ES2599814T3 - Métodos y ácidos nucleicos relacionados con el gen GLI3 para análisis de trastornos proliferativos celulares - Google Patents

Abstract

Un método para la detección de cáncer colorrectal en un sujeto, que comprende determinar el nivel de expresión de al menos el gen PCDHGC3 en una muestra biológica aislada de dicho sujeto en donde la metilación y/o la expresión a la baja de CpG es indicativa de la presencia o clase de cáncer colorrectal.

Description

Métodos y ácidos nucleicos relacionados con el gen GLI3 para análisis de trastornos proliferativos celulares

Campo de la invención

La presente invención se refiere a secuencias de ADN genómico que muestran patrones de expresión alterados en estados de enfermedad con respecto a la normalidad.

Antecedentes

Incidencia y diagnóstico del cáncer.

El cáncer es la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos. Las tasas de mortalidad podrían mejorar significativamente si se pudieran mejorar los métodos de escrutinio actuales en términos de la conformidad del paciente, la sensibilidad y la facilidad de escrutinio. Los métodos recomendados actuales para el diagnóstico del cáncer son a menudo costosos y no son adecuados para su aplicación como pruebas de escrutinio para la población general.

En los Estados Unidos, la incidencia anual de cáncer colorrectal es de aproximadamente 150.000, con 56.600 individuos que mueren por cáncer colorrectal cada año. El riesgo de cáncer colorrectal a lo largo de la vida en la población general es de aproximadamente 5 a 6 por ciento. A pesar de los intensos esfuerzos en los últimos años en el escrutinio y la detección temprana del cáncer de colon, hasta hoy la mayor parte de los casos se diagnostican en fase avanzada con metástasis regional o distante. Si bien las opciones terapéuticas incluyen cirugía y quimioterapia coadyuvante o paliativa, la mayor parte de los pacientes mueren por el progreso de su cáncer en unos pocos meses. La identificación de los cambios moleculares que subyacen al desarrollo del cáncer de colon puede ayudar a desarrollar nuevas opciones de verificación, escrutinio, diagnóstico y terapia que podrían mejorar la mala prognosis general para estos pacientes.

Las pautas actuales para el escrutinio colorrectal de acuerdo con la American Cancer Society utilizan una de cinco diferentes opciones para el escrutinio en individuos de riesgo medio de 50 años de edad o más mayores. Estas opciones incluyen 1) prueba de sangre oculta en heces (FOBT) anualmente, 2) sigmoidoscopía flexible cada cinco años, 3) FPBT anual más sigmoidoscopía flexible cada cinco años, 4) enema de bario de doble contraste (DCBE) cada cinco años o 5) colonoscopia cada diez años. Incluso aunque estos procedimientos de prueba son bien aceptados por la comunidad médica, la implementación de un escrutinio generalizado para el cáncer colorrectal no se ha logrado. La conformidad por parte del paciente es un factor principal para el uso limitado debido a la incomodidad o inconveniencia asociadas con los procedimientos. La prueba FOBT, aunque no es un procedimiento invasivo, requiere restricciones en la dieta y otras 3-5 días antes de la prueba. Los niveles de sensibilidad para este ensayo también son muy bajos para el adenocarcinoma colorrectal con una amplia variabilidad que depende de la prueba. Las medidas de sensibilidad para la detección de adenomas son incluso menores puesto que la mayoría de los adenomas no sangran. Por el contrario, la sensibilidad para los procedimientos más invasivos tales como la sigmoidoscopia y la colonoscopia es bastante elevada debido a la visualización directa del lúmen del colon. Pruebas no aleatorizadas han evaluado la eficacia de estas técnica, no obstante, utilizando datos de estudios de casos y controles y datos del National Polyp Study (U.S.) se ha demostrado que la eliminación de pólipos adenomatosos da como resultado una reducción de 76-90% en la incidencia de CRC. La sigmoidoscopia tiene la limitación de visualizar solamente el lado izquierdo del colon dejando las lesiones del colon derecho sin detectar. Ambos procedimientos de exploración son costosos, requieren una preparación catártica y tiene un mayor riesgo de morbididad y mortalidad. Claramente se necesitan pruebas mejoradas con una mayor sensibilidad, especificidad, facilidad de uso y disminución de los costes antes de que el escrutinio amplio general del cáncer colorrectal se convierta en una rutina.

La detección precoz del cáncer colorrectal se basa generalmente en la prueba de sangre oculta en las heces (FOBT) realizada anualmente en individuos asintomáticos. Las recomendaciones actuales adaptadas por varias organizaciones para el cuidado de la salud, incluyendo la American Cancer Society, reclaman pruebas de sangre oculta en las heces a principios de la edad de 50, repetidas anualmente hasta que el paciente ya no se pueda beneficiar del escrutinio. Una FOBT positiva conduce a un examen colonoscópico del intestino; un procedimiento costoso e invasivo, con una tasa de complicaciones graves de uno por cada 5.000 exámenes. Solamente 12% de los pacientes con deposiciones positivas para sangre son diagnosticados de cáncer o de pólipos grandes en el momento de la colonoscopia. Numerosos estudios muestran que el escrutinio FOBT no mejora la mortalidad relacionada con el cáncer o la supervivencia general. La conformidad con la prueba de sangre oculta ha sido escasa; menos de 20 por ciento de la población se ofrece o completa una FOBT recomendada. Si la FOBT se realiza apropiadamente, el paciente recoge una muestra fecal de tres movimientos consecutivos del intestino. Las muestras se obtienen mientras el paciente se adhiere a unas pautas dietéticas y evita medicaciones que se sabe que inducen sangrado gastrointestinal oculto. En realidad, los médicos frecuentemente no logran instruir adecuadamente a los pacientes, los pacientes frecuentemente no siguen las directrices del protocolo, y algunos pacientes encuentran la tarea de recoger las muestras fecales difícil o desagradable, por consiguiente la conformidad con la prueba de sangre oculta anual es escasa. Si la sensibilidad y la especificidad de la prueba se pudieran mejorar por encima de las de los métodos actuales, la frecuencia de la prueba se podría reducir, la recogida de muestras consecutivas se podría eliminar, las modificaciones de la dieta y el programa de medicación se podrían eliminar, y la conformidad del paciente aumentaría. Para complicar el problema de la conformidad, la sensibilidad y la especificidad de la FOBT para detectar el cáncer de colon son escasas. La escasa especificidad de la prueba conduce a una colonoscopia innecesaria, añadiendo un coste considerable al escrutinio del cáncer de colon.

Se ha calculado que la especificidad de la FOBT es a lo sumo de 96%, con una sensibilidad de 43% (adenomas) y de 50% (carcinoma colorrectal). La sensibilidad se puede mejorar utilizando un inmunoanálisis FOBT tal como el producido bajo el nombre de fábrica 'InSure™', con una sensibilidad mejorada de 77% (adenomas) y 88,9% (carcinoma colorrectal).

Marcadores de enfermedades moleculares. Los marcadores de enfermedades moleculares ofrecen varias ventajas sobre otros tipos de marcadores, siendo una ventaja que incluso las muestras de tamaños muy pequeños y/o las muestras cuya arquitectura de tejidos no se ha mantenido pueden ser analizadas bastante eficazmente. En la última década se ha demostrado que numerosos genes son expresados diferencialmente entre la normalidad y los carcinomas de colon. Sin embargo, no se ha demostrado que ningún marcador solo o combinado, sea suficiente para el diagnóstico de los carcinomas de colon. Se ha demostrado recientemente que los enfoques multi-dimensionales basados en ARNm son capaces de proporcionar mejores medios para distinguir entre diferentes tipos de tumores y lesiones benignas y malignas. Sin embargo, su aplicación como herramienta de diagnóstico rutinaria en el entorno clínico se ve obstaculizada por la extrema inestabilidad del ARNm, los cambios de expresión que se producen rápidamente después de ciertos desencadenantes (p. ej., la recogida de muestras), y, lo más importante, la gran cantidad de ARNm necesario para el análisis (Lipshutz, R. J. et al., Nature Genetics 21:20-24, 1999; Bowtell, D. D. L. Nature genetics suppl. 21:25-32, 1999), que a menudo no se puede obtener de una biopsia rutinaria.

Se ha sugerido el uso de marcadores biológicos para mejorar adicionalmente la sensibilidad y la especificidad de la FOBT, los ejemplos de tales pruebas incluyen el ensayo de análisis de las deposiciones PreGen-Plus™ asequible de EXACT Sciences que tiene una sensibilidad de 20% (adenoma) y 52% (carcinoma colorrectal) y tiene una especificidad de 95% en ambos casos. Esta prueba analiza la presencia de 23 mutaciones de ADN asociadas con el desarrollo de neoplasmas de colon. Se conoce el uso de la metilación del ADN como marcador del cáncer de colon. Por ejemplo Sabbioni et al. (Molecular Diagnosis 7:201-207, 2003) detectaron hipermetilación de un panel de genes que consisitía en TPEF, HIC1, DAPK y MGMT en sangre periférica en 98% de pacientes de carcinoma de colon. No obstante, esto proporciona una base adecuada para una prueba comercializable, puesto que la especificidad de semejante prueba también es suficientemente elevada.

El modelo actual de patogénesis colorrectal favorece un progreso por etapas de los adenomas, que incluye el desarrollo de displasia y finalmente signos de cáncer invasivo. Los cambios moleculares subyacentes a esta secuencia de adenoma-carcinoma incluyen alteraciones genéticas y epigenéticas de genes supresores de tumores (APC, p53, DCC), la activación de oncogenes (K-ras) y la inactivación de genes de reparación de emparejamientos erróneos de ADN. Recientemente, se han revelado otros cambios moleculares y defectos genéticos. De este modo, la activación de la ruta de señalización Wnt no incluye solamente mutaciones del gen APC, si no que también puede resultar de mutaciones de la β-catenina. Además, las alteraciones en la ruta de señalización TGF-β junto con sus transductores de señales SMAD4 y SMAD2 se han vinculado al desarrollo del cáncer de colon.

A pesar del reciente progreso en la comprensión de la patogénesis de los adenomas y carcinomas del colon y sus cambios genéticos y moleculares, los cambios genéticos y epigenéticos subyacentes al desarrollo de metástasis son menos comprendidos. No obstante, en general, está aceptado que el proceso de invasión y proteolisis de la matriz extracelular, así como la infiltración de la membrana basal vascular implica proteínas adherentes, tales como miembros de la familia de receptores de integrina, las cadherinas, la superfamilia de inmunoglobulinas, la proteína de unión a laminina y el receptor de CD44. Aparte de la adherencia, el proceso de formación de metástasis también incluye la inducción y regulación de la angiogénesis (VEGF, bFGF), la inducción de la proliferación celular (EGF, HGF, IGF) y la activación de enzimas proteoliticas (MMP, TIMP, uPAR), así como la inhibición de la apoptosis (Bcl-2, Bcl-X). Más recientemente, otros grupos han comparado los cambios genéticos y moleculares en las lesiones metastásicas con los cambios encontrados en los cánceres colorrectales primarios. De este modo, Kleef et al. informaron de la pérdida de DOC-2, un gen supresor de tumores candidato, tanto en el cáncer colorrectal primario como metastásico. Además, Zauber et al. informaron de que en su serie de 42 cánceres colorrectales, las mutaciones Ki-ras en los cánceres primarios fueron idénticas en las 42 lesiones primarias y metastásicas sincrónicas emparejadas. De un modo similar, la pérdida de heterocigosidad del locus APC fue idéntica para los 39 carcinomas y metástasis sincrónicas emparejadas. Los autores concluyeron que para los genes Ki-ras y APC, los cambios genéticos son idénticos al cáncer colorrectal primario. No obstante, otros grupos han encontrado cambios genéticos y moleculares en cánceres de colon metastásicos, que no están presentes en los cánceres primarios. Así, se ha informado sobre el desarrollo de LOH del cromosoma 3p en las metástasis colorrectales.

Metilación de islas CpG. Aparte de las mutaciones, se ha demostrado que la metilación aberrante de islas CpG conduce al silenciamiento transcripcional de ciertos genes que han sido previamente vinculados a la patogénesis de diversos cánceres. Las islas CpG son secuencias cortas que son ricas en dinucleótidos CpG y normalmente se pueden encontrar en la región 5' de aproximadamente 50% de todos los genes humanos. La metilación de las citosinas en estas islas conduce a la pérdida de expresión génica y ha sido referida en la inactivación del cromosoma X y la impronta genómica.

Recientemente varios grupos también han analizado la metilación de diversos genes en el cáncer colorrectal y han informado sobre el silenciamiento transcripcional por metilación del promotor para p16INK4, p14ARF, p15INK4b, MGMT, hMLH1, GSTP1, DAPK, CDH1, TIMP-3 y APC entre otros. De ese modo, aparte de la inactivación mutacional de ciertos genes, la hipermetilación de estos genes también contribuye significativamente a la patogénesis de esta enfermedad. Véase también "Reverse transcirption primer used in cDNA analysis technique", EBI accession no. GSN:AAQ75611, 4 de Agosto de 1995 y "Oligonucleotide for detecting cytosine methylation SEQ ID NO: 2679.", EBI accession no. GSN:ABQ16088

En los últimos años se han identificado varios genes que están metilados en el cáncer de colon por MS-APPCR. Este grupo de genes, entre otros, incluye TPEF/HPP1 que frecuentemente está metilado en cánceres de colon y que fue identificado independientemente por dos grupos diferentes utilizando el método MS-APPCR (véase, p. ej., Young J, Biden KG, Simms LA, Huggard P, Karamatic R, Eyre HJ, Sutherland GR, Herath N, Barker M, Anderson GJ, Fitzpatrick DR, Ramm GA, Jass JR, Leggett BA. HPP1: a transmembrane protein-encodin gene commonly methylated in colorectal polyps and cancers. Proc Natl Acad Sci USA 98:265-270, 2001). Para la identificación de genes en cancer pancreático véase Pogue-Geile et al., Cancer Genomics & Proteomics, Vol.1 1 Enero 2004, p 371-386.

Enfoque multifactorial. El diagnóstico del cáncer ha contado tradicionalmente con la detección de marcadores moleculares individuales (p. ej., mutaciones de genes, niveles elevados de PSA). Lamentablemente, el cáncer es un estado de enfermedad en el que los marcadores individuales no han logrado detectar o diferenciar típicamente muchas formas de la enfermedad. De este modo, se ha demostrado que los ensayos que reconocen solamente un único marcador tienen un valor predictivo limitado. Un aspecto fundamental de esta invención es que los diagnósticos de cáncer basados en la metilación y el escrutinio, el diagnóstico, y el seguimiento terapéutico de tales enfermedades proporcionarán mejoras significativas sobre el estado de la técnica que utiliza ensayos de marcadores individuales mediante el uso de una selección de marcadores múltiples. El enfoque analítico multiplexado está particularmente bien adaptado para el diagnóstico del cáncer puesto que el cáncer no es una simple enfermedad, este enfoque de "panel" multi-factorial es coherente con la naturaleza heterogénea del cáncer, tanto citológicamente como clínicamente.

Resulta clave para la implementación satisfactoria de un enfoque de paneles para las pruebas de diagnóstico basadas en la metilación el diseño y desarrollo de paneles optimizados de marcadores que puedan caracterizar y distinguir los estados de enfermedad. La presente invención describe una pluralidad de paneles de genes particularmente eficaces y únicos, el análisis de metilación de uno o una combinación de miembros del panel que permite la detección de los trastornos proliferativos de células de colon con una sensibilidad, especificidad y/o valor predictivo particularmente elevados.

Desarrollo de pruebas médicas. Dos mediciones valorativas clave de cualquier escrutinio médico o prueba de diagnóstico son su sensibilidad y su especificidad, que miden cómo de bien funciona la prueba para detectar con exactitud todos los individuos afectados sin excepción, y sin incluir falsamente individuos que no tienen la enfermedad diana (valor predictivo). Históricamente, muchas pruebas de diagnóstico han sido criticadas debido a la escasa sensibilidad y especificidad.

Un resultado positivo verdadero (TP) se produce cuando la prueba es positiva y la afección se encuentra presente. Un resultado falso positivo (FP) se produce cuando la prueba es positiva pero la afección no se encuentra presente. Un resultado negativo verdadero (TN) se produce cuando la prueba es negativa y la afección no se encuentra presente. Un resultado falso negativo (FN) se produce cuando la prueba es negativa pero la afección no se encuentra presente. En este contexto: Sensibilidad = TP/(TP + FN); Especificidad = TN/(FP + TN); y Valor predictivo = TP/(TP + FP).

La sensibilidad es una medición de la capacidad de la prueba para detectar correctamente la enfermedad diana en un individuo que está siendo sometido a la prueba. Una prueba que tiene una sensibilidad escasa produce una tasa elevada de falsos negativos, esto es, los individuos que tienen la enfermedad pero son falsamente identificados por estar libres de esa enfermedad concreta. El daño potencial de un falso negativo es que el individuo enfermo pueda permanecer sin diagnosticar y sin tratar durante cierto período de tiempo, durante el cual la enfermedad puede progresar a una fase más tardía en la que los tratamientos, si los hubiera, pueden ser menos eficaces. Un ejemplo de una prueba que tiene una baja sensibilidad es una prueba de sangre basada en proteínas para el VIH. Este tipo de prueba muestra una escasa sensibilidad debido a que no logra detectar la presencia del virus hasta que la enfermedad está bien establecida y el virus ha invadido el torrente sanguíneo en una cantidad sustancial. Por el contrario, un ejemplo de una prueba que tiene una elevada sensibilidad es la detección de carga viral que utiliza la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La elevada sensibilidad se logra debido a que este tipo de prueba puede detectar cantidades muy pequeñas de virus. La alta sensibilidad es particularmente importante cuando las consecuencias de la falta de diagnóstico son elevadas.

La especificidad, por otra parte, es una medición de la capacidad de una prueba para identificar con exactitud pacientes que están libres del estado de enfermedad. Una prueba que tiene una escasa especificidad produce una elevada tasa de falsos positivos, esto es, individuos que son falsamente identificados por tener la enfermedad. Una desventaja de los falsos positivos es que obligan a los pacientes a experimentar tratamientos con procedimientos médicos innecesarios con sus consiguientes riesgos, estreses emocionales y financieros, y que podrían tener efectos adversos sobre la salud del paciente. Una característica de las enfermedades que hace difícil desarrollar pruebas de diagnóstico con una elevada especificidad es que los mecanismos de la enfermedad, concretamente en el cáncer, a menudo implican una pluralidad de genes y proteínas. Adicionalmente, ciertas proteínas se pueden elevar por razones no relacionadas con un estado de enfermedad. Un ejemplo de una prueba que tiene una elevada especificidad es una prueba basada en genes que puede detectar una mutación en p53. La especificidad es importante cuando el coste o el riesgo asociados con otros procedimientos de diagnostico o con otra intervención médica son muy elevados.

Necesidad pronunciada en la técnica. Generalmente se acepta que existe una necesidad pronunciada en la técnica de un mejor escrutinio y detección temprana del cáncer. Como ejemplo, si la especificidad del escrutinio del cáncer de colon se puede incrementar, el problema de los resultados falsos positivos de las pruebas que conduce a un examen colonoscópico innecesario se reduciría conduciendo a un ahorro en el coste y a una mayor seguridad.

A la vista de la incidencia de los cánceres en general y más concretamente de las desventajas asociadas con los actuales métodos de escrutinio de trastornos proliferativos de las células colorrectales, existe una necesidad sustancial en la técnica de métodos mejorados para la detección precoz del cáncer, en particular del cáncer de colon, para utilizarlos además de, o como sustitutos de las pruebas disponibles en la actualidad.

Antecedentes de los genes de la presente invención. El gen de la Septina 9 humana (lamben conocido como proteína de fusión de tipo septina MLL, proteína de fusión de tipo septina MLL MSF-A, SIpa, Eseptina, Msf, proteína de tipo septina Septina de Ovario/Mama (septina Ov/Br) y Septina D1) está localizado en el cromosoma 17q25 Dentro del cóntigo AC068594.15.1.168501 y es un miembro de la familia del gen de la Septina. El SEQ ID NO: 12 proporciona la secuencia de dicho gen, que comprende las regiones de los transcritos tanto de Septina 9 como Q9HC74 y las regiones promotoras. El SEQ ID NO: 13 y el SEQ ID NO: 14 proporcionan regiones ricas en CpG de dicho gen particularmente preferidas de acuerdo con la presente invención.

Se ha postulado que los miembros de la familia de genes de la Septina están asociados con múltiples funciones celulares que varían entre el transporte de vesículas y la citoquinesis. La interrupción de la acción de la Septina 9 da como resultado una división celular incompleta, véase Surka, M.C., Tsang, C.W., y Trimble, W.S. Mol Biol Cell, 13:353245 (2002). Se ha demostrado que la Septina 9 y otras proteínas son compañeros de fusión del proto-oncogen MLL sugiriendo un papel en la tumorigénesis, véase Osaka, M, Rowley, J.D. y Zeleznik-Le, N.J. PNAS, 96:6428-6433 (1999). Buroorws et al. informaron sobre un estudio profundo de la expresión de las múltiples isoformas del gen de Septina 9 en el cáncer de ovario y mostraron una expresión específica del tejido de varios transcritos, véase Burrows, J.F., Chanduloy, et al S.E.H. Journal of Pathology, 201:581-588 (2003).

Un estudio reciente (de la técnica anterior publicada después de la fecha de prioridad) sobre 7000 tejidos normales y tumorales indica que existe una constante expresión en exceso de las isoformas de Septina 9 en numerosos tejidos tumorales, véase Scott, M., Hyland, P.L. et al. Oncogene, 24: 4688-4700 (2005). Los autores especulan que el gen es probablemente un gen de cáncer de tipo II en el que los cambios en la regulación del control del procesamiento del transcrito de ARN de diferentes productos, y los niveles de estas isoformas de proteínas alteradas pueden proporcionar respuestas al papel del gen en la neoplasia.

KAY L. POGUE-GEILE ET AL: CANCER GENOMICS & PROTEOMICS, vol. 1, 1 Enero 2004 (2004-01-01), páginas 371-386 divulga que el ARNm de PCDHGC3, como se analizó en una micromatriz de ADNc, es subexpresado en cáncer pancreático.

La base de datos Geneseq [Rn línea] 4 de Agosto de 1995, recuperada de EBI accession no. GSN:AAQ75611 divulga una secuencia que tiene 100 % de identidad con la SEQ ID NO:17 de la presente solicitud.

El documento WO2007/073220, publicado el 28.07.2007 (es decir, después de la fecha de prioridad de la presente solicitud) divulga que un gran número de genes, por ejemplo, PCDHGC3, se expresan diferencialmente entre recaída y la no recaída del cáncer colorrectal

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1 a 10 proporcionan una visión general de la media log de metilación medida por medio del ensayo HM de acuerdo con el Ejemplo 2. Cada figura consiste en tres gráficos, los gráficos en la parte superior y en el medio proporcionan el análisis binario y multi-clase respectivamente, la sensibilidad se muestra en el eje de la Y, la metilación del ADN medida en (log 10 ng/mL) se muestra en el eje de la X.

En cada figura el gráfico en la parte inferior proporciona una ROC en donde la sensibilidad se muestra sobre el eje de la Y y 1-especificidad se muestra en el eje de la X.

La Figura 1 proporciona una visión general del funcionamiento del ensayo HM de RASSF2 de acuerdo con el Ejemplo 2, en todas las muestras.

La Figura 2 proporciona una visión general del funcionamiento del análisis HM de Septina 9 de acuerdo con el Ejemplo 2, en todas las muestras.

Figura 3 proporciona una visión general del funcionamiento del ensayo HM de SND1 de acuerdo con el Ejemplo 2, en todas las muestras.

La Figura 4 proporciona una visión general del funcionamiento del ensayo HM de PCDHGC3 de acuerdo con el Ejemplo 2, en todas las muestras.

La Figura 5 proporciona una visión general del funcionamiento del ensayo HM de TFAP2E de acuerdo con el Ejemplo 2, en todas las muestras.

La Figura 6 proporciona una visión general del funcionamiento del ensayo HM de RASSF2 de acuerdo con el Ejemplo 2, en todas las muestras de tejido con carcinoma colorrectal y colorrectales normales.

La Figura 7 proporciona una visión general del funcionamiento del ensayo HM de Septina 9 de acuerdo con el Ejemplo 2, en todas las muestras de tejido con carcinoma colorrectal y colorrectales normales.

La Figura 8 proporciona una visión general del funcionamiento del ensayo HM de SND1 de acuerdo con el Ejemplo 2, en todas las muestras de tejido con carcinoma colorrectal y colorrectales normales.

