ES2613682T3 - Procedimiento para producir una solución de azúcar con una concentración baja de cumaramida y/o ferulamida - Google Patents

Procedimiento para producir una solución de azúcar con una concentración baja de cumaramida y/o ferulamida Download PDF

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Abstract

Procedimiento para producir una solución de azúcar, que comprende: una etapa de pretratamiento, que consiste en tratar la biomasa celulósica con un agente de tratamiento que contiene amoníaco para obtener un producto tratado con amoníaco; una etapa de preparación de una solución de azúcar tratada con amoníaco, que consiste en sacarificar enzimáticamente el producto tratado con amoníaco para obtener una solución de azúcar tratada con amoníaco; y una etapa de preparación de una solución de azúcar purificada para eliminar la cumaramida y/o la ferulamida en la solución de azúcar tratada con amoníaco mediante purificación y determinar la concentración de cumaramida y/o ferulamida para obtener una solución de azúcar purificada que tiene una concentración de cumaramida y/o ferulamida de 10 a 1.100 ppm.

Description

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DESCRIPCION
Procedimiento para producir una solucion de azucar con una concentracion baja de cumaramida y/o ferulamida Sector
La presente invencion se refiere a un procedimiento para producir una solucion de azucar con una concentracion baja de cumaramida y/o ferulamida, a partir de biomasa celulosica, y a un procedimiento para producir etanol.
Antecedentes
Se ha utilizado un procedimiento de produccion de fermentacion de una sustancia quimica a partir de azucar como materia prima en la produccion de diversas materias primas industriales. Recientemente, como azucar que se utiliza como materia prima de fermentacion, se ha utilizado industrialmente una sustancia derivada de una materia prima comestible, tal como cana de azucar, almidon y remolacha azucarera. Sin embargo, la materia prima comestible puede ser insuficiente debido a un aumento de la poblacion mundial en el futuro, y esto puede causar un repentino aumento de los precios. Por lo tanto, el desarrollo de un procedimiento para producir de forma eficiente una solucion de azucar a partir de un material no comestible renovable, es decir, biomasa celulosica, ha cobrado protagonismo.
La biomasa celulosica incluye principalmente lignina, que es un polimero aromatico, y celulosa y hemicelulosa, las dos polimeros monosacaridos. Entre los ejemplos de un procedimiento para producir una solucion de azucar a partir de biomasa celulosica como materia prima se pueden incluir un procedimiento para hidrolizar directamente biomasa celulosica como materia prima usando acido sulfurico concentrado o similar, y un procedimiento de sacarificacion enzimatica con pretratamiento, en el que la biomasa celulosica se somete previamente a un pretratamiento, tal como un tratamiento con vapor, un tratamiento de pulverizacion fina y un tratamiento con acido sulfurico diluido, para separar la celulosa y la hemicelulosa de la lignina, y la celulosa y la hemicelulosa se hidrolizan con una enzima diastasica, tal como la celulasa.
Una solucion de azucar producida a partir de biomasa celulosica obtenida por estos procedimientos tiene un problema en el que durante un procedimiento de produccion de la solucion de azucar, se produce un inhibidor de la fermentacion, tal como hidroximetilfurfural (HMF), furfural y vainillina, y durante la produccion de alcohol y similares mediante la fermentacion de la solucion de azucar obtenida, la fermentacion de la solucion de azucar esta inhibida. Ademas, la concentracion de azucar de una solucion de azucar que se va a obtener puede ser baja dependiendo de las condiciones de tratamiento de la produccion de la solucion de azucar. En este caso, la solucion de azucar debe concentrarse varias veces, hasta aproximadamente 10 veces, antes de la etapa de fermentacion. Como procedimiento para eliminar el inhibidor de la fermentacion en la solucion de azucar y, al mismo tiempo, aumentar la concentracion de azucar durante la produccion de la solucion de azucar a partir de la biomasa celulosica como materia prima, se ha dado a conocer un procedimiento para tratar la solucion de azucar utilizando una membrana de nanofiltracion (por ejemplo, veanse las referencias de patente 1 y 2).
En general, el procedimiento de sacarificacion enzimatica con pretratamiento tiene la ventaja de que el impacto ambiental es menor en comparacion con el procedimiento para hidrolizar directamente la materia prima, pero, por otra parte, el rendimiento en azucar es bajo. Como procedimiento de pretratamiento en el que el impacto ambiental es pequeno y se obtiene un alto rendimiento en azucar, se ha propuesto un procedimiento de pretratamiento que utiliza un agente de tratamiento que contiene amoniaco (vease, por ejemplo, la referencia de patente 3).
Dicha etapa de tratamiento con amoniaco es tambien parte de un procedimiento de produccion de una solucion acuosa de azucar refinada que utiliza biomasa que contiene celulosa como material de alimentacion, que comprende
(1) una etapa de descomposicion de la biomasa que contiene celulosa, tal como utilizando una enzima despues del tratamiento con amoniaco, para producir una solucion acuosa de azucar (2) una etapa de someter la solucion acuosa de azucar resultante de la etapa (1) a un tratamiento de coagulacion, (3) una etapa de someter la solucion acuosa de azucar resultante de la etapa (2) a microfiltracion y/o ultrafiltracion para recuperar una solucion acuosa de azucar desde el lado aguas abajo y (4) una etapa de someter la solucion acuosa de azucar resultante de la etapa (3) a nanofiltracion y/u osmosis inversa para recuperar una solucion acuosa de azucar refinada desde el lado de aguas arriba mientras se eliminan las sustancias que obstaculizan la fermentacion desde el lado de aguas abajo, respectivamente (por ejemplo, vease las referencias de patente 4 y 5).
Ademas, la referencia no de patente 6 se refiere a un procedimiento para producir etanol mediante el pretratamiento de pasto varilla con amoniaco, llevando a cabo una sacarificacion enzimatica seguida de fermentacion de la solucion de azucar obtenida. Dicho documento indica que los compuestos de cumaramida y/o ferulamida pueden formarse tras el pretratamiento del pasto varilla con amoniaco.
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Lista de citas Referencias de patente
Referencia de patente 1: folleto de la publicacion internacional no. 2009/110374
Referencia de patente 2: folleto de la publicacion internacional no. 2010/067785
Referencia de patente 3: publicacion de patente japonesa abierta a inspeccion publica N° 2008-161125
Referencia de patente 4: folleto de la publicacion internacional no. 2011/111451
Referencia de patente 5: folleto de la publicacion internacional no. 2011/162009
Referencia no de patente 6: Bowman y otros, Bioresource Technology 2012, volumen 110, paginas 437-447 Sumario
Problema tecnico
En general, en una solucion de azucar obtenida a partir de biomasa celulosica que se somete a un pretratamiento, tal como un tratamiento con vapor, como se ha descrito anteriormente, se produce un inhibidor de la fermentacion, tal como hidroximetilfurfural (HMF), furfural y vainillina durante un procedimiento de produccion de la solucion de azucar, y la fermentacion de la solucion de azucar esta inhibida durante la produccion de alcohol y similares mediante la fermentacion de la solucion de azucar obtenida.
Por otra parte, en una solucion de azucar obtenida mediante el procedimiento de sacarificacion enzimatica con pretratamiento utilizando el pretratamiento con un agente de tratamiento que contiene amoniaco, como se describe en las referencias de patente 3-6, el inhibidor de la fermentacion conocido descrito anteriormente apenas se detecta, pero se ha encontrado que la fermentacion de la solucion de azucar esta inhibida como una solucion de azucar obtenida usando biomasa celulosica.
Por lo tanto, un objeto de la presente invencion es dar a conocer un procedimiento para producir una solucion de azucar que sea capaz de mejorar la eficacia de la fermentacion de la solucion de azucar durante la fermentacion de la solucion de azucar que se obtiene utilizando biomasa celulosica pretratada con un agente de tratamiento que contiene amoniaco, que puede alcanzar un alto rendimiento de azucar, con el fin de mejorar la eficiencia de la produccion de etanol y similares utilizando la solucion de azucar obtenida a partir de biomasa celulosica, asi como dar a conocer una solucion de azucar y un procedimiento para producir etanol.
Solucion al problema
Con el fin de resolver el problema y lograr el objetivo, los presentes inventores han investigado intensamente un procedimiento para producir una solucion de azucar y un procedimiento para producir etanol. Como resultado, los inventores han descubierto que un hidrolizado (solucion de azucar tratada con amoniaco), obtenido mediante la hidrolisis con una enzima de la biomasa celulosica pretratada con amoniaco, incluye cumaramida y ferulamida como inhibidores de la fermentacion especificos. Sobre la base del hallazgo obtenido, los presentes inventores han descubierto que, cuando se eliminan la cumaramida y/o la ferulamida en la solucion de azucar tratada con amoniaco, mediante purificacion para fijar la concentracion de cumaramida y/o ferulamida en un intervalo predeterminado, se puede mejorar la eficiencia de la fermentacion de la solucion de azucar tratada con amoniaco. La presente invencion se ha completado sobre la base de los hallazgos.
Especificamente, la presente invencion tiene las siguientes configuraciones (1) a (5).
(1) Un procedimiento para producir una solucion de azucar, que comprende:
una etapa de pretratamiento que consiste en tratar la biomasa celulosica con un agente de tratamiento que contiene amoniaco para obtener un producto tratado con amoniaco;
una etapa de preparacion de una solucion de azucar tratada con amoniaco que consiste en sacarificar enzimaticamente el producto tratado con amoniaco para obtener una solucion de azucar tratada con amoniaco; y una etapa de preparacion de una solucion de azucar purificada que consiste en eliminar la cumaramida y/o la ferulamida en la solucion de azucar tratada con amoniaco mediante purificacion y determinar la concentracion de cumaramida y/o ferulamida para obtener una solucion de azucar purificada que tiene una concentracion de cumaramida y/o ferulamida de 10 a 1.100 ppm.
