cuando la molécula de anticuerpo está destinada para usos terapéuticos y no se requieren funciones efectoras, por ejemplo, para simple bloqueo de la actividad de IL-13. Se apreciará que también se puedan usar variantes de secuencias de estos dominios de región constante. Por ejemplo, las moléculas de IgG4 en donde la serina en la posición 241 fueron modificadas en prolina como se describe en Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108. También comprenderán los expertos en la técnica que los anticuerpos se pueden someter a una variedad de modificaciones postraduccionales. El tipo y la extensión de estas modificaciones a menudo depende de la línea celular huésped usada

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Los programas tales como ** ExPASY http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html y http://www.iut-arles.up.univmrs.fr/w3bb/d abim/compo-p.html se pueden usar para predecir el punto isoeléctrico del anticuerpo o fragmento.

En una realización, los anticuerpos de la presente invención son apropiados para suministro por inhalación, por ejemplo, por nebulización. En un ejemplo, las propiedades físicas de los anticuerpos de la presente invención, por ejemplo, la afinidad de unión y la potencia, no se alteran sustancialmente por nebulización. En un ejemplo, los anticuerpos de la presente invención son altamente estables. Una medida de la estabilidad de anticuerpo es la temperatura de fusión (Tm). La temperatura de fusión se puede determinar por cualquier método apropiado conocido en la técnica, por ejemplo, usando Thermofluor (Ericsson et al, Analytical Biochemistry 357 (2006) 289-298) o DSC (calorimetría diferencial de barrido). Con preferencia, los anticuerpos proporcionados por la presente invención tienen una alta temperatura de fusión (Tm), normalmente de al menos 75 °C. En un ejemplo, el anticuerpo de la presente invención tiene una Tm de al menos 75 °C. En un ejemplo, el anticuerpo de la presente invención tiene una Tm de al menos 80 °C. En un ejemplo, el anticuerpo de la presente invención tiene una Tm de al menos 83 °C.

También se proporciona una región específica o epítope de IL-13 humana que son ligados por un anticuerpo proporcionado por la presente invención, en particular un anticuerpo que comprende la secuencia de cadena pesada (SEQ ID NO:35) y/o la secuencia de cadena ligera (SEQ ID NO:27).

Esta región específica o epítope del polipéptido de IL-13 humana se puede identificar por cualquier método de mapeo de epítopes apropiados conocidos en la técnica en combinación con cualquiera de los anticuerpos proporcionados por la presente invención. Los ejemplos de tales métodos incluyen péptidos de control de distintas longitudes derivados de IL-13 para la unión con el anticuerpo de la presente invención con el fragmento más pequeño que se puede unir específicamente con el anticuerpo que contiene la secuencia del epítope reconocido por el anticuerpo. Los péptidos de IL-13 se pueden producir sintéticamente o por digestión proteolítica del polipéptido de IL-13. Los péptidos que se unen con el anticuerpo se pueden identificar, por ejemplo, por análisis espectrométrico de masa. En otro ejemplo, se pueden usar espectroscopia de RMN o cristalografía por rayos X para identificar el epítope ligado por un anticuerpo de la presente invención. Una vez identificado, se puede usar el fragmento epitópico que se une a un anticuerpo de la presente invención, de ser requerido, como un inmunógeno para obtener anticuerpos antagonistas adicionales que se unen con el mismo epítope.

Los anticuerpos que bloquean en forma cruzada la unión de un anticuerpo de acuerdo con la presente invención en particular, un anticuerpo que comprende la secuencia de cadena pesada (SEQ ID NO: 31) y la secuencia de cadena ligera (SEQ ID NO: 27) puede ser similarmente útil para antagonizar la actividad de IL-13.

Los anticuerpos de bloqueo cruzado se pueden identificar usando cualquier método adecuado en la técnica, por ejemplo utilizando ensayos ELISA o BIAcore de competición en los que la unión del anticuerpo de bloqueo cruzado a IL-13 humana impide la unión de un anticuerpo de la presente invención o viceversa.

Las moléculas de anticuerpo de la presente invención tienen adecuadamente una alta afinidad de unión, en particular afinidad picomolar. La afinidad se puede medir usando cualquier método adecuado conocido en la técnica, que incluye por resonancia de plasmón superficial, que incluye BIAcore tal como se describe en los Ejemplos en la presente usando IL-13 natural o recombinante aislada. En un ejemplo, la afinidad se mide usando IL-13 humana recombinante como se describe en los Ejemplos de la presente. En una realización, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de unión de aproximadamente 100 pM o mejor. En una realización, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de unión de aproximadamente 50 pM o mejor. En una realización, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de unión de aproximadamente 40 pM

o mejor. En una realización, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de unión de aproximadamente 30 pM o mejor. En una realización, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de unión de aproximadamente 20 pM o mejor. En una realización, la molécula de anticuerpo de la presente invención es totalmente humana o humanizada y tiene una afinidad de unión de aproximadamente 100 pM o mejor. En una realización, la molécula de anticuerpo de la presente invención es totalmente humana o humanizada y tiene una afinidad de unión de 30 pM o mejor.