La Figura 9 proporciona una visión general del funcionamiento del ensayo HM de PCDHGC3 de acuerdo con el Ejemplo 2, en todas las muestras de tejido con carcinoma colorrectal y colorrectales normales.

La Figura 10 proporciona una visión general del funcionamiento del ensayo HM de TFAP2E de acuerdo con el Ejemplo 2, en todas las muestras de tejido con carcinoma colorrectal y colorrectales normales.

La Figura 11 proporciona una visión general del poder predictivo del modelo de regresión logística de combinaciones de marcadores. Se es la sensibilidad, Esp es la especificidad, AUC es el área bajo la curva.

Las Figuras 12 a 21 proporcionan una visión general de la media mayoritaria log de metilación medida por medio del ensayo HM de acuerdo con el Ejemplo 2. Cada figura consiste en tres gráficos, los gráficos en la parte superior y en el medio proporcionan el análisis binario y multi-clase respectivamente, la sensibilidad se muestra en el eje de la Y, la metilación de ADN medida en (log 10 ng/ml) se muestra en el eje de la X.

En cada figura el gráfico en la parte inferior proporciona una ROC en donde la sensibilidad se muestra en el eje de la Y y 1-especificidad se muestra en el eje de la X.

La Figura 12 proporciona una visión general del funcionamiento del ensayo HM de RASSF2 de acuerdo con el Ejemplo 2, en todas las muestras.

La Figura 13 proporciona una visión general del funcionamiento del ensayo HM de Septina 9 de acuerdo con el Ejemplo 2, en todas las muestras.

La Figura 14 proporciona una visión general del funcionamiento del ensayo HM de SND1 de acuerdo con el Ejemplo 2, en todas las muestras.

La Figura 15 proporciona una visión general del funcionamiento del ensayo HM de PCDHGC3 de acuerdo con el Ejemplo 2, en todas las muestras.

La Figura 16 proporciona una visión general del funcionamiento del ensayo HM de TFAP2E de acuerdo con el Ejemplo 2, en todas las muestras.

La Figura 17 proporciona una visión general del funcionamiento del ensayo HM de RASSF2 de acuerdo con el Ejemplo 2, en todas las muestras de tejido con carcinoma colorrectal y colorrectales normales.

La Figura 18 proporciona una visión general del funcionamiento del ensayo HM de Septina 9 de acuerdo con el Ejemplo 2, en todas las muestras de tejido con carcinoma colorrectal y colorrectales normales.

La Figura 19 proporciona una visión general del funcionamiento del ensayo HM de SND1 de acuerdo con el Ejemplo 2, en todas las muestras de tejido con carcinoma colorrectal y colorrectales normales.

La Figura 20 proporciona una visión general del funcionamiento del ensayo HM de PCDHGC3 de acuerdo con el Ejemplo 2, en todas las muestras de tejido con carcinoma colorrectal y colorrectales normales.

La Figura 21 proporciona una visión general del funcionamiento del ensayo HM de TFAP2E de acuerdo con el Ejemplo 2, en todas las muestras de tejido con carcinoma colorrectal y colorrectales normales.

Las Figuras 22 a 26 proporcionan una visión general de la media log de metilación medida por medio de ensayos HM combinados (paneles de genes) de acuerdo con el Ejemplo 2. Cada figura consiste en dos gráficos, el gráfico superior muestra todas las muestras (Normales, Enfermedad no colorrectal, Cánceres no Colorrectales y todas las fases de CRC), el gráfico inferior presenta solamente muestras normales y con CRC. La sensibilidad se muestra en el eje de la Y, la metilación de ADN medida en (log 10 ng/mL) se muestra en el eje de la X.

La Figura 22 proporciona una visión general del funcionamiento de los ensayos de Septina 9+TFAP2E+RASSF2+PCDHGC3+SND1.

La Figura 23 proporciona una visión general del funcionamiento de los ensayos de Septina 9+TFAP2E+RASSF2+PCDHGC3.

La Figura 24 proporciona una visión general del funcionamiento de los ensayos de Septina 9+TFAP2E+RASSF2.

La Figura 25 proporciona una visión general del funcionamiento de los ensayos de Septina 9+TFAP2E.

La Figura 26 proporciona una visión general del funcionamiento de los ensayos de Septina 9+RASSF2.

Las Figuras 27 y 28 proporcionan una visión general de la metilación medida por medio del ensayo MSP de acuerdo con el Ejemplo 1. Cada figura consiste en tres gráficos, los gráficos en la parte superior y en el medio proporcionan el ensayo binario y multi-clase respectivamente, la sensibilidad se muestra en el eje de la Y, la metilación del ADN se muestra en el eje de la X.

En cada figura, el gráfico de la parte inferior proporciona una ROC en donde la sensibilidad se muestra en el eje de la Y y 1-especificidad se muestra en el eje de la X. La Figura 27 proporciona una visión general del ensayo de MRPS21 de acuerdo con el Ejemplo 1. La Figura 28 proporciona una visión general del ensayo DOCK10 de acuerdo con el Ejemplo

1.

Compendio de la invención

La presente invención proporciona un método para detectar trastornos proliferativos celulares, en un sujeto que comprende determinar los niveles de expresión de of PCDHGC3 en una muestra biológica aislada de dicho sujeto en donde la expresión reducida y/o la metilación de CpG son indicativas de la presencia o clase de dicho trastorno.

Los aspectos de la invención proporcionan un método para detectar trastornos proliferativos celulares en un sujeto que comprende determinar los niveles de expresión del gen PCDHGC3 o del gen PCDHGC3 y de Septina 9 o del gen PCDHGC3 y de Septina 9 y al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E, SND1, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1. PCDH10, DOCK10 y MRPS21. Preferiblemente, dicho grupo consiste de los genes RASSF2, TFAP2E, SND1.

Preferiblemente, se determina la expresión de una pluralidad de dichos genes. Preferiblemente, se determina la expresión de 2, 3 o 4 de dichos genes. Preferiblemente, se determinan los niveles de expresión de una de las siguientes combinaciones de genes:

•

Septina 9+RASSF2+TFAP2E+PCDHGC3+SND1

•

Septina 9+RASSF2+TFAP2E+PCDHGC3

•

Septina 9+TFAP2E+PCDHGC3

•

Septina 9+PCDHGC3

Diversos aspectos de la presente invención proporcionan un marcador genético eficaz y único, por medio del cual el análisis de expresión de dicho marcador permite la detección de trastornos proliferativos celulares con una sensibilidad, especificidad y/o valor predictivo particularmente elevados. En el contexto del carcinoma colorrectal, los métodos de prueba de la invención tienen una utilidad particular para el escrutinio de poblaciones en riesgo. Los métodos de la invención tienen ventajas sobre los métodos de la técnica anterior (incluyendo el estándar industrial FOBT), debido a la mejor sensibilidad, especificidad y probable conformidad del paciente.

Los métodos y kits de la presente invención se utilizan para detectar el carcinoma colorrectal.

En una realización, la invención proporciona un método para la detección de carcinomas colorrectales en un sujeto que comprende la determinación de los niveles de expresión de al menos el gen PCDHGC3 o el gen PCDHGC3 y Septina 9

o el gen PCDHGC3 y Septina 9 y un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E, SND1, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21 en una muestra biológica aislada de dicho sujeto en donde la subexpresión y/o metilación CpG es indicativa de la presencia o clase de dicho trastorno. Preferiblemente, dicho grupo se compone de los genes RASSF2, TFAP2E, SND1 & PCDHGC3.

Preferiblemente se determina la presencia, ausencia o nivel de expresión de ARNM de una pluralidad de dichos genes. Preferiblemente, se determina la expresión de 2, 3 o 4 de dichos genes.

En una realización, dicho nivel de expresión se determina detectando la presencia, ausencia o nivel de ARNm transcrito a partir de dicho gen. Se prefiere particularmente que dicho método comprende la determinación de los niveles de expresión del gen PCDHGC3 o el gen PCDHGC3 y Septina 9 o el gen PCDHGC3 y Septina 9 y de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E, SND1 EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21. Preferiblemente, dicho grupo consiste de los genes RASSF2, TFAP2E, SND1 y PCDHGC3. Preferiblemente, se determina la expresión de 2, 3 o 4 de dichos genes. Preferiblemente, se determina los niveles de expresión de una de las siguientes combinaciones de genes:

•

Septina 9+RASSF2+TFAP2E+PCDHGC3+SND1

Septina 9+RASSF2+TFAP2E+PCDHGC3

•

Septina 9+TFAP2E+PCDHGC3

•

Septina 9+PCDHGC3

[0040] En una realización adicional, dicho nivel de expresión se determina detectando la presencia, ausencia o nivel de un polipéptido codificado por dicho gen o secuencia del mismo.

[0041] En una realización preferida adicional, dicha expresión se determina detectando la presencia o ausencia de metilación de CpG dentro de dicho gen, en donde la presencia de metilación indica la presencia de un trastorno proliferativo celular. Dicho método comprende las siguientes etapas: i) poner en contacto el ADN genómico aislado de una muestra biológica (preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en el plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre entera, células sanguíneas aisladas, células aisladas de la sangre) obtenida del sujeto con al menos un reactivo,

o serie de reactivos que distinguen entre los dinucleótidos CpG metilados y no metilados dentro de al menos una región diana del ADN genómico, en donde la secuencia de nucleótidos de dicha región diana comprende al menos una secuencia de dinucleótido CpG del gen PCDHGC3 o del gen PCDHGC3 y Septina 9 o del gen PCDHGC3 y Septina 9 y al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E, SND1" EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21; y ii) la detección de carcinoma colorrectal, al menos en parte.

[0042] Preferiblemente, dicho grupo consiste de los genes RASSF2, TFAP2E, SND1 y PCDHGC3 y/o de sus regiones promotoras o reguladoras. Preferiblemente se analiza una pluralidad de regiones diana. Preferiblemente se analizan 2, 3

o 4 de las regiones diana.

[0043] Preferiblemente, la región diana comprende, o se hibrida en condiciones rigurosas con una secuencia de al menos 16 nucleótidos contiguos de al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 a SEC ID NO: 133. Preferiblemente, dicho grupo se compone de SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 11.

[0044] En i), se prefiere particularmente que la secuencia de nucleótidos de dicha región diana comprenda al menos una secuencia de dinucleótido CpG del gen PCDHGC3 o del gen PCDHGC3 y Septina 9 o el gen PCDHGC3 y Septina9 y al menos un gen seleccionado del grupo que consiste de RASSF2, TFAP2E, SND1, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21. Preferiblemente, dicho grupo consiste de los genes RASSF2, TFAP2E, SND1 y PCDHGC3 y/o de sus regiones promotoras o reguladoras.

[0045] Preferiblemente, las regiones diana consisten en una de las siguientes combinaciones de genes

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Septina 9+RASSF2+TFAP2E+PCDHGC3+SND1

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Septina 9+RASSF2+TFAP2E+PCDHGC3

•

•

Septina 9+TFAP2E+PCDHGC3

•

Septina 9+PCDHGC3

Preferiblemente, la sensibilidad de dicha detección es de aproximadamente 75% a aproximadamente 96%, o de aproximadamente 80% a aproximadamente 90%, o de aproximadamente 80% a aproximadamente 85%. Preferiblemente, la especificidad es de aproximadamente 75% a aproximadamente 96%, o de aproximadamente 80% a aproximadamente 90%, o de aproximadamente 80% a aproximadamente 85%.

El método es novedoso puesto que no existen actualmente métodos que permitan la detección de cáncer mediante análisis de fluidos corporales, con una sensibilidad y una especificidad suficientemente altas para su uso en un análisis aprobado del organismo regulador y asequible comercialmente. Por ejemplo, los métodos actuales utilizados para detectar y diagnosticar el carcinoma colorrectal incluyen colonoscopia, sigmoidoscopia, y cáncer de colon con sangre oculta en las heces. En comparación con estos métodos, la invención descrita es mucho menos invasiva que la colonoscopia, y tan sensible, si no más, que la sigmoidoscopia y la FOBT. El desarrollo de un análisis de fluidos corporales representa una clara ventaja técnica sobre los métodos actuales conocidos en la técnica ya que se prevé que, al menos para el escrutinio del carcinoma colorrectal, la conformidad del paciente para una única prueba basada en un fluido corporal será mayor que para los análisis de deposiciones por triplicado recomendado para la FOBT.

[0048] Una realización particular, el método comprende el uso de al menos el gen PCDHGC3 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 y un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E, SND1, PCDHGC3, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21 como un marcador para la detección y distinción de los trastornos proliferativos celulares. Preferiblemente, dicho grupo consiste de los genes RASSF2, TFAP2E y SND1. y/o sus regiones promotoras o reguladoras.

[0049] Una realización preferida, el método comprende el uso de al menos menos el gen PCDHGC3 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 y un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E, SND1, EDNRB, STOM , GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21 como un

marcador para la detección y distinción de los trastornos proliferativos celulares. Preferiblemente dicho grupo consiste de los genes RASSF2, TFAP2E y SND1 y/o de sus regiones promotoras o reguladoras.

[0050] Preferiblemente se analiza una pluralidad de genes. Preferiblemente se analizan 2, 3 o 4 genes. Se prefieren particularmente las siguientes combinaciones de genes:

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Septina 9+RASSF2+TFAP2E+PCDHGC3+SND1

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Septina 9+RASSF2+TFAP2E+PCDHGC3

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Septina 9+TFAP2E+PCDHGC3

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Septina 9+PCDHGC3

La presente invención es particularmente adecuada para la detección de cáncer colorrectal.

Los métodos y kits de la presente invención son particularmente eficaces en la detección del cáncer colorrectal. Dicho uso del gen se puede activar por medio de cualquier análisis de la expresión del gen, por medio de análisis de la expresión de ARNm o análisis de la expresión de proteínas. Sin embargo, en la realización más preferida de la invención, la detección de trastornos de proliferación de células colorrectales se habilita por medio de análisis del estado de metilación de al menos el gen PCDHGC3 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 o el gen PCDHGC3 y Septina 9 gen y un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E, SND1, PCDHGC3, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10, y MRPS21, y sus promotores o elementos reguladores. Preferiblemente, dicho grupo consiste de los genes RASSF2, TFAP2E y SND1 y/o de sus regiones promotoras o reguladoras. Preferiblemente se analiza una pluralidad de genes. Preferiblemente se analizan 2, 3 o 4 genes.

[0053] Se prefiere además que la detección de trastornos proliferativos de células colorrectales se habilita por medio de análisis del estado de metilación del gen PCDHGC3 en combinación con Septina 9 y al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E, SND1, EDNRB , STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21, y sus promotores o elementos reguladores. Preferiblemente, dicho grupo está formado por los genes RASSF2, TFAP2E andSND1 y/o sus regiones promotoras o reguladoras. Preferiblemente se analiza una pluralidad de genes. Preferiblemente se analizan 2, 3 o 4 genes. Se prefieren particularmente las siguientes combinaciones de genes:

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Septina 9+RASSF2+TFAP2E+PCDHGC3+SND1

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Septina 9+RASSF2+TFAP2E+PCDHGC3

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Septina 9+TFAP2E+PCDHGC3

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Septina 9+PCDHGC3

La divulgación proporciona un método para el análisis de muestras biológicas para determinar características asociadas con el desarrollo de trastornos proliferativos celulares, caracterizado el método porque al menos un ácido nucleico, o un fragmento del mismo, del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 a SEQ ID NO: 133 está en contacto con un reactivo o serie de reactivos capaces de distinguir entre dinucleótidos CpG metilados y no metilados dentro de la secuencia genómica, o secuencias de interés. En una realización preferida, dicho grupo consiste de SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11.

Se prefiere además que al menos un ácido nucleico, o un fragmento del mismo, del SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 14 y al menos un ácido nucleico, o un fragmento del mismo del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 a SEQ ID NO: 133 (o más preferiblemente SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11) esté en contacto con un reactivo o serie de reactivos capaces de distinguir entre dinucleótidos CpG metilados y no metilados.

La presente divulgación proporciona un método para averiguar los parámetros epigenéticos del ADN genómico asociado con el desarrollo de trastornos proliferativos celulares neoplásicos (p. ej. cánceres). El método tiene utilidad para un mejor diagnóstico, tratamiento y seguimiento de dichas enfermedades.

Preferiblemente, la fuente de la muestra de ensayo se selecciona del grupo que consiste en células o líneas celulares, placas histológicas, biopsias, tejido incluido en parafina, fluidos corporales, producto eyaculado, orina, sangre, y combinaciones de los mismos. Más preferiblemente, la fuente se selecciona del grupo que consiste en producto eyaculado, orina, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa, células sanguíneas aisladas, células aisladas de la sangre obtenida del sujeto.

Específicamente, la presente divulgación proporciona un método para detectar carcinoma colorrectal incluyendo las fases tempranas que comprende:

obtener una muestra biológica que comprende uno o varios ácidos nucleicos genómicos; poner en contacto los uno o más ácidos nucleicos, o un fragmento de los mismos, con un reactivo o una pluralidad de reactivos suficiente para distinguir entre secuencias de dinucleótidos CpG metilados y no metilados dentro de al menos una secuencia diana del ácido nucleico del sujeto, en donde la secuencia diana comprende, o hibrida en condiciones restrictivas con, una secuencia que comprende al menos 16 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 a SEQ ID NO: 133 (más `referiblemente SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11), comprendiendo dichos nucleótidos contiguos al menos una secuencia de dinucleótidos CpG; y determinar, basándose al menos en parte en dicha distinción, el estado de metilación de al menos una secuencia de dinucleótidos CpG diana, de media, o un valor que refleja un estado de metilación promedio de una pluralidad de secuencias de dinucleótidos CpG diana. Adicionalmente se prefiere que al menos dos secuencias diana sean analizadas en donde una primera secuencia diana comprende, o hibrida en condiciones restrictivas con, una secuencia que comprende al menos 16 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 12 al SEQ ID NO: 14 y una segunda región diana comprende, o hibrida en condiciones restrictivas con, una secuencia que comprende al menos 16 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 a SEQ ID NO: 133 (más preferiblemente SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11).

Preferiblemente, distinguir entre secuencias de dinucleótidos CpG metilados y no metilados dentro de la secuencia diana comprende la conversión o no conversión dependiente del estado de metilación de al menos una de tales secuencias de dinucleótidos CpG en la correspondiente secuencia de dinucleótidos convertida o no convertida dentro de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 15 al SEQ ID NO: 36 y el SEQ ID NO: 43 al SEQ ID NO: 64 y el SEQ ID NO: 134 al SEQ ID NO: 141, y regiones contiguas de las mismas correspondientes a la secuencia diana. Se prefiere además que dicha consiste de SEQ ID NOS: 15, 16, 43, 44, 17; 18, 45, 46, 27, 28, 55, 56,35 36 63 y 64.

Adicionalmente se prefiere que la distinción entre las secuencias de dinucleótidos CpG metiladas y no metiladas dentro de la secuencia diana comprenda la conversión o no conversión dependiente del estado de metilación de al menos una de tales secuencias de dinucléotidos CpG en la correspondiente secuencia de dinucleótidos convertida o no convertida dentro del SEQ ID NO: 37 al SEQ ID NO: 42 y del SEQ ID NO: 65 al SEQ ID NO: 70 y al menos una de tales secuencias de dinucleótidos CpG en la correspondiente secuencia de dinucleótidos convertida o no convertida seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 15 al SEQ ID NO: 36 y el SEQ ID NO: 43al SEQ ID NO: 56 y regiones contiguas de las mismas correspondientes a la secuencia diana.

Aspectos adicionales de la divulgación proporcionan un método para la detección de trastornos proliferativos celulares neoplásicos, muy preferiblemente carcinoma colorrectal, que comprende: obtener una muestra biológica que tiene ADN genómico del sujeto; extraer el ADN genómico; tratar el ADN genómico, o un fragmento del mismo, con uno o más reactivos para convertir las bases de citosina no metiladas de la posición 5 en uracilo u otra base que es detectablemente distinta a la citosina en términos de propiedades de hibridación; poner en contacto el ADN genómico tratado, o el fragmento tratado del mismo, con una enzima de amplificación y al menos dos cebadores que comprenden, en cada caso una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos de longitud que es complementaria a, o hibrida en condiciones moderadamente restrictivas o restrictivas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 15 al SEQ ID NO: 36 y el SEQ ID NO: 43 al SEQ ID NO: 64 y el SEQ ID NO: 134 al SEQ ID NO: 141 (y más preferiblemente el grupo que consiste en los SEQ ID NOS: 15,16, 43, 44, 17, 18, 45, 46, 27, 28, 55, 56,35 36 63 y 64), y complementos de los mismos, en donde el ADN tratado o el fragmento del mismo es amplificado para producir un producto amplificado, o no es amplificado; y determinar, basándose en la presencia o ausencia de, o en una propiedad de dicho producto amplificado, el estado de metilación o un promedio, o un valor que refleja un promedio del nivel de metilación de al menos uno, pero más preferiblemente una pluralidad de dinucleótidos CpG de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 11 y el SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133 (y más preferiblemente el grupo que consiste en el SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11). Adicionalmente se prefiere que dicho método comprenda además poner en contacto el ADN genómico tratado, o el fragmento tratado del mismo, con una enzima de amplificación y al menos dos cebadores que comprenden, en cada caso una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos de longitud que es complementaria a, o hibrida en condiciones moderadamente restrictivas o restrictivas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 37 al SEQ ID NO: 42 y el SEQ ID NO: 65 al SEQ ID NO: 70, y complementos de los mismos, en donde el ADN tratado o el fragmento del mismo se amplifica para producir un producto amplificado, o no se amplifica; y determinar, basándose en la presencia o ausencia de, o en una propiedad de dicho producto amplificado, el estado de metilación o un promedio, o un valor que refleja un promedio del nivel de metilación de al menos uno, pero más preferiblemente una pluralidad de dinucleótidos CpG de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 12 al SEQ ID NO: 14.

Preferiblemente, la determinación comprende el uso de al menos un método seleccionado del grupo que consiste en: i) hibridar al menos una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos de longitud que es complementaria a, o hibrida en condiciones moderadamente restrictivas o restrictivas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 15 al SEQ ID NO: 36 y el SEQ ID NO: 43 al SEQ ID NO: 64 y el SEQ ID NO: 134 al SEQ ID NO: 141 (y más preferiblemente el grupo que consiste en los SEQ ID NOS: 15, 16, 43, 44, 17, 18, 45, 46, 27, 28, 55, 56, 35 36 63 y 64), y complementos de los mismos; ii) hibridar al menos una molécula de ácido nucleico, unida a una fase sólida, que comprende una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos de longitud que es complementaria a, o hibrida en condiciones moderadamente restrictivas o restrictivas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 15 al SEQ ID NO: 36 y el SEQ ID NO: 43 al SEQ ID NO: 64 y el SEQ ID NO: 134 al SEQ ID NO: 141 (y más preferiblemente el grupo que consiste en los SEQ ID NOS: 15, 16, 43, 44,17, 18, 45, 46, 27, 28, 55, 56,35 36 63 y 64), y complementos de los mismos; iii) hibridar al menos una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos de longitud que es complementaria a,

o hibrida en condiciones moderadamente restrictivas o restrictivas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 15 al SEQ ID NO: 36 y el SEQ ID NO: 43 al SEQ ID NO: 64 y el SEQ ID NO: 134 al SEQ ID NO: 141 (y más preferiblemente el grupo que consiste en los SEQ ID NOS: 15, 16, 43, 44,17, 18, 45, 46, 27, 28, 55, 56,35 36 63 y 64), y , y complementos de los mismos, y extender al menos una de tales moléculas de ácido nucleico hibridada en al menos una base nucleotídica; y iv) secuenciar los productos amplificados.

Aspectos adicionales de la divulgación proporcionan un método para el análisis (esto es, la detección) de trastornos proliferativos de células, que comprende: obtener una muestra biológica que tiene ADN genómico del sujeto; extraer el ADN genómico; poner en contacto el ADN genómico, o un fragmento del mismo, que comprende una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 11 y el SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133 (y más preferiblemente el subgrupo de los mismos que consiste en los SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11) o una secuencia que hibrida en condiciones restrictivas con este con una o más enzimas de restricción sensibles a la metilación, en donde el ADN genómico o bien es digerido de ese modo para producir fragmentos de digestión, o bien no es digerido de ese modo; y determinar, basándose en la presencia o ausencia de, o en una propiedad de al menos uno de tales fragmentos, el estado de metilación de al menos una secuencia de dinucleótidos CpG de al menos una secuencia genómica seleccionada del grupo que consiste del SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 11 y el SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133 (y más preferiblemente el subgrupo de los mismos que consiste en los SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11), o un promedio, o un valor que refleja un estado de metilación promedio de una pluralidad de secuencias de dinucleótidos CpG de la misma. Preferiblemente, el ADN genómico digerido o no digerido es amplificado antes de la determinación.