(2) El procedimiento para producir una solucion de azucar, segun el punto (1) descrito anteriormente, en el que la biomasa celulosica contiene biomasa herbacea.
(3) El procedimiento para producir una solucion de azucar, segun los puntos (1) o (2) descritos anteriormente, en el que se usa una membrana de nanofiltracion en un tratamiento de purificacion de la solucion de azucar tratada con amoniaco.
(4) El procedimiento para producir una solucion de azucar, segun cualquiera de los puntos (1) a (3) descritos anteriormente, en el que el producto tratado con amoniaco se sacarifica enzimaticamente con una solucion que tiene una concentracion de una materia solida del producto tratado con amoniaco en un intervalo del 1 al 10% en masa durante la sacarificacion enzimatica del producto tratado con amoniaco.
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(5) El procedimiento, segun cualquiera de los puntos (1) a (4) descritos anteriormente, que comprende ademas la utilizacion de la solucion de azucar obtenida como materia prima de la fermentacion para producir etanol.
Efectos ventajosos de la invencion
Segun la presente invencion, cuando se fermenta una solucion de azucar obtenida utilizando biomasa celulosica pretratada con un agente de tratamiento que contiene amoniaco, se puede mejorar la eficiencia de la fermentacion de la solucion de azucar.
Breve descripcion de las figuras
La figura 1 es un diagrama de flujo que muestra un ejemplo de un procedimiento para producir una solucion de azucar segun una realizacion de la presente invencion.
La figura 2 es un diagrama que muestra los resultados del analisis de compuestos aromaticos en una solucion de azucar tratada con amoniaco mediante HPLC.
La figura 3 es un diagrama que muestra un espectro de absorcion UV del pico 1 de la solucion de azucar tratada con amoniaco.
La figura 4 es un diagrama que muestra un espectro de absorcion UV del pico 2 de la solucion de azucar tratada con amoniaco.
La figura 5 es un diagrama que muestra un espectro de absorcion UV de una muestra estandar de cumaramida.
La figura 6 es un diagrama que muestra un espectro de absorcion UV de una muestra estandar de ferulamida.
La figura 7 es un diagrama que muestra la relacion entre un tiempo de fermentacion y una concentracion de etanol de una solucion concentrada por NF y una solucion concentrada por OI.
La figura 8 es un diagrama que muestra la relacion entre un tiempo de fermentacion y una concentracion de xilosa de la solucion concentrada por NF y la solucion concentrada por OI.
La figura 9 es un diagrama que muestra la relacion entre el tiempo de fermentacion y la concentracion de etanol de la solucion concentrada por NF y la solucion concentrada por OI.
La figura 10 es un diagrama que muestra la relacion entre el tiempo de fermentacion y la concentracion de xilosa de la solucion concentrada por NF y la solucion concentrada por OI.
Descripcion de las realizaciones
En lo sucesivo en el presente documento, la presente invencion se describe con mayor detalle con referencia a los dibujos. Ademas, los constituyentes divulgados se pueden utilizar en una combinacion apropiada o mediante una seleccion apropiada.
El procedimiento para producir una solucion de azucar segun la realizacion de la presente invencion se describe con referencia a los dibujos. La figura 1 es un diagrama de flujo que muestra un ejemplo del procedimiento para producir una solucion de azucar segun esta realizacion. Como se muestra en la figura 1, el procedimiento para producir una solucion de azucar segun esta realizacion incluye las siguientes etapas:
(A) una etapa de pretratamiento que consiste en tratar la biomasa celulosica con un agente de tratamiento que contiene amoniaco para obtener un producto tratado con amoniaco (etapa S11);
(B) una etapa de preparacion de una solucion de azucar tratada con amoniaco que consiste en sacarificar enzimaticamente el producto tratado con amoniaco para preparar una solucion de azucar tratada con amoniaco (etapa S12); y
(C) una etapa de preparacion de una solucion de azucar purificada que consiste en eliminar la cumaramida y/o la ferulamida en la solucion de azucar tratada con amoniaco mediante purificacion para obtener una solucion de azucar purificada que tiene una concentracion de cumaramida y/o ferulamida de 10 a 1.100 ppm (etapa S13).
En el presente documento, biomasa celulosica significa biomasa herbacea, tal como bagazo, pasto varilla, hierba de elefante, Erianthus, rastrojo de maiz, paja de arroz y paja de cebada, o biomasa lenosa, tal como arboles y materiales de construccion residuales. La biomasa celulosica contiene polisacaridos, tal como celulosa y hemicelulosa. Se puede producir una solucion de azucar mediante la hidrolisis de dichos polisacaridos.
En general, la hidrolisis de la biomasa celulosica se denomina sacarificacion. En esta realizacion, una solucion azucar producida mediante sacarificacion de biomasa celulosica se denomina solucion de azucar derivada de celulosa. La solucion de azucar derivada de celulosa incluye monosacaridos, tal como glucosa, xilosa, manosa y arabinosa, y polisacaridos solubles en agua, tal como celobiosa, celooligosacarido y xiloligosacarido. Dichos sacaridos pueden utilizarse como materia prima de la fermentacion (fuente de carbono) de un microorganismo y son convertidos por el microorganismo en diversas sustancias quimicas, tales como etanol, acido lactico y aminoacidos.
<Etapa de pretratamiento: Etapa S11 >
La biomasa celulosica se trata con un agente de tratamiento que contiene amoniaco para obtener un producto tratado con amoniaco (etapa de pretratamiento: etapa S11). En general, los ejemplos de un procedimiento de
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pretratamiento de biomasa celulosica pueden incluir un tratamiento con vapor, un tratamiento de pulverizacion fina, un tratamiento de chorro, un tratamiento acido con una solucion acida de acido sulfurico o similar, un tratamiento alcalino con una solucion alcalina de hidroxido de sodio o similar, un tratamiento con amoniaco (NH3), un tratamiento enzimatico y un tratamiento con un compuesto que contiene un grupo amino (NH2). Entre estos procedimientos de pretratamiento, segun esta realizacion, la biomasa celulosica se pretrata con un agente de tratamiento que contiene amoniaco. El amoniaco se obtiene y se manipula con facilidad. Por un procedimiento de pretratamiento con un agente de tratamiento que contiene amoniaco, la biomasa celulosica puede sacarificarse eficazmente en comparacion con otros procedimientos de pretratamiento. Cuando la biomasa celulosica se trata previamente con un agente de tratamiento que contiene amoniaco antes de la sacarificacion, se puede mejorar la eficiencia de la sacarificacion de la biomasa celulosica.
Como agente de tratamiento que contiene amoniaco, se puede utilizar amoniaco en combinacion con algunos de entre un compuesto que contiene un grupo amino y otro compuesto. Entre los ejemplos del compuesto que contiene un grupo amino se pueden incluir metilamina, etilamina, propilamina, butilamina, hidrazina, etilendiamina, propanodiamina y butanodiamina. Entre los ejemplos del otro compuesto se pueden incluir dioxido de carbono, nitrogeno, etileno, metano, etano, propano, butano, pentano, hexano, tolueno, benceno, fenol, dioxano, xileno, acetona, cloroformo, tetracloruro de carbono, etanol, metanol, propanol y butanol.
El agente de tratamiento que contiene amoniaco puede ser cualquiera de entre un liquido, un gas y una fase mixta gas-liquido. Incluso cuando se usa amoniaco en cualquier estado de entre un liquido, un gas y una fase mixta gas-liquido, se puede obtener una biomasa celulosica que tiene una excelente eficacia de sacarificacion enzimatica. El agente de tratamiento que contiene amoniaco puede ser un fluido de amoniaco supercritico o un fluido de amoniaco subcritico. Un procedimiento de tratamiento con un fluido de amoniaco supercritico no esta particularmente limitado y puede seleccionarse apropiadamente dependiendo del proposito. Por ejemplo, este procedimiento de tratamiento se puede llevar a cabo introduciendo biomasa celulosica y amoniaco en un reactor, tal como una autoclave, y aplicando calor y presion al interior del reactor para hacer que el amoniaco llegue a un estado supercritico. Dado que el fluido de amoniaco supercritico tiene una alta permeabilidad en el interior de la biomasa celulosica, la biomasa celulosica adecuada para la sacarificacion enzimatica puede obtenerse de manera eficiente y rapida.
La biomasa celulosica reunida puede utilizarse tal cual o la biomasa celulosica se puede cortar o pulverizar antes de un pretratamiento para formar particulas de biomasa celulosica que tienen un diametro de particula promedio que es igual o menor que un diametro de particula predeterminado y, despues, se somete a pretratamiento. Cuando el diametro de particula de la biomasa celulosica se disminuye previamente, la manipulacion es facil y puede mejorarse la eficiencia del tratamiento con el agente de tratamiento que contiene amoniaco.
El diametro de particula de las particulas de biomasa celulosica no esta particularmente limitado y puede seleccionarse apropiadamente dependiendo de los propositos de la misma. Por ejemplo, el diametro de particula es, preferentemente, de 5 mm o menor, mas preferentemente, de 1 mm o menor, y ademas preferentemente, de 0,1 mm o menor. Cuando el diametro de particula de las particulas de biomasa celulosica es superior a 5 mm, la biomasa celulosica puede no estar suficientemente sometida a un tratamiento de sacarificacion. Cuando el diametro de particula de las particulas de biomasa celulosica esta comprendido dentro del intervalo indicado anteriormente, el tiempo requerido para el tratamiento de sacarificacion de la biomasa celulosica puede acortarse y puede reducirse la cantidad de amoniaco que se va a utilizar.
La biomasa celulosica reunida puede utilizarse tal cual y pretratarse con el agente de tratamiento que contiene amoniaco, pero la presente invencion no esta limitada a esto. Desde el punto de vista de la recuperacion del amoniaco que se va a utilizar en un pretratamiento de biomasa celulosica, la biomasa celulosica puede secarse y pretratarse mediante la adicion del agente de tratamiento que contiene amoniaco.
Como procedimiento de pretratamiento de la biomasa celulosica, se utiliza un procedimiento de tratamiento con el agente de tratamiento que contiene amoniaco, pero el procedimiento de tratamiento con el agente de tratamiento que contiene amoniaco puede utilizarse en combinacion con el otro procedimiento de pretratamiento de la biomasa celulosica, como se ha descrito anteriormente.
<Etapa de preparacion de solucion de azucar tratada con amoniaco: Etapa S12>
Se anade una enzima al producto tratado con amoniaco obtenido en la etapa de pretratamiento (etapa S11), para realizar la sacarificacion mediante un tratamiento enzimatico y se obtiene una solucion de azucar tratada con amoniaco (hidrolizado) (etapa de preparacion de la solucion de azucar tratada con amoniaco: etapa S12). En esta realizacion, la solucion de azucar obtenida por sacarificacion de la biomasa celulosica tratada con el agente de tratamiento que contiene amoniaco se denomina solucion de azucar tratada con amoniaco.
La solucion de azucar preparada a partir de biomasa celulosica (solucion de azucar derivada de celulosa) contiene un inhibidor o inhibidores de la fermentacion, cuya cantidad o componente varia dependiendo del procedimiento de pretratamiento o sacarificacion. La inhibicion de la fermentacion significa un fenomeno en el que, cuando se produce
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una sustancia quimica como materia prima de la fermentacion a partir de la solucion de azucar derivada de celulosa, disminuyen la velocidad de crecimiento de un microorganismo, la cantidad de produccion, la dosis acumulada y la velocidad de produccion de la sustancia quimica en cooperacion con la utilizacion de un monosacarido de muestra como materia prima de la fermentacion. El inhibidor de la fermentacion representa una sustancia causante que produce un fenomeno de inhibicion de la fermentacion en dicha etapa de fermentacion para evitar una reaccion de fermentacion. Entre los ejemplos especificos del inhibidor de la fermentacion se pueden incluir acido acetico, acido formico, acido levulinico, furfural e hidroximetilfurfural (HMF), que son sustancias excesivamente descompuestas de azucar, y vainillina, acetovainilina y guayacol, que son compuestos aromaticos derivados de lignina.
La solucion de azucar tratada con amoniaco contiene cumaramida y ferulamida como inhibidores de la fermentacion. La cumaramida y la ferulamida no estan contenidas en una solucion de azucar derivada de celulosa obtenida por un tratamiento distinto del tratamiento con amoniaco, pero estan contenidas en la solucion de azucar tratada con amoniaco. Por lo tanto, la cumaramida y la ferulamida son inhibidores especificos de la fermentacion contenidos en la solucion de azucar tratada con amoniaco. La cumaramida y la ferulamida son compuestos amida producidos por condensacion de acido cumarico y acido ferulico con amoniaco, respectivamente. El acido cumarico o el acido ferulico estan contenidos en la biomasa celulosica. Por lo tanto, la cumaramida y la ferulamida de la solucion de azucar tratada con amoniaco se producen mediante reacciones de condensacion de acido cumarico y acido ferulico, respectivamente, en la biomasa celulosica, con una molecula de amoniaco por el tratamiento con amoniaco durante la adicion del agente de tratamiento que contiene amoniaco a la biomasa celulosica en la etapa de pretratamiento (etapa S11).
Incluso cuando se utiliza la biomasa celulosica herbacea o lenosa como materia prima, la cumaramida y la ferulamida estan contenidas en la solucion de azucar tratada con amoniaco. Sin embargo, cuando se utiliza la biomasa herbacea como materia prima, la cumaramida y la ferulamida estan contenidas en mayores cantidades. Por lo tanto, cuando la solucion de azucar tratada con amoniaco se utiliza como materia prima de la fermentacion tal como esta, sin purificacion, la eficiencia de la fermentacion cuando se utiliza la biomasa herbacea como materia prima es menor que cuando se utiliza la biomasa lenosa como materia prima. Sin embargo, segun la presente invencion, incluso cuando se utiliza la biomasa herbacea o lenosa como materia prima, se puede obtener la misma eficiencia de la fermentacion por purificacion de la solucion de azucar tratada con amoniaco. La razon por la que las cantidades de cumaramida y ferulamida en la solucion de azucar tratada con amoniaco cuando se utiliza la biomasa herbacea como materia prima son mayores que cuando se utiliza la biomasa lenosa como materia prima es que las cantidades de acido cumarico y acido ferulico en la biomasa herbacea son inicialmente mayores que las de la biomasa lenosa.
Es preferente que el producto tratado con amoniaco sea sacarificado enzimaticamente con una solucion que tenga una concentracion de materias solidas del producto tratado con amoniaco en un intervalo del 1% en masa o mas y del 10% en masa o menos durante la sacarificacion enzimatica del producto tratado con amoniaco. La concentracion de materias solidas del producto tratado con amoniaco es del 5% en masa o mas y menos del 10% en masa. Cuando la concentracion de materias solidas del producto tratado con amoniaco es del 10% en masa o menos, una reaccion de sacarificacion no esta inhibida durante la sacarificacion enzimatica del producto tratado con amoniaco mediante la adicion de una enzima al producto tratado con amoniaco en la etapa de preparacion de la solucion de azucar tratada con amoniaco, como se describe a continuacion (etapa S12). Ademas, se puede suprimir un aumento en la concentracion del inhibidor de la fermentacion en la solucion de azucar tratada con amoniaco. Cuando la concentracion de materias solidas del producto tratado con amoniaco es del 1% en masa o mas, la energia y el tiempo de tratamiento pueden suprimirse durante la concentracion hasta una concentracion requerida para su utilizacion como materia prima para la produccion de fermentacion y el coste puede disminuir. Por lo tanto, esto es economicamente ventajoso.
Un componente disolvente que contiene las materias solidas del producto tratado con amoniaco no esta limitado siempre que las materias solidas del producto tratado con amoniaco puedan dispersarse en su interior. Se utiliza agua o similares.
La enzima utilizada para la sacarificacion enzimatica del producto tratado con amoniaco no esta particularmente limitada, siempre y cuando sea una enzima que tenga una actividad de descomposicion de la celulosa (celulasa). Como enzima, preferentemente se utiliza celulasa que contiene celulasa de tipo exo o celulasa de tipo endo que tiene actividad de descomposicion de celulosa cristalina. Es preferente que dicha celulasa sea celulasa producida por hongos filamentosos, mas preferentemente celulasa producida por especies de Trichoderma, entre los hongos filamentosos y, aun mas preferentemente, celulasa producida por Trichoderma reesei entre las especies de Trichoderma.
La sacarificacion enzimatica se realiza, preferentemente, a un pH de aproximadamente 3 a aproximadamente 7 y, mas preferentemente, de aproximadamente 5. Ademas, la temperatura de reaccion de la sacarificacion enzimatica es, preferentemente, de 40 a 70°C, y, mas preferentemente, de aproximadamente 50°C.
La solucion de azucar tratada con amoniaco obtenida mediante la sacarificacion enzimatica puede someterse a una etapa posterior como tal o despues de la eliminacion de materias solidas mediante separacion de solido-liquido, tal como un procedimiento de separacion centrifuga y un procedimiento de separacion por membrana.
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<Etapa de preparacion de solucion de azucar purificada: Etapa S13>
La cumaramida y/o ferulamida contenidas en la solucion de azucar tratada con amomaco obtenida en la etapa de preparacion de la solucion de azucar tratada con amomaco (etapa S12) se eliminan mediante purificacion y se determina la concentracion de cumaramida y/o ferulamida para obtener una solucion de azucar purificada que tiene una concentracion predeterminada (etapa de preparacion de la solucion de azucar purificada: etapa S13).
La concentracion de cumaramida y/o ferulamida en la solucion de azucar purificada esta comprendida dentro de un intervalo de 10 a 1.100 ppm, mas preferentemente de 10 a 800 ppm y, mas preferentemente, de 10 a 450 ppm. Cuando la concentracion de cumaramida y/o ferulamida en la solucion de azucar purificada es de 1.100 ppm o menos, la eficiencia de la fermentacion mejora significativamente. Cuando la concentracion en la solucion de azucar purificada es de 10 ppm o mas, se puede suprimir un aumento en la energfa y los costes requeridos para la purificacion de la solucion de azucar tratada con amomaco. En otras palabras, aunque la eficiencia de la fermentacion de la solucion de azucar purificada mejora a medida que la concentracion de cumaramida y/o ferulamida es menor, cuando la concentracion en la solucion de azucar purificada es inferior a 10 ppm, la eficiencia de la fermentacion de la solucion de azucar purificada no mejora adicionalmente y la energfa y los costes requeridos para la purificacion de la solucion de azucar tratada con amomaco aumentan. Por lo tanto, esto es economicamente desventajoso y no es preferente.