Se apreciará que la afinidad de los anticuerpos proporcionados por la presente invención se puede alterar usando cualquier método adecuado conocido en la técnica. Por lo tanto, la presente descripción también se refiere a variantes de las moléculas de anticuerpo de la presente invención, que tienen una afinidad por IL-13 mejorada. Tales variantes se pueden obtener mediante numerosos protocolos de maduración por afinidad que incluyen mutación de las CDR (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392 -403, 1995), transposición de cadena (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), uso de cepas mutaodras de E. coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), transposición de ADN (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), despliegue en fagos (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) y PCR sexual (Crameri et al., Nature, 391,288-291, 1998). Vaughan et al. (supra) discute estos métodos de maduración por afinidad.

En una realización las moléculas de anticuerpo de la presente invención bloquean la interacción entre IL-13 y un receptor IL-13, en particular las moléculas de anticuerpo de la presente invención bloquean la interacción entre IL-13 e IL-13Ra1 y la interacción entre IL-13 e IL-13 Ra2 En los ejemplos de la presente se describen numerosos ensayos adecuados para determinar la capacidad de un anticuerpo para bloquear esta interacción. En una realización, la

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presente invención proporciona un anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para IL-13 humana. En una realización, el receptor de IL-13 humana usado en el ensayo es IL-13 Ra1 humana natural o IL-13Ra2 humana natural. En una realización, el receptor de IL-13 humana usado en el ensayo es IL-13 Ra1 humana recombinante o IL-13Ra2 humana recombinante. En una realización, la IL-13 humana usada en el ensayo es IL-13 humana recombinante. En una realización, el anticuerpo neutralizante es un anticuerpo humanizado o totalmente humano o fragmento de este.

Si se desea, un anticuerpo para uso en la presente invención se puede conjugar con una o más moléculas efectoras. Se apreciará que la molécula efectora puede comprender una molécula efectora única o dos o más de tales moléculas unidas de tal modo de formar un resto único que se puede unir a los anticuerpos de la presente invención. Cuando se desea obtener un fragmento de anticuerpo unido a una molécula efectora, se puede preparar mediante procedimientos químicos o de ADN recombinante estándares en los que el fragmento de anticuerpo está unido, ya sea directamente o por medio de un agente de acoplamiento a la molécula efectora. Las técnicas para la conjugación de tales moléculas efectoras con anticuerpos son bien conocidas en la técnica (ver Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53; Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62:119-58 y Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123).). Los procedimientos químicos particulares incluyen, por ejemplo, los descritos en los documentos WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 y WO 03031581. Alternativamente, cuando la molécula efectora es una proteína o polipéptido, el enlace se puede obtener mediante procedimientos de ADN recombinante, por ejemplo como se describe en los documentos WO 86/01533 y EP 0392745.

La expresión molécula efectora, como se usa en la presente, incluye, por ejemplo, agentes antineoplásicos, fármacos, toxinas, proteínas biológicamente activas, por ejemplo enzimas, otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, polímeros sintéticos o naturales, ácidos nucleicos y fragmentos de estos, por ejemplo, ADN, ARN y fragmentos de estos, radionucleidos, particularmente radioyoduro, radioisótopos, metales quelados, nanopartículas y grupos indicadores tales como compuestos fluorescentes o compuestos que se pueden detectar por espectroscopía de RMN

o ESR.

Los ejemplos de moléculas efectoras pueden incluir citotoxinas o agentes citotóxicos que incluyen cualquier agente que sea perjudicial para las células (por ejemplo, mata). Los ejemplos incluyen combrestatinas, dolastatinas, epotilonas, estaurosporina, maytansinoides, espongistatinas, rizoxina, halicondrinas, roridinas, hemiasterlinas, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, y puromicina y análogos u homólogos de estos.

Las moléculas efectoras también incluyen, pero sin limitación, antimetabolitos (por ejemplo metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo decarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalano, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo daunorubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), Bleomicina, mitramicina, antramicina (AMC), calicheamicinas o duocarmicinas), y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina).

Otras moléculas efectoras pueden incluir radionucleidos quelados tales como 111In y 90Y, Lu177, Bismuto213, Californio252 , Iridio192 y Tungsteno188/Renio188; o fármacos tales como, pero sin limitación, alquilfosfocolinas, inhibidores de topoimerasa I, taxoides y suramina.

Otras moléculas efectoras incluyen proteínas, péptidos y enzimas. Las enzimas de interés incluyen, pero sin limitación, enzimas proteolíticas, hidrolasas, liasas, isomerasas, transferasas. Las proteínas, polipéptidos y péptidos de interés incluyen, pero sin limitación, inmunoglobulinas, toxinas tales como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas o toxina diftérica, una proteína tal como insulina, factor de necrosis tumoral, a-interferón, p-interferón, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas o activador de plasminógeno tisular, un agente trombótico o un agente antiangiogénico, por ejemplo, angiostatina o endostatina, o un modificador de la respuesta biológica tal como una linfoquina, interleuquina-1 (IL-1), interleuquina-2 (IL-2), factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos (GM-CSF), factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF), factor de crecimiento nervioso (NGF) u otro factor de crecimiento e inmunoglobulinas.