Adicionalmente se prefiere que dicho método comprenda adicionalmente determinar, basándose en la presencia o ausencia de, o en una propiedad de al menos uno de tales fragmentos, el estado de metilación de al menos una secuencia de dinucleótidos CpG de al menos una secuencia genómica seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 12 al SEQ ID NO: 14, o un promedio, o un valor que refleja un estado de metilación promedio de una pluralidad de secuencias de dinucleótidos CpG de la misma.

Aspectos adicionales de la divulgación proporcionan secuencias novedosas de ácido nucleico genómicas y modificadas químicamente, así como oligonucleótidos y/o oligómeros de PNA para el análisis de los patrones de metilación de citosina dentro de las secuencias del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 1 TO SEQ ID NO: 11 AND SEQ ID NO: 132 TO SEQ ID NO: 133 (y más preferiblemente el subgrupo de los mismos que consiste en los SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11).

Breve descripción de las figuras

Descripción detallada de la invención

Definiciones:

El término "Razón Observada/Esperada" ("Razón O/E") hace referencia a la frecuencia de dinucleótidos CpG en una secuencia de ADN concreta, y corresponde al [número de sitios CpG / (número de bases C x número de bases G)] / longitud de la banda para cada fragmento.

El término "isla CpG " hace referencia a una región contigua de ADN genómico que satisface los criterios de (1) tener una frecuencia de dinucléotidos de CpG correspondiente a una "Razón Observada/Esperada" >0,6, y (2) tener un "Contenido de GC" >0,5. Las islas CpG tienen típicamente, pero no siempre, entre aproximadamente 0,2 y aproximadamente 1 Kb, o hasta aproximadamente 2 Kb de longitud.

El término "estado de metilación" o "estatus de metilación" hace referencia a la presencia o ausencia de 5-metilcitosina ("5-mCyt") en uno o una pluralidad de dinucleótidos CpG dentro de una secuencia de ADN. Los estados de metilación en uno o más sitios de metilación de CpG concretos (teniendo cada uno dos secuencias de dinucleótidos CpG) dentro de una secuencia de ADN incluyen "no metilado", "completamente metilado" y "hemi-metilado".

El término "hemi-metilación" o "hemimetilación" hace referencia al estado de metilación de un ADN de doble hebra en donde solamente una hebra del mismo está metilada.

El término "AUC" según se utiliza en la presente memoria es una abreviatura para el área bajo la curva. En particular hace referencia al área bajo la curva Característica Operativa del Receptor (ROC, en sus siglas en inglés). La curva ROC es un gráfico de la tasa de positivos verdaderos frente a la tasa de falsos positivos para los diferentes puntos de corte posibles de una prueba de diagnóstico. Esto demuestra el equilibrio entre la sensibilidad y la especificidad dependiendo del punto de corte seleccionado (cualquier incremento en la sensibilidad estará acompañado de un descenso en la especificidad). El área bajo una curva ROC (AUC) es una medida de la exactitud de la prueba de diagnóstico (cuanto más grande sea el área mejor, el óptimo es 1, una prueba al azar tendría una curva ROC que yace sobre la diagonal con un área de 0,5; para una referencia: J.P. Egan. Signal Detection Theory and ROC Analysis, Academic Press, NuevaYork, 1975).

El término "hipermetilación" hace referencia al estado de metilación promedio correspondiente a un aumento de la presencia de 5-mCyt en uno o una pluralidad de dinucleótidos CpG dentro de una secuencia de ADN de una muestra de ADN de prueba, con respecto a la cantidad de 5-mCyt encontrada en los correspondientes dinucleótidos CpG dentro de una muestra de ADN de control normal.

El término "hipometilación" hace referencia al estado de metilación promedio correspondiente a una disminución de la presencia de 5-mCyt en uno o una pluralidad de dinucleótidos CpG dentro de una secuencia de ADN de una muestra de ADN de prueba, con respecto a la cantidad de 5-mCyt encontrada en los correspondientes dinucleótidos CpG dentro de una muestra de ADN de control normal.

El término "micromatriz" hace referencia en sentido amplio tanto a "micromatrices de ADN", como a "chips de ADN", como se reconoce en la técnica, incluye todos los soportes sólidos reconocidos en la técnica, e incluye todos los métodos para la fijación de moléculas de ácido nucleico a estos o la síntesis de ácidos nucleicos sobre ellos.

"Parámetros genéticos" son mutaciones y polimorfismos de genes y las secuencias requeridas adicionalmente para su regulación. Se denominan mutaciones en particular, las inserciones, deleciones, mutaciones puntuales, inversiones y polimorfismos y, son particularmente preferidos los SNP (polimorfismos de un solo nucleótido).

"Parámetros epigenéticos" son, en particular, la metilación de citosina. Otros parámetros epigenéticos incluyen, por ejemplo, la acetilación de histonas que, sin embargo, no puede ser analizada directamente utilizando el método descrito pero que, a su vez, se corresponde con la metilación del ADN.

El término "reactivo de bisulfito" hace referencia a un reactivo que comprende bisulfito, disulfito, sulfito de hidrógeno o combinaciones de los mismos, útiles como se describe en la presente memoria para distinguir entre secuencias de dinucleótidos CpG metiladas y no metiladas.

El término "ensayo de metilación" hace referencia a cualquier ensayo para determinar el estado de metilación de una o más secuencias de dinucleótidos CpG dentro de una secuencia de ADN.

El término "MS.AP-PCR" (Reacción en Cadena de la Polimerasa Cebada Arbitrariamente Sensible a la Metilación) hace referencia a la tecnología reconocida en la técnica que permite un barrido global del genoma utilizando cebadores ricos en CG para centrarse en las regiones que contienen más probablemente dinucleótidos CpG, y descrita por Gonzalgo et al., Cancer Research 57:594-599, 1997.

El término "MethyLight™" hace referencia a la técnica de PCR en tiempo real basada en fluorescencia reconocida en la técnica descrita por Eads et al., Cancer Res. 59:2302-2306, 1999.

El término ensayo "HeavyMethyl™", en la realización del mismo implementada en la presente memoria, hace referencia a un ensayo, en donde las sondas de bloqueo específicas de la metilación (también referidos en la presente memoria como bloqueadores) que cubren las posiciones de CpG, o cubiertas por los cebadores de amplificación permiten la amplificación selectiva específica de la metilación de una muestra de ácido nucleico.

El término ensayo "HeavyMethyl™ MethyLight™", en la realización del mismo implementada en la presente memoria, hace referencia a un ensayo HeavyMethyl™ MethyLight™, que es una variación del ensayo MethyLight™, en donde el ensayo MethyLight™ se combina con sondas de bloqueo específicas de la metilación que cubren las posiciones de CpG entre los cebadores de amplificación.

El término "Ms-SNuPE" (Extensión de cebadores de nucleótidos sencillos sensible a la metilación) hace referencia al ensayo reconocido en la técnica descrito por Gonzalgo y Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997.

El término "MSP" (PCR específica de la metilación) hace referencia al ensayo de metilación reconocido en la técnica descrito por Herman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996, y por la Patente de los Estados Unidos Núm.

5.786.146.

El término "COBRA" (Análisis de restricción con bisulfto combinado) hace referencia al ensayo de metilación reconocido en la técnica descrito por Xiong and Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997.

El término "MCA" (Amplificación de Isla CpG Metilada) hace referencia al ensayo de metilación descrito por Toyota et al., Cancer Res. 59:2307-12, 1999, y en el documento WO 00/26401 A1.

El término "hibridación" se debe entender como una unión de un oligonucleótido a una secuencia complementaria en los términos de los emparejamientos de bases de Watson-Crick en el ADN de muestra, formando una estructura dúplex.

"Condiciones de hibridación restrictivas", según se define en la presente memoria, implica una hibridación a 68°C en 5x SSC/5x solución de Denhardt/SDS al 1,0%, y lavado en 0,2x SSC/SDS al 0,1% a la temperatura ambiente, o implica el equivalente de la misma reconocido en la técnica (p. ej., condiciones en las que la hibridación se lleva a cabo a 60°C en 2,5 x tampón SSC, seguido de varias etapas de lavado a 37°C a una baja concentración de tampón, y permanece estable). Las condiciones moderadamente restrictivas, como se define aquí, implican incluyendo el lavado en 3x SSC a 42°C, o su equivalente reconocido en la técnica de los mismos. Los parámetros de concentración de sal y temperatura se pueden variar para alcanzar el nivel óptimo de identidad entre la sonda y el ácido nucleico diana. Las pautas con respecto a tales condiciones están disponibles en la técnica, por ejemplo, por Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY.; y Ausubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, NY.) en la Unidad de 2.10.

Los términos "enzimas de restricción específica de metilación" o "enzimas de restricción sensibles a la metilación" se tomarán en el sentido de una enzima que digiere selectivamente un ácido nucleico dependiente del estado de metilación de su sitio de reconocimiento. En el caso de tales enzimas de restricción que cortan específicamente si el sitio de reconocimiento no está metilado o hemimetilado, el corte no se llevará a cabo, o con una eficiencia significativamente reducida, si el sitio de reconocimiento está metilado. En el caso de tales enzimas de restricción que cortan específicamente si el sitio de reconocimiento no está metilado o hemimetilado, el corte no se llevará a cabo, o con una eficiencia significativamente reducida si el sitio de reconocimiento está metilado. Se prefieren las enzimas de restricción específicas de metilación, cuya la secuencia de reconocimiento contiene un dinucleótido CG (por ejemplo CGCG o CCCGGG). También se prefieren para algunas realizaciones las enzimas de restricción que no cortan si este dinucleótido está metilado en el átomo de carbono C5. "Enzimas de restricción no específicas de metilación" o "enzimas de restricción no sensibles a metilación " son enzimas de restricción que cortan una secuencia de ácido nucleico con independencia del estado de metilación con una eficiencia casi idéntica. También se les llama "enzimas de restricción inespecíficas de metilación"

En referencia a las secuencias de matrices compuestas, la frase "nucleótidos contiguos" se refiere a una región de secuencia contigua de cualquier secuencia contigua individual de la matriz compuesta, pero no incluye una región de la secuencia de matriz compuesta que incluye un "nodo", como se define en la presente memoria más arriba.

Se considerará que el término “gen” incluye todas las variantes de transcrito del mismo (p. ej., el término “Septina 9” incluirá por ejemplo su transcrito truncado Q9HC74) y todos los elementos promotores y reguladores del mismo. Además, como se conoce una pluralidad de SNP en dicho gen, se considerará que el término incluye todas las variantes de secuencia del mismo.

Visión general

La presente divulgación proporciona un método para la detección de trastornos proloferativos celulares (preferiblemente carcinoma colorrectal) en un sujeto que comprende determinar los niveles de expresión de al menos el gen PCDHGC3 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 y un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E, SND1, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21 en una muestra biológica aislada de dicho sujeto en donde la subexpresión y/o metilación CpG es indicativa de la presencia o clase de dicho trastorno. Preferiblemente, dicho grupo consiste de los genes RASSF2, TFAP2E y SND1. y/o sus regiones promotoras o reguladoras.

[0092] Dichos marcadores pueden ser utilizados para el diagnóstico de trastornos proliferativos celulares (preferiblemente cáncer), más preferiblemente carcinoma colorrectal. Dicho método se caracteriza porque la subexpresión y/o la presencia de metilación de CpG es indicativa de la presencia de un trastorno proliferativo celular neoplásico o carcioma colorrectal y la ausencia de la misma es indicativa de la ausencia de los mismos. Se prefiere además que los niveles de expresión del gen al menos el gen PCDHGC3 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 y de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E, SND1, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21 en una muestra biológica aislada de dicho sujeto se determina en donde la subexpresión y/o metilación CpG es indicativa de la presencia o clase de dicho trastorno. Preferiblemente, dicho grupo consiste de los genes RASSF2, TFAP2E y SND1 y/o sus regiones promotoras o reguladoras.

Preferiblemente se analiza una pluralidad de genes. Preferiblemente se analizan 2, 3 o 4 genes. Resultan particularmente preferidas las siguientes combinaciones de genes:

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Septina 9+RASSF2+TFAP2E+PCDHGC3+SND1

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Septina 9+RASSF2+TFAP2E+PCDHGC3

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Septina 9+TFAP2E+PCDHGC3

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Septina 9+PCDHGC3

Los marcadores de la presente invención son particularmente eficaces en la detección o distinción entre los trastornos proliferativos de células colorrectales, proporcionando de ese modo medios mejorados para la detección precoz y por lo tanto un mejor tratamiento de dichos trastornos.

[0095] Además de las realizaciones anteriores en donde se analiza el análisis de metilación de al menos el gen PCDHGC3 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 y un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E, SND1, EDNRB , STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21, la invención presenta paneles adicionales de genes que comprenden al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E, SND1, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3 , LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21 con utilidad novedosa para la detección de cánceres, en particular cáncer colorrectal.

[0096] Preferiblemente, dichos paneles de genes comprenden al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E y SND1 y/o sus regiones promotoras o reguladoras.

[0097] En una realización preferida del método dicho panel comprende al menos el gen PCDHGC3 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 y al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E, SND1, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21. Preferiblemente, dicho grupo consiste de los genes RASSF2, TFAP2E y SND1 y/o de sus regiones promotoras o reguladoras.

[0098] Se prefieren particularmente las siguientes combinaciones de genes:

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Septina 9+RASSF2+TFAP2E+PCDHGC3+SND1

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Septina 9+RASSF2+TFAP2E+PGDHGC3

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Septina 9+TFAP2E+PCDHGC3

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Septina 9+PCDHGC3

[0099] En una primera realización adicional, la presente invención se basa en el análisis del estado de metilación CpG de al menos menos el gen PCDHGC3 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 y un gen seleccionado del grupo que consiste de RASSF2, TFAP2E, SND1, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21. Se prefiere que las secuencias de dichos genes sean conforme a la Tabla 1. Preferiblemente, dicho grupo consiste de los genes RASSF2, TFAP2E, SND1 y/o de sus regiones promotoras o reguladoras. En dicha realización, se prefiere que las secuencias de dichos genes sean conforme a la Tabla 7.

La modificación con bisulfito del ADN es una herramienta reconocida en la técnica utilizada para evaluar el estatus de metilación de CpG. La 5-metilcitosina es la modificación de base covalente más frecuente en el ADN de células eucarióticas. Juega un papel, por ejemplo, en la regulación de la transcripción, en la impronta genética, y en la tumorigénesis. Por lo tanto, la identificación de 5-metilcitosina como componente de la información genética tiene un interés considerable. Sin embargo, las posiciones de la 5-metilcitosina no pueden ser identificadas por medio de secuenciación, debido a que la 5-metilcitosina tiene el mismo comportamiento de emparejamiento de bases que la citosina. Por otra parte, la información epigenética portada por la 5-metilcitosina se pierde completamente, p. ej. durante la amplificación por PCR.

El método más frecuentemente utilizado para analizar el ADN para determinar la presencia de 5-metilcitosina se basa en la reacción específica del bisulfito con la citosina por medio de la cual, tras la subsiguiente hidrólisis alcalina, la citosina se convierte en uracilo que corresponde a la timina en su comportamiento de emparejamiento de bases. Significativamente, sin embargo, la 5-metilcitosina permanece sin variaciones en estas condiciones. Por consiguiente, el ADN original se convierte de tal manera que la metilcitosina, que originalmente no se podía distinguir de la citosina por su comportamiento en la hibridación, ahora puede ser detectada como la única citosina restante utilizando mecanismos de la biología molecular reconocidos en la técnica, convencionales, por ejemplo, por medio de amplificación e hibridación, o por medio de secuenciación. Todos estos mecanismos se basan en las propiedades de emparejamiento de bases diferenciales, que ahora pueden ser explotadas completamente.

La técnica anterior, en términos de sensibilidad, se define mediante un método que comprende incluir el ADN que se va a analizar en una matriz de agarosa, evitando de ese modo la difusión y renaturalización del ADN (el bisulfito solamente reacciona con ADN de hebra sencilla), y remplazar todas las etapas de precipitación y purificación por una diálisis rápida (Olek A, et al., A modified and improved method for bisulfite based cytosine methylation analysis, Nucleic Acids Res. 24:5064-6, 1996). De este modo es posible analizar las células individuales para determinar el estado de metilación, que ilustra la utilidad y sensibilidad del método. Una visión general de los métodos reconocidos en la técnica para detectar 5metilcitosina es proporcionada por Rein, T., et al., Nucleic Acids Res., 26:2255, 1998.

La técnica del bisulfito, con algunas excepciones (p. ej., Zeschnigk M, et al., Eur J Hum Genet. 5:94-98, 1997), actualmente solo se utiliza en investigación. En todos los casos, se amplifican fragmentos específicos, cortos de un gen conocido después del tratamiento con bisulfito, y se secuencian completamente (Olek y Walter, Nat Genet. 1997 17:2756, 1997), se someten a una o más reacciones de extensión (Gonzalgo y Jones, Nucleic Acids Res., 25:2529-31, 1997; documento WO 95/00669; Patente de los Estados Unidos Núm. 6.251.594) para analizar posiciones de citosina individuales, o se tratan por medio de digestión enzimática (Xiong y Laird, Nucleic Acids Res., 25:2532-4, 1997). La detección por medio de hibridación también se ha descrito en la técnica (Olek et al., documento WO 99/28498). Adicionalmente, se ha descrito el uso de la técnica del bisulfito para la detección de la metilación con respecto a genes individuales (Grigg y Clark, Bioessays, 16:431-6, 1994; Zeschnigk M, et al., Hum Mol Genet., 6:387-95, 1997; Feil R, et al., Nucleic Acids Res., 22:695-, 1994; Martin V, et al., Gene, 157:261-4, 1995; documentos WO 97/46705 y WO 95/15373).

La presente divulgación proporciona el uso de la técnica del bisulfito, combinada con uno o más ensayos de metilación, para la determinación del estatus metilación de las secuencias de dinucleótidos de CpG, dentro de al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 a SEQ ID NO:

133. Particularmente preferido es el subgrupo del mismo que consiste en SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11.

Los dinucleótidos de CpG genómicos pueden estar metilados o no metilados (alternativamente conocidos como metilados al alza o a la baja respectivamente). No obstante los métodos de la presente divulgación son adecuados para el análisis de muestras biológicas de una naturaleza heterogénea p. ej., una baja concentración de células tumorales en un fondo de sangre o deposiciones. Por consiguiente, cuando se analiza el estatus de metilación de una posición de CpG dentro de semejante muestra, el experto en la técnica puede utilizar un ensayo cuantitiativo para determinar el nivel (p. ej., porcentaje, fracción, razón, proporción o grado) de metilación en una posición de CpG concreta en oposición al estado de metilación. Por consiguiente, se debe considerar que el término estatus de metilación o estado de metilación también representa un valor que refleja el grado de metilación en una posición de CpG. A menos que se establezca específicamente, se debe considerar que los términos "hipermetilado" o "metilado al alza" representan un nivel de metilación por encima de un punto de corte especificado, en donde dicho corte puede ser un valor que representa el nivel de metilación promedio o mediana para una población dada, o es preferiblemente un nivel de corte optimizado. El “corte” también es referido en la presente memoria como “umbral”. En el contexto de la presente invención se considerará que los términos “metilado”, “hiper-metilado” o “metilado al alza”, incluyen un nivel de metilación por encima del corte de metilación cero (0) % (o equivalentes del mismo) para todas las posiciones de CpG dentro y asociadas con (p. ej., las regiones promotoras o reguladoras) los genes o secuencia genómica seleccionada del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E , SND1, PCDHGC3, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10; DOCK10 y MRPS21 y el gen SEPTINA 9.

De acuerdo con la presente divulgación, la determinación del estado de metilación de las secuencias de dinucleótido CpG dentro de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 a SEQ ID NO: 133 (y más preferiblemente el subgrupo del mismo que consiste en SEQ ID NO: 1: SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11) tiene utilidad tanto en el diagnóstico como en la caracterización de trastornos proliferativos celulares. Procedimientos de ensayo de la metilación. Se conocen en la técnica varios procedimientos de ensayo de metilación, y se pueden utilizar junto con la presente invención. Estos ensayos permiten la determinación del estado de metilación de uno o una pluralidad de dinucleótidos de CpG (p. ej., islas CpG ) dentro de una secuencia de ADN. Tales ensayos implican, entre otras técnicas la secuenciación de ADN del ADN tratado con bisulfito, la PCR (para la amplificación específica de la secuencia), el análisis de transferencia Southern, y el uso de enzimas de restricción sensibles a la metilación.

Por ejemplo, la secuenciación genómica se ha simplificado para el análisis de los patrones de metilación del ADN y la distribución de la 5-metilcitosina mediante el uso de tratamiento con bisulfito (Frommer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831, 1992). Adicionalmente, se utiliza la digestión con enzimas de restricción de los productos de la PCR amplificados a partir del ADN convertido con bisulfito, p. ej., el método descrito por Sadri y Hornsby (Nucl. Acids Res. 24:5058-5059, 1996), o COBRA (Análisis de Restricción con Bisulfito Combinado) (Xiong & Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997).

COBRA. El análisis COBRATM es un ensayo de metilación cuantitativo útil para determinar los niveles de metilación de ADN en loci de genes específicos en pequeñas cantidades de ADN genómico (Xiong y Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997). En resumen, se utiliza la digestión con enzimas de restricción para revelar las diferencias de secuencias dependientes de la metilación en los productos de la PCR de ADN tratado con bisulfito de sodio. Las diferencias de secuencias dependientes de la metilación se introducen primero en el ADN genómico mediante tratamiento con bisulfito convencional de acuerdo con el procedimiento descrito por Frommer et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831, 1992). A continuación se lleva a cabo la amplificación por PCR del ADN convertido con bisulfito para las islas CpG de interés, seguido de digestión con endonucleasas de restricción, electroforesis en gel, y detección utilizando sondas de hibridación marcadas, específicas. Los niveles de metilación en la muestra de ADN original se representan por medio de las cantidades relativas del producto de PCR digerido y no digerido de una manera linealmente cuantitativa a través de un amplio espectro de niveles de metilación del ADN. Además, esta técnica se puede aplicar de manera fiable a ADN obtenido de muestras de tejido incluidas en parafina diseccionadas al microscopio.

Los reactivos típicos (p. ej., los que se encontrarían en un kit con basado en COBRA™ típico) para el análisis COBRA™ pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR para un gen específico (o secuencia de ADN tratada con bisulfito o isla CpG); enzima de restricción y tampón apropiado; oligonuclétido de hibridación al gen; oligonucleótido de hibridación de control; kit de marcaje con quinasa para sonda de oligonucleótido; y oligonucleótidos marcados. Además, los reactivos de conversión con bisulfito pueden incluir: tampón de desnaturalización de ADN; tampón de sulfonación; kits o reactivos de recuperación de ADN (p. ej., precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad); tampón de desulfonación; y componentes de recuperación de ADN.

Preferiblemente, se utilizan solos o combinados con otros de estos métodos ensayos tales como "MethyLight™" (una técnica de PCR en tiempo real basada en fluorescencia) (Eads et al., Cancer Res. 59:2302-2306, 1999), reacciones Ms-SNuPE™ (Extensión de cebadores de nucleótidos sencillos sensible a la metilación) (Gonzalgo y Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997), PCR específica de metilación ("MSP"; Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:98219826, 1996; Patente de los Estados Unidos Núm. 5.786.146), y amplificación de islas CpG metiladas ("MCA"; Toyota et al., Cancer Res. 59:2307-12, 1999).

La técnica de ensayo "HeavyMetil™", es un método cuantitativo para evaluar las diferencias en la metilación basándose en la amplificación específica de la metilación de ADN tratado con bisulfito. Las sondas de bloqueo específicas de la metilación (también referidas en la presente memoria como bloqueadores) que abarcan posiciones CpG entre, o abarcadas por los cebadores de amplificación permiten la amplificación selectiva específica de la metilación de una muestra de ácido nucleico.

El término ensayo "HeavyMetil™ MethyLight™", en la realización del mismo implementado en la presente memoria, hace referencia a un ensayo HeavyMetil™MethyLight™, que es una variación del ensayo MethyLight™, en donde el ensayo MethyLight™ se combina con sondas de bloqueo específicas de la metilación que abarcan posiciones CpG entre los cebadores de amplificación. El ensayo HeavyMetil™ también se puede utilizar combinado con cebadores de amplificación específicos de la metilación.