El procedimiento para purificar la solucion de azucar tratada con amomaco no esta particularmente limitado, y entre los ejemplos de los mismos se pueden incluir destilacion, extraccion, cristalizacion, recristalizacion, cromatograffa en columna y separacion de membrana. Estos procedimientos de purificacion de la solucion de azucar tratada con amomaco pueden utilizarse solos o puede utilizarse una pluralidad de los procedimientos en combinacion. Entre los procedimientos de purificacion de la solucion de azucar tratada con amomaco, preferentemente se utiliza un tratamiento con membrana y, en particular, se utiliza, preferentemente, una membrana de nanofiltracion. La membrana de nanofiltracion puede prevenir la penetracion de azucar en la solucion de azucar tratada con amomaco y permite que la atraviesen la cumaramida y/o la ferulamida. Por lo tanto, la utilizacion de la membrana de nanofiltracion en la purificacion de la solucion de azucar tratada con amomaco permite tanto la concentracion de azucar como la eliminacion de ferulamida y cumaramida.
La membrana de nanofiltracion es una membrana de separacion que generalmente se define como "membrana que permite que la atraviesen los iones monovalentes e impide que lo hagan los iones divalentes ", y tambien se conoce como nanofiltro, membrana de nanofiltracion o membrana NF. La membrana de nanofiltracion es una membrana que puede tener espacios vacfos finos de algunos nanometros y se utiliza, principalmente, para la prevencion de partfculas finas, moleculas, iones, sales y similares, en agua.
Como material para la formacion de la membrana de nanofiltracion, se puede utilizar un material macromolecular, tal como polfmero a base de acetato de celulosa, poliamida, poliester, poliimida y polfmero de vinilo. La membrana de nanofiltracion no se limita a una pelfcula hecha de un tipo de los materiales anteriores y se puede utilizar una membrana que contiene una pluralidad de materiales de membrana. La estructura de membrana de la membrana de nanofiltracion puede ser una membrana asimetrica que tiene una capa compacta sobre, al menos, un lado y microporos cuyo diametro aumenta gradualmente desde la capa compacta hacia el interior de la membrana o hacia otro lado, o una membrana compuesta que tiene una capa funcional muy delgada hecha de otro material sobre la capa compacta de la membrana asimetrica. Como membrana compuesta, por ejemplo, se puede utilizar una membrana compuesta que constituye un nanofiltro que tiene una capa funcional de poliamida sobre una membrana de soporte hecha de polisulfona como material de membrana. Por ejemplo, una membrana compuesta de este tipo se describe en la solicitud de patente japonesa abierta a inspeccion publica no. Sho. 62-201606.
En particular, es preferente una membrana compuesta que tiene alta resistencia a la presion, alta permeabilidad al agua y alto rendimiento de eliminacion de solutos, y potencial excelente, e incluye una capa funcional de poliamida. Con el fin de mantener la durabilidad frente a la presion de funcionamiento, la alta permeabilidad al agua y el rendimiento de prevencion, es adecuada una membrana que tiene una estructura en la que una capa funcional es poliamida y esta sostenida por una membrana porosa o un soporte hecho de telas no tejidas. Es adecuada que una membrana semipermeable de poliamida sea una membrana semipermeable compuesta que tiene una capa funcional de poliamida reticulada obtenida mediante una reaccion de policondensacion de una amina multifuncional con un haluro acido multifuncional como soporte.
Entre los ejemplos de componente de acido carboxflico preferente, que es un monomero que constituye la poliamida en la membrana de nanofiltracion que tiene una capa funcional de poliamida, se pueden incluir un acido carboxflico aromatico, tal como acido trimesico, acido benzofenona tetracarboxflico, acido trimelftico, acido piromelftico, acido isoftalico, acido tereftalico, acido naftalenodicarboxflico, acido difenilcarboxflico y acido piridincarboxflico. Teniendo en cuenta a la solubilidad en un disolvente para la formacion de una membrana, son mas preferentes el acido trimesico, el acido isoftalico, el acido tereftalico y una mezcla de los mismos.
Entre los ejemplos de componente de amina preferente, que es un monomero que constituye la poliamida, se
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pueden incluir una diamina primaria que tiene un anillo aromatico, tal como m-fenilendiamina, p--fenilendiamina, bencidina, metilenbisdianilina, eter de 4,4'-diaminobifenilo, dianisidina, eter de 3,3',4-triaminobifenilo, eter de 3,3',4,4'-tetraaminobifenilo, 3,3'-dioxibencidina, 1,8-naftalendiamina, m(p)-monometilfenilendiamina, eter de 3,3'-monometilamino-4,4'-diaminobifenilo, 4,N,N'-(4-aminobenzoil)-p(m)-fenilendiamina-2,2'-bis(4-aminofenilbencimidazol), 2,2'-bis(4-aminofenilbenzoxazol) y 2,2'-bis(4-aminofenilbenzotiazol), y una diamina secundaria, tal como piperazina, piperidina, y derivados de los mismos. En particular, preferentemente se utiliza una membrana de nanofiltracion que tiene una capa funcional de poliamida reticulada que contiene piperazina o piperidina como monomero, ya que tiene resistencia al calor y resistencia quimica ademas de resistencia a la presion y durabilidad. Es mas preferente una poliamida que contiene la poliamida de piperazina reticulada o poliamida de piperidina reticulada como componente principal y un componente representado por la siguiente formula quimica (1), y es aun mas preferente una poliamida que contiene poliamida de piperazina reticulada como componente principal y el componente representado mediante la siguiente formula quimica (1). Preferentemente, se utiliza el componente representado por la siguiente formula quimica (1), en la que n es 3. Entre los ejemplos de una membrana de nanofiltracion que tiene una capa funcional de poliamida que contiene poliamida de piperazina reticulada como componente principal y el componente representado por la siguiente formula quimica (1) se pueden incluir los descritos en la solicitud de patente japonesa abierta a inspeccion publica no. Sho. 62-201606. Entre los ejemplos especificos de los mismos se pueden incluir una membrana de nanofiltracion basada en poliamida de piperazina reticulada, UTC60, disponible a traves de la firma TORAY INDUSTRIES, INC., que tiene una capa funcional de poliamida que contiene poliamida de piperazina reticulada como componente principal y el componente representado por la siguiente formula quimica (1), en la que n es 3.
imagen1
R R ...(i)
(n es un numero entero de 1 o mas).
La membrana de nanofiltracion se utiliza generalmente como un modulo de membrana en espiral. La membrana de nanofiltracion utilizada en esta realizacion se utiliza, preferentemente, como un modulo de membrana en espiral. Entre los ejemplos especificos de modulos de membrana de nanofiltracion preferentes se pueden incluir una membrana de nanofiltracion GEsepa, disponible a traves de la firma GE Osmonics, Inc., que es una membrana de nanofiltracion basada en acetato de celulosa, una membrana de nanofiltracion NF99 o NG99HF, disponible a traves de la firma Alfa Laval, que tiene una capa funcional de poliamida, una membrana de nanofiltracion NF-45, NF-90, NF-200, NF-270 o NF-400, disponible a traves de la firma Filmtech Corporation, que tiene una capa funcional de poliamida de piperazina reticulada y un modulo de membrana de nanofiltracion SU-210, SU-220, SU-600 o SU-610, disponible a traves de la firma tOrAY INDUSTRIES, INC., incluyendo UTC60, disponible a traves de la firma TORAY INDUSTRIES, INC., que tiene una capa funcional que contiene poliamida de piperazina reticulada como componente principal y una poliamida que contiene un componente representado por la formula quimica (1) anterior. Son preferentes una membrana de nanofiltracion NF99 o NF99HF, disponible a traves de la firma Alfa Laval, que tiene una capa funcional de poliamida, una membrana de nanofiltracion NF-45, NF-90, NF-200 o NF-400, disponible a traves de la firma Filmtech Corporation, que tiene una capa funcional de poliamida de piperazina reticulada y un modulo de membrana de nanofiltracion SU-210, SU-220, sU-600 o SU-610, disponible a traves de la firma ToRaY INDUSTRIES, INC., incluyendo UTC60, disponible a traves de la firma TORAY INDUSTRIES, INC., que tiene una capa funcional que contiene poliamida de piperazina como componente principal y una poliamida que contiene un componente representado por la formula quimica anterior (1). Es mas preferente una membrana de nanofiltracion SU-210, SU-220, SU-600 o SU-610, disponible a traves de la firma TORAY INDUSTRIES, INC., incluyendo UTC60, disponible a traves de la firma TORAY INDUSTRIES, INC., que tiene una capa funcional que contiene poliamida de piperazina reticulada como componente principal y una poliamida que contiene un componente representado por la formula quimica (1) anterior.
El pH de la solucion de azucar tratada con amoniaco para pasar a traves de la membrana de nanofiltracion no esta particularmente limitado y el pH es, preferentemente, de 1 a 5. Cuando el pH es inferior a 1, la membrana se desnaturaliza en la utilizacion durante un periodo prolongado y los rendimientos de la membrana, tales como el flujo y la relacion de permeabilidad, disminuyen significativamente. Cuando el pH es superior a 5, la relacion de eliminacion del inhibidor de la fermentacion puede disminuir significativamente. Cuando el pH de la solucion de azucar tratada con amoniaco se ajusta dentro del intervalo y la solucion de azucar tratada con amoniaco se somete a filtracion a traves de la membrana de nanofiltracion, se puede mejorar la relacion de eliminacion del inhibidor de la fermentacion. Cuando el pH de la solucion de azucar tratada con amoniaco esta comprendido dentro del intervalo, hay un efecto de supresion de las incrustaciones en la membrana de nanofiltracion. Por lo tanto, la membrana de nanofiltracion se puede utilizar de forma estable durante un periodo prolongado.
El acido o alcali utilizado en el ajuste del pH de la solucion de azucar tratada con amoniaco no esta particularmente limitado. Entre los ejemplos del acido se pueden incluir acido clorhidrico, acido sulfurico, acido nitrico y acido fosforico. El acido sulfurico, el acido nitrico y el acido fosforico son preferentes desde el punto de vista de la dificultad de inhibicion durante la fermentacion, y el acido sulfurico es mas preferente desde el punto de vista de la
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economia. Es preferente que el alcali sea amoniaco, hidroxido sodico, hidroxido calcico o una solucion acuosa que contiene cualquiera de ellos desde el punto de vista economico, mas preferentemente, amoniaco o hidroxido sodico, que es un ion monovalente, desde el punto de vista de las incrustaciones en la membrana, y, mas preferentemente, amoniaco desde el punto de vista de la dificultad de inhibicion durante la fermentacion.
Una etapa de ajuste del pH de la solucion de azucar tratada con amoniaco puede realizarse en cualquier momento siempre que se realice la etapa antes de que la solucion de azucar tratada con amoniaco pase a traves de la membrana de nanofiltracion. Cuando se usa una enzima para la hidrolisis de la biomasa celulosica, el pH se puede ajustar a 5 o menos durante una reaccion de hidrolisis. Cuando el pH se reduce a 4 o menos en un procedimiento de reciclado de una enzima contenida en un filtrado, es probable que se produzca la desactivacion de la enzima. Por lo tanto, es preferente ajustar el pH despues de la eliminacion de la enzima contenida en el filtrado.
La temperatura de la solucion de azucar tratada con amoniaco que se hace pasar a traves de la membrana de nanofiltracion no esta particularmente limitada. La temperatura se puede ajustar apropiadamente desde el punto de vista de aumentar el rendimiento de la eliminacion del inhibidor de la fermentacion durante la filtracion a traves de la membrana de nanofiltracion utilizada. Especificamente, cuando se utiliza la membrana de nanofiltracion para la filtracion, es preferente que la temperatura de la solucion de azucar tratada con amoniaco sea de 40°C a 80°C. Esto se debe a que se mejora el rendimiento de eliminacion del inhibidor de la fermentacion por la membrana de nanofiltracion. Cuando la temperatura de la solucion de azucar tratada con amoniaco durante la filtracion a traves de la membrana de nanofiltracion es de 40°C o superior, el rendimiento de eliminacion del inhibidor de fermentacion en la solucion de azucar tratada con amoniaco aumenta. Cuando la temperatura de la solucion de azucar tratada con amoniaco es superior a 80°C, la membrana de nanofiltracion se desnaturaliza. Por lo tanto, se pueden perder las propiedades de la membrana. De acuerdo con lo anterior, cuando la temperatura de la solucion de azucar tratada con amoniaco esta comprendida dentro del intervalo mencionado anteriormente, puede mejorarse el rendimiento de eliminacion del inhibidor de la fermentacion a traves de la membrana de nanofiltracion.
Especificamente, se puede realizar un procedimiento que utiliza nanofiltracion de acuerdo con un procedimiento descrito en la publicacion internacional no. 2010/067785.
Cuando la solucion de azucar tratada con amoniaco se somete a filtracion a traves de la membrana de nanofiltracion, el inhibidor de la fermentacion puede eliminarse mas eficazmente mediante la adicion de agua a la solucion de azucar tratada con amoniaco. Mediante la cantidad de agua a anadir, se puede ajustar el contenido del inhibidor de la fermentacion contenido en la solucion de azucar purificada despues de la nanofiltracion. Especificamente, a medida que aumenta la cantidad de agua a anadir, el contenido del inhibidor de la fermentacion contenido en la solucion de azucar purificada despues de la nanofiltracion disminuye.
Por tanto, la cumaramida y/o la ferulamida en la solucion de azucar tratada con amoniaco se eliminan mediante purificacion y se determina la concentracion de cumaramida y/o ferulamida para obtener una solucion de azucar purificada que tenga una concentracion predeterminada.
Como se ha descrito anteriormente, segun el procedimiento para producir una solucion de azucar, la cumaramida y/o la ferulamida en la solucion de azucar tratada con amoniaco que se obtiene mediante sacarificacion enzimatica del producto tratado con amoniaco obtenido mediante tratamiento de la biomasa celulosica con el agente de tratamiento que contiene amoniaco se eliminan mediante purificacion y se determina la concentracion de cumaramida y/o ferulamida. De este modo, se puede obtener una solucion de azucar purificada que tiene una concentracion predeterminada. Cuando la cumaramida y/o la ferulamida especificas contenidas en la solucion de azucar tratada con amoniaco como inhibidores de la fermentacion se reducen con antelacion antes de la fermentacion de la solucion de azucar, se puede mejorar la eficiencia de la fermentacion.
Mediante la fermentacion de la solucion de azucar purificada resultante utilizada como materia prima de la fermentacion, se puede producir etanol. El procedimiento para producir etanol a partir de la solucion de azucar purificada obtenida mediante el procedimiento para producir una solucion de azucar no esta particularmente limitado. Entre los ejemplos del procedimiento para producir etanol se pueden incluir un procedimiento de fermentacion en dos etapas descrito en la solicitud de patente japonesa abierta a inspeccion publica No. 2009-296983. En el procedimiento de fermentacion en dos etapas, una hexosa, tal como glucosa y manosa, se convierte en etanol mediante levaduras o bacterias en una etapa de fermentacion primaria, y una pentosa, tal como xilosa, se convierte en etanol en una etapa de fermentacion secundaria. Como hongos utilizados en la etapa de fermentacion primaria, se pueden utilizar germenes conocidos. Entre los hongos, es preferente una levadura, tal como Saccharomyces cerevisiae. Esto se debe a que la levadura tiene una alta resistencia al etanol y permite producir etanol que tiene una concentracion del 5% o mas. Como hongos utilizados en la etapa de fermentacion secundaria, se puede utilizar una levadura de asimilacion de pentosas, tal como Pichia stipitis y, en particular, es preferente una cepa provista de un rendimiento resistente a la inhibicion de la fermentacion.
En la solucion de azucar purificada obtenida mediante el procedimiento para producir una solucion de azucar, se eliminan la cumaramida y/o la ferulamida especificas contenidas como inhibidores de la fermentacion en la solucion de azucar tratada con amoniaco que se obtiene tratando la biomasa celulosica con el agente de tratamiento que
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contiene amoniaco. Por lo tanto, cuando la solucion de azucar purificada se utiliza como materia prima de la fermentacion, la fermentacion no se inhibe. Por consiguiente, la utilizacion de la solucion de azucar purificada obtenida mediante el procedimiento para producir una solucion de azucar como materia prima de la fermentacion puede mejorar la eficiencia de la produccion de etanol.
Ejemplos
En adelante, en el presente documento, el contenido de la presente invencion se describe con detalle haciendo referencia a los ejemplos y ejemplos comparativos.
<Ejemplo 1: Preparacion y analisis de una solucion de azucar purificada>
[A. Preparacion de la solucion de azucar tratada con amoniaco]
(1. T ratamiento de trituracion de la biomasa celulosica)
Se utilizo Erianthus como biomasa celulosica. El Erianthus se trituro con un molino de corte y el tamano de particula se controlo con un tamiz con una abertura de 4 mm. El diametro promedio de particula (d50), medido mediante un procedimiento de difraccion laser, fue de aproximadamente 975 pm. El Erianthus triturado se seco a una temperatura de 40°C a una presion reducida de 5 kPa durante todo el dia y la noche. El contenido de humedad del Erianthus seco era aproximadamente el 0,5% en masa con respecto a la masa del Erianthus seco.
(2. Tratamiento de la biomasa celulosica con amoniaco)
La celulosa triturada y seca, en forma de virutas de celulosa, se trato con amoniaco. Se cargo una autoclave de acero inoxidable equipada con un agitador con una capacidad de aproximadamente 5 l con 200 g de las virutas de celulosa. Posteriormente, se repitieron la introduccion de gas nitrogeno presurizado en la autoclave y la despresurizacion para eliminar el aire de la autoclave y reemplazar el aire por gas nitrogeno. Despues, la autoclave se calento a 120°C. Despues del calentamiento, la autoclave se despresurizo y el gas nitrogeno se evacuo a presion reducida. Por otra parte, se introdujo amoniaco presurizado en otro recipiente a presion y se calento a una temperatura ligeramente superior a 120°C. A continuacion, se abrio una valvula de una tuberia que conectaba la autoclave y el recipiente a presion para introducir amoniaco en la autoclave, de modo que la presion a una temperatura de 120°C fuese de 1,2 MPa. Las virutas de celulosa se trataron con amoniaco en las condiciones de temperatura y presion durante 2,5 horas con agitacion. Posteriormente, se despresurizo la autoclave y se evacuo el amoniaco. Adicionalmente, se hizo pasar gas nitrogeno a traves de la autoclave para eliminar el amoniaco residual en las particulas de viruta de celulosa. De este modo, se obtuvo biomasa pretratada. Esta biomasa se utilizo como celulosa tratada con amoniaco (producto tratado con amoniaco).
(3. Hidrolisis de celulosa tratada con amoniaco)
Se anadieron 7,6 kg de agua a 0,4 kg de celulosa tratada con amoniaco, de manera que la concentracion de la celulosa tratada con amoniaco fue del 5%. A la resultante se anadio una pequena cantidad de acido sulfurico concentrado o hidroxido sodico acuoso para ajustar el pH a 5. Posteriormente, se anadio una preparacion de celulasa derivada de Trichoderma reesei(Accellerase DuEt, disponible a traves de la firma Genencor, Inc.) en una cantidad de 1/100 de la cantidad de celulosa seca tratada con amoniaco en terminos de la cantidad de proteina enzimatica. Se llevo a cabo una reaccion de sacarificacion a 50°C durante 24 horas. La sustancia obtenida mediante la reaccion de sacarificacion se utilizo como un hidrolizado.
(4. Separacion solido-liquido del hidrolizado)
El hidrolizado resultante se centrifugo y se separo en un componente de la solucion, asi como una celulosa y una lignina no descompuestas. El componente de la solucion se sometio a filtracion a traves de una membrana de microfiltracion que tenia un diametro de microporos de 0,45 pm (Stericup, disponible a traves de la firma Millipore Corporation) para eliminar las particulas insolubles en escala micrometrica. El componente de la solucion obtenido mediante el procedimiento descrito anteriormente se utilizo como una solucion de azucar tratada con amoniaco.
[B. Preparacion de solucion de azucar purificada]
(5. Condensacion del azucar a traves de una membrana de nanofiltracion)
La solucion de azucar tratada con amoniaco resultante se sometio a filtracion a traves de una membrana de nanofiltracion (UTC-60, disponible a traves de la firma TORAY INDUSTRIES, INC.) a temperatura normal y a una presion de funcionamiento de 4 MPa. La solucion concentrada obtenida mediante filtracion se utilizo como una solucion de azucar purificada. Como dispositivo de separacion por membrana, se utilizo una unidad de membrana plana (SEPA CF-II, disponible a traves de la firma GE Osmonics, area eficaz de membrana: 140 cm2).
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[C. Analisis de la solucion de azucar tratada con amoniaco]
Se analizaron los sacaridos, el acido organico y un compuesto aromatico en la solucion de azucar tratada con amoniaco obtenida en "4. Separacion solido-liquido del hidrolizado”. A continuacion se muestra cada condicion de analisis de los sacaridos, el acido organico y el compuesto aromatico en la solucion de azucar tratada con amoniaco.
(Condiciones del analisis de HPLC)
1. Condiciones de analisis de los sacaridos
Las concentraciones de glucosa y xilosa en la solucion de azucar tratada con amoniaco se determinaron en las condiciones de cromatografia liquida de alta resolucion (HPLC) mostradas a continuacion por comparacion con una muestra estandar.
Aparato: Sistema ACQUITY UPLC (fabricado por Waters)
Columna: Columna ACQUITY UPLC BEH Amida 1,7 pm 2,1 x 100 mm (fabricada por Waters)
Fase movil: liquido A; 80% de acetonitrilo + 0,2% de Tea, liquido B; 30% de acetonitrilo + 0,2% de TEA Caudal: 0,3 ml/min Temperatura: 55°C
2. Condiciones de analisis del acido organico
La concentracion de acido acetico en la solucion de azucar tratada con amoniaco se determino en las condiciones de HPLC mostradas a continuacion por comparacion con la muestra estandar.
Aparato: Hitachi High-Performance Liquid Chromatograph Lachrom elite (fabricado por Hitachi)
Columna; GL-C610H-S (fabricada por Hitachi)
Fase movil: Acido perclorico 3 mM Liquido de reaccion: solucion de azul de bromotimol Procedimiento de deteccion: Detector de UV-VIS Caudal fase movil: 0,5 ml/min, liquido de reaccion: 0,6 ml/min Temperatura: 60 °C
3. Condiciones de analisis del compuesto aromatico
Las concentraciones de acido cumarico, cumaramida y ferulamida en la solucion de azucar tratada con determinaron en las condiciones de HPLC mostradas a continuacion por comparacion con la muestra este momento, se obtuvo el espectro de absorcion UV (longitud de onda de medicion: 200 nm a 400 pico de deteccion.
Aparato: Hitachi High-Performance Liquid Chromatograph Lachrom elite (fabricado por Hitachi)
Columna: Synergi 2,5 pm Hydro-RP 100A (fabricado por Phenomenex)
Procedimiento de deteccion: Detector de matriz de diodos Caudal: 0,6 ml/min Temperatura: 40°C
Los sacaridos en la solucion de azucar tratada con amoniaco resultante se analizaron en las condiciones de HPLC descritas en "1. Condiciones de analisis de los sacaridos.” Como se confirma a partir del resultado, la glucosa y la xilosa estan contenidas como componentes sacaridos principales. El acido organico en la solucion de azucar tratada con amoniaco resultante se analizo en las condiciones de HPLC descritas en "2. Condiciones de analisis del acido organico.” Como se ve por el resultado, el acido acetico estaba contenido como componente acido organico principal. El compuesto aromatico en la solucion de azucar tratada con amoniaco resultante se analizo en las condiciones de HPLC descritas en "3. Condiciones de analisis del compuesto aromatico.” El resultado se muestra en la figura 2. Como se ve en la figura 2, se detectaron tres picos principales (veanse los picos 1, 2 y 3) de la solucion de azucar tratada con amoniaco.
Entre estos, se encontro que el pico 3 era un pico de acido cumarico, puesto que los tiempos de elucion de HPLC del pico 3 y de la muestra estandar de acido cumarico coincidian entre si. Los tiempos de elucion de los dos compuestos restantes (picos 1 y 2) no coincidian con los de ninguna de las muestras estandar de HMF, furfural, vainillina, acetovanillona, acido ferulico, coniferil aldehido y guayacol, que se conocen como compuestos aromaticos contenidos en una solucion de azucar derivada de la biomasa celulosica. Los dos picos (picos 1 y 2) se aislaron mediante HPLC y los pesos moleculares de los mismos se analizaron mediante LC/MS (LcMS-IT-TOF y LC20A, fabricado por Shimadzu Corp.).
Como se muestra a partir de los resultados, los pesos moleculares de los picos 1 y 2 fueron 163,063 y 193,074, respectivamente. Se supone que el acido cumarico y el acido ferulico se someten a una reaccion de condensacion
amoniaco se estandar. En nm) de cada
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con moleculas de amoniaco, para producir cumaramida y ferulamida, respectivamente. Los pesos moleculares calculados a partir de las formulas estructurales de cumaramida y ferulamida fueron 163,172 y 193,198, respectivamente, y se corresponden con los pesos moleculares obtenidos por LC/MS, respectivamente. Por lo tanto, se estima que los dos picos restantes (picos 1 y 2) en la solucion de azucar de celulosa tratada con amoniaco son cumaramida y ferulamida.
Se prepararon muestras estandar de cumaramida y ferulamida mediante sintesis a medida (contratista: VSN, Inc., laboratorio de sintesis), y se midieron los tiempos de elucion de HPLC de las muestras estandar sintetizadas. Como resultado, los tiempos de elucion (3,74 min) del pico 1 en la solucion de azucar tratada con amoniaco y la muestra estandar de cumaramida en una solucion mixta de las muestras patron coincidieron completamente entre si y los tiempos de elucion (5,25 min) del pico 2 en la solucion de azucar tratada con amoniaco y la muestra estandar de ferulamida en una solucion mixta de las muestras patron coincidieron completamente entre si (vease la figura 2).
Las figuras 3 a 6 muestran todos los espectros de absorcion UV de los picos 1 y 2 en la solucion de azucar tratada con amoniaco, la muestra estandar de cumaramida y la muestra estandar de ferulamida, que se obtuvieron en la HPLC. En este caso, la longitud de onda de medicion es de 200 nm a 400 nm. Como se muestra en las figuras 3 y 5, los espectros de absorcion UV del pico 1 en la solucion de azucar tratada con amoniaco y la muestra estandar de cumaramida coincidieron entre si. Como se muestra en las figuras 4 y 6, los espectros de absorcion UV del pico 2 en la solucion de azucar tratada con amoniaco y la muestra estandar de ferulamida coincidieron entre si.
Como puede verse a partir de los resultados del analisis, los picos 1 y 2 en la solucion de azucar tratada con amoniaco, que es un hidrolizado de celulosa tratada con amoniaco, son la cumaramida y la ferulamida, respectivamente, y la solucion de azucar tratada con amoniaco contenia una gran cantidad de los compuestos.
[D. Analisis de la solucion de azucar purificada]
La tabla 1 muestra la concentracion de cada componente en la solucion de materia prima (solucion de azucar tratada con amoniaco) antes de la filtracion, la solucion de azucar concentrada (solucion de azucar purificada) despues de la filtracion y una solucion de permeacion. El analisis de los componentes se realizo de acuerdo con las condiciones de analisis de HPLC descritas en "C. Analisis de la solucion de azucar tratada con amoniaco".
(Tabla 1)
Glucosa (g/l) Xilosa (g/l) Acido acetico (g/l) Acido cumarico (g/l) Cumaramida (g/l) Ferulamida (g/l)
Solucion de la materia prima
17,0 11,0 0,157 0,037 0,491 0,189
Solucion de azucar concentrado
99,6 53,9 0,151 0,079 0,622 0,454
Solucion de permeacion
1,16 1,4 0,169 0,030 0,317 0,064
Como se desprende de la tabla 1, cuando la solucion de azucar tratada con amoniaco se sometio a filtracion a traves de la membrana de nanofiltracion, los componentes sacaridos, es decir, glucosa y xilosa, en la solucion de azucar concentrada se concentraron 5,9 veces y 4,9 veces, respectivamente. Por otra parte, los componentes no sacaridos (acido acetico, acido cumarico, cumaramida y ferulamida) se concentraron de aproximadamente 1 a aproximadamente 2,4 veces. Cuando la solucion de azucar tratada con amoniaco se sometio a filtracion a traves de la membrana de nanofiltracion, la mayor parte de los componentes de sacarido en la solucion de la materia prima y la mayoria de los componentes no sacaridos podian separarse eficazmente en un lado de no permeacion y un lado de permeacion, respectivamente.
<Ejemplo comparativo 1: Consideracion del caso en el que el sacarido se concentra a partir de solucion de azucar tratada con amoniaco usando una membrana de osmosis inversa>
La filtracion se realizo de la misma manera que en "5. Condensacion de sacarido a traves de una membrana de nanofiltracion" en el ejemplo 1, excepto porque se utilizo una membrana de osmosis inversa (UTC-80, disponible a traves de la firma TORAY INDUSTRIES, INC.) como membrana de separacion y la presion de funcionamiento fue de 5 MPa. La tabla 2 muestra la concentracion de cada componente en la solucion de materia prima (solucion de azucar tratada con amoniaco) antes de la filtracion, la solucion de azucar concentrada (solucion de azucar purificada) despues de la filtracion y una solucion de permeacion. Observese que los componentes se analizaron mediante HPLC de la misma manera que se ha descrito anteriormente.
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(Tabla 2)
Glucosa (g/l) Xilosa (g/l) Acido acetico (g/l) Acido cumarico (g/l) Cumaramida (g/l) Ferulamida (g/l)
Solucion de la materia prima
17,0 11,0 0,157 0,037 0,491 0,189
Solucion de azucar concentrado
102,9 59,5 0,743 0,160 2,050 2,053
Solucion de permeacion
0,2 0,1 0 0 0 0
Como se desprende claramente de la tabla 2, los componentes monosacaridos, incluidas la glucosa y la xilosa, y otros componentes estaban apenas contenidos en la solucion de permeacion. Se confirma que, cuando la membrana de osmosis inversa se utiliza como membrana de separacion, los componentes sacaridos y la cumaramida y la ferulamida en la solucion de azucar tratada con amoniaco no pueden separarse.
<Ejemplo 2: Prueba de crecimiento utilizando una solucion modelo que contiene cumaramida, acido cumarico y ferulamida>
En el cultivo principal de "A. Prueba de crecimiento de Pichia stipitis usando una solucion modelo de azucar", que se describe a continuacion, se anadio cualquiera de entre cumaramida, acido cumarico y ferulamida a una concentracion de 2 ppm a 200 ppm como aditivo en un medio, y el medio se sometio a una prueba de crecimiento. Como control positivo, un medio YPDX sin aditivos se sometio a la misma prueba.
(A. Prueba de crecimiento de Pichia stipitis usando una solucion modelo de azucar)
Se cultivo estaticamente una cepa NBRC1687 de Pichia stipitis a 25°C en un medio de agar YPDX, producido mediante la adicion de agar al 2% a un medio YPDX mostrado en la tabla 3 a continuacion (precultivo). Una de las colonias formadas en el medio de agar se inoculo en 10 ml del medio YPDX con un bucle de platino y se cultivo a 25°C y 120 spm en un tubo de ensayo con un volumen de 20 ml durante 48 horas con agitacion (precultivo). Se anadio 1 ml de medio despues del precultivo a 9 ml de medio YPDX y se continuo el cultivo a 25°C y 60 spm en un tubo de ensayo con un volumen de 20 ml (cultivo principal). 0, 24 y 48 horas despues del inicio del cultivo, se realizo el muestreo, se midio la concentracion de monosacarido y la absorbancia (DO660). De este modo, se observo el crecimiento de cuerpos de hongos.
(Tabla 3)
Composicion
Concentracion de la composicion (g/l)
Glucosa
10
Xilosa
10
Polipeptona
20
Extracto de levaduras
10
La tabla 4 muestra los resultados del analisis de las concentraciones de glucosa y xilosa en el medio durante la obtencion de muestras en este ejemplo.
(Tabla 4)
Glucosa
CP Cumaramida ( ppm) Acido cumarico (ppm) Ferulamida (ppm)
0
2 20 200 2 20 200 2 20 200
0 h
10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
24 h
2,4 2,3 4,82 5,9 2,6 2,6 3,6 2,3 6,6 6,7
48 h
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Xilosa
CP Cumaramida ( ppm) Acido cumarico (ppm) Ferulamida (ppm)
0
2 20 200 2 20 200 2 20 200
0
10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
24 h
2,4 2,3 9,7 9,5 2,6 8,7 9,2 2,3 9,3 9,7
48 h
0 0 0 0,4 0 0 0 0 0 5,2
Como se desprende claramente de la tabla 4, cuando las concentraciones de los aditivos fueron de 20 ppm o mas,
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el consumo de xilosa se retraso en todos los aditivos en comparacion con el control positivo, y se produjo una inhibicion del crecimiento. Por otra parte, cuando las concentraciones de los aditivos eran de 2 ppm, no se observo inhibicion del crecimiento en absoluto en todos los aditivos. La cumaramida y la ferulamida fueron superiores al acido cumarico en la inhibicion del crecimiento, esta tendencia se observo que era particularmente importante en la tasa de consumo de glucosa. Especificamente, se descubrio que la cumaramida y la ferulamida eran inhibidores de la fermentacion en el cultivo de Pichia stipitis.
<Ejemplo 3: Prueba de crecimiento de la solucion de azucar concentrada a traves de la membrana de nanofiltracion>
Una solucion de azucar concentrada de la solucion de azucar tratada con amoniaco a traves de la membrana de nanofiltracion (en lo sucesivo denominada solucion concentrada por NF 1) se ajusto mediante el procedimiento descrito en “5. Condensacion de sacarido a traves de una membrana de nanofiltracion) en el ejemplo 1. En la solucion concentrada por NF 1, se mezclo agua en una cantidad igual a la cantidad de la solucion concentrada por NF 1 y se realizo la filtracion a traves de una membrana de nanofiltracion de nuevo en las condiciones descritas en "5. Condensacion de sacarido a traves de una membrana de nanofiltracion" en el ejemplo 1, para obtener una solucion concentrada por NF 2. A la solucion concentrada por NF 2 se anadio agua en una cantidad igual a la cantidad de la solucion concentrada por NF 2 y se realizo la filtracion a traves de la membrana de nanofiltracion de nuevo en las condiciones descritas en "5. Condensacion de sacarido a traves de una membrana de nanofiltracion" del ejemplo 1, para obtener una solucion concentrada por NF 3. En la tabla 5 se muestra la concentracion de cada componente de las soluciones concentradas de NF 1 a 3 y la solucion de azucar concentrada obtenida a traves de una membrana de osmosis inversa (en lo sucesivo, solucion concentrada por OI) mediante el procedimiento descrito en el ejemplo comparativo 1.
Se realizo una prueba de crecimiento utilizando cada solucion de azucar mediante un procedimiento descrito en "B. Prueba de crecimiento de Pichia stipitis utilizando una solucion concentrada de solucion de azucar tratada con amoniaco”, descrita mas adelante. Los resultados de la prueba se muestran en la tabla 5. En los resultados de la prueba de crecimiento, los casos en los que la absorbancia (DO660) 48 horas despues del inicio del cultivo es del 50% al 100%, del 10% al 50% y menos del 10% con respecto al control positivo estan representados por ++, +, y -, respectivamente. La absorbancia (DO660) del control positivo despues de 48 horas fue de aproximadamente 15.
(B. Prueba de crecimiento de Pichia stipitis usando una solucion concentrada de azucar tratada con amoniaco)
En una prueba de crecimiento utilizando la solucion concentrada de la solucion de azucar tratada con amoniaco, se realizo el cultivo de la misma manera que en “A. Prueba de crecimiento de Pichia stipitis usando una solucion modelo de azucar”, a excepcion de que se utilizo un medio en el que se anadieron polipeptona y un extracto de levadura a la solucion concentrada de la solucion de azucar tratada con amoniaco para que las concentraciones de la misma fueran iguales a las del medio YPDX descrito en la tabla 3 como medio para un cultivo principal. El control positivo se cultivo de la misma manera que en “A. Prueba de crecimiento de Pichia stipitis utilizando una solucion concentrada de azucar.”
(Tabla 5)
Glucosa (g/l) Xilosa (g/l) Acido cumarico (g/l) Cumaramida (g/l) Ferulamida (g/l) (a) + (b) (ppm) Crecimiento de microorganismo
Solucion concentrada por NF 1
99,6 53,9 0,079 0,622 0,454 1076 +
Solucion concentrada por NF 2
98,3 51,5 0,053 0,436 0,345 781 +
Solucion concentrada por NF 3
97,7 50,2 0,032 0,213 0,217 430 ++
Solucion concentrada por OI (ejemplo comparativo)
102,9 59,5 0,160 2,050 0,809 2859 -
Como se desprende claramente de la tabla 5, cada vez que se repitio la adicion de agua a la solucion concentrada por NF y la nanofiltracion, las concentraciones de acido cumarico, cumaramida y ferulamida disminuyeron. Por otro lado, cuando se realizo la filtracion a traves de la membrana de osmosis inversa, estas sustancias se concentraron marcadamente. A partir de los resultados de la prueba de crecimiento, cuando la concentracion total de cumaramida y ferulamida en la solucion de azucar es de 1.100 ppm o menos, el crecimiento es posible. A partir de los resultados, se confirmo que la eliminacion de cumaramida y ferulamida requeria un tratamiento con una membrana de nanofiltracion, pero no con membrana de osmosis inversa. Como puede verse a partir de los resultados y del ejemplo 2, cuando se realizo la purificacion en la nanofiltracion, de manera que la concentracion total de cumaramida y ferulamida era de 1.100 ppm o menos, era posible un crecimiento eficaz de un microorganismo.
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<Ejemplo: 4 Prueba de produccion de etanol utilizando una solucion de azucar tratada con amoniaco>
Se produjo etanol utilizando la solucion de azucar concentrada (solucion concentrada por NF) obtenida de la solucion de azucar tratada con amoniaco a traves de la membrana de nanofiltracion y la solucion de azucar concentrada (solucion concentrada por OI) obtenida usando la membrana de osmosis inversa mediante el procedimiento descrito en el ejemplo comparativo 1 de acuerdo con "C. Prueba de produccion de etanol de Pichia stipitis usando una solucion de azucar tratada con amoniaco", descrita a continuacion. Las propiedades de fermentacion de los mismos se compararon entre si.
<C. Prueba de produccion de etanol de Pichia stipitis utilizando una solucion de azucar tratada con amoniaco>
La prueba de produccion de etanol a partir de la solucion de azucar tratada con amoniaco se realizo de acuerdo con un procedimiento de fermentacion en dos etapas descrito en la solicitud de patente japonesa abierta a inspeccion publica no. 2009-296983. Se cultivo Saccharomyces cerevisiae utilizando una solucion concentrada de la solucion de azucar tratada con amoniaco para convertir glucosa en etanol como fermentacion primaria. En este caso, se confirmo que, incluso cuando se utilizo cualquiera de entre la solucion concentrada por NF y la solucion concentrada por OI, no se inhibio la fermentacion.
Posteriormente, se cultivo Pichia stipitis utilizando una solucion de fermentacion primaria cuya concentracion de etanol se ajusto a 10 g/l con un evaporador rotatorio para convertir la xilosa de la solucion de fermentacion primaria en etanol como fermentacion secundaria. En la fermentacion secundaria, la relacion entre el tiempo de fermentacion y la concentracion de etanol de la solucion de fermentacion primaria derivada de la solucion concentrada por NF y la solucion de fermentacion primaria derivada de la solucion concentrada por OI se muestra en la figura 7, y la relacion entre el tiempo de fermentacion y la concentracion de xilosa de la solucion de fermentacion primaria derivada de la solucion concentrada por NF y la solucion de fermentacion primaria derivada de la solucion concentrada por OI se muestra en la figura 8. Como se muestra en las figuras 7 and 8, la produccion de etanol por la solucion de fermentacion primaria derivada de la solucion concentrada por OI fue inhibida en gran medida en la fermentacion secundaria por Pichia stipitis. La tasa de consumo de xilosa, la tasa de produccion de etanol y la concentracion final de produccion de etanol disminuyeron en comparacion con la produccion de etanol por la solucion de fermentacion primaria derivada de la solucion concentrada por NF. Por lo tanto, era evidente que un inhibidor de la fermentacion alcoholica se habia concentrado significativamente mediante la concentracion a traves de la membrana de osmosis inversa en comparacion con la concentracion a traves de la membrana de nanofiltracion.
<Ejemplo 5: Verificacion de la inhibicion de la produccion de etanol mediante la solucion de permeacion despues de la filtracion con membrana>
Se produjo etanol utilizando un filtrado (solucion de permeacion) obtenido durante la produccion de la solucion
concentrada por NF y la solucion concentrada por OI. Las soluciones de permeacion derivadas de la solucion
concentrada por NF y la solucion concentrada por OI se denominan solucion de permeacion por NF y solucion de permeacion por OI, respectivamente. Cada solucion de permeacion se concentro 3 veces con un evaporador rotatorio. A la solucion de permeacion concentrada se anadieron un extracto de levadura, polipeptona y xilosa, de manera que las concentraciones finales fueron del 0,5%, 1,0% y 7,0%, respectivamente. Al medio liquido preparado se anadio Pichia stipitis para producir etanol. Como control, se utilizo un medio liquido en el que un extracto de levadura, polipeptona y xilosa se anadieron al agua, de manera que la composicion era la misma que se ha descrito anteriormente, y se llevo a cabo la misma verificacion.
La figura 9 muestra la relacion entre el tiempo de fermentacion y la concentracion de etanol de la solucion
concentrada por NF y la solucion concentrada por OI. La figura 10 muestra la relacion entre el tiempo de
fermentacion y la concentracion de xilosa de la solucion concentrada por NF y la solucion concentrada por OI. Como se muestra en las figuras 9 y 10, el consumo de xilosa y la produccion de etanol, que eran los mismos que los del control, se realizaron en un medio que contenia la solucion de permeacion por OI. En un medio que contenia la solucion de permeacion por NF, la tasa de consumo de xilosa disminuyo hasta aproximadamente el 75% de la del control, y la tasa de produccion de etanol disminuyo hasta aproximadamente el 60%. Como es evidente a partir de los resultados, un inhibidor de la produccion de etanol penetro en la membrana de nanofiltracion en un tratamiento de concentracion de la solucion de azucar tratada con amoniaco a traves de la membrana de nanofiltracion y se acumulo en el filtrado. Por lo tanto, el inhibidor de la produccion de etanol puede eliminarse mediante el tratamiento de concentracion a traves de la membrana de nanofiltracion.
<Ejemplo 6: Concentracion de celulosa tratada con amoniaco durante la sacarificacion>
A 0,4 kg de celulosa tratada con amoniaco descrita en “2. Tratamiento de la biomasa celulosica con amoniaco”, del ejemplo 1, se anadio agua segun la cantidad a anadir durante la preparacion descrita en la tabla 6 para ajustar la concentracion de celulosa tratada con amoniaco al 5, 10, 15 y 20%. A la resultante se anadio una pequena cantidad de acido sulfurico concentrado para ajustar el pH a 5 y, despues, se anadio una preparacion de celulasa (Accellerase DUET, disponible a traves de la firma Genencor) en una cantidad de 1/100 de la cantidad de celulosa seca tratada con amoniaco en terminos de la cantidad de proteina enzimatica. Se llevo a cabo una reaccion de
5
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25
sacarificacion enzimatica a 50°C durante 24 horas. El hidrolizado resultante se centrifugo y se separo en un componente de la solucion, asi como una celulosa y una lignina no descompuestas. El componente de la solucion se sometio a filtracion a traves de una membrana de microfiltracion que tenia un diametro de microporos de 0,45 pm (Stericup, disponible a traves de la firma Millipore Corporation) para eliminar las particulas insolubles en escala micrometrica. El componente de la solucion obtenido mediante el procedimiento se sometio a un tratamiento de membrana de nanofiltracion de acuerdo con “5. Condensacion de sacarido a traves de una membrana de nanofiltracion" del ejemplo 1, para obtener una solucion concentrada por NF. La relacion de concentracion se ajusto de manera que la concentracion de glucosa en la solucion concentrada era de aproximadamente el 10%. La concentracion de cada componente de la solucion concentrada se muestra en la tabla 7.
(Tabla 6)
Concentracion de celulosa tratada con amoniaco (% en masa) durante la sacarificacion enzimatica
Cantidad de agua anadida durante la preparacion (kg)
5
7,6
10
3,6
15
2,6
20
1,6
(Tabla 7)
Concentracion de celulosa tratada con amoniaco (% en masa) durante la sacarificacion enzimatica
Concentracion en la solucion concentrada por NF (g/l)
Glucosa
Xilosa Cumaramida (a) Ferulamida (b) (a) + (b) (ppm)
5
99,6 53,9 0,62 0,45 1.070
10
101,2 53,4 0,61 0,47 1.080
15
100,4 52,2 0,72 0,53 1.250
20
102,3 52,8 0,80 0,59 1.390
Como se desprende claramente de la tabla 7, cuando la concentracion de celulosa tratada con amoniaco durante la sacarificacion enzimatica fue del 5% y del 10%, la concentracion total de cumaramida y ferulamida en la solucion concentrada por NF fue de 1.100 ppm o menos. Cuando la concentracion de celulosa tratada con amoniaco durante la sacarificacion enzimatica fue del 15% y del 20%, las concentraciones totales de cumaramida y ferulamida aumentaron marcadamente y fueron de 1.250 ppm y 1.390 ppm, respectivamente. Como puede verse a partir de los resultados y en el ejemplo 5, cuando la concentracion total de cumaramida y ferulamida en la solucion de azucar es de 1.100 ppm o menos, un microorganismo es viable y el microorganismo puede producir etanol de forma eficiente. Por lo tanto, es preferente que la concentracion de celulosa tratada con amoniaco durante la sacarificacion enzimatica sea del 10% o menos.

Claims (5)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento para producir una solucion de azucar, que comprende:
    5 una etapa de pretratamiento, que consiste en tratar la biomasa celulosica con un agente de tratamiento que contiene amoniaco para obtener un producto tratado con amoniaco;
    una etapa de preparacion de una solucion de azucar tratada con amoniaco, que consiste en sacarificar enzimaticamente el producto tratado con amoniaco para obtener una solucion de azucar tratada con amoniaco; y una etapa de preparacion de una solucion de azucar purificada para eliminar la cumaramida y/o la ferulamida en la 10 solucion de azucar tratada con amoniaco mediante purificacion y determinar la concentracion de cumaramida y/o ferulamida para obtener una solucion de azucar purificada que tiene una concentracion de cumaramida y/o ferulamida de 10 a 1.100 ppm.
  2. 2. Procedimiento para producir una solucion de azucar, segun la reivindicacion 1, en el que la biomasa celulosica 15 contiene biomasa herbacea.
  3. 3. Procedimiento para producir una solucion de azucar, segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que se usa una membrana de nanofiltracion en un tratamiento de purificacion de la solucion de azucar tratada con amoniaco.
    20
  4. 4. Procedimiento para producir una solucion de azucar, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el producto tratado con amoniaco se sacarifica enzimaticamente con una solucion que tiene una concentracion de una materia solida del producto tratado con amoniaco en un intervalo del 1 al 10% en masa durante la sacarificacion enzimatica del producto tratado con amoniaco.
    25
  5. 5. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende ademas la utilizacion de la solucion de azucar obtenida como materia prima de la fermentacion para producir etanol.
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