ES2611103T3 - Composiciones y métodos para producir emulsiones para técnicas de resonancia magnética nuclear y otras aplicaciones - Google Patents

Abstract

Una composición acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 éter u óxido de PFPE, un emulsionante, una comezcla de tensioactivo y un aditivo, en la que el emulsionante comprende ricinoleato de glicerol polietilenglicol.

Description

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DESCRIPCION

Composiciones y metodos para producir emulsiones para tecnicas de resonancia magnetica nuclear y otras aplicaciones

Antecedentes

Muchos procesos biologicos se realizan por poblaciones de celulas. Por ejemplo, las celulas del sistema inmunitario se reclutan desde el torrente sangumeo a areas de inflamacion o infeccion, produciendose una acumulacion de celulas inmunitarias en el sitio afectado. Con frecuencia se produce una marcada infiltracion de celulas inmunitarias en tejidos afectados por enfermedades autoinmunitarias, canceres e infecciones. De forma similar, el rechazo de trasplantes esta mediado por celulas inmunitarias del hospedador que entran y destruyen el tejido trasplantado. Tambien hay cada vez mas indicios de que celulas madre que se originan en la medula osea migran a traves del torrente sangumeo y ayudan a la regeneracion de tejidos danados.

Ademas, el area mas prometedora aparentemente de la terapia biologica implica el campo emergente de la terapia celular. La terapia celular se define, en sentido amplio, como el tratamiento de enfermedades humanas mediante la administracion de celulas terapeuticas que se han seleccionado, multiplicado y tratado farmacologicamente fuera del cuerpo, o ex vivo. Estas celulas pueden proceder del paciente (celulas autologas), de otro ser humano (celulas alogenicas), de otros organismos (celulas xenogenicas), o de lmeas celulares inmortalizadas.

Las celulas representan el sistema terapeutico fundamental debido a su capacidad de realizar funciones complejas y su capacidad de respuesta a cambios en el tejido circundante o en el organismo hospedador. En el modo mas sencillo de terapia celular, las celulas pueden aislarse, cultivarse en cantidad ex vivo, e implantarse en pacientes para producir y secretar factores solubles que directamente se dirigen al mecanismo de la enfermedad. Las celulas tambien pueden realizar tareas tan complejas como la reconstitucion de tejidos, organos o respuestas inmunitarias basandose en su capacidad de alojarse en sitios espedficos dentro del cuerpo, salir de la circulacion e integrarse en tejidos espedficos o diferenciarse en nuevos tejidos. Otros agentes terapeuticos celulares pueden programarse para la destruccion de tumores o el tratamiento de metastasis (por ejemplo, agentes inmunoterapeuticos).

Aunque las poblaciones de celulas dinamicas juegan un papel clave en enfermedades significativas, las presentes tecnologfas para monitorizar la localizacion y el movimiento de las celulas in vivo son bastante limitadas. Tfpicamente, los movimientos de las celulas se observan unicamente en “instantaneas” obtenidas por analisis histologico de biopsias de tejidos. Sin embargo, el proceso de muestreo de un tejido con frecuencia altera el comportamiento de las celulas, y solo puede obtenerse un numero limitado de biopsias a partir de un tejido u organo particular. Se han hecho algunos progresos estudiando los movimientos de celulas mediante ensayos in vitro y tejidos aislados ex vivo. Los instrumentos existentes para el analisis no invasivo de organismos vivos, en el momento actual, son poco adecuados para el rastreo de celulas vivas. Las tecnologfas de obtencion de imagenes basadas en luz, tales como bioluminiscencia (por ejemplo, luciferasas), con frecuencia son ineficaces para visualizar estructuras profundas porque la mayona de los tejidos de los mairnferos son opticamente opacos. Las tecnicas de tomograffa de emision de positrones (PET) que usan sondas marcadas radiactivamente son muy sensibles. Sin embargo, la instrumentacion PET con frecuencia esta limitada a una resolucion de varios milfmetros y no puede resolver detalles finos de tejidos y organos. Ademas, las celulas marcadas no pueden detectarse durante periodos de tiempo que se extienden mas alla de la semivida tfpica de los radioisotopos PET y, generalmente, la pEt no es util para estudios longitudinales. Para conseguir una comprension fundamental de procesos celulares, tienen que desarrollarse nuevas formas de visualizar y cuantificar la dinamica de la poblacion de tipos celulares espedficos in vivo.

La formacion de imagenes por resonancia magnetica (IRM) es una herramienta de diagnostico clmico usada de forma generalizada porque no es invasiva, permite visualizar objetos opticamente opacos y proporciona contraste entre tejidos blandos con una resolucion espacial razonablemente alta. La IRM convencional se centra casi exclusivamente en la visualizacion de la anatomfa y no tiene especificidad por ningun tipo celular particular. La “sonda” usada por IRM convencional es el proton ubicuo (1H) en las moleculas de agua moviles. Se necesitan nuevas clases de sondas o reactivos de IRM exogenas para facilitar la obtencion de imagenes espedficas de celulas en sujetos vivos.

Sumario

La presente invencion se define por las reivindicaciones adjuntas. En ciertos aspectos, la solicitud desvela una composicion acuosa como se caracteriza en las reivindicaciones adjuntas, comprendiendo dicha composicion acuosa perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE, un emulsionante, una co-mezcla de tensioactivo y un aditivo, donde el emulsionante comprende ricinoleato de glicerol polietilenglicol. En deltas realizaciones, la co-mezcla de tensioactivo comprende un 70 % en moles de lecitina, un 28 % en moles de colesterol y un 2 % en moles de DPPE. En ciertas realizaciones, el aditivo es propilenglicol. En ciertas realizaciones, la composicion comprende perfluoro- 15-corona-5 eter u oxido de PFPE en el intervalo del 20% al 50% p/v. En ciertas realizaciones, la composicion comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE en el intervalo del 25% al 35% p/v. En ciertas

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realizaciones, la composicion comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE en el intervalo del 30% al 40% p/v. En ciertas realizaciones, la composicion comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE en el intervalo del 35% al 36% p/v. En ciertas realizaciones, la composicion comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE en un 35,6 % p/v.

En ciertas realizaciones, la composicion comprende el emulsionante en el intervalo del 1 % al 10 % p/v. En ciertas realizaciones, la composicion comprende el emulsionante en el intervalo del 1 % al 5 % p/v. En ciertas realizaciones, la composicion comprende el emulsionante en un 3 % p/v.

En ciertas realizaciones, la composicion comprende propilenglicol en el intervalo del 1 % al 10% p/v. En ciertas realizaciones, la composicion comprende propilenglicol en el intervalo del 1 % al 5 % p/v. En ciertas realizaciones, la composicion comprende propilenglicol en un 2 % p/v. En ciertas realizaciones, la composicion comprende la co- mezcla de tensioactivo que comprende lecitina, colesterol y DPPE en el intervalo del 1 % al 10% p/v. En ciertas realizaciones, la composicion comprende la co-mezcla de tensioactivo que comprende lecitina, colesterol y DPPE en el intervalo del 1 % al 5 % p/v. En ciertas realizaciones, la composicion comprende la co-mezcla de tensioactivo que comprende lecitina, colesterol y DPPE en un 2 % p/v.

En ciertos aspectos, la solicitud desvela una composicion acuosa como se caracteriza en las reivindicaciones adjuntas, comprendiendo dicha composicion acuosa perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE en un 35,6 % p/v, un emulsionante en un 3,0 % p/v, una co-mezcla de tensioactivo en un 2,0 % p/v, donde la co-mezcla de tensioactivo comprende lecitina, colesterol y DPPE, y un aditivo en un 2,0 % p/v, donde el aditivo es propilenglicol y donde el emulsionante comprende ricinoleato de glicerol polietilenglicol.

Tambien se describe en el presente documento una composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE y un copoifmero de bloque, donde la composicion comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE en el intervalo del 10% al 20% p/p, y donde la composicion comprende el copolfmero de bloque en el intervalo del 0,1 % al 2,0 % p/p. Tambien se describe en el presente documento que el copolfmero de bloque puede ser un copolfmero tri-bloque que comprende poli(oxido de etileno) y poli(oxido de propileno). Ademas, en el presente documento se describe que el copolfmero de bloque puede ser un copolfmero tri-bloque de poli(oxido de etileno)- poli(oxido de propileno)-poli(oxido de etileno) (PEO-PPO-PEO) que comprende un contenido de PEO del 80 %.

Ademas, en el presente documento se describe que la composicion puede comprender perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE en el intervalo del 12% al 17% p/p o en un 15% p/p. Ademas, en el presente documento se describe que la composicion puede comprender el copolfmero de bloque en el intervalo del 0,1 % al 1,0 % p/p o en un 0,6 % p/p.

En el presente documento tambien se describe una composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE en un 15 % p/p y un copolfmero de bloque en un 0,6 % p/p. Tambien se describe en el presente documento que el copolfmero de bloque puede ser un copolfmero tri-bloque que comprende poli(oxido de etileno) y poli(oxido de propileno). Ademas, en el presente documento se describe que el copolfmero de bloque puede ser un copolfmero tri-bloque de poli(oxido de etileno)-poli(oxido de propileno)-poli(oxido de etileno) (PEO-PPO-PEO) que comprende un contenido de PEO del 80 %.

Tambien se describe en el presente documento que la composicion puede comprender ademas sulfato de protamina en el intervalo del 0,01 % al 1,0 % p/p, en el intervalo del 0,01 % al 0,5 % p/p, en el intervalo del 0,01 % al 0,1 % p/p o en un 0,04 % p/p.

En ciertos aspectos, la solicitud desvela una emulsion que comprende una composicion de una cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento. En ciertas realizaciones, la emulsion tiene un tamano medio de gotas menor de 200 nm de diametro. En ciertas realizaciones, la emulsion es estable a temperaturas que vanan de 4 °C a 37 °C. En ciertas realizaciones, la emulsion tiene un mdice de polidispersidad que vana de 0,1 a 0,2.

En ciertos aspectos, la solicitud desvela un metodo para preparar una emulsion como se caracteriza en las reivindicaciones adjuntas, que comprende metodos de alta energfa. En ciertas realizaciones, el metodo de alta energfa es microfluidizacion. En ciertas realizaciones, el metodo de alta energfa es sonicacion.

En ciertos aspectos, la solicitud desvela un metodo para marcar una celula, comprendiendo el metodo poner en contacto la celula ex vivo con una emulsion como se caracteriza en las reivindicaciones adjuntas en condiciones tales que el reactivo de formacion de imagenes de fluorocarburo se asocia con la celula.

En ciertos aspectos, la solicitud desvela un metodo para detectar una celula en un sujeto, comprendiendo el metodo: a) administrar al sujeto una celula que esta marcada con una emulsion como se caracteriza en las reivindicaciones adjuntas; y b) examinar al menos una parte del sujeto por una tecnica de resonancia magnetica nuclear, detectandose de esta manera la celula marcada en el sujeto.

En el presente documento tambien se describe un metodo para detectar celulas trasplantadas en un receptor de un

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trasplante, comprendiendo el metodo: a) administrar celulas para trasplante a un receptor de un trasplante, estando al menos una parte dichas celulas para el trasplante marcadas con una emulsion de la solicitud; b) examinar al menos una parte del sujeto mediante una tecnica de resonancia magnetica nuclear, detectandose de esta manera las celulas marcadas.

En el presente documento tambien se describe un metodo para cuantificar el numero de celulas in vivo, comprendiendo el metodo: a) administrar al sujeto celulas que estan marcadas con una emulsion de la solicitud; b) examinar al menos una parte del sujeto mediante una tecnica de resonancia magnetica nuclear, detectandose de esta manera las celulas marcadas en el sujeto; y c) cuantificar el numero de celulas marcadas en una region de interes (ROI).

Ademas, en el presente documento tambien se describe un metodo para cuantificar el numero de leucocitos in vivo, comprendiendo el metodo: a) administrar al sujeto una emulsion de la solicitud; b) extraer una muestra de sangre periferica del sujeto y medir la carga celular eficaz de leucocitos; c) examinar al menos una parte del sujeto por una tecnica de resonancia magnetica nuclear, detectandose de esta manera las celulas marcadas en el sujeto; y d) cuantificar el numero de celulas marcadas en una region de interes (ROI). Tambien se describe en el presente documento que la poblacion de celulas puede separarse de la muestra antes de la medicion de la carga celular y la proporcion de dichas celulas se usa para cuantificar el numero de celulas marcadas en esa poblacion en una ROI.

Tambien se describe en el presente documento un metodo para marcar una celula, comprendiendo el metodo poner en contacto la celula in vivo con una emulsion de la solicitud en tales condiciones que el reactivo de formacion de imagenes de fluorocarburo se asocia con la celula.

Ademas, en el presente documento se describe un metodo para detectar una celula en un sujeto, comprendiendo el metodo: a) administrar al sujeto una emulsion de la solicitud; y b) examinar al menos una parte del sujeto por una tecnica de resonancia magnetica nuclear, detectandose de esta manera la celula marcada en el sujeto.

En ciertos aspectos, la solicitud desvela un metodo para medir la presion parcial de oxfgeno en un tejido, comprendiendo el metodo poner en contacto el tejido in vivo con una emulsion como se caracteriza en las reivindicaciones adjuntas en tales condiciones que el reactivo de formacion de imagenes de fluorocarburo se asocia con el tejido.

En ciertos aspectos, la solicitud desvela una emulsion como se caracteriza en las reivindicaciones adjuntas para uso en un metodo para detectar una permeabilidad vascular elevada en un tejido, donde el tejido se va a poner en contacto in vivo con la emulsion en condiciones tales que el reactivo de formacion de imagenes de fluorocarburo se asocia con el tejido.

En ciertos aspectos, la solicitud desvela una formulacion celular marcada para la administracion a un sujeto, comprendiendo la formulacion: a) una celula; y b) una emulsion como se caracteriza en las reivindicaciones adjuntas que esta asociada con la celula.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 muestra datos recogidos para la Emulsion 3, que contiene perfluoro-15-corona 5 eter y emulsionado con Cremophor EL. A) Se midio la dispersion de luz dinamica (DLS) para mostrar la distribucion del tamano de gotas de la emulsion. B) Se evaluo la estabilidad a largo plazo (6 meses) a una temperatura de almacenamiento convencional de 5 °C. Estos datos muestran el diametro medio medido y la polidispersidad (ambos en unidades de nm) a lo largo del tiempo. C) La estabilidad en suero de la emulsion se evaluo midiendo el diametro y la polidispersidad en presencia de suero por DLS. Los datos son la media de n=3 mediciones independientes y se presentan como la media ± desviacion tfpica (DT).

La Figura 2 muestra datos recogidos del marcaje de la nanoemulsion 3 con colorante fluorescente. A) Se midio la dependencia de la intensidad de la fluorescencia de la concentracion de colorante tanto en agua como unido a la emulsion. B) Se obtuvo el espectro de emision de fluorescencia de Dil en agua y unido a la emulsion.

La Figura 3 muestra una comparacion del tamano de gotas de la nanoemulsion 3 marcada con colorante fluorescente Dil (lmea de trazos) y no marcada (lmea continua).

La Figura 4 muestra la citotoxicidad de la nanoemulsion 3 y la captacion en celulas RAW. A) Se expusieron celulas a diferentes dosis de nanoemulsion 3 durante 3 y 24 h, y se evaluo la viabilidad celular mediante recuento celular. B) Se midio la captacion en celulas RAW sedimentadas por RMN F Despues de una exposicion de 18 h. Los datos representan la media de n=3 sedimentos celulares, y las barras de error son ± DT.

La Figura 5 muestra un espectro representativo de RMN 19F de las celulas RAW marcadas con la formulacion 3. Como patron interno se uso acido trifluoroacetico con un desplazamiento qmmico a -76,00 ppm, mientras que las celulas marcadas se muestran a -92,90 ppm.

La Figura 6 muestra la produccion de citocinas en celulas RAW marcadas con la formulacion 3. Se cultivaron celulas RAW marcadas con formulacion 3 (1x106 celulas/ml) y se expusieron a 250 ng/ml de LPS. Se recogieron los sobrenadantes de cultivo despues de 24 horas y se ensayaron con respecto a la presencia de IL-6 y TNF-alfa. Las mediciones de citocinas se determinaron por ELISA. Los datos son la media de dos experimentos independientes y

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se muestran como media ± DT.

La Figura 7 muestra el tamano medio de gotas de la nanoemulsion 5 el dfa 1 y el dfa 342 despues de la formulacion (lmea continua y de trazos, respectivamente). Los datos demuestran la estabilidad a largo plazo, el pequeno tamano de partfculas y la estrecha distribucion de partfculas de la nanoemulsion 5.

La Figura 8 muestra el tiempo de eliminacion en sangre de las formulaciones 3 y 5 inyectadas por via intravenosa en raton. Las dos formulaciones tienen una semivida en sangre comparable. Se midieron los datos promediados usando RMN 19F de muestras de sangre seriadas tomadas en puntos de tiempo discretos despues de la inyeccion a partir de una cohorte de animales (n=5)

La Figura 9 muestra datos tfpicos de IRM 19F/1H in vivo en un modelo de inflamacion usando la nanoemulsion 3. Los datos de 19F (pseudocolor) muestran una acumulacion altamente localizada de celulas inflamatorias que rodean una esponja implantada quirurgicamente empapada en adyuvante Completo de Freund antes de la implantacion. La imagen de 1H (escala de grises) proporciona el fondo anatomico en este raton anestesiado.

La Figura 10 muestra la cuantificacion del perfil de inflamacion debajo de la medula espinal de una rata con encefalomielitis alergica experimental (EAE). A los animales que mostraban signos clmicos de EAE (estadio 2) se les administro una inyeccion intravenosa de nanoemulsion 3 y, 48 horas despues, la rata se sacrifico y se ensayo la inflamacion usando un espectro de RMN 19F de alta resolucion de segmentos fijos intactos de la medula espinal.

Descripcion detallada

1. Vision general

En ciertos aspectos, la divulgacion proporciona nuevos metodos y reactivos caracterizados en las reivindicaciones adjuntas para marcar celulas ex vivo con un reactivo de formacion de imagenes de resonancia magnetica nuclear, tal como un reactivo de formacion de imagenes de fluorocarburo, y cuantificar las celulas marcadas in vivo o ex vivo. Las celulas marcadas pueden detectarse por una tecnica de resonancia magnetica nuclear de 19F (por ejemplo, IRM/SRM) y cuantificarse de acuerdo con los metodos descritos en el presente documento. Las tecnicas de resonancia magnetica nuclear de 19F son excelentes herramientas de formacion de imagenes para sistemas biologicos debido a la ausencia de senales endogenas de fondo. El fluor esta presente, si lo esta, a niveles extremadamente bajos en los organismos vivos, y generalmente no esta en una forma qmmica que sea detectable por tecnicas de resonancia magnetica nuclear en estado lfquido. Esto es bastante distinto de lo que ocurre en la IRM de 1H convencional que, aunque proporciona la visualizacion de detalles anatomicos finos, no permite la deteccion selectiva de poblaciones celulares particulares. Ciertos metodos desvelados en el presente documento permiten la exploracion total o parcial del cuerpo para visualizar la distribucion de celulas marcadas en un sujeto vivo. La localizacion anatomica precisa de las celulas marcadas detectadas por resonancia magnetica nuclear de 19F puede determinarse, por ejemplo, por superposicion de una imagen de IRM de 1H que proporcione detalles anatomicos. En realizaciones preferidas, la imagen de 1H se adquiere durante la misma sesion de imagenes que la imagen de 19F (sin mover el objeto) para asegurar el registro. Ademas, las tecnicas de resonancia magnetica nuclear desveladas en el presente documento pueden aplicarse eficazmente en contextos ex vivo, como ocurre en las muestras de tejido, organos escindidos y cultivos celulares. La tecnologfa de formacion de imagenes desvelada en el presente documento puede aplicarse a un gran numero de problemas biologicos y medicos.

En ciertos aspectos, un metodo de la invencion puede comprender marcar celulas ex vivo con un reactivo de formacion de imagenes de 19F, administrar las celulas marcadas a un sujeto y detectar las celulas marcadas en el sujeto. Las celulas a marcar pueden ser una fraccion celular o muestra de tejido en bruto, o las celulas pueden cultivarse y/o someterse a enriquecimiento antes de marcarse. Por ejemplo, pueden seleccionarse tipos celulares particulares por clasificacion de celulas activada por fluorescencia (FACS) antes del marcaje. En la tecnica se conocen otros metodos de clasificacion o enriquecimiento selectivo para los diversos tipos celulares diferentes que pueden ser de interes. Los tipos de celulas que estan marcadas tambien pueden controlarse por la naturaleza del reactivo de formacion de imagenes. Por ejemplo, las suspensiones coloidales sencillas del reactivo de formacion de imagenes tenderan a captarse mas rapidamente por celulas con actividad fagocftica. Como otro ejemplo, un reactivo de formacion de imagenes puede formularse con o unirse covalentemente a un resto de direccion que facilite la direccion selectiva del reactivo de formacion de imagenes a una poblacion particular de celulas. Mas adelante se describen adicionalmente reactivos de formacion de imagenes. Despues del marcaje, las celulas pueden administrarse inmediatamente o las celulas pueden almacenarse, cultivarse adicionalmente, purificarse, enriquecerse, segregarse o procesarse de cualquier forma que no sea incompatible con el uso deseado de dichas celulas.

En el presente documento tambien se describe que las celulas marcadas pueden administrarse para un fin terapeutico. La tecnologfa descrita en el presente documento puede usarse para supervisar el trafico de agentes terapeuticos celulares in vivo o en cualquier otro medio deseado, tal como un explante de tejido. Durante muchos anos se han usado trasplantes de celulas de medula osea en receptores de terapias ablativas para canceres. Tambien se han usado diversas poblaciones de celulas purificadas en lugar de medula osea, tales como poblaciones celulares enriquecidas en celulas madre hematopoyeticas; por ejemplo, pueden recogerse celulas de sangre de cordon umbilical o sangre periferica. Despues de entrar en el torrente sangumeo, las celulas madre generalmente se desplazan hasta la medula osea, donde empiezan a producir nuevos globulos blancos, globulos rojos y plaquetas. Este injerto normalmente se produce en un periodo de aproximadamente 2 a 4 semanas despues

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del trasplante. Tradicionalmente, el injerto se supervisa mediante ensayos frecuentes de recuento de sangre, y la recuperacion completa de la funcion inmunitaria generalmente requiere varios meses (para receptores de trasplantes autologos) a anos (para pacientes que reciben trasplantes alogenicos o singenicos). El muestreo de celulas por aspiracion de la medula osea puede proporcionar una informacion adicional sobre la funcion de las celulas trasplantadas. Estas tecnicas de supervision pueden mejorarse por el marcaje ex vivo de las celulas a trasplantar (o alguna pequena fraccion de dichas celulas), permitiendo de esta manera una supervision no invasiva de la localizacion y movimiento de las celulas trasplantadas por tecnicas de resonancia magnetica nuclear. El trasplante alogenico no mieloablativo (es decir, el trasplante de intensidad reducida) es una terapia celular similar que puede ser eficaz para tratar varios tipos de cancer. En general, esta tecnica se basa en una menor dosis de radiacion y/o agente quimioterapeutico y una enfermedad de injerto frente a hospedador limitada (la accion de celulas inmunitarias del trasplante contra cualquier celula cancerosa del hospedador residual) para proporcionar una actividad anticancerosa suficiente, asf como el potencial hematopoyetico de las celulas del injerto de restaurar el sistema hematopoyetico del paciente. Como ocurre con un injerto ablativo tradicional, las tecnicas descritas en el presente documento pueden usarse para supervisar las localizaciones y movimientos de celulas de injerto en un trasplante alogenico no mieloablativo.