Los reactivos típicos (p. ej., como los que se podrían encontrar en un kit basado en MethyLight™ típico) para el análisis HeavyMetil™ pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR para genes específicos (o secuencia de ADN tratada con bisulfito o isla CpG); oligonucléotidos de bloqueo; tampones de PCR y desoxinucleótidos optimizados; y polimerasa Taq.

MSP. La MSP (PCR específica de la metilación) permite evaluar el estatus de metilación de virtualmente cualquier grupo de sitios CpG dentro de una isla CpG , independientemente del uso de enzimas de restricción sensibles a la metilación (Herman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996; Patente de los Estados Unidos Núm. 5.786.146). En resumen, el ADN es modificado por medio de bisulfito de sodio que convierte todas las citosinas no metiladas, pero no las metiladas, en uracilo, y con posterioridad es amplificado con cebadores específicos para ADN metilado versus no metilado. La MSP requiere solamente pequeñas cantidades de ADN, es sensible a alelos metilados al 0,1% de un locus de una isla CpG dada, y se puede llevar a cabo sobre ADN extraído de muestras incluidas en parafina. Los reactivos típicos (p. ej., como los que se podrían encontrar en un kit basado en MSP típico) para el análisis de MSP pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR metilados y no metilados para genes específicos (o secuencia de ADN tratada con bisulfito o isla CpG), tampones de PCR y desoxinucleótidos optimizados, y sondas específicas.

MethyLight™. El ensayo MethyLight™ es un ensayo de metilación cuantitativo de alto rendimiento que utiliza la tecnología de PCR en tiempo real basada en fluorescencia (TaqMan™) que no requiere más manipulaciones después de la etapa de PCR (Eads et al., Cancer Res. 59:2302-2306, 1999). En resumen, el proceso MethyLight™ comienza con una muestra mixta de ADN genómico que se convierte, en una reacción con bisulfito de sodio, en una agrupación mixta de diferencias de secuencias dependientes de la metilación de acuerdo con procedimientos convencionales (el proceso con bisulfito convierte los residuos de citosina no metilados en uracilo). A continuación se lleva a cabo la PCR basada en fluorescencia en una reacción “sesgada” (con cebadores de PCR que se solapan con dinucleótidos CpG conocidos). La discriminación de secuencias se puede producir tanto a nivel de amplificación como a nivel del proceso de detección de la fluorescencia.

El ensayo MethyLight™ se puede utilizar como una prueba cuantitativa para los patrones de metilación en la muestra de ADN genómico, en donde se produce la discriminación de secuencias a nivel de hibridación de las sondas. En esta versión cuantitativa, la reacción de PCR proporciona una amplificación específica de la metilación en presencia de una sonda fluorescente que se solapa con un supuesto sitio de metilación concreto. Un control objetivo para la cantidad de ADN de entrada es proporcionado por medio de una reacción en la que ni los cebadores, ni la sonda cubren cualquiera de los dinucléotidos de CpG. Alternativamente, se logra una prueba cualitativa para la metilación genómica sondeando la agrupación de PCR sesgada con oligonucléotidos de control que no “abarcan” sitios de metilación conocidos (una versión basada en la fluorescencia de las técnicas HeavyMethyl™ y MSP), o con oligonucleótidos que abarcan sitios de metilación potenciales.

El proceso MethyLight™ puede ser utilizado con cualquier sonda adecuada p. ej., "TaqMan™", Lightcycler™ etc. Por ejemplo, el ADN genómico de doble hebra se trata con bisulfito de sodio y se somete a uno de dos conjuntos de reacciones de PCR, utilizando sondas TaqMan™; p. ej., con cebadores de MSP y/u oligonucleótidos bloqueadores de HeavyMethyl y sonda TaqMan™. La sonda TaqMan™ está marcada doblemente con moléculas “informadora” y “extintora” fluorescentes, y está diseñada para que sea específica para una región con un contenido relativamente elevado de GC de manera que se funda a una temperatura aproximadamente 10°C más alta en el ciclo de PCR que los cebadores directo e inverso anteriores. Esto permite que la sonda TaqMan™ permanezca completamente hibridada durante la etapa de recocido/extensión de la PCR. A medida que la polimerasa Taq sintetice enzimáticamente una nueva hebra durante la PCR, alcanzará virtualmente la sonda TaqMan™ recocida. La actividad endonucleasa 5' a 3' de la polimerasa Taq desplazará a continuación la sonda TaqMan™ digiriéndola para liberar la molécula informadora fluorescente para la detección cuantitativa de su señal ahora extinguida utilizando un sistema de detección fluorescente en tiempo real.

Los reactivos típicos (p. ej., como los que se encontrarían en un kit basado en MethyLight™ típico) para el análisis MethyLight™ pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR para genes específicos (o secuencias de ADN tratadas con bisulfito o islas CpG ); sondas TaqMan™ o Lightcycler™; tampones de PCR y desoxinucleótidos optimizados; y polimerasa Taq.

El ensayo QM™ (metilación cuantitativa) es una prueba cuantitativa alternativa para los patrones de metilación en muestras de ADN genómico, en donde la discriminación de las secuencias se produce a nivel de hibridación de la sonda. En esta versión cuantitativa, la reacción de PCR proporciona una amplificación objetiva en presencia de una sonda fluorescente que se solapa con un supuesto sitio de metilación concreto. Un control objetivo para la cantidad de ADN de entrada es proporcionado por una reacción en la que ni los cebadores, ni la sonda cubren ninguno de los dinucleótidos de CpG. Alternativamente, se logra una prueba cualitativa para la metilación genómica mediante el sondeo de la agrupación de PCR sesgada con nucleótidos de control que no “abarcan” los sitios de metilación conocidos (una versión basada en fluorescencia de las técnicas HeavyMetil™ y MSP), o con nucleótidos que abarcan sitios de metilación potenciales.

El proceso QM™ puede ser utilizado con cualquier sonda adecuada p. ej. "TaqMan™", Lightcycler™ etc. en el proceso de amplificación. Por ejemplo, el ADN genómico de doble hebra se trata con bisulfito de sodio y se somete a cebadores objetivos y la sonda TaqMan™. La sonda TaqMan™ consiste en moléculas “informadoras” y “extintoras” fluorescentes duales, y está diseñada para que sea específica para una región con un contenido de GC relativamente elevado de manera que se funde a una temperatura aproximadamente 10°C mayor en el ciclo de PCR que los cebadores directo e inverso. Esto permite que la sonda TaqMan™ permanezca totalmente hibridada durante la etapa de recocido/extensión de la PCR. A medida que la polimerasa Taq sintetice enzimáticamente una nueva hebra durante la PCR, alcanzará eventualmente la sonda TaqMan™ recocida. La actividad endonucleasa 5' a 3' de la polimerasa Taq desplazará a continuación la sonda TaqMan™ digiriéndola para liberar la molécula informadora fluorescente para la detección cuantitativa de su señal ahora no extinguida utilizando un sistema de detección fluorescente en tiempo real.

Los reactivos típicos (p. ej., como los que se podrían encontrar en un kit basado en QM™ típico) para el análisis QM™ pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR para un gen específico (o secuencia de ADN tratada con bisulfito o isla CpG); sondas TaqMan™ o Lightcycler™; tampones de PCR y desoxinucleótidos optimizados; y polimerasa Taq.

Ms-SNuPE. La técnica Ms-SNuPE™ es un método cuantitativo para evaluar las diferencias de metilación en sitios de CpG específicos basándose en el tratamiento con bisulfito de ADN, seguido de extensión de cebadores de un sólo nucleótido (Gonzalgo y Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997). En resumen, el ADN genómico se hace reaccionar con bisulfito de sodio para convertir la citosina no metilada en uracilo mientras que deja 5-metilcitosina sin cambios. La amplificación de la secuencia diana deseada se lleva a cabo a continuación utilizando los cebadores de PCR específicos para el ADN convertido con bisulfito, y el producto resultante se aísla y se utiliza como molde para el análisis de metilación en los sitios CpG de interés. Se pueden analizar pequeñas cantidades de ADN (p. ej., secciones de patología diseccionadas al microscopio), y esto evita la utilización de enzimas de restricción para determinar el estatus de metilación en los sitios CpG.

Los reactivos típicos (p. ej., como los que se podrían encontrar en un kit basado en Ms-SNuPE™ típico) para el análisis Ms-SNuPE™ pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR para un gen específico (o secuencia de ADN tratada con bisulfito o isla CpG ); tampones de PCR y desoxinucleótidos optimizados; kit de extracción en gel; cebadores de control positivo; cebadores de Ms-SNuPE™ para un gen específico; tampón de reacción (para la reacción de Ms-SNuPE); y nucleótidos marcados.

Adicionalmente, los reactivos de conversión de bisulfito pueden incluir: tampón de desnaturalización de ADN; tampón de sulfonación; reactivos o kit de recuperación de ADN (p. ej., precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad); tampón de desulfonación; y componentes de recuperación de ADN.

La secuencia genómica de acuerdo con SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 a SEC ID NO: 133 (y más preferiblemente el subgrupo de los mismos que consiste en SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11), y variantes tratadas de origen no natural de los mismos de acuerdo con SEQ ID NO: 15 a SEQ IQ NO: 36 y SEQ ID NO: 43 a SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO : 134 a SEQ ID NO: 141 (y más preferiblemente el subgrupo de los mismos que consiste en SEQ ID NO: 15, 16, 43, 44, 17, 18, 45, 46, 27, 28, 55, 56, 35 36 63 y 64), se determinó que tiene utilidad novedosa para la detección temprana de trastornos proliferativos celulares, en particular los trastornos de proliferación celular colorrectal

En un aspecto, el método comprende las siguientes etapas: i) poner en contacto ADN genómico (preferiblemente aislado de fluidos corporales) obtenido del sujeto con al menos un reactivo, o serie de reactivos que distinguen entre dinucleótidos CpG metilados y no metilados dentro de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E , SND1, PCDHGC3, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21 (incluyendo sus regiones promotoras y reguladoras); y ii) detectar, o detectar y distinguir entre dos o entre varios trastornos proliferativos de células de colon. En un aspecto preferido, la exactitud de dicho método aumenta determinando adicionalmente el estatus de metilación del gen de SEPTINA 9 por medio de dichas etapas del método. Preferiblemente dicho grupo consiste en los genes RASSF2, TFAP2E, SND1 y PCDHGC3 y/o sus regiones promotoras

o reguladoras.

Se prefieren particularmente las siguientes combinaciones de genes:

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Septina 9+RASSF2+TFAP2E+PCDHGC3+SND1

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Septina 9+RASSF2+TFAP2E+PCDHGC3

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Septina 9+TFAP2E+PCDHGC3

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Septina 9+PCDHGC3

Preferiblemente, la sensibilidad es de aproximadamente 75% a aproximadamente 96%, o de aproximadamente 80% a aproximadamente 90%, o de aproximadamente 80% a aproximadamente 85%. Preferiblemente, la especificidad es de aproximadamente 75% a aproximadamente 96%, o de aproximadamente 80% a aproximadamente 90%, o de aproximadamente 80% a aproximadamente 85%.

El ADN genómico se puede aislar por medio de cualquier método convencional en la técnica, incluyendo el uso de kits disponibles en el mercado. En resumen, cuando el ADN de interés está encapsulado en una membrana celular la muestra biológica debe ser desorganizada y lisada por medios enzimáticos, químicos o mecánicos. La solución de ADN puede ser aclarada a continuación de proteínas y otros contaminante, p. ej., mediante digestión con proteinasa K. El ADN genómico se recupera a continuación de la solución. Esto se puede llevar a cabo por medio de una variedad de métodos incluyendo la precipitación por adición de sal, la extracción orgánica o la unión del ADN a un soporte en fase sólida. La elección del método se verá afectada por numerosos factores incluyendo el tiempo, el coste y la cantidad requerida de ADN. Todos los tipos de muestras clínicas que comprenden material neoplásico o pre-neoplásico son adecuados para su uso en el presente método, se prefieren líneas celulares, placas histológicas, biopsias, tejido incluido en parafina, fluidos corporales, deposiciones, efluente colónico, orina, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa, células sanguíneas aisladas, células aisladas de la sangre y combinaciones de los mismos. Los fluidos corporales son la fuente preferida de ADN; son particularmente preferidos el plasma sanguíneo, el suero sanguíneo, la sangre completa, las células sanguíneas aisladas y las células aisladas de la sangre.

La muestra de ADN genómico se trata a continuación con al menos un reactivo o una serie de reactivos que distinguen entre dinucléotidos CpG metilados y no metilados en la al menos una región diana del ADN genómico, en donde la región diana comprende, o hibrida en condiciones restrictivas con una secuencia de al menos 16 nucleótidos contiguos al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 a SEQ ID NO: 133 (y más preferiblemente el subgrupo de los mismos consiste en SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO:11) respectivamente, en donde dichos nucleótidos contiguos comprende al menos una secuencia de dinucléotidos CpG. Adicionalmente se prefiere que dicho reactivo, o serie de reactivos distingan entre dinucleótidos CpG metilados y no metilados dentro de al menos dos regiones diana del ADN genómico, en donde la primera región diana comprende, o hibrida en condiciones restrictivas con una secuencia de al menos 16 nucleótidos contiguos de al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 12 al SEQ ID NO: 14 y una segunda región diana que comprende, o hibrida en condiciones restrictivas con una secuencia de al menos 16 nucleótidos contiguos de al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 a SEQ ID NO: 133 (y más preferiblemente el subgrupo de los mismos consiste en SEQ ID NO:1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO:11), en donde dichos nucleótidos contiguos comprenden al menos una secuencia de dinucleótidos CpG.

Es particularmente preferido que dicho reactivo convierta las bases de citosina que no están metiladas en la posición 5' en uracilo, timina, u otra base que sea diferente a la citosina en términos de comportamiento en la hibridación. No obstante en una realización alternativa dicho reactivo puede ser una enzima de restricción sensible a la metilación.

Cuando la muestra de ADN genómico se trata de tal manera que las bases de citosina que no están metiladas en la posición 5' se convierten en uracilo, timina, u otra base que es diferente a la citosina en términos de comportamiento en la hibridación, se prefiere que este tratamiento sea llevado a cabo con bisulfito (sulfito de hidrógeno, disulfito) y después hidrólisis alcalina. Semejante tratamiento da como resultado la conversión del SEQ ID NO: 1 y los SEQ ID NO: 14 a SEQ ID NO: 43, el SEQ ID NO: 70 en donde dichos dinucleótidos de CpG no están metilados en el SEQ ID NO: 15 -SEQ ID NO: 42 en donde dichos dinucleótidos de CpG están metilados.

[0133] El ADN tratado se analiza a continuación con el fin de determinar el estado de metilación de las secuencias del gen diana (al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E, SND1, PCDHGC3, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21 antes del tratamiento). Es particularmente preferido que la región diana comprenda, o hibride en condiciones restrictivas con al menos 16 nucleótidos contiguos de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E, SND1, PCDHGC3, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21. Se prefiere que la secuencia de dichos genes de acuerdo con SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133 sea analizada.

Se prefiere además que dicho grupo consiste de los genes RASSF2, TFAP2E, SND1 y PCDHGC3 y/o sus regiones promotoras o reguladoras. En dicha realización, se prefiere que la secuencia de dichos genes de acuerdo con el SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO:11 sea analizada.

El método de análisis se puede seleccionar entre aquellos conocidos en la técnica, incluyendo aquellos enumerados en la presente memoria. Son particularmente preferidos MethyLight™, MSP y el uso de oligonucléotidos de bloqueo (HeavyMetil™) como se describe en la presente memoria. Adicionalmente se prefiere que cualquiera de los oligonucleótidos utilizados en semejante análisis (incluyendo cebadores, oligonucleótidos de bloqueo y sondas de detección) sean complementarios inversos, idénticos, o hibriden en condiciones restrictivas a muy restrictivas con un segmento de al menos 16 pares de bases de longitud de las secuencias de bases de uno o más del SEQ ID NO: 15 al SEQ ID NO: 36 y el SEQ ID NO: 43 al SEQ ID NO: 64 AND SEQ ID NO: 134 TO SEQ ID NO: 141 (y más preferiblemente el subgrupo de los mismos que consiste de SEQ ID NOS: 15, 16, 43, 44,17, 18, 45, 46, 27, 28, 55, 56,35 36 63 y 64) y secuencias complementarias a estas.

La metilación aberrante, más específicamente la hipermetilación de los genes o la secuencia genómica seleccionada del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E , SND1, PCDHGC3, EDNRB, STOM, GLI3; RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21 (incluyendo sus regiones promotoras y/o reguladoras) está asociada con la presencia de trastornos proliferativos celulares neoplásicos, y es particularmente prevalente en los carcinomas colorrectales. Por consiguiente cuando una muestra biológica presenta cualquier grado de metilación, dicha muestra debe ser determinada como cancerosa.

El análisis de uno de los genes o la secuencia genómica seleccionada del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E , SND1, PCDHGC3, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21 permite por primera vez detectar, o detectar y distinguir entre dos o entre varios trastornos proliferativos de células de colon provisto de una sensibilidad mayor o igual a 80% y una especificidad mayor o igual a 80%. Preferiblemente dicho grupo consiste de los genes RASSF2, TFAP2E , SND1 y PCDHGC3 y/o sus regiones promotoras o reguladoras.

La sensibilidad se calcula como (neoplasia detectada/todas las neoplasias) p. ej. (neoplasia de colon detectada/todas las neoplasias de colon; y la especificidad se calcula como (negativos no detectados/negativos totales).

Preferiblemente, la sensibilidad es de aproximadamente 75% a aproximadamente 96%, o de aproximadamente 80% a aproximadamente 90%, o de aproximadamente 80% a aproximadamente 85%. Preferiblemente, la especificidad es de aproximadamente 75% a aproximadamente 96%, o de aproximadamente 80% a aproximadamente 90%, o de aproximadamente 80% a aproximadamente 85%.

La neoplasia de colon se define en la presente memoria como todas las malignidades y adenomas de colon mayores de 1 cm, o subconjuntos de los mismos. Los negativos se pueden definir como individuos sanos.

En un aspecto, el método divulga el uso de al menos el gen PCDHGC3 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 y un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E, SND1; EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21 (o regiones promotoras o reguladoras del mismo) como marcador para la detección de trastornos proliferativos celulares (en particular trastornos del colon). Preferiblemente dicho grupo consiste de los genes RASSF2, TFAP2E, SND1 y/o sus regiones promotroras o reguladoras. Dicho método puede ser habilitado por medio de cualquier análisis de expresión de un ARN transcrito a partir del mismo o polipéptido o proteína traducidos a partir de dicho ARN, preferiblemente por medio de análisis de expresión de ARNm o análisis de expresión de polipéptidos. De acuerdo con lo anterior la presente invención también proporciona análisis diagnósticos y métodos de diagnóstico, tanto cuantitativos como cualitativos, para detectar la expresión de al menos el gen PCDHGC3 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 y un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E , SND1,, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21 en un sujeto y determinar a partir de allí la presencia o ausencia de cáncer en dicho sujeto.

La descripción proporciona además ensayos y métodos de diagnóstico, ambos cuantitativos y cualitativos para detectar la expresión del gen PCDHGC3 en combinación con al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en Septina 9, RASSF2, TFAP2E, SND1, PCDHGC3, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21 en un sujeto y determinar a partir de los mismos la presencia o ausencia de cáncer en dicho sujeto.

[0143] Son particularmente preferidas las siguientes combinaciones de genes:

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Septina 9+RASSF2+TFAP2E+PCDHGC3+SND1

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Septina 9+RASSF2+TFAP2E+PCDHGC3

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Septina 9+TFAP2E+PCDHGC3

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Septina 9+PCDHGC3

La expresión aberrante del ARNm transcrito a partir de los genes o secuencias genómicas seleccionada del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E. SND1; PCDHGC3, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1. GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21 están asociadas con la presencia de cáncer en un sujeto. Preferiblemente dicho grupo consiste de los genes SND1; PCDHGC3 y RASSF2.

De acuerdo con la presente invención, la subexpresión (y/o presencia de metilación) está asociada con la presencia de cáncer, y viceversa la sobreexpresión (y/o ausencia de metilación) está asociada con la ausencia de cáncer.

Para detectar la presencia de ARNm que codifica un gen, se obtiene una muestra de un paciente. La muestra puede ser cualquier muestra adecuada que comprenda materia celular del tumor. Los tipos de muestras adecuadas incluyen líneas celulares, portas histológicos, biopsias, tejido incluido en parafina, fluidos corporales, deposiciones, efluente colónico, orina, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa, células sanguíneas aisladas, células aisladas de la sangre y todas las posibles combinaciones de los mismos. Se prefiere que dichos tipos de muestras sean deposiciones o fluidos corporales seleccionados del grupo que consiste en efluente colónico, orina, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa, células sanguíneas aisladas, células aisladas de la sangre.

La muestra se puede tratar para extraer el ARN de ella. El ácido nucleico resultante de la muestra se analiza a continuación. Se conocen en el estado de la técnica muchos mecanismos para determinar los niveles absolutos y relativos de la expresión génica, los mecanismos comúnmente utilizados para su uso en la presente invención incluyen la hibridación in situ (p. ej. FISH), análisis Northern, ensayos de protección frente a ARNasa (RPA), mecanismos basados en micromatrices y PCR, tales como PCR cuantitativa y PCR de presentación diferencial o cualquier otro método de detección de ácidos nucleicos.

Es particularmente preferido el uso del mecanismo de transcripción inversa/reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR). El método de RT-PCR es bien conocido en la técnica (por ejemplo, véase Watson y Fleming, más arriba).

El método de RT-PCR se puede llevar a cabo como sigue. Se aísla el ARN celular total por ejemplo, mediante el método de isotiocianato de guanidinio convencional y el ARN total se somete a transcripción inversa. El método de transcripción inversa implica la síntesis de ADN sobre un molde de ARN utilizando una enzima transcriptasa inversa y un cebador dT oligonucleotídico en el extremo 3' y/o cebadores hexaméricos al azar. El ADNc producido de este modo se amplifica a continuación por medio de PCR. (Belyavsky et al, Nucl Acid Res 17:2919-2932, 1989; Krug y Berger, Methods in Enzymology, Academic Press, N.Y., Vol. 152, págs. 316-325, 1987 que se incorporan aquí como referencia). Es adicionalmente preferida la variante “En Tiempo Real” de la RT-PCR, en donde el producto de la PCR es detectado por medio de sondas de hibridación (p. ej. TaqMan, Lightcycler, Molecular Beacons y Scorpion) o verde SYBR. La señal detectada procedente de las sondas o el verde SYBR es cuantificada a continuación por medio de la referencia a una curva patrón o comparando los valores Ct con los de un patrón de calibración. El análisis de los genes constitutivos se utiliza a menudo para normalizar los resultados.

En el análisis de transferencia Northern se leva a cabo el análisis del ARNm total o poli(A)+ sobre un gel de agarosa desnaturalizante y se detecta por medio de hibridación con una sonda marcada en el propio gel seco o sobre una membrana. La señal resultante es proporciona a la cantidad de ARN diana en la población de ARN.

La comparación de las señales de dos o más poblaciones celulares o tejidos revela las diferencias relativas en los niveles de expresión génica. La cuantificación absoluta se puede realizar comparando la señal con una curva patrón generada utilizando cantidades conocidas de un transcrito in vitro correspondiente al ARN diana. El análisis de los genes constitutivos, genes cuyos niveles de expresión se espera que permanezcan relativamente constantes con independencia de las condiciones, se utiliza a menudo para normalizar los resultados, eliminando cualquier diferencia evidente causada por una transferencia desigual de ARN a la membrana o una carga desigual de ARN sobre el gel.

La primera etapa del análisis Northern es el aislamiento del ARN intacto, puro de las células o tejido de interés. Debido a que las transferencias Northern distinguen los ARN por tamaños, la integridad de la muestra influye en el grado en el que se localiza la señal en una única banda. Las muestras de ARN parcialmente degradadas darán como resultado que la señal se esparza o se distribuya sobre varias bandas con una pérdida global de sensibilidad y posiblemente una interpretación errónea de los datos. En el análisis de transferencia Northern, se pueden utilizar sondas de ADN, ARN y oligonucleótidos y estas sondas están preferiblemente marcadas (p. ej. marcas radiactivas, marcas de masa o marcas fluorescentes). El tamaño del ARN diana, no la sonda, determinará el tamaño de la banda detectada, de manera que los métodos tales como el marcaje cebado al azar, que genera sondas de longitudes variables, son adecuados para la síntesis de la sonda. La actividad específica de la sonda determinará el nivel de sensibilidad, de manera que se prefiere utilizar sondas con actividades altamente específicas.

En el ensayo de protección de ARNasa, la diana de ARN y la sonda de ARN de una longitud definida se hibridan en solución. Después de la hibridación, el ARN se digiere con ARNasas específicas para ácidos nucleicos de hebra sencilla para eliminar cualquier ARN diana y sondas de hebra sencilla no hibridados. Las ARNasas se inactivan, y el ARN se separa p. ej. mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante. La cantidad de sonda de ARN intacta es proporcional a la cantidad de ARN diana en la población de ARN. Se puede utilizar la RPA para la cuantificación relativa y absoluta de la expresión génica y también para mapear la estructura del ARN, tal como los límites intrón/exón y los sitios de inicio de la transcripción. El ensayo de protección con ARNasa es preferible al análisis de transferencia Northern ya que generalmente tiene un límite de detección más bajo.

Las sondas de ARN antisentido utilizadas en RPA se generan mediante transcripción in vitro de un molde de ADN con un punto final definido y se encuentran normalmente en el intervalo de 50-600 nucleótidos. El uso de las sondas de ARN que incluyen secuencias adicionales no homólogas al ARN diana permite distinguir el fragmento protegido de la sonda completa. Las sondas de ARN se utilizan típicamente en lugar de las sondas de ADN debido a la facilidad de generar sondas de ARN de hebra sencilla y a la reproducibilidad y fiabilidad de la digestión de los dúplex de ARN:ARN con las ARNasas (Ausubel et al. 2003), son particularmente preferidas las sondas con actividades muy específicas.

Es particularmente preferido el uso de micromatrices. El proceso de análisis con micromatrices se puede dividir en dos partes principales. Primero está la inmovilización de secuencias génicas conocidas sobre portaobjetos de vidrio u otro soporte sólido seguido de hibridación del ADNc marcado fluorescentemente (que comprende las secuencias que se van a interrogar) con los genes conocidos inmovilizados sobre el portaobjetos de vidrio (u otra fase sólida). Después de la hibridación, las matrices se escanean utilizando un escáner de micromatrices fluorescente. El análisis de la intensidad de fluorescencia relativa de los diferentes genes proporciona una medida de las diferencias en la expresión génica.

Las matrices de ADN se pueden generar inmovilizando oligonucleótidos sintetizados previamente sobre portaobjetos de vidrio preparados u otras superficies sólidas. En este caso, se fabrican secuencias de genes representativos y se preparan utilizando métodos de síntesis de oligonucleótidos y de purificación convencionales. Estas secuencias de genes sintetizadas son complementarias a los transcritos de ARN de los genes de interés (en este caso los genes o secuencias genómicas seleccionadas del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E, SND1, PCDHGC3, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10, MRPS21 y Septina 9 y tienden a ser secuencias más cortas en el intervalo de 25-70 nucleótidos. Alternativamente, los oligonucleótidos inmovilizados pueden ser sintetizados químicamente in situ sobre la superficie del portaobjetos. La síntesis de oligonucleótidos in situ implica la adición consecutiva de los nucleótidos apropiados a las aplicaciones sobre la micromatriz; las aplicaciones que no reciben un nucleótido se protegen durante cada fase del proceso utilizando máscaras físicas o virtuales. Preferiblemente dichos ácidos nucleicos sintetizados son ácidos nucleicos bloqueados.

En los experimentos con micromatrices de perfilado de la expresión, los moldes de ARN utilizados son representativos del perfil de transcripción de las células o tejidos en estudio. El ARN se aísla primero de las poblaciones de células o los tejidos que se van a comparar. Cada muestra de ARN se utiliza a continuación como molde para generar ADNc marcado fluorescentemente a través de una reacción de transcripción inversa. El marcaje fluorescente del ADNc se puede completar mediante métodos de marcaje directo o de marcaje indirecto. Durante el marcaje directo, los nucleótidos modificados fluorescentemente (p. ej., Cy®3- o Cy®5-dCTP) se incorporan directamente al ADNc durante la transcripción inversa. Alternativamente, se puede lograr el marcaje indirecto incorporando nucleótidos modificados con aminoalilo durante la síntesis de ADNc y a continuación conjugando un éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) al ADNc modificado con aminoalilo después de que se complete la reacción de transcripción inversa. Alternativamente, la sonda puede no estar marcada, pero puede ser detectable por medio de unión específica con un ligando que está marcado, ya sea directamente o indirectamente. Las marcas y los métodos adecuados para el marcaje de ligandos (y sondas) se conocen en la técnica, e incluyen, por ejemplo, marcas radiactivas que se pueden incorporar por medio de métodos conocidos (p. ej., traslado de muescas o tratamiento con quinasa). Otras marcas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, biotina, grupos fluorescentes, grupos quimioluminiscentes (p. ej., dioxetanos, concretamente dioxetanos activados), enzimas, anticuerpos, y similares.

Para llevar a cabo el análisis de expresión génica diferencial, los ADNc generados a partir de diferentes muestras de ARN se marcan con Cy®3. El ADNc marcado resultante se purifica para eliminar los nucleótidos no incorporados, el colorante libre y el ARN residual. Después de la purificación, las muestras de ADNc marcado se hibridan a la micromatriz. La rigurosidad de la hibridación se determina por medio de numerosos factores durante la hibridación y durante el procedimiento de lavado, incluyendo la temperatura, la fuerza iónica, la duración y la concentración de formamida. Estos factores se esbozan, por ejemplo, en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., 1989). La micromatriz se somete a barrido después de la hibridación utilizando un escáner de micromatrices fluorescente. La intensidad de fuorescencia de cada aplicación indica el nivel de expresión del gen analizado; las aplicaciones brillantes corresponden a genes fuertemente expresados, mientras las aplicaciones tenues indican una expresión débil.

Una vez que se obtienen las imágenes, los datos de partida deben ser analizados. En primer lugar, la fluorescencia del fondo debe ser restada de la fluorescencia de cada aplicación. A continuación se normalizan los datos para una secuencia de control, tal como ácidos nucleicos añadidos exógenamente (preferiblemente ARN o ADN), o un panel de genes constitutivos para considerar cualquier hibridación no específica, imperfecciones en la matriz o variabilidad en el ajuste de la matriz, marcaje de ADNc, hibridación o lavado. La normalización de datos permite comparar los resultados de múltiples matrices.

Otro aspecto de la divulgación hace referencia al uso de kits en el diagnóstico del cáncer en un sujeto de acuerdo con los métodos de la presente invención, comprendiendo dicho kit: un medio para medir el nivel de transcripción de genes

o secuencias genómicas seleccionada del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E, SND1, PCDHGC3, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21 . Preferiblemente dicho grupo consiste de los genes RASSF2, TFAP2E , SND1 y PCDHGC3 y/o sus regiones promotoras o reguladoras.

En un aspecto preferido, los medios para medir el nivel de transcripción comprenden oligonucleótidos y polinucleótidos capaces de hibridar en condiciones restrictivas o moderadamente restrictivas con los productos de transcripción del gen PCDHGC3 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 y el gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E , SND1, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21. Preferiblemente dicho grupo consiste de los genes RASSF2, TFAP2E, SND1 y/o sus regiones promotoras o reguladoras.

Adicionalmente se prefiere que dicho kit comprenda adicionalmente medios para medir el nivel de transcripción del gen de Septina 9 que comprende los oligonucleótidos o polinucleótidos capaces de hibridar en condiciones restrictivas o moderadamente restrictivas con los productos de transcripción de dicho gen. En una realización, dichos oligonucleótidos

o polinucleótidos comprenden al menos 9, 18 o 25 bases de una secuencia complementaria a o que hibrida con dicho producto de transcripción.

En una realización más preferida el nivel de transcripción se determina mediante técnicas seleccionadas del grupo de análisis de transferencia Northern, PCR con transcriptasa inversa, protección con ARNasa, y micromatrices. En otra realización de la invención, el kit comprende adicionalmente medios para obtener una muestra biológica del paciente. Se prefiere un kit, que comprende adicionalmente un recipiente que es muy preferiblemente adecuado para contener los medios para medir el nivel de transcripción y la muestra biológica del paciente, y muy preferiblemente comprende adicionalmente instrucciones para su uso y para la interpretación de los resultados del kit.

En un aspecto preferido el kit comprende (a) una pluralidad de oligonucleótidos o polinucleótidos capaces de hibridar en condiciones restrictivas o moderadamente restrictivas con los productos de transcripción de al menos el gen PCDHGC3

o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 y un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E, SND1, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21;

(b)

un recipiente, preferiblemente adecuado para que contenga los oligonucleótidos o polinucleótidos y una muestra biológica del paciente que comprende los productos de transcripción en donde los oligonucleótidos o polinucleótidos pueden hibridar en condiciones restrictivas o moderadamente restrictivas con los productos de transcripción, (c) medios para detectar la hibridación de la etapa (b); y, opcionalmente (d) instrucciones para el uso y la interpretación de los resultados del kit. Adicionalmente se prefiere que dichos oligonucleótidos o polinucleótidos de la etapa (a) comprendan en cada caso al menos 9, 18 o 25 bases de una secuencia complementaria a o que hibrida con los productos de transcripción de un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E, SND1, PCDHGC3, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21 y sequences complementary thereto. Preferiblemente dicho grupo consiste de los genes RASSF2, TFAP2E , SND1 y PCDHGC3 y/o sus regiones promotroras o reguladoras..

Adicionalmente se prefiere que dicho kit comprenda (e) una pluralidad de oligonucleótidos o polinucleótidos capaces de hibridar en condiciones restrictivas o moderadamente restrictivas con los productos de transcripción del gen de Septina

9. Dichos oligonucleótidos o polinucleótidos de (e) comprenden preferiblemente en cada caso al menos 9, 18 o 25 bases de una secuencia complementaria a o que hibrida con los productos de transcripción de Septina 9.

El kit también puede contener otros componentes tales como tampón de hibridación (donde los oligonucleótidos se van a utilizar como una sonda) empaquetado en un recipiente separado. Alternativamente, cuando los oligonucleótidos se van a utilizar para amplificar una región diana, el kit puede contener, envasados en recipientes separados, una polimerasa y un tampón de reacción optimizados para la extensión del cebador mediada por la polimerasa, tal como PCR. Preferiblemente dicha polimerasa es una transcriptasa inversa. Adicionalmente se prefiere que el kit contenga adicionalmente un reactivo de ARNasa.

La presente divulgación proporciona además métodos para la detección de la presencia del polipéptido codificado por dichas secuencias génicas en una muestra obtenida de un paciente.

Los niveles aberrantes de expresión polipeptídica del polipéptido codificado por los genes o las secuencias genómicas seleccionada del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E , SND1, PCDHGC3, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MOPS21 están asociados con la presencia de cáncer. La exactitud del diagnóstico del cáncer colorrectal aumenta cuando los polipéptidos del gen de Septina 9 se analizan combinados con dicho polipéptido anteriormente mencionado.

De acuerdo con la presente invención, la expresión a la baja de dichos polipéptidos está asociada con la presencia de cáncer.

Se puede utilizar cualquier método conocido en la técnica para detectar polipéptidos. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, espectrometría de masas, inmunodifusión, inmunoelectroforesis, métodos inmunoquímicos, ensayos de unión a ligandos, técnicas inmunohistoquímicas, ensayos de aglutinación y complemento (p. ej., véase Basic and Clinical Immunology, Sites and Terr, eds., Appleton y Lange, Norwalk, Conn. Págs. 217-262, 1991). Se prefieren los métodos de inmunoensayo de unión a ligando que incluyen hacer reaccionar anticuerpos con uno o varios epítopos y desplazar competitivamente un polipéptido marcado o derivado del mismo.

Ciertos aspectos de la presente divulgación comprenden el uso de anticuerpos específicos para el polipéptido codificado por un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E, SND1, PCDHGC3, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21. Preferiblemente dicho grupo consiste de los genes RASSF2, TFAP2E, SND1 y PCDHGC3. Realizaciones adicionales de la presente invención comprenden el uso de una primera especie de anticuerpos específicos para el polipéptido codificado por el gen de PCDHGC3 y una segunda especie de anticuerpos específicos para el polipéptido codificado por un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E , SND1, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10, MRPS21 y Septina 9. Preferiblemente dice segunda especies de anticuerpos es específica para el polipéptido codificado por un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E, SND1 y Septina 9.

Tales anticuerpos son útiles para el diagnóstico de cáncer. En ciertas realizaciones la producción de anticuerpos monoclonales o policlonales puede ser inducida por el uso de un epítopo codificado por un polipéptido codificado por un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E, SND1, PCDHGC3, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LirnK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 MRPS21 y Septina 9 como un antígeno. Preferiblemente dicho grupo consiste de los genes RASSF2, TFAP2E, SND1 y Septina 9. Tales anticuerpos pueden ser utilizados a su vez para detectar polipéptidos expresados como marcadores para el diagnóstico del cáncer. Los niveles de tales polipéptidos presentes se pueden cuantificar por métodos convencionales. La unión anticuerpo-polipéptido se puede detectar y cuantificar por una variedad de medios conocidos en la técnica, tales como el marcaje con ligandos fluorescentes o radiactivos. La invención comprende además kits para realizar los procedimientos antes mencionados, en donde tales kits contienen anticuerpos específicos para los polipéptidos investigados.

Numerosos inmunoensayos de unión a polipéptidos competitivos y no competitivos son bien conocidos en la técnica. Los anticuerpos empleados en tales ensayos pueden no estar marcados, por ejemplo tal como se utiliza en ensayos de aglutinación, o estar marcados para su uso en una amplia variedad de métodos de ensayo. Las marcas que se pueden utilizar incluyen radionúclidos, enzimas, reactivos fluorescentes, quimioluminescentes, sustratos enzimáticos o cofactores, inhibidores de enzimas, partículas, colorantes y similares. Los ensayos preferidos incluyen, pero no se limitan a radioinmunoensayo (RIA), inmunoensayos enzimáticos, p. ej., ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), inmunoensayos fluorescentes y similares. Los anticuerpos policlonales o monoclonales o los epítopos de los mismos se pueden elaborar para su uso en inmunoensayos mediante cualquiera de una serie de métodos conocidos en la técnica.

En una realización alternativa del método, las proteínas se pueden detectar por medio de análisis de transferencia Western. Dicho análisis es convencional en la técnica, brevemente las proteínas se separan por medio de electroforesis

p. ej., SDS-PAGE. Las proteínas separadas se transfieren a continuación a una membrana adecuada (o papel), p. ej. nitrocelulosa, conservando la separación espacial conseguida por la electroforesis. La membrana se incuba después con un agente de bloqueo para unir los sitios cohesivos restantes sobre la membrana, los agentes comúnmente usados incluyen proteína genérica (p. ej. proteína de leche). A continuación se añade un anticuerpo específico para la proteína de interés, estando dicho anticuerpo marcado de manera detectable por ejemplo mediante colorantes o medios enzimáticos (p. ej. fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante). A continuación, se detecta la localización del anticuerpo sobre la membrana.

En una realización alternativa del método, las proteínas se pueden detectar por medio de inmunohistoquímica (el uso de anticuerpos para sondear antígenos específicos en una muestra). Dicho análisis es convencional en la técnica, en donde la detección de antígenos en los tejidos se conoce como inmunohistoquímica, mientras que la detección en las células cultivadas se denomina generalmente inmunocitoquímica. En resumen, el anticuerpo primario que se va a detectar mediante la unión a su antígeno específico. El complejo antígeno-anticuerpo se une después a un anticuerpo secundario conjugado con enzima. En presencia del sustrato necesario y el cromógeno se detecta la enzima unida de acuerdo a los depósitos de color en los sitios de unión anticuerpo-antígeno. Hay una amplia gama de tipos adecuados de muestras, afinidad antígeno-anticuerpo, tipos de anticuerpos, y métodos de mejora de la detección. Por lo tanto las condiciones óptimas para la detección inmunohistoquímica o inmunocitoquímica deben ser determinadas por la persona experta en la técnica para cada caso individual.

Un enfoque para preparar anticuerpos para un polipéptido consiste en la selección y preparación de una secuencia de aminoácidos de la totalidad o parte del polipéptido, la síntesis química de la secuencia de aminoácidos y la inyección en un animal apropiado, normalmente un conejo o un ratón (Milstein y Kohler Nature 256: 495-497, 1975; Gulfre y Milstein, Methods in Enzymology: Immunochemical Techniques 73: 1-46, Langone y Banatis eds., Academic Press, 1981 que se incorporan como referencia en su totalidad). Los métodos para la preparación de los polipéptidos o epítopos de los mismos incluyen, pero no se limitan a, la síntesis química, las técnicas de ADN recombinante o el aislamiento de muestras biológicas.

En la última etapa del método se determina el diagnóstico del paciente, con lo cual la expresión a la baja de al menos e gen PCDHGC3 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 y un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E , SND1,, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21 es indicativa de la presencia de cáncer. Se entenderá que el término expresión a la baja significa la expresión a un nivel detectado menor que un corte pre-determinado que puede ser seleccionado del grupo que consiste en la media, mediana o un valor umbral optimizado. Otro aspecto de la divulgación proporciona un kit para su uso en el diagnóstico del cáncer en un sujeto de acuerdo con los métodos de la presente invención que comprende: un medio para detectar polipéptidos de al menos el gen PCDHGC3 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 y un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E , SND1, PCDHGC3, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10,y MRPS21. Preferiblemente dicho grupo consiste de los genes RASSF2, TFAP2E, SND1. Los medios para detectar los polipéptidos comprenden preferiblemente anticuerpos, derivados de anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos. Los polipéptidos se detectan muy preferiblemente por medio de transferencia Western utilizando un anticuerpo marcado. En otra realización de la invención, el kit comprende además medios para obtener una muestra biológica del paciente. Se prefiere un kit, que comprende adicionalmente un recipiente adecuado para contener los medios para detectar los polipéptidos en la muestra biológica del paciente, y lo más preferiblemente comprende adicionalmente instrucciones para el uso e interpretación de los resultados del kit. En una realización preferida el kit comprende: (a) un medio para detectar polipéptidos al menos el gen PCDHGC3 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 y un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E , SAND1, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21; (b) un recipiente adecuado para contener dichos medios y la muestra biológica del paciente, que comprende los polipéptidos en donde los medios pueden formar complejos con los polipéptidos; (c) un medio para detectar los complejos de (b); y opcionalmente (d) las instrucciones para el uso y la interpretación de los resultados del kit.

Preferiblemente (a) es un medio para detectar polipéptidos al menos un gen seleccionado del grupo que consiste enRASSF2, TFAP2E , SND1 y Septina 9.

El kit también puede contener otros componentes tales como tampones o soluciones adecuados para el bloqueo, lavado

o recubrimiento, envasados en un recipiente separado.

Aspectos particulares de la,presente divulgación proporcionan una nueva aplicación del análisis de los niveles y/o patrones de metilación dentro de dichas secuencias que permite la detección precisa, la caracterización y/o el tratamiento de trastornos proliferativos de células colorrectales. La detección precoz del cáncer está directamente relacionada con el pronóstico de la enfermedad, y el método descrito permite de ese modo al médico y al paciente tomar decisiones de tratamiento mejores y más informadas.

Mejoras adicionales

La presente divulgación proprociona nuevos usos para la secuencia genómica del SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133. Realizaciones adicionales proporcionan variantes modificadas de SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133 así como oligonucleótidos y/o oligómeros de PNA para el análisis de patrones de metilación de citosina dentro del SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133.

Un objetivo de la divulgación comprende el análisis de el estado de metilación de uno o más dinucleótidos de CpG dentro de al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133 y las secuencias complementarias a estos.

La divulgación proporciona ácidos nucleicos tratados, derivados de los SEQ ID NO:1 al SEQ ID NO: 14 y el SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133 genómicos, en donde el tratamiento es adecuado para convertir al menos una base de citosina no metilada de la secuencia de ADN genómico en uracilo u otra base que es detectablemente diferente de la citosina en términos de hibridación. Las secuencias genómicas en cuestión pueden comprender una o más posiciones de CpG metilado consecutivas. Dicho tratamiento comprende preferiblemente el uso de un reactivo seleccionado del grupo que consiste en bisulfito, sulfito de hidrógeno, disulfito, y sus combinaciones. En un aspecto preferido, la divulgación proporciona un ácido nucleico modificado de origen no natural que comprende una secuencia de al menos 16 bases de nucleótidos contiguas de longitud de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 15 al SEQ ID NO: 70 y el SEQ ID NO: 134 al SEQ ID NO: 141. En un aspecto preferido adicional dicho ácido nucleico tiene al menos 50, 100, 150, 200, 250 ó 500 pares de bases de longitud de un segmento de la secuencia de ácido nucleico descrita en el SEQ ID NO: 15 al SEQ ID NO: 36 y el SEQ ID NO: 43 al SEQ ID NO: 64 y el SEQ ID NO: 134 al SEQ ID NO: 141. Es particularmente preferida una molécula de ácido nucleico que no es idéntica o complementaria a toda o una porción de las secuencias del SEQ ID NO: 15 al SEQ ID NO: 70 y el SEQ ID NO: 134 al SEQ ID NO: 141 pero no al SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 14 y el SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133 u otro ADN de origen natural.

Se prefiere que dicha secuencia comprenda al menos un dinucleótido CpG, TpA o CpA y secuencias complementarias a estos. Las secuencias del SEQ ID NO: 15 al SEQ ID NO: 70 y el SEQ ID NO: 134 al SEQ ID NO: 141 proporcionan versiones de origen no natural modificadas del ácido nucleico de acuerdo con el SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 14 y el SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133, en donde la modificación de cada secuencia genómica da como resultado la síntesis de un ácido nucleico que tiene una secuencia que es única y distinta de dicha secuencia genómica de la siguiente manera. Para cada ADN genómico de hebra efectora, por ejempo el SEQ ID NO: 1, se describen cuatro versiones convertidas. Una primera versión en donde "C" se convierte en "T", pero "CpG" sigue siendo "CpG" (es decir, corresponde al caso en el que, para la secuencia genómica, todos los residuos "C" de las secuencias de dinucleótidos CpG están metilados y por lo tanto no son convertidos); una segunda versión describe el complemento de la secuencia de ADN genómico descrita (esto es, hebra antisentido), en donde "C" se convierte en "T", pero "CpG" sigue siendo "CpG" (esto es, corresponde al caso en el que, para todos los residuos "C" de las secuencias de dinucleótido CpG están metilados y por lo tanto no son convertidos). Las secuencias convertidas metiladas al alza del SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 14 y el SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133 corrsponden al SEQ ID NO: 15 al SEQ ID NO: 42. Se proporciona una tercera versión convertida químicamente de cada secuencia genómica, en donde “C” se convierte en “T” para todos los residuos “C”, incluyendo aquellos de las secuencias de dinucleótidos "CpG" (es decir, corresponde al caso en el que, para las secuencias genómicas, todos los residuos "C" de las secuencias de dinucleótidos CpG no están metiladas); una versión químicamente convertida final de cada secuencia, describe el complemento de la secuencia de ADN genómico descrita (esto es hebra antisentido), en donde "C" se convierte en "T" para todos los residuos de "C", incluidos aquellos de las secuencia de dinucleótidos "CpG" (esto es, corresponde al caso en el que, para el complemento (hebra antisentido) de cada secuencia genómica, todos los residuos "C" de las secuencias de dinucleótidos CpG no están metilados). Las secuencias convertidas “metiladas a la baja” del SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 14 y el SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133 corresponden al SEQ ID NO: 43 al SEQ ID NO: 70. Véase la Tabla 1 para más detalles.

De manera significativa, hasta ahora, las secuencias de ácidos nucleicos y las moléculas de acuerdo con el SEQ ID NO: 15 al SEQ ID NO: 36 y el SEQ ID NO: 43 al SEQ ID NO: 64 y el SEQ ID NO: 134 al SEQ ID NO: 141 no estaban implicados en o conectados con la detección de trastornos proliferativos celulares.

En un aspecto preferido alternativo, la divulgación proporciona además oligonucleótidos u oligómeros adecuados para su uso en los métodos de la invención para detectar el estado de metilación de la citosina en el ADN genómico o tratado (modificado químicamente), de acuerdo con el SEQ ID NO: 15 al SEQ ID NO: 70 y el SEQ ID NO: 134 al SEQ ID NO: 141; SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 14 y el SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133. Dichos oligonucleótidos o ácidos nucleicos oligoméricos proporcionan nuevos medios de diagnóstico. Dicho oligonucleótido u oligómero que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene una longitud de al menos nueve (9) nucleótidos que es idéntica a, hibrida, en condiciones moderadamente restrictivas o restrictivas (como se ha definido en la presente memoria anteriormente), a una secuencia de ácido nucleico tratado de acuerdo con el SEQ ID NO: 15 al SEQ ID NO: 70 y el SEQ ID NO: 134 al SEQ ID NO: 141 y/o secuencias complementarias a estas, o a una secuencia genómica de acuerdo con el SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 14 y el SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133 y/o secuencias complementarias a estas.

Por lo tanto, la presente divulgación incluye moléculas de ácido nucleico (p. ej. oligonucleótidos y moléculas de ácido péptidonucleico (PNA) (oligómeros de PNA)) que hibridan en condiciones de hibridación moderadamente restrictivas y/o restrictivas con toda o una porción de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 15 al SEQ ID NO: 70 y SEQ ID NO: 134 al SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133 o con los complementos de las mismas. Se prefiere particularmente una molécula de ácido nucleico que hibrida en condiciones de hibridación moderadamente restrictivas y/o restrictivas con toda o una porción de las secuencias del SEQ ID NO: 15 al SEQ ID NO: 70 y SEQ ID NO: 134 al SEQ ID NO: 141 pero no del SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133 u otro ADN genómico humano.

La porción idéntica o que hibrida de los ácidos nucleicos que hibridan tiene típicamente al menos 9, 16, 20, 25, 30 o 35 nucleótidos de longitud. Sin embargo, las moléculas más largas tienen la utilidad de la invención, y están por lo tanto dentro del alcance de la presente divulgación.

Preferiblemente, la porción que hibrida de los ácidos nucleicos que hibridan de la invención es idéntica al menos en 95%, o al menos en 98%, o en 100% a la secuencia, o una porción de la misma de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 15 al SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 43 al SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 134 al SEQ ID NO: 141, o a los complementos de las mismas.

Los ácidos nucleicos que hibridan del tipo descrito en la presente memoria se pueden utilizar, por ejemplo, como un cebador (por ejemplo, un cebador de PCR), o una sonda o cebador de diagnóstico y/o pronóstico. Preferiblemente, la hibridación de la sonda de oligonucleótido con una muestra de ácido nucleico se lleva a cabo en condiciones restrictivas y la sonda es idéntica en 100% a la secuencia diana. La estabilidad del dúplex de ácido nucleico o el híbrido se expresa como la temperatura de fusión o Tm, que es la temperatura a la que una sonda se disocia de un ADN diana. Esta temperatura de fusión se utiliza para definir las condiciones de rigurosidad requeridas.

Para secuencias diana que están relacionadas y son sustancialmente idénticas a la secuencia correspondiente del SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133 (tales como las variantes alélicas y los SNP), en lugar de idénticas, es útil establecer primero la temperatura más baja a la que sólo se produce la hibridación homóloga con una concentración concreta de sal (p. ej., SSC o SSPE). A continuación, suponiendo que 1% de emparejamientos erróneos dan como resultado una disminución de 1°C en la Tm, la temperatura del lavado final en la reacción de hibridación se reduce en consecuencia (por ejemplo, si se buscan secuencias que tienen una identidad de >95% con la sonda, la temperatura de lavado final se reduce en 5°C). En la práctica, el cambio en la Tm puede ser de entre 0,5°C y 1,5°C para un 1% de emparejamientos erróneos.

Ejemplos de oligonucleótidos de longitud X (en nucleótidos), según lo indicado por las posiciones de polinucleótidos con referencia al, por ejemplo, SEQ ID NO: 1, incluyen aquellos correspondientes a los conjuntos (conjuntos efectores y antisentido) de oligonucleótidos solapantes de manera consecutiva de longitud X, donde los oligonucleótidos dentro de cada conjunto solapante de manera consecutiva (correspondiente a un valor X dado) se definen como el conjunto finito de Z oligonucleótidos desde las posiciones de los nucleótidos:

Sln a (n + (X-1));

donde n = 1, 2, 3, ...(Y- (X-1));

donde Y es igual a la longitud (nucleótidos o pares de bases) del SEQ ID NO: 1 (2519);

donde X es igual a la longitud común (en nucleótidos) de cada oligonucleótido en el conjunto (p. ej., X = 20 para un conjunto de 20 unidades solapantes de manera consecutiva); y

donde el número (Z) de oligómeros solapantes de manera consecutiva de longitud X para un determinado SEQ ID NO de longitud Y es igual a Y- (2519-1). Por ejemplo Z = 2519-19 = 2500, ya sea para conjuntos efectores o antisentido de SEQ ID NO: 1, donde X = 20.

Preferiblemente, el conjunto se limita a aquellos oligómeros que comprenden al menos un dinucleótido CpG, TpG o CpA.

Ejemplos de oligonucleótidos 20 unidades incluyen el siguiente conjunto de 2.261 oligómeros (y el conjunto antisentido complementario del mismo), indicado por las posiciones de polinucleótido con referencia al SEQ ID NO: 1:

1-20, 2-21, 3-22, 4-23, 5-24, ............... y 2499-2519.

Preferiblemente, el conjunto se limita a aquellos oligómeros que comprenden al menos un dinucleótido CpG, TpG o CpA.

Del mismo modo, los ejemplos de oligonucleótidos de 25 unidades incluyen el siguiente conjunto de 2.256 oligómeros (y el conjunto antisentido complementario a estos). indicado por las posiciones de polinucleótido con referencia al SEQ ID NO: 1:

1-25, 2-26, 3-27, 4-28, 5-29, ...... y 2494-2519.

Preferiblemente, el conjunto se limita a los oligómeros que comprenden al menos un dinucleótido CpG, TpG o CpA.

La presente divulgación abarca, para cada uno de los SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 15 al SEQ ID NO: 36 y el SEQ ID NO: 43 al SEQ ID NO: 64 y el SEQ ID NO: 134 al SEQ ID NO: 141 (efector y antisentido), múltiples conjuntos solapantes de manera consecutiva de oligonucleótidos u oligonucleótidos modificados de longitud X, donde, p. ej., X = 9, 10, 17, 20, 22, 23, 25, 27, 30 ó 35 nucleótidos.

Los oligonucleótidos u oligómeros, de acuerdo con la presente divulgación constituyen herramientas eficaces útiles para comprobar los parámetros genéticos y epigenéticos de las secuencias genómicas seleccionadas del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133. Los conjuntos preferidos de tales oligonucleótidos u oligonucleótidos modificados de longitud X son aquellos conjuntos solapantes de manera consecutiva de oligómeros correspondientes al SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 15 al SEQ ID NO: 70 y SEQ ID NO: 134 al SEQ ID NO: 141 (y a los complementos de los mismos). Preferiblemente, dichos oligómeros comprenden al menos un dinucleótido CpG, TpG o CpA.

Son particularmente preferidos los oligonucleótidos u oligómeros de acuerdo con la presente divulgación en los que la citosina de las secuencias del dinucleótido CpG (o del correspondiente dinucleótido TpG o CpA convertido) está dentro del tercio medio del oligonucleótido; es decir, donde el oligonucleótido tiene, por ejemplo, 13 bases de longitud, el dinucleótido CpG, TpG o CpA está posicionado dentro del quinto a noveno nucleótidos desde el extremo 5'.

Los oligonucleótidos de la divulgación también pueden ser modificados por conexión química del oligonucleótido a uno o más radicales o productos conjugados para mejorar la actividad, la estabilidad o la detección del oligonucleótido. Tales radicales o productos conjugados incluyen cromóforos, fluoróforos, lípidos tales como colesterol, ácido cólico, tioéter, cadenas alifáticas, fosfolípidos, poliaminas, polietilenglicol (PEG), radicales palmitilo, y otros como se describe, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Números 5.514.758, 5.565.552, 5.567.810, 5.574.142, 5.585.481, 5.587.371, 5.597.696 y 5.958.773. Las sondas también pueden existir en la forma de un PNA (ácido peptidonucleico) que tiene propiedades de emparejamiento particularmente preferidas. Por lo tanto, el oligonucleótido puede incluir otros grupos añadidos tales como péptidos, y puede incluir agentes de escisión desencadenados por hibridación (Krol et al., BioTechniques 6: 958-976, 1988) o agentes intercalantes (Zon, Pharm. Res. 5: 539 a 549, 1.988). Con este fin, el oligonucleótido se puede conjugar con otra molécula, p. ej., un cromóforo, fluoróforo, péptido, agente de entrecruzamiento desencadenado por hibridación, agente de transporte, agente de escisión activado por hibridación, etc.

El oligonucleótido puede comprender también al menos un radical azúcar modificado y/o radical base reconocidos en la técnica, o puede comprender una cadena principal modificada o enlace internucleosídico no natural.

Los oligonucleótidos u oligómeros de acuerdo con aspectos particulares de la presente divulgación se utilizan normalmente en "conjuntos", que contienen al menos un oligómero para el análisis de cada uno de los dinucleótidos CpG de una secuencia genómica seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133 y secuencias complementarias de la misma o del correspondiente dinucleótido CpG, TpG o CpA dentro de una secuencia de ácidos nucleicos tratados de acuerdo con el SEQ ID NO: 15 al SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 43 al SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 134 al SEQ ID NO: 141 y las secuencias complementarias a estas. Sin embargo, se prevé que por factores económicos u otros puede ser preferible analizar una selección limitada de los dinucleótidos CpG dentro de dichas secuencias, y el contenido del conjunto de oligonucleótidos se altera en consecuencia.

Por lo tanto, en aspectos particulares, la presente divulgación proporciona un conjunto de al menos dos (2) (oligonucleótidos y/u oligómeros de PNA) útiles para detectar el estado de metilación de la citosina en el ADN genómico tratado (SEQ ID NO: 15 al SEQ ID NO: 70 y SEQ ID NO: 134 al SEQ ID NO: 141), o en el ADN genómico (SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133 y secuencias complementarias a estas). Estas sondas permiten el diagnóstico, clasificación y/o la terapia de los parámetros genéticos y epigenéticos de los trastornos proliferativos de células colorrectales. El conjunto de oligómeros también se puede utilizar para la detección de polimorfismos de un único nucleótido (SNP) en el ADN genómico tratado (SEQ ID NO: 15 al SEQ ID NO: 70 y SEQ ID NO: 134 al SEQ ID NO: 141) o en el ADN genómico (SEQ ID NO:1 al SEQ ID NO:14 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO:133 y las secuencias complementarias a estas).

EN realizaciones preferidas, al menos uno, y más preferiblemente todos los miembros de un conjunto de oligonucleótidos están unidos a una fase sólida.

En aspectos adicionales, la presente divulgación proporciona un conjunto de al menos dos (2) oligonucleótidos que se utilizan como oligonucleótidos “cebadores” para amplificar secuencias de ADN de uno de los SEQ ID NO:1 al SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 15 al SEQ ID NO: 70 y SEQ ID NO: 134 al SEQ ID NO: 141 y secuencias complementarias a estas, o segmentos de las mismas.

Se prevé que los oligonucleótidos pueden constituir toda o parte de una "matriz" o "chip de ADN" (es decir, una disposición de diferentes oligonucleótidos y/u oligómeros de PNA unidos a una fase sólida). Semejante matriz de diferentes secuencias de oligonucleótidos y/u oligómeros de PNA puede estar caracterizada, por ejemplo, por estar dispuesta sobre la fase sólida en forma de una retícula rectangular o hexagonal. La superficie de la fase sólida puede estar compuesta de silicio, vidrio, poliestireno, aluminio, acero, hierro, cobre, níquel, plata, u oro. También se puede utilizar nitrocelulosa así como plásticos tales como nailon, que pueden existir en la forma de bolitas o también como matrices de resina. Una visión general del estado de la técnica en la fabricación de matrices de oligómeros puede ser obtenida de una edición especial de la revista Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, Volumen 21, Enero 1999, y de la bibliografía allí citada). Las sondas marcadas fluorescentemente se utilizan frecuentemente para el barrido de matrices de ADN inmovilizadas. La simple fijación de colorantes Cy3 y Cy5 al extremo 5'-OH de la sonda específica es particularmente adecuada para marcadores de fluorescencia. La detección de la fluorescencia de las sondas hibridadas se puede llevar a cabo, por ejemplo, a través de un microscopio confocal. Los colorantes Cy3 y Cy5, además de muchos otros, se encuentran disponibles en el mercado.

También se prevé que los oligonucleótidos o secuencias particulares de los mismos, puedan constituir la totalidad o parte de una "matriz virtual" en donde se utilizan los oligonucleótidos o secuencias concretas de los mismos, por ejemplo, como "indicadores" como parte de, o combinados con una población diversa de sondas marcadas únicas para analizar una mezcla compleja de analitos. Tal método, por ejemplo, se describe en el documento US 2003/0013091(Número de serie de Estados Unidos 09/898,743, publicado el 16 de Enero 2003). En tales métodos, se generan suficientes etiquetas de manera que cada ácido nucleico de la mezcla compleja (es decir, cada analito) se pueda unir de forma única a una única marca y por lo tanto ser detectado (cada marca se cuenta directamente, dando como resultado una lectura digital de cada especie molecular de la mezcla).

Se prefiere particularmente que los oligómeros sean utilizados para al menos uno de: detección de; diagnóstico de; tratamiento de; seguimiento de; y tratamiento y seguimiento de trastornos proliferativos de células colorrectales. Esto es posible por medio del uso de dichos conjuntos para la detección de una o más de las siguientes clases de tejidos: carcinoma colorrectal, adenoma de colon, tejido del colon inflamatorio, adenomas de colon con displasia de grado 2 de menos de 1 cm, adenomas de colon con displasia de grado 3 mayores de 1 cm, tejido de colon normal, tejido sano distinto de colon y tejido de cáncer distinto de colon.

Son particularmente preferidos aquellos conjuntos de oligómeros de acuerdo con los Ejemplos.

En el aspecto más preferido del método, se determina la presencia o ausencia de un trastorno proliferativo celular, muy preferiblemente carcinoma colorrectal. Esto se logra mediante el análisis del estatus de metilación de al menos una secuencia diana que comprende al menos una posición CpG, comprendiendo dicha secuencia, o hibridando en condiciones restrictivas con al menos 16 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133 (y más preferiblemente el subgrupo de los mismos que consiste en SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11) y los complementos de la misma. En una realización preferida adicional, esto se logra mediante el análisis del estatus de metilación de una secuencia diana que comprende al menos una posición de CpG, comprendiendo dicha secuencia, o hibridando en condiciones restrictivas con al menos 16 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 12 al SEQ ID NO: 14 y al menos una secuencia diana adicional que comprende al menos una posición CpG, comprendiendo dicha secuencia, o hibridando en condiciones restrictivas con al menos 16 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133 (y más preferiblemente el subgrupo de los mismos que consiste en SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11) y los complementos de la misma.

La presente divulgación proprociona además un método para la determinación de parámetros genéticos y/o epigenéticos de la secuencia genómica de acuerdo con SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133 dentro de un sujeto mediante el análisis de la metilación de la citosina y de los polimorfismos de un único nucleótido. Dicho método comprende poner en contacto un ácido nucleico que comprende el SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133(y más preferiblemente el subgrupo de los mismos que consiste en SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO:11) en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto con al menos un reactivo o una serie de reactivos, en donde dicho reactivo o serie de reactivos, distinguen entre dinucleótidos CpG metilados y no metilados dentro del ácido nucleico diana.

EN un aspecto preferido, dicho método comprende las siguientes etapas: En la primera etapa, se obtiene una muestra del tejido que se va a analizar. La fuente puede ser cualquier fuente adecuada, tal como líneas celulares, cortes histológicos, biopsias, tejido incluido en parafina, fluidos corporales, deposiciones, efluente colónico, orina, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa, células sanguíneas aisladas, células aisladas de la sangre y todas las combinaciones posibles de los mismos. Se prefiere que dichas fuentes de ADN sean de deposiciones o fluidos corporales seleccionados del grupo que consiste en efluente colónico, orina, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa, células sanguíneas aisladas, células aisladas de la sangre.

El ADN genómico se aísla a continuación de la muestra. El ADN genómico puede ser aislado por cualquier medio convencional en la técnica, incluyendo el uso de kits disponibles comercialmente. Brevemente, cuando el ADN de interés está encapsulado en una membrana celular la muestra biológica debe ser desorganizada y lisada mediante medios enzimáticos, químicos o mecánicos. La solución de ADN puede aclararse después de proteínas y otros contaminantes p. ej., por digestión con proteinasa K. A continuación se recupera el ADN genómico de la solución. Esto se puede llevar a cabo por medio de una variedad de métodos que incluyen precipitación salina, extracción orgánica o unión del ADN a un soporte en fase sólida. La elección del método se verá afectada por varios factores incluyendo tiempo, coste y cantidad necesaria de ADN.

Cuando el ADN de la muestra no está encerrado en una membrana (p. ej., ADN circulante a partir de una muestra de sangre) se pueden emplear métodos convencionales en la técnica para el aislamiento y/o la purificación de ADN. Tales métodos incluyen el uso de un reactivo de degeneración de proteínas p. ej., sal caotrópica, p. ej., hidrocloruro de guanidina o urea; o, un detergente p. ej. dodecilsulfato de sodio (SDS), bromuro de cianógeno. Los métodos alternativos incluyen, pero no se limitan a, precipitación con etanol o precipitación con propanol, concentración a vacío, entre otros, por medio de una centrífuga. El experto en la técnica también puede hacer uso de dispositivos tales como dispositivos de filtro p. ej. ultrafiltración, superficies de sílice o membranas, partículas magnéticas, partículas de poliestirol, superficies de poliestirol, superficies cargadas positivamente, y membranas cargadas positivamente, membranas cargadas, superficies cargadas, membranas de transición cargadas, y superficies de transición cargadas.

Una vez que los ácidos nucleicos se han extraído, el ADN de doble hebra genómico se utiliza en el análisis.

En la segunda etapa del método, la muestra de ADN genómico se trata de tal manera que las bases de citosina que no están metiladas en la posición 5' se convierten en uracilo, timina, u otra base que sea diferente a la citosina en términos de comportamiento de hibridación. En la presente memoria esto se entenderá como "pre-tratamiento" o "tratamiento".

Esto se logra preferiblemente por medio de tratamiento con un reactivo de bisulfito. El término "reactivo de bisulfito" se refiere a un reactivo que comprende bisulfito, disulfito, sulfito de hidrógeno o combinaciones de los mismos, útil como se describe en la presente memoria para distinguir entre secuencias de dinucleótidos CpG metilados y no metilados. Los métodos de dicho tratamiento son conocidos en la técnica (p. ej. documento PCT/EP2004/011715 que se publica como WO2005/038051). Se prefiere llevar a cabo el tratamiento con bisulfito en presencia de disolventes desnaturalizantes tales como, pero no limitados a, n-alquilenglicol, en particular dimetiléter de dietilenglicolglicol (DME), o en presencia de dioxano o derivados de dioxano. En una realización preferida, los disolventes desnaturalizantes se usan a concentraciones entre 1% y 35% (v/v). También se prefiere llevar a cabo la reacción de bisulfito en presencia de captadores tales como, pero no limitados a, derivados de cromano, p. ej., ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2carboxílico o ácido trihidroxibenzoico y derivados de los mismos, p. ej. ácido gálico (véase el documento PCT/EP2004/011715).

La conversión de bisulfito se lleva a cabo preferiblemente a una temperatura de reacción entre 30° C y 70°C, con lo cual la temperatura aumenta a más de 85°C durante períodos de tiempo cortos durante la reacción (véase el documento PCT/EP2004/011715). El ADN tratado con bisulfito se purifica preferiblemente antes de la cuantificación. Esto se puede llevar a cabo mediante cualquier medio conocido en la técnica, tal como, pero no limitado a, ultrafiltración, llevada a cabo preferiblemente por medio de columnas "MicroconTM" (fabricadas por Millipore (TM)). La purificación se lleva a cabo de acuerdo con el protocolo modificado del fabricante (véase el documento PCT/EP2004/011715).

En la tercera etapa del método, los fragmentos de ADN tratado se amplifican, usando conjuntos de oligonucleótidos cebadores de acuerdo con la presente divulgación, y una enzima de amplificación. La amplificación de varios segmentos de ADN se puede llevar a cabo simultáneamente en uno y el mismo recipiente de reacción. Típicamente, la amplificación se lleva a cabo utilizando una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Preferiblemente, dichos productos amplificados tienen de 100 a 2000 pares de bases de longitud. El conjunto de oligonucleótidos cebadores incluye al menos dos oligonucleótidos cuyas secuencias son cada una complementaria inversa, idéntica, o hibrida en condiciones restrictivas o muy restrictivas con un segmento de las secuencias de bases de al menos 16 pares de bases de longitud de una de las secuencias de los SEQ ID NO: 15 al SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 43 al SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 134 al SEQ ID NO: 141 (y más preferiblemente el subgrupo de los mismos que consiste en SEQ ID NOS: 15, 16, 43, 44, 17, 18, 45, 46, 27, 28, 55, 56,35 36 63 y 64) y secuencias complementarias a estas. Se prefiere que el conjunto de oligonucleótidos cebadores comprenda adicionalmente al menos dos oligonucleótidos cuyas secuencias sean cada una complementaria inversa, idéntica, o hibride en condiciones restrictivas o muy restrictivas con un segmento de las secuencias de bases de al menos 16 pares de bases de longitud de uno de los SEQ ID NO: 37 al SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 65 al SEQ ID NO: 70 y las secuencias complementarias a estas.

En un aspecto alternativo del método, el estatus de metilación de posiciones CpG preseleccionadas dentro de al menos unas secuencias de ácidos nucleicos seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133 (y más preferiblemente el subgrupo de los mismos que consiste en SEQ ID NO:1; SEQ ID NO: 2; (SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11), y preferiblemente además del SEQ ID NO: 12 al SEQ ID NO: 14 se puede detectar mediante el uso de oligonucleótidos cebadores específicos de metilación. Esta técnica (MSP) se ha descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 6.265.171 de Herman. El uso de cebadores específicos del estatus de metilación para la amplificación de ADN tratado con bisulfito permite la diferenciación entre ácidos nucleicos metilados y no metilados. Los pares de cebadores de MSP contienen al menos un cebador que hibrida con un dinucleótido CpG tratado con bisulfito. Por lo tanto, la secuencia de dichos cebadores comprende al menos un dinucleótido CpG. Los cebadores de MSP específicos para el ADN no metilado contienen una "T" en la posición de la posición C en el CpG. Preferiblemente, por lo tanto, se requiere que la secuencia de bases de dichos cebadores comprenda una secuencia que tenga una longitud de al menos 9 nucleótidos que hibride con una secuencia de ácido nucleico tratado de acuerdo con uno de los SEQ ID NO: 15 al SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 43 al SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 134 al SEQ ID NO: 141 (y más preferiblemente el subgrupo de los mismos que consiste en SEQ ID NOS: 15, 16, 43, 44,17, 18, 45, 46, 27, 28, 55, 56,35 36 63 y 64) y secuencias complementarias a estas, en donde la secuencia de bases de dichos oligómeros comprende al menos un dinucleótido CpG. Una realización preferida adicional del método, el método comprende el uso de oligonucléotidos de bloqueo (ensayo HeavyMethyl™). El uso de tales oligonucleótidos bloqueadores ha sido descrito por Yu et al., BioTechniques 23: 714 - 720, 1.997. Los oligonucleótidos de la sonda de bloqueo hibridan con el ácido nucleico tratado con bisulfito a la vez que con los cebadores de PCR. La amplificación por PCR del ácido nucleico se termina en la posición 5' de la sonda de bloqueo, de tal manera que la amplificación de un ácido nucleico se suprime cuando la secuencia complementaria a la sonda de bloqueo está presente. Las sondas se pueden diseñar para hibridar con el ácido nucleico tratado con bisulfito de una manera específica del estatus de metilación. Por ejemplo, para la detección de ácidos nucleicos metilados dentro de una población de ácidos nucleicos no metilados, la supresión de la amplificación de los ácidos nucleicos que no están metilados en la posición en cuestión se llevaría a cabo mediante el uso de sondas de bloqueo que comprenden un 'CpA' o 'TpA' en la posición en cuestión, en oposición a un 'CpG' si se desea la supresión de la amplificación de ácidos nucleicos metilados.

Para los métodos de PCR que utilizan los oligonucleótidos bloqueadores, la desorganización eficaz de la amplificación mediada por polimerasa requiere que los oligonucleótidos bloqueadores no sean alargados por la polimerasa. Preferiblemente, esto se logra a través del uso de los bloqueadores que son 3'-desoxioligonucleótidos, u oligonucleótidos derivatizados en la posición 3' con otro grupo hidroxilo "libre". Por ejemplo, los 3'-Oacetiloligonucleótidos son representativos de una clase preferida de molécula bloqueadora.

Adicionalmente, la descomposición mediada por polimerasa de los oligonucleótidos bloqueadores debe ser excluida. Preferiblemente, tal exclusión comprende o bien el uso de una polimerasa que carece de actividad exonucleasa 5'-3', o bien el uso de oligonucleótidos bloqueadores modificados que tienen, por ejemplo, puentes de tioato en los extremos 5' de los mismos que hacen que la molécula bloqueadora sea resistente a la nucleasa. Las aplicaciones concretas pueden no requerir tales modificaciones en 5' del bloqueador. Por ejemplo, si los sitios de unión al bloqueador y al cebador se solapan, impidiendo de ese modo la unión del cebador (por ejemplo, con exceso de bloqueador), la degradación del oligonucleótido bloqueador será excluida sustancialmente. Esto es debido a que la polimerasa no extenderá el cebador hacia, y a través (en la dirección 5'-3') del bloqueador, un proceso que da como resultado normalmente la degradación del oligonucleótido bloqueador hibridado.

Una realización de bloqueador/PCR particularmente preferido, para los propósitos de la presente invención, y como es implemetado en la presente memoria, comprende el uso de oligómeros de ácido peptidonucleico (PNA) como oligonucleótidos de bloqueo. Tales oligómeros bloqueadores de PNA son ideales, ya que no se descomponen ni tampoco son extendidos por la polimerasa.

Preferiblemente, por lo tanto, se requiere que la secuencia de bases de dichos oligonucleótidos de bloqueo comprenda una secuencia que tenga una longitud de al menos 9 nucleótidos que hibride con una secuencia de ácido nucleico tratado de acuerdo con uno de los SEQ ID NO: 15 al SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 43 al SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 134 al SEQ ID NO: 141 (y más preferiblemente el subgrupo de los mismos que consiste en SEQ ID NOS: 15, 16, 43, 44,17, 18, 45, 46, 27, 28, 55, 56,35 36 63 y 64) y secuencias complementarias a estas, en donde la secuencia de bases de dichos oligonucleótidos comprende al menos un dinucleótido CpG, TpG o CpA. También se prefiere un oligonucleótido de bloqueo que tenga una longitud de al menos 9 nucleótidos que hibride con una secuencia de ácido nucleico tratado de acuerdo con uno de los SEQ ID NO: 37 a SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 65 a SEQ ID NO: 70 y secuencias complementarias a estas, en donde la secuencia de bases de dichos oligonucleótidos comprende al menos un dinucleótido CpG, TpG o CpA.

Los fragmentos obtenidos por medio de la amplificación pueden llevar una marca detectable directamente o indirectamente. Se prefieren las marcas en forma de marcas de fluorescencia, radionúclidos o fragmentos de moléculas separables que tienen una masa típica que puede ser detectada en un espectrómetro de masas. Cuando dichas marcas son marcas de masa, se prefiere que los productos amplificados marcados tengan una sola carga neta positiva o negativa, permitiendo una mejor detectabilidad en el espectrómetro de masas. La detección se puede llevar a cabo y visualizar por medio de, p. ej. espectrometría de masas con desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI) o usando la espectrometría de masas de pulverización de electrones (ESI).

La espectrometría de masas con desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF) es un desarrollo muy eficaz para el análisis de biomoléculas (Karas y Hillenkamp, Anal Chem., 60: 2299-301, 1988). Un analito está incluido en una matriz de absorción de luz. La matriz es evaporada por un pulso de láser corto transportando así la molécula de analito en fase de vapor de una manera no fragmentada. El analito se ioniza por colisiones con moléculas de la matriz. Un voltaje aplicado acelera los iones en un tubo de vuelo libre de campo. Debido a sus diferentes masas, los iones se aceleran a diferentes velocidades. Los iones más pequeños alcanzan el detector antes que los más grandes. La espectrometría MALDI-TOF es muy adecuada para el análisis de péptidos y proteínas. El análisis de ácidos nucleicos es algo más difícil (Gut y Beck, Current Innovations and Future Trends, 1: 147-57, 1995). La sensibilidad con respecto al análisis de ácido nucleico es aproximadamente 100 veces menor que para los péptidos, y disminuye desproporcionadamente al aumentar el tamaño del fragmento. Por otra parte, para los ácidos nucleicos tiene una cadena principal con una carga negativa múltiple, el proceso de ionización a través de la matriz es considerablemente menos eficiente. En la espectrometría MALDI-TOF, la selección de la matriz desempeña un papel eminentemente importante. Para la desorción de péptidos, se han encontrado varias matrices muy eficaces que producen una cristalización muy fina. En la actualidad hay varias matrices sensibles para el ADN, sin embargo, la diferencia de sensibilidad entre los péptidos y los ácidos nucleicos no se ha reducido. Esta diferencia en la sensibilidad se puede reducir, sin embargo, modificando químicamente el ADN de tal manera que sea más similar a un péptido. Por ejemplo, los ácidos nucleicos con fosforotioato, en los cuales los fosfatos habituales de la cadena principal están sustituidos por tiofosfatos, pueden convertirse en un ADN de carga neutra usando una simple química de alquilación (Gut y Beck, Nucleic Acids Res.23: 1367-1373, 1.995). El acoplamiento de una etiqueta de carga a este ADN modificado da como resultado un aumento en la sensibilidad de MALDI-TOF al mismo nivel que el encontrado para los péptidos. Una ventaja adicional del etiquetado con carga es la mayor estabilidad del análisis frente a las impurezas, que hace la detección de sustratos no modificados considerablemente más difícil.

En la cuarta etapa del método, los productos amplificados obtenidos durante la tercera etapa del método se analizan para determinar el estatus de metilación de los dinucleótidos CpG antes del tratamiento.

En realizaciones en las que los productos amplificados fueron obtenidos por medio de la amplificación MSP, la presencia o ausencia de un producto amplificado es en sí misma indicativa del estado de metilación de las posiciones CpG cubiertas por el cebador, de acuerdo con las secuencias de bases de dicho cebador.

Los productos amplificados obtenidos mediante PCR convencional y específica de la metilación se pueden analizar adicionalmente por medio de los métodos basados en bases tales como, pero no limitados a la tecnología de matrices y las tecnologías basadas en sondas, así como por medio de técnicas como la secuenciación y la extensión dirigida por moldes.

En una realización del método, los productos amplificados sintetizados en la etapa tres se hibridan con posterioridad con una matriz o un conjunto de oligonucleótidos y/o sondas de PNA. En este contexto, la hibridación se lleva a cabo de la siguiente manera: el conjunto de sondas usadas durante la hibridación está compuesto preferiblemente de al menos 2 oligonucleótidos u oligómeros de PNA; en el proceso, los productos amplificados sirven como sondas que hibridan con oligonucleótidos previamente unidos a una fase sólida; los fragmentos no hibridados se eliminan posteriormente; dichos oligonucleótidos contienen al menos una secuencia de bases que tiene una longitud de al menos 9 nucleótidos que es complementaria inversa o idéntica a un segmento de las secuencias de bases especificadas en la presente Lista de Secuencias; y el segmento comprende al menos un dinucleótido CpG, TpG o CpA. La porción de hibridación de los ácidos nucleicos de hibridación es típicamente de al menos 9, 15, 20, 25, 30 o 35 nucleótidos de longitud. Sin embargo, las moléculas más largas tienen la utilidad de la invención, y por lo tanto están dentro del alcance de la presente invención

En una realización preferida, dicho dinucleótido está presente en el tercio central del oligómero. Por ejemplo, cuando el oligómero comprende un dinucleótido CpG, dicho dinucleótido es preferiblemente el quinto a noveno nucleótido del extremo 5' de un segmento de 13 unidades. Existe un oligonucleótido para el análisis de cada dinucleótido CpG dentro de una secuencia de acuerdo con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133, y las posiciones equivalentes dentro del SEQ ID NO: 15 al SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 43 al SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 134 al SEQ ID NO: 141. Dichos oligonucleótidos pueden también estar presentes en la forma de ácidos peptidonucleicos. A continuación, se eliminan los productos amplificados no hibridados. Los productos amplificados hibridados se detectan. En este contexto, se prefiere que las marcas unidas a los productos amplificados sean identificables en cada posición de la fase sólida a la que se encuentra una secuencia de oligonucleótidos.

En aún una realización adicional del método, el estatus de metilación genómica de las posiciones de CpG puede determinarse por medio de sondas de oligonucleótidos (tal como se detalla más arriba) que hibridan con el ADN tratado con bisulfito concurrentemente con los cebadores de amplificación de PCR (en donde dichos cebadores pueden ser convencionales o específicos de la metilación).

Una realización particularmente preferida de este método es el uso de la PCR Cuantitativa en Tiempo Real basada en fluorescencia (Heid et al., Genome Res. 6: 986-994, 1.996; véase también la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.331.393) que emplea una sonda de de oligonucleótido fluorescente doblemente marcada (TaqMan™ PCR, utilizando ABI Prism 7700 Sequence Detection System, Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, California). La reacción de PCR TaqMan™ hace uso de un oligonucleótido interrogante no extensible, llamado sonda TaqMan™, que, en realizaciones preferidas, está diseñado para hibridar con una secuencia rica en CpG localizada entre los cebadores de amplificación directo e inverso. La sonda TaqMan™ comprende además un "radical informador" fluorescente y un "radical extintor" unido covalentemente a radicales conectores (p. ej., fosforamiditas) unidos a los nucleótidos del oligonucleótido TaqManTM. Para el análisis de metilación dentro de los ácidos nucleicos posterior al tratamiento con bisulfito, se requiere que la sonda sea específica de la metilación, como se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.331.393 8 incorporada aquí como referencia en su totalidad), también conocido como el ensayo MethylightTM™. Las variaciones sobre la metodología de detección TaqMan™, que también son adecuadas para su uso con la invención descrita incluyen el uso de la tecnología de doble sonda (LightCycler™) o cebadores de amplificación fluorescentes (tecnología Sunrise™). Ambas técnicas se pueden adaptar de una manera adecuada para su uso con ADN tratado con bisulfito, y por otra parte para el análisis de metilación dentro de los dinucleótidos CpG.

En una realización adicional preferida del método, la cuarta etapa del método comprende el uso de la extensión de oligonucleótidos dirigida por moldes, tal como MS-SNuPE como describen Gonzalgo y Jones, Nucleic Acids Res.25: 2529-2531, 1.997.

En otra realización adicional del método, la cuarta etapa del método comprende la secuenciación y el posterior análisis de la secuencia del producto amplificado generado en la tercera etapa del método (Sanger F., et al, Proc Natl Acad Sci USA 74: 5463-5467, 1977).

Mejor modo:

En la realización más preferida del método, los ácidos nucleicos genómicos se aíslan y se tratan de acuerdo con las tres primeras etapas del método descrito anteriormente, a saber:

1.

a) la obtención, de un sujeto, de una muestra biológica que tiene ADN genómico del sujeto;

2.

b) la extracción o aislamiento de otra forma del ADN genómico;

3.

c) el tratamiento del ADN genómico de b), o un fragmento del mismo, con uno o más reactivos para convertir las bases de citosina que están sin metilar en la posición 5 del mismo en uracilo o en otra base que es detectablemente distinta a la citosina en términos de propiedades de hibridación; y en donde

4.

d) la amplificación después del tratamiento en c) se lleva a cabo de una manera específica de metilación, es decir, mediante el uso de cebadores específicos de metilación u oligonucleótidos de bloqueo, y adicionalmente en donde

5.

e) la detección de los productos amplificados se lleva a cabo por medio de una sonda de detección en tiempo real, como se describe anteriormente.

Preferiblemente, cuando la amplificación posterior de d) se lleva a cabo por medio de cebadores específicos de metilación, como se ha descrito anteriormente, dichos cebadores específicos de metilación comprenden una secuencia que tiene una longitud de al menos 9 nucleótidos que hibrida con una secuencia de ácido nucleico tratado de acuerdo con uno de los SEQ ID NO: 15 al SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 43 al SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 134 al SEQ ID NO: 141 (y más preferiblemente uno del subgrupo de los mismos que consiste en SEQ ID NOS: 15, 16, 43, 44,17, 18, 45, 46, 27, 28, 55, 56,35 36 63 y 64) y las secuencias complementarias a estas, en donde la secuencia de bases de dichos oligómeros comprenden al menos un dinucleótido CpG. Se prefiere particularmente que la amplificación posterior de d) se lleve a cabo, adicionalmente, por medio de cebadores específicos de metilación que comprenden cada uno una secuencia que tiene una longitud de al menos 9 nucleótidos que hibrida con una secuencia de ácido nucleico tratado de acuerdo con uno de los SEQ ID NO: 37 a la SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 65 a SEQ ID NO: 70 (y más preferiblemente uno del subgrupo de los mismos que consiste en SEQ ID NOS: 15, 16, 43, 44, 17, 18, 45, 46, 27, 28, 55, 56,35 36 63 y 64) y secuencias complementarias a estas, en donde la secuencia de bases de dichos oligómeros comprenden al menos un dinucleótido CpG.

La Etapa e) del método, a saber, la detección de los productos amplificados específicos indicativos del estatus de metilación de una o más posiciones de CpG de al menos una secuencia del grupo que comprende SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133(y más preferiblemente el subgrupo de los mismos que consiste en (SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11) y preferiblemente también SEQ ID NO: 12 al SEQ ID NO: 14 se lleva a cabo por medio de métodos de detección en tiempo real como se ha descrito anteriormente.

Aspectos adicionales de la divulgació proporcionan un método para el análisis del estatus de metilación del ADN genómico according to the disclosure (SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133 y furthermore SEQ ID NO: 12 al SEQ ID NO: 14 y complementos de los mismos) sin la necesidad de conversión con bisulfito. Se conocen métodos en la técnica en donde un reactivo de enzima de restricción sensible a la metilación, o una serie de reactivos de enzimas de restricción que comprende reactivos de enzimas de restricción sensibles a la metilación que distinguen entre dinucleótidos CpG metilados y no metilados dentro de una región de destino se utilizan en la determinación de la metilación, por ejemplo, pero no limitado a DMH.

En la primera etapa de tales aspectos adicionales, la muestra de ADN genómico se aísla de fuentes tisulares o celulares. El ADN genómico se puede aislar por cualquier medio convencional en la técnica, incluyendo el uso de kits disponibles en el mercado. Brevemente, cuando el ADN de interés está encapsulado en una membrana celular la muestra biológica debe ser desorganizada y lisada mediante medios enzimáticos, químicos o mecánicos. La solución de ADN se puede aclarar a continuación de proteínas y otros contaminantes, p. ej., digestión con proteinasa K. A continuación se recupera el ADN genómico de la solución. Esto se puede llevar a cabo por medio de una variedad de métodos que incluyen precipitación salina, extracción orgánica o unión de ADN a un soporte en fase sólida. La elección del método se verá afectada por varios factores incluyendo tiempo, coste y cantidad necesaria de ADN. Todos los tipos de muestras clínicas que comprenden materia neoplásica o potencialmente neoplásica son adecuados para su uso en el presente método, se prefieren las líneas celulares, placas histológicas, biopsias, tejido incluido en parafina, fluidos corporales, deposiciones, efluentes colónicos, orina, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa, células sanguíneas aisladas, células aisladas de la sangre y combinaciones de los mismos. Los fluidos corporales son la fuente preferida de ADN; es particularmente preferido el plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa, células sanguíneas aisladas y células aisladas de la sangre.

Una vez que los ácidos nucleicos se han extraído, el ADN de doble hebra genómico se utiliza en el análisis.

En un aspecto preferido, el ADN se puede escindir antes del tratamiento con enzimas de restricción sensibles a la metilación. Tales métodos son conocidos en la técnica y pueden incluir medios físicos o enzimáticos. Se prefiere particularmente el uso de una o una pluralidad de enzimas de restricción que no sean sensibles a la metilación, y cuyos sitios de reconocimiento son ricos en AT y no comprenden dinucleótidos CG. El uso de tales enzimas permite la conservación de las islas CpG y regiones ricas en CpG en el ADN fragmentado. Las enzimas de restricción no específicas de la metilación se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en MseI, BfaI, Csp61, Tru1l, Tvu1l, Tru91, Tvu91, Mael y Xspl. Es particularmente preferido es el uso de dos o tres de tales enzimas. Es particularmente preferido el uso de una combinación de MseI, BfaI y Csp61.

El ADN fragmentado puede ser ligado a continuación oligonucleótidos adaptadores con el fin de facilitar la posterior amplificación enzimática. La ligación de oligonucleótidos a fragmentos de ADN con extremos romos y cohesivos se conoce en la técnica, y se lleva a cabo por medio de la desfosforilación de los extremos (p. ej. utilizando fosfatasa alcalina de ternera o camarón) y la posterior ligación utilizando enzimas ligasa (p. ej. ADN ligasa de T4) en presencia de dATPs. Los oligonucleótidos adaptadores tienen típicamente al menos 18 pares de bases de longitud.

En la tercera etapa el ADN (o fragmentos del mismo) se digiere a continuación con una o más enzimas de restricción sensibles a la metilación. La digestión se lleva a cabo de tal manera que la hidrólisis del ADN en el sitio de restricción es informativa del estatus de metilación de un dinucleótido CpG específico de al menos el gen PCDHGC3 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 y un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E, SND1, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1; PCDH10, DOCK10 y MRPS21. Preferiblemente, dicho grupo consiste de los genes RASSF2, TFAP2E y SND1

Se prefiere particularmente que la digestión se lleve a cabo de tal manera que la hidrólisis del ADN en el sitio de restricción es informativo del estado de metilación de al menos un dinucleótido CpG del gen Septina 9 y, adicionalmente, de al menos un dinucleótido CpG de al menos el gen PCDHGC3 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9

o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 y un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E, SND1, PCDHGC3, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21. Preferiblemente, dicho grupo consiste de los genes RASSF2, TFAP2E, SND1 y PCDHGC3.

[0249] Particularmente preferidas son las siguientes combinaciones de genes

•

Septina 9+RASSF2+TFAP2E+PCDHGC3+SND1

•

Septina 9+RASSF2+TFAP2E+PCDHGC3

•

Septina 9+TFAP2E+PCDHGC3

•

Septina 9+PCDHGC3

Preferiblemente, la enzima de restricción específica de la metilación se selecciona del grupo que consiste en Bsi E1, Hga I HinPI, Hpy99I, Ava I, Bce Al, Bsa HI, Bisl, BstUI, Bsh1236I, Accll, BstFNI, McrBC, Glal, Mvnl, Hpall (HapII), Hhal, Acil, Smal, HinP1I. HpyCH4lV, Eagl y mezclas de dos o más de las enzimas anteriores. Se prefiere una mezcla que contiene las enzimas de restricción BstUI, Hpall, HpyCH41V y HinP1I.

En la cuarta etapa, que es opcional pero un aspecto preferido, los fragmentos de restricción se amplifican. Esto se lleva a cabo preferiblemente usando una reacción en cadena de la polimerasa, y dichos productos amplificados pueden llevar marcas detectables adecuadas como se ha comentado anteriormente, a saber, marcas de fluoróforo, radionúclidos y marcadores de masa.

Es particularmente preferida la amplificación por medio de una enzima de amplificación y al menos dos cebadores que comprenden, en cada caso una secuencia contigua de al menos 16 nucleótidos de longitud que es complementaria a, o hibrida en condiciones moderadamente restrictivas o restrictivas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133 (y más preferiblemente el subgrupo de los mismos que consiste en SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11), y complementos de los mismos. Se prefiere adicionalmente la amplificación por medio de una enzima de amplificación, al menos dos cebadores que comprenden, en cada caso una secuencia contigua de al menos 16 nucleótidos de longitud que es complementaria a, o se hibrida en condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133 (y más preferiblemente el subgrupo de los mismos que consiste en SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11), y los complementos de la misma y al menos dos cebadores que comprenden, en cada caso una secuencia contigua de al menos 16 nucleótidos de longitud que es complementaria a, o hibrida en condiciones moderadamente restrictivas o restrictivas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 12 al SEQ ID NO: 14, y complementos de las mismas. Preferiblemente, dicha secuencia contigua tiene al menos 16, 20 ó 25 nucleótidos de longitud. En una realización alternativa dichos cebadores pueden ser complementarios a cualquiera de los adaptadores ligados a los fragmentos.

En la quinta etapa se detectan los productos amplificados. La detección puede ser por cualquier medio convencional en la técnica, por ejemplo, pero no limitado a, análisis de electroforesis en gel, análisis de hibridación, incorporación de etiquetas detectables en los productos de PCR, análisis de matrices de ADN, análisis MALDI o ESI. Preferiblemente, dicha detección se lleva a cabo mediante hibridación con al menos un ácido nucleico o ácido peptidonucleico que comprende en cada caso una secuencia contigua de al menos 16 nucleótidos de longitud que es complementaria a, o hibrida en condiciones moderadamente restrictivas o restrictivas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133(y más preferiblemente el subgrupo de los mismos que consiste en SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11), y los complementos de la misma. Se prefiere adicionalmente que dicha detección se lleve a cabo mediante hibridación con al menos un ácido nucleico o ácido peptidonucleico que comprende en cada caso una secuencia contigua de al menos 16 nucleótidos de longitud que es complementaria a, o hibrida en condiciones moderadamente restrictivas o restrictivas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133(y más preferiblemente el subgrupo de los mismos que consiste de SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11), y los complementos de la misma, y, adicionalmente, al menos un ácido nucleico o ácido peptidonucleico que comprende en cada caso una secuencia contigua de al menos 16 nucleótidos de longitud que es complementaria a, o hibrida en condiciones moderadamente restrictivas o restrictivas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 12 al SEQ ID NO: 14. Preferiblemente, dicha secuencia contigua tiene al menos 16, 20 ó 25 nucleótidos de longitud.

Con posterioridad a la determinación del estado de metilación o el nivel de los ácidos nucleicos genómicos la presencia

o ausencia de trastornos proliferativos celulares (muy preferiblemente carcinoma colorrectal) se deduce basándose en el estado de metilación o nivel de al menos una secuencia de dinucleótido CpG de al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133(y más preferiblemente el subgrupo de los mismos que consiste en SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11), o un promedio, o un valor que refleja un estado de metilación promedio de una pluralidad de secuencias de dinucleótidos CpG de la secuencia de al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133 (y más preferiblemente el subgrupo de los mismos que consiste de SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11) en donde la metilación se asocia con la presencia de carcinoma colorrectal. Se prefiere adicionalmente que en la determinación del estado de metilación o el nivel de los ácidos nucleicos genómicos, la presencia o ausencia de trastorno proliferativo celular (muy preferiblemente carcinoma colorrectal) se deduzca basándose en el estado de metilación o el nivel de al menos una secuencia de dinucleótido CpG del gen de Septina 9 y, además, de al menos una secuencia de dinucleótido CpG de al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 12 al SEQ ID NO: 14, o un promedio, o un valor que refleja un estado de metilación promedio de una pluralidad de secuencias de dinucleótido CpG de al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133 (y más preferiblemente el subgrupo de los mismos que consiste en SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11) en donde la metilación de cualquiera de las posiciones CpG analizadas se asocia con la presencia de carcinoma colorrectal.

Cuando dicha metilación se determina por medios cuantitativos el punto de corte para determinar dicha presencia de metilación es preferiblemente cero (es decir, cuando una muestra presenta cualquier grado de metilación se determina que tiene un estatus de metilación en la posición de CpG analizada). No obstante, se prevé que el experto en la técnica pueda desear ajustar dicho valor de corte con el fin de proporcionar un ensayo de una sensibilidad o especificidad particularmente preferidas. Por consiguiente dicho valor de corte se puede aumentar (aumentando así la especificidad), dicho valor de corte puede estar dentro de un intervalo seleccionado del grupo que consiste en 0% - 5%, 5% - 10%, 10% - 15%, 15% - 20%, 20% - 30% y 30% - 50%. Son particularmente preferidos los puntos de corte de 10%, 15%, 25%, y 30%.

En un aspecto alternativo del método en donde un panel de genes que comprenden Septina 9 o su transcrito truncado Q9HC74 y al menos un gen seleccionado del grupo que consiste enRASSF2, TFAP2E, SND1, PCDHGC3, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21 (preferiblemente dicho grupo consiste de los genes RASSF2, TFAP2E , SND1 y PCDHGC3) después de la determinación del estado de metilación de los ácidos nucleicos genómicos para la presencia o ausencia de trastornos proliferativos celulares, en particular el trastorno proliferativo de células colorrectales se deduce basándose en el estado de metilación de al menos una secuencia de dinucleótido CpG de SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133 , y al menos un secuencia de dinucleótido CpG del SEC ID NO: 7 o un promedio, o un valor que refleja un estado de metilación promedio de una pluralidad de secuencias de dinucleótidos CpG de los mismos en donde la hipermetilación está asociada con cánceres, en particular cáncer colorrectal.

Ensayos de diagnóstico y pronóstico para trastornos proliferativos celulares

La presente descripción permite el diagnóstico de los eventos que son desfavorables para los pacientes o individuos en los que los parámetros genéticos y/o epigenéticos importantes dentro de al menos el gen PCDHGC3 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 y un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E, SND1, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21 pueden ser utilizados como marcadores. Dichos parámetros obtenidos por medio de la presente divulgación se pueden comparar con otro conjunto de parámetros genéticos y/o epigenéticos, sirviendo las diferencias como base para un diagnóstico y/o pronóstico de eventos que son desventajosos para los pacientes o individuos.

Más específicamente, la presente invención permite el escrutinio de las poblaciones en riesgo para la detección precoz de carcinomas colorrectales. Los trastornos proliferativos celulares colorrectales neoplásicos, más particularmente los carcinomas, presentan una menor metilación (es decir, una disminución de la expresión) dentro de al menos el gen PCDHGC3 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 y un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E , SND1, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21, en oposición a los trastornos benignos y los tejidos normales que no lo hacen.

Específicamente, la presente divulgación proporciona ensayos de diagnóstico de cáncer basados en la medición de la expresión diferencial (preferiblemente metilación) de una o más secuencias de dinucleótidos CpG de al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133 que comprende semejante secuencia de dinucleótido CpG. Típicamente, tales ensayos implican la obtención de una muestra de un sujeto, la realización de un ensayo para medir la expresión of at least least el gen PCDHGC3 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 y un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E, SND1, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10, y MRPS21, preferiblemente mediante la determinación del estatus de metilación de la secuencia de acuerdo con el SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133, derivada de la muestra, en relación con una muestra de control o un patrón conocido y la realización de un diagnóstico basado en el mismo. Preferiblemente, dicho gen es RASSF2, TFAP2E y SND1

Son particularmente preferidas las siguientes combinaciones de genes:

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Septina 9+RASSF2+TFAP2E+PCDHGC3+SND1

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Septina 9+RASSF2+TFAP2E+PCDHGC3

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Septina 9+TFAP2E+PCDHGC3

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Septina 9+PCDHGC3

En aspectos particulares preferidos, los oligómeros se utilizan para evaluar el estatus de metilación de dinucleótidos CpG, tales como los basados en los SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO:15 al SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 43 al SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 134 al SEQ ID NO: 141, o matrices de los mismos, así como kits basados en ellos y útiles para el diagnóstico de trastornos proliferativos celulares, muy preferiblemente carcinoma colorrectal.

Kits

Por otra parte, un aspecto adicional de la presente descripción es un kit que comprende: un medio para determinar la metilación de al menos el gen PCDHGC3 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 y un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E , SND1, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21. Preferiblemente dicho grupo consiste de los genes RASSF2, TFAP2E y SND1..

Los medios para determinar la metilación comprenden preferiblemente un reactivo que contiene bisulfito; uno o una pluralidad de oligonucleótidos que consisten en secuencias que en cada caso son idénticas, son complementarias, o hibridan en condiciones restrictivas o altamente restrictivas con un segmento largo de al menos 9 o más preferiblemente 18 bases de longitud de una secuencia seleccionada entre los SEQ ID NO: 15 al SEQ ID NO: 36 y (SEQ ID NO: 43 al SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 134 al SEQ ID NO: 141 (y más preferiblemente el subgrupo de los mismos que consiste en SEQ ID NOS: 15, 16, 43, 44, 17, 18, 45, 46, 27, 28, 55, 56, 35 36 63 y 64); y opcionalmente instrucciones para llevar a cabo y evaluar el método descrito del análisis de metilación. En una realización, la secuencia de bases de dichos oligonucleótidos comprende al menos un kit de dinucleótidos CpG, CpA o TpG. En una realización adicional dicho kit puede comprender adicionalmente uno o una pluralidad de oligonucleótidos que consisten en secuencias que en cada caso son idénticas, son complementarias, o hibridan en condiciones restrictivas o altamente restrictivas con un segmento de al menos 9 y más preferiblemente 18 bases de longitud de una secuencia seleccionada entre los SEQ ID NO: 37 al SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 65 al SEQ ID NO: 70 (y más preferiblemente el subgrupo de los mismos que consiste en SEQ ID NOS: 15, 16, 43, 44, 17, 18, 45, 46, 27, 28, 55, 56, 35 36 63 y 64).

En un aspecto adicional, dicho kit puede comprender adicionalmente reactivos convencionales para la realización de un análisis de metilación específico de la posición CpG, en donde dicho análisis comprende una o más de las siguientes técnicas: MS-SNuPE, MSP, MethyLight™, HeavyMethyl, COBRA, y secuenciación de ácidos nucleicos. Sin embargo, un kit a lo largo de las líneas de la presente invención, puede contener también sólo una parte de los componentes antes mencionados.

En un aspecto preferido, el kit puede comprender reactivos de conversión de bisulfito adicionales seleccionados del grupo que consiste en: tampón de desnaturalización de ADN; tampón de sulfonación; reactivos o kits de recuperación de ADN (p. ej. precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad); tampón de desulfonación; y componentes de recuperación de ADN.

En un aspecto alternativo adicional, el kit puede contener, empaquetados en recipientes separados, una polimerasa y un tampón de reacción optimizado para la extensión de los cebadores mediada por la polimerasa, tal como la PCR. En otro aspecto el kit comprende además medios para obtener una muestra biológica del paciente. Se prefiere un kit, que comprende adicionalmente un recipiente adecuado para contener los medios para determinar la metilación de al menos el gen PCDHGC3 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 o el gen PCDHGC3 y el gen Septina 9 y un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E, SND1,, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L, PCDH10, DOCK10, y MRPS21 en la muestra biológica del paciente, y muy preferiblemente comprende adicionalmente instrucciones para el uso y la interpretación de los resultados del kit. En un aspecto preferrido, el kit comprende: (a) un reactivo de bisulfito; (b) un recipiente adecuado para contener dicho reactivo de bisulfito y la muestra biológica del paciente; (c) al menos un conjunto de oligonucleótidos cebadores que contienen dos oligonucleótidos cuyas secuencias en cada caso son idénticas, son complementarias, o hibridan en condiciones restrictivas o altamente restrictivas con un segmento de al menos 9 o más preferiblemente 18 bases de longitud de una secuencia seleccionada entre los SEQ ID NO: 15 al SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 43 al SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 134 al SEQ ID NO: 141 (y más preferiblemente el subgrupo de los mismos que consiste en SEQ ID NOS: 15,16, 43, 44,17,18, 45, 46, 27, 28, 55, 56, 35 36 63 y 64); y opcionalmente (d) instrucciones para el uso e interpretación de los resultados del kit. En un aspecto preferido alternativa, el kit comprende:

(a) un reactivo de bisulfito; (b) un recipiente adecuado para contener el dicho reactivo de bisulfito y la muestra biológica del paciente; (c) al menos un oligonucleótido y/u oligómero de PNA que tiene una longitud de al menos 9 ó 16 nucleótidos que es idéntico o hibrida con una secuencia de ácido nucleico pre-tratado de acuerdo con uno de los SEQ ID NO: 15 al SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 43 al SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 134 al SEQ ID NO: 141 (y más preferiblemente de acuerdo con uno del subgrupo del mismo que consiste en SEQ ID NOS: 15, 16, 43,44,17,18, 45, 46, 27, 28, 55, 56, 35 36 63 y 64) y las secuencias complementarias a estos; y opcionalmente (d) las instrucciones para el uso y la interpretación de los resultados del kit.

En un aspecto alternativo, el kit comprende: (a) un reactivo de bisulfito; (b) un recipiente adecuado para contener dicho reactivo de bisulfito y la muestra biológica del paciente; (c) al menos un conjunto de oligonucleótidos cebadores que contienen dos oligonucleótidos cuyas secuencias en cada caso son idénticas, son complementarias, o hibridan en condiciones restrictivas o altamente restrictivas con un segmento de al menos 9 y más preferiblemente 18 bases de longitud de una secuencia seleccionada entre los SEQ ID NO: 15 al SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 43 al SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 134 al SEQ ID NO:141 (y más preferiblemente seleccionado del subgrupo del mismo que consiste en SEQ ID NOS: 15, 16, 43, 44, 17, 18, 45, 46, 27, 28, 55, 56,35 36 63 y 64); (d) al menos un oligonucleótido y/u oligómero de PNA que tiene una longitud de al menos 9 ó 16 nucleótidos que es idéntico o hibrida con una secuencia de ácido nucleico pre-tratado de acuerdo con uno de los SEQ ID NO: 15 al SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 43 al SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 134 al SEQ ID NO: 141 (y más preferiblemente seleccionado del subgrupo del mismo que consiste en SEQ ID NOS: 15, 16, 43, 44, 17, 18, 45, 46, 27, 28, 55, 56,35 36 63 y 64) y secuencias complementarias a estos; y opcionalmente (e) instrucciones para el uso y la interpretación de los resultados del kit.

Dichos kits pueden comprender adicionalmente al menos un conjunto de oligonucleótidos cebadores que contienen dos oligonucleótidos cuyas secuencias en cada caso son idénticas, son complementarias, o hibridan en condiciones restrictivas o altamente restrictivas con un segmento de 9 o más, preferiblemente 18 bases de longitud de una secuencia seleccionada entre los SEC ID NO: 37 a SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 65 a SEQ ID NO: 70.

El kit también puede contener otros componentes tales como tampones o soluciones convenientes para bloquear, lavar

o recubrir, empaquetadas en un recipiente separado.

Los reactivos típicos (p. ej., como los que se podrían encontrar en un kit basado en COBRA™ típico) para el análisis COBRATM pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR para al menos el gen PCDHGC3 o el gen PCDHGC3 y Septina 9 el gen PCDHGC3 y Septina 9 y un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E , SND1, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21; la enzima de restricción para el gen de RASSF2 y un tampón apropiado; oligo de hibridación con el gen; oligo de hibridación de control; kit de marcaje con quinasa para la sonda oligo; y nucleótidos marcados. Los reactivos típicos (p. ej. como los que se podrían encontrar en un kit basado en MethyLight TM típico) para el análisis MethyLight™ pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR para la secuencia convertida con bisulfito de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E , SND1, PCDHGC3, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21; sondas específicas de bisulfito (p. ej. TaqMan TM o Lightcycler™); tampones de PCR y desoxinucleótidos optimizados; y polimerasa Taq.

Los reactivos típicos (p. ej, como los que se podrían encontrar en un kit basado en Ms-SNuPE™ típico) para el análisis Ms-SNuPE™ pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR para el gen específico (o secuencia de ADN tratado con bisulfito o isla CpG ); tampones de PCR y desoxinucleótidos optimizados; kit de extracción en gel; cebadores de control positivo; cebadores de Ms-SNuPE™ para la secuencia convertida con bisulfito de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E , SND1, PCDHGC3, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21; tampón de reacción (para la reacción Ms-SNuPE); y nucleótidos marcados.

Los reactivos típicos (p. ej. como los que podrían encontrarse en un kit basado en MSP típico) para el análisis de MSP pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR metilados y no metilados para la secuencia convertida con bisulfito o una secuencia genómica seleccionada del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E, SND1, PCDHGC3, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 MRPS21 y Septina 9, tampones de PCR y desoxinucleótidos optimizados, y sondas específicas.

Por otra parte, un aspecto adicional de la presente descripción es un kit alternativo que comprende un medio para determinar la metilación de al menos el gen PCDHGC3 o el gen PCDHGC3 y Septina 9 el gen PCDHGC3 y Septina 9 y un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E , SND1, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21 ,en donde dichos medios comprenden preferiblemente al menos una enzima de restricción específica de metilación; uno o una pluralidad de oligonucleótidos cebadores (preferiblemente uno o una pluralidad de pares de cebadores) adecuados para la amplificación de una secuencia que comprende al menos un dinucleótido CpG de una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133(y más preferiblemente seleccionado del subgrupo del mismo que consiste en SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11); y opcionalmente instrucciones para llevar a cabo y evaluar el método de análisis de la metilación descrito. En una realización, la secuencia de bases de dichos oligonucleótidos son idénticas, son complementarias, o hibridan en condiciones restrictivas o altamente restrictivas con un segmento de al menos 18 bases de longitud de una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133 (y más preferiblemente seleccionado del subgrupo del mismo que consiste en SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11). Preferiblemente, dicho kit comprende adicionalmente uno o una pluralidad de oligonucleótidos cebadores (preferiblemente uno o una pluralidad de pares de cebadores) adecuados para la amplificación de una secuencia que comprende al menos un dinucleótido CpG de una secuencia seleccionada entre los SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 14.

En un aspecto adicional dicho kit puede comprender uno o una pluralidad de sondas de oligonucleótidos para el análisis de los fragmentos digeridos, preferiblemente dichos oligonucleótidos son idénticos, son complementarios, o hibridan en condiciones restrictivas o altamente restrictivas con un segmento de al menos 16 bases de longitud de una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133 (y más preferiblemente seleccionado del subgrupo del mismo que consiste en SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11). En una realización adicional, dicho kit puede comprender además uno o una pluralidad de sondas de oligonucleótidos para el análisis de los fragmentos digeridos, preferiblemente dichos oligonucleótidos son idénticos, son complementarios, o hibridan en condiciones restrictivas o altamente restrictivas con un segmento de al menos 16 bases de longitud de una secuencia seleccionada entre los SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 14.

En un aspecto preferido, el kit puede comprender reactivos adicionales seleccionados del grupo que consiste en: tampón (p. ej. tampones para enzimas de restricción, para PCR, de almacenamiento o de lavado); reactivos o kits de recuperación de ADN (p. ej. precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad) y componentes de recuperación de ADN.

En un aspecto alternativo adicional, el kit puede contener, empaquetados en recipientes separados, una polimerasa y un tampón de reacción optimizado para la extensión del cebador mediada por la polimerasa, tales como PCR. En otro aspecto de la divulgación, el kit comprende adicionalmente medios para obtener una muestra biológica del paciente. En una realización preferida, el kit comprende: (a) un reactivo de enzima de restricción sensible a la metilación; (b) un recipiente adecuado para contener dicho reactivo y la muestra biológica del paciente; (c) al menos un conjunto de oligonucleótidos, uno o una pluralidad de ácidos nucleicos o ácidos peptidonucleicos que son idénticos, son complementarios, o hibridan en condiciones restrictivas o altamente restrictivas con un segmento de al menos 9 bases de longitud de una secuencia seleccionada de SEQ ID NO:1 al SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133 (y más preferiblemente seleccionado del subgrupo del mismo que consiste en SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO:11); y opcionalmente (d) instrucciones para el uso y la interpretación de los resultados del kit. En una realización, dicho kit comprende (e) al menos un conjunto de oligonucleótidos, uno o una pluralidad de ácidos nucleicos

o ácidos peptidonucleicos que son idénticos, son complementarios, o hibridan en condiciones restrictivas o altamente restrictivas con un segmento de al menos 9 bases de longitud de una secuencia seleccionada entre los SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 14.

En un aspecto preferido alternativo, el kit comprende: (a) un reactivo de enzima de restricción sensible a la metilación;

(b)

un recipiente adecuado para contener dicho reactivo y la muestra biológica del paciente; (c) al menos un conjunto de oligonucleótidos cebadores adecuados para la amplificación de una secuencia que comprende al menos un dinucleótido CpG de una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO:132 al SEQ ID NO:133 (y más preferiblemente seleccionado del subgrupo del mismo que consiste en SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11); y opcionalmente (d) instrucciones para el uso e interpretación de los resultados del kit. En un aspecto, dicho kit comprende adicionalmente (e) al menos un conjunto de oligonucleótidos cebadores adecuados para la amplificación de una secuencia que comprende al menos un dinucleótido CpG de una secuencia seleccionada entre los SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 14.

En un aspecto alternativo, el kit comprende: (a) un reactivo de enzima de restricción sensible a la metilación; (b) un recipiente adecuado para contener dicho reactivo y la muestra biológica del paciente; (c) al menos un conjunto de oligonucleótidos cebadores adecuados para la amplificación de una secuencia que comprende al menos un dinucleótido CpG de una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133 (y más preferiblemente seleccionado del subgrupo del mismo que consiste en SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11); (d) al menos un conjunto de oligonucleótidos, uno o una pluralidad de ácidos nucleicos o ácidos peptidonucleicos que son idénticos, son complementarios, o hibridan en condiciones restrictivas o altamente restrictivas con un segmento de al menos 9 base de longitud de una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133 (y más preferiblemente seleccionado del subgrupo del mismo que consiste en SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11) y opcionalmente (e) instrucciones para el uso y la interpretación de los resultados del kit. En una realización, dicho kit comprende adicionalmente (f) al menos un conjunto de oligonucleótidos cebadores adecuados para la amplificación de una secuencia que comprende al menos un dinucleótido CpG de una secuencia seleccionada entre los SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 14.

El kit también puede contener otros componentes tales como tampones o soluciones adecuados para bloquear, lavar o recubrir, envasados en un recipiente separado.

La descripción se refiere adicionalmente a un kit para su uso para proporcionar un diagnóstico de la presencia de un trastorno proliferativo celular en un sujeto por medio de análisis de enzima de restricción sensible a la metilación. Dicho kit comprende un recipiente y un componente de micromatriz de ADN. Siendo dicho componente de micromatriz de ADN una superficie sobre la cual se inmoviliza una pluralidad de oligonucleótidos en las posiciones designadas y en donde el oligonucleótido comprende al menos un sitio de metilación CpG. Al menos uno de dichos oligonucleótidos es específico para al menos el gen PCDHGC3 o el gen PCDHGC3 y Septina 9 o el gen PCDHGC3 y Septina 9 y un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E, SND1, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21 y comprende una secuencia de al menos 15 pares de bases de longitud, pero no más de 200 pb de una secuencia de acuerdo con uno de SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133 (y más preferiblemente seleccionado del subgrupo del mismo que consiste en SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11). Preferiblemente dicha secuencia tiene al menos 15 pares de bases de longitud pero no más de 80 pb, de una secuencia de acuerdo con uno de SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133 (y más preferiblemente seleccionado del subgrupo del mismo que consiste en SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11). Se prefiere adicionalmente que dicha secuencia tenga al menos 20 pares de bases de longitud, pero no más de 30 pb, de una secuencia de acuerdo con uno de SEQ ID NO: 1 al SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 132 al SEQ ID NO: 133 (y más preferiblemente seleccionado del subgrupo del mismo que consiste en SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11). En una rfealización preferida, dicho kit puede comprender adicionalmente una secuencia de al menos 15 pares de bases de longitud, pero no más de 200 pb de una secuencia de acuerdo con uno de los SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 14. Preferiblemente, dicha secuencia tiene al menos 15 pares de bases de longitud, pero no más de 80 pb de una secuencia de acuerdo con uno de los SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO:

14. Se prefiere además que dicha secuencia tenga al menos 20 pares de bases de longitud, pero no más de 30 pb de una secuencia de acuerdo con uno de los SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 14.

Dicho kit de prueba comprende adicionalmente preferiblemente un componente de una enzima de restricción que comprende una o una pluralidad de enzimas de restricción sensibles a la metilación.

En un aspecto adicional, dicho kit de prueba se caracteriza adicionalmente porque comprende al menos una enzima de restricción específica de metilación, y en donde los oligonucleótidos comprenden un sitio de restricción de dichas al menos una enzima de restricción específicas de metilación.

El kit puede comprender adicionalmente uno o varios de los siguientes componentes, que son conocidos en la técnica para el enriquecimiento de ADN: un componente de proteína, uniéndose dicha proteína selectivamente a ADN metilado; un componente de ácido nucleico formador de tríplex, uno o una pluralidad de conectores, opcionalmente en una solución adecuada; sustancias o soluciones para la realización de una ligación p. ej. ligasas, tampones; sustancias o soluciones para la realización de una cromatografía en columna; sustancias o soluciones para la realización de un enriquecimiento basado en inmunología (p. ej. inmunoprecipitación); sustancias o soluciones para la realización de una

amplificación de ácido nucleico p. ej. PCR; un colorante o varios colorantes, si son aplicables con un reactivo de acoplamiento, si son aplicables en solución; sustancias o soluciones para la realización de una hibridación; y/o sustancias o soluciones para la realización de una etapa de lavado.

La divulgación proporciona además una composición de materia útil para la detección de trastornos proliferativos de células de colon. Dicha composición comprende al menos un ácido nucleico de 18 pares de bases de longitud de un segmento de la secuencia de ácido nucleico descrita en los SEQ ID NO: 15 al SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 43 al SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO:134 al SEQ ID NO:141 (y más preferiblemente seleccionado del subgrupo del mismo que consiste en SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11), y una o más sustancias tomadas del grupo que comprende: Cloruro de magnesio 1-5 mM, 100-500 dNTP µM, 0,5-5 unidades de polimerasa Taq, albúmina de suero bovino, un oligómero, en particular, un oligonucleótido u oligómero de ácido peptidonucleico (PNA), comprendiendo dicho oligómero en cada caso al menos una secuencia de bases que tiene una longitud de al menos 9 nucleótidos que es complementaria a, o hibrida en condiciones moderadamente restrictivas o restrictivas con un ADN genómico pretratado de acuerdo con uno de los SEQ ID NO: 15 al SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 43 al SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO:134 al SEQ ID NO:141 (y más preferiblemente seleccionado del subgrupo del mismo que consiste en SEQ ID NO:1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11) y secuencias complementarias a estos. En un aspecto de la descripción dicha composición comprende adicionalmente un oligómero, en particular, un oligonucleótido o un oligómero de ácido peptidonucleico (PNA), comprendiendo dicho oligómero en cada caso al menos una secuencia de bases que tiene una longitud de al menos 9 nucleótidos que es complementaria a, o hibrida en condiciones moderadamente restrictivas o restrictivas con un ADN genómico pretratado de acuerdo con uno de los SEQ ID NO: 37 a SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 65 a SEQ ID NO: 70 y secuencias complementarias a estos. Se prefiere que dicha composición de materia comprenda una solución tampón apropiada para la estabilización de dicho ácido nucleico en una solución acuosa y que permita reacciones basadas en polimerasa dentro de dicha solución. Los tampones adecuados son conocidos en la técnica y se encuentran disponibles en el mercado.

En realizaciones preferidas adicionales de la divulgación, dicho al menos un oligómero tiene al menos 50, 100, 150, 200, 250 ó 500 pares de bases de longitud de un segmento de la secuencia de ácido nucleico descrita en los SEQ ID NO: 15 al SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 43 al SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 134 al SEQ ID NO: 141, o SEQ ID NO: 37 al SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 65 al SEQ ID NO: 70.

Aunque la presente invención ha sido descrita con especificidad de acuerdo con algunas de sus realizaciones preferidas, los siguientes ejemplos sirven solamente para ilustrar la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1

En el siguiente ejemplo se diseñó una variedad de ensayos adecuados para el análisis de metilación de los genes y las secuencias genómicas de acuerdo con las tablas 1 y 2, con el fin de validar los adecuados de dichos marcadores para la detección del carcinoma colorrectal. Además, se evaluó el funcionamiento de los paneles de genes (combinaciones de una pluralidad de marcadores), tuvieron un particular interés los paneles que comprendían el gen de Septina 9 que proporciona una precisión mejorada sobre el uso de Septina 9 solamente.

Los ensayos fueron diseñados para ser ejecutados en la plataforma LightCycler (Roche Diagnostics), pero también son adecuados otros de tales aparatos comúnmente usados en la técnica. Los ensayos fueron ensayos MSP. Los productos amplificados de MSP fueron diseñados para ser detectados por medio de sondas de detección marcadas con fluorescencia Taqman Style.

Muestras

En total, se analizaron 314 muestras:

198 carcinoma colorrectal de las siguientes fases:

-

Fase 0: 4 muestras

-

Fase 1: 19 muestras

-

Fase 2: 84 muestras

-

Fase 3: 57 muestras

-

Fase 4: 20 muestras

-

Fase desconocