CN114929890A - 用于评价基因检测装置的性能的样品、制备所述样品的方法、以及用于评价性能的设备、用于评价性能的方法、用于评价性能的程序和用于评价基因检测装置的性能的设备 - Google Patents

Abstract

用于评价基因检测装置的性能的样品包括：核酸A；和核酸B，核酸A和核酸B包含互不相同的序列，该样品包含特定分子数量的核酸A和包含多于核酸A的分子数量的核酸B，并且规定了核酸A的分子数量与核酸B的分子数量的比例A/B。

Description

用于评价基因检测装置的性能的样品、制备所述样品的方法、 以及用于评价性能的设备、用于评价性能的方法、用于评价性 能的程序和用于评价基因检测装置的性能的设备

技术领域

本发明涉及一种用于评价基因检测装置的性能的样品、用于制备样品的方法和用于评价性能的设备、用于评价性能的方法、用于评价性能的程序和用于评价基因检测装置的性能的设备。

要求2020年1月16日提交的日本专利申请号2020-005315和2020年8月17日提交的日本专利申请号2020-137596的优先权，其内容通过引用并入本文。

背景技术

近年来，针对血液循环DNA(循环无细胞DNA：cfDNA)的癌症和器官异常的早期检测以及胎儿状况和母体健康的检测技术的发展已经取得进展。特别是使用下一代测序仪(NGS)的测试不仅可以同时测试多个区域，而且与其他方法相比，还可以以更高的灵敏度检测靶标，并且因此受到关注。此外，使用NGS进行的测试不仅用于医疗场所，而且还用于环境DNA分析，以检查水或土壤中的生物群以及检查肠道和口腔中的微生物群。

然而，在使用相关技术的NGS进行检测时，在癌症的实例中可以检测到约0.05％的等位基因比例的超低浓度的突变，而没有核酸样品作为准确地评价其性能的标准。特别地，存在一个问题，即在通过稀释法制作等位基因比例为约0.05％的标准样品的情况下，例如较低含量比例的等位基因(下文在某些情况下称为“次要等位基因”)特别是在分配时总是受到泊松分布的影响，并且最终浓度会发生变化。虽然可以通过制作大量的标准样品来避免这个问题，但实际NGS序列检测测试中使用的核酸样品体积最多为约50μL，即使是在分配用于NGS序列检测测试时可以准确制备超低浓度的标准样品，泊松分布也会对其产生影响，并且这样的影响是无法避免的。作为另一种方法，也可以考虑制备比不受泊松分布影响的拷贝数更多的次要等位基因的方法，但是对于较高含量比例的等位基因(下文在某些情况下也称为“主要等位基因”)的拷贝数在这种情况下变得非常大。通过该方法得到的超高浓度的核酸样品具有高粘度，反应溶液中的镁离子浓度降低，并且在使用包括PCR反应的NGS的检测中重要的各种反应被抑制。

迄今为止，虽然各设施的操作员通过手动技术稀释市售的人类基因组DNA而制备的样品已被用作标准样品，但不可能确保如上所述的低等位基因比例的阳性标准样品(阳性对照)的制备准确度。因此，即使使用标准样品评价测试性能，也无法确定标准样品的变化是否是测试性能存在任何缺陷的原因或测试性能是否存在任何缺陷。由于这些原因，需要一种用于准确评价测试性能的标准样品。此外，为了在使用液体活检(liquid biopsy)的方法中提供更准确和精确的信息，需要具有保证准确度的标准样品。

专利文献1公开了一种如在面板检测等中多个基因为分析靶标的情况下，以更高的准确度管理基因检测的质量的方法。具体地，公开了一种用于评价基因检测质量的方法，该基因检测用于测试从受试者收集的样品中的基因的多种类型的基因突变，包括第一类型的基因突变和不同于第一类型的第二类型的基因突变，在该方法中制备包含具有第一类型的基因突变的第一标准基因和具有第二类型的基因突变的第二标准基因的质量管理样品，获取质量管理样品中包含的基因的序列信息，以及基于获取的序列信息输出评价基因检测质量的指标。

然而，关于专利文献1中记载的质量管理样品，没有规定突变不同的两种类型的基因的含量比例，也没有具体研究其制备方法，因此无法确保制备准确度，并且存在改进的空间。

发明内容

本发明要解决的问题

本发明提供了一种用于评价基因检测装置的性能的样品，其能够减少反应空间内的核酸总量，并且准确地评价基因检测装置的性能。

解决问题的手段

一种用于评价基因检测装置的性能的样品包括：核酸A；和核酸B，其中核酸A和核酸B具有互不相同的序列，包含具有特定分子数量的核酸A，包含多于核酸A的分子数量的核酸B，并且规定核酸A的分子数量相对于核酸B的分子数量的比例A/B。

本发明的效果

根据本发明的用于评价基因检测装置的性能的样品，可以提供一种用于评价基因检测装置的性能的样品，其能够减少反应空间内的核酸总量并且准确地评价基因检测装置的性能。

附图说明

图1是显示具有基于泊松分布的变化的分子数量与变化系数CV之间的关系的图。

图2是显示已复制DNA的细胞的频率与荧光强度之间的关系的图。

图3是显示基于电磁阀方法的喷头的实例的示意图。

图4是显示基于压电方法的喷头的实例的示意图。

图5是基于图4的压电方法的喷头的修改实例的示意图。

图6(a)是显示施加到压电元件的电压的实例的示意图。图6(b)是显示施加到压电元件的电压的另一实例的示意图。

图7(a)至图7(c)是显示液滴状态的实例的示意图。

图8是显示使液滴依次降落在孔内的分配设备的实例的概略图。

图9是显示液滴形成设备的实例的示意图。

图10是举例显示图9的液滴形成设备中的控制装置的硬件块的图。

图11是举例显示图9的液滴形成设备中的控制装置的功能块的图。

图12是显示液滴形成设备的操作的实例的流程图。

图13是显示液滴形成设备的修改实例的示意图。

图14是显示液滴形成设备的另一修改实例的示意图。

图15(a)和图15(b)是举例显示飞翔液滴中有两个荧光粒子的情况的图。

图16是举例显示粒子间不重叠的情况下的亮度值Li与实际测量的亮度值Le之间的关系的图。

图17是显示液滴形成设备的另一修改实例的示意图。

图18是显示液滴形成设备的另一实例的示意图。

图19是显示通过微通道的细胞的计数方法的实例的示意图。

图20是显示用于获取喷头的喷嘴单元附近的图像的方法的实例的示意图。

图21是显示概率P(＞2)与平均细胞数之间的关系的图。

图22(a)和22(b)是显示根据本发明用于评价基因检测装置的性能的设备的实例的图(立体图和截面图)。

图23是显示根据本发明用于评价基因检测装置的性能的设备的硬件配置的实例的框图。

图24是显示根据本发明用于评价基因检测装置的性能的设备的功能配置的实例的图。

图25是显示根据本发明用于评价基因检测装置的性能的程序的处理的实例的流程图。

图26(a)至26(e)是显示实施例2中基于从具有超低等位基因频率的样品(IJ组)的3次运行(run)和手动稀释样品(手动组)的1次运行获得的读段计数(read counts)计算的PM分数的图。

图27是显示实施例2中基于从具有超低等位基因频率的样品(IJ组)的3次运行和手动稀释样品(手动组)的1次运行获得的读段计数计算的PM分数的表。

图28是显示实施例2中基于从具有超低等位基因频率的样品(IJ组)的3次运行和手动稀释样品(手动组)的1次运行获得的读段计数计算的PM分数(IJ组中的再现性评价)的表。

图29是显示实施例3中基于从具有超低等位基因频率的样品(IJ组)的1次运行获得的读段计数计算的PM分数与追加拷贝数之间的关系的图。

图30是显示实施例4中基于操作员A/设备1的4次运行、操作员B/设备1的2次运行和操作员C/设备2的3次运行获得的读段计数计算的PM分数的图。

图31是显示实施例5中基于从具有超低等位基因频率的样品的1次运行获得的读段计数计算的PM分数与等位基因频率之间的关系的图。

图32是显示实施例5中基于从具有超低等位基因频率的样品的1次运行获得的读段计数计算的PM分数与等位基因频率之间的关系的图。

图33是显示实施例6中横轴表示拷贝数的情况下的回归线(左图)和横轴表示拷贝数的对数的情况下的回归线(右图)的图。

具体实施方式

下文将根据需要参考具体实施方式和附图描述根据本发明的实施方式的用于评价基因检测装置的性能的样品和用于制备其的方法和用于评价性能的设备、用于评价性能的方法、用于评价性能的程序和用于评价基因检测装置的性能的设备(下文在一些情况中简称为“根据本实施方式的性能评价样品”、“根据本实施方式的制备方法”、“根据本实施方式的设备”、“根据本实施方式的性能评价方法”、“根据本实施方式的性能评价程序”和“根据本实施方式的性能评价装置”)。这些实施方式和附图仅为便于理解本发明的实施例，并不用于限制本发明。换句话说，以下描述的构件的形状、大小、配置等可以在不脱离本发明的主旨的范围内进行改变或改进，并且其等同物也包含在本发明中。

此外，在所有的附图中，对相同的部件应用相同的附图标记，并且适当省略重复的描述。

在说明书中，除非在说明书中另有说明，否则说明书中使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域技术人员通常理解的相同的含义。说明书中提及的所有专利、申请、其他出版物和信息的全部内容将被并入说明书中以供参考。此外，在说明书中引用的出版物与说明书中的描述之间发生一些冲突的情况下，应优先参考说明书中的描述。

<用于评价基因检测装置的性能的样品>

根据本实施方式用于评价性能的样品包括核酸A和核酸B，并且核酸A和核酸B具有互不相同的序列。此外，根据本实施方式的样品包含具有特定分子数量的核酸A，并且包含多于核酸A的分子数量的核酸B。此外，在根据本实施方式的样品中，规定核酸A的分子数量相对于核酸B的分子数量的比例A/B。

在根据本实施方式的样品中，由于核酸A的分子数量是准确测定的特定分子数量，因此可以将其含量设定为极微小的量，比如1个分子，并且因此即使相对于核酸A存在大量的核酸B也可以减少核酸(即核酸A和核酸B)的总量。此外，如后面实施例所述，可以使用标准样品准确地评价基因检测装置，其中通过核酸A中分子数量的准确度来保证准确度。基因检测装置的实例包括定量PCR装置、核酸序列测定装置(测序仪)(例如，下一代测序仪)等。

定量PCR装置的实例包括实时PCR装置等。

实时PCR装置是通过随时间(实时)测量由PCR实现的扩增，基于扩增率对模板核酸进行定量的装置。定量使用荧光染料进行，并且主要有嵌入法和杂交法。

在嵌入法中，模板核酸的扩增反应在嵌入剂的存在下进行，嵌入剂独特地***(嵌入)到双链DNA中并发出荧光。嵌入剂的实例包括SYBR Green I(CAS No.：163795-75-3)或其衍生物。另一方面，使用TaqMan(注册商标)探针的方法是最典型的杂交法，并且使用通过将荧光物质和猝灭物质与互补寡核苷酸连接到靶核酸序列而获得的探针。

下一代测序仪是近年来开发的一组碱基序列分析装置，并且通过对以克隆样方式扩增的DNA模板或流式细胞内部的单个DNA分子进行大量并行处理，分析能力显著提高。

可用于本实施方式的测序技术可以是通过以重叠方式读取同一区域获得多个读段的测序技术(深度测序)。

可以在本实施方式中使用的具体的测序技术没有特别限定，并且其实例包括基于Sanger法以外的测序原理的每次运行可获取大读段计数的测序技术，比如离子半导体测序、焦磷酸测序、使用可逆染料终止子的合成测序、连接测序和基于寡核苷酸探针连接的测序。

基因检测装置的性能的实例包括每个反应空间的碱基序列分析性能、每个反应空间的荧光测量性能等。例如，基因检测装置的高性能可能意味着每个反应空间的碱基序列分析准确度和荧光测量准确度没有变化。

注意，关于说明书中的“分子数量”，基因检测装置将读取为一个核酸的分子计为一个分子。

[特定分子数量]

在本说明书中，特定分子数量是指样品中所含的核酸A的分子数量以具体的或更高的水平准确地规定。换句话说，可以说样品中实际包含的核酸A的分子数量是已知的。换句话说，本说明书中的特定分子数量是与相关领域中通过系列稀释获得的预定分子数量(计算的估算值)相比具有更高准确度和可靠性的作为数量的值，并且特别是，该值是即使在1000或更少的低分子数量的区域中也不取决于泊松分布的控制值。

关于控制值，表示不确定度的变化系数CV优选地落在相对于分子的平均数x的CV＜1/√x或CV≤20％的任何值的大小内。

根据本实施方式的样品，与相关领域相比，通过规定样品中所含的核酸A的分子数量可以更准确地评价基因检测装置的性能。

核酸A中的分子数量可以是小于核酸B中的任何特定分子数量。具体地，就减少核酸(即核酸A和核酸B)的总量而言，核酸A中的分子数量优选地为1或更多且200或更少，更优选地为1或更多且100或更少，并且进一步优选地为1或更多且50或更少。

在此，核酸A的“分子数量”和“拷贝数”可以相互关联。特别地，在基因组上的两个位置导入核酸A的碱基序列的G1期酵母菌的情况下，例如导入核酸A的相同染色体的数量为1，并且如果酵母菌数＝1，则核酸A中的分子数量＝核酸A的拷贝数＝2。在说明书中，核酸A中的特定分子数量可以被称为核酸A的绝对数量。

当使用根据本实施方式的样品评价基因检测装置的性能时，在存在多个包含核酸A的反应空间(以下，也称为“孔”)的情况下，表达每个孔中包含的核酸A的拷贝数相同意味着当反应空间充满样品时产生的核酸A的数量的变化在允许范围内。核酸A的数量的变化是否在允许范围内，可以根据后述的表示不确定度的信息来判断。

与核酸A中的特定分子数量相关的信息的实例包括关于不确定度的信息、载体的信息(将在后面描述)、关于核酸A的信息等。

“不确定度”在ISO/IEC指南99：2007[国际计量术语-基本和一般概念及相关术语(VIM)]被定义为“表征能够与伴随测量结果的测量量合理关联的值的变化的参数”。

在此，“能够与测量量合理关联的值”是指测量量的真实值的候选值(candidate)。换句话说，不确定度是指与测量目标的制造相关的操作、设备等引起的测量结果的变化有关的信息。随着不确定度的增加，预期作为测量结果的变化也会增加。不确定度可以是从测量结果获得的标准偏差，或者可以是可靠性水平的一半值，该可靠性水平表示为以预定概率或更大概率包含真实值的值的宽度。

可以基于Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement(GUM：ISO/IEC Guide 98-3)和Japan Accreditation Board Note 10测试中与测量不确定度相关的指南来计算不确定度。

作为计算不确定度的方法，可以应用两种方法，即使用测定值的统计等的A类评价方法和使用从例如校准证书、制造商说明书、发布的信息等获得的有关不确定度的信息的B类评价方法。

通过将由于诸如操作和测量的因素获得的不确定度转换为标准不确定度，可以在相同的可靠性水平上表示不确定度。标准不确定度表示从测定值获得的平均值的变化。

作为用于计算不确定度的方法的实例，例如，提取导致不确定度的因素，并且然后计算由于每个因素引起的不确定度(标准偏差)。然后，通过平方和法，合成计算出的每个因素引起的不确定度，从而计算合成标准不确定度。由于合成标准不确定度的计算采用平方和法，因此可以忽略引起不确定度的因素中不确定度较小的因素。

作为关于不确定度的信息，可以使用填充容器的核酸A的变化系数。例如，变化系数是指在容器中填充核酸A时产生的每个容器所填充的核酸A的数量的变化的相对值。换句话说，变化系数是指填充容器的核酸A的数量的填充准确度。变化系数是标准偏差σ除以平均值x所得的值。在此，如果将标准偏差σ除以平均拷贝数(平均填充拷贝数)x而得到的值定义为变化系数CV，则获得以下关系式1。

CV＝σ/x (式1)

通常来说，核酸A在样品中具有泊松分布的随机分布状态。因此，标准偏差σ可以看作是满足系列稀释法中具有平均拷贝数x的关系式2，即泊松分布中的随机分布状态。如此方式，在通过系列稀释法稀释包含核酸A的样品的情况下，如果使用源自上述式1和下述式2的式3由标准偏差σ和平均拷贝数x获得平均拷贝数x的变化系数CV(CV值)，变化系数CV显示在表1和图1中。可以从图1获得具有基于泊松分布的变化的分子数量变化系数CV值。

[表1]

从表1和图1的结果可以确定，在通过系列稀释法用100个核酸A的拷贝填充孔的情况下，例如，如果忽略其他准确度，最终填充孔的核酸A的拷贝数的变化系数(CV值)至少为10％。

关于核酸A中的分子数量，变化系数的CV值和核酸A的平均特定拷贝数x优选地满足以下表达CV<1√x，并且进一步优选满足CV<1/2√x。

作为关于不确定度的信息，在存在多个包含核酸A的孔的情况下，优选地使用关于基于孔中包含的核酸A中的特定分子数量的所有孔的不确定度的信息。

可想到产生不确定度的几个因素，并且在将核酸A导入细胞中并计数细胞并分配到孔中的情况下，其实例包括细胞中核酸A的数量(例如，细胞的细胞周期等)，用于将细胞布置在孔中的装置(包括喷墨设备和控制喷墨设备的操作时机的设备的每个部分的操作结果)。例如，形成细胞悬浮液的液滴时液滴中所含的细胞数、细胞在孔内的适当位置设置的频率(例如，置于孔内的细胞数)、由于细胞悬浮液中的细胞被破坏而导致核酸A包含在细胞悬浮液中的污染物(包含杂质；也称为“污染物”)等。

关于核酸A的信息的实例包括关于核酸A中的分子数量的信息。关于核酸A中的分子数量的信息的实例包括关于例如包含在孔中的核酸A中的分子数量的不确定度的信息。

[核酸A]

通常，核酸是指来源于嘌呤或嘧啶的含氮碱基以及其中糖和磷酸规则地连接的聚合物的有机化合物，并且包括核酸类似物。核酸没有特别限制，可以根据目的适当地选择，并且其实例包括DNA、RNA、cDNA等。核酸A可以是核酸片段，可以合并到细胞核中，优选地合并到细胞核中。