Tambien se estan desarrollando agentes terapeuticos celulares para uso en la liberacion de protemas terapeuticas. Tambien se describe en el presente documento que pueden aislarse celulas, cultivarse en cantidad ex vivo y despues implantarse para producir y secretar factores solubles, que pueden ser activos localmente (por ejemplo, enzimas, citocinas y neurotransmisores) o a una distancia (por ejemplo, hormonas y reguladores del crecimiento). Tambien pueden administrarse celulas a un paciente para realizar fines terapeuticos complejos, tales como la reconstitucion de tejidos, organos o respuestas inmunitarias basandose en su capacidad de alojarse en sitios espedficos dentro del cuerpo, salir de la circulacion e integrarse en tejidos circundantes o diferenciarse para reemplazar tejidos danados. Tambien se han propuesto terapias de celulas madre para una minada de enfermedades que incluyen trastornos neurologicos, particularmente los caracterizados por muerte celular (por ejemplo, enfermedad de Parkinson, ictus y lesion cerebral causada por traumatismo), trastornos cardiovasculares (por ejemplo, infarto de miocardio), regeneracion muscular (por ejemplo, en pacientes que padecen caquexia u otros trastornos debilitantes), regeneracion pancreatica en diabetes, regeneracion hepatica, etc. En cualquier caso, las celulas, o una subpoblacion de las mismas, pueden marcarse con un reactivo de formacion de imagenes ex vivo antes de la administracion, permitiendo de esta manera la supervision de estas celulas in vivo. La supervision in vivo por una tecnica de resonancia magnetica nuclear puede ser util, por ejemplo, para evaluar la viabilidad de las celulas administradas. Un medico puede adaptar un programa de dosificacion dependiendo del grado en el que se detectan celulas marcadas en un paciente despues de su administracion. La supervision in vivo tambien puede ser util para determinar si las celulas terapeuticas se han localizado en una localizacion deseada. En general, sera posible investigar correlaciones entre el comportamiento de migracion de celulas terapeuticas in vivo, asf como el numero y/o la supervivencia de celulas terapeuticas in vivo, y los resultados terapeuticos. Cuando se han establecido dichas correlaciones, la formacion de imagenes in vivo de las celulas terapeuticas puede usarse como indicador de pronostico que puede ser util para seleccionar la dosificacion, los modos de administracion y las intervenciones terapeuticas adicionales apropiadas que beneficiaran al paciente. Ciertos avances de formacion de imagenes descritos en el presente documento proporcionaran beneficio a una amplia serie de estrategias terapeuticas celulares, porque estas metodologfas de formacion de imagenes podran detectar cuando, donde y si las celulas terapeuticas se han liberado en las dianas deseadas in vivo. Ademas, la deteccion de las celulas marcadas puede mejorarse por la cuantificacion de celulas marcadas en un ROI, tal como un organo o tejido particular.

Un ejemplo de una aplicacion de tecnologfa desvelada en el presente documento es el rastreo de celulas dendnticas (CD). Se sabe que las CD son las celulas presentadoras de antfgeno mas eficaces y tienen la capacidad de estimular a las celulas T vfrgenes para iniciar una respuesta inmunitaria. Como las CD son los estimuladores mas potentes de la respuesta inmunitaria en el cuerpo, las CD representan una posible estrategia terapeutica para aumentar la “visibilidad” de tumores para el sistema inmunitario de un paciente. Las CD son el centro de las vacunas de tumores que se estan desarrollando. Se usan diversos metodos para exponer las celulas dendnticas a antfgenos tumorales ex vivo, despues de lo cual, las celulas dendnticas educadas se vuelven a infundir para estimular el desarrollo de la destruccion del tumor mediada por celulas T. En el documento WO2005072780 se presentan datos que aplican un metodo descrito en el presente documento al marcaje y rastreo de CD y otros tipos celulares.

Ademas de las CD, otros tipos celulares han demostrado ser prometedores para la inmunoterapia en cancer y otras enfermedades tales como diabetes, aunque su progreso se ha visto impedido por muchos factores, incluyendo la incapacidad de observar su movimiento despues del trasplante en animales y seres humanos. Las celulas asesinas naturales (NK, por sus siglas en ingles), cuando se recogen, se tratan ex vivo y se trasplantan, han demostrado la capacidad de destruir las celulas tumorales metastasicas. Otros tipos celulares tratados ex vivo y trasplantados para promover la inmunidad del cancer incluyen celulas asesinas activadas por linfocinas (LAK), linfocitos infiltrantes de tumores y monocitos activados asesinos. El trasplante de celulas T, que son globulos blancos que atacan a las celulas patogenas, ha demostrado ser prometedor contra una diversidad de canceres, incluyendo el cancer pancreatico, en el que se estan iniciando ensayos clmicos, y contra la esclerosis multiple y la infeccion por VIH.

Ademas, en el presente documento se describe que pueden administrarse celulas marcadas a un sujeto con fines no terapeuticos. Por ejemplo, las celulas pueden marcarse ex vivo, administrarse a un sujeto y despues detectarse, con

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la expectativa de que las celulas marcadas se comporten de forma similar a celulas parecidas no marcadas in vivo y, por lo tanto, puedan usarse para supervisar el comportamiento de poblaciones de celulas endogenas. La supervision puede usarse para rastrear movimientos de celulas, particularmente en el caso de celulas que se sabe que se mueven mucho, tales como las celulas del sistema inmunitario, muchos tipos de celulas madre y celulas presentes en la sangre. La supervision tambien puede usarse para el rastreo de la viabilidad o adherencia de celulas no moviles en el sitio del implante. Las celulas de muchos tejidos, tales como el musculo, hugado, pancreas, rinon, cerebro o piel tenderan a ser relativamente estacionarias, pero la desaparicion del marcador puede indicar una alta tasa de muerte, baja adherencia u otra informacion. Las tecnicas modernas de cultivo y clasificacion de celulas permiten el agrupamiento selectivo y el marcaje de practicamente cualquier poblacion celular deseada, incluyendo diversos tipos de celulas madre, tipos de celulas inmunitarias y otros tipos de celulas sangumeas. Por ejemplo, pueden usarse marcadores de la superficie celular para clasificar poblaciones mixtas de celulas para purificar una poblacion de interes. Como se describe en el documento WO2005072780 y en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos n.° 60/792003, tanto las celulas T como las celulas dendnticas pueden marcarse ex vivo y detectarse in vivo.

Como ejemplo, pueden usarse celulas inmunitarias marcadas como representantes detectables para los movimientos de las celulas inmunitarias en un paciente. Las celulas inmunitarias participan y son marcadores para una serie de trastornos inflamatorios y autoinmunitarios, asf como para canceres y para la formacion de placas ateroscleroticas. Como metodologfa general, en un paciente puede detectarse cualquier proceso que implique el reclutamiento de celulas inmunitarias mediante la administracion al paciente de celulas inmunitarias marcadas. La acumulacion de un marcador en un area particular proporciona una indicacion del grado de respuesta inmunitaria que se produce en esa parte del cuerpo. Tradicionalmente, estos tipos de estudios implican tecnicas histologicas que son incompatibles con sujetos vivos. Ciertos metodos de la divulgacion pueden facilitar el desarrollo de estrategias terapeuticas para el tratamiento de enfermedades humanas. La capacidad de rastrear poblaciones seleccionadas de celulas inmunitarias de forma no invasiva y sin el uso de radioisotopos puede impactar en muchas areas de la inmunologfa basica y clmica, tales como esclerosis multiple, diabetes, supervision del rechazo de trasplante de organos y cancer. Por ejemplo, los tumores con frecuencia estan altamente infiltrados por celulas inmunitarias. Pueden tomarse imagenes de las celulas marcadas en un sujeto para revelar la localizacion de un tumor, y en algunos casos puede ser util como una exploracion de deteccion no invasiva. La temprana deteccion de los canceres ha sido un problema cntico, ya que la mayona de los canceres en estadio temprano se tratan facilmente por cirugfa sin recurrir a agentes quimioterapeuticos debilitantes. De forma similar, el progreso de otras enfermedades inflamatorias puede supervisarse por el rastreo de la de la dinamica de celulas inmunitarias en el paciente. Tambien puede evaluarse la eficacia de la terapia inmunosupresora. En el caso de un receptor de trasplante de organos, el receptor podna recibir una dosis de celulas inmunitarias marcadas antes de recibir el trasplante. La supervision in vivo de la acumulacion de celulas inmunitarias en el trasplante entonces podna usarse como un signo de advertencia temprano de rechazo. En el caso de los trasplantes, los metodos desvelados en el presente documento son particularmente deseables debido a que la alternativa, las biopsias, como es bien conocido, aumentan el riesgo de rechazo de organos.

Como ejemplo adicional, las celulas para uso en un trasplante de celulas de medula osea, o un trasplante de celulas madre de sangre periferica, pueden marcarse ex vivo como se describe en el presente documento, administrarse y supervisarse in vivo mediante una tecnica de resonancia magnetica nuclear. Dicha supervision puede usarse para evaluar el injerto de celulas del donante en las cavidades oseas del receptor, asf como la supervivencia y el movimiento de las celulas marcadas en el receptor. Un medico puede usar informacion relacionada con el trafico de las celulas del donante en un receptor como una indicacion precoz del probable exito o fracaso del procedimiento. Este tipo de deteccion precoz permitira a los medicos adaptar el regimen terapeutico despues del trasplante de acuerdo con ello. Otro agente terapeutico celular para el cancer en el que puede aplicarse la tecnologfa de deteccion es el trasplante alogenico no mieloablativo o de intensidad reducida. Este procedimiento puede usarse con una infusion de linfocitos del donante para reforzar el efecto de injerto contra tumor que destruye las celulas cancerosas. En este caso, podna marcarse la poblacion entera, o una fraccion, de las celulas trasplantadas antes de la infusion. Despues podna usarse una tecnica de resonancia magnetica nuclear para determinar hacia donde se mueven las celulas en el cuerpo, lo cual puede ser indicativo de la eficacia del procedimiento. Como con frecuencia es deseable limitar la dosis de celulas alogenicas para minimizar el rechazo, el patron de trafico de celulas puede usarse para calibrar la dosis. En las terapias celulares para el cancer anteriores, puede ser deseable marcar selectivamente una o mas subpoblaciones de las celulas trasplantadas (por ejemplo, celulas T o celulas madre CD34+) que se cree que tienen eficacia terapeutica.

Como ejemplo adicional, las celulas implicadas en la formacion de un nuevo tejido, tal como en la angiogenesis, pueden marcarse, administrarse a un sujeto y detectarse para identificar puntos clave de formacion de tejido. Por ejemplo, pueden marcarse celulas del musculo liso y/o celulas precursoras endoteliales e introducirse en el torrente sangumeo. Es de esperar que dichas celulas se acumulen en sitios de actividad angiogenica. La actividad angiogenica puede asociarse con acontecimientos fisiologicos y patologicos tales como el ciclo menstrual, un embarazo precoz, la formacion de vasos colaterales en respuesta a bloqueos arteriales, el desarrollo de tumores y la curacion de heridas. De forma similar, pueden marcarse celulas implicadas en la curacion de heridas, tales como fibroblastos, y administrarse sistemicamente o en un sitio en el que se sospecha que existe una lesion para supervisar el comportamiento celular.

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Por ejemplo, puede proporcionarse un medicamento o dispositivo de liberacion que contenga agregados celulares del linaje de los cardiomiocitos o celulas derivadas de los mismos, marcados, para el tratamiento de un cuerpo humano o animal, incluyendo formulaciones para terapia cardiaca. Las celulas de linaje de los cardiomiocitos pueden administrarse a un paciente en un metodo para reconstituir o suplementar la actividad contractil y/o de marcapasos en el tejido cardfaco (vease la Solicitud de Patente de Estados Unidos n.° 20060040389, 20050112104, 20050244384).

Ademas, en el presente documento se describe que las celulas del linaje de los cardiomiocitos marcadas pueden usarse para regenerar o reparar el musculo cardfaco estriado que se ha danado por una enfermedad o por degeneracion. Las celulas del linaje de los cardiomiocitos marcadas se integran con el tejido sano del receptor reemplazando la funcion de las celulas muertas o danadas, regenerandose de esta manera el musculo cardfaco en su conjunto. El musculo cardfaco normalmente no tiene potencial reparador. Las celulas del linaje de los cardiomiocitos marcadas se usan, por ejemplo, en la regeneracion del musculo cardiaco para varias indicaciones principales: (i) implantes de corazon isquemico, (ii) terapia para pacientes con insuficiencia cardfaca congestiva, (iii) prevencion de enfermedades adicionales para pacientes sometidos a un injerto de bypass de arteria coronaria, (iv) regeneracion de tejidos conductores, (v) regeneracion del musculo liso de vasos y (vi) regeneracion de valvulas.

La administracion de las celulas puede dirigirse al corazon por una diversidad de procedimientos tales como la administracion localizada. Las celulas madre mesenquimaticas pueden proceder de un espectro de fuentes que incluyen, en orden de preferencia: autologas, alogenicas o xenogenicas. Tambien se describe en el presente documento la supervision del progreso de estas celulas in vivo.

Las celulas del linaje de los cardiomiocitos pueden ser celulas precursoras de cardiomiocitos o cardiomiocitos diferenciados. Los cardiomiocitos diferenciados incluyen uno o mas de cardiomiocitos primarios, cardiomiocitos nodales (marcapasos); cardiomiocitos de conduccion; y cardiomiocitos de trabajo (contractiles), que pueden ser de tipo auricular o ventricular. Ademas, en el presente documento se describe que las celulas pueden proceder de una muestra de musculo (u otra muestra) que contiene celulas progenitoras musculares tales como celulas satelite (vease la Solicitud de Patente de Estados Unidos n.° 20050244384). Tambien se describe en el presente documento que las celulas pueden ser celulas madre mesenquimaticas (MSC) (vease la Solicitud de Patente de Estados Unidos n.° 20050112104).

Un “precursor de cardiomiocitos” se define como una celula que es capaz (sin desdiferenciacion o reprogramacion) de producir una descendencia que incluye cardiomiocitos. Dichos precursores pueden expresar marcadores tfpicos del linaje, incluyendo, sin limitacion, troponina I cardiaca (cTnl), troponina T cardiaca (cTnT), cadena pesada de miosina sarcomerica (MHC), GATA4, Nkx2.5, N-cadherina, 1-adrenoceptor beta (1-AR beta), AnF, la familia MEF-2 de factores de transcripcion, creatina quinasa MB (CK-MB), mioglobina o factor natriuretico auricular (ANF).

En ciertos casos, puede ocurrir que las celulas estan tan asociadas con un sitio o estructura biologica de interes que las celulas marcadas pueden administrarse con el unico fin de ayudar a la visualizacion de dicha estructura. Como se ha mencionado anteriormente, las celulas inmunitarias de forma caractenstica se infiltran en los tumores. Por consiguiente, pueden administrarse celulas inmunitarias marcadas con el objetivo de visualizar tumores.

La tecnologfa desvelada en el presente documento puede aplicarse a estudios de modelos animales de enfermedades humanas. Diversos modelos animales de enfermedades pueden mostrar una supervivencia o dinamica alterada de una o mas poblaciones celulares. Dichas poblaciones celulares pueden marcarse, administrarse al animal y supervisarse. Por ejemplo, puede supervisarse la infiltracion de celulas inmunitarias en el pancreas del modelo de raton NOD para la diabetes. Otros ejemplos de modelos animales incluyen: encefalomielitis alergica experimental (modelo de esclerosis multiple), modelos tumorales de gliosarcoma y rechazo de trasplantes de organos. Mediante el rastreo de poblaciones definidas fenotfpicamente de celulas inmunitarias en estos modelos, se pueden esclarecer aspectos de la etiologfa de la enfermedad y supervisar como se ve afectado el trafico de las celulas por los agentes terapeuticos. Este metodo puede usarse, por ejemplo, para seleccionar farmacos que tienen un efecto deseado en un modelo animal. Un ensayo de seleccion de farmacos puede comprender administrar celulas marcadas a un animal y detectar las celulas in vivo en presencia de un agente de ensayo. Los cambios en el comportamiento celular que estan correlacionados con la presencia del agente de ensayo pueden ser indicativos de un efecto terapeutico. Dichos cambios pueden detectarse por comparacion con una referencia adecuada que incluye, por ejemplo, el mismo animal antes y despues del tratamiento con el agente de ensayo u otro animal no tratado. Ademas de un agente de ensayo, los metodos pueden usarse para evaluar los efectos de las condiciones de ensayo, tales como un regimen de ejercicio, lesiones, alteracion genetica, etc. Como ejemplo, es de esperar que un farmaco para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria reduzca la tendencia de las celulas inmunitarias de acumularse en un tejido afectado. Ademas de las evaluaciones en estado estacionario, los metodos desvelados en el presente documento pueden usarse para evaluar las propiedades cineticas de las celulas, tales como la tasa a la que las celulas llegan a un sitio particular y el tiempo de persistencia de la senal en un sitio. Los ensayos de seleccion de farmacos pueden ser particularmente potentes cuando se combinan con supervision in vivo de poblaciones celulares muy bien definidas, tales como ciertos grupos de celulas inmunitarias que estan implicadas en diversos trastornos. Por ejemplo, la supervision de celulas T citotoxicas marcadas puede ser particularmente util

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para identificar farmacos que pueden ser utiles para prevenir el rechazo de trasplantes. La capacidad de supervisar celulas in vivo proporciona un ensayo potente que puede aplicarse al analisis de esencialmente cualquier animal experimental, incluyendo, por ejemplo, cualquiera de los diversos ratones transgenicos o mutantes de otra forma que se han generado.

Varios grupos han estudiado el marcaje y la visualizacion de celulas inmunitarias usando agentes de contraste de MRI. Otros investigadores han usado agentes de contraste de MRI para marcar tipos celulares tales como celulas madre y precursores neuronales. La mayona de estos estudios hacen que las celulas sean magneticamente distintas mediante la incorporacion de agentes de oxido de hierro superparamagneticos (SPIO). Tambien se han usado celulas marcadas con agentes de contraste que incorporan otros tipos de iones metalicos, particularmente gadolinio y manganeso. En estudios que utilizan estos agentes basados en iones metalicos, no se obtienen directamente imagenes de los compuestos; en su lugar, se observa su efecto indirecto sobre el agua circundante. La presencia del agente tiende a acortar los tiempos de relajacion (T1, T2 o T2*) del agua en las proximidades del compuesto; estos efectos pueden detectarse en imagenes ponderadas en tiempos de relajacion. Los agentes SPIO, por ejemplo, confieren contraste a imagenes de rH convencionales alterando localmente el campo magnetico experimentado por las moleculas de agua moviles cercanas, lo cual a su vez modula Ti, T2 o T2* Los metodos descritos en el presente documento son claramente diferentes de todos los metodos que usan agentes de contraste basados en iones metalicos porque las senales de los nucleos de 19F en los reactivos de formacion de imagenes pueden detectarse directamente y, opcionalmente, proporcionar imagenes.

Un inconveniente intrmseco de la deteccion de celulas marcadas usando agentes de contraste basados en iones metalicos es que, con frecuencia, uno se encuentra con una situacion en la que es necesario interpretar cambios sutiles en un contraste de escala de grises en regiones que se cree que contienen celulas marcadas. La gran senal de fondo de 1H procedente de la alta concentracion de agua movil presente en los tejidos puede hacer diffcil identificar de forma ineqrnvoca regiones que contienen celulas marcadas; esto es especialmente problematico sin la biodistribucion de celulas marcadas no se conoce a priori. Los resultados de una imagen “instantanea” con frecuencia son ambiguos en cuanto a si las celulas marcadas estan presentes en un tejido espedfico. Este es un problema particularmente molesto cuando se intenta detectar celulas marcadas con SPIO en organos cargados de hierro que aparecen intrmsecamente oscuros en imagenes anatomicas (ponderados en T2 o T2*), tales como en el tugado o el bazo. Con frecuencia, se tiene que recurrir a detectar los cambios de intensidad de la imagen en lapsos de tiempo en un organo particular durante un periodo de varias horas para verificar que se han acumulado celulas marcadas. Ademas, la cuantificacion de celulas marcadas in vivo en regiones de interes usando agentes de contraste basados en iones metalicos es problematica, y generalmente no hay una forma sencilla y fiable de hacer esto usando IRM ponderada en tiempos de relajacion o usando mapas cuantitativos de IRM con tiempos de relajacion.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la solicitud pueden encontrar aplicacion en espectroscopia por RM de 19F (SRM), formacion de imagenes por resonancia magnetica (IRM) y formacion de imagenes espectroscopicas por resonancia magnetica (ISRM).

En otro aspecto de la solicitud, las emulsiones de la solicitud pueden usarse para el marcaje in situ de macrofagos y monocitos residentes. En esta aplicacion, se inyecta por via intravenosa (iv) directamente una embolada de emulsion. Aqrn, la emulsion se tampona apropiadamente (por ejemplo, un pH fisiologicamente seguro, osmolaridad, etc.) para una inyeccion iv segura. Despues de la inyeccion, las gotas de emulsion se retiran de la sangre por celulas fagodticas residentes, tales como neutrofilos, macrofagos y monocitos. Estas celulas marcadas participan en acontecimientos inflamatorios dentro del cuerpo. Cuando en un sitio se acumulan cantidades suficientes de estas celulas marcadas in situ, se vuelven detectables usando SRM/IRM de 19F in vivo o en tejido escindido (de una biopsia o necropsia). La cantidad absoluta de nucleos de 19F o la cantidad de senales de 19F presentes en un tejido (medidas in vivo o ex vivo) se correlaciona directamente con el grado o extension de inflamacion presente. Ademas, en el presente documento se describe que la senal de 19F puede ser un diagnostico de inflamacion, biomarcador cuantitativo o indicador de inflamacion.

Una embolada de emulsion puede inyectarse iv, y las gotas de emulsion se captan por fagocitos residentes que migran a un tumor. La deteccion de 19F en el tumor es una herramienta de diagnostico que identifica la localizacion del tumor, asf como la distribucion y el grado de su actividad de macrofagos o de inflamacion. Ademas, se sabe que el perfluoro-15-corona-5 eter, un componente principal de las emulsiones, se coordina o se une al oxfgeno. En la tecnica se sabe que esta molecula, en presencia de oxfgeno, tiene sus tiempos de relajacion de RMN de 19F (T1, T2 y T2*) acortados en una cantidad que es linealmente proporcional a la presion parcial de oxfgeno (pO2) local. En particular, el tiempo de relajacion de la red de spin de 19F (T1) de perfluoro-15-corona-5 eter es muy sensible a la pO2 (C.H. Sotak, et al., Magn. Resort. Med. 29, 188 (1993)). De esta manera, las mediciones de T1 del perfluoro-15- corona-5 eter intersticial e incorporado en los macrofagos en el tumor pueden usarse para medir la pO2, que puede ser un marcador sensible de la eficacia de una diversidad de agentes terapeuticos para el cancer. Las emulsiones de la solicitud pueden usarse para ensayar la hipoxia o la hiperoxia. La deteccion de pO2 en los tejidos puede conseguirse mediante inyeccion directa de emulsiones en el tejido.

Tambien se describe en el presente documento que las emulsiones de la solicitud pueden usarse para detectar una amplia serie de lesiones y enfermedades en las que esta presente la inflamacion. Ademas, en el presente

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documento se describe que la enfermedad puede seleccionarse del grupo que consiste en cancer, enfermedad cardiovascular, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad autoinmunitaria (por ejemplo, esclerosis multiple, artritis reumatoide, diabetes de tipo I, lupus, enfermedad de Crohn, neuritis optica, etc.), rechazo de trasplantes de organos, enfermedades infecciosas y lesion traumatica cerebral y de la medula espinal.

Las emulsiones de la solicitud pueden usarse para obtener imagenes de lesiones del Idgado a traves de una imagen de 19F de la distribucion de la emulsion en ese organo. Las emulsiones de la solicitud que se inyectan por via iv pueden eliminarse por el Idgado y captarse por las celulas hepaticas. Las lesiones del Idgado pueden dar como resultado distribuciones anomalas y heterogeneas de captacion de la emulsion e intensidad de las imagenes de 19F.

Las emulsiones de la solicitud pueden usarse como sonda de oxigenacion de tejidos. Las emulsiones de la solicitud pueden servir como sensor para el pO2 en tejidos usando SRM/IRM de 19F. El perfluoro-15-corona-5 eter se coordina con el oxfgeno, cambiando de esta manera su valor de T1 19F varias veces. De esta manera, una medicion del T1 19F por SRM o IRM (por ejemplo, usando un mapa de imagenes de T1l) proporciona una medicion cuantitativa de la pO2. (Vease Taylor J, y Deutsch C. Biophys J 53: 227-233, 1988; Mason, R. P.; Rodbumrung, W.; Antich, P. P. NMR Biomed 9: 125-134; 1996; Laukemper-Ostendorf, S.; Scholz, A.; Burger, K.; Heussel, C. P.; Schmittner, M.; Weiler, N.; Markstaller, K.; Eberle, B.; Kauczor, H. U.; Quintel, M.; Thelen, M.; Schreiber, W. G. Magn Reson Med 47: 82-89; 2002; y Kim, J. G.; Zhao, D.; Song, Y.; Constantinescu, A.; Mason, R. P.; Liu, H. J Biomed Opt 8: 53-62; 2003).

Las emulsiones de la solicitud se pueden acumular en areas con una permeabilidad vascular elevada, tales como, por ejemplo, en tumores. Las emulsiones de la solicitud pueden usarse para ensayar la perfusion de tejidos, proporcionar la posibilidad de determinar los volumenes de sangre en tejidos, para acortar selectivamente los tiempos de relajacion o densidades de la sangre y para visualizar graficamente la permeabilidad de los vasos sangurneos. Las emulsiones de la solicitud pueden usarse para el diagnostico espedfico de tumores malignos, el control temprano de terapias en caso de terapia citostatica, antiflogfstica o vasodilatadora, la deteccion precoz de areas infraperfundidas (por ejemplo, en el miocardio), angiograffa en enfermedades vasculares y la deteccion y diagnostico de inflamaciones esteriles o infecciosas.

Las emulsiones de la solicitud pueden usarse como un portador de oxfgeno artificial o sustituto de sangre artificial (vease la publicacion de patente de Estados Unidos n.° 20040057906, patentes de Estados Unidos n.° 4.838.274 y 5.785.950 y el documento WO 96/40057). Las emulsiones pueden usarse in vivo o ex vivo. Las emulsiones de la divulgacion pueden tener disueltas en su interior grandes cantidades de gases, incluyendo oxfgeno, dioxido de carbono y aire, por unidad de volumen. Por consiguiente, pueden usarse fluorocarburos (FC) y perfluorocarburos (PFC) como portadores en aplicaciones en las que debe suministrarse oxfgeno a los organos y tejidos.

De esta manera, los metodos y composiciones desvelados en el presente documento proporcionan herramientas muy necesarias en los campos de la medicina y la biologfa.

2. Emulsiones

El reactivo de formacion de imagenes usado en los presentes metodos es un fluorocarburo, es decir, una molecula que incluye al menos un enlace carbono-fluor. Gracias a los atomos de 19F, los reactivos de formacion de imagenes desvelados en el presente documento pueden detectarse por IRM de 19F y otras tecnicas de resonancia magnetica nuclear, tales como tecnicas de SRM. Un reactivo de formacion de imagenes de fluorocarburo puede tener una o mas de las siguientes propiedades: 1) una citotoxicidad reducida; 2) un espectro de RMN de 19F que es sencillo, teniendo idealmente una sola resonancia estrecha para minimizar los artefactos de desplazamiento qmmico; 3) alta sensibilidad con un gran numero de atomos de fluor equivalentes de RMN en cada molecula; 4) formulado para permitir el marcaje eficaz de muchos tipos celulares y no restringido a celulas fagodticas. Preferentemente, el reactivo de formacion de imagenes comprende una pluralidad de atomos de fluor unidos a carbono, por ejemplo, mas de 5, mas de 10, mas de 15 o mas de 20 atomos de fluor unidos a carbono. Preferentemente, al menos 4, al menos 8, al menos 12 o al menos 16 de los atomos de fluor tienen un desplazamiento qmmico de RMN aproximadamente equivalente.

Para el marcaje de celulas en cultivo, los reactivos de formacion de imagenes pueden emplearse en una o mas de al menos tres modalidades: 1) reactivos de formacion de imagenes que se internalizan o se absorben de otra manera por las celulas diana sin la formacion de ninguna asociacion covalente u otra asociacion de union; 2) reactivos de formacion de imagenes que se unen covalentemente a las celulas diana; y 3) reactivos de formacion de imagenes acoplados a moleculas, tales como anticuerpos o ligandos, que se unen a moleculas presentes en las celulas diana.

Los reactivos de formacion de imagenes del primer tipo incluyen los eteres de perfluoro corona y otros perfluoropolieteres (PFPE) que se captan por las celulas y, preferentemente, quedan retenidos en las celulas sin degradacion durante un periodo de tiempo sustancial, por ejemplo, teniendo una semivida en la celula de al menos 1 hora, 4 horas, al menos aproximadamente un dfa, al menos aproximadamente tres dfas, o incluso al menos aproximadamente una semana. Por razones obvias, se prefiere que el reactivo de formacion de imagenes no interfiera con las funciones celulares normales o presente citotoxicidad a las concentraciones empleadas para el

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marcaje. Como se demuestra en el presente documento, los perfluoropolieteres muestran un efecto toxico reducido en las celulas marcadas.

Los reactivos de formacion de imagenes del segundo tipo incluyen compuestos electrofilos que reaccionan con sitios nucleofilos en la superficie celular, tales como grupos tiol, amino y/o hidroxilo expuestos. Por consiguiente, los reactivos de formacion de imagenes tales como maleimidas, yoduros de alquilo, N-hidroxisuccinimida o esteres de N-hidroxisulfosuccinimida (NHS o esteres de sulfo-NHS), acil succinimidas y similares, pueden formar enlaces covalentes con las superficies celulares. Otras tecnicas usadas en el acoplamiento de protemas pueden adaptarse para acoplar reactivos de formacion de imagenes a las protemas de la superficie celular. Vease Means et al. (1990) Bioconjugate Chemistry 1: 2-12, para estrategias adicionales de dicho acoplamiento.

Los reactivos de formacion de imagenes del tercer tipo pueden prepararse mediante la reaccion de reactivos de formacion de imagenes del segundo tipo no con las propias celulas, sino con un resto funcional que sea un ligando o anticuerpo que se dirige a la celula. Los ligandos y anticuerpos adecuados pueden seleccionarse para la aplicacion de interes. Por ejemplo, un ligando que se dirige selectivamente a celulas hematopoyeticas podna marcarse con un reactivo de formacion de imagenes como se describe en el presente documento y administrarse a un paciente, tal como mediante inyeccion.

Como alternativa, un reactivo de formacion de imagenes puede acoplarse a un peptido de internalizacion indiscriminado, tal como protema antepennepedia, protema de transactivacion de VIH (TAT), mastoparan, melitina, bombolitina, hemolisina delta, pardaxina, exotoxina A de pseudomonas, clatrina, toxina difterica, protema C9 del complemento o un fragmento de cualquiera de estas. Las celulas tratadas con esta molecula indiscriminada ex vivo absorberan el reactivo de formacion de imagenes. Cuando dichas celulas marcadas se implantan en un animal, tal como un mairnfero, el reactivo de formacion de imagenes puede usarse para visualizar y/o rastrear las celulas implantadas por tecnicas de resonancia magnetica nuclear.

El peptido de internalizacion puede proceder de la protema antepennepedia de Drosophila u homologos de la misma. Se ha demostrado que el homeodominio de 60 aminoacidos de longitud de la homeoprotema antepennepedia se transloca a traves de las membranas biologicas y puede facilitar la translocacion de polipeptidos heterologos a los que se acopla. Vease, por ejemplo, Derossi et al. (1994) J Biol Chem 269: 10444-10450; y Perez et al. (1992) J Cell Sci 102: 717-722. Se ha demostrado que fragmentos tan pequenos como fragmentos de 16 aminoacidos de longitud de esta protema son suficientes para dirigir la internalizacion. Vease Derossi et al. (1996) J Biol Chem 271: 18188-18193.

Otro ejemplo de un peptido de internalizacion es la protema transactivadora de VIH (TAT). Esta protema parece estar dividida en cuatro dominios (Kuppuswamy et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17: 3551-3561). La protema TAT purificada se capta por las celulas en cultivos tisulares (Frankel y Pabo, (1989) Cell 55: 1189-1193) y los peptidos, tales como el fragmento que corresponde a los restos 37-62 de TAT, se captan rapidamente por la celula in vitro (Green y Loewenstein, (1989) Cell 55: 1179-1188). La region altamente basica media la internalizacion y direccion del resto de internalizacion al nucleo (Ruben et al., (1989) J. Virol. 63: 1-8). Los peptidos o analogos que incluyen una secuencia presente en la region altamente basica pueden conjugarse con reactivos de formacion de imagenes fluorados para ayudar a la internalizacion y direccion de esos reactivos al medio intracelular.

La presente invencion proporciona nuevas composiciones caracterizadas en las reivindicaciones adjuntas que comprenden reactivos de formacion de imagenes. Con mas detalle, la presente invencion proporciona una composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de pFpE, un emulsionante, una co-mezcla de tensioactivo y un aditivo, donde el emulsionante comprende ricinoleato de glicerol polietilenglicol. En ciertas realizaciones, la co-mezcla de tensioactivo comprende lecitina (es decir, fosfatidilcolina de huevo lipoide), colesterol y dipalmitoil fosfatidiletanolamina (DPPE). En ciertas de estas realizaciones, la co-mezcla de tensioactivo comprende un 70 % en moles de lecitina; un 28 % en moles de colesterol y un 2 % en moles de DPPI. En ciertas realizaciones, el aditivo es propilenglicol.

Como se usa en el presente documento, la expresion “oxido de PFPE” se refiere a perfluoropoli(etilenglicol) dialquil eter (por ejemplo, como puede adquirirse de Exfluor Inc., TX),

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Oxido de PFPE (Rf = CF3, CF2CF3),

donde Rf es CF3 y CF2CF3 en una relacion de 2:1, basandose en el analisis de RMN de 19F.

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El emulsionante tambien descrito en el presente documento puede ser un solubilizante no ionico. De acuerdo con la presente invencion, el emulsionante comprende ricinoleato de glicerol polietilenglicol. En ciertas de estas realizaciones, el emulsionante comprende ademas esteres de acidos grasos de polietilenglicol, polietilenglicoles libres y glicerol etoxilado.

En ciertas realizaciones, el emulsionante se prepara haciendo reaccionar aceite de ricino y oxido de etileno en una relacion molar de 1:35. Pueden obtenerse emulsionantes ejemplares de BASF Corporation y se venden con el nombre comercial Cremophor® EL.

En ciertas realizaciones, la composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE, Cremophor® EL, una co-mezcla de tensioactivo (por ejemplo, que comprende lecitina, colesterol y DPPE) y un aditivo (por ejemplo, propilenglicol) comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE en el intervalo del 20 % al 50 % p/v, tal como del 25 % al 45 % p/v, tal como del 30 % al 40 % p/v, tal como un 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 % o 40 % p/v. En ciertas de estas realizaciones, la composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE, Cremophor® EL, una co-mezcla de tensioactivo (por ejemplo, que comprende lecitina, colesterol y DPPE) y un aditivo (por ejemplo, propilenglicol) comprende perfluoro- 15-corona-5 eter u oxido de PFPE en el intervalo del 35 % al 36 % p/v, tal como en un 35,1 %, 35,2 %, 35,3 %, 35,4%, 35,5%, 35,6%, 35,7%, 35,8% o 35,9% p/v. En ciertas realizaciones, la composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE, Cremophor® EL, una co-mezcla de tensioactivo (por ejemplo, que comprende lecitina, colesterol y DPPE) y un aditivo (por ejemplo, propilenglicol) comprende perfluoro- 15-corona-5 eter u oxido de PFPE en un 35,6 % p/v.

En ciertas realizaciones, la composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE, Cremophor® EL, una co-mezcla de tensioactivo (por ejemplo, que comprende lecitina, colesterol y DPPE) y un aditivo (por ejemplo, propilenglicol) comprende Cremophor® EL en el intervalo del 1 % al 10 % p/v, tal como del 1 % al 5 % p/v, tal como un 1 %, 2 %, 3 %, 4 % o 5 % p/v. En ciertas realizaciones, la composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPe, Cremophor® EL, una co-mezcla de tensioactivo (por ejemplo, que comprende lecitina, colesterol y DPPE) y un aditivo (por ejemplo, propilenglicol) comprende Cremophor® EL en un 3 % p/v.

En ciertas realizaciones, la composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE, Cremophor® EL, una co-mezcla de tensioactivo (por ejemplo, que comprende lecitina, colesterol y DPPE) y propilenglicol comprende propilenglicol en el intervalo del 1 % al 10 % p/v, tal como del 1 % al 5 % p/v, tal como un 1 %, 2 %, 3 %, 4 % o 5 % p/v. En ciertas realizaciones, la composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona- 5 eter u oxido de PFPE), Cremophor® EL, una co-mezcla de tensioactivo (por ejemplo, que comprende lecitina, colesterol y DPPE) y propilenglicol comprende propilenglicol en un 2 % p/v.

En ciertas realizaciones, la composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE, Cremophor® EL, un aditivo (por ejemplo, propilenglicol) y una co-mezcla de tensioactivo, donde la co-mezcla de tensioactivo comprende lecitina, colesterol y DPPE, comprende la co-mezcla de tensioactivo, donde la co-mezcla de tensioactivo comprende lecitina, colesterol y DPPE, en el intervalo del 1 % al 10 % p/v, tal como del 1 % al 5 % p/v, tal como un 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, o 5 % p/v. En ciertas realizaciones, la composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE, Cremophor® EL, un aditivo (por ejemplo, propilenglicol) y una co- mezcla de tensioactivo, donde la co-mezcla de tensioactivo comprende lecitina, colesterol y DPPE, comprende la co- mezcla de tensioactivo, donde la co-mezcla de tensioactivo comprende lecitina, colesterol y DPPE, en un 2 % p/v.

En ciertas realizaciones, la composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE, Cremophor® EL, una co-mezcla de tensioactivo (por ejemplo, que comprende lecitina, colesterol y DPPE) y un aditivo (por ejemplo, propilenglicol) comprende ademas polietilamina. En ciertas de estas realizaciones, la composicion acuosa comprende polietilamina en el intervalo del 0,01 % al 5,0 % p/p. En ciertas realizaciones, la composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE, Cremophor® EL, una co-mezcla de tensioactivo (por ejemplo, que comprende lecitina, colesterol y DPPE), un aditivo (por ejemplo, propilenglicol) y polietilamina comprende ademas sulfato de protamina. En ciertas de estas realizaciones, la composicion acuosa comprende ademas sulfato de protamina en el intervalo del 0,01 % al 5,0 % p/p.

En ciertas realizaciones, la presente invencion proporciona una composicion acuosa que comprende perfluoro-15- corona-5 eter u oxido de PFPE en un 35,6 % p/v, Cremophor® EL en un 3,0 % p/v, una co-mezcla de tensioactivo (por ejemplo, que comprende lecitina, colesterol y DPPE) en un 2,0 % p/v y un aditivo (por ejemplo, propilenglicol) en un 2,0 % p/v.

Los terminos emulsion y nanoemulsion, como se usan en esta memoria descriptiva, son equivalentes a menos que se indique espedficamente lo contrario. En ciertas realizaciones, la emulsion puede comprender ademas un copolfmero de bloque de polietilenglicol y polipropilenglicol. En ciertas realizaciones, la emulsion puede comprender ademas un Pluronic™. Los tensioactivos Pluronic™ no ionicos, bloque de poli(oxido de etileno) (PEO)/poli(oxido de propileno) (PPO)/poli(oxido de etileno) (PEO) (tipo ABA), copolfmeros de bloque (PEO/PPO/PEO) presentan un amplio intervalo de hidrofilia/hidrofobia en funcion de la relacion de PEO/PPO, de forma que se puede esperar

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obtener diferentes morfologfas de fases separadas con poKmeros tales como PLA, as^ como diferentes grados de hidratacion de la matriz. En particular, la hidratacion juega un papel importante en la determinacion de la degradacion del poUmero a traves de la hidrolisis del esqueleto del ester. Estos tensioactivos polimericos presentaron toxicidades mmimas in vivo y algunos de ellos estan en uso clmico, como se describe por BASF Corporation en su boletm tecnico de 1989; Attwood, et al., Int. J. Pharm. 26, 25 (1985); y patente de Estados Unidos n.° 4.188.373 de Krezanoski. Estos materiales pueden obtenerse en BASF Corporation. En ciertas realizaciones, las emulsiones de la presente invencion comprenden ademas copolfmero tri-bloque que comprende poli(oxido de etileno) y poli(oxido de propileno).

En ciertas realizaciones, las emulsiones de la presente invencion comprenden un copolfmero tri-bloque de poli(oxido de etileno)-poli(oxido de propileno)-poli(oxido de etileno) (PEO-PPO-PEO) que comprende un 80 % de contenido de PEO. En ciertas de estas realizaciones, el valor de equilibrio hidrofilo-lipofilo (HLB) del copolfmero tri-bloque es 29, donde el valor de HLB puede calcularse a partir de la siguiente ecuacion:

imagen2

donde n representa el numero de unidades repetidas en el segmento de PEO del polfmero y m representa el numero de unidades repetidas en el segmento de PPO del polfmero.

Pueden obtenerse copolfmeros tri-bloque ejemplares en BASF Corporation y se venden con el nombre comercial de Pluronic™ F68.

En el presente documento tambien se describe una composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE y el Pluronic™ F68. La composicion acuosa que comprende perfluoro-l5-corona-5 eter u oxido de PFPE y el Pluronic™ F68, puede comprender perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE en el intervalo del 10 % al 20% p/p, tal como del 12% al 17% p/p, tal como un 12%, 13%, 14%, 15%, 16% o 17% p/p. Tambien se describe en el presente documento que la composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE y el Pluronic™ F68, puede comprender perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE en un 15 % p/p y que la composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE y el Pluronic™ F68, puede comprender el Pluronic™ F68 en el intervalo del 0,1 % al 2,0 % p/p, tal como del 0,1 % al 1,0 % p/p, tal como un 0,1 %, 0,2 %, 0,3 %, 0,4 %, 0,5 %, 0,6 %, 0,7 %, 0,8 %, 0,9 % o 1,0 % p/p. Ademas, en el presente documento se describe que la composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE y el Pluronic™ F68 puede comprender el Pluronic™ F68 en un 0,6 % p/p.

En el presente documento tambien se describe una composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE en un 15 % p/p y el Pluronic™ F68 en un 0,6 % p/p.

Ademas, en el presente documento se describe que la composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE y el Pluronic™ F68 puede comprender ademas sulfato de protamina. Tambien se describe en el presente documento que la composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE, el Pluronic™ F68 y sulfato de protamina puede comprender sulfato de protamina en el intervalo del 0,01 % al 1,0 % p/p, tal como del 0,01 % al 0,5% p/p, tal como del 0,01 % al 0,10% p/p, tal como un 0,01 %, 0,02%, 0,03%, 0,04 %, 0,05 %, 0,06 %, 0,07 %, 0,08 %, 0,09 % o 0,10 % p/p. Ademas, en el presente documento se describe que la composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE, el Pluronic™ F68 y sulfato de protamina puede comprender sulfato de protamina en un 0,04 % p/p.

Tambien se describe en el presente documento que la composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE y el Pluronic™ F68 ademas puede comprender polietilamina. Tambien se describe en el presente documento una composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE en un 15 % p/p, el Pluronic™ F68 en un 0,6 % p/p y sulfato de protamina en un 0,04 % p/p.

La presente invencion tambien proporciona formulaciones de las composiciones de la presente invencion caracterizadas en las reivindicaciones adjuntas que son adecuadas para la captacion por las celulas. Por ejemplo, las composiciones de la presente invencion pueden formularse como una emulsion. Como ejemplo, la presente invencion proporciona una emulsion que comprende una composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE, Cremophor® EL, una co-mezcla de tensioactivo y un aditivo. En ciertas realizaciones, la co- mezcla de tensioactivo comprende lecitina, colesterol y dipalmitoil fosfatidil etanolamina (DPPE). En ciertas de estas realizaciones, la co-mezcla de tensioactivo comprende un 70 % en moles de lecitina; un 28 % en moles de colesterol; y un 2 % en moles de DPPI. En ciertas realizaciones, el aditivo es propilenglicol.

En ciertas realizaciones de la emulsion anterior, la composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE, Cremophor® EL, una co-mezcla de tensioactivo (por ejemplo, que comprende lecitina, colesterol y DPPE) y un aditivo (por ejemplo, propilenglicol) comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE en el

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intervalo del 20 % al 50 % p/v, tal como del 25 % al 45 % p/v, tal como del 30 % al 40 % p/v, tal como un 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 % o 40 % p/v. En ciertas de estas realizaciones de la emulsion anterior, la composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE, Cremophor® EL, una co-mezcla de tensioactivo (por ejemplo, que comprende lecitina, colesterol y DPPE) y un aditivo (por ejemplo, propilenglicol) comprende perfluoro-l5-corona-5 eter u oxido de PFPE en el intervalo del 35 % al 36 % p/v, tal como un 35,1 %, 35,2%, 35,3%, 35,4%, 35,5%, 35,6%, 35,7%, 35,8%, o 35,9% p/v. En ciertas realizaciones de la emulsion anterior, la composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE, Cremophor® EL, una co-mezcla de tensioactivo (por ejemplo, que comprende lecitina, colesterol y DPPE) y un aditivo (por ejemplo, propilenglicol) comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE en un 35,6 % p/v.

En ciertas realizaciones de la emulsion anterior, la composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE, Cremophor® EL, una co-mezcla de tensioactivo (por ejemplo, que comprende lecitina, colesterol y DPPE) y un aditivo (por ejemplo, propilenglicol) comprende Cremophor® EL en el intervalo del 1 % al 10 % p/v, tal como del 1 % al 5 % p/v, tal como un 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, o 5 % p/v. En ciertas realizaciones de la emulsion anterior, la composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE, Cremophor® EL, una co-mezcla de tensioactivo (por ejemplo, que comprende lecitina, colesterol y DPPE) y un aditivo (por ejemplo, propilenglicol) comprende Cremophor® El en un 3 % p/v.

En ciertas realizaciones de la emulsion anterior, la composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE, Cremophor® EL, una co-mezcla de tensioactivo (por ejemplo, que comprende lecitina, colesterol y DPPE) y propilenglicol comprende propilenglicol en el intervalo del 1 % al 10 % p/v, tal como del 1 % al 5 % p/v, tal como un 1 %, 2 %, 3 %, 4 % o 5 % p/v. En ciertas realizaciones de la emulsion anterior, la composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE, Cremophor® EL, una co-mezcla de tensioactivo (por ejemplo, que comprende lecitina, colesterol y DPPE) y propilenglicol comprende propilenglicol en un 2 % p/v.

En ciertas realizaciones de la emulsion anterior, la composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE, Cremophor® EL, un aditivo (por ejemplo, propilenglicol) y una co-mezcla de tensioactivo, donde la co-mezcla de tensioactivo comprende lecitina, colesterol y DpPe, comprende la co-mezcla de tensioactivo, donde la co-mezcla de tensioactivo comprende lecitina, colesterol y DPPE, en el intervalo del 1 % al 10 % p/v, tal como del 1 % al 5 % p/v, tal como un 1 %, 2 %, 3 %, 4 % o 5 % p/v.

En ciertas realizaciones de la emulsion anterior, la composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE, Cremophor® EL, un aditivo (por ejemplo, propilenglicol) y una co-mezcla de tensioactivo, donde la co-mezcla de tensioactivo comprende lecitina, colesterol y DPPE, comprende la co-mezcla de tensioactivo, donde la co-mezcla de tensioactivo comprende lecitina, colesterol y DPPE en un 2 % p/v.

En ciertas realizaciones, la presente invencion proporciona una emulsion que comprende una composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE en un 35,6 % p/v, Cremophor® EL en un 3,0 % p/v, una co-mezcla de tensioactivo (por ejemplo, que comprende lecitina, colesterol y DPPE) en un 2,0 % p/v y un aditivo (por ejemplo, propilenglicol) en un 2,0 % p/v.

En el presente documento tambien se describe una emulsion que comprende una composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE y el Pluronic™ F68. Ademas, en el presente documento se describe que, en la emulsion anterior, la composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE y el Pluronic™ F68, puede comprender perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE en el intervalo del 10 % al 20 % p/p, tal como del 12 % al 17 % p/p, tal como un 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 % o 17 % p/p. En el presente documento tambien se describe que, en la emulsion anterior, la composicion acuosa que comprende perfluoro-15- corona-5 eter u oxido de PFPE y el Pluronic™ F68 puede comprender perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE en un 15 % p/p. Ademas, en el presente documento se describe que, en la emulsion anterior, la composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE y el Pluronic™ F68 puede comprender el Pluronic™ F68 en el intervalo del 0,1 % al 2,0 % p/p, tal como del 0,1 % al 1,0 % p/p, tal como un 0,1 %, 0,2 %, 0,3 %, 0,4 %, 0,5 %, 0,6 %, 0,7 %, 0,8 %, 0,9 % o 1,0 % p/p. Tambien se describe en el presente documento que, en la emulsion anterior, la composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE y el Pluronic™ F68 puede comprender el Pluronic™ F68 en un 0,6 % p/p.

En el presente documento tambien se describe una emulsion que comprende una composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE en un 15 % p/p y el Pluronic™ F68 en un 0,6 % p/p.

Ademas, en el presente documento tambien se describe que, en la emulsion anterior, la composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE y el Pluronic™ F68 puede comprender ademas sulfato de protamina. Ademas, en el presente documento se describe que, en la emulsion anterior, la composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE, el Pluronic™ F68 y el sulfato de protamina puede comprender sulfato de protamina en el intervalo del 0,01 % al 1,0 % p/p, tal como del 0,01 % al 0,5 % p/p, tal como del 0,01 % al 0,10 % p/p, tal como un 0,01 %, 0,02 %, 0,03 %, 0,04 %, 0,05 %, 0,06 %, 0,07 %, 0,08 %, 0,09 % o 0,10 % p/p. Ademas, en el presente documento se describe que, en la emulsion anterior, la composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE, el Pluronic™ F68 y sulfato de protamina puede comprender

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sulfato de protamina en un 0,04 % p/p.

En el presente documento tambien se describe una emulsion que comprende una composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE en un 15 % p/p, el Pluronic™ F68 en un 0,6 % p/p y sulfato de protamina en un 0,04 % p/p.

En ciertas realizaciones, las composiciones y las emulsiones de la presente invencion comprenden Cremophor® EL, un solubilizante no ionico y un emulsionante que comprende ricinoleato de polietilenglicol, obtenido por la reaccion de aceite de ricino con oxido de etileno en una relacion molar de 1:35. Este material puede obtenerse de BASF Corporation.

En ciertas realizaciones, la emulsion puede comprender ademas un lfpido. En ciertas realizaciones de emulsiones de la presente invencion que comprenden ademas un lfpido, el lfpido es DMPC. En ciertas realizaciones de emulsiones de la presente invencion que comprenden ademas un lfpido, la emulsion comprende ademas un Pluronic™. En ciertas realizaciones, el Pluronic™ es F68.

En ciertas realizaciones, la emulsion puede comprender ademas polietilamina.

En ciertas realizaciones, la emulsion puede comprender ademas sulfato de protamina.

En ciertas realizaciones de emulsiones de la presente invencion que comprenden ademas sulfato de protamina, la emulsion comprende ademas un Pluronic™. En ciertas realizaciones, el Pluronic™ es F68. En ciertas realizaciones, la emulsion de la presente invencion comprende ademas sulfato de protamina.

Las emulsiones de la presente invencion preferentemente tendran una distribucion de tamanos de gotas que permitiran la captacion celular adecuada. En ciertas realizaciones, puede ser ventajoso un tamano de gotas uniforme. El grado deseado de uniformidad del tamano de las gotas puede variar dependiendo de la aplicacion. En ciertas realizaciones, la emulsion tiene un tamano medio de gotas menor de 500 nm, o menor de 400 nm, o menor de 300 nm, o menor de 200 nm de diametro. Opcionalmente, un 25 % o 50 % o 75 % o mas de las gotas caeran dentro del intervalo seleccionado. Los tamanos de las gotas pueden evaluarse, por ejemplo, por tecnicas de dispersion de luz o por visualizacion de las gotas de emulsion usando micrograffas EM. En ciertos tipos celulares que tienen una cantidad relativamente pequena de citoplasma, tales como la mayona de las celulas madre, las emulsiones tienen un tamano medio de gotas menor de 200 nm, o menor de 100 nm, o menor de 50 nm de diametro.

En ciertas realizaciones, es ventajoso un tamano de gotas pequeno. En ciertas realizaciones, el tamano de gotas pequeno aumenta el tiempo de circulacion en aplicaciones en las que la emulsion se inyecta por via iv. En ciertas realizaciones, las gotas se separan de las celulas por circulacion. En ciertas realizaciones, el pequeno tamano de las gotas aumenta el marcaje de las celulas ex vivo.

En ciertas realizaciones, el pequeno tamano de gotas aumenta el marcaje uniforme.

Las emulsiones para uso en celulas preferentemente deben ser estables en un amplio intervalo de temperaturas. En ciertas realizaciones, las emulsiones seran estables a la temperatura corporal (37 °C en el caso de los seres humanos) y a una temperatura de almacenamiento, tal como 4 °C o la temperatura ambiente (20-25 °C). Por ejemplo, con frecuencia sera deseable almacenar la emulsion a una temperatura fna, en el intervalo de 2 -10 °C, tal como 4 °C, y despues calentar la emulsion temperatura ambiente (por ejemplo, de 18 a 28 °C y, mas tfpicamente, de 20 a 25 °C). Despues de marcar las celulas, la emulsion experimental una temperatura de aproximadamente 37 °C. Por consiguiente, una emulsion preferida retendra el intervalo deseado de tamano de gotas a temperaturas que vanan desde las temperaturas de refrigeracion hasta la temperatura corporal. En ciertas realizaciones, la emulsion es estable a temperaturas que vanan de 4 °C a 37 °C.

En ciertas realizaciones, la emulsion tiene un mdice de polidispersidad que vana de 0,1 a 0,2.

Las propiedades de una emulsion pueden controlarse principalmente por las propiedades del propio reactivo de formacion de imagenes, la naturaleza de los tensioactivos y/o disolventes usados, y los tipos de dispositivo de procesamiento (por ejemplo, sonicador, microfluidizador, homogeneizador, etc.). En las patentes de Estados Unidos n.° 5.330.681 y 4.990.283 se describen ampliamente metodos para formar emulsiones con ciertas moleculas de PFPE. Puede ser eficaz una fase continua de un compuesto polihidroxilado, tal como polialcoholes y sacaridos en una solucion acuosa concentrada. Los siguientes polialcoholes y sacaridos han resultado ser particularmente eficaces: glicerol, xilitol, manitol, sorbitol, glucosa, fructosa, sacarosa, maltitol, compuestos dimericos de glicerol (di- glicerol o bis(2,3-di-hidroxipropil) eter, compuestos polihidroxilados solubles en agua solidos tales como azucares y productos de condensacion de glicerol como triglicerol y tetraglicerol. La dispersion en la emulsion puede realizarse en presencia de tensioactivos convencionales, incluyendo tensioactivos cationicos, anionicos, anfoteros y no ionicos. Los ejemplos de tensioactivos adecuados incluyen lauril sulfato sodico, sulfosuccinato (hemiester sulfosuccmico), coco-anfocarboxiglicinato, cetil fosfato potasico, alquil polioxietileno-eter carboxilato sodico, cloruro de benzalconio

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potasico, alquil amidopropil betama, alcohol etoxilado cetil-esteanlico y monooleato de sorbitan-etoxilato (20), Tween 20. Aunque pueden usarse ecuaciones termodinamicas para intentar predecir mezclas de reactivos de formacion de imagenes que daran lugar a emulsiones que tienen los tamanos de gotas y la estabilidad deseados, generalmente se acepta que lo mas eficaz sera el ensayo real de diversas mezclas. La emulsificacion de mezclas es sencilla y rapida, permitiendo un rapido ensayo de una amplia serie de combinaciones para identificar las que dan lugar a emulsiones que son adecuadas para uso en los metodos desvelados en el presente documento.

En las aplicaciones que implican el marcaje ex vivo, se disenan emulsiones preferidas para facilitar la captacion del reactivo de formacion de imagenes por las celulas objeto. Un tensioactivo puede disenarse para formar emulsiones estables que lleven una gran cantidad de perfluoro-l5-corona-5 eter u oxido de PFPE en la fase acuosa. Ademas, puede tener propiedades que aumenten la liberacion intracelular de las gotas de la emulsion en el tiempo de incubacion mas corto posible. El aumento de la carga intracelular de perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE mejora la sensibilidad a las celulas marcadas. Ademas, la minimizacion del tiempo de cultivo puede ser importante cuando se trabaja con los cultivos celulares primarios. La eficacia de la captacion intracelular depende del tipo celular. Por ejemplo, los macrofagos y algunas celulas dendnticas captaran por endocitosis casi cualquier partfcula, mientras que otros tipos celulares de interes solo pueden ser debilmente fagocfticos. En cualquier caso, la eficacia de la captacion puede reforzarse sustancialmente al disenar el tensioactivo de forma que la superficie de la gota de la emulsion tenga propiedades que promuevan la captacion celular en cultivo (es decir, gotas de emulsion de “autoliberacion”) (vease Janjic et al, JACS, 2008, 130 (9), 2832 -2841 y la solicitud de patente provisional de Estados Unidos 61/062.710). La superficie de la gota de emulsion puede fabricarse de manera que tenga propiedades lipofilas, u opcionalmente cationicas, mediante un diseno de tensioactivo apropiado. Por ejemplo, el tensioactivo puede incorporar lfpidos, tales como lfpidos cationicos o neutros, emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas o liposomas, que tienden a unirse o a fusionarse con la superficie celular, aumentando de esta manera la captacion de la gota de emulsion. La superficie de la gota de emulsion tambien puede incorporar senales de liberacion de celulas tales como poliaminas. Los ejemplos incluyen emulsiones que tienen poliaminas, tales como polietilenimina o sulfato de protamina, incorporadas en la capa de tensioactivo de la gota de la emulsion durante el procesamiento.

En ciertas realizaciones, un sistema coloidal para uso como vehnculo de liberacion in vitro e in vivo es un liposoma (es decir, una vesfcula de membrana artificial). La preparacion y uso de dichos sistemas es bien conocido en la tecnica. Se describen lfpidos cationicos adecuados en lo siguiente: Feigner et al., 1987, PNAS 84, 7413-7417; Eppstein et al., patente de Estados Unidos n.° 4.897.355), (Rose, patente de Estados Unidos n.° 5.279.833; Eppand et al. patente de Estados Unidos n.° 5.283.185; Gebeyehu et al., patente de Estados Unidos n.° 5.334.761; Nantz et al., patente de Estados Unidos n.° 5.527.928; Bailey et al., patente de Estados Unidos n.° 5.552.155; Jesse, patente de Estados Unidos n.° 5.578.475). Otros enfoques incluyen la incorporacion en los peptidos tensioactivos (por ejemplo, oligo-Arg9 y peptidos de tipo TAT) que facilitan la entrada en las celulas, o anticuerpos que se dirigen a moleculas espedficas de la superficie celular. Ademas, en ciertas realizaciones, se pueden incorporar pequenas protemas cationicas en el tensioactivo, tales como sulfato de protamina, para aumentar la captacion celular. El sulfato de protamina es no toxico para las celulas y tiene la aprobacion de la FDA para uso en seres humanos como antagonista de heparina. En ciertas realizaciones, se usan sistemas de dispersion coloidales, tales como complejos de macromoleculas, nanocapsulas, microesferas y perlas. En el presente documento se describen otros enfoques para aumentar la captacion de los fluorocarburos emulsionados, tal como mediante el uso de agentes de transfeccion adicionales o mediante el uso de electroporacion de las celulas.

En realizaciones preferidas, las emulsiones tienen propiedades de “autoliberacion” sin tener que anadir reactivos potenciadores de la captacion. Dichas emulsiones preferentemente son estables y tienen una vida util de un periodo de meses o anos.

Se entiende que los tensioactivos y reactivos potenciadores de la captacion no deben considerarse grupos exclusivos y, en algunos casos, pueden superponerse.

3. Celulas y marcaje

Los metodos descritos en el presente documento pueden usarse con una amplia serie de celulas, incluyendo celulas tanto procariotas como eucariotas, y preferentemente celulas de mairnfero. Las tecnologfas para la preparacion de celulas incluyen cultivo celular, clonacion, transferencia nuclear, modificacion genetica y encapsulacion, donde la clonacion no incluye el proceso de clonacion de seres humanos.

Una lista parcial de celulas de mamffero adecuadas incluye: celulas sangumeas, mioblastos, celulas de medula osea, celulas de sangre periferica, celulas de sangre de cordon umbilical, cardiomiocitos (y precursores de los mismos), condrocitos (celulas de cartflago), celulas dendnticas, tejido neural fetal, fibroblastos, hepatocitos (celulas hepaticas), celulas de islotes del pancreas, queratinocitos (celulas de la piel) y celulas madre. En ciertas realizaciones preferidas, las celulas a usar son una poblacion fraccionada de celulas inmunitarias. Las subpoblaciones reconocidas de celulas inmunitarias incluyen los linfocitos, tales como linfocitos B (receptores Fc, MHC de clase II, CD19+, CD21+), linfocitos T hELer (CD3+, CD4+, CD8-), linfocitos T citolfticos (CD3+, CD4-, CD8+), celulas asesinas naturales (CD16+), los fagocitos mononucleares, incluyendo monocitos, neutrofilos y

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macrofagos, y celulas dendnticas. Otros tipos celulares que pueden ser de interes incluyen eosinofilos y basofilos.

Las celulas pueden ser autologas (es decir, proceder del mismo individuo) o singenicas (es decir, derivadas de un individuo geneticamente identico, tal como un hermano de camada singenico o un gemelo identico), aunque tambien se contemplan celulas alogenicas (es decir, celulas derivadas de un individuo geneticamente diferente de la misma especie). Aunque es menos preferido, tambien pueden administrarse celulas xenogenicas (es decir, derivadas de una especie diferente de la del receptor), tales como celulas de cerdos transgenicos. Cuando las celulas del donante son xenogenicas, se prefiere que las celulas se obtengan a partir de un individuo de una especie dentro del mismo orden, mas preferentemente la misma superfamilia o familia (por ejemplo, cuando el receptor es un ser humano, se prefiere que las celulas procedan de un primate, mas preferentemente un miembro de la superfamilia Hominoidea).

Cuando es medica y eticamente apropiado, las celulas pueden obtenerse de cualquier estadio del desarrollo del individuo donante, incluyendo un bebe (por ejemplo, desde el nacimiento hasta aproximadamente tres anos de edad en seres humanos), nino (por ejemplo, desde aproximadamente tres anos de edad a aproximadamente 13 anos de edad en seres humanos), adolescente (por ejemplo, de aproximadamente 13 anos de edad a aproximadamente 18 anos de edad en seres humanos), adulto joven (por ejemplo, de aproximadamente 18 anos de edad a

aproximadamente 35 anos de edad en seres humanos), adulto (de aproximadamente 35 anos de edad a

aproximadamente 55 anos de edad en seres humanos) o anciano (por ejemplo, de aproximadamente 55 anos o mas en seres humanos), donde las celulas no proceden de un embrion humano.

En muchas realizaciones, las celulas se marcan poniendo en contacto las celulas con una emulsion del reactivo de formacion de imagenes, de tal forma que el reactivo se capte por las celulas. Mediante dicho metodo pueden marcarse celulas tanto fagocfticas como no fagocfticas. Por ejemplo, como se demuestra en el documento WO2005072780, pueden marcarse tanto celulas dendnticas (fagocfticas) como celulas de gliosarcoma (no fagocfticas) poniendo en contacto las celulas con una emulsion del reactivo de formacion de imagenes.

En ciertos aspectos, un metodo de la invencion puede comprender marcar las celulas in vivo con un reactivo de

formacion de imagenes de 19F y detectar las celulas marcadas en el sujeto. Las celulas a marcar pueden

determinarse por propiedades espedficas de las celulas, tales como la actividad fagodtica. Las celulas que se marcan pueden controlarse por la via de administracion del reactivo de formacion de imagenes. Los tipos de celulas que se marcan pueden controlarse por la naturaleza del reactivo de formacion de imagenes. Por ejemplo, las suspensiones coloidales sencillas del reactivo de formacion de imagenes tenderan a captarse mas rapidamente por las celulas con actividad fagodtica. Como otro ejemplo, un reactivo de formacion de imagenes puede formularse o unirse covalentemente a un resto de direccion que facilita la direccion selectiva del reactivo de formacion de imagenes a una poblacion particular de celulas. En ciertas realizaciones, el reactivo de formacion de imagenes comprende perfluoro-15-corona eter.

En ciertas realizaciones, las celulas a marcar son celulas madre, donde las celulas madre no son celulas madre embrionarias humanas. Las terapias de celulas madre comunmente se usan como parte de un regimen ablativo para el tratamiento de canceres con radiacion de alta dosis y/o agentes quimioterapeuticos. Los regfmenes ablativos generalmente emplean celulas madre hematopoyeticas, o poblaciones de celulas que contienen celulas madre hematopoyeticas, como las que pueden obtenerse, por ejemplo, a partir de sangre periferica, sangre de cordon umbilical o medula osea. Las celulas de este tipo, o una parte de las mismas, pueden marcarse y rastrearse in vivo para supervisar la supervivencia y el injerto en la localizacion apropiada. Cada vez son mas atractivos otros tipos de celulas madre como agentes terapeuticos para una amplia diversidad de trastornos.

Como ejemplo, las celulas pueden ser celulas madre embrionarias de raton, o celulas ES de otro animal modelo. El marcaje de dichas celulas puede ser util para rastrear el destino de dichas celulas administradas a ratones, opcionalmente como parte de un programa de investigacion preclrnica para el desarrollo de terapias con celulas madre embrionarias. Los ejemplos de celulas madre embrionarias de raton incluyen: la lrnea celular JM1 ES descrita en M. Qiu et al., Genes Dev 9, 2523 (1995) y la lrnea ROSA descrita en G. Friedrich, P. Soriano, Genes Dev 5, 1513 (1991), y las celulas ES de raton descritas en la patente de Estados Unidos n.° 6.190.910. Estan disponibles muchas otras lmeas ES de raton en Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine). Los ejemplos de celulas madre embrionarias humanas tambien descritas en el presente documento incluyen las adquiribles a traves de los siguientes proveedores: Arcos Bioscience, Inc., Foster City, California, CyThera, Inc., San Diego, California, BresaGen, Inc., Athens, Georgia, ES Cell International, Melbourne, Australia, Geron Corporation, Menlo Park, California, Goteborg University, Goteborg, Suecia, Karolinska Institute, Estocolmo, Suecia, Maria Biotech Co. Ltd. - Maria Infertility Hospital Medical Institute, Seul, Korea, MizMedi Hospital - Seoul National University, Seul, Korea, National Centre for Biological Sciences/ Tata Institute de Fundamental Research, Bangalore, India, Pochon CHA University, Seul, Korea, Reliance Life Sciences, Mumbai, India, ReNeuron, Surrey, Reino Unido, StemCells, Inc., Palo Alto, California, Technion University, Haifa, Israel, University of California, San Francisco, California, y Wisconsin Alumni Research Foundation, Madison, Wisconsin. Ademas, se describen ejemplos de celulas madre embrionarias en las siguientes patentes de Estados Unidos y solicitudes de patente publicadas: 6.245.566; 6.200.806; 6.090.622; 6.331.406; 6.090.622; 5.843.780; 20020045259; 20020068045. Ademas, las celulas ES humanas tambien descritas en el presente documento pueden seleccionarse de la lista de lmeas celulares aprobadas proporcionada por los institutos nacionales de la salud y accesibles en
http://escr.nih.gov. Ademas, puede seleccionarse una lrnea de celulas madre

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embrionaria que tambien se describe en el presente documento del grupo que comprende: la lmea WA09 obtenida del Dr. J. Thomson (Univ. de Wisconsin) y las lmeas UC01 y UC06, ambas en el registro NIH actual.

En ciertas realizaciones, una celula madre para uso en los metodos desvelados es una celula madre de origen neural o neuroendocrino, tal como una celula madre del sistema nervioso central (veanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 6.468.794; 6.040.180; 5.753.506; 5.766.948), el bulbo olfatorio o tejidos neurales perifericos (veanse, por ejemplo, las solicitudes de patente de Estados Unidos publicadas 20030003574; 20020123143; 20020016002 y Gritti et al. 2002 J Neurosci 22(2):437-45), la medula espinal (veanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 6.361.996, 5.851.832) o un linaje neuroendocrino, tal como la glandula suprarrenal, glandula pituitaria o ciertas partes del intestino (vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 6.171.610, y celulas PC12 como se describe en Kimura et al. 1994 J. Biol. Chem. 269: 18961-67). En realizaciones preferidas, se obtiene una celula madre neural de un tejido periferico o un tejido que cicatriza facilmente, proporcionando de esta manera una poblacion autologa de celulas para el trasplante.

En ciertos metodos desvelados pueden emplearse celulas madre hematopoyeticas o mesenquimaticas. Los estudios recientes sugieren que las celulas hematopoyeticas derivadas de medula osea (HSC) y las celulas madre mesenquimaticas (MSC), que se afslan facilmente, tienen un potencial de diferenciacion mas amplio que el que se ha reconocido previamente. Las HSC purificadas no solo dan lugar a todas las celulas de la sangre, sino que tambien pueden desarrollarse en celulas normalmente procedentes del endodermo, como hepatocitos (Krause et al., 2001, Cell 105: 369-77; Lagasse et al., 2000 Nat Med 6: 1229-34). De forma similar, es de esperar que las HSC de sangre periferica y de sangre de cordon umbilical proporcionen un espectro util de potencial de desarrollo. Las MSC parecen ser similarmente multipotentes, produciendo una descendencia que, por ejemplo, puede expresar marcadores de celulas neurales (Pittenger et al., 1999 Science 284: 143-7; Zhao et al., 2002 Exp Neurol 174: 11-20). Los ejemplos de celulas madre hematopoyeticas incluyen los descritos en las patentes de Estados Unidos n.° 4.714.680; 5.061.620; 5.437.994; 5.914.108; 5.925.567; 5.763.197; 5.750.397; 5.716.827; 5.643.741; 5.061.620. Los ejemplos de celulas madre mesenquimaticas incluyen los descritos en las patentes de Estados Unidos n.° 5.486.359; 5.827.735; 5.942.225; 5.972.703, los descritos en las publicaciones PCT n.° WO 00/53795; WO 00/02654; WO 98/20907, y los descritos en Pittenger et al. y Zhao et al., supra.

Las lmeas de celulas madre preferentemente proceden de mairnferos, tales como roedores (por ejemplo, raton o rata), primates (por ejemplo, monos, chimpances o seres humanos), cerdos y rumiantes (por ejemplo, vacas, ovejas y cabras) y particularmente de seres humanos, donde la lmea de celulas madre no procede de celulas madre embrionarias humanas. En ciertas realizaciones, las celulas madre proceden de una fuente autologa o una fuente compatible con el tipo HLA. Por ejemplo, pueden obtenerse celulas madre de un sujeto que necesita celulas productoras de hormonas pancreaticas (por ejemplo, pacientes diabeticos que necesitan celulas productoras de insulina) y cultivarse para generar celulas productoras de insulina autologas. Otras fuentes de celulas madre se obtienen facilmente a partir de un sujeto, tales como celulas madre de tejido muscular, celulas madre de la piel (dermis o epidermis) y celulas madre de la grasa.

En algunas realizaciones preferidas, las celulas para administracion a un ser humano deben cumplir las directrices de las buenas practicas con tejidos establecidas por la administracion de alimentos y medicamentos de los Estados Unidos (FDA) o una agencia reguladora equivalente en otro pafs. Los metodos para desarrollar dicha lmea celular pueden incluir pruebas en donantes, y medios para evitar la exposicion a celulas y productos no humanos.

Las celulas derivadas de un donante (opcionalmente el paciente es el donante) pueden administrarse como celulas fraccionadas o no fraccionadas, segun lo dicte el objetivo de las celulas a administrar. Las celulas pueden fraccionarse para enriquecerse en ciertos tipos celulares antes de la administracion. Los metodos de fraccionamiento son bien conocidos en la tecnica y, generalmente, implican tanto seleccion positiva (es decir, retencion de celulas basandose en una propiedad particular) como seleccion negativa (es decir, eliminacion de celulas basandose en una propiedad particular). Como sera evidente para un experto en la materia, las propiedades particulares (por ejemplo, marcadores de superficie) que se usan para la seleccion positiva y negativa dependeran de la poblacion deseada de celulas. Los metodos usados para la seleccion/enriquecimiento de celulas pueden incluir tecnoiogfa de inmunoafinidad o metodo de centrifugacion por densidad. La tecnologfa de inmunoafinidad puede adquirir una diversidad de formas, como es bien conocido en la tecnica, pero generalmente utiliza un anticuerpo o derivado de anticuerpo en combinacion con algun tipo de tecnologfa de segregacion. La tecnologfa de segregacion generalmente da como resultado la segregacion ffsica de celulas unidas por el anticuerpo y celulas no unidas por el anticuerpo, aunque en algunos casos la tecnologfa de segregacion que destruye las celulas unidas por el anticuerpo puede usarse para una seleccion negativa.

Para la seleccion/enriquecimiento de las celulas seleccionadas a usar puede utilizarse cualquier tecnologfa de inmunoafinidad adecuada, incluyendo clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS), panning, separacion inmunomagnetica, cromatograffa de inmunoafinidad, fijacion del complemento mediada por anticuerpos, inmunotoxina, segregacion en gradiente de densidad y similares. Despues del procesamiento en el proceso de inmunoafinidad, las celulas deseadas (las celulas unidas por el reactivo de inmunoafinidad en el caso de seleccion positiva, y las celulas no unidas por el reactivo de inmunoafinidad en el caso de seleccion negativa) se recogen y se someten a rondas adicionales de seleccion de inmunoafinidad/enriquecimiento, o se reservan para la administracion

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al paciente.

La seleccion de inmunoafinidad/enriquecimiento tipicamente se realiza incubando una preparacion de celulas que comprende el tipo celular deseado con un anticuerpo o reactivo de afinidad derivado de anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo espedfico para un marcador de superficie dado), utilizando despues el reactivo de afinidad unido para seleccionar para o contra las celulas a las que se une el anticuerpo. El proceso de seleccion generalmente implica una separacion ffsica, tal como la que puede conseguirse dirigiendo gotas que contienen celulas individuales al interior de diferentes recipientes dependiendo de la presencia o ausencia de los reactivos de afinidad unidos (FACS), utilizando un anticuerpo unido (directa o indirectamente) a un sustrato en fase solida (panning, cromatograffa de inmunoafinidad), o utilizando un campo magnetico para recoger las celulas que se unen a gotas magneticas a traves del reactivo de afinidad (separacion inmunomagnetica). Como alternativa, las celulas indeseables pueden eliminarse de la preparacion usando un reactivo de afinidad que dirige un ataque citotoxico a las celulas unidas por el reactivo de afinidad. El ataque citotoxico puede activarse por el reactivo de afinidad (por ejemplo, fijacion del complemento) o puede localizarse en las celulas diana por el reactivo de afinidad (por ejemplo, inmunotoxina, tal como cadena B de ricina).

Aunque es de esperar que los metodos desvelados en el presente documento se usen frecuentemente para la supervision de celulas in vivo, debe indicarse que las metodologfas son igualmente eficaces para la supervision de celulas en cultivo, en una muestra de tejido u otro material celular ex vivo. Para los usos terapeuticos, las celulas pueden marcarse en una etapa deseada durante la preparacion para la administracion al paciente.

Pueden usarse una diversidad de metodos para marcar las celulas con un reactivo de formacion de imagenes. En general, las celulas se pondran en contacto con el reactivo de formacion de imagenes de tal forma que el reactivo de formacion de imagenes se asocie con la celula. Las condiciones con frecuencia seran condiciones de cultivo celular convencionales disenadas para mantener la viabilidad celular. El termino “asociado” pretende incluir cualquier manera por la que el reactivo de formacion de imagenes y la celula se mantengan en una proximidad ffsica suficiente durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que el reactivo de formacion de imagenes proporcione informacion util sobre la posicion de la celula, ya sea in vivo o in vitro. El reactivo de formacion de imagenes puede localizarse intracelularmente, por ejemplo, despues de fagocitosis o de la entrada mediada por un tensioactivo en la celula. Las celulas inmunitarias, tales como celulas dendnticas, macrofagos y celulas T con frecuencia son altamente fagodticas y los datos presentados en el presente documento y en otros estudios demuestran que dichas celulas, y otros tipos de celulas fagodticas, se marcan facilmente. Tambien pueden marcarse otros tipos celulares, tales como celulas madre, independientemente de la actividad fagodtica. El reactivo de formacion de imagenes puede insertarse en una membrana celular o unirse de forma covalente o no covalente con un componente extracelular de la celula. Por ejemplo, ciertos fluorocarburos lineales descritos en el presente documento pueden derivatizarse para unirse a uno o mas restos de direccion. Un resto de direccion se seleccionara para facilitar la asociacion de tejido de formacion de imagenes con la celula a marcar. Un resto de direccion puede disenarse para causar la insercion no espedfica del fluorocarburo en una membrana celular (por ejemplo, una secuencia de aminoacidos hidrofoba u otro resto hidrofobo tal como un resto de palmitoflo o un resto de miristoMo) o para facilitar la entrada no espedfica en la celula. Un resto de direccion puede unirse a un componente de la superficie celular, como ocurre en el caso de ligandos receptores. Un resto de direccion puede ser un miembro de un par de union espedfico, donde el companero de union es un componente de la superficie celular. El resto de direccion puede ser, por ejemplo, un ligando para un receptor, o un anticuerpo, tal como un anticuerpo monoclonal o policlonal o cualquiera de los diversos agentes de union polipeptfdicos que comprenden una parte variable de una inmunoglobulina (por ejemplo, fragmento Fv, fragmento Fv monocatenario (scFv), fragmento Fab', fragmento F(ab')2, anticuerpo de un solo dominio, anticuerpo camelizado, anticuerpo humanizado, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos). En ciertas realizaciones, el reactivo de formacion de imagenes de fluorocarburo comprende perfluoro- 15-corona eter.

El marcaje celular con emulsiones de fluorocarburos tambien puede facilitarse usando agentes de transfeccion para ayudar a la liberacion celular. Con frecuencia, los agentes de transfeccion consisten en lfpidos cationicos, liposomas cationicos, policationes y similares. El agente de transfeccion se premezcla con el agente de marcaje de emulsion de fluorocarburo, con lo que se asocia con, o recubre, las gotas de emulsion. Las gotas de emulsion tratadas con agente de transfeccion despues se anaden a las celulas cultivadas y se incuban de forma que las celulas se marcan. Los agentes de transfeccion comunes incluyen Lipofectamine (Invitrogen, Inc) FuGene, DOTAP (Roche Diagnostics, Inc.) y poli-L-lisina. Tambien pueden usarse protemas pequenas como agentes de transfeccion, tales como muchos tipos de protaminas. Las protaminas, las protemas de union al ADN principales en el nucleo del esperma en la mayona de los vertebrados, empaquetan el ADN en un volumen menor del 5 % de un nucleo de celula somatica. Las protaminas son protemas sencillas de bajo peso molecular que son ricas en arginina y fuertemente basicas. Las protaminas disponibles en el mercado proceden el esperma de salmon y ciertas especies distintas de peces. El termino “protamina”, como se usa en el presente documento, se refiere a un polipeptido rico en arginina, cationico y de bajo peso molecular. La molecula de protamina tfpicamente comprende de aproximadamente 20 a aproximadamente 200 aminoacidos y generalmente se caracteriza por contener al menos un 20 %, 50 % o 70 % de arginina.

Las protaminas con frecuencia se formulan como sales, con uno o mas contraiones tales como sulfato, fosfato y

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cloruro.

Los datos proporcionados en esta solicitud muestran que las protaminas (por ejemplo, el sulfato de protamina) son muy eficaces en la liberacion de gotas de emulsion de fluorocarburo PFpE en celulas cultivadas. Los sulfatos de protamina adecuados pueden proceder de una diversidad de fuentes (por ejemplo, salmon, arenque, trucha, etc.) y ser de diversos calidades y formas (por ejemplo, USP, calidades II, III, X, etc.), con y sin histonas o cualquier derivado recombinante. Los ejemplos de otras soluciones de protamina que pueden usarse como agentes de transfeccion incluyen fosfato de protamina, cloruro de protamina, sulfato-2 de protamina, sulfato-3 de protamina, sulfato-10 de protamina y base libre de protamina.

Los datos proporcionados en esta solicitud muestran nanoemulsiones autoliberables preparadas con reactivos de formacion de imagenes de fluorocarburo (por ejemplo, perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE) e incorporan un tensioactivo Pluronic™, opcionalmente con sulfato de protamina, o Cremophor® EL con un emulsionante y un aditivo. La simple co-incubacion de las celulas con ciertas nanoemulsiones autoliberables proporciona un marcaje celular suficiente para la formacion de imagenes, sin necesidad de reactivos de transfeccion.

Cuando las celulas se van a usar en un regimen terapeutico, se han usado diversos metodos para liberar las celulas, incluyendo inyecciones y el uso de dispositivos especiales para implantar celulas en diversos organos. La presente invencion no se restringe a ningun metodo de liberacion particular. Las celulas marcadas pueden supervisarse independientemente de si las celulas se liberan directamente en un sitio particular o se liberan sistemicamente. Por ejemplo, se obtuvieron imagenes de forma satisfactoria de CD marcadas despues de una implantacion focal directamente en tejidos o una inyeccion intravenosa, y se obtuvieron imagenes de las celulas T despues de la inyeccion intraperitoneal. Las celulas pueden insertarse en un dispositivo de liberacion que facilita la introduccion por inyeccion o implantacion en los sujetos. Dichos dispositivos de liberacion pueden incluir tubos, por ejemplo, cateteres, para inyectar las celulas y fluidos en el cuerpo de un sujeto receptor. En una realizacion preferida, los tubos ademas tienen una aguja, por ejemplo, una jeringa, a traves de la cual las celulas de la divulgacion pueden introducirse en el sujeto en una localizacion deseada. Las celulas pueden prepararse para la liberacion en una diversidad de formas diferentes. Por ejemplo, las celulas pueden suspenderse en una solucion o gel o incluirse en una matriz de soporte cuando estan contenidas en dicho dispositivo de liberacion. Las celulas pueden mezclarse con un vehnculo o diluyente farmaceuticamente aceptable en el que las celulas de la divulgacion siguen siendo viables. Los vehnculos y diluyentes farmaceuticamente aceptables incluyen solucion salina, soluciones tampon acuoso, disolventes y/o medios de dispersion. El uso de dichos vehnculos y diluyentes es bien conocido en la tecnica. La solucion es preferentemente esteril y fluida. Preferentemente, la solucion es estable en las condiciones de fabricacion y almacenamiento y esta conservada frente a la accion contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos mediante el uso de, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido ascorbico, timerosal y similares. Las soluciones de la divulgacion pueden prepararse incorporando celulas como se describe en el presente documento en un vehnculo o diluyente farmaceuticamente aceptable y, cuando se requiera, otros ingredientes enumerados anteriormente, seguido de esterilizacion por filtracion.

4. Tecnicas de resonancia magnetica nuclear

Como se describe en el presente documento, pueden usarse tecnicas de resonancia magnetica nuclear para detectar poblaciones de celulas marcadas. El termino “detectar” se usa para incluir cualquier esfuerzo para determinar la presencia o ausencia de una molecula o celula marcada, particularmente por una tecnica de resonancia magnetica nuclear. El termino “detectar” tambien pretende incluir mediciones mas sofisticadas, incluyendo mediciones cuantitativas y la generacion de imagenes bi- o tridimensionales. Por ejemplo, puede usarse IRM para generar imagenes de dichas celulas. En muchos casos, las celulas marcadas pueden administrarse a un sujeto vivo. Despues de la administracion de las celulas, puede examinarse alguna parte del sujeto, o el sujeto entero, por IRM para generar un conjunto de datos de IRM. En otros casos, la emulsion se inyecta directamente por via iv y, posteriormente, se toman imagenes del sujeto en uno o mas puntos de tiempo. Se pretende que una “serie de datos”, segun se usa el termino en el presente documento, incluya datos de partida reunidos durante el sondeo de resonancia magnetica del material objeto, los parametros de adquisicion, asf como la informacion procesada, transformada o extrafda de los datos de partida. Los datos de partida incluyen senales transitorias obtenidas por IRM/SRM, incluyendo la cafda libre de la induccion, los ecos de espm, los ecos estimulados y/o ecos de gradiente. Los ejemplos de informacion procesada incluyen representaciones graficas bidimensionales o tridimensionales del material objeto. La informacion procesada tambien puede incluir imagenes de magnitud, los componentes de imagenes reales e imaginarias, asf como las imagenes de mapa de fases asociadas. Otro ejemplo de informacion extrafda es una puntuacion que representa la cantidad o concentracion de reactivo de formacion de imagenes o senal de 19F en el material objeto. Mediante el uso de la cantidad de senal de 19F en el material objeto, y una calibracion de la cantidad media de reactivo de formacion de imagenes por celula antes de la implantacion (en el caso del marcaje ex vivo), se puede estimar el numero absoluto de celulas en el material objeto. La cantidad de senal de 19F presente en un material objeto puede representarse o calcularse de muchas formas; por ejemplo, puede medirse la relacion media entre senal y ruido (SNR) de la senal de 19F para una region de interes (ROI) y usarse para calcular la abundancia de celulas marcadas. En ciertas realizaciones, la intensidad media, o sumatorio en

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forma de pixel o voxel de la senal de F puede usarse para calcular la abundancia de celulas marcadas. Este tipo de datos puede reunirse en una sola region del sujeto tal como, por ejemplo, el bazo u otro organo de importancia

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particular para las celulas marcadas. Las celulas marcadas pueden examinarse en contextos distintos que en el sujeto. Puede ser deseable examinar las celulas marcadas en cultivo. En ciertas realizaciones, las celulas marcadas pueden aplicarse o generarse dentro de una muestra de tejido o cultivo tisular y, por lo tanto, pueden obtenerse imagenes de las celulas marcadas tambien en esos contextos. Por ejemplo, un organo, tejido u otro material celular a trasplantar puede ponerse en contacto con un reactivo de formacion de imagenes para generar celulas marcadas antes de la implantacion de dicho trasplante en un sujeto.

En general, los agentes de marcaje de la divulgacion se disenan para uso en sistemas de deteccion IRM convencionales. En la realizacion mas comun de IRM, se observa el nucleo de hidrogeno (proton, 1H) en moleculas de agua movil contenidas en materiales objeto. Para detectar los marcadores desvelados en el presente documento, se detecta un nucleo alternativo, 19F. La IRM de 19F tiene una sensibilidad intrmseca solo ligeramente menor en comparacion con 1H; la sensibilidad relativa es de aproximadamente 0,83. Ambos tienen un espm nuclear de + 1/2. La abundancia isotopica natural de 19F es de un 100 %, que es comparable a un 99,985 % en el caso de 1H. Los principios ffsicos detras de la deteccion y formacion de imagenes son los mismos para la IRM tanto de 1H como de 19F. El material objeto se pone en un campo magnetico estatico grande. El campo tiende a alinear el momento magnetico asociado con los nucleos de 1H o 19F a lo largo de la direccion del campo. Los nucleos se alteran del equilibrio por radiacion de radiofrecuencia (RF) pulsatil a la frecuencia de Larmor, que es una frecuencia caractenstica proporcional a la fuerza del campo magnetico en el que los nucleos absorben energfa de forma resonante. Despues de retirar la RF, los nucleos inducen un voltaje transitorio en una antena receptora; este voltaje transitorio constituye la senal de resonancia magnetica nuclear (RMN). Tanto en la frecuencia como en la fase de la senal de RMN esta codificada informacion espacial mediante la aplicacion selectiva de gradientes de campo magnetico que se superponen sobre el campo estatico grande. Los voltajes transitorios generalmente se digitalizan, y despues estas senales pueden procesarse, por ejemplo, usando un ordenador para producir imagenes.

A una fuerza de campo magnetico constante, la frecuencia de Larmor de 19F es solo ligeramente menor (~6 %) en comparacion con 1H. De esta manera, es sencillo adaptar exploraciones convencionales de IRM, tanto en hardware como en software, para adquirir datos de 19F. La deteccion de 19F puede acoplarse con diferentes tipos de exploraciones de resonancia magnetica, tales como IRM, SRM u otras tecnicas. Tfpicamente, sera deseable obtener una imagen de IRM de 1H para comparar con la imagen de 19F. En un organismo vivo u otro tejido biologico, la IRM de proton proporcionara una imagen del material objeto y permitira definir el contexto anatomico de las celulas marcadas detectadas en la imagen de 19F. En una realizacion preferida de la divulgacion, se recogen datos tanto para 19F como para 1H durante la misma sesion; el objeto no se mueve durante estas adquisiciones para asegurar mejor que las dos series de datos estan en registro espacial. Normalmente, se adquieren series de datos de 19F y 1H secuencialmente, en cualquier orden. Puede construirse una bobina de RF (es decir, antena) que pueda sintonizarse electricamente a partir de la frecuencia de Larmor de 19F y 1H. La sintonizacion entre estas dos frecuencias puede realizarse manualmente (por ejemplo, a traves de un inductor o capacitor variable electromecanico), o electricamente, a traves de una circuitena electronica activa. Como alternativa, con las modificaciones apropiadas en el hardware y/o software del instrumento de IRM, las dos series de datos pueden adquirirse simultaneamente, por ejemplo, para conservar el tiempo de formacion de imagenes. La adquisicion simultanea de las series de datos de 19F y 1H requiere una bobina de RF o antena que pueda sintonizarse electricamente de forma simultanea a la frecuencia de Larmor de 19F y 1H (es decir, una bobina sintonizada doble). Como alternativa, la bobina de RF puede ser de “banda amplia”, con una resonancia electrica sintonizada ampliamente que cubre las dos frecuencias de Larmor (es decir, 19F y H). Otras tecnicas de formacion de imagenes, tales como deteccion de fluorescencia, pueden acoplarse con IRM de 19F. Esto sera particularmente deseable cuando un reactivo de formacion de imagenes de fluorocarburo se ha modificado con un resto fluorescente. En otras realizaciones, la exploracion de MRI de 19F puede combinarse con una exploracion PET en el mismo sujeto o paciente mediante el uso de reactivos de marcaje de fluorocarburo 18F/19F radiactivos en modelo dual como se describe en el presente documento.

El examen de IRM puede realizarse de acuerdo con cualquier metodologfa adecuada conocida en la tecnica. Durante los anos se han desarrollado muchos tipos diferentes de secuencias de pulsos de IRM, o el conjunto de instrucciones usadas por el aparato de IRM para organizar la recogida de datos, y tecnicas de procesamiento de senales (por ejemplo, transformada de Fourier y reconstruccion de proyeccion), para recoger y procesar los datos de las imagenes (por ejemplo, vease Magnetic Resonance Imaging, Tercera Edicion, editores D. D. Stark y W. G. Bradley, Mosby, Inc., St. Louis MO 1999). Los reactivos y metodos de esta divulgacion no se restringen a ningun metodo de procesamiento o secuencia de pulsos de imagenes particular de las senales de RMN de partida. Por ejemplo, los metodos de IRM que pueden aplicarse a esta divulgacion incluyen en sentido amplio eco de espm, eco simulado, eco de gradiente, imagenes basadas en cafda libre de la induccion y cualquier combinacion de las mismas. Las tecnicas de obtencion de imagenes rapidas, en las que se adquiere mas de una lmea en el espacio k o segment°S9 grandes| de espacio k a partir de cada senal excitada, tambien son muy adecuadas para adquirir los datos de F (o de H). Los ejemplos de tecnicas de formacion de imagenes rapidas incluyen enfoques de eco de espm rapidos (por ejemplo, FSE, turbo SE, TSE, RARE o HASTE), formacion de imagenes ecoplanares (EPI), tecnicas de eco de gradiente y eco de espm combinadas (por ejemplo, GRASE), imagenes en espiral e imagenes en rafaga. El desarrollo de secuencias de pulsos y metodos de procesamiento de senales nuevos y mejorados es un campo que evoluciona continuamente, y las personas expertas en la materia pueden encontrar multiples formas para obtener imagenes de las celulas marcadas con 19F en su contexto anatomico.

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Como otro ejemplo de tecnica de resonancia magnetica nuclear, la SRM puede usarse para detectar la presencia de celulas marcadas con fluorocarburo en tejidos u organos localizados. Normalmente, los metodos de SRM se realizan en un escaner de IRM convencional. Con frecuencia, el volumen de interes (VOI) localizado se define dentro de una

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exploracion de IRM de H anatomica convencional. Posteriormente, la magnitud de la senal de RMN de F observada dentro del VOI se relaciona directamente con el numero de celulas marcadas, y/o la concentracion media de PFPE por celula presente en el tejido u organo. Los metodos para aislar un VOI dentro de un sujeto mas grande son bien conocidos en la tecnica (por ejemplo, Magnetic Resonance Imaging, Tercera Edicion, Capttulo 9, Editores D. D. Stark y W. G. Bradley, Mosby, Inc., St. Louis MO 1999). Los ejemplos incluyen el uso de una bobina de superficie de RF localizada cerca del VOI, spoiling de superficie, metodos de gradiente Bi de bobina de superficie, tecnicas de gradiente Bo con seleccion de rodajas, STEAM, PRESS, espectroscopia in vivo guiada por la imagen (ISIS) y formacion de imagenes por espectroscopia de resonancia magnetica (MRSI). El desarrollo de secuencias de pulsos y metodos de procesamiento de senales nuevos y mejorados esta evolucionando continuamente para la SRM, y los expertos en la materia pueden encontrar multiples formas para detectar las senales de RMN de 19F que proceden de las celulas marcadas con fluorocarburo en vOi.

En ciertos casos, el material objeto es un especimen de tejido fijado o conservado de otra manera que se ha obtenido por biopsia o necropsia a partir del animal o ser humano. El material objeto despues se somete a RMN de 19F en estado lfquido, uni- o multidimensional, de alta resolucion, convencional para determinar la cantidad de fluor presente en la muestra. El contenido de fluor se relaciona directamente con el numero de celulas marcadas en el especimen de material objeto. En el caso del marcaje in situ de fagocitos residentes (por ejemplo, monocitos, macrofagos, neutrofilos y celulas del Idgado) con la emulsion de fluor como se ha descrito anteriormente (por ejemplo, usando nanoemulsion 3), la cantidad de 19F medida en la muestra es directamente proporcional al numero de estos fagocitos presentes en el tejido. De esta manera se puede ensayar la cantidad relativa de inflamacion en los tejidos intactos sin tener que usar histologfa o cualquier otra tecnica destructiva y engorrosa. En ciertas realizaciones, para analizar el contenido de 19F del tejido, se usa RMN de 19F de una dimension. En ciertas realizaciones, se anadira un compuesto de referencia de 19F a la muestra de un numero conocido de espines de 19F que tiene un desplazamiento qrnmico que es diferente del de la composicion de la emulsion de marcaje de celulas (vease mas adelante). En ciertas realizaciones, las areas relativas integradas bajo el pico de emulsion y el pico de referencia pueden usarse para calcular el numero absoluto de atomos de fluor presentes en la muestra de tejido. En ciertas realizaciones, el peso de la muestra de tejido tambien se puede incorporar en este calculo para eXtraer la densidad media de fluor de la muestra de tejido, y este parametro puede considerarse un mdice cuantitativo de inflamacion o “mdice de inflamacion”.

En el presente documento tambien se describe un metodo para cuantificar los numeros de celulas marcadas in vivo o en materiales del sujeto dentro de un ROI. Un ROI puede incluir todas las celulas marcadas en un sujeto o celulas marcadas en organos espedficos tales como el pancreas, tejidos espedficos tales como ganglios linfaticos o cualquier region de uno o mas voxeles que muestran una senal IRM/SRM de 19F detectable. Un ROI puede ser un area no definida de otra manera mas alla de un experimento particular. Hay varias formas en que las celulas marcadas pueden cuantificarse en los materiales objeto o in vivo, como se describe en el presente documento.

En el caso del marcaje ex vivo, la calibracion de la “dosis celular” media del agente de marcaje de 19F antes de la implantacion de una poblacion celular particular con frecuencia es un prerrequisito para determinaciones celulares cuantitativas en materiales objeto o en el paciente. Es de esperar que diferentes tipos celulares tengan diferentes capacidades innatas de captar los agentes de marcaje in vitro y, por lo tanto, tambien variara la dosis celular del agente de marcaje. Ademas, diferentes celulas del mismo tipo adquiridas de diferentes fuentes (por ejemplo, diferentes pacientes) pueden tener diferentes afinidades por el agente de marcaje. De esta manera, puede requerirse una calibracion de la dosis celular. Esta calibracion puede usarse, inicialmente, para modificar el protocolo de marcaje (es decir, las condiciones de incubacion, la duracion del tiempo durante el que las celulas se incuban con emulsion de fluorocarburo de marcaje, concentracion de emulsion de fluorocarburo en medio de cultivo durante el marcaje, etc.) para conseguir un cierto intervalo de dosis celulares antes de que las celulas marcadas se usen realmente en un sujeto del que se van a obtener imagenes. Como alternativa, se pueden fijar las condiciones y el protocolo de marcaje y medir el valor medio de 19F marcado por celula, tal cual, para la posterior cuantificacion en el sujeto del que se desean obtener imagenes. En ciertas realizaciones, el numero medio de moleculas de 19F (F) por celula de una poblacion de celulas marcadas se mide (es decir, se calibra) in vitro antes de la administracion de las celulas al sujeto o paciente. En ciertas realizaciones, el numero medio de moleculas de 19F (F) por celula de una poblacion de celulas marcadas se calibra en una poblacion de ensayo de celulas de un tipo particular, no necesariamente destinada a un paciente, sino que se usa para calibrar la dosis celular del agente de marcaje como consecuencia de un protocolo de marcaje o conjunto de condiciones particular; opcionalmente, el valor de la dosis celular despues se usa para el marcaje futuro y experimentos de obtencion de imagenes in vivo en el mismo tipo de poblacion de celulas con el mismo protocolo de marcaje.

La dosis celular de agente de marcaje puede ensayarse in vitro usando una diversidad de tecnicas cuantitativas. Por ejemplo, se puede usar un espectro de RMN de 19F unidimensional (1D) obtenido a partir de un sedimento celular, suspension celular o lisado celular, de un numero conocido de celulas marcadas. A partir de este espectro, se puede calcular el area integrada del espectro de 19F o una parte del mismo, procedente del reactivo de marcaje asociado con las celulas. El area integrada del espectro de 19F, denominado Scelulas es directamente proporcional a la cantidad

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total de 19F en el sedimento, suspension o lisado celular. Para medir el numero absoluto de nucleos de 19F, las Sceiuias medidas pueden normalizarse a un patron de 19F. Un patron de 19F puede ser, por ejemplo, una solucion de un volumen y concentracion conocidos de un agente fluoroqmmico, donde se puede calcular el numero total de nucleos de 19F en el patron, denominado Fpatron. Una referencia adecuada del agente fluoroqmmico idealmente tiene un espectro sencillo de RMN de 19F, preferentemente con una sola resonancia estrecha (por ejemplo, acido trifluoroacetico o TFA) y, opcionalmente, un desplazamiento qmmico de 19F que es significativamente diferente del correspondiente al fluorocarburo de marcaje. El patron de 19F puede ponerse en el mismo tubo de RMN que el material de celula marcada a medir, en un tubo separado u, opcionalmente, puede medirse en otro experimento usando el mismo instrumento de RMN. Entonces puede medirse el area integrada del espectro procedente del patron de 19F, denominado Spatron. Posteriormente, puede calcularse el numero medio de 19F por celula marcada, denominado Fc, por ejemplo, usando la formula:

c

t—i ^ceiulas t-t

F c — *— fpatron patron

AL

donde Ncelulas es el numero de celulas marcadas contenidas en la muestra de ensayo in vitro. En la tecnica son bien conocidos metodos de RMN cuantitativos para 19F y otros nucleos, y los expertos pueden encontrar muchas variaciones del procedimiento de calibracion de dosis celular descrito anteriormente. Ademas de RMN de 19F, hay otros metodos cuantitativos que pueden usarse para ensayar la dosis celular del reactivo de marcaje. Por ejemplo, un reactivo puede marcarse con fluorescencia, luminiscencia, opticamente o radiactivamente (vease la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 1 2007-0258886).

De forma similar, en el caso del marcaje celular in situ de fagocitos circulantes despues de la inyeccion iv de una emulsion, para medir el marcaje celular eficaz, se puede extraer una parte de sangre periferica del sujeto y medir la carga celular eficaz de leucocitos usando los metodos descritos anteriormente. Ademas, puede usarse una o mas de las diversas tecnicas de enriquecimiento o clasificacion de celulas para clasificar celulas fagodticas (por ejemplo, macrofagos) antes de la medicion de la carga (anteriormente) para definir mejor que poblacion celular se ha marcado in situ. Despues puede usarse el parametro de marcaje celular medido para calcular el numero aparente de celulas inflamatorias presentes en el tejido usando los metodos de resonancia magnetica descritos en el presente documento.

Para extraer la cuantificacion precisa de celulas marcadas y/o la puntuacion de inflamacion relativa de los conjuntos de datos de IRM/SRM de 19F, pueden emplearse calibraciones y patrones adicionales. Por ejemplo, se puede usar una referencia de 19F externa calibrada (es decir, fantoma) durante la exploracion real de IRM/SRM de 19F del material objeto que contiene las celulas marcadas. Se usa la intensidad de imagen del fantoma calibrado, por ejemplo, cuando se analizan los conjuntos de datos de IRM/SRM de 19F para demostrar un patron absoluto para el numero de nucleos de 19F cuando se examina el material objeto o el paciente. El fantoma calibrado se usa para normalizar la sensibilidad del sistema de IRM/SRM particular que se ha cargado con un sujeto particular del que se desean obtener imagenes. La referencia de 19F puede ser, por ejemplo, uno o mas vasos que contienen una solucion de una concentracion conocida de nucleos de 19F. En realizaciones preferidas, la solucion contiene una concentracion diluida del reactivo de marcaje de fluorocarburo emulsionado. Opcionalmente, la solucion contiene reactivo de marcaje de fluorocarburo no emulsionado, un gel o lfquido, por ejemplo, que se ha diluido en un disolvente adecuado. Opcionalmente, la solucion puede estar compuesta por otro agente fluoroqmmico, idealmente con un espectro de RMN de 19F sencillo, preferentemente con una sola resonancia de RMN estrecha (por ejemplo, acido trifluoroacetico (TFA) o trifluoroacetamida (TFM) y otros acidos fluorados, trifluorotolueno o trifluoroetanol). En realizaciones preferidas, los valores de T1 y T2 de la solucion de referencia son similares a los del reactivo de marcaje. Opcionalmente, la solucion puede contener celulas marcadas con perfluorocarburo, o lisados de las mismas. La referencia no celular tiene la ventaja de mayores tiempos de almacenamiento. Opcionalmente, la solucion puede tomar la forma de un gel. El recipiente que contiene la solucion preferentemente se puede sellar y puede tomar una diversidad de geometnas; las geometnas de recipientes preferidas incluyen elipsoidal, cilrndrica, esferica y formas de tubos paralelos. Pueden usarse uno o mas recipientes que contienen solucion de referencia de

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F durante la IRM/SRM de F de la materia objeto. Si se usan multiples referencias de F (es decir, recipientes), pueden contener la misma concentracion de 19F o diferentes concentraciones y, en el caso de esto ultimo, idealmente contienen concentraciones graduadas del agente fluoroqmmico. La colocacion del o de los recipientes de referencia de 19F calibrados puede ser preferentemente externa o al lado de u, opcionalmente, dentro del sujeto o paciente del que se desean obtener imagenes, antes de la adquisicion de los datos. En realizaciones preferidas, se obtienen imagenes de la referencia usando IRM de 19F a lo largo del sujeto en el mismo campo de vision (FOV) de la imagen. Opcionalmente, se adquieren los datos de SRM de 19F en la referencia de forma secuencial o en paralelo con el conjunto de datos del sujeto. Opcionalmente, pueden adquirirse datos de la referencia usando IRM/SRM adquiridas en una exploracion separada. Opcionalmente, la referencia externa no se explora junto con un sujeto en cada examen de IRM/SRM de 19F, sino que mas bien, se usan valores de la intensidad de la senal de 19F de referencia adquirida usando IRM/SRM a partir de una exploracion de un objeto comparable o un objeto simulado. En una exploracion dada de IRM/SRM de 19F, pueden extraerse muestras del patron de 19F calibrado por uno o mas voxeles. La intensidad de 19F observable producida por un voxel puede ser proporcional a la concentracion del agente fluoroqmmico en la solucion (o gel) y el volumen del voxel. Con frecuencia, en una exploracion de IRM de

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19F, el patron de referencia comprende muchos voxeles. Con frecuencia, se calcula la intensidad media de uno, varios o todos los voxeles en el patron de referencia. Opcionalmente, la intensidad media de la imagen se calcula sobre una ROI definida dentro de la imagen de 19F del patron de referencia. Opcionalmente, la geometna ffsica del recipiente de patron de referencia contribuye a definir la intensidad de la senal de 19F observada; por ejemplo, el o los compartimientos de volumen que contiene la solucion de referencia de 19F es mas pequeno que el volumen del voxel. En otras realizaciones, la referencia externa calibrada se basa en una solucion con una intensidad de senal de 1H de un miembro conocido de 1H detectable; en este caso, la sensibilidad de la senal de 19F en el material objeto es una referencia a un patron calibrado de 1H. Idealmente, la solucion o gel en la referencia calibrada de 1H (contenida en un recipiente como se ha descrito anteriormente) produce un espectro de RMN de 1H sencillo, preferentemente con una sola resonancia RMN estrecha (por ejemplo, H2O o mezclas de H2O-D2O). A diferencia de lo que ocurrina con un nucleo diferente, el uso de la referencia del patron de 1H es igual en muchos otros aspectos a lo que se ha descrito anteriormente para la referencia de 19F. Opcionalmente, el patron de referencia calibrado contiene cualquier otro nucleo activo de IRM/SRM. En algunas realizaciones, la referencia es un organo o tejido interno detectado a traves de IRM/SRM 1H, donde los datos pueden ser de partida o estar normalizados. En otras realizaciones, la referencia es un patron que no se explora con el sujeto, sino que se calibra por factores relevantes tales como el peso del paciente o el tamano de la cavidad corporal.

Mediante la combinacion o manipulacion por ordenador de dos o mas parametros clave a partir del conjunto de datos de IRM/SRM de 19F, se puede calcular el numero de celulas marcadas y/o la cantidad relativa de inflamacion presente en un ROI como se ha descrito en el presente documento. Por ejemplo, un conjunto clave de parametros puede incluir: (i) la dosis celular de agente de marcaje (es decir Fc) medida in vitro; (ii) el conjunto de datos de IRM/SRM de 19F in vivo tomados en el sujeto en uno o mas puntos de tiempo despues de la administracion de celulas marcadas; (iii) el volumen del voxel; (iv) el area de voxel en plano (es decir, el area del pixel de imagen); (v) opcionalmente, el conjunto de datos de IRM/SRM a partir del patron de referencia de 19F; (vi) opcionalmente, el ruido de Johnson medido de los datos de IRM/SRM de 19F en el material objeto; (vii) opcionalmente, la relacion entre senal y ruido (SNR) medida de uno o mas voxeles del conjunto de datos de IRM/SRM de 19F en el material objeto; (viii) opcionalmente, la SNR medida de uno o mas voxeles del conjunto de datos de IRM/SRM de 19F del patron de referencia; (ix) opcionalmente, los tiempos de relajacion de RMN de 19F (T1, T2 y T2*) del material objeto; (x), opcionalmente los tiempos de relajacion de RMN de 19F (T1, T2 y T2*) del patron de referencia (por ejemplo, vease Magnetic Resonance Imaging, Tercera Edicion, capttulo 4, editores D. D. Stark y W. G. Bradley, Mosby, Inc., St. Louis MO 1999). Los expertos en la materia pueden obtener otros parametros, combinaciones de los conjuntos anteriores o derivaciones de los mismos, particularmente a partir del conjunto de datos de IRM/SRM 19F, que pueden usarse para cuantificar el numero de celulas marcadas in situ. En ciertas realizaciones, el conjunto anterior de parametros clave puede usarse para obtener medidas cuantitativas o estadfsticas de la exactitud o confianza del numero medido de celulas marcadas.

Hay muchas formas de combinar los parametros clave (i-x, anteriores), cualquier subserie de estos o cualquiera de sus combinaciones o aproximaciones, para estimar el numero eficaz de celulas marcadas vistas por IRM de 19F en el material objeto, denominado Nc. Por ejemplo, se puede usar una ecuacion de la forma

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en la que: Nc = numero total de celulas marcadas en el ROI; [Fr] = concentracion de 19F en la solucion (o gel) de referencia de 19F calibrada; v = volumen de voxel; Ir = intensidad media de la referencia de 19F calibrada tomada con la exploracion de IRM/SRM, promediada sobre uno o mas voxel; Fc = dosis celular media de 19F del agente marcador medida in vitro; Nroi = numero de voxeles en la ROI que contiene celulas marcadas; Ic(i) = intensidad de imagen del io voxel en la ROI que contiene las celulas marcadas; i = mdice sin unidad para voxeles en la ROI que contiene celulas marcadas.

Tambien hay muchas formas de conseguir una aproximacion de Nc a partir del conjunto de datos de 19F. Por ejemplo, se podna usar la expresion

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Xc~^-[Fr-]v — Nros

en la que Icavg es la intensidad media de la ROI que contiene las celulas marcadas (es decir, la intensidad media de los voxeles de Nroi). Como otro ejemplo, se podna usar

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en la que Vc es el volumen total de la ROI que contiene las celulas marcadas. Como ejemplo adicional, se podna usar

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en la que Vr es el volumen eficaz de la referencia en la IRM/SRM 19F y Nr es el numero de nucleos de 19F en Vr. Observese que, en todas las formulas anteriores, las diversas intensidades (es decir, Ir, Icavg, Ic(i)) pueden normalizarse con respecto al ruido de la imagen y, de esta manera, las formulas anteriores pueden expresarse de forma equivalente en terminos de los valores de SNR apropiados para las regiones particulares. Por lo tanto, hay muchas formas de estimar el numero de celulas marcadas, Nc, y muchas formas similares de estas expresiones basicas pueden obtenerse por manipulaciones matematicas basicas, sin embargo, todas se basan en el mismo contenido basico contenido dentro de los parametros de entrada descritos por (i-x). Ademas, no es necesario expresar la cuantificacion de las celulas marcadas en una ROI en terminos de numeros absolutos o numeros de celulas eficaces. Pueden obtenerse otros indices cuantitativos que sean indicativos de la cantidad de celulas en una ROI. Por ejemplo, se puede calcular la relacion Icavg/lR, o la relacion de valores de SNR medios observados en la ROI y la referencia; todos estos caen dentro de subconjuntos de los parametros y/o las expresiones anteriores.

Debe indicarse que el analisis anterior del numero de celulas e indices relacionados supone que los tiempos de relajacion de RMN de 19F (es decir, particularmente T1 y/o T2) del marcador de fluorocarburo es aproximadamente igual que el material en el patron de referencia de 19F calibrado. En caso de que los tiempos de relajacion no sean comparables, un experto en la materia puede corregir facilmente esto empleando las ecuaciones de intensidad de IRM conocidas del protocolo particular de formacion de imagenes que se use, expresado en terminos de T1 y T2.

Opcionalmente, el conjunto de datos de IRM de 19F del material objeto puede someterse a un procesamiento posterior antes de realizar el calculo real de cuantificacion celular (como se ha descrito anteriormente). Por ejemplo, los algoritmos de procesamiento posterior pueden incluir la “eliminacion del ruido” del conjunto de datos de 19F. Esto puede conseguirse, por ejemplo, mediante la umbralizacion de la imagen para quitar el ruido de baja intensidad; esto implica el reajuste de la intensidad de la imagen de forma que los valores bajos se fijen a cero. En imagenes de IRM de magnitud, con frecuencia aparece ruido de Johnson aleatorio y se distribuye uniformemente a traves del FOV de la imagen. Es bien conocido en la tecnica que se puede fijar un umbral de la intensidad de imagen de bajo nivel de forma que las regiones que se sabe que no contienen una senal verdadera (es decir, carecen de nucleos de 19F y/o 1H) parecen tener una intensidad nula o casi nula. Este proceso puede realizarse de una forma ad hoc (es decir, “manualmente” o por inspeccion visual) o mediante el uso de un algoritmo informatico. En otras realizaciones, la eliminacion del ruido del conjunto de datos puede conseguirse usando otros algoritmos, por ejemplo, usando analisis wavelet, y en la tecnica se conocen muchos metodos para la eliminacion del ruido de las imagenes: Khare, A., et al., INTERNATIONAL JOURNAL OF WAVELETS MULTIRESOLUTION AND INFORMATION PROCESSING, 3 (4): 477496 DEC 2005; Cruz-Enriquez, H., et al., IMAGE ANALYSIS AND RECOGNITION, 3656: 247-254 2005; Awate, SP., et al., INFORMATION PROCESSING IN MEDICAL IMAGING, PROCEEDINGS, 3565: 677-688 2005; Ganesan, R., et al., IIE TRANSACTIONS, 36 (9): 787-806 SEP 2004; Scheunders, P., IEEE TRANSACTIONS ON IMAGE PROCESSING, 13 (4): 475-483 APR 2004; Ghugre, NR., MAGNETIC RESONANCE IMAGING, 21 (8): 913-921 OCT 2003; Bao, P., et al., IEEE TRANSACTIONS ON MEDICAL IMAGING, 22 (9): 1089-1099 SEP 2003; Wu, ZQ., et al., ELECTRONICS LETTERS, 39 (7): 603-605 APR 3 2003; LaConte, SM., et al., MAGNETIC RESONANCE IN MEDICINE, 44 (5): 746-757 NOV 2000; Laine, AF., ANNUAL REVIEW OF BIOMEDICAL ENGINEERING, 2: 511-550 2000; Zaroubi, S., et al., MAGNETIC RESONANCE IMAGING, 18 (1): 59-68 JAN 2000; Nowak, RD., IEEE TRANSACTIONS ON IMAGE PROCESSING, 8 (10): 1408-1419 OCT 1999; y Healy, DM., et al., ANNALS OF BIOMEDICAL ENGINEERING, 23 (5): 637-665 SEP-OCT 1995.

En la tecnica se conocen otros tipos de algoritmos de procesamiento posterior que pueden aplicarse al conjunto de datos de IRM de 19F antes o despues de la cuantificacion, tales como el llenado con ceros (A Handbook of Nuclear Magnetic Resonance, 2a Edicion, Ray Freeman, Addison Wesley Longman Press 1997) y diversas interpolaciones de imagenes, eliminacion de ruido y algoritmos de suavizado de imagenes (por ejemplo, vease The Image Processing Handbook, 3a Edicion, John C. Russ, CRC Press/IEEE Press).

En ciertas realizaciones, el conjunto anterior de parametros clave (i-x) puede usarse para obtener medidas cuantitativas o estadfsticas de la exactitud o confianza del numero medido de celulas marcadas o indices relacionados. Los conjuntos de datos de IRM/SRM de 19F con frecuencia se someten a limitaciones de SRN dentro de la ROI y, por lo tanto, con frecuencia esto es util para calcular una medicion de la confianza o exactitud de la medicion. En la tecnica se conocen muchos metodos para el analisis estadfstico de IRM y otras imagenes de tipo biomedico. Se entiende que la realizacion reivindicada incluye estos metodos conocidos.

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5. Formulaciones farmaceuticas y usos

Los metodos de administracion de las emulsiones de la solicitud son bien conocidos para los expertos en la materia. Para conseguir la actividad deseada, las emulsiones pueden administrarse en una diversidad de formas de dosificacion unitarias. La dosis variara de acuerdo con la emulsion particular. La dosis tambien variara dependiendo de la forma de administracion, la salud general, condicion, tamano y edad del paciente.

En ciertas realizaciones, la administracion de las emulsiones puede realizarse por via intravascular, por ejemplo, a traves de una infusion intravenosa por inyeccion. En ciertas realizaciones, pueden usarse otras vfas de administracion. Se encuentran formulaciones adecuadas para inyeccion en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17a ed. (1985). Dichas formulaciones deben ser esteriles y no pirogenicas, y generalmente incluiran un vetnculo farmaceuticamente eficaz, tal como solucion salina, solucion salina tamponada (por ejemplo, tamponada con fosfato), solucion de Hank, solucion de Ringer, dextrosa/solucion salina, soluciones de glucosa y similares. Las formulaciones pueden contener sustancias auxiliares farmaceuticamente aceptables cuando se requiera, tales como agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes, agentes bactericidas, conservantes, estabilizantes y similares. En ciertas realizaciones se usan tampones adecuados para administracion intravenosa para ayudar a la estabilidad de la emulsion. En ciertas realizaciones se usan glicoles para ayudar a la estabilidad de la emulsion.

En ciertas realizaciones, la administracion de las emulsiones puede realizarse por via parenteral, tipicamente por inyeccion, tal como inyeccion intraarticular o intravascular (por ejemplo, infusion intravenosa) o inyeccion intramuscular. Si se desea y se puede poner en practica para la emulsion particular a administrar, pueden usarse otras vfas de administracion, por ejemplo, oral (p.o.).

En las composiciones farmaceuticas de la solicitud tambien pueden estar presentes agentes humectantes, emulsionantes y lubricantes, tales como laurilsulfato sodico y estearato de magnesio, asf como agentes colorantes, agentes de recubrimiento, edulcorantes, agentes aromatizantes y de perfume, conservantes y antioxidantes.

En ciertas realizaciones, las formulaciones de las emulsiones objeto son formulaciones apirogenicas que carecen sustancialmente de endotoxinas y/o sustancias pirogenicas relacionadas. Las endotoxinas incluyen toxinas que estan limitadas dentro de microorganismos y se liberan cuando los microorganismos se rompen o se mueren. Las sustancias pirogenicas tambien incluyen sustancias termoestables (glicoprotemas) que inducen fiebre, procedentes de la membrana externa de bacterias y otros microorganismos. Estos dos tipos de sustancias pueden producir fiebre, hipotension y shock si se administran a seres humanos. Debido a los posibles efectos perjudiciales, es ventajoso eliminar incluso pequenas cantidades de endotoxinas de las soluciones farmaceuticas de farmaco administradas por via intravenosa. La Administracion de Alimentos y Medicamentos (“FDA”) ha establecido un lfmite superior de 5 unidades de endotoxina (UE) por dosis por kilogramo de peso corporal en un penodo de una sola hora para aplicaciones de farmacos intravenosos (The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1):223 (2000)).

Las formulaciones de las emulsiones objeto de la invencion incluyen las adecuadas para la administracion oral, dietetica, topica, parenteral (por ejemplo, inyeccion intravenosa, intraarterial, intramuscular, subcutanea), oftalmologica (por ejemplo, topica o intraocular), inhalacion (por ejemplo, inhalacion intrabronquial, intranasal u oral, gotas intranasales), rectal y/o intravaginal. Otros metodos adecuados de administracion tambien pueden incluir dispositivos recargables o biodegradables y dispositivos polimericos de liberacion controlada. Las endoprotesis, en particular, pueden recubrirse con un polfmero de liberacion controlada mezclado con un agente de la solicitud. Las composiciones farmaceuticas de esta divulgacion tambien pueden administrarse como parte de una terapia combinatoria con otros agentes (en la misma formulacion o en una formulacion separada).

La cantidad de la formulacion que sera terapeuticamente eficaz puede determinarse por tecnicas clmicas convencionales. Ademas, opcionalmente pueden emplearse ensayos in vitro para ayudar a identificar intervalos de dosificacion optimos. La dosis precisa a emplear en la formulacion tambien dependera de la via de administracion. Las dosis eficaces pueden extrapolarse a partir de curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas de ensayo de modelos animales o in vitro. La dosificacion de las composiciones a administrar puede determinarse por el experto en la materia sin experimentacion indebida junto con estudios convencionales de dosis-respuesta. Las circunstancias relevantes a considerar al realizar esas determinaciones incluyen la afeccion o afecciones a tratar, la eleccion de la composicion a administrar, la edad, el peso y la respuesta del paciente individual, y la gravedad de los smtomas del paciente. Por ejemplo, puede usarse el peso corporal real del paciente para calcular la dosis de las formulaciones en mililitros (ml) a administrar. No puede haber un ajuste hacia abajo al peso “ideal”. En dicha situacion, puede calcularse una dosis apropiada mediante la siguiente formula: dosis (ml) = [peso del paciente (kg) x nivel de dosis (mg/kg)/concentracion de farmaco (mg/ml)].

Los agentes terapeuticos de la divulgacion pueden administrarse en una diversidad de formas de dosificacion unitarias y sus dosificaciones variaran con el tamano, potencia y semivida in vivo del agente terapeutico particular que se administre.

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Para aplicaciones in situ, pueden formularse emulsiones que tienen propiedades farmacocineticas optimas para permitir la captacion por los fagocitos antes de la eliminacion de la emulsion.

Las dosis de los agentes terapeuticos de la divulgacion tambien variaran dependiendo de la forma de administracion, el uso particular de la emulsion, la salud general, el estado, el tamano y la edad del paciente, y el criterio del medico a cargo del caso.

Las formulaciones de la solicitud pueden distribuirse como artfculos de fabricacion que comprenden material de envasado y un agente farmaceutico que comprende la emulsion y un vetnculo farmaceuticamente aceptable segun sea apropiado para el modo de administracion. Las formulaciones farmaceuticas y usos de la divulgacion pueden combinarse con cualquier composicion conocida para las aplicaciones de la solicitud.

6. Metodos informaticos

Los metodos para cuantificar celulas marcadas tfpicamente se llevaran a cabo con la ayuda de un ordenador, que puede funcionar con un software disenado para el fin de dicha cuantificacion. Dicho software puede ser un programa autonomo o puede estar incorporado en otro software, tal como un software de procesamiento de imagenes de IRM (vease la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2007-0253910).

La divulgacion se comprendera mas facilmente haciendo referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen meramente con fines de ilustracion de ciertos aspectos y realizaciones de la presente solicitud, y no pretenden limitar la divulgacion.

Ejemplos

A menos que se indique otra cosa, todas las siguientes nanoemulsiones presentadas se preparan con perfluoro-15- corona eter, un fluorocarburo bien conocido en la tecnica usado para formular emulsiones como sustitutos de sangre, para la deteccion de oxfgeno y el rastreo de celulas (veanse las patentes de Estados Unidos n.° 4.838.274 y 5.785.950). En los siguientes ejemplos, se introdujeron nuevos enfoques para formular nanoemulsiones estables con perfluoro-15-corona 5 eter. Otras nuevas formulaciones incorporan diversos coemulsionantes que hacen que las emulsiones sean “autoliberables” en diversos tipos celulares. Las nuevas formulaciones de emulsion descritas en el presente documento muestran notables mejoras con respecto a las emulsiones de la tecnica anterior, particularmente con respecto a un menor tamano de gotas de la nanoemulsion (de tan solo 110 nm), lo cual es ventajoso para aplicaciones in vivo. Las nanoemulsiones presentadas se preparan como monodispersas (PDI < 0,1) y muestran una estabilidad excepcional en presencia de suero y a temperaturas corporales. Ademas, la novedad se basa en la introduccion de sulfato de protamina u otros cotensioactivos para conseguir propiedades de “autoliberacion” y el uso de Cremophor EL, para conseguir un tamano de gotas excepcionalmente pequeno y una alta estabilidad in vivo.

Todas las nanoemulsiones presentadas se prepararon a una escala de 0,5-1 litro usando microfluidizacion. Las emulsiones se analizaron por dispersion de luz dinamica (DLS) para el tamano de gotas y polidispersidad usando un Malvern Zetasizer Nano ZS. El aspecto de las emulsiones se evaluo visualmente. Las nanoemulsiones se ensayaron con respecto a la estabilidad en suero, el pH y la osmolalidad. Ademas, se ha demostrado la eficacia para experimentos in vivo.

Todos los experimentos con suero se realizaron en DMEM (medio esencial modificado por Dubelcco, Invitrogen Inc.) en presencia de FBS al 10 % (suero bovino fetal, Hyclone Inc.).

Abreviaturas

p/p relacion peso/peso tA temperatura ambiente PDI mdice de polidispersidad

WFI agua para inyeccion (esteril) PSA analisis del tamano de gotas MF Microfluidizador

Material

Perfluoro-15-corona-5-eter: ExFluor, Inc. Round Rock, TX.

Sulfato de protamina: Sigma P3369 lote n.° 022K12201 CAS n.° 53597-25-4. Satisface el ensayo de la USP Pluronic F68: BASF (Lutrol F68/ Poloxamer 188) calidad USP/NF Agua para inyeccion: Braun (esteril/apirogenica)

Colesterol: Sigma Cholesterol Ph Eur; 14606

DPPE: Dipalmitoil fosfatidiletanol de Avanti Polar Lipids: 16:0 PE 850705P Lecitina (Pc de Huevo): fosfatidil Colina de Huevo Lipoide

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Cremophor ELP: BASF 10205104 calidad USP/NF Propilenglicol: Fagron BV 176947 calidad Ph Eur

Perfluoro-15-corona 5 eter/F68 con y sin sulfato de protamina

Tabla 1. Nanoemulsiones 1 y 2 composicion con volumen de emulsion final de 1 l en WFI como fase externa

Formulacion

perfluoro-15- corona-5-eter % p/p Emulsionante 1 % p/p Emulsionante 2 % p/p

1

15 % 0,6 % Pluronic F68

2

15 % 0,6 % Pluronic F68 0,04 % Sulfato de Protamina

Procedimiento:

Primero se preparo una pre-emulsion altamente concentrada, se diluyo con agua esteril para alcanzar la concentracion final necesaria y finalmente se proceso por MF para obtener una emulsion con un tamano de gota (<200 nm) y polidispersidad (<0,15) aceptables. Los emulsionantes y aditivos se disolvieron en agua esteril justo antes del uso. Se preparo solucion de Pluronic F68 en agua a 100 mg/ml y sulfato de protamina a 20 mg/ml. La preemulsion concentrada se preparo procesando todos los lfquidos requeridos (aceite de perfluoro-15-corona 5 eter, solucion de F68 y solucion de Sulfato de Protamina) con cizalla rotativa (usando un eje ultra-turrax con un diametro de 25 mm) a 13500 rpm durante 2,5 minutos. Esta primera mezcla despues se diluyo hasta la concentracion final necesaria y se volvio a procesar con cizalla rotativa durante 1 minuto. Las pre-emulsiones se procesaron inmediatamente por MF, usando un microfluidizador M-110S (Microfluidics Corp.). La presion del lfquido durante el proceso de microfluidizacion fue >18500 psi (1275,53 bar), y el pequeno tamano de gota se consiguio mediante 5 a 8 pases (ciclos) discretos. La nanoemulsion se esterilizo por filtracion. El producto se filtro usando un disco de PRF de 47 mm (PTFE, 0,22 pm) en un soporte de filtro (PALL, Inc.). Se consiguio una filtracion satisfactoria usando un bajo flujo de 2-8 ml/min.

Las emulsiones se inspeccionaron visualmente y se sometieron a mediciones del tamano de gotas y de la polidispersidad por DLS. Todas las muestras se diluyeron con WFI para alcanzar una concentracion final de un 1 % de perfluoro-15-corona-5-eter antes de las mediciones de DLS.

Resultados

Tabla 2. Resultados de PSA e inspeccion visual

Formulacion

Diametro (nm) (PDI) Pico Medio (nm) Aspecto Visual

1

149 0,036 157 turbio, lechoso, homogeneo

2

150 0,036 158 turbio, lechoso, homogeneo

En las dos formulaciones, el tamano de gotas fue <200 nm y la polidispersidad <0,2 durante 3 meses tras el almacenamiento a 5 °C y a temperatura ambiente.

Nanoemulsion de perfluoro-15-corona 5 eter con Cremophor-EL (Formulacion 3)

Se diseno una nueva formulacion de perfluoro-15-corona-5 eter para conseguir una mayor estabilidad y un menor tamano de gota con respecto a las nanoemulsiones basadas en lfpidos conocidas actualmente.

Esta nueva formulacion utiliza por primera vez Cremophor® EL (BASF) como emulsionante para un fluorocarburo. Cremophor EL es un solubilizante no ionico en el que el componente principal es ricinoleato de glicerol- polietilenglicol que, junto con esteres de acidos grasos de polietilenglicol, representa la parte hidrofoba; el componente hidrofilo mas pequeno consiste en polietilenglicoles y glicerol etoxilado. El componente lipfdico se incorpora en la cubierta liposomal de la gota de nanoemulsion, mientras que el PEG asegura la estabilizacion esterica. La gota de nanoemulsion resultante tiene un nucleo de perfluoro-15-corona-5-eter, un recubrimiento liposomal y una superficie estabilizada estericamente a traves de la parte de PEG del Cremophor EL. La estabilizacion esterica mejoro notablemente la vida util y la estabilidad de la nanoemulsion in vivo. Para demostrar las mejoras conseguidas mediante la introduccion de Cremophor EL en la formulacion de emulsion, se preparo la

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formulacion de la tecnica anterior (emulsion 4) siguiendo un procedimiento presentado previamente (documento WO2006096499) junto con la nueva formulacion (emulsion 3). Las dos emulsiones se compararon y los resultados se presentan mas adelante. Las dos emulsiones se prepararon en una escala de 250 ml.

Tabla 3. Composiciones de emulsion con medio de WFI y liposomas que consistian en un 70 % en moles de lecitina, un 28 % en moles de colesterol y un 2 % en moles de DPPE.

Formulacion

perfluoro-15- corona-5-eter % p/p Emulsionante 1 % p/v Emulsionante 2 % p/v Aditivo % p/v

3

35,6 % 3,0 % Cremophor ELP 2,0 % Liposomas 2,0 % Propilenglicol

4

35,6 % 2,0 % de aceite de Cartamo 2,0 % Liposomas 1,7 %Glicerina

Procedimiento:

En resumen, se prepararon liposomas por sonicacion de los componentes liposomales. Se preparo una preemulsion concentrada anadiendo perfluoro-15-corona-5-eter/emulsionante 1 y aditivo; posteriormente, el lote se diluyo con agua para inyeccion hasta la concentracion final y se proceso usando el MF hasta que se obtuvo el tamano final de gotas de aceite.

Con mas detalle, se disolvieron los componentes liposomales lecitina, colesterol y DPPE en cloroformo y se secaron por evaporacion rotatoria en una pelfcula. Los lfpidos despues se dispersaron en WFI por sonicacion. Las suspensiones resultantes se lavaron abundantemente con argon (gas), se cerraron y se almacenaron protegidas de la luz a 5 °C hasta el uso. Todos los componentes, incluyendo el Cremophor® EL (o aceite de cartamo), el perfluoro- 15-corona-5-eter, el propilenglicol y los liposomas primero se combinaron con una pequena cantidad de agua. Esta mezcla concentrada inicial tema perfluoro-15-corona-5-eter a un 60 % p/p. La mezcla se proceso por cizalla rotativa (turrax) durante dos minutos a 12500 rpm y la pre-emulsion concentrada resultante se diluyo adicionalmente con WFI hasta el volumen final y se proceso de nuevo durante 1 minuto a 12500 rpm. La pre-emulsion no era estable y, por lo tanto, se proceso inmediatamente por microfluidizacion con 5 a 8 pases (ciclos) discretos en el MF con una presion de >18500 psi (1275,53 bar). El producto de emulsion final fue estable como se describe mas adelante.

La formulacion 5 se preparo usando el procedimiento descrito anteriormente para la formulacion 3, reemplazando perfluoro-15-corona-5 eter en peso por PFPE lineal. Este reemplazo fue posible debido al peso espedfico y la viscosidad similares entre el PFPE lineal y el perfluoro-15-corona-5 eter. La cantidad de oxido de PFPE en la formulacion 5 fue equivalente a la cantidad en peso de perfluoro-15-corona 5 eter en la formulacion 3, con la ventaja de que se obtuvo un mayor numero de espines de 19F equivalentes/gota de nanoemulsion. Las cantidades de co- mezcla de tensioactivo, Cremophor EL y aditivo fueron iguales a las descritas para la formulacion 3. En resumen, primero se combinaron Cremophor® EL (o aceite de cartamo), PFPE lineal, propilenglicol y liposomas con una pequena cantidad de agua. Esta mezcla concentrada inicial comprendfa PFPE lineal al 60 % p/p. La mezcla se proceso por cizalla rotativa (turrax) durante dos minutos a 12500 rpm, y la pre-emulsion concentrada resultante se diluyo adicionalmente con WFI hasta el volumen final y se proceso de nuevo durante 1 minuto a 12500 rpm. La preemulsion fue estable y se proceso inmediatamente por microfluidizacion con 5 a 8 pases (ciclos) discretos en el MF con una presion de >18500 psi (1275,53 bar). La Figura 7 muestra las mediciones del tamano de las gotas por DLS para la formulacion 5 el dfa 1 y el dfa 342. Estos datos demostraron la estabilidad excepcional de esta formulacion tras el almacenamiento a 4 °C.

Resultados:

Estabilidad de la vida util de la emulsion de la formulacion 3:

La emulsion 3 se siguio por DLS y se inspecciono visualmente con respecto a signos de desestabilizacion durante un total de >6 meses. En la Figura 1 se muestra un resumen de los datos de estabilidad para la formulacion 3. Por la inspeccion visual, la formulacion 3 tuvo un aspecto turbio y lechoso; no se observaron gotas grandes, agregados, sedimentacion o separacion de fases durante el seguimiento. Es importante indicar que el tamano de las gotas de la emulsion de la formulacion 3 era mas pequeno que el de todas las demas emulsiones ensayadas y, lo que es mas importante, el tamano de las gotas y el PDI se redujeron de forma espectacular en comparacion con la formulacion 4 (documento WO2006096499). En la Tabla 4 se muestran resultados comparativos. La introduccion de Cremophor EL redujo de forma espectacular el tamano de gotas de la formulacion 3, en comparacion con la formulacion 4 preparada con aceite de cartamo en las mismas condiciones de fabricacion.

Tabla 4. Tamano comparativo de gotas y mediciones de PDI de Formulaciones 3 y 4

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Formulacion

Diametro (nm) (PDI) Pico Medio (nm)

3

105 0,108 116

4

217 0,053 233

Tanto a 5 °C como a 25 °C, se detecto inicialmente un pequeno aumento en el tamano de gotas (17 % a 5 °C despues de 2 meses y hasta el 32 % a 25 °C). El pequeno aumento en el tamano de las gotas indico una posible maduracion de Ostwald durante los 2 primeros meses de seguimiento. En el punto de tiempo de 3 meses, el tamano se estabilizo a aproximadamente 150 nm y el PDI se mantuvo bajo (<0,15). El aumento de volumen de las gotas se detuvo y la nanoemulsion no cambio en su aspecto visual y se mantuvo estable durante el seguimiento posterior. La emulsion 3 se ensayo en presencia de suero a dos puntos de tiempo, tiempo 0 y 6 meses. En cada punto de tiempo, el tamano de las gotas de la nanoemulsion y el PDI no mostraron un cambio significativo en presencia de suero despues de 3 h de incubacion a 37 °C (Tabla 6).

Tabla 5. Aspecto visual, pH y osmolalidad de la Formulacion 3.

Formulacion

pH Osmolalidad (mOsmol/kg) Aspecto Visual

3

4,7 311 La muestra fue turbia y lechosa, no se observaron gotas o sedimentacion

Tabla 6. Estabilidad en suero de la Formulacion 3

Formulacion

Punto de tiempo/Condiciones Diametro (nm) PDI Pico Medio (nm)

3

T = 0 semana 105 0,108 116

3 en suero

T = 1 hora/ 37 °C 105 0,187 129

3 en suero

T = 3 hora/ 37 °C 118 0,255 143

La formulacion 4 con aceite de cartamo se preparo en paralelo con la formulacion 3 usando metodos presentados previamente (documento WO2006096499). El tamano de las gotas, el PDI y la estabilidad en suero de esta emulsion se compararon con la formulacion 3, que utiliza Cremophor EL (anteriormente). El tamano de gotas de la formulacion 4 fue sustancialmente mas grande que en comparacion con las formulaciones 1, 2 o 3 (Tablas 4 y 7). El tamano de las gotas aumento aproximadamente un 25% despues de solo una semana a 5 °C (Tabla 7). Despues de un periodo de 2 semanas, se alcanzo el valor estacionario aparente para el tamano de las gotas (Tabla 7). La polidispersidad aumento considerablemente, lo cual no se observo en las otras formulaciones. La Tabla 8 muestra la estabilidad en suero de la formulacion 4.

Tabla 7. Tamano de gotas y mediciones de PDI de Formulacion 4 en aceite de cartamo

Formulacion

Punto de tiempo/Condiciones Diametro (nm) PDI Pico Medio (nm)

4

o II 1- 217 0,053 233

T = 1 semana/ a 5 °C

229 0,158 254

T = 2 semana/ a 5 °C

232 0,147 271

T = 1 semana/ a 25 °C

224 0,106 252

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Formulacion

Punto de tiempo/Condiciones Diametro (nm) PDI Pico Medio (nm)

T = 2 semana/ a 25 °C 229 0,132 266

TABLA 8. Estabilidad en suero de la Formulacion 4 que incorpora aceite de cartamo

Formulacion

Punto de tiempo/Condiciones Diametro (nm) PDI Pico Medio (nm)

4

T = 0 semana 217 0,053 233

4 en suero

T = 1 hora/ 37 °C 241 0,147 282

4 en suero

T = 3 hora/ 37 °C 244 0,139 281

Estabilidad de vida util de emulsion de la Formulacion 5:

La emulsion de la formulacion 5 se siguio por DLS y se inspecciono visualmente para detectar los signos de desestabilizacion durante un total de 11 meses. Como se ha descrito anteriormente, la Figura 7 muestra que el tamano de partfculas y el PDI permanecieron sin cambios despues de 342 dfas (> 11 meses) tras el almacenamiento a 4-8 °C.

Incorporacion de colorante fluorescente en la Formulacion 3

Para demostrar adicionalmente la utilidad de la formulacion 3, se incorporo un colorante fluorescente en la capa lipfdica de la formulacion 3 despues del procesamiento. Esta adicion creo un agente de “modalidad doble” que puede detectarse tanto por resonancia magnetica de 19F como por diversos metodos de fluorescencia (por ejemplo, citometna de flujo, histolog^a, analisis FAC, microscopfa de fluorescencia y similares). Se usaron colorantes lipofilos que estan disponibles ampliamente en el mercado (por ejemplo, dialquilcarbocianinas, Invitrogen, Inc.). Por ejemplo, se uso Dil (Molecular Probes), un colorante fluorescente que no es soluble en agua y no muestra practicamente fluorescencia a menos que este en un entorno hidrofobo lipfdico. El Dil se incorporo en el recubrimiento liposomal de la formulacion 3. Los estudios de fluorescencia mostraron una fluorescencia estable del colorante dentro de la parte liposomal de la formulacion (Fig. 2). El colorante era claramente no fluorescente a menos que estuviera asociado con el nucleo lipfdico de la emulsion. Debido a la baja solubilidad en agua, el colorante se mantuvo asociado con la nanoemulsion y mantuvo su fluorescencia tras dilucion en agua o el medio de cultivo celular. La incorporacion de colorante fluorescente no afecto al tamano de gota o a la polidispersidad y no afecto a la estabilidad en suero de la formulacion 3, como se muestra en la Figura 3. El colorante tampoco tuvo efectos negativos sobre la captacion de la nanoemulsion en las celulas (datos no mostrados).

Formulaciones 3 y 5 con sulfato de protamina y polietilamina

Las nanoemulsiones 3 y 5 tambien pueden formularse con sulfato de protamina y polietilamina para mejorar la captacion en celulas no fagocfticas. Estas poliaminas se incorporan en la pre-emulsion y se integran en la capa de tensioactivo de la emulsion despues del procesamiento de mF, como se ha descrito anteriormente. La cantidad de poliamina se optimizara para conseguir un marcaje celular optimo. (Vease el documento WO2009/009105).

Formulaciones 3 y 5 suplementadas con PFPE fluorescentes

Recientemente se han descrito amidas de PFPE mezcladas fluorescentes (FBPA) que contienen colorantes fluorescentes conjugados covalentemente (por ejemplo, BODIPyTR, FITC o Alexa647). Estos aceites de PFPE conjugados fluorescentes se comportan como una sola fase de fluorocarburo unica durante el procesamiento de nanoemulsiones [si se desean mas detalles, vease Janjic et al., J Am Chem Soc. 5 mar de 2008; 130(9): 2832-41]. Pueden prepararse versiones fluorescentes de las formulaciones 3 y 5 con FBPA. En la formulacion 3, puede reemplazarse un 10% v/v del perfluoro-15-corona-5 eter por FBPA. Por consiguiente, en la formulacion 5, se reemplaza un 10 % v/v de oxido de PFPE por FBPA. Los aceites se mezclan cuidadosamente entre sf para obtener una fase de fluorocarburo unica y despues se someten a procedimientos de preparacion de nanoemulsiones como se describe para la formulacion 3 y la formulacion 5. La ventaja de la fase de fluorocarburo que se marca con colorante fluorescente en lugar de la co-mezcla de tensioactivo es multiple. En primer lugar, el colorante fluorescente

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en estas nuevas formulaciones se mantiene dentro del nucleo de fluorocarburo de la gota de nanoemulsion a lo largo de todo el procesamiento, durante el marcaje celular y supuestamente in vivo. En segundo lugar, la senal fluorescente es directamente proporcional a la senal de RMN de 19F del tejido o las celulas marcadas [Janjic et al., J Am Chem Soc. 2008 Mar 5; 130(9): 2832-41], por lo tanto, no hay marcaje diferencial entre las celulas (o tejidos) para las dos modalidades de formacion de imagenes o deteccion (es decir, resonancia magnetica y fluorescencia).

Evaluacion biologica de la formulacion 3.

La formulacion 3 mostro una excelente estabilidad y un tamano de gotas muy pequeno (<150 nm) con baja polidispersidad (<0,15), como se muestra en la Figura 1. La nanoemulsion es estable tanto in vitro, en condiciones de cultivo celular, como in vivo, tras la inyeccion a roedores. En el presente documento se presenta una evaluacion mas detallada de la formulacion 3, incluyendo la captacion celular, el perfil de toxicidad y la evaluacion de las celulas marcadas con respecto al fenotipo y cambios de actividad.

Se expusieron celulas RAW (ATCC, Manassass, VA), cultivadas de acuerdo con las instrucciones del vendedor, a diferentes concentraciones de formulacion 3 durante 3 y 24 h, y la citotoxicidad se estimo por recuento directo de celulas. Se observo una toxicidad minima a la maxima dosis aplicada y despues de 24 horas de exposicion (Figura 4A). La captacion de la formulacion 3 en las celulas RAW se midio por RMN de 19F en sedimentos celulares como se ha descrito anteriormente y mostro una clara dependencia de la dosis (Figura 4B). La Figura 5 muestra un espectro de RMN de 19F representativo de las celulas RAW marcadas con la formulacion 3. Se obtuvo una captacion satisfactoria en las celulas RAW fagocfticas despues de 18 h de co-incubacion y sin reactivos de transfeccion. Para promover la captacion en celulas no fagocfticas, se incorporaron sulfato de protamina y polietilamina en la formulacion 3 como se describe en la formulacion 2 (anterior).

El marcaje de celulas de la formulacion 3 no mostro impacto sobre la capacidad de produccion de citocinas de las celulas RAW (Figura 6). Las celulas se activaron por LPS durante 24 h antes de exponerse a la formulacion 3 durante 18 h, se lavaron y despues se cultivaron durante 24 h. Se uso un ensayo ELISA para medir la produccion de citocinas, incluyendo los niveles de IL-6 y TNF-alfa. Estos ensayos mostraron que las celulas marcadas con formulacion 3 no teman ningun impacto sobre su actividad in vitro.

Se midio el tiempo de eliminacion en sangre in vivo para las formulaciones 3 y 5 en roedores (Figure 8). En una cohorte de ratones C57BL/6 (hembra, 6 semanas de edad) se inyecto una sola embolada de 0,5 ml de una formulacion dada a traves de la vena de la cola. Despues de la inyeccion, no se observaron efectos adversos en estos animales. Despues se extrajeron pequenas aftcuotas de sangre de cada animal en un conjunto fijado de puntos de tiempo. Se uso un tamano de muestra de N = 5 ratones para cada formulacion. El contenido de 19F de cada muestra de sangre se ensayo usando RMN de 19F; un volumen conocido de cada una de las muestras de sangre se anadio a una solucion de referencia de fluor calibrada (TFA), como se ha descrito anteriormente, puesta en un capilar, y se calculo la cantidad de 19F por volumen de sangre a lo largo del tiempo (Fig. 8). En general, las formulaciones 3 y 5 tuvieron una semivida en sangre similarmente larga (>14 horas, Fig. 8).

En general, varias de las formulaciones descritas anteriormente (por ejemplo, formulaciones 3 y 5) se crearon para acelerar la tarea rutinaria de cuantificar la inflamacion en espedmenes de tejido intactos. En el caso de los experimentos de marcaje in situ, la inflamacion puede ensayarse de dos maneras - usando RMN de alta resolucion convencional o usando IRM. En ambos metodos, se detecta la abundancia de nucleos de 19F en el tejido, contenidos dentro de celulas inflamatorias fagocfticas (por ejemplo, monocitos/macrofagos/neutrofilos). La mayor parte de la instrumentacion de RMN estandar puede detectar rutinariamente 19F. La RMN proporciona un enfoque sensible y economico para cuantificar el grado de infiltracion de leucocitos en las muestras de tejido. Este enfoque evita la necesidad de la engorrosa tincion patologica y la posterior cuantificacion celular mediante microscopfa. No se requiere una preparacion especial del tejido, excepto una etapa de fijacion opcional. Ademas, el uso de RMN elimina la posibilidad de desviaciones y errores en el muestreo histologico, dando como resultado conjuntos de datos mas pequenos y de mayor calidad. El analisis de RMN de los tejidos escindidos no es destructivo y, por lo tanto, los mismos tejidos se pueden someter a analisis histologicos o bioqmmicos convencionales despues de la RMN.

Como ejemplo tfpico de aplicacion de la eficacia in vivo de estas emulsiones, la formulacion 3 se uso para detectar la inflamacion en un modelo de granuloma inducido por esponja usando IRM in vivo. Se humedecio un disco de esponja de PVS en adyuvante completo de Freund (CFA) y se implanto por via subcutanea dorsalmente en un raton C57BL/6. Se administro una sola inyeccion intravenosa de la formulacion 3 (0,5 ml) el dfa 4 despues de la cirugfa. Se obtuvieron imagenes del raton anestesiado el dfa 5 a 7T. La figura 9 muestra una imagen de fusion 1H/19F, con el 19F en seudo-color. Los datos muestran una concentracion intensa de macrofagos marcados con la formulacion 3 que rodean a la esponja (asterisco). Tambien se observa una pequena cantidad de 19F en el Idgado, una ruta de eliminacion importante de la formulacion (Fig. 9). 'R' es un capilar de referencia de 19F diluido a lo largo del torso del animal. Los animales de control con la esponja humedecida en solucion salina presentaron una senal de 19F negativa despues de la administracion de la formulacion 3. Estos datos de ejemplo muestran la alta especificidad por la inflamacion de la formulacion 3.

Como ejemplo adicional de la utilidad de las formulaciones descritas anteriormente, se uso la formulacion 3 para medir el perfil de inflamacion en la medula espinal (SC) de un modelo de roedor de esclerosis multiple,

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encefalomielitis alergica experimental (EAE). El modelo de EAE se genero en una rata DA usando una sola inoculacion subcutanea en la base de la cola que consistfa en homogeneizado isogenico de medula espinal mezclado con adyuvante completo de Freund (CFA). En ratas EAE en estadio clmico 2 se inyecto por v^a intravenosa formulacion 3 (0,5 ml) y, 48 horas despues, se ensayaron segmentos fijos intactos de la SC con respecto a la inflamacion usando espectroscopia de RMN de 19F convencional a 470 MHz (Figure 10). En la figura 10, el rndice de inflamacion representa la densidad de inflamacion de cada vertebra de la medula espinal, calculada como numero de nucleos de F por peso de tejido. Tambien se muestran animales de control que reciben CFA, pero no homogeneizado de SC, que muestran una captacion minima de formula 3. Los datos mostrados son los resultados medios para n = 3 animales. En este ejemplo, la preparacion total y el tiempo de analisis por SC fue de aproximadamente 6 horas, representando aproximadamente un orden de magnitud en ahorro de tiempo en comparacion con analisis histologicos convencionales.

Hay muchos otros ejemplos experimentales in vivo recientes de la utilidad de la formulacion 3 y 5. Por ejemplo, Klug et al. (Abstract #3172, Proc. Int. Soc. Mag. Reson. Med. 17, 2009) demostraron que la formulacion 5 puede usarse para visualizar la inflamacion aguda y cronica en modelos de raton. Estos investigadores usaron ratones C57BL/6 preparados con inyecciones localizadas en la oreja de TNF-a, y ratones apoE-/", un modelo de placas ateroscleroticas. Despues de una sola inyeccion intravenosa de formulacion 5, pudo detectarse 19F por IRM en sitios de inyeccion de TNF-a en los ratones C57BL/6, y en los ratones apoE-/", pudo detectarse 19F en la region del arco braquiocefalico, que es un sitio comun de placas en estos animales.

En otros estudios, Hitchens et al. (Abstract #932, Proc. Int. Soc. Mag. Reson. Med. 17, 2009) usa la formulacion 3 para visualizar el rechazo del trasplante de organos solidos. Se trasplanto el corazon/pulmon o rinon de una rata DA en una cepa de rata BN. En ambos casos, el trasplante de DA a BN sirve como modelo de aloinjerto experimental que experimenta un rechazo agudo. Varios dfas despues del trasplante, se administro una sola inyeccion de formulacion 3 en estos animales por via intravenosa y, despues, los animales se sometieron a IRM de 19F/1H 24 horas despues. Los datos de 19F in vivo mostraron claramente la infiltracion de celulas inflamatorias en los organos de rechazo, pero no en los organos de control (sin rechazo). Los estudios histologicos de validacion confirmaron que la senal de 19F se origina en macrofagos infiltrantes.

Otros investigadores (Basse-Lusebrink et al., Abstract #807, Proc. Int. Soc. Mag. Reson. Med. 17, 2009) usaron tanto la formulacion 3 como la formulacion 5 en un modelo de raton de infarto cortical. Los animales infartados recibieron inyecciones IP de cualquier formulacion y se observo una senal de IRM de 19F localizada y pronunciada a partir de una supuesta infiltracion de macrofagos en la lesion cortical isquemica. Los autores mostraron adicionalmente que el pequeno desplazamiento qmmico (~1 ppm) entre el perfluoro-15-corona-5 eter y el PFPE lineal usados en la formulacion 3 y 5, respectivamente, podfa resolverse espectroscopicamente in vivo para revelar emulsiones inyectadas en diferentes puntos de tiempo y, por lo tanto, diferentes ondas de celulas inflamatorias en la lesion. Usando formacion de imagenes por desplazamiento qmmico (CSI) localizado espacialmente convencionales se pudo detectar y resolver simultaneamente la distribucion cerebral in vivo de las dos formulaciones que se inyectaron en puntos de tiempo diferentes.

Claims (13)

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   REIVINDICACIONES

   1. Una composicion acuosa que comprende perfluoro-15-corona-5 eter u oxido de PFPE, un emulsionante, una co- mezcla de tensioactivo y un aditivo, en la que el emulsionante comprende ricinoleato de glicerol polietilenglicol.
2. 2. La composicion acuosa de la reivindicacion 1, en la que la co-mezcla de tensioactivo comprende un 70 % en moles de lecitina, un 28 % en moles de colesterol y un 2 % en moles de DPPE.
3. 3. La composicion acuosa de la reivindicacion 1 o 2, en la que el aditivo es propilenglicol.
4. 4. La composicion acuosa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende perfluoro-15- corona-5 eter en un 35,6 % p/v, un emulsionante en un 3,0 % p/v, donde el emulsionante comprende ricinoleato de glicerol polietilenglicol, una co-mezcla de tensioactivo en un 2,0 % p/v, donde la co-mezcla de tensioactivo comprende lecitina, colesterol y DPPE, y un aditivo en un 2,0 % p/v, donde el aditivo es propilenglicol.
5. 5. La composicion acuosa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende oxido de PFPE en un 35,6 % p/v, un emulsionante en un 3,0 % p/v, donde el emulsionante comprende ricinoleato de glicerol polietilenglicol, una co-mezcla de tensioactivo en un 2,0 % p/v, en la que la co-mezcla de tensioactivo comprende lecitina, colesterol y DPPE, y un aditivo en un 2,0 % p/v, donde el aditivo es propilenglicol.
6. 6. Una emulsion que comprende una composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
7. 7. Un metodo para preparar una emulsion de la reivindicacion 6 que comprende metodos de alta energfa.
8. 8. Un metodo para marcar una celula, comprendiendo el metodo poner en contacto la celula ex vivo con una emulsion de la reivindicacion 6 en condiciones tales que el reactivo de formacion de imagenes de fluorocarburo se asocie con la celula, en el que la celula no es una celula obtenida a partir de un embrion humano.
9. 9. Un metodo para detectar una celula en un sujeto, comprendiendo el metodo:

   a) administrar al sujeto una celula que esta marcada con una emulsion de la reivindicacion 6; y

   b) examinar al menos una parte del sujeto por una tecnica de resonancia magnetica nuclear, detectandose de esta manera la celula marcada en el sujeto,

   en el que la celula no es una celula obtenida a partir de un embrion humano.
10. 10. Un metodo para medir la presion parcial de oxfgeno en un tejido, comprendiendo el metodo poner en contacto el tejido in vivo con una emulsion de la reivindicacion 6 en condiciones tales que el reactivo de formacion de imagenes de fluorocarburo se asocie con el tejido.
11. 11. La emulsion de la reivindicacion 6 para uso en un metodo para detectar la permeabilidad vascular elevada en un tejido, en la que el tejido se va a poner en contacto in vivo con la emulsion en condiciones tales que el reactivo de formacion de imagenes de fluorocarburo se asocie con el tejido.
12. 12. La emulsion de la reivindicacion 6 para uso en un metodo para detectar inflamacion en un tejido, en la que el tejido se va poner en contacto in vivo con la emulsion en condiciones tales que el reactivo de formacion de imagenes de fluorocarburo se asocie con el tejido.
13. 13. Una formulacion celular marcada para administrarse a un sujeto, comprendiendo la formulacion:

    a) una celula; y

    b) una emulsion de la reivindicacion 6 que esta asociada con la celula,

    en la que la celula no es una celula obtenida a partir de un embrion humano.