Otras moléculas efectoras pueden incluir sustancias detectables útiles por ejemplo en el diagnóstico. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos protésicos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, nucleidos radiactivos, metales emisores de positrones (para uso en la tomografía por emisión de positrones) e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos. Ver generalmente la Patente

U.S N.º 4.741.900 para iones metálicos que se pueden conjugar con anticuerpos para uso como diagnóstico. Las enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; Los grupos protésicos adecuados incluyen estreptavidina, avidina y biotina; los materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoroesceína de diclorotriazinilamina, cloruro de dansilo y ficoeritrina; los materiales luminiscentes adecuados incluyen luminol; los materiales bioluminiscentes adecuados incluyen luciferasa, luciferina y aequorina; y los nucleidos radiactivos adecuados incluyen 125I, 131I, 111In y 99Tc.

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Harris and S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC and "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545]. En un ejemplo, PEG está unido a una cisteína en la región bisagra. En un ejemplo, un fragmento Fab modificado con PEG tiene un grupo maleimida unido covalentemente a un grupo tiol único en una región bisagra modificada. Un residuo de lisina puede estar unido covalentemente al grupo maleimida y a cada uno de los grupos amina del residuo de lisina se puede unir un polímero de metoxipoli (etilenglicol) que tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 Da. Por lo tanto, el peso molecular total del PEG unido al fragmento Fab puede ser de aproximadamente 40.000 Da.

En una realización, la presente invención proporciona una molécula de anticuerpo antagonista que tiene especificidad para IL-13 humana, que es un fragmento Fab' modificado que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia dada en SEQ ID NO: 35 y una cadena ligera que comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 27 y que tiene en el extremo C-terminal de su cadena pesada una región bisagra modificada que contiene al menos un residuo de cisteína al que está unida una molécula efectora. Convenientemente, la molécula efectora es PEG y está unida usando los métodos descritos en los documentos WO 98/25971 y WO 2004072116 o WO 2007/003898. Las moléculas efectoras se pueden unir a fragmentos de anticuerpo usando los métodos descritos en las solicitudes de patente internacional WO 2005/003169, WO 2005/003170 y WO 2005/003171.

En una realización, el anticuerpo o fragmento no se une a una molécula efectora.

La presente invención también proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica la cadena pesada y/o ligera de una molécula de anticuerpo de la presente invención. Convenientemente, la secuencia de ADN codifica la cadena pesada o ligera de una molécula de anticuerpo de la presente invención. La secuencia de ADN de la presente invención puede comprender ADN sintético, por ejemplo producido por procesamiento químico, ADNc, ADN genómico

o cualquier combinación de estos.

Las secuencias de ADN que codifican una molécula de anticuerpo de la presente invención se pueden obtener por métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las secuencias de ADN que codifican parte o todas las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo se pueden sintetizar según se desee a partir de las secuencias de ADN determinadas o sobre la base de las correspondientes secuencias de aminoácidos.

El ADN codificador para las secuencias marco aceptoras está ampliamente disponible para los expertos en la técnica y se puede sintetizar fácilmente sobre la base de sus secuencias de aminoácidos conocidas.

Se pueden usar técnicas estándar de biología molecular para preparar secuencias de ADN que codifican la molécula de anticuerpo de la presente invención. Las secuencias de ADN deseadas se pueden sintetizar completa o parcialmente usando técnicas de síntesis de oligonucleótidos. Se pueden usar técnicas apropiadas de mutagénesis dirigida al sitio y de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

En la presente se proporcionan ejemplos de secuencias adecuadas. Se puede codificar un péptido señal adecuado para la cadena pesada, tal como el péptido señal murino MEWSWVFLFF LSVTTGVHS (SEQ ID NO: 45). Se puede codificar un péptido señal adecuado para la cadena ligera tal como el péptido señal murino MSVPTQVLGL LLLWLTDARC (SEQ ID NO: 46) que se escinde para dar una molécula de anticuerpo antagonista de la presente invención. La presente invención también proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica la cadena pesada de un anticuerpo de la presente invención que comprende las SEQ ID NO: 32, 34 ó 36 ó 38. La presente invención también proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica la cadena ligera de un anticuerpo de la presente invención que comprende las SEQ ID NO: 24, 26, 28 ó 30,

Los métodos generales por los que se pueden construir los vectores, los métodos de transfección y los métodos de cultivo son bien conocidos por los expertos en la técnica. A este respecto, se hace referencia en "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual producido por Cold Spring Harbor Publishing.

También se proporciona una célula huésped que comprende uno o más vectores de clonación o expresión que comprenden una o más secuencias de ADN que codifican un anticuerpo de la presente invención. Se puede usar cualquier sistema de célula/ vector huésped adecuado para la expresión de las secuencias de ADN que codifican la molécula de anticuerpo de la presente invención. Se pueden usar bacterias, por ejemplo E. coli, y otros sistemas microbianos o se pueden usar eucariotas, por ejemplo mamíferos, sistemas de expresión de células huésped. Las células huésped de mamífero adecuadas incluyen CHO, mieloma o células de hibridoma.

La presente invención también proporciona un proceso para la producción de una molécula de anticuerpo de acuerdo con la presente invención que comprende cultivar una célula huésped que contiene un vector de la presente invención en condiciones adecuadas para conducir a la expresión de proteína a partir de ADN que codifica la molécula de anticuerpo de la presente invención, y aislar la molécula de anticuerpo.

La molécula de anticuerpo puede comprender solo un polipéptido de cadena pesada o ligera, en cuyo caso solo se necesita usar una secuencia codificadora del polipéptido de cadena pesada o ligera para transfectar las células huésped. Para la producción de productos que comprenden tanto cadenas pesadas como ligeras, la línea celular se

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puede transfectar con dos vectores, un primer vector que codifica un polipéptido de cadena ligera y un segundo vector que codifica un polipéptido de cadena pesada. Alternativamente, se puede usar un vector único, el vector que incluye secuencias que codifican polipéptidos de cadena ligera y cadena pesada.

Los anticuerpos y fragmentos de acuerdo con la presente descripción se expresan a buenos niveles a partir de células huésped. En consecuencia, las propiedades de los anticuerpos y/o fragmentos parecen optimizadas y propicias para el procesamiento comercial.

Como los anticuerpos de la presente invención son útiles en el tratamiento y/o profilaxis de una afección patológica, la presente invención también proporciona una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende una molécula de anticuerpo de la presente invención en combinación con uno o más de un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Por consiguiente, se proporciona el uso de un anticuerpo de la invención para la fabricación de un medicamento. La composición se suministrará normalmente como parte de una composición farmacéutica estéril que incluirá normalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéutica de la presente invención puede comprender adicionalmente un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

La presente invención también proporciona un proceso para la preparación de una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende añadir y mezclar la molécula de anticuerpo de la presente invención junto con uno o más de un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

La molécula de anticuerpo puede ser el ingrediente activo único en la composición farmacéutica o diagnóstico o se puede acompañar de otros ingredientes activos que incluyen otros ingredientes de anticuerpos, por ejemplo anti-TNF, anti IL-1p, anti-célula T, anti-IFNγ o anti -LPS, o ingredientes no anticuerpo tales como xantinas. Otros ingredientes activos adecuados incluyen anticuerpos capaces de inducir tolerancia, por ejemplo, anticuerpos anti-CD3 o anti-CD4.

En una realización adicional, el anticuerpo, fragmento o composición de acuerdo con la descripción se emplea en combinación con un agente farmacéuticamente activo adicional, por ejemplo un corticosteroide (tal como propionato de fluticasona) y/o un agonista beta 2 (tal como salbutamol, salmeterol o formoterol) o inhibidores del crecimiento y proliferación celular (tales como rapamicina, ciclofosfimida, metotrexato) o alternativamente un inhibidor de CD28 y/o CD40. En una realización, el inhibidor es una molécula pequeña. En otra realización, el inhibidor es un anticuerpo específico del blanco.

Las composiciones farmacéuticas comprenden adecuadamente una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de la invención. La expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" tal como se usa en la presente se refiere a una cantidad de un agente terapéutico necesario para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o afección específica o para exhibir un efecto terapéutico o preventivo detectable. Para cualquier anticuerpo, la cantidad terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente en ensayos de cultivo celular o en modelos animales, usualmente en roedores, conejos, perros, cerdos o primates. El modelo animal también se puede usar para determinar el rango de concentración y la vía de administración apropiados. Dicha información luego se puede usar para determinar dosis y vías útiles para la administración en seres humanos.

La cantidad terapéuticamente efectiva precisa para un sujeto humano dependerá de la gravedad del estado de enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, peso y sexo del sujeto, dieta, tiempo y frecuencia de administración, combinación de fármacos, sensibilidad a la reacción y tolerancia/respuesta a la terapia. Esta cantidad se puede determinar por la experimentación de rutina y está dentro del criterio del clínico. Generalmente, una cantidad terapéuticamente efectiva será de 0,01 mg/kg a 50 mg/kg, por ejemplo 0,1 mg/kg a 20 mg/kg. Alternativamente, la dosis puede ser de 1 a 500 mg por día, tal como 10 a 100, 200, 300 ó 400 mg por día. Las composiciones farmacéuticas se pueden presentar convenientemente en formas de dosis unitarias que contienen una cantidad predeterminada de un agente activo de la invención en seres humanos.

Las composiciones se pueden administrar individualmente a un paciente o se pueden administrar en combinación (por ejemplo, en forma simultánea, secuencial o separada) con otros agentes, fármacos u hormonas.

La dosis a la que se administra la molécula de anticuerpo depende de la naturaleza de la afección para tratar, la extensión de la inflamación presente y de si la molécula de anticuerpo se está usando profilácticamente o para tratar una afección existente.

La frecuencia de dosis dependerá de la vida media de la molécula de anticuerpo y de la duración de su efecto. Si la molécula de anticuerpo tiene una vida media corta (por ejemplo 2 a 10 horas) puede ser necesario dar una o más dosis al día. Alternativamente, si la molécula de anticuerpo tiene una vida media larga (por ejemplo, de 2 a 15 días), puede ser necesario solo dar una dosis una vez al día, una vez por semana o incluso una vez cada 1 ó 2 meses.

El vehículo farmacéuticamente aceptable no debe por sí mismo inducir la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición y no debe ser tóxico. Los vehículoes adecuados pueden ser macromoléculas grandes, de metabolización lenta, tales como proteínas, polipéptidos, liposomas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas virales inactivas.

Se pueden usar sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo sales de ácidos minerales, tales como clorhidratos,

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gases propulsores adecuados se seleccionan entre hidrocarburos tales como n-propano, n-butano o isobutano y halohidrocarburos tales como derivados clorados y/o fluorados de metano, etano, propano, butano, ciclopropano o ciclobutano. Los gases propulsores mencionados anteriormente se pueden usar solos o en mezclas de estos.

Los gases propulsores particularmente adecuados son derivados de alcano halogenados seleccionados entre TG 11, TG 12, TG 134a y TG227. De los hidrocarburos halogenados mencionados anteriormente, TG134a (1,1,1,2-tetrafluoroetano) y TG227 (1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano) y sus mezclas son particularmente adecuados.

Los aerosoles inhalables que contienen gas propulsor también pueden contener otros ingredientes tales como cosolventes, estabilizantes, agentes de tensión superficial (tensioactivos), antioxidantes, lubricantes y medios para ajustar el pH. Todos estos ingredientes son conocidos en la técnica.

Los aerosoles inhalables que contienen gases propulsores de acuerdo con la invención pueden contener hasta 5% en peso de sustancia activa. Los aerosoles de acuerdo con la invención contienen, por ejemplo, 0,002 a 5% en peso, 0,01 a 3% en peso, 0,015 a 2% en peso, 0,1 a 2% en peso, 0,5 a 2% en peso, o 0,5 a 1% de peso de ingrediente activo.

Alternativamente, las administraciones tópicas al pulmón también pueden ser mediante la administración de una formulación en solución o suspensión solución líquida, por ejemplo empleando un dispositivo tal como un nebulizador, por ejemplo, un nebulizador conectado a un compresor (por ejemplo el nebulizador Pari LC-Jet Plus (R) conectado a un compresor Pari Master (R) fabricado por Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va.).

En una realización, la formulación se proporciona como ampollas diferenciadas que contienen una dosis unitaria para la administración mediante nebulización.

En una realización, el anticuerpo se suministra en forma liofilizada, para reconstituciones o alternativamente como formulación de suspensión.

El anticuerpo de la invención se puede dispersar en un solvente, por ejemplo, en forma de una solución o una suspensión. Se puede suspender en una solución fisiológica apropiada, por ejemplo, solución salina fisiológica, un solvente farmacológicamente aceptable o una solución tampón. Las soluciones tampón conocidas en la técnica pueden contener 0,05 mg a 0,15 mg de edetato disódico, 8,0 mg a 9,0 mg de NaCl, 0,15 mg a 0,25 mg de polisorbato, 0,25 mg a 0,30 mg de ácido cítrico anhidro y 0,45 mg a 0,55 mg de citrato de sodio por 1 ml de agua de modo de obtener un pH de aproximadamente 4,0 a 5,0. Como se mencionó anteriormente, una suspensión se puede preparar por ejemplo, a partir de anticuerpos liofilizados.

Las formulaciones en suspensión o solución terapéuticas también pueden contener uno o más excipientes. Los excipientes son bien conocidos en la técnica e incluyen tampón (por ejemplo, tampón citrato, tampón fosfato, tampón acetato y tampón bicarbonato), aminoácidos, urea, alcoholes, ácido ascórbico, fosfolípidos, proteínas (por ejemplo, albúmina sérica), EDTA, cloruro de sodio, liposomas, manitol, sorbitol y glicerol. Las soluciones o suspensiones se pueden encapsular en liposomas o microesferas biodegradables. La formulación se proporcionará generalmente en una forma sustancialmente estéril empleando procedimientos de fabricación estériles.

Esto puede incluir la producción y esterilización por filtración de la solución solvente tampón usada para la formulación, suspensión aséptica del anticuerpo en la solución de solvente tampón estéril y dispensación de la formulación en recipientes estériles por métodos familiares a los expertos en la técnica.

La formulación nebulizable de acuerdo con la presente descripción puede proporcionarse, por ejemplo, como unidades de dosis única (por ejemplo, recipientes o viales de plástico sellados) envasados en sobres de aluminio. Cada vial contiene una dosis unitaria en un volumen, por ejemplo, 2 ml de tampón solvente/solución.

Se considera que los anticuerpos de la presente descripción son adecuados para su administración mediante nebulización.

También se prevé que el anticuerpo de la presente invención se pueda administrar mediante el uso de terapia génica. Para conseguir esto, las secuencias de ADN que codifican las cadenas pesadas y ligeras de la molécula de anticuerpo bajo el control de los componentes de ADN apropiados se introducen en un paciente de modo que tal que las cadenas de anticuerpo se expresan a partir de las secuencias de ADN y se ensamblan in situ.

La presente invención también proporciona una molécula de anticuerpo (o composiciones que la comprenden) para usar en el control de enfermedades inflamatorias, por ejemplo enfermedad inflamatoria aguda o crónica. Convenientemente, se puede usar la molécula de anticuerpo (o composiciones que la comprenden) para reducir el proceso inflamatorio o para prevenir el proceso inflamatorio. En una realización se proporciona una reducción in vivo de las células T activadas, en particular las involucradas en las respuestas inmunes inflamatorias inapropiadas, por ejemplo, reclutadas en la proximidad/lugar de tal respuesta.

La reducción de células T activadas, tal como se emplea en la presente, puede ser una reducción, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o más por ciento en comparación antes del tratamiento o sin tratamiento.

Ventajosamente, el tratamiento con un anticuerpo, fragmento o composición de acuerdo con la presente invención,

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puede permitir la reducción en el nivel de células T activadas, sin reducir el nivel general de células T de los pacientes (células T inactivadas). Esto puede producir menos efectos secundarios, y posiblemente prevenir la reducción de las células T en el paciente.

La presente invención también proporciona la molécula de anticuerpos de la presente invención para usar en el tratamiento o profilaxis de un trastorno patológico mediado por IL-13 o asociado con un nivel aumentado de IL-13.

La afección o trastorno patológico se puede seleccionar, por ejemplo, del grupo que consiste en infecciones (virales, bacterianas, fúngicas y parasitarias), shock endotóxico asociado con infección, artritis tal como artritis reumatoide, asma como asma grave, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfermedad inflamatoria pélvica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, enfermedad de Peyronie, enfermedad celíaca, enfermedad de la vesícula biliar, enfermedad pilonidal, peritonitis, psoriasis, vasculitis, adherencias quirúrgicas, accidente cerebrovascular, diabetes tipo I, enfermedad de Lyme, meningoencefalitis, uveítis autoinmune, trastornos inflamatorios inmunomediados del sistema nervioso central y periférico tales como esclerosis múltiple, lupus (como el lupus eritematoso sistémico) y síndrome de Guillain-Barr, dermatitis atópica, hepatitis autoinmune, alveolitis fibrosante, enfermedad de Grave, nefropatía IgA, púrpura trombocitopénica idiopática, enfermedad de Menière, pénfigo, cirrosis biliar primaria, sarcoidosis, esclerodermia, qranulomatosis de Wegener, otros trastornos autoinmunes, pancreatitis, trauma (cirugía), enfermedad de injerto contra huésped, rechazo de trasplante, enfermedad cardiaca que incluye enfermedades isquémicas tales como infarto de miocardio así como aterosclerosis, coagulación intravascular, resorción ósea, osteoporosis, osteoartritis, periodontitis e hipoclorhidria.

La presente invención también proporciona una molécula de anticuerpo de acuerdo con la presente invención para usar en el tratamiento o profilaxis del dolor, particularmente el dolor asociado con la inflamación.

En una realización, el anticuerpo de acuerdo con la invención reduce la resistencia al tratamiento de la inflamación, particularmente la resistencia pulmonar al tratamiento de la inflamación.

En una realización, el anticuerpo de acuerdo con la invención, reduce los niveles de proteína IL-13 en el tejido bronquial, por ejemplo en comparación con los niveles anteriores al tratamiento. La reducción puede ser de 5, 10, 20, 30, 40% o más.

En una realización, el anticuerpo de acuerdo con la invención reduce los niveles de proteína de IL-13 en el líquido de lavado nasal y/o en el fluido broncoalveolar, por ejemplo en comparación con los niveles previos al tratamiento. La reducción puede ser de 5, 10, 20, 30, 40% o más.

En una realización, el anticuerpo de acuerdo con la invención reduce la afluencia de eosinófilos, por ejemplo en comparación con los niveles previos al tratamiento. La reducción puede ser de 5, 10, 20, 30, 40% o más, por ejemplo cuando se trata durante 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más semanas.

En una realización, el anticuerpo de acuerdo con la invención es adecuado para reducir niveles inadecuados de células caliciformes, por ejemplo en el tratamiento de hiperplasia de células caliciformes, tales como hiperplasia crónica de células caliciformes. La reducción se puede observar después del tratamiento durante 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más semanas.

En una realización, el anticuerpo de acuerdo con la invención es adecuado para reducir los niveles de óxido nítrico exhalado (FeNO), en comparación con los niveles previos al tratamiento. Se considera que el óxido nítrico exhalado es un factor de riesgo o un marcador para la inflamación pulmonar.

En una realización, el anticuerpo de acuerdo con la invención es adecuado para la prevención de la deposición de colágeno inapropiada asociada con respuestas inflamatorias, en particular la deposición de colágeno peribronquial.

En una realización, el anticuerpo de acuerdo con la invención es adecuado para prevenir la angiogénesis inapropiada asociada con respuestas inflamatorias.

De este modo, se proporciona un anticuerpo de acuerdo con la invención para usar en el tratamiento y métodos de tratamiento que lo emplean.

El anticuerpo de acuerdo con la invención, tal como se emplea en la presente, también se refiere a fragmentos y derivados descritos en la memoria descriptiva.

La presente invención proporciona además el uso de una molécula, fragmento o composición de anticuerpo de acuerdo con la presente invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de un trastorno patológico mediado por IL-13 o asociado con un aumento de IL-13, por ejemplo como se describe en la presente, en particular el trastorno patológico es artritis reumatoide, asma o EPOC.

La presente invención además proporciona además el uso de una molécula, fragmento o composición de anticuerpo de acuerdo con la invención presente en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de una o más indicaciones médicas descritas en la presente.

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la secuencia de aminoácidos para la región variable de la cadena pesada del anticuerpo humanizado con la secuencia señal (SEQ IDNO:33)

la secuencia de ADN para la región variable de la cadena pesada del anticuerpo humanizado con la secuencia señal (SEQ ID NO:34)

la secuencia de aminoácidos para la región constante y variable de la cadena pesada del anticuerpo humanizado (SEQ ID NO:35)

La Figura 10 muestra la secuencia de ADN para la región constante y variable de la cadena pesada del anticuerpo humanizado (SEQ ID NO:36)

la secuencia de aminoácidos para la región constante y variable de la cadena pesada del anticuerpo humanizado con la secuencia señal (SEQ ID NO:37)

la secuencia de ADN para la región constante y variable de la cadena pesada del anticuerpo humanizado (SEQ ID NO:38)

La Figura 11 muestra secuencias de aminoácidos y ADN para el marco aceptor VK 1 2-1-(1)02 JK4 humano (SEQ ID NO:39 y SEQ ID NO:40) y marco aceptor VH2 3-1 2-26 JH4 (SEQ ID NO:41 y SEQ ID NO:42)

La Figura 12 muestra un alineamiento de las cadenas ligeras para el marco aceptor de rata y las cadenas ligeras humanizadas y también las cadenas pesadas. Las CDR están en negrita y subrayados. Los residuos donantes G49 y R71 están en negrita, cursiva y resaltados.

Figura 13. Efecto de Ab652 sobre BAL eotaxina-3 medido 24 horas después de la exposición al alergeno en un modelo de asma de primate no humano. Los datos se expresan como media ± SEM, n = 4-8 por grupo.

Figura 14. Efecto de Ab652 en el recuento de eosinófilos de BAL medido 24 horas después de la exposición al alergeno en un modelo de asma de primate no humano. Los datos se normalizan con el recuento de eosinófilos BAL medido en la fase de selección del estudio. Media ± SEM, n = 4-8 por grupo.

Figura 15. Efecto de Ab652 en la resistencia pico de las vías respiratorias medida hasta 15 minutos después de la exposición al alergeno en un modelo de asma de primate no humano. Los datos se expresan como media ± SEM, n = 4-8 por grupo.

Figura 16. Efecto de Ab652 en la resistencia pico de las vías respiratorias medida 24 h después de la exposición al alergeno en un modelo de asma de primate no humano. Los datos se normalizan con la resistencia de las vías respiratorias medida antes de la exposición al alergeno. Media ± SEM, n=4-8 por grupo

Ejemplos

1. Generación/Selección del anticuerpo terapéutico

Las ratas se inmunizaron con IL-13 humana purificada (Peprotech) o fibroblastos de rata que expresan IL-13 humana (que expresa aproximadamente 1 μg/ml en el sobrenadante de cultivo) o, en algunos casos, una combinación de los dos. Después de 3 a 6 dosis, los animales se sacrificaron y se recolectaron PBMC, bazo, médula ósea y ganglios linfáticos. Los sueros se controlaron por la unión a IL-13 humana en ELISA y también para la capacidad de neutralizar hIL-13 en el ensayo celular indicador STATK-HEK-293 (ensayo HEK-Blue Invivogen).

Los cultivos de SLAM (cultivos de células B) se prepararon por un método similar al descrito por Zubler et al. (J. Immunol., 1985). En pocas palabras, 500-5000 esplenocitos o PBMC de un animal inmunizado se cultivaron en lotes de 100 placas de 96 pocillos con 200 μl/pocillo de medio RPMI 1640 (Gibco BRL) suplementado con FCS 10% (PAA laboratories ltd), HEPES 2% Sigma Aldrich), L-glutamina 1% (Gibco BRL), solución de penicilina/estreptomicina 1% (Gibco BRL), (3-mercaptoetanol 0,1% (Gibco BRL), sobrenadante de cultivo de esplenocito de conejo activado 3% y células de timoma EL-4 irradiadas con gamma (5x 104/pocillo) durante 7 días a 37 ºC en una atmósfera de CO2 5% Los sobrenadantes del cultivo de células B se analizaron en ensayos de selección y los sobrenadantes positivos se consolidaron en placas maestras. Las células B cultivadas se congelaron a -80 ºC en 100 μl de DMSO 10% en FCS.

Los sobrenadantes de cultivo de SLAM se analizaron primero en cuanto a su capacidad para unirse a hIL-13 en un ensayo basado en perlas en el FMAT. Se trató de un ensayo homogéneo que usa IL-13 humana biotinilada recubierta sobre perlas de estreptavidina y un conjugado de Fc-Cy5 anti-rata de cabra. Los cultivos positivos de este ensayo luego se incorporaron en el ensayo celular indicador HEK-293 IL-13R-STAT-6 (ensayo HEK-Blue, Invivogen) para identificar neutralizadores. Los sobrenadantes neutralizantes luego se perfilaron en el Biacore para estimar la tasa de disociación y también para caracterizar el modo de acción de la neutralización. La neutralización se clasificó como bin 1 o bin 2. Bin 1 representaba un anticuerpo que se une a IL-13 humana e impide la unión de IL-13Ra1 y como resultado también bloquea la unión de IL-4R. Bin 2 representó un anticuerpo que se une a hIL-13 de tal manera que permite la unión a IL-13Ra1, pero impide el reclutamiento de IL-4R en el complejo. Los autores seleccionaron los anticuerpos que actúan a través de bin 1.

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Tabla 4

IL-13 fuente (250 pg/ml): IC50 Fab Ab652 (ng/ml)

Derivada de E. coli, tipo salvaje: 1,05

Mamífero (fibroblastos de rata), tipo salvaje: 0,57

Células T humanas naturales, tipo salvaje: 2,12

Células T humanas naturales, variante R130Q: 1,66

Cynomolgus en el receptor humano (1/4,000 = 250pg/ml): 1,61

Fab nebulizado: 1,15

Tabla 5

Fuente de IL-13: IC50 ± SEM de Ab652 Afinidad funcional KD de Ab652

ng/ml: p M ng/ml pM

Recombinante, derivada de E. coli (purificada): 0,670 ± 0,235 (n = 4) 14,267 ± 4,943 (n = 4) - -

Recombinante, derivada de células de: 0,103 (n 2,173 (n

Potencia frente a: mamífero (fibroblastos de rata o 0,611 ± 0,039 (n = 12,857 ± 0,821 (n = 1) = 1)

IL-13 tipo salvaje humana: sobrenadante de HEK293 transfectados) 2) = 2)

Natural, derivada de donante tipo salvaje homocigota (sobrenadante de PBMC): 1,544 ± 0,140 (n = 9) 32,503 ± 2,949 (n = 9) - -

Potencia frente a variante de IL-13 humana: Natural, derivada de donante de variante R130Q homocigota (sobrenadante de PBMC) 0,861 ± 0,141 (n = 7) 20,079 ± 3,082 (n = 7) - -

Recombinante, derivada de células de

mamífero (fibroblastos de rata o: 3,342 ± 0,431 (n = 70,328 ± 9,072 (n 0,210 (n 4,414 (n

Potencia frente a IL13 de Cynomolgus: sobrenadante de HEK293 transfectados) 13) = 13) = 1) = 1)

Potencia frente a IL-13 de rata: Recombinante, derivada de células de mamífero (sobrenadante de HEK293 transfectado) 952,600 (n = 1) 20,046,300 (n = 1) - -

Potencia frente a IL-13 de perro: Recombinante, derivada de células de mamífero (sobrenadante de HEK293 transfectado) Sin reactividad cruzada (n = 2) Sin reactividad cruzada (n = 2) - -

5 En general, estos datos demuestran que Fab Ab652 es similarmente potente en la neutralización de IL-13 humana recombinante y natural producida a partir de fuentes bacterianas y de mamíferos. La potencia de CA154_652.g2 frente a L-13 de cynomolgous en este ensayo no es más de 3 veces menor que frente a IL-13 humana también generada a partir de fibroblastos de rata. La potencia de CA154_652.g2 no se altera tras la nebulización con el nebulizador PARI eFLOW®.

10 1.7 Caracterización física de Ab652

Como se describió anteriormente, se generaron 8 regiones diferentes variables injertadas con anticuerpo utilizando las CDR derivadas del anticuerpo de rata seleccionado (SEQ ID NO: 1-6, Figura 1). La selección de Ab652 (gL1gH2) de los 8 injertos se basó en la potencia como se describió anteriormente y en las características biofísicas.

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Claims

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