核酸A可以是从生物体获得的天然产物，可以是加工产物，可以使用基因重组技术制造，或者可以是化学合成的人工合成核酸。其中，可以单独使用一种，或者也可以两种或更多种一起使用。在同时使用两种或更多种核酸A的情况下，已知两种核酸A都包含比核酸B少的分子数量。通过使用人工合成的核酸，可以减少杂质，获得低分子，从而提高初始反应效率。

核酸A的序列可以是源自真核生物、原核生物、多细胞生物和单细胞生物中的任何生物的序列。真核生物的实例包括动物、昆虫、植物、真菌、藻类、原生动物等。动物的优选实例包括脊椎动物比如鱼、两栖动物、爬行动物、鸟类和哺乳动物。通过核酸A为根据本实施方式用于评价性能的样品中的脊椎动物的DNA，在鱼类环境DNA分析、肉种判定、清真检测等中测定各种DNA混合样品时，根据本实施方式用于评价性能的样品可以用作保证准确度的标准样品。

在脊椎动物中，优选地使用哺乳动物。哺乳动物的实例包括人、猴、狨猴、狗、牛、马、羊、猪、兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠等，并且优选的实例包括人。

其中，核酸A优选地为人类基因组DNA或其片段。

人工合成的核酸是指通过人工合成包含与天然存在的DNA或RNA的成分(碱基、脱氧核糖、磷酸)相同的成分的核酸而得到的核酸。人工合成的核酸例如可以是具有编码蛋白质的碱基序列的核酸，或者可以是具有任意选择的碱基序列的核酸。

核酸类似物或核酸片段的实例包括有非核酸组分连接到其上的核酸或核酸片段，用标记剂比如荧光染料或同位素标记的核酸或核酸片段(例如，用荧光染料或放射性同位素标记的引物或探针)，以及其中构成核酸或核酸片段的核苷酸的部分化学结构发生改变的人工核酸(例如，PNA、BNA、LNA等)。

核酸A的形式没有特别限制，可以根据目的适当地选择，并且其实例包括双链核酸、单链核酸和部分双链或单链核酸，并且核酸A可以是环状或线性质粒。此外，核酸可以具有修饰或突变。

核酸A优选地具有特定碱基序列以及已知碱基序列。特定碱基序列没有特别限制并且可以根据目的适当地选择，并且其实例包括用于遗传病检测的碱基序列、自然界中不存在的非天然碱基序列、来源于动物细胞的碱基序列、来源于植物细胞的碱基序列、来源于真菌细胞的碱基序列、来源于细菌的碱基序列、来源于病毒的碱基序列等。其中，可以单独使用一种，或者也可以两种或更多种一起使用。

在将用于遗传病检测的碱基序列用作核酸A的情况下，只要核酸A包括遗传病独有的碱基序列，核酸A没有特别限制并且可以根据目的适当地选择。

核酸A可以是来源于使用的细胞的核酸，或者可以是通过基因导入引入的核酸。核酸A的种类可以是一种或多种。在包含两种或更多种核酸A的情况下，所有核酸A都包括少于核酸B的已知数量的分子。在将通过基因导入合并到细胞核中的核酸用作核酸A的情况下，优选地检查特定分子数量的核酸A(例如，一个分子(一个拷贝))已被导入一个细胞中。检查导入了特定分子数量的核酸A的方法没有特别限制，并且可以根据目的适当地选择，并且其实例包括序列、PCR法、Southern印迹法等。

在将核酸A导入细胞核的情况下，基因导入方法没有特别限制，只要能够将特定核酸序列的目标拷贝数导入目标位置即可，并且其实例包括同源重组、CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpfl、TALEN、锌指核酸酶、Flip-in、Jump-in等。可选地，可以将核酸A以质粒、人工染色体等形式导入细胞核中。例如，在使用酵母菌(酵母细胞)作为细胞的情况下，从高效率和易于控制的观点考虑，优选采用它们之间的同源重组。

可以使用微区或载体将核酸A微分配(micropartition)到样品中。此时，由微区或载体微分配的核酸A可以是一个或多个分子。在两个或更多个分子的核酸A被微分配的情况下，多个存在的核酸A可以具有相同的序列或不同的序列。在样品中核酸A被载体微分配的情况下，核酸A以核酸A直接连接至载体或核酸A经由接头等间接连接至其存在。

微区的形式的实例包括细胞、脂质体、微囊、病毒、液滴、乳液等。载体的形式的实例包括金属颗粒、磁性颗粒、陶瓷颗粒、聚合物颗粒、蛋白质颗粒等。

(细胞)

细胞是构成生物体的结构和功能单元，并且核中的特定序列可以用作核酸A。核酸A可以具有最初存在于核中的碱基序列，或者可以从外部导入。

细胞没有特别限制并且可以根据目的适当地选择，并且其实例包括真核细胞、原核细胞、多细胞生物细胞、单细胞生物细胞等。可以单独使用一种细胞，或两种或更多种细胞可以一起使用。

真核细胞没有特别限制并且可以根据目的适当地选择，并且其实例包括动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞、藻类、原生动物等。其中，可以单独使用一种，或者可以一起使用两种或更多种。特别地，优选地使用动物细胞或真菌细胞。

动物细胞可源自其的动物的实例包括与上述“核酸A”所示的那些相似的实例。特别地，优选地使用哺乳动物。

动物细胞可以是粘附细胞或可以是漂浮细胞。粘附细胞可以是直接从组织或器官收集的原代细胞，可以是通过直接从组织或器官收集的原代细胞传代获得的细胞，可以是分化细胞，或可以是未分化细胞。

分化细胞没有特别限制并且可以根据目的适当地选择，并且其实例包括内皮细胞比如作为实质肝细胞的肝细胞、星状细胞、枯否细胞、血管内皮细胞、窦状内皮细胞和角膜内皮细胞；表皮细胞比如成纤维细胞、成骨细胞、破骨细胞、牙周衍生的细胞和表皮角质细胞；上皮细胞比如气管上皮细胞、肠道上皮细胞、子宫颈上皮细胞和角膜上皮细胞；乳腺细胞和周细胞；肌肉细胞比如平滑肌细胞和心肌细胞、肾细胞和胰岛细胞；神经细胞比如周围神经细胞和视神经细胞；软骨细胞、骨细胞等。

未分化的细胞没有特别限制并且可以根据目的适当地选择，并且其实例包括全能干细胞比如胚胎干细胞(ES细胞)和诱导性多能干细胞(iPS细胞)；多能干细胞比如间质干细胞；单能干细胞比如内皮祖细胞等。

真菌细胞没有特别限制并且可以根据目的适当地选择，并且其实例包括霉和酵母菌。其中可以单独使用一种，或者可以一起使用两种或更多种。特别地，优选地使用酵母菌，因为可以调节细胞周期并使用单倍体细胞。细胞周期是指当细胞数量增加时发生细胞***，并且在细胞***中产生的细胞(子细胞)成为再次进行细胞***并产生新的子细胞的细胞(母细胞)的过程。

酵母菌没有特别限制并且可以根据目的适当地选择，并且其优选的实例包括与G0/G1期同步培养并在G1期固定化的酵母菌。此外，酵母菌的优选实例包括Bar1基因缺陷型酵母，其对控制G1期细胞周期的信息素(性激素)的敏感性增加。如果酵母菌是Bar1基因缺陷型酵母菌，可以降低目前无法控制细胞周期的酵母菌比例，从而防止样品中所含细胞中核酸A分子数量增加等。

原核细胞没有特别限制并且可以根据目的适当地选择，并且其实例包括真细菌比如大肠菌、古细菌等。其中，可以单独使用一种，或者可以一起使用两种或更多种。

细胞优选是死细胞。在死细胞的情况下，可以防止分选后发生细胞***和细胞内核酸量的变化。优选地，细胞在它们接收光时能够发光。如果细胞在接收光时能够发光，则可以使细胞在高度精确控制细胞数量的情况下降落在孔内。

优选地，细胞在它们接收光时能够发射光。光接收是指细胞接收光。细胞的光发射由光学传感器检测。光学传感器是指收集人眼可以看到的可见光束以及波长比可见光束更长的近红外线和短波长红外线中的任何一种，并点亮到热红外区域并获取作为图像数据的目标细胞的形状等的无源传感器。

当它们接收光时能够发射光的细胞没有特别限制并且可以根据目的适当地选择，并且其实例包括被荧光染料染色的细胞、荧光蛋白表达的细胞和被荧光标记抗体标记的细胞。被荧光染料染色的细胞中的位点、荧光蛋白的表达位点和被荧光标记抗体标记的位点没有特别限制，并且其实例包括整个细胞、细胞核、细胞膜等。

荧光染料的实例包括荧光素、偶氮、若丹明、香豆素、芘、花青等。其中，可以单独使用一种，或者可以一起使用两种或更多种。其中，特别地，优选地使用荧光素、偶氮、若丹明或花青，更优选地使用曙红、伊文思蓝(Evans Blue)、台盼蓝、若丹明6G、若丹明B、若丹明123或Cy3。

可以使用市售的荧光染料，并且市售产品的实例包括产品名称：EosinY(由WakoPure Chemical Corporation制造)，产品名称：Evans Blue(由Wako Pure ChemicalCorporation制造)，产品名称：Trypan Blue(由Wako Pure Chemical Corporation制造)，产品名称：Rhodamine 6G(由Wako Pure Chemical Corporation制造)，产品名称：Rhodamine B(由Wako Pure Chemical Corporation制造)，产品名称：Rhodamine 123(由Wako Pure Chemical Corporation制造)等。

荧光蛋白的实例包括Sirius、EBFP、ECFP、mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP、TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana、KusabiraOrange、mOrange、TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、mPlum、PS-CFP、Dendra2、Kaede、EosFP、KikumeGR等。其中，可以单独使用一种，或者可以一起使用两种或更多种。

荧光标记抗体没有特别限制，只要它们可以被连接至靶细胞并且已经被荧光标记，并且可以根据目的适当地选择，并且其实例包括FITC标记的抗CD4抗体、PE标记的抗CD8抗体等。其中，可以单独使用一种，或者可以一起使用两种或更多种。

细胞的体积平均粒径在游离状态下优选地为30μm或更小，更优选地为10μm或更小，并且特别优选地为7μm或更小。如果体积平均粒径为30μm或更小，则细胞可以适当地用于喷墨法中的液滴排出装置、细胞分选仪等。

细胞的体积平均粒径例如可以通过以下的测量方法来测定。在使用酵母作为细胞的情况下，可以通过提取10μL产生的染色酵母分散液，将其放置在由PMMA制造的塑料载玻片上，使用自动细胞计数器(产品名称：Countess Automated Cell Counter；由Invitrogen制造)等来测量体积平均粒径。注意，通过类似测量方法，也可以获得细胞数量。

细胞悬浮液中细胞的密度没有特别限制，可以根据目的适当地选择，优选地为5×10⁴/mL或更多且5×10⁸/mL或更少，并且更优选地为5×10⁴/mL或更多且5×10⁷/mL或更少。如果细胞密度落入上述范围内，则可以在排出液滴中可靠地包括细胞。细胞密度可以使用与体积平均粒径的测量方法类似的自动细胞计数器(产品名称：Countess Automated CellCounter，由Invitrogen制造)来测量。

(脂质体)

脂质体是由包括脂质分子的脂质双层形成的脂质囊泡，并且具体是指具有封闭的脂质的囊泡，其基于脂质分子的疏水基团和亲水基团的极性，具有由生成的脂质双层与外部隔离的空间。

(微囊)

脂质体是由脂质双层膜使用脂质形成的封闭囊泡，并且在封闭囊泡的空间中具有水相(内部水相)。内部水相包括水等。脂质体可以是单个片层(单层片层、单片层、双层膜的一层)，或者可以是多层片层(多片层或多个双层膜，具有洋葱形结构，其中各层由水状层切分)。

脂质体可以包封核酸A，并且其形式没有特别限制。“包封(Encapsulating)”是指将核酸包括在内部水相中的形式或膜本身用于脂质体的形式。其实例包括核酸A被密封在由膜形成的封闭空间中的形式、核酸A被包封在膜本身中的形式等，并且还可以采用它们的组合。

脂质体的大小(平均粒径)没有特别限制，只要它可以包封核酸A即可。此外，优选地使用球状或接近球状的形状。

构成脂质体的脂质双层的成分(膜成分)选自脂质。可以使用任何脂质，只要其溶解在水溶性有机溶剂和酯类有机溶剂的混合溶剂中即可。脂质的具体实例包括磷脂、除磷脂以外的脂质、胆固醇及其衍生物。这些成分中，可以单独使用一种，或者可以一起使用两种或更多种。

(微囊)

微囊是指具有壁材和中空结构的微小颗粒，并且可以将核酸A包封在中空结构中。微囊没有特别限制，并且壁材、大小等可以根据目的适当地选择。

用于微囊的壁材的实例包括聚氨酯树脂、聚脲、聚脲-聚氨酯树脂、脲-甲醛树脂、三聚氰胺-甲醛树脂、聚酰胺、聚酯、聚砜酰胺、聚碳酸酯、聚亚磺酸酯、环氧树脂、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙酸乙烯酯、明胶等。其中，可以单独使用一种，或者可以一起使用两种或更多种。

微囊的大小没有特别限制，只要它可以包封核酸A即可，并且可以根据目的适当地选择。用于制造微囊的方法没有特别限制并且可以根据目的适当地选择，并且其实例包括原位方法、界面聚合方法、核salvation方法等。

[核酸B]

核酸B的实例包括与前述核酸A中示例的那些相同的那些。其中，核酸B优选地为人类基因组DNA或其片段。

本实施方式中的样品可以单独包含这样的核酸B中的一种，或者其两种或更多种的组合。在包含两种或更多种核酸B的情况下，两种核酸B的含量均大于核酸A的含量。

尽管核酸B的分子数量可以是任何数量，只要核酸B中的分子数量大于核酸A中的分子数量即可，但是在与核酸A中的分子数量相比得到过量方面，核酸B中的分子数量优选地为200或更多，更优选地为1000或更多，进一步优选地为5000或更多，特别优选地为10000或更多。另一方面，例如，就获得核酸(即核酸A和核酸B)的总量不妨碍基因检测装置中各种处理(包括PCR反应)的量而言，核酸B的上限可以是约10⁸或更少。

在包含两种或更多种核酸B的情况下，各核酸B的分子数量优选地等于或大于上述下限值，并且核酸B中的分子总数等于或小于上述上限值。

核酸A中的分子数量相对于核酸B中的分子数量的比例A/B可以是任何特定的已知值，没有特别限制，优选使得核酸B中的分子数量比核酸A的分子数量过大，优选地为10％或更小，更优选地为1％或更小，并且进一步优选地为小于1％。

此外，上述比例A/B优选对应于特定遗传病的发生频率。例如，在特定遗传病为纯合突变且发生频率为1％的情况下，核酸A为有突变的已知序列的基因，核酸B为没有突变的已知序列的基因，并且上述比例A/B可以规定为1/99。此外，在特定遗传病为杂合突变且发生频率为1％的情况下，核酸A是有突变的已知序列的基因，核酸B是没有突变的已知序列的基因，并且上述比例A/B可以规定为1/199。此外，例如在核酸A为有突变的EGFR基因且核酸B为无突变的EGFR基因的情况下，如后述的实施例所述，比例A/B可以规定为对应于EGFR基因突变的发生频率的值。此时，核酸A优选地包括包含EGFR基因的外显子18、19、20、21串联连接的序列的碱基序列。例如，可以在外显子18的5'末端、外显子之间和外显子21的3'末端进一步添加诸如限制性酶切位点等的序列以及与用于核酸A扩增的引物同源的序列，如将在下面的实施例中描述的那样。这种核酸A的具体实例包括具有由序列号1等表示的碱基序列的核酸。

通常来说，“遗传病”包括单一遗传病、多因素遗传病、染色体异常等。其中，由突变引起的疾病是优选的。这里描述的突变包括基因中核酸的取代、缺失或***、基因融合和拷贝数变异。“取代”是指基因序列中的至少一个碱基是不同碱基的状态。“取代”包括点突变和单碱基变异。“缺失”和“***”是指基因序列中的至少一个碱基被***和/或缺失的状态。“基因融合”是指某个基因的5'侧的序列和另一个基因的3'末端侧的序列由于染色体易位等而相互连接的状态。“拷贝数变异(Copy number variation)”是指每个细胞基因组上的拷贝数在个体之间是不同的。具体的实例包括串联重复的可变核苷酸(VNTR；重复序列变异)、短串联重复多态性(STRP；微卫星变异)、基因扩增等。

例如，根据本实施方式的样品中包括的核酸总量，即核酸A和核酸B中的分子总数可以是任意量，只要不妨碍基因检测装置中的各种处理(包括PCR反应)即可，并且可以是10⁸或更少。此外，在将根据本实施方式的样品作为液体活检的标准样品的情况下，期望地在测试中使用的样品中核酸的总量优选地与核酸的量(约30至90ng的人类基因组)相当，并且核酸A和核酸B中的分子总数优选地为30000或更少并且更优选地为25000或更少。

另一方面，尽管核酸总量的下限没有特别限制，但是下限可以是3或更多且可以大于200。

[其他成分]

本实施方式的性能评价样品可以包含溶剂作为另一成分。溶剂的优选实例包括水溶性溶剂，比如水、乙醇、二甲基亚砜(DMSO)、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)等。

例如，根据本实施方式的样品可广泛用于生物相关产业、生命科学产业、医疗产业等，并且适合用于基因检测装置的性能评价、准确度管理等。此外，可以适当地使用样品来评价遗传病检测的准确度。

<制备用于评价基因检测装置的性能的样品的方法>

下面将描述根据本实施方式的制备方法。

本实施方式的制备方法包括：合并步骤：将核酸A合并到到细胞核内的核酸中；核酸A填充步骤：在容器中产生液滴，其包含一个其中核酸A被合并到细胞核的核酸中的细胞，并通过控制液滴的数量用特定数量的细胞进行填充；和核酸B填充步骤：将核酸B填充到所述容器中，使得核酸A中的分子数量相对于核酸B中的分子数量的比例A/B为特定比例。根据本实施方式的制备方法优选地进一步包括细胞悬浮液纯化步骤和细胞数计数步骤，并且更优选地包括计算在所述细胞悬浮液生成步骤、所述核酸A填充步骤和所述细胞计数步骤中估算的核酸A的分子数量的确定度的步骤，，输出步骤和记录步骤，并且根据需要进一步包括其他步骤。

[合并步骤]

在合并步骤中，将核酸A合并到细胞核中的核酸中。

尽管合并到细胞核内的核酸中的核酸A中的分子数量没有特别限制，只要分子数量为特定分子数量，但是从导入效率的角度看，分子数量优选地为一个。

将核酸A合并到细胞核内的核酸中的方法包括与作为在上述“核酸A”中“导入基因的方法”所例示的方法类似的方法。

[核酸A填充步骤]

在核酸A填充步骤中，产生液滴，其包含一个其中核酸A合并到细胞核内的核酸中的细胞，并且通过控制液滴的数量来进行特定数量的细胞的填充。注意，液滴是指由于表面张力而合并的液块。

液滴的产生和填充可以通过将包含核酸A合并到细胞核内的核酸中的细胞的细胞悬浮液作为液滴排出，并使液滴依次降落在容器内来实现。排出意味着使细胞悬浮液以液滴的形式飞翔。顺序是指事件按顺序一一发生。降落意味着使液滴到达孔中。

作为容器，虽然优选地使用1孔微量管、8孔管、96孔板、384孔板等，但也可以分配相同数量的细胞在这样的板中的每个孔中，或者在有多个孔的情况下，也可以放置不同数量的细胞。此外，可能存在不包含任何细胞的孔。

作为排出装置，可以适当地使用将细胞悬浮液作为液滴排出的装置(下文也称为“喷头”)。

将细胞悬浮液作为液滴排出的方法的实例包括喷墨法中的按需法、连续法等。其中，在连续法的情况下，出于在达到稳定的排出状态之前空排出、液滴量的调整、即使在孔之间的移动过程中也会连续形成液滴等原因，使用的细胞悬浮液的死体积有增加的趋势。在本实施方式中，从调整细胞数的观点出发，优选地减少死体积的影响，并且因此在上述两种方法中，按需法更合适。

按需法的实例包括多种已知方法，比如通过对液体施加压力来排出液体的加压法、通过由加热引起的膜沸腾来排出液体的热方法、以及通过使用静电吸引力拉动液滴来形成液滴的静电法。其中，优选地使用加压法，理由如下。

在静电法中，需要安装与保持细胞悬浮液并形成液滴的排出单元相对的电极。在根据本实施方式的制造方法中，用于接收液滴的板被设置为面对它，并且优选地不设置电极以提高板配置的自由度。对于热方法，会发生局部加热，并且因此存在对作为生物材料的细胞的影响和加热器部分的燃烧(结垢)的担忧。由于热的影响取决于板的含量和用途，因此不必无条件地排除它，但是与热方法相比，加压法由于不担心加热器部分的燃烧而成为优选的。

加压法的实例包括使用压电元件向液体施加压力的方法、使用诸如电磁阀的阀施加压力的方法等。可用于排出细胞悬浮液的液滴的液滴生成装置的构造实例如图3至5中所显示。

图3是显示基于电磁阀方法的喷头的实例的示意图。基于电磁阀方法的喷头包括电机13a、电磁阀112、液体腔11a、细胞悬浮液300a和喷嘴111a。作为基于电磁阀方法的喷头，例如可以适当地使用来自TechElan的分配器。

图4是显示基于压电方法的喷头的实例的示意图。基于压电方法的喷头包括压电元件13b、液体腔11b、细胞悬浮液300b和喷嘴111b。作为基于压电方法的喷头，可以适当地使用来自Cytena的单细胞打印机等。

尽管可以使用这些喷头中的任何一个，但是优选地使用压电方法以提高用于生成板的产量(throughput)，因为不可能通过使用电磁阀的加压法以高速重复形成液滴。此外，根据使用典型的压电元件13b的基于压电方法的喷头，可能存在诸如由于沉降引起的细胞浓度变化以及发生喷嘴堵塞的问题。

因此，可以例示图5等所显示的结构作为更优选的结构。图5是基于使用图4中的压电元件的压电方法的喷头的修改实例的示意图。图5中的喷头包括压电元件13c、液体腔11c、细胞悬浮液300c和喷嘴111c。

根据图5的喷出头，能够通过未显示的控制设备在纸张表面的横向施加压缩应力，使膜12c在纸张表面的上下方向变形，向压电元件13c施加电压。

除了按需法之外的方法的实例包括连续形成液滴的连续方法。在连续方法中，当液滴被压缩并推出喷嘴时，压电元件或加热器提供周期性波动，并且因此可以连续产生微小液滴。此外，可以通过施加电压来控制飞翔液滴的排出方向，来选择是使液滴降落在孔上还是将它们收集在收集单元中。对于这种方法，使用细胞分选仪或流式细胞仪，并且例如，可以使用由Sony Corporation制造的细胞分选仪SH800Z装置。

图6(a)是显示施加到压电元件的电压的实例的示意图。此外，图6(b)是显示施加到压电元件的电压的另一实例的示意图。图6(a)显示了形成液滴的驱动电压。可以基于电压(V_A、V_B、V_C)的强度形成液滴。图6(b)显示了用于搅拌细胞悬浮液而不排出液滴的电压。

可以通过输入多个强度不足以排出液滴的脉冲来搅拌液体腔中的细胞悬浮液，并且可以抑制在液滴未被排出期间由于细胞沉降而产生浓度分布。

下面将描述可以在本实施方式中使用的喷头的液滴形成操作。喷头可以通过向在压电元件上形成的上电极和下电极施加脉冲电压来排出液滴。图7(a)至图7(c)是显示各时刻的液滴状态的示意图。

首先，如图7(a)中所显示，通过对压电元件13c施加电压，膜12c突然变形，从而在液体腔11c内保持的细胞悬浮液和膜12c之间产生高压，并且由于压力，液滴从喷嘴单元中被推出。

接下来，如图7(b)中所显示，继续从喷嘴单元推出液体，并且在压力向上缓和之前的一段时间内液滴增长。最后，如图7(c)中所显示，当膜12c恢复原状时，在细胞悬浮液与膜12c的界面附近的液体压力下降，并且形成液滴310’。

在根据本实施方式的制备方法中，可以通过将由其中形成有孔的板制成的容器固定到可移动台上并结合台的驱动和由喷头形成液滴，使液滴依次降落在孔上。尽管这里已经描述了随着移动台来移动板的方法，但是当然可以移动喷头。

对板没有特别限制，并且可以使用在生物技术领域中通常使用的形成有孔的板。板中孔的数量没有特别限制，可以根据目的适当地选择，并且可以是一个或多个。虽然优选地使用单孔微量管、八孔管、96孔板、384孔板等作为板，但是也可以分配相同数量的细胞在这样的板中的每个孔中，或者在有多个孔的情况下，也可以放置不同数量的细胞。此外，可能存在不包含任何细胞的孔。

图8是显示用于使液滴依次降落板中的孔内的分配设备400的实例的概略图。如图8中所显示，用于使液滴降落的分配设备400包括液滴形成设备401、板700、台800和控制设备900。

在分配设备400中，板700设置在配置为可移动的台800上方。在板700上形成有多个孔710(凹部)，从液滴形成设备401的喷头排出的液滴降落在孔710上。控制设备900使台800移动并控制液滴形成设备401的喷头与每个孔710之间相对位置关系。以这种方式，可以从液滴形成设备401的喷头依次排出每个孔中包含荧光染色细胞350的液滴310。

控制设备900例如可以配置为包括CPU、ROM、RAM、主存储器等。在这种情况下，控制设备900的各种功能可以通过CPU读取记录在主存储器的ROM等中的程序并执行该程序来实现。然而，控制设备900的一部分或全部可以仅通过硬件来实现。此外，控制设备900可以物理地配置有多个装置等。

作为排出的液滴，在使细胞悬浮液降落在孔内时，优选地使液滴降落在孔内以获得多个级别。多个级别意味着作为标准的多个参考。多个级别的实例包括例如在孔中包含核酸A的多个细胞的预定浓度梯度。可以使用由传感器计数的值来控制多个级别。

[核酸B填充步骤]

在核酸B填充步骤中，容器用核酸B填充，使得核酸A中的分子数量相对于核酸B中的分子数量的比例A/B为特定比例。

核酸B的填充可以以分散或溶解在溶剂中的形式实现。填充方法没有特别限定，并且可以使用例如微量移液管通过手动技术进行填充，或者可以使用自动进样器自动进行填充。

由于核酸B中的分子数量相对于核酸A中的分子数量优选地为过量，因此在比例A/B为特定的已知比例的数值范围内允许小的测量误差，并且不需要像核酸A中的分子数量那样严格且准确地规定分子数量。测定核酸B中的分子数量的具体方法没有特别限制，并且其实例包括吸收光谱法、实时PCR法、数字PCR法、以核酸碱基为分析目标的高速液相色谱同位素稀释质谱法(LC-IDMS)、使用核酸结构中的磷的电感耦合等离子体原子发射(ICP-OES)作为指标、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)等。其中，优选地使用吸收光谱法、实时PCR法或数字PCR法。

通过吸收光谱法，可以通过在包含核酸B的溶液中测量260nm处的吸光度(OD₂₆₀)，定量核酸B的浓度，并使定量的核酸B的质量除以分子量来计算分子数量。

实时PCR法是一种定量PCR(Q-PCR)并且适用于通过随时间(实时)测量PCR中的扩增来基于扩增率定量核酸B。使用荧光染料进行定量，并且主要有嵌入法和杂交法。

在嵌入法中，核酸A的扩增反应在嵌入剂的存在下进行，嵌入剂独特地***(嵌入)到双链DNA中并发出荧光。嵌入剂的实例包括SYBR Green I(CAS No.：163795-75-3)或其衍生物。另一方面，使用TaqMan(注册商标)探针的方法是最典型的杂交法，并且使用通过将荧光物质和猝灭物质与互补寡核苷酸连接到靶核酸序列而获得的探针。

在使用实时PCR法计算核酸B中的分子数量的情况下，可以通过稍后将描述的实施例中所显示的实时PCR法测定核酸B和分子数量互不相同的多个核酸A(例如，10个分子(拷贝)、50个分子(拷贝)、100个分子(拷贝)的三个核酸A)，其中可以使用由分子数量互不相同的多个核酸A创建的校准曲线来确定核酸B的分子数量。

[细胞悬浮液生成步骤]

细胞悬浮液生成步骤是生成包含多个细胞和溶剂的细胞悬浮液的步骤，多个细胞包括细胞核中的核酸A。溶剂是指用于分散细胞的液体。细胞悬浮液中的悬浮液是指细胞以分散方式存在于溶剂中的状态。生成意味着创建。

(细胞悬浮液)

细胞悬浮液包含在细胞核中具有核酸A的多个细胞和溶剂，优选地包含添加剂，并且根据需要进一步包含其他成分。在细胞核中具有核酸A的多个细胞如上述“核酸A”的“细胞”中所描述。

(溶剂)

溶剂没有特别限制并且可以根据目的适当地选择，并且其实例包括水、培养液、分离液、稀释液、缓冲液、溶解有机物溶液、有机溶剂、聚合物凝胶溶液、胶体溶液、电解质水溶液、无机盐水溶液、金属水溶液、其混合溶液等。其中，可以单独使用一种，或者可以一起使用两种或更多种。其中，优选地使用水或缓冲液，更优选地使用水、磷酸盐缓冲液(PBS)、Tris-EDTA缓冲液(TE)。

(添加剂)

添加剂没有特别限制，可以根据目的适当地选择，并且其实例包括表面活性剂、核酸、树脂等。其中，可以单独使用一种，或者可以一起使用两种或更多种。

表面活性剂可以防止细胞间聚集并提高连续排出稳定性。表面活性剂没有特别限制并且可以根据目的适当地选择，并且其实例包括离子表面活性剂和非离子表面活性剂。其中，可以单独使用一种，或者可以一起使用两种或更多种。其中，优选地使用非离子表面活性剂，因为它不会使蛋白质变性或失活，尽管它取决于添加量。

离子表面活性剂的实例包括脂肪酸钠、脂肪酸钾、α-磺基脂肪酸酯钠、直链烷基苯磺酸钠、硫酸烷基酯钠、烷基醚磺酸酯钠、α烯烃磺酸钠等。其中，可以单独使用一种，或者可以一起使用两种或更多种。特别地，优选地使用脂肪酸钠，并且更优选地使用十二烷基硫酸钠(SDS)。

非离子表面活性剂的实例包括烷基糖苷、烷基聚氧乙烯醚(Brij系列等)、辛基苯酚乙氧基化物(Triton X系列、Igepal CA系列、Nonidet P系列、Nikkol OP系列等)、聚山梨醇酯(Tween系列，比如Tween 20等)、脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、烷基麦芽糖苷、蔗糖脂肪酸酯、糖苷脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯、脂肪酸单甘油酯等。其中，可以单独使用一种，或者可以一起使用两种或更多种。特别地，优选地使用聚山梨醇酯。

表面活性剂的含量没有特别限制，可以根据目的适当地选择，并且相对于细胞悬浮液的总量优选地为按质量计0.001％或更多且按质量计30％或更少。如果含量为按质量计0.001％或更多，则可以获得添加表面活性剂的效果，如果含量为按质量计30％或更少，则可以抑制细胞聚集，并且从而严格控制细胞悬浮液中核酸的拷贝数。

核酸没有特别限制，只要它不影响作为测试目标的核酸(核酸A和核酸B)的检测即可，并且可以根据目的适当地选择，并且其实例包括CoIE1 DNA等。通过添加核酸，可以防止核酸A附着于孔壁表面等。

树脂没有特别限制并且可以根据目的适当地选择，并且其实例包括聚乙烯亚胺等。

(其他成分)

其他成分没有特别限制并且可以根据目的适当地选择，并且其实例包括交联剂、pH调节剂、防腐剂、抗氧化剂、渗透压调节剂、润湿剂、分散剂等。

分散细胞的方法没有特别限制并且可以根据目的适当地选择，并且其实例包括介质法比如珠磨机、超声波法比如超声波均化器、利用压力差的方法比如弗氏压碎器(Frenchpress)等。其中，可以单独使用一种，或者可以一起使用两种或更多种。其中，优选地使用超声波法，因为它对细胞造成的损伤较小。在介质法中，破碎能力强，并且细胞膜或细胞壁可能被破坏，或者介质可能作为污染物混入。

筛选细胞的方法没有特别限制并且可以根据目的适当地选择，并且其实例包括湿式分类、细胞分选仪、使用过滤器的筛选等。其中，可以单独使用一种，或者可以一起使用两种或更多种。特别地，优选地使用细胞分选仪和使用过滤器的筛选，因为对细胞的损伤较小。

对于细胞，优选通过测定细胞的细胞周期，基于细胞悬浮液中所含的细胞数来估算核酸A中的分子数量。细胞周期的测定是指细胞***导致的细胞数以数值表示。核酸A中分子数量的估算是指核酸A的拷贝数是从细胞数中获得的。

计数目标可以是细胞中有多少核酸A而不是细胞的数量。由于选择每个细胞导入核酸A的一个拷贝或通过基因重组将核酸A导入细胞中，因此可以认为核酸A的数量等于细胞数量。然而，由于细胞以特定周期***，因此核酸的复制是在细胞中进行的。尽管细胞周期因细胞类型而异，但是可以通过从细胞悬浮液中取出预定量的溶液并测量多个细胞的周期来计算一个细胞中所含核酸A的数量的预期值和确定度。例如，这可以通过使用流式细胞仪观察细胞核染色的细胞来实现。

确定度是指在可能发生某些事件的情况下，预先预测特定事件发生的可能性程度并且该事件实际发生的概率。计算意味着在计算之后获得数值。

图2是显示已复制DNA的细胞的频率与荧光强度之间的关系的实例的图。如图2中所显示，在直方图中，根据有无复制DNA而出现两个峰，并且因此可以计算出DNA复制后的细胞存在的比例。可以由计算结果计算一个细胞中所含的核酸A的平均分子数量，并通过将上述细胞数计数结果乘以该计算结果来计算核酸A中估算的分子数量。

此外，优选在产生细胞悬浮液之前进行细胞周期控制处理，并且通过统一考虑上述复制发生前后的状态的数量，可以由细胞数量准确地计算核酸A中的分子数量。

对于估算的特定分子数量，优选地计算确定度(概率)。通过计算确定度(概率)，可以基于这些数值将确定度表达和输出为离散度或标准偏差。在多个因素的影响相加的情况下，可以使用通常使用的标准偏差的平方和根。例如，可以使用排出细胞数、细胞内DNA的数量、排出细胞降落在孔内的降落率等因素的正确回答率。也可以从中选择和计算影响大的项。

[细胞数计数步骤]

细胞数计数步骤是在液滴产生之后且液滴降落到容器上之前，利用传感器对液滴中包含的细胞数进行计数的步骤。传感器是指将自然现象或人造物质的机械、电磁、热、声学或化学特性或它们所指示的空间信息/时间信息转换为其他介质的信号的装置，这些信号可以通过应用一些科学原理由人或机器轻松处理。计数的意思是对数量计数。

细胞数计数步骤没有特别限制，只要在排出液滴后且在液滴降落在孔上之前可以用传感器计数液滴中包含的细胞数就可以根据传感器进行计数即可，可以根据目的适当地选择，并且可以包括在排出之前观察细胞的过程和在降落之前对细胞进行计数的过程。

在液滴排出后且液滴降落到孔上之前对液滴中所含的细胞数计数时，优选地在液滴位于孔口部分正上方的某个位置的时刻观察液滴中的细胞，液滴预计通过该孔口部分可靠地进入板中的孔。

观察液滴中的细胞的方法的实例包括光学检测方法、电或磁检测方法等。

(光学检测方法)

下面将使用图9、13和14描述用于光学检测的方法。图9是显示液滴形成设备401的实例的示意图。图13和图14是显示液滴形成设备的其他实例(401A、401B)的示意图。如图9中所显示，液滴形成设备401包括喷头(液滴排出装置)10、驱动装置20、光源30、光接收元件60和控制装置70。

在图9中，将通过对细胞进行荧光染色并将它们分散在预定溶液中而获得的液体用作细胞悬浮液，并且通过用从光源发出的特定波长的光照射从喷头形成的液滴并用光接收元件检测从细胞发出的荧光来进行计数。此时，除了用荧光染料对细胞进行染色的方法外，还可以使用细胞中原本包含的分子发出的自身荧光，或可以预先将编码荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白(GFP))的基因导入细胞中，使细胞发出荧光。用光照射是指在其上照射光。

喷头10包括液体腔11、膜12和驱动元件13，并且可以以液滴的形式排出其中悬浮有荧光染色细胞350的细胞悬浮液300。

液体腔11是保持其中悬浮有荧光染色细胞350的细胞悬浮液300的液体保持单元，和在下表面侧形成有作为贯通孔的喷嘴111。液体腔11可以由例如金属、硅或陶瓷形成。荧光染色细胞350的实例包括用荧光染料染色的无机微粒、有机聚合物颗粒等。

膜12是固定在液体腔11的上端部的膜状构件。膜12的平面形状例如可以是圆形，或者可以是椭圆形、四边形等。

驱动元件13设置在膜12的上表面侧。驱动元件13的形状可以根据膜12的形状进行设计。在膜12的平面形状为圆形的情况下，优选地提供圆形驱动元件13。

可以通过驱动装置20向驱动元件13提供驱动信号来使膜12振动。可以使包含荧光染色细胞350的液滴310通过膜12的振动从喷嘴111排出。

在将压电元件用作驱动元件13的情况下，例如，可以采用设置有用于向压电材料的上表面和下表面施加电压的电极的结构。在这种情况下，通过驱动装置20在压电元件的上电极和下电极之间施加电压，在纸张表面的横向方向上施加压缩应力，并且因此可以使膜12在纸张表面的上下方向上振动。作为压电材料，例如可以使用锆钛酸铅(PZT)。此外，可以使用各种压电材料比如氧化铁铋、金属铌酸盐、钛酸钡等，或者通过在这些材料中添加金属或不同氧化物而获得的材料。

光源30用光L照射飞翔液滴310。注意，“飞翔(flying)”是指液滴310在从液滴喷出装置10排出到降落到降落目标之间的状态。飞翔液滴310在被光L照射的位置具有大致球面形状。此外，光L的光束形状为大致圆形。

在此，光L的光束直径优选地为各液滴310的直径的约10至100倍。这是为了即使在液滴310的位置存在变化时，来自光源30的光L也能够可靠地照射液滴310。

然而，光L的光束直径显著超过液滴310直径的100倍是不优选的。这是因为照射液滴310的光的能量密度降低，因此使用光L作为激发光而发出的荧光Lf的光量减少，并且难以用光接收元件60进行检测。

从光源30发出的光L优选地为脉冲光，并且例如优选地使用固体激光、半导体激光、染料激光等。在光L为脉冲光的情况下，脉冲宽度优选地为10μs或更小并且更优选地为1μs或更小。虽然每单位脉冲的能量显著取决于光学***，比如存在/不存在聚光，但能量优选地为约0.1μJ或更多且更优选地为1μJ或更多。

荧光染色细胞350包含在飞翔液滴310中，并且光接收元件60接收由吸收作为激发光的光L的荧光染色细胞350发出的荧光Lf。荧光Lf从荧光染色细胞350向所有方向发出，并且因此光接收元件60可以设置在它可以接收荧光Lf的任何选定位置。此时，为了提高对比度，优选地将光接收元件60设置在从光源30发出的光L不直接入射的位置。

光接收元件60没有特别限制，只要该元件可以接收从荧光染色细胞350发出的荧光Lf即可，并且可以根据目的适当地选择，并且优选使用通过用具有特定波长的光照射液滴来接收来自液滴中的细胞的荧光的光学传感器。例如，尽管光接收元件60的实例包括一次元件比如光电二极管或光传感器，但是在需要高灵敏度的测定的情况下，优选地使用光电倍增管或雪崩光电二极管。作为光接收元件60，例如可以使用二次元件比如电荷耦合器件(CCD)、互补金属氧化物半导体(CMOS)、栅极CCD。

注意，由于荧光染色细胞350发出的荧光Lf与从光源30发出的光L相比较弱，因此可以在光接收元件60的前段(光接收表面侧)中安装用于衰减光L的波长范围的滤光片。因此，可以通过光接收元件60获得显著高的对比度的荧光染色细胞350的图像。作为滤光片，可以使用例如使包括光L的波长的特定波长范围衰减的凹口滤光片等

此外，如上所述，从光源30发出的光L优选地为脉冲光，但是从光源30发出的光L也可以是连续的振荡光。在这种情况下，优选控制光接收元件60，使得它可以在飞翔液滴310被连续振荡的光照射并且使光接收元件60接收荧光Lf的时刻取光。

控制装置70具有对驱动装置20和光源30进行控制的功能。此外，控制装置70具有基于由光接收元件60接收到的光量获取信息并对液滴310中所含的荧光染色细胞350的数量(包括零的情况)进行计数的功能。以下，将参照图10至12描述包括控制装置70的操作的液滴形成设备401的操作。

图10是作为实例显示图9的液滴形成设备的控制装置的硬件块的图。图11是作为实例显示图9中的液滴形成设备的控制装置的功能块的图。图12是显示液滴形成设备的操作实例的流程图。

如图10中所显示，控制装置70包括CPU 71、ROM 72、RAM 73、通信接口(通信I/F)74和总线75。CPU 71、ROM 72、RAM 73和I/F 74经由总线75相互连接。

CPU 71控制控制装置70的每种功能。作为存储装置的ROM 72存储由CPU 71执行以控制控制装置70的每种功能的程序和各种信息。作为存储装置的RAM 73用作CPU 71的工作区等。此外，RAM 73可以临时存储预定信息。I/F 74是用于将液滴形成设备401与其他设备等连接的接口。液滴形成设备401可以经由I/F 74连接到外部网络等。

如图11中所显示，控制装置70包括作为功能块的排出控制装置701、光源控制装置702和细胞数计数装置(细胞数检测装置)703。

将参照图11和12描述由液滴形成设备401执行的细胞数量的计数。首先，在步骤S11中，控制装置70的排出控制装置701向驱动装置20提供排出指令。从排出控制装置701接收到排出指令的驱动装置20向驱动元件13提供驱动信号并使膜12振动。包含荧光染色细胞350的液滴310通过膜12的振动从喷嘴111排出。

接着，在步骤S12中，控制装置70的光源控制装置702与液滴310的排出同步(与从驱动装置20向液滴排出装置10提供驱动信号同步)向光源30发出开启指令。如此，光源30开启，并且飞翔液滴310被光L照射。

注意，这里描述的同步并不意味着在液滴排出装置10执行液滴310排出的同时(与从驱动装置20向液滴排出装置10提供驱动信号同时)发出光，而是指在液滴310飞翔并到达预定位置时用光L照射液滴310时从光源30发出光。换句话说，光源控制装置702控制光源30以相对于由液滴排出装置10执行的液滴310的排出(从驱动装置20向液滴排出装置10提供的驱动信号)延迟预定时间段来发光。

例如，预先测量在将驱动信号提供给液滴排出装置10时排出的液滴310的速度v。然后，基于测量的速度v计算排出液滴310和到达预定位置之间的时间t，并且用光照射光源30的时间相对于将驱动信号提供给液滴排出装置10的时间延迟时间t。以这种方式，可以进行令人满意的发光控制并用来自光源30的光可靠地照射液滴310。

接着，在步骤S13中，控制装置70的细胞计数装置703基于来自光接收元件60的信息对液滴310所包含的荧光染色细胞350的数量(包括零的情况)进行计数。在此，来自光接收元件60的信息包括亮度值(光量)和荧光染色细胞350的面积值。

细胞计数装置703例如通过将光接收元件60接收的光量与预设的阈值进行比较，能够对荧光染色细胞350的数量进行计数。在这种情况下，可以使用一次元件或二次元件作为光接收元件60。

在将二次元件用作光接收元件60的情况下，细胞计数装置703可以使用用于执行图像处理的方法，该方法基于从光接收元件60获得的二次图像来计算荧光染色细胞350的亮度值或面积。在这种情况下，细胞计数装置703可以通过图像处理计算荧光染色细胞350的亮度值或面积值，并且将计算出的亮度值或面积值与预设的阈值进行比较，来计数荧光染色细胞350的数量。

注意，荧光染色细胞350可以是细胞或染色细胞。染色细胞是指被荧光染料染色的细胞或可表达荧光蛋白的细胞。在染色细胞中，可以使用上述荧光染料。此外，可以使用上述荧光蛋白。

以这种方式，驱动信号从驱动装置20提供给液滴排出装置10，液滴排出装置10保持其中悬浮有荧光染色细胞350的细胞悬浮液300，排出包含荧光染色细胞350的液滴310，并且在液滴形成设备401中用来自光源30的光L照射飞翔液滴310。然后，使用光L作为激发光，飞翔液滴310中包含的荧光染色细胞350发出荧光Lf，并且光接收元件60接收荧光Lf。此外，细胞计数装置703基于来自光接收元件60的信息，对飞翔液滴310中所包含的荧光染色细胞350的数量进行计数。

换句话说，根据液滴形成设备401，因为飞翔液滴310中所含的荧光染色细胞350的数量是在该位点实际观察到的，因此与相关技术相比，能够进一步提高荧光染色细胞350的数量的计数准确度。此外，由于向飞翔液滴310所含的荧光染色细胞350照射光L而发出荧光Lf，并且光接收元件60接收荧光Lf，因此能够获得高对比度的荧光染色细胞350的图像，并且因此可以减少荧光染色细胞350的数量的错误计数的发生频率。

图13是显示图9中的液滴形成设备401的修改实例的示意图。如图13中所显示，液滴形成设备401A与液滴形成设备401不同(参照图9)，因为在光接收元件60的前段设置有反射镜40。注意，可以省略与上述实施方式相同的部件的描述。

这样，在液滴形成设备401A中，在光接收元件60的前段设置反射镜40，并且因此能够提高光接收元件60的布局的自由度。

例如，尽管在使喷嘴111接近图9中的布局的降落目标的情况下有可能在降落目标与液滴形成设备401的光学***(特别是光接收元件60)之间产生干涉的问题，但是可以通过采用图13中的布局来避免干涉的发生。

如图13中所显示，通过改变光接收元件60的布局来缩短液滴310降落的降落目标和喷嘴111之间的距离(间隙)并抑制降落位置的变化。结果，可以提高分配的准确度。

图14是显示图9的液滴形成设备401的另一修改实例的示意图。如图14中所显示，液滴形成设备401B与液滴形成设备401的(参照图9)的不同之处在于，除了接收从荧光染色细胞350发出的荧光Lf₁的光接收元件60之外，还包括接收从荧光染色细胞350发出的荧光Lf₂的光接收元件61。注意，可以省略与上述实施方式相同的部件的描述。

在此，荧光Lf₁和Lf₂表示从荧光染色细胞350向所有方向发出的荧光中的一些。光接收元件60和61可以设置在它们可以接收从荧光染色细胞350在不同方向发出的荧光的任何选定位置。注意，三个或更多个光接收元件可以设置在它们可以接收从荧光染色细胞350在不同方向发出的荧光的位置处。此外，光接收元件可能具有相同的规格或可能有不同的规格。

如果设置一个光接收元件，则在多个荧光染色细胞350包含在飞翔液滴310中的情况下，由于荧光染色细胞350的重叠，存在细胞计数装置703可能会错误地计数液滴310中包含的荧光染色细胞350的数量的问题。

图15(a)和图15(b)是举例显示飞翔液滴中包括两个荧光染色细胞的情况的图。例如，可能存在如图15(a)中所示的荧光染色细胞350a和350b之间发生重叠的情况和如图15(b)中所示的荧光染色细胞350a和350b之间不发生重叠的情况。可以通过设置两个或更多个光接收元件来减少荧光染色细胞重叠的影响。

如上所述，细胞计数装置703可以通过图像处理计算来荧光粒子的亮度值或面积值并将计算出的亮度值或面积值与预设阈值进行比较来计数荧光粒子的数量。

在设置两个或更多个光接收元件的情况下，通过使用表示从每个光接收元件获得的亮度值或面积值中的最大值的数据能够抑制计数错误的发生。在这点上，将参照图16给出更详细的描述。

图16是显示粒子间没有重叠的情况下的亮度值Li和实际测量的亮度值Le之间的关系的图。如图16中所显示，在液滴中的粒子之间没有重叠的情况下，Le＝Li。如果假设一个细胞的亮度值为Lu，例如，在细胞数/液滴数＝1的情况下Le＝Lu，或者在细胞数/液滴数＝n的情况下Le＝nLu(n是自然数)。

然而，在n为2或更大的情况下，粒子之间可能会发生重叠，因此在实践中实际测量的亮度值可能是Lu≤Le≤nLu(图16中的阴影部分)。因此，在细胞数/液滴数＝n的情况下，例如可以将阈值设定为(nLu-Lu/2)≤阈值<(nLu+Lu/2)。此外，在设置多个光接收元件的情况下，通过使用从每一个光接收元件获得的数据中的最大值的数据，能够抑制计数错误的发生。注意，可以使用面积值代替亮度值。

此外，在设置有多个光接收元件的情况下，可以通过基于多个片段的形状数据估算细胞数的算法来确定细胞数。这样，因为液滴形成设备401B包括接收由荧光染色细胞350向不同方向发出的荧光的多个光接收元件，所以能够进一步降低荧光染色细胞350的计数错误的发生频率。

图17是显示图9中的液滴形成设备401的另一修改实例的示意图。如图17中所显示，液滴形成设备401C与液滴形成设备401(参照图9)的不同之处在于，液滴喷出装置10被液滴喷出装置10C代替。注意，可以省略与上述实施方式中相同的部件的描述。

液滴排出装置10C包括液体腔11C、膜12C和驱动元件13C。液体腔11C在其上部具备大气开口单元115，该大气开口单元115将液体腔11C向大气开放，并且配置为能够从大气开口单元115排出细胞悬浮液300中所含的气泡。

膜12C是固定在液体腔11C的下端部的膜状构件。在膜12C的大致中央形成有作为贯通孔的喷嘴121，并且通过膜12C的振动将保持在液体腔11C内的细胞悬浮液300作为液滴310从喷嘴121排出。由于液滴310是利用膜12C的振动的惯性形成的，因此可以排出具有高表面张力(高粘度)的细胞悬浮液300。膜12C的平面形状例如可以是圆形的，并且可以是椭圆形、四边形等。

膜12C的材质虽然没有特别限定，但是由于膜12C容易振动，因此如果材料过软，则在不能排出时难以立即降低振动，并且因此具有一定程度的硬度的材料是优选使用的。作为膜12C的材料，例如可以使用金属材料、陶瓷材料或具有一定程度的硬度的聚合物材料。

当细胞用作荧光染色细胞350时，优选地使用对细胞和蛋白质具有低粘附性的材料。通常认为细胞的粘附依赖于材料与水的接触角，并且当材料的亲水性高或其疏水性高时细胞的粘附性降低。可以使用各种金属材料或陶瓷(金属氧化物)作为亲水性高的材料，并且可以使用氟树脂等作为疏水性高的材料。

这种材料的其他实例包括不锈钢、镍、铝、二氧化硅、氧化铝、氧化锆等。此外，还可以想到通过涂覆材料表面来减少细胞粘附。例如，可以用上述金属或金属氧化物材料涂覆材料表面，或者用模拟细胞膜的合成磷脂聚合物(例如，由NOF制造的Lipidure)涂覆材料表面。

喷嘴121优选地在膜12C的大致中心处形成为大致正圆形的通孔。在这种情况下，虽然喷嘴121的直径没有特别限制，但是直径优选地为荧光染色细胞350的大小的两倍或更高，以避免喷嘴121中的荧光染色细胞350堵塞。在荧光染色细胞350为例如动物细胞，特别是人体细胞的情况下，根据所使用的细胞，细胞的大小通常为约5μm至50μm，并且因此喷嘴121的直径优选地为10μm或更大且更优选地为100μm或更大。

另一方面，如果液滴过大，则难以达到形成微小液滴的目的，并且喷嘴121的直径优选地为200μm或更小。换句话说，在液滴排出装置10C中，喷嘴121的直径通常在10μm或更大且200μm或更小的范围内。

驱动元件13C形成在膜12C的下表面侧。驱动元件13C的形状可以根据膜12C的形状来设计。例如，在膜12C的平面形状为圆形的情况下，优选地在喷嘴121的周围形成具有环状(环)平面形状的驱动元件13C。作为驱动元件13C的驱动方法，可以使用与驱动元件13类似的驱动方法。

驱动装置20可以选择性地(例如，可选地)施加通过膜12C的振动形成液滴310的排出波形和在不形成液滴310的范围内使膜12C振动的搅拌波形至驱动元件13C。

例如，通过使排出波形和搅拌波形都为矩形波，并且与排出波形的驱动电压相比降低搅拌波形的驱动电压，可以防止通过施加搅拌波形形成液滴310。换句话说，能够根据驱动电压的高低来控制膜12C的振动状态(振动程度)。

由于驱动元件13C在液滴排出装置10C中的膜12C的下表面侧形成，因此可以通过使膜12振动的驱动元件13C产生从液体腔11C的下部方向向上部方向的流动。

此时，荧光染色细胞350的运动成为从下侧向上侧的运动，在液体腔11C内产生对流，并产生包含荧光染色细胞350的细胞悬浮液300的搅拌。由于在液体腔11C内从下部方向向上部方向流动，将沉降并凝集的荧光染色细胞350均匀地分散在液体腔11C内。

换句话说，除了驱动元件13C之外，驱动装置20还能够通过基于膜12C的振动状态来控制排出波形使保持在液体腔11C内的细胞悬浮液300从喷嘴121排出为液滴310。此外，除了驱动元件13C之外，驱动装置20还可以通过基于膜12C的振动状态控制搅拌波形来搅拌保持在液体腔11C中的细胞悬浮液300。注意，在搅拌时液滴310不从喷嘴121排出。

这样，通过在未形成液滴310时搅拌细胞悬浮液300，能够防止荧光染色细胞350在膜12C上沉降并凝集，能够使荧光染色细胞350均匀地分散在细胞悬浮液300中。因此，可以减少喷嘴121的堵塞和排出液滴310中的荧光染色细胞350的数量的变化。结果，可以连续且稳定地将包含荧光染色细胞350的细胞悬浮液300排出为液滴310。

此外，可能存在液滴形成设备401C中的液体腔11C内的细胞悬浮液300中包含气泡的情况。即使在这种情况下，由于在液滴形成设备401C的液体腔11C的上部设置有大气开口单元115，并且因此能够通过大气开口单元115将细胞悬浮液300所含的气泡排出到外部空气中。以这种方式，可以连续且稳定地形成液滴310，而不需要处理大量液体以便排出气泡。

换句话说，由于在喷嘴121附近包括气泡的情况下和在膜12C中包括多个气泡的情况下对排出状态有影响，因此为了长时间稳定地形成液滴，必须排出所包含的气泡。尽管膜12C中包括的气泡通常自然地或通过膜12C的振动而向上移动，但是因为大气开口单元115设置在液体腔11C中，所以可以从大气开口单元115排出所包含的气泡。因此，即使在液体腔11C中包含气泡，也能够防止不排出发生，并且连续且稳定地形成液滴310。

注意，膜12C可以在没有形成液滴的时刻没有形成液滴的范围内振动，并且气泡可以在液体腔11C中主动地向上移动。

(电或磁检测方法)

作为电或磁检测方法，将用于计数细胞数的线圈200作为传感器提供在将细胞悬浮液作为液滴310’从液体腔11’排出到板700’的喷头的正下方，如图18中所显示。通过用特定蛋白质修饰并且能够附着至细胞的磁珠覆盖细胞，可以利用附着有磁珠的细胞通过线圈内部时产生的感应电流来检测飞翔液滴中细胞的存在/不存在。通常，细胞在其表面具有细胞特有的蛋白质，并且通过用能够附着蛋白质的抗体对磁珠进行修饰，可以使磁珠附着至细胞。可以使用现成的产品作为这样的磁珠，并且可用的实例包括由Veritas Corporation制造的Dynabeads(注册商标)。

(排出前观察细胞的过程)

在排出前观察细胞的过程的实例包括计数已通过图19中所显示的微通道250的细胞350’的方法、获取图20中所显示的喷头的喷嘴单元附近的图像的方法等。

图19中所显示的方法是在细胞分选装置中使用的方法，并且例如，可以使用SonyCorporation制造的细胞分选仪SH800Z。在图19中，通过用来自光源260的激光照射微通道250并使用聚光透镜265通过检测器255检测散射光或荧光，可以在识别细胞的存在/不存在和细胞类型的同时形成液滴。通过使用该方法，可以基于已经穿过微通道250的细胞数来预测降落在预定孔内的细胞数。

此外，可以使用由Cytena制造的单细胞打印机作为图20中所显示的喷头10’。在图20中，作为在排出前经由透镜265’由图像获取单元255’获取喷嘴单元附近的图像的结果，可以估算喷嘴单元附近的细胞350”已被排出，并且还可以通过基于排出前后图像之间的差异估算认为已排出的细胞数来推测降落在预定孔中的细胞数。虽然在图19中所显示的对穿过了微通道的细胞进行计数的方法中，液滴是连续产生的，但是图20中所显示的方法可以根据需要形成液滴，因此是更优选的。

(降落后计数细胞的过程)

作为降落后计数细胞的过程，可以采用通过用荧光显微镜等观察板内的孔来检测荧光染色细胞的方法。该方法描述于例如参考文献1(Moon S.等人，Drop-on-demandsingle cell isolation and total RNA analysis，PLoS One，Vol.6，Issue 3，e17455，2011)。

在液滴排出前和降落后观察细胞的方法具有以下问题，并且根据生成的板的类型，在排出期间观察液滴中的细胞是最优选的。

在排出前观察细胞的方法中，通过排出之前(和之后)的图像观察计数穿过通道的细胞数和推测已经降落的细胞数。因此，尚未确认细胞是否真的被排出，并且从而可能发生意外错误。例如，可能存在这样的情况，其中由于喷嘴单元的污染，液滴不能正常排出，液滴会附着到喷嘴板，并且液滴中的细胞不会降落在喷嘴板上。此外，可能存在这样的情况，其中细胞会残留在喷嘴单元的狭窄区域内，并且由于排出操作，细胞会比预想的移动的多并且移动到观察范围外。

在降落后检测板上细胞的方法也存在问题。首先，需要准备好对板进行显微镜观察。虽然，作为可观察的板，通常使用具有透明且平坦的底面的板，特别是由玻璃制成的具有底面的板，但这是特殊的板，并且存在普通孔无法使用的问题。此外，在细胞数多出几十个的时候，发生细胞重叠，并且因此存在不能正确地进行计数的问题。

因此，除了排出液滴后和液滴降落在孔上前使用传感器和细胞数计数装置对液滴中包含的细胞数进行计数之外，优选地进行排出前观察细胞的过程和降落后计数细胞的过程。

作为光接收元件，可以使用包括一个或小数量光接收单元的光接收元件，例如光电二极管、雪崩光电二极管或光电倍增管，并且作为其他实例，它也可以使用二维传感器，比如具有以二维阵列形状设置的光接收元件的电荷耦合器件(CCD)、互补金属氧化物半导体(CMOS)或栅极CCD。

当使用包括一个或小数量光接收单元的光接收元件时，也可以考虑使用预先准备的校准曲线从荧光强度确定液滴中有多少细胞，并且主要是以二值方式检测飞翔液滴中存在/不存在细胞。当细胞悬浮液中的细胞浓度足够低，并且在液滴中只有一个或零个细胞的状态下进行排出时，可以通过二值检测以足够的准确度进行计数。

假设细胞在细胞悬浮液中随机分布，则认为飞翔液滴中的细胞数服从泊松分布，并且液滴中有两个或更多个细胞的概率P(>2)为由下面的式4表示。

P(＞2)＝1-(1+λ)×_e ^-λ (式4)

图21是显示概率P(＞2)与平均细胞数之间的关系的图。在此，λ是液滴中的平均细胞数，并且这是通过将细胞悬浮液中的细胞浓度乘以排出液滴的体积而获得的。

在通过二值检测计数细胞数的情况下，概率P(>2)优选地为足够小的值以确保准确度，并且λ<0.15，这导致概率P(>2)优选地满足1％或更小。光源没有特别限制只要光源可以激发细胞的荧光，并且可以根据目的适当地选择，并且可以使用典型灯，比如经过滤波以用特定波长照射的汞灯或卤素灯、发光二极管(LED)、激光器等。然而，当形成特别是1nL的微小液滴时，需要以高光强度照射狭窄区域，并且因此优选地使用激光。作为激光光源，可以使用多种通常已知的激光器，比如固体激光器、气体激光器或半导体激光器。此外，激发光源可以连续照射液滴通过的区域，或者可以在通过与液滴的排出同步的液滴排出操作添加预定时间延迟而获得的定时以脉冲方式照射该区域。

[细胞悬浮液生成步骤、核酸A填充步骤和细胞计数步骤中估算的核酸A分子数量的确定度计算步骤]

该步骤是在每一个步骤(即核酸A填充步骤和细胞计数步骤)中计算确定度的步骤。估算的核酸A中的分子数量的确定度可以与细胞悬浮液生成步骤中的确定度类似地计算。

注意，作为确定度的计算时机，确定度可以在细胞计数步骤的下一步骤中集中计算，或者可以在每个步骤(即细胞悬浮液生成步骤、核酸A填充步骤和细胞计数步骤)结束时计算确定度，以及每个不确定度可以在细胞计数步骤的下一步中综合计算。换句话说，可以在综合计算之前适当地计算上述每个步骤中的确定度。

[输出步骤]

输出步骤是将细胞计数装置基于传感器测定的检测结果计数的值作为降落到容器内的细胞悬浮液中所含的细胞数输出的步骤。计数值是指根据传感器测量的检测结果，细胞数计数装置包含在容器中的细胞数。

输出是指响应于来自诸如电机、通信机、计算器等装置的输入而计数的值作为电子信息被发送到作为外部计数结果存储装置的服务器，或者将计数值打印为印刷品。

在输出步骤中，在板生成时观察或估算板中每个孔中的细胞数或靶核酸数，并将观察值或估算值输出到外部存储单元。输出可以与细胞计数步骤同时进行，或者可以在细胞计数步骤之后进行。

[记录步骤]

记录步骤是记录在输出步骤中输出的观察值或估算值的步骤。记录步骤可以通过记录单元适当地进行。记录可以与输出步骤同时进行，或者可以在输出步骤之后进行。记录不仅包括将信息应用到记录介质，而且还包括将信息保存在记录单元中。在这种情况下，记录介质也可以称为存储单元。

[其他步骤]

其他步骤没有特别限制，可以根据目的适当地选择，并且其实例包括酶灭活步骤等。

酶灭活步骤是使酶失活的步骤。酶的实例包括Dnase、核糖核酸酶等。使酶失活的方法没有特别限制并且可以根据目的适当地选择，并且可以适当地使用已知的方法。

<用于评价基因检测装置的性能的设备>

根据本实施方式的设备包括多个反应空间，并且在多个反应空间的至少一些中包含上述用于基因检测装置的性能评价的样品(下文也简单地称为“性能评价样品”)。

根据本实施方式的设备特别适用于评价上述基因检测装置的性能的应用。特别地，根据本实施方式的设备例如可以应用于使用定量PCR装置或下一代测序仪作为基因检查装置的液体活检。

除了性能评价样品之外，反应空间可以包含在由基因检测装置执行的处理和预处理中使用的试剂。

试剂的实例包括引物、扩增试剂等。引物是在聚合酶链式反应(PCR)中具有模板DNA(本实施方式中的核酸A和核酸B)所特有的具有18至30个碱基的互补碱基序列的合成寡核苷酸，并且设置在两个位置(一对)，即正向引物(有义引物)和反向引物(反义引物)夹住扩增目标区域。

在聚合酶链式反应(PCR)中扩增试剂的实例包括作为酶的DNA聚合酶、四种碱基(dGTP、dCTP、dATP和dTTP)、Mg²⁺(最终浓度为约1mM或更高且2mM或更低的氯化镁)、保持最佳pH(pH7.5至9.5)的缓冲液等。

反应空间中性能评价样品的状态，和如果有的话，引物和扩增试剂的状态没有特别限制并且可以根据目的适当地选择。例如，状态可以是溶液状态或固体状态中的任一种。

从可用性的观点来看，它们特别优选地处于溶液状态。如果它们处于溶液状态，则用户可以在测试中即时使用它们。从运输的观点来看，它们特别优选地处于固体状态，并且进一步优选地处于固体干燥状态。如果它们处于固体干燥状态，则可以通过分解酶等降低试剂的分解速度并提高试剂的保存性。

干燥方法没有特别限制并且可以根据目的适当地选择，并且其实例包括冷冻干燥、加热干燥、热风干燥、真空干燥、蒸汽干燥、抽吸干燥、红外线干燥、滚筒干燥、旋转干燥等。

反应空间优选包含适当量的试剂，从而通过在使用装置之前即时将固体干燥状态的试剂溶解在缓冲液或水中，试剂可以立即用作反应溶液。

根据本实施方式的设备可以在全部多个反应空间中包含性能评价样品，或者可以在多个反应空间的一些中包含性能评价样品。在后一种情况下，剩余的反应空间可以是空的或者可以包含例如具有不同组成的试剂。

在本实施方式的设备中，反应空间的形式没有特别限制，并且其实例包括孔、液滴、基板上的隔板(partition)等。例如，在反应空间为孔的情况下，本实施方式的设备可以为孔板的形式。

[孔]

孔的形状、数量、体积、材料、颜色等没有特别限制并且可以根据目的适当地选择。孔的形状没有特别限制，只要孔可以包含性能评价样品即可，并且如果有的话，可以根据目的适当地选择试剂，并且其实例包括凹部比如平底、圆底、U形底和V形底。

设置多个孔，并且其数量优选地为5个或更多，更优选地为50个或更多。适合使用孔数为2个以上的多孔板。多孔板的实例包括孔数为24、48、96、384、1536等的孔板。

每个孔的体积没有特别限制并且可以根据目的适当地选择，并且考虑到典型基因检测装置中使用的样品量，体积优选地为10μL或更大且1000μL或更小。

孔的材料没有特别限制并且可以根据目的适当地选择，并且其实例包括聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、氟树脂、丙烯酸树脂、聚碳酸酯、聚氨酯、聚氯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯等。

孔的颜色可以是例如透明的、半透明的、有色的、完全阴影的等。孔的可湿性没有特别限制并且可以根据目的适当地选择，并且孔可以具有例如斥水性。如果孔具有斥水性，则可以减少试剂对孔内壁的吸附。此外，如果孔具有斥水性，在溶液状态下孔中的试剂很容易移动。

使孔内壁具有斥水性的方法没有特别限制并且可以根据目的适当地选择，并且其实例包括氟类树脂涂膜的形成方法、氟等离子处理、压花等。通过进行获得接触角为100°或更大的斥水性的处理，能够减少因取液失败而导致的试剂量的减少，以及不确定度和变动系数的增加。

[基材]

根据本实施方式的设备优选地具有在基材上设置孔的板状，但也可以是诸如八孔管的连接型的孔管。基材的材料、形状、大小、结构等没有特别限制并且可以根据目的适当地选择。

基材的材料没有特别限制并且可以根据目的适当地选择，并且其实例包括半导体、陶瓷、金属、玻璃、石英玻璃、塑料等。其中，优选地使用塑料。

塑料的实例包括聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、氟树脂、丙烯酸树脂、聚碳酸酯、聚氨酯、聚氯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯等。

基材的形状没有特别限制并且可以根据目的适当地选择，并且其实例包括片状、板状等。基材的结构没有特别限制，可以根据目的适当地选择，并且可以是例如单层结构或多层结构。

[识别装置]

根据本实施方式的设备可以包括识别装置，该识别装置能够识别关于核酸A中的特定分子数量(例如，细胞数)的信息和关于核酸A中的分子数量相对于核酸B中的分子数量的比例A/B的信息。识别装置没有特别限制并且可以根据目的适当地选择，并且其实例包括存储器、IC芯片、条形码、QR码(注册商标)、射频识别码(下文也称为“RFID”)、分色、印刷等。

设置识别装置的位置和识别装置的数量没有特别限制并且可以根据目的适当地选择。

除了关于核酸A中的特定分子数量的信息和关于核酸A中的分子数量相对于核酸B中的分子数量的比例A/B的信息之外，识别装置存储的信息的实例还包括分析结果(例如，PM值、PM值的变化等)、细胞的生死、性能评价样品填充在多个孔中的哪个孔、性能评价样品的类型、测量日期和时间、进行测量的人的姓名等。

存储在识别装置中的信息可以使用各种读取装置来读取，并且如果识别装置是条形码，例如，条形码读取器被用作读取装置。

在识别装置中写入信息的方法没有特别限制并且可以根据目的适当地选择，并且其实例包括手动输入、当性能评估样品被分配到每个孔时直接从计数核酸A中的特定分子数量的液滴形成设备写入数据的方法、传输保存在服务器中的数据、传输保存在云端的数据等。

[其他构件]

其他构件没有特别限制并且可以根据目的适当地选择，并且其实例包括密封构件等。

为了防止在孔内包括异物、防止填充物流出等，根据本实施方式的设备优选地具备密封部件。密封构件可以被配置为能够沿着切割线被切割和分离，使得可以密封至少一个孔并且可以单独密封或打开每个孔。

密封构件的形状的实例包括符合孔内壁直径的盖形式、覆盖孔开口部分的膜形式等。

用于密封构件的材料的实例包括聚烯烃树脂、聚酯树脂、聚苯乙烯树脂、聚酰胺树脂等。密封构件优选地为可以一次密封所有孔的膜形式。此外，可以采用需要再次打开的孔和不需要打开的孔具有不同的粘合强度的配置来减少用户错误。

在根据本实施方式的设备中，一个孔中的核酸A中的特定分子数量和所有其他孔中的核酸A中的特定分子数量可以相同，或者可以是彼此不同的两个或更多个。在前一种情况下，特定分子数量的实例包括所有孔中的分子数量为1的情况、数量为5的情况、数量为10的情况、数量为20的情况、数量为40的情况、数量为80的情况、数量为160的情况等。在后者的情况下，特定分子数量的实例包括数量为1、5、20、40、80和160的情况，数量为1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的情况，数量为1、3、5、7和9的情况，数量为2、4、6、8和10的情况等。此外，一些孔可能不包含核酸A，并且可用作阴性对照。

在一个孔中的核酸A中的特定分子数量和所有其他孔中核酸A中的特定分子数量相同的装置中，容易比较孔之间的评价结果。因此，能够适当地使用用于评价基因检测装置的性能的设备。

根据本实施方式的设备可以包括一组两个或更多个孔，其中核酸A中的特定分子数量不同。例如，在设备的基材是包括多个孔的板的情况下，每个组“区域”由板上的每个组形成。注意，在由核酸A中具有不同特定分子数量的两个或更多个组形成的“区域”中，孔可以彼此相邻或可以彼此分开。

以这种方式，例如，在使用根据本实施方式的设备对基因检测装置进行测定而得到的结果中，在比较不同位置具有相同特定分子数量的孔并且存在不适合利用的孔(不适用的孔)的情况下，可以确定是否再次校准基因检测装置或是否从应用目标中排除不适合实际样品的孔中的样品。

图22(a)是显示本实施方式的设备的实例的立体图。图22(b)是沿图22(a)中的b-b’线的箭头剖视图。

设备1包括基材6和形成于基材6中的多个反应空间7，反应空间7填充有性能评价样品1。性能评价样品1包含具有特定分子数量的核酸A(2)和核酸B(3)。在图22(a)和图22(b)的实例中，反应空间是孔。此外，孔的开口部分可以用密封构件(未显示)覆盖。

此外，关于填充每个反应空间7的核酸A(2)中的特定分子数量的信息，关于核酸A(2)中的分子数量相对于核酸B(3)中的分子数量的比例A/B的信息，以及存储其他信息的IC芯片或条形码(识别装置)可以设置在密封构件和基材6之间并且处于除了孔(未显示)的开口部分之外的位置。例如，通过将识别装置设置在该位置，可以防止识别装置的意外修改等。此外，可以通过包括识别装置的设备1将设备1与没有识别装置的普通孔板区分开来。因此可以防止设备的混淆。

<制造用于基因检测装置的性能评价设备的方法>

在此，将描述制造包括多个反应空间且在多个反应空间的至少一些中包括性能评价样品的设备的方法。

根据本实施方式的制造方法包括：细胞悬浮液生成步骤：生成包含在细胞核内包括核酸A的多个细胞和溶剂的细胞悬浮液；液滴降落步骤：通过将细胞悬浮液作为液滴排出，使液滴依次降落在板中的孔内；和细胞数计数步骤：在液滴排出后且在液滴降落在孔上之前，用传感器对液滴中所含的细胞数进行计数。还优选地包括计算在细胞悬浮液生成步骤、液滴降落步骤和细胞计数步骤中估算的核酸A中分子数量的确定度的步骤、从孔内细胞提取核酸A的核酸提取步骤、输出步骤和记录步骤，并且根据需要进一步包括其他步骤。

液滴降落步骤与上述“制备用于基因检测装置的性能评价样品的方法”中的“核酸A填充步骤”相同。因此，由于使用了与上述“制备用于基因检测装置的性能评价用样品的方法”相同的步骤，细胞悬浮液生成步骤、液滴降落步骤、细胞计数步骤、计算确定度的步骤、输出步骤和记录步骤，因此将省略对这些步骤的描述。

[核酸提取步骤]

核酸提取步骤是从孔中的细胞中提取核酸A的步骤。提取是指破坏细胞膜、细胞壁等并提取核酸。作为从细胞中提取核酸A的方法，已知在90℃或更高且100℃更低下进行热处理的方法。如果在90℃或更低下进行热处理，则DNA可能无法提取，如果在100℃或更高下进行热处理，则DNA可能会分解。热处理优选地通过添加表面活性剂来进行。

表面活性剂没有特别限制并且可以根据目的适当地选择，并且其实例包括离子表面活性剂和非离子表面活性剂。其中，可以单独使用一种，或者可以一起使用两种或更多种。其中，优选地使用非离子表面活性剂，因为它不会使蛋白质变性和失活，尽管它取决于添加量。

离子表面活性剂的实例包括脂肪酸钠、脂肪酸钾、α-磺基脂肪酸酯钠、直链烷基苯磺酸钠、硫酸烷基酯钠、烷基醚磺酸酯钠、α烯烃磺酸钠等。其中，可以单独使用一种，或者可以一起使用两种或更多种。特别地，优选地使用脂肪酸钠，并且更优选地使用十二烷基硫酸钠(SDS)。

非离子表面活性剂的实例包括烷基糖苷、烷基聚氧乙烯醚(Brij系列等)、辛基酚乙氧基化物(Totiton X系列、Igepal CA系列、Nonidet P系列、Nikkol OP系列等)、聚山梨醇酯(Tween系列，比如Tween 20等)、脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、烷基麦芽糖苷、蔗糖脂肪酸酯、糖苷脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯、脂肪酸单甘油酯等。其中，可以单独使用一种，或者可以一起使用两种或更多种。特别地，优选地使用聚山梨醇酯。

相对于孔中的细胞悬浮液的总量，表面活性剂的含量优选地为按质量计0.01％或更多且按质量计5.00％或更少。如果含量为按质量计0.01％或更多，可以实现DNA提取，并且如果含量为按质量计5.00％或更少，可以防止PCR中的扩增抑制，因此这些范围适合于实现这两种效果。

对于具有细胞壁的细胞，通过上述方法可能无法充分提取DNA。这种情况下的实例包括渗透压冲击法、冻融法、酶消化法、DNA提取试剂盒的利用、超声波处理法、弗氏压碎器法、均质化法等。其中，由于提取的DNA的损失少，因此优选地使用酶消化法。

[其他步骤]

其他步骤没有特别限制并且可以根据目的适当地选择，并且其实例包括酶灭活步骤、添加试剂的步骤等。

酶失活步骤是使酶失活的步骤。酶的实例包括DNase、RNase、用于在核酸提取步骤中提取核酸的酶等。使酶失活的方法没有特别限制并且可以根据目的适当地选择，并且可以适当地使用已知的方法。

试剂的实例包括与上述“用于基因检测装置的性能评价设备”中示例的那些类似的试剂。

<用于基因检测装置的性能评价方法>

根据本实施方式的性能评价方法包括：PM值信息获取步骤：使用用于基因检测装置的性能评价设备(以下在一些情况中简称为“设备”)获取该设备中的PM值信息；和

性能评价步骤：基于PM值信息评价基因检测装置的性能，并且根据需要该方法进一步包括其他步骤。

[PM值信息获取步骤]

在PM值信息获取步骤中，使用作为评价目标的基因检测装置对性能评价样品进行核酸序列分析，并获取PM值信息。核酸序列分析中的处理可以根据基因检测装置的类型适当地选择。特别地，例如，将性能评价样品中的核酸片段化，收集片段化的核酸(预处理)，读取收集到的核酸的序列(测序)。

测序中使用的测序引物没有特别限制，并且可以基于适合扩增目标区域的序列适当地设定。至于用于测序的试剂，可以根据所使用的测序技术的类型和测序仪选择合适的试剂。

(预处理)

特别地，在预处理中，将性能评价样品中的核酸A和核酸B片段化为用测序仪读取序列的长度。样品DNA的片段化例如可以通过超声波处理、核酸片段化试剂的处理等公知的方法进行。获得的DNA片段(核酸片段)的长度范围为例如几十到几百bp。

可选地，在预处理的另一实例中，在使用PCR反应的靶序列的情况下不进行片段化，并且使用设计用于扩增靶序列(核酸A和核酸B)的引物对性能评价样品进行PCR反应。获得的PCR产物的长度范围可以为几十到几百bp。此时，通过进行在引物上添加了接头序列的尾部PCR，可以同时进行以下的接头添加步骤。

接下来，将与所使用的测序仪类型或测序方案相对应的接头序列添加到获得的DNA片段的两端(3’末端和5’末端)。然而，在使用由Ilumina，Inc.制造的测序仪或采用与由Iluimina，Inc.制造的测序仪类似的方法的装置的情况下，虽然该步骤是必需的步骤，但在使用了另一类型的测序仪的情况下也可以省略。

接头序列是用于在后面的步骤中执行测序的序列。在一个实施方式中，接头序列可以是用于与固定到要进行乳液PCR的珠子上的寡DNA杂交的序列。在另一个实施方式中，接头序列可以是用于与固定到要进行桥式PCR的流式细胞的寡DNA杂交的序列。

接头序列可以直接添加到DNA片段的两端。为了将接头序列添加到DNA片段，可以使用本领域已知的方法。例如，可以使DNA序列平滑以连接接头序列。

(测序)

作为测序技术，可以适当地选择并使用已知的方法，并且其具体实例包括上述在“用于基因检测装置的性能评价样品”中示例的相同的测序技术。

在实施方式中，下面将描述基于乳液PCR和离子半导体测序的测序方法。

首先，将添加了接头序列的DNA片段和与接头序列互补的短寡DNA连接的珠子以1:1的比例混合，然后通过将混合物与扩增试剂一起包封在油包水滴乳液中形成油中包封一个珠子且仅一个DNA片段的微反应器。以这种方式，每个DNA片段在珠子上被扩增到数百万个拷贝，而其中没有混合其他序列。

接下来，破坏乳液以浓缩珠子，将珠子放置在半导体测序芯片上的微孔内，并且然后进行序列分析。在微孔上，由与接头互补的引物进行用DNA聚合酶的延伸反应。此时，在用聚合酶使核苷酸进入DNA的过程中，氢离子被释放，并且因此显示可检测的pH变化。在半导体测序芯片上的微孔中，每孔放置大约一百万拷贝的DNA分子。用离子半导体测序仪(例如，Ion Personal Genome Machine(PGM，注册商标)测序仪等)将新的核苷酸一个接一个地添加到芯片中。在添加的核苷酸具有与微孔中的DNA中的序列互补的序列的情况下，该核苷酸被吸收到DNA中，并且氢离子被释放。结果，孔中的pH值会发生变化，并且离子传感器会检测到这种变化。这样检测到的化学信息直接转换成数字信息。如果两个相同的碱基连续出现在DNA链中，电荷就会加倍，并且芯片就会检测到两个碱基。接着，在添加的碱基不符合模板的情况下，不记录电荷变化，并且也不读取碱基。这样，离子半导体测序***直接检测碱基，并且因此不需要扫描仪、照相机、光源等，并且在几秒内运行以记录每个碱基的取用所需的时间显著缩短。

在另一个实施方式中，下文将描述基于乳液PCR和焦磷酸测序的测序方法。

作为乳液PCR的步骤，进行与上述“通过乳液PCR和离子半导体测序的测序法”相同的步骤，然后破坏乳液以浓缩珠子，并将珠子置于带有大量孔的皮克滴定仪板(picotiterplate)上进行序列分析，每个孔中可以包含一个珠子。在板上，使用DNA聚合酶从与接头互补的引物中进行延伸反应。此时，dNTP被逐一替换为通过仅添加dATP实现的反应和通过仅添加dGTP实现的反应的延伸材料。如果发生延伸反应，则焦磷酸被分离，因此可以基于由萤光素酶引起的发光反应进行检测，并且因此可以获得核酸的序列信息。

下面将描述另一个实施方式中的桥式PCR和合成测序的测序方法。

首先，将DNA片段序列应用于流式细胞。接着，作为分析目标的DNA片段在流式细胞上通过桥式PCR法进行扩增。换句话说，对作为分析目标的DNA片段进行上述预处理，将两种不同的接头序列固定在两端，使DNA片段具有单链，并将接头序列固定在流式细胞的5’末端侧。

将5’末端侧的接头序列预先固定在流式细胞上，达到桥接状态，并且通过DNA片段3’末端侧的接头序列与流式细胞上的5’末端侧上的接头序列连接形成桥接。

在该状态下利用DNA聚合酶进行DNA延伸反应，使之变性，从而获得两条单链DNA片段。

通过以该顺序重复这样的桥形成、DNA延伸反应和变性，局部固定的多个单链DNA片段的扩增可以形成簇。

然后，将形成簇的单链DNA用作模板，通过合成测序读取序列。

特别地，首先在固定在流式细胞上的单链DNA中加入荧光标记且3’末端侧封闭的DNA聚合酶和dNTP，并进一步加入序列引物。

例如，仅需要将序列引物设计为与部分接头序列杂交。换句话说，只需要设计序列引物来扩增来源于样品DNA的DNA片段，并且在添加索引序列的情况下，只需要进一步设计序列引物以扩增索引序列。

添加序列引物后，用DNA聚合酶进行3’末端封闭荧光dNTP的单碱基延伸反应。由于3’末端侧使用封闭的dNTP，一旦实现对应于一个碱基的延伸，聚合酶反应就会停止。然后，除去DNA聚合酶，用激光激发与碱基连接的荧光物质以使单链DNA延长一个碱基，并将此时产生的发光记录为照片。

在照片中，使用荧光显微镜对与A、C、G和T相对应的荧光颜色进行成像，其中改变波长滤光片以便确定四种碱基。在拍摄完所有照片之后，由照片数据确定碱基。然后，除去荧光物质和封闭3’末端侧的保护基团，并且处理进行到下一个聚合酶反应。可以通过将该流程假设为一个循环并在第二个循环、第三个循环等中重复该流程来对整个长度进行测序。

获得通过测序得到的读取序列信息。读取序列信息是显示由测序仪读取的碱基序列的数据。读取序列信息可以包括序列中每个碱基的质量分数以及读取序列。

[性能评价步骤]

在性能评价步骤中，评价核酸序列分析。核酸序列分析的评价优选基于诸如PM值(也称为PM分数)的值进行。如稍后将在实施例中描述的，发明人发现PM值的变化作为用于准确评价基因检测装置的性能的指标是特别有用的。

PM值是由读取序列信息计算的，是血浆突变分数(Plasma Mutation score)，并由每100,000个读段中每个突变的读段计数定义。PM值小表示核酸A量少，并且PM值大表示核酸A量多。在根据本实施方式的性能评价方法中，在多个反应空间中在相同条件下进行核酸序列分析的情况下，PM值的变化是指在每个反应空间中获得的PM值的变化。PM值的较小变化意味着基因检测装置的较高性能。此外，小的变化意味着基因检测装置更令人满意的的分析准确度。另一方面，PM值的较大变化意味着分析不是在最佳预处理条件和序列条件下进行的。

<用于基因检测装置的性能评价程序和性能评价装置>

根据本实施方式的性能评价程序包括：PM值信息获取步骤：使用上述设备获取设备中的PM值信息；和

性能评价步骤：基于PM值信息评价基因检测装置的性能，并且性能评价程序根据需要进一步包括其他步骤。

根据本实施方式的性能评价装置包括：PM值信息获取单元，其使用上述设备获取设备中的PM值信息；和

性能评价单元，其基于PM值信息评价基因检测装置的性能，并且性能评价装置根据需要进一步包括其他部件。

由于根据本实施方式的性能评价装置中的控制单元等执行的控制与上述基因检测装置的性能评价方法的执行具有相同的意义，因此通过对根据本实施方式的性能评价装置的描述也将阐明对基因检测装置的性能评价方法的细节。此外，由于根据本实施方式的性能评价程序是使用计算机等作为硬件资源通过基因检测装置的性能评价装置来实现的，因此通过对根据本实施方式的性能评价装置的描述也将阐明根据本实施方式的性能评价程序的细节。

[PM值信息获取步骤和信息获取单元]

获取PM值信息的步骤是上述使用设备获取PM值信息的步骤(PM值信息获取步骤)，并且由信息获取单元执行。可以使用上述设备通过基因检测装置进行核酸序列的分析(测序)来获得PM值信息。

PM值信息的实例包括PM值、PM值的变化等。在这些信息片段中，可以单独使用一种，或者可以组合使用两种或更多种进行评价。PM值的变化与上述那些类似。PM值的变化的实例包括标准偏差、CV值等。

(评价步骤和评价单元)

评价步骤是基于PM值信息评价基因检测装置的性能的步骤，并且由评价单元进行。

例如，在定性评价中，上述装置可以用于在基因检测装置中对核酸序列进行分析(测序)，测量PM值，并计算平均PM值。假设每个孔的PM值在平均PM值的10％以内表示为“A”，并且每个孔的PM值超过平均PM值的10％表示为“B”，则可以评估面内特性。

此外，通过使用根据本实施方式的设备进行特定时间段的测定，能够获得与核酸序列的分析相关的信息的时间变化。以此方式，在每个孔的PM值超过平均PM值的10％的情况下，例如可以与面内特性类似地校准基因检测装置或不使用测定位置。此外，由于设置的特定分子数量是绝对值，因此可以使用设置了相同特定分子数量的设备来比较基因检测装置的性能。

在定量评价中，通过使用根据本实施方式的设备进行特定时间段的测定，能够获得与核酸序列的分析相关的信息的时间变化。以此方式，在获得偏离质量管理值的数值的情况下，可以与面内特性类似地校准基因检测装置或不使用测定位置。此外，由于设置的分子数量是绝对值，因此可以使用配置了相同分子数量的设备来比较基因检测装置的性能。

(其他步骤和其他零件)

其他步骤和其他零件没有特别限制并且可以根据目的适当地选择，并且其实例包括显示步骤、显示单元等。

可以使用包括构成性能评价装置的控制单元的计算机来执行根据本实施方式的基于性能评价程序的处理。下文将描述性能评价装置的硬件配置和功能配置。

(性能评价装置的硬件配置)

图23是显示基因检测装置的性能评价装置100的硬件配置的实例的框图。如图23中所显示，性能评价装置100包括中央处理单元(CPU)101、主存储装置102、辅助存储装置103、输出设备104、输入设备105和通信接口(通信I/F)106。这些部件经由总线107相互连接。

CPU 101是执行各种控制和算术运算的处理装置。CPU 101通过执行操作***(OS)和存储在主存储装置102中的程序等来实现各种功能。换句话说，CPU 101通过执行基因检测装置的性能评价程序而用作基因检测装置的性能评价装置100的控制单元130。

此外，CPU 101控制基因检测装置的性能评价装置100的整体操作。注意，尽管在本文中假设控制性能评价装置100的整体操作的装置是CPU 101，但是本发明不限于此，并且例如现场可编程门阵列(FPGA)可以控制整体操作。

基因检测装置的性能评价程序和各种数据库不一定要存储在主存储装置102、辅助存储装置103等中。经由因特网、局域网(LAN)、广域网(WAN)等与基因检测装置的性能评价装置100连接的其他信息处理装置等可以存储基因检测装置的性能评价程序和各种数据库。基因检测装置的性能评价装置100可以从这些其他信息处理装置获取基因检测装置的性能评价程序和各种数据库，并执行程序和数据库。

主存储装置102存储各种程序，并存储执行各种程序所需的数据等。主存储装置102包括未被显示的只读存储器(ROM)和随机存取存储器(RAM)。

ROM存储各种程序，例如基本输入/输出***(BIOS)。RAM用作当由CPU 101执行存储在ROM中的各种程序时开发的工作范围。RAM没有特别限制并且可以根据目的适当地选择。RAM的实例包括动态随机存取存储器(DRAM)、静态随机存取存储器(SRAM)等。

辅助存储装置103没有特别限制，只要它可存储各种类型的信息，并且可以根据目的适当地选择，并且其实例包括固态驱动、硬盘驱动等。此外，辅助存储装置103可以是例如便携式存储装置，诸如紧凑盘(CD)驱动器、数字多功能盘(DVD)驱动器或蓝光(注册商标)盘(BD)。

作为输出设备104，可以使用显示器、扬声器等。显示器没有特别限制，可以适当使用已知的显示器，并且其实例包括液晶显示器和有机EL显示器。

输入设备105只要能够接收对测试装置的性能评价装置100的各种要求即可，没有特别限定，可以适当使用公知的输入设备，其实例包括键盘、鼠标、触控面板等。

通信接口(通信I/F)106没有特别限定，可以适当使用已知的通信接口，并且其实例包括无线或有线通信装置等。

如上所述的硬件配置可以实现基因检测装置的性能评价装置100的处理功能。

(性能评价装置的功能配置)

图24是显示基因检查装置的性能评价装置100的功能配置的实例的图。如图24中所显示，性能评价装置100包括输入单元110、输出单元120、控制单元130和存储单元140。

控制单元130包括信息获取单元131和评价单元132。控制单元130控制整个性能评价装置100。存储单元140包括信息数据库141和评价结果数据库142。下文中“数据库”可以称为“DB”。信息获取单元131使用存储在存储单元140的信息DB 141中的数据来获取关于核酸序列分析的信息。例如，信息DB 141存储通过如上所述的实验预先获得的数据，比如PM值。

注意，链接到设备的信息可以存储在信息DB 141中。对DB的输入可以由连接到性能评价装置100的另一个信息处理装置执行，或者可以由操作员执行。

评价单元132基于关于核酸序列的分析的信息评价基因检测装置的性能。评价基因检测装置的性能的具体方法如上所述。由评价单元132获得的对基因检测装置的性能的评价结果被存储在存储单元140中的评价结果DB 142中。

接下来，将描述根据本实施方式的性能评价程序的处理过程。图25是显示基因检测装置的性能评价装置100中的控制单元130的性能评价程序的处理过程的流程图。

在步骤S110中，性能评价装置100的控制单元130的信息获取单元131获取存储在存储单元140的信息DB 141中的关于核酸序列的分析的信息数据，并转移到S111中处理。

在步骤S111中，性能评价装置100的控制单元130的评价单元132基于获取的信息评价基因检测装置的性能，并转移到S112中处理。

在步骤S112中，性能评价装置100中的控制单元130将获得的基因检测装置的性能评价结果保存在存储单元140的评价结果DB 142中并结束处理。

实施例

尽管将基于以下实施例描述本发明，但是本发明不限于以下实施例。

[实施例1]

(填充拷贝数少的核酸并评价填充准确度)

1.制备拷贝数少的核酸

(1)人工核酸的设计

用于合并到酵母中的人工核酸在后面描述的(2)中产生。人工核酸被设计为具有与EGFR基因的外显子18、19、20和21区域相同的同源序列，并且能够在EGFR基因的突变分析时用相同的引物进行扩增。将限制酶位点***到外显子序列中。人工核酸包含五种类型的突变作为检测目标。五个合并的突变是e19_deletion、T790M、C797S、L858R和L861Q，它们是众所周知的EGFR基因突变。所产生的人工核酸包括由序列号1表示的碱基序列。

(2)产生拷贝数少的核酸系列的酵母悬浮液

(2-1)重组酵母的制备

将出芽酵母YIL015W/BY4741(由ATCC制造；ATCC4001408)用作特定核酸序列的一个拷贝的载体细胞，从而产生重组体。作为特定的核酸序列，预先制作将上述(1)中设计的人工核酸和作为选择标记的URA 3基因串联导入的质粒。使用该质粒通过同源重组将一个拷贝的人工核酸导入载体细胞的基因组DNA的Bar1基因区，从而产生重组酵母。产生了一种具有突变EGFR基因的重组体。

(2-2)重组酵母的培养和细胞周期的控制

在包含在50g/L YPD培养基(由Takara Bio Co.,Ltd.制造；CLN-630409)中培养的90mL重组酵母的三角烧瓶中，加入包含500μg/mLα1-Mating Factor乙酸盐(由Sigma-Aldrich制造；T6901-5MG，下文在一些情况下称为“α-factor”)的900μL Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水(由Thermo Fisher Scientific Co.,Ltd.制造；14190-144；下文也可称为“DPBS”)，并使用生物摇床(由Taitec Co.,Ltd.制造；BR-23FH)以250rpm的摇动速率和28℃的温度温育2小时，并且从而获得其中酵母处于G0/G1期的酵母悬浮液。

(2-3)重组酵母的固定化

将确认为G0/G1期的45mL酵母悬浮液转移至离心管(由Azuwan Co.,Ltd.制造；VIO-50R)，使用离心机(由Hitachi,Ltd.制造；F16RN)以3000rpm的转速对混合物离心5分钟，并从中除去上清液以获得酵母颗粒。将4mL***(由Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.制造；062-01661)加入获得的酵母颗粒中，并将混合物静置5分钟并离心以除去上清液，从而获得酵母颗粒。然后，将10mL乙醇添加到获得的酵母颗粒中并悬浮，从而获得固定化酵母悬浮液。

(2-4)重组酵母的核染色

分配200μL固定化酵母悬浮液，用DPBS洗涤一次，并且再悬浮在480μL DPBS中。在加入20μL 20mg/mL RNase A(由Nippon Gene Co.Ltd.制造；318-06391)后，使用生物摇床将混合物在37℃温育2小时。然后，向其中加入25μL 20mg/mL的蛋白酶K(由Takara BioInc.制造；TKR-9034)，并使用Petit Cool(由Wakenbee Tech Co.,Ltd.制造；Petit CoolMiniT-C)将混合物在50℃温育2小时。最后，向其中加入6μL 5mM SYTOX Green NucleicAcid Stain(由Thermo Fisher Scientific Co.,Ltd.制造；S7020)以将混合物在阴凉处染色30分钟。

(2-5)重组酵母的分散

使用超声波均化器(由Yamato Scientific Co.,Ltd.制造；LUH150)以30％的输出将进行核染色的酵母悬浮液分散10秒以获得酵母悬浮液油墨。

2.填充拷贝数少的核酸

(1)计数酵母悬浮液的数量并分配酵母悬浮液

对液滴中的酵母菌数进行计数，将1个细胞排出到每个孔，并且通过以下的方法产生细胞数已知的板。特别地，使用液滴形成设备(由Ricoh Japan Corporation制造)，使用基于压电应用方法的喷头(由Ricoh Japan Corporation制造)作为液滴排出装置，以10Hz将酵母悬浮液油墨依次排出到96孔板(“MicroAmp 96-well Reaction plate”(产品名称)，由Thermo Fisher Scientific Co.,Ltd.制造)的每个孔中。

使用高灵敏度照相机(由Tokyo Instruments,Inc.制造；sCMOS pco.edge)作为光接收装置，用于对排出液滴中的酵母进行成像。将YAG激光器(由Spectra Physics,Inc.制造；Explorer ONE-532-200-KE)用作光源，使用Image J图像处理软件作为粒子计数装置进行图像处理，粒子计数装置用于对捕获的图像进行细胞计数，并产生具有一个细胞的已知板。

(2)核酸提取

将1mg/mL酵母裂解酶(R)100T(由NACALAI TESQUE，INC.制造；07665-55)加入包含5ng/μL ColE1 DNA(由Wako Pure Chemical Industries制造；312-00434)的Tris-EDTA(TE)Buffer(下文在一些情况下称为“ColE1/TE”)，从而制备酵母裂解酶溶液。

在产生的细胞数已知的板的各孔中加入4μL酵母裂解酶溶液，在37.2℃下温育30分钟以溶解细胞壁(提取核酸)，并且然后在95℃对其进行热处理2分钟，从而产生参比设备。

(3)不确定度的计算

接下来，为了考虑从具有一个细胞的已知板(参比设备)获得的结果的可靠性，计算了一个细胞的不确定度。注意，对于每个特定的拷贝数，可以使用下面描述的方法计算各种拷贝数的不确定度。

作为液滴中的细胞数，使用通过对排出装置排出的液滴的图像分析计数的液滴中的细胞数和通过使排出装置排出的液滴降落在载玻片上并用显微镜观察每个降落的液滴而获得的细胞数。

作为细胞中核酸(细胞周期)的拷贝数，使用细胞周期的G1期对应的细胞比例(99.5％)和G2期对应的细胞比例(0.5％)用于计算。

虽然将排出的液滴降落在孔内的数量计为孔内细胞数，但在对96个样品的计数中，所有液滴降落在孔内，并且将孔内细胞数的因素从不确定度计算中排除。

关于污染，进行了3次试验，以检查在4μL油墨滤液的实时PCR中导入细胞核的核酸以外的核酸是否没有包含在油墨液中。结果，在所有三个试验中都获得了检测下限，并且因此污染因素也被排除在不确定度的计算之外。

作为不确定度，通过平方和法从通过从每个因素的测定值获得标准偏差并乘以灵敏度系数来统一计量量的单位而获得的标准不确定度(以下也称为“标准不确定度(测量量单位)”)而获得合成标准不确定度。由于合成标准不确定度仅包括正态分布约68％范围内的值，因此采用通过将合成标准不确定度加倍的扩展不确定度可以获得考虑到正态分布约95％的不确定度。结果如表2中所显示。

[表2]

在表2中，“符号”是指与不确定度因素相关的任何选定符号。“值(±)”是平均值的实验标准偏差，并且是通过将计算的实验标准偏差除以数据数量的平方值获得的。“概率分布”是每个不确定度因素所具有的概率分布，在A类不确定度评价的情况下该部分为空，并且B类不确定度评价时输入正态分布或矩形分布。“除数”是指对从每个因素获得的不确定度进行归一化的数字。“标准不确定度”是“值(±)”除以“除数”所获得的值。“灵敏度系数”是指用于将单位统一为计量量单位的值。

接下来，计算填充孔的核酸样品的平均特定拷贝数和不确定度。结果显示在表3中。通过将不确定度值除以平均特定拷贝数来计算变化系数CV值。

[表3]

确认了将特定拷贝数为1(即，1拷贝)的核酸(一个酵母)分配到孔中的准确度为±0.1281拷贝。在孔中填充了一个或多个拷贝的情况下，达到填充特定拷贝数的核酸的准确度被认为是通过准确度的累积来确定的。

基于上述结果，通过将获得的扩展不确定度存储为测量变化的指标，实验中的用户可以将不确定度的指标用作每个孔的测量结果的可靠性的确定标准并作为设备的数据。此外，通过使用上述可靠性确定基准，能够高准确度地进行分析测试的性能评价。

(4)将不确定度值应用于孔

然后，将如表2中计算的不确定度(或变化系数)的值应用于每个孔。

以这种方式，可以计算出低浓度核酸系列的平均核酸计数值、其不确定度和变化系数，并将值应用于每个孔。

[实施例2]

(EGFR基因的突变分析)

1.超低等位基因频率样品的制备

使用与实施例1中类似的步骤，将1拷贝包含实施例1中设计的人工核酸(突变EGFR基因)的酵母填充到样品填充孔中，以具有规定的拷贝数。用于e19_deletion突变分析的孔的规定拷贝数为53拷贝，用于T790M和C797S突变分析的孔各64拷贝，和用于L858R和L861Q突变分析的孔各7拷贝。

接下来，将用酵母填充的每个样品填充孔填充4.0μL(7.5ng/μL)人类基因组DNA(由Promega制造)。该填充量对应于包含约一万拷贝的正常EGFR基因的量。填充后，在样品填充孔中进行混合以制备具有0.07％、0.53％和0.64％的超低等位基因频率的样品。此外，制备通过将导入了实施例1中设计的人工核酸(突变EGFR基因)的酵母基因组DNA手动稀释以具有各拷贝数(7、53和64拷贝)添加到孔中的样品，作为对照。以与上述类似的方式向其中添加人类基因组DNA(由Promega制造)以制备手动稀释样品(对照组)。注意，对照组中使用的酵母基因组DNA是使用用于酵母高回收的Gen Toru Kun(注册商标)(由TakaraBiomedical Inc.制造)提取的。

2.PCR法核酸扩增

接下来，使用与“1”中类似的方法对具有超低等位基因频率的样品和“1”中制备的手动稀释样品进行核酸提取。接着，将提取的各核酸在样品填充孔中通过PCR法进行扩增反应。反应溶液组成共50μL，包括25.0μL无核酸酶水、5.0μL 10×KOD-Plus-Buffer、5.0μL2mM dNTPs、2.0μL 25mM MgSO₄、2.0μL PCR引物F(10μM)、2.0μL PCR引物R(10μm)、1.0μLKOD-Plus(1U/μL)、4.0μL人类基因组DNA(7.5ng/μL)和4.0μL突变EGFR基因(包括酵母裂解酶0.4U)。作为PCR引物，对每个外显子应用24种索引，并使用具有索引的引物。特别地，使用了包含以下碱基序列的引物。注意，索引序列(INDEX)是包括任意选定的五个碱基的序列。

[表4]

通过PCR法的DNA扩增反应使用T100TM Thermal Cycler(由Bio-rad制造)进行。作为具体的反应条件，首先在94℃下温育2分钟。之后，进行40个循环，包括3个阶段：在94℃下15秒、在50℃下30秒和在68℃下15秒。最后将产物冷却至10℃，并结束反应。

3.通过QIAquick纯化PCR产物

使用QIAquick(由QIAGEN制造)纯化PCR产物。操作根据方案进行。此时，将产物转移至PCR反应容器中，使用ION chef***进行后续乳液PCR。

4.浓度测量

将Qubit3.0(由Thermo Fisher Scientific Co.,Ltd.制造)用于测量PCR产物的浓度。基于测得的浓度，将所有样品分配到1.5mL管中以具有相同的浓度，并使用无核酸酶水(NFW)稀释至12pM。

5.使用ION chef***进行乳液PCR和芯片加载

根据ION chef***的方案进行乳液PCR反应和芯片加载。

6.通过ION PGM测序

根据ION PGM方案进行序列分析。下文中对超低等位基因频率的样品(以下也统称为“IJ组”)进行3次运行(每个n＝24，5个区域)，并且手动稀释样品进行1次运行(每个n＝24，5个区域)。

7.数据采集和分析

根据EGFR液体的方法(参考文献2：“Kukita Y等人，“QuantitativeIdentification of Mutant Alleles Derived from Lung Cancer in Plasma Cell-FreeDNA via Anomaly Detection Using Deep Sequencing Data”，PLoS ONE，第8卷，第11期，e81468，2013)，进行了数据采集和分析。

8.考虑因素

图26是显示基于从IJ组的3次运行和手动稀释样品(也称为对照组或“手动组”)的1次运行获得的读段计数计算的PM分数的图。注意，在图26中，IJ 1到IJ3表示第一次运行到第三次运行的分析结果。阐明了IJ组中所有样品的变化都较小。此外，图27和图28是显示上述PM分数的表，并且同样阐明了，也与CV值相比，IJ组在所有条件下的变化均较小。注意，“CV值”是通过将标准偏差除以平均值获得的百分比。

这些结果表明，可以通过喷墨法准确地生产具有低等位基因频率的样品，这些样品不能通过手动稀释产生，并表明作为液体活检标准样品的适当性和再现性。

[实施例3]

(检测EGFR基因突变分析的线性)

1.制备具有超低等位基因频率的样品

使用与实施例1类似的步骤，将1拷贝包含实施例1中设计的人工核酸(突变EGFR基因)的酵母填充到样品填充孔中，以具有规定的拷贝数。作为规定的拷贝数，准备了5个级别，即0拷贝、7拷贝、53拷贝、64拷贝和100拷贝。

接下来，将用酵母填充的每个样品填充孔填充4.0μL(7.5ng/μL)人类基因组DNA(由Promega制造)。该填充量对应于包含约一万拷贝的正常EGFR基因的量。在填充后，在样品填充孔中进行混合以制备超低等位基因频率分别为0.07％、0.53％、0.64％和1.00％的样品。

2.通过PCR法进行核酸扩增

使用与实施例2中描述的类似的方法进行核酸扩增。

3.通过QIAquick纯化PCR产物

使用与实施例2中描述的类似的方法纯化PCR产物。

4.浓度测量

使用与实施例2中描述的类似的方法测量浓度。

5.使用ION chef***进行乳液PCR和芯片加载

使用与实施例2中描述的类似的方法进行使用ION chef***的乳液PCR和芯片加载。

6.通过ION PGM测序

根据ION PGM方案进行序列分析。该序列在具有超低等位基因频率的样品(下文在一些情况下统称为“IJ组”)上进行一次运行(每个级别n＝4，5个级别(0、7、53、64、100)，和两个区域(T790M，L858R))。

7.数据采集和分析

使用与实施例2中描述的类似的方法进行数据采集和分析。

8.考虑因素

图29是显示基于从一次运行获得的读段计数计算的PM分数的图。纵轴表示PM分数，横轴表示导入每个孔内的拷贝数。阐明了T790M和L858R二者均显示高线性。黑色虚线表示从导入的拷贝数预期的PM分数，并且两个突变不符合这条线的原因是因为突变和野生序列之间的扩增效率或检测效率不同。在该实例中，突变型T790M与野生型相比具有更高的扩增效率或检测效率，并且与实际导入的拷贝数相比具有更高的PM分数。相反，L858R具有较低的扩增效率或检测效率，并且与预期的PM分数相比，整体分数较低。

这些结果意味着输出PM分数因突变而异。这是一个实例，其中可以阐明基于能够通过喷墨法准确地产生的具有低等位基因频率的样品的测试的特性，该样品不能通过手动稀释产生。

[实施例4]

(EGFR基因的突变分析2)

使用三个不同的操作员和两种不同类型的设备进行与实施例2中类似的操作，并且将差异可视化。具体步骤如下。

1.制备具有超低等位基因频率的样品

使用与实施例1类似的步骤，将1拷贝包含实施例1中设计的人工核酸(突变EGFR基因)的酵母填充到样品填充孔中，以具有规定的拷贝数。作为规定的拷贝数，准备了四个级别，即10拷贝、30拷贝、50拷贝、100拷贝的孔。接下来，将用酵母填充的每个样品填充孔填充4.0μL(7.5ng/μL)人类基因组DNA(由Promega制造)。该填充量对应于包含约一万拷贝的正常EGFR基因的量。在填充后，在样品填充孔中进行混合以制备具有0.1％、0.3％、0.5％和1.0％的超低等位基因频率的样品。

2.样品分布

将“1”中调节的具有超低等位基因频率的样品的所需量分配给操作员A和B中的每一个。此时，在每个拷贝数级别中，操作员A的需要量为72孔，和操作员B的需要量为36孔。

3.通过PCR法核酸扩增

将“2”中分布的具有超低等位基因浓度的每个样品在样品填充孔内通过PCR法进行扩增反应。反应溶液组成共50μL，包括25.0μL无核酸酶水、5.0μL 10×KOD-Plus-Buffer、5.0μL 2mM dNTPs、2.0μL 25mM MgSO4、2.0μL PCR引物F(10μM)、2.0μL PCR引物R(10μM)、1.0μl的KOD-Plus(1U/μL)、4.0μL人类基因组DNA(7.5ng/μL)和4.0μL突变EGFR基因(包括酵母裂解酶0.4U)。作为PCR引物，对每个外显子应用24种索引，并且使用具有索引的引物。特别地，使用了包含上述表4中所显示的碱基序列的引物。注意，索引序列(INDEX)是包括任意选定的五个碱基的序列。

使用T100TM Thermal Cycler(由Bio-rad制造)进行通过PCR法的DNA扩增反应。作为具体的反应条件，首先在94℃下温育2分钟。之后，进行40个循环，包括3个阶段：在94℃下15秒、在50℃下30秒和在68℃下15秒。最后将产物冷却至10℃，并结束反应。

4.通过QIAquick纯化PCR产物

使用QIAquick(由QIAGEN制造)纯化PCR产物。根据方案进行操作。此时，将产物转移至PCR反应容器中，使用ION chef***进行后续乳液PCR。

5.浓度测量

使用Qubit3.0(由Thermo Fisher Scientific Co.,Ltd.制造)来测量PCR产物的浓度。基于测得的浓度，将所有样品分配到1.5mL管中以达到相同浓度，并且然后使用无核酸酶水(NFW)稀释至15nM。在下文中，这可以被称为库。

6.库的发送

操作员A发送在“5”之前执行的库，对应于操作员C的两次运行的量。操作员C再次测量“5”中接收的库的浓度。

7.使用ION chef***进行乳液PCR和芯片加载

操作员A和B使用设备1的ION chef***根据方案进行乳液PCR反应和芯片装载。

操作员C使用设备2的ION chef***根据方案进行乳液PCR反应和芯片装载。

8.使用ION PGM的序列

操作员A和B使用设备1的ION PGM根据方案进行序列分析。操作员A进行了四次运行，而操作员B进行了两次运行。

操作员C使用设备2的ION PGM根据方案进行序列分析。操作员C进行了两次运行。此后，操作员C再次对第一次运行中使用的库进行运行，并且总共进行了3次运行。

9.数据采集和分析

数据采集和分析根据EGFR液体的方法进行(参见上面列出的参考文献2)。

10.考虑因素

图30是显示基于从操作员A/设备1的4次运行、操作员B/设备1的两次运行和操作员C/设备2的3次运行获得的读段计数计算的PM分数的图。注意，由于操作员C的第一次运行和第三次运行使用了相同的库，因此这通过用图中的实线连接显示。各级别的平均值和CV如下表5至9所示。添加星号至CV超过30％的级别。

[表5]

[表6]

[表7]

[表8]

[表9]

如图30和表5至9中所显示，通过喷墨法的手动稀释无法准确地产生等位基因频率低的样品，造成显示操作员之间以及设备之间的差异。

[实施例5]

(EGFR基因的突变分析的线性检查2)

1.制备具有超低等位基因频率的样品

使用与实施例1类似的程序，将1拷贝包含实施例1中设计的人工核酸(突变EGFR基因)的酵母填充到样品填充孔中，以具有规定的拷贝数。作为规定的拷贝数，准备了四个级别，即10拷贝、30拷贝、50拷贝和100拷贝。

接下来，将用酵母填充的每个样品填充孔填充4.0μL(7.5ng/μL)人类基因组DNA(由Promega制造)。该填充量对应于包含约一万拷贝的正常EGFR基因的量。填充后，在样品填充孔中进行混合以制备具有0.1％、0.3％、0.5％和1.0％的超低等位基因频率的样品。

2.通过PCR法的核酸扩增

使用与实施例2中描述的类似的方法进行核酸扩增。

3.通过QIAquick纯化PCR产物

使用与实施例2中描述的类似的方法纯化PCR产物。

4.浓度测量

使用与实施例2中描述的类似的方法测量浓度。

5.使用ION chef***进行乳液PCR和芯片加载

使用与实施例2中描述的类似的方法进行使用ION chef***的乳液PCR和芯片加载。

6.通过ION PGM的序列

根据ION PGM方案进行序列分析。该序列对具有超低等位基因频率的样品进行1次运行(每个级别n＝6、4个级别(10、30、50、100)，5个区域(T790M、L861Q、C797S、E19_del和L858R))。

7.数据采集和分析

使用与实施例2中描述的类似的方法进行数据采集和分析。

8.考虑因素

显示基于从具有超低等位基因频率的样品的一次运行中获得的读取计数计算的PM分数和具有等位基因频率的样品的一次运行中获得的读取计数计算的PM分数之间的关系的图显示在图31(T790M、L861Q、C797S)和图32(E19_del、L858R)。在在图31和32中，纵轴代表PM分数，而横轴代表等位基因频率。阐明了T790M、L861Q、C797S、E19_del和L858R均显示高线性度。

[实施例6]

(使用核酸A的测定值确定核酸B的拷贝数的方法)

研究了用于准确限定比核酸A的拷贝数更多的核酸B的拷贝数的方法。对多级别的核酸A进行qPCR，基于其测定值进行回归分析，并绘制校准曲线。将作为核酸B的拷贝数的数值代入校准曲线，并将其用作核酸A的校准曲线的外推值。核酸B也以类似的方式进行qPCR，并将该测定值与核酸A的校准曲线的外推值进行比较，以确认核酸B的测定值包含在一定的接受标准内，从而限定核酸B的拷贝数酸。具体流程如下所示。

1.制备具有超低等位基因频率的样品

使用与实施例1类似的步骤，将1拷贝包含实施例1中设计的人工核酸(突变EGFR基因)的酵母填充到作为核酸A的样品填充孔中，以获得规定的拷贝数。作为规定的拷贝数，准备了四个级别，即10拷贝、30拷贝、50拷贝和100拷贝。对于每个级别，准备12个孔。

接下来，在作为核酸B的样品填充孔中填充4.0μL(7.5ng/μL)人类基因组DNA(由Promega制造)。该填充量对应于包含约一万拷贝的正常EGFR基因的量。这是为48个孔准备的。

2.qPCR

在每个孔中通过qPCR法对“1”中制备的具有超低等位基因频率的样品进行扩增反应。反应溶液组成共20μL，包括3.6μL无核酸酶水、10.0μL TaqMan(注册商标)UniversalPCR Master Mix、1.0μL qPCR引物F(10μM)、1.0μL qPCR引物R(10μM)、0.4μL TaqMan(注册商标)探针和4.0μL人类基因组DNA(7.5ng/μL)或突变EGFR基因(含酵母裂解酶0.4U)。作为qPCR引物，使用TaqMan(注册商标)Probe，包含以下碱基序列的引物。

[表10]

使用QuantStudio^TM 12K Flex Real-Time PCR System(由Thermo FisherScientific Co.,Ltd.制造)进行qPCR。作为具体的反应条件，在50℃下温育2分钟。此后，在95℃下进行10分钟的温育。然后，进行50个循环，包括两个步骤，即在95℃下30秒和在61℃下1分钟。最后将产物冷却至10℃，并结束反应。

3.回归分析和外推值计算

从包含核酸A的反应孔中10至100个拷贝的qPCR的测量结果(Cq值：定量循环)获得回归线。取拷贝数(以10为底)的常用对数，并由线性函数获得回归线。将作为核酸B的拷贝数的10000拷贝的常用对数4代入该回归线的方程并用作外推值。

接着，除了包含核酸的反应孔中的10至100个拷贝之外，获得包括10000个核酸B拷贝的Cq值的5个级别的回归线。与仅核酸A的回归线类似，取拷贝数的常用对数，并通过线性函数获得回归线。

图33的左图以横轴表示拷贝数，并且图33的右图以横轴表示拷贝数的常用对数。

4.考虑因素(外推值与核酸B平均值的比较)

外推值为26.10，并且核酸B的Cq值的平均值为25.91。该差值是0.19，并且当换算成拷贝数时差值是2^0.19，大约是14％。

由以上结果，可以使用通过使用通过喷墨法准确地确定了拷贝数的核酸A而得到的测定值来确定核酸B的拷贝数。

本发明包括下述方面。

(1)一种用于评价基因检测装置的性能的样品，所述样品包括：

核酸A；和核酸B，

其中核酸A和核酸B具有互不相同的序列，

包含具有特定分子数量的核酸A，

包含多于核酸A的分子数量的核酸B，和

规定核酸A的分子数量相对于核酸B的分子数量的比例A/B。

(2)根据(1)所述的样品，其中核酸A的分子数量是1或更多且200或更少。

(3)根据(1)或(2)所述的样品，其中核酸A和核酸B的分子总数是30000或更少。

(4)根据(1)至(3)中任一项所述的样品，其中所述核酸A的分子数量相对于所述核酸B的分子数量的比例A/B是10％或更小。

(5)根据(1)至(4)中任一项所述的样品，其中所述核酸A的分子数量相对于所述核酸B的分子数量的比例A/B是1％或更小。

(6)根据(1)至(5)中任一项所述的样品，其中核酸A和核酸B是脊椎动物的DNA。

(7)根据(1)至(6)中任一项所述的样品，其中核酸A和核酸B是人类基因组DNA。

(8)根据(1)至(7)中任一项所述的样品，其中所述核酸A的分子数量相对于所述核酸B的分子数量的比例A/B对应于特定遗传病的发生频率。

(9)根据(8)所述的样品，其中核酸A为有突变的EGFR基因，并且所述核酸B为无突变的EGFR基因。

(10)根据(9)所述的样品，其中核酸A包括碱基序列，所述碱基序列包含其中所述EGFR基因的外显子18、19、20和21串联连接的序列。

(11)根据(1)至(10)中任一项所述的样品，其中所述基因检测装置是下一代测序仪。

(12)一种用于(1)至(11)中任一项所述的样品的方法，所述方法包括以下步骤：

合并步骤：将所述核酸A合并到细胞核内的核酸中；

核酸A填充步骤：在容器内产生液滴，液滴包含一个其中将所述核酸A合并到细胞核内的核酸中的细胞，并通过控制所述液滴的数量用特定数量的细胞进行填充；和

核酸B填充步骤：在容器内用所述核酸B进行填充，使得所述核酸A的分子数量相对于所述核酸B的分子数量的比例A/B为特定比例。

(13)根据(12)所述的方法，其中所述细胞为酵母或哺乳动物细胞。

(14)根据(12)或(13)所述的方法，其中在所述核酸B填充步骤中，通过吸收光谱法或实时PCR法测量核酸B的分子数量。

(15)根据(14)所述的方法，其中在所述核酸B填充步骤中，通过所述实时PCR法测量所述核酸B和分子数量互不相同的多个核酸A，并且使用由分子数量互不相同的多个核酸A创建的校准曲线确定核酸B的分子数量。

(16)一种用于评价基因检测装置的性能的设备，其包括：多个反应空间，

其中根据(1)至(11)中任一项所述的样品包含在至少一些反应空间中。

(17)一种用于评价基因检测装置的性能的方法，其包括使用根据(16)所述的用于评价基因检测装置的性能的设备的以下过程：PM值信息获取过程：获取用于评价性能的设备中的PM值信息；和

性能评价过程：基于所述PM值信息评价所述基因检测装置的性能。

(18)一种用于评价基因检测装置的性能的程序，其使计算机执行：

PM值信息获取步骤：使用根据(16)所述的用于评价基因检测装置的性能的设备在用于评价性能的设备中获取PM值信息；和

性能评价步骤：基于所述PM值信息评价基因检测装置的性能。

(19)一种用于评价基因检测装置的性能的设备，其包括：

PM值信息获取单元，其配置为通过使用根据(16)所述的用于评价基因检测装置的性能的设备在用于评价性能的设备中获取PM值信息；和

性能评价单元，其配置为基于PM值信息评价基因检测装置的性能。

附图标记列表

1：设备

2：核酸A

3：核酸B

4：用于评价性能的样品

5：用于评价性能的样品的优先区域

6：基材

7：反应空间(孔)

10、10’、10C：喷头(液滴排出装置)

11、11a、11b、11c、11C、11’：液体腔

12、12C：膜

13、13C：驱动元件

13a：电机

13b、13c：压电元件

20：驱动装置

30、260：光源

40：反射镜

60、61：光接收元件

70：控制装置

71、101：CPU

72：ROM

73：RAM

74、106：I/F

75：总线

100：性能评价装置

102：主存储装置

103：辅助存储装置

104：输出设备

105：输入设备

107：总线

111、111a、111b、111c、121：喷嘴

112：电磁阀

115：大气开口单元

200：线圈

250：微通道

255：检测器

255’：图像获取单元

265、265’：透镜

300、300a、300b、300c：细胞悬浮液

310、310’：液体液滴

350、350a、350b、350’、350”：细胞

400：分配设备

401、401A、401B、401C：液滴形成设备

700、700’：板

710：孔

800：台

900：控制设备

L：光

Lf、Lf₁、Lf₂：荧光

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本未审查专利申请，首次公开号2019-80501。

序列表

<110> 株式会社理光

<120> 用于评价基因检测装置的性能的样品、制备所述样品的方法、以及用于评价性能的设备、用于评价性能的方法、用于评价性能的程序和用于评价基因检测装置的性能的设备

<130> 202004656

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 658

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 1

ttatatcagt tattacccgg gtacccatgg tgagggctga ggtgaccctt gtctctgtgt 60

tcttgtcccc cccagcttgt ggagcctctt acacccagtg gagaagctcc caaccaagct 120

ctcttgagga tcttgaagga aactgaattc aaaaagatca aagtgctggc ctccggtgcg 180

ttcggcacgg tgtataaggt aaggtccctg gcacaggcct ctgggctggg ccgcagggag 240

ctctgtcata gggactctgg atcccagaag gtgagaaagt taaaattccc gtcgctatca 300

acatctccga aagccaacaa ggaaatcctc gatgtgagtt tctgctttgc tgtgtggggg 360

tccatggctc tgagctccac gtgtgccgcc tgctgggcat ctgcctcacc tccaccgtgc 420

agctcatcat gcagctcatg cccttcggct ccctcctgga ctatgtccgg gaacacaaag 480

acaatattgg ctcccagtac ctgagctcaa cgtactggtg aaaacaccgc agcatgtcaa 540

gatcacagat tttggccggg ccaaacagct gggtgcggaa gagaaagaat accatgcaga 600

aggaggcaaa gtaaggaggt ggctttaggt cagccagcat tttccttcta gagtcgac 658

<210> 2

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(35)

<223> 索引序列

<400> 2

ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag nnnnnccaga aggtgagaaa gttaaaa 57

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 3

cctctctatg ggcagtcggt gatagcaaag cagaaactca cat 43

<210> 4

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(35)

<223> 索引序列

<400> 4

ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag nnnnncatct gcctcacctc ca 52

<210> 5

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 5

cctctctatg ggcagtcggt gatgtctttg tgttcccgga cat 43

<210> 6

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(35)

<223> 索引序列

<400> 6

ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag nnnnngcagc atgtcaagat cacag 55

<210> 7

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 7

cctctctatg ggcagtcggt gataaagcca cctccttact ttg 43

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 8

aggtgaccct tgtctctgtg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 9

cctcaagaga gcttggttgg 20

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 10

agcttgtgga gcctcttaca cccagt 26

Claims (19)

1.一种用于评价基因检测装置的性能的样品，其包括：

核酸A；和

核酸B，

其中所述核酸A和所述核酸B具有互不相同的序列，

包含具有特定分子数量的核酸A，

包含多于所述核酸A的分子数量的核酸B，

并且规定了核酸A的分子数量相对于核酸B的分子数量的比例A/B。

2.根据权利要求1所述的样品，其中所述核酸A的分子数量是1或更多且200或更少。

3.根据权利要求1或2所述的样品，其中所述核酸A和所述核酸B的分子总数是30000或更少。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的样品，其中所述核酸A的分子数量相对于所述核酸B的分子数量的比例A/B是10％或更小。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的样品，其中所述核酸A的分子数量相对于所述核酸B的分子数量的比例A/B是1％或更小。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的样品，其中所述核酸A和所述核酸B是脊椎动物的DNA。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的样品，其中所述核酸A和所述核酸B是人类基因组DNA。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的样品，其中所述核酸A的分子数量相对于所述核酸B的分子数量的比例A/B对应于特定遗传病的发生频率。

9.根据权利要求8所述的样品，其中所述核酸A为有突变的EGFR基因，并且所述核酸B为无突变的EGFR基因。

10.根据权利要求9所述的样品，其中所述核酸A包括碱基序列，所述碱基序列包含其中所述EGFR基因的外显子18、19、20和21串联连接的序列。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的样品，其中所述基因检测装置是下一代测序仪。

12.一种用于制备根据权利要求1至11中任一项所述的样品的方法，所述方法包括：

合并步骤：将所述核酸A合并到细胞核内的核酸中；

核酸A填充步骤：在容器内产生液滴，所述液滴包含一个将所述核酸A合并到细胞核内的核酸中的细胞，并通过控制所述液滴的数量用特定数量的细胞进行填充；和

核酸B填充步骤：在所述容器内用所述核酸B进行填充，使得所述核酸A的分子数量相对于所述核酸B的分子数量的比例A/B为特定比例。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述细胞为酵母或哺乳动物细胞。

14.根据权利要求12或13所述的方法，其中在所述核酸B填充步骤中，通过吸收光谱法或实时PCR法测量所述核酸B的分子数量。

15.根据权利要求14所述的方法，其中在所述核酸B填充步骤中，通过所述实时PCR法测量所述核酸B和分子数量互不相同的多个核酸A，并且使用由分子数量互不相同的多个核酸A创建的校准曲线确定所述核酸B的分子数量。

16.一种用于评价基因检测装置的性能的设备，其包括：

多个反应空间，

其中根据权利要求1至11中任一项所述的样品包含在至少一些所述反应空间中。

17.一种用于评价基因检测装置的性能的方法，其包括使用根据权利要求16所述的用于评价基因检测装置的性能的设备的以下步骤：

PM值信息获取步骤：在用于评价性能的所述设备中获取PM值信息；和

性能评价过程：基于所述PM值信息评价所述基因检测装置的性能。

18.一种用于评价基因检测装置的性能的程序，所述程序使计算机执行：

PM值信息获取步骤：使用根据权利要求16所述的用于评价基因检测装置的性能的设备在用于评价性能的所述设备中获取PM值信息；和

性能评价步骤：基于所述PM值信息评价基因检测装置的性能。

19.一种用于评价基因检测装置的性能的设备，包括：

PM值信息获取单元，其配置为通过使用根据权利要求16所述的用于评价基因检测装置的性能的设备在用于评价性能的所述设备中获取PM值信息；和

性能评价单元，其配置为基于所述PM值信息评价所述基因检测装置的性能。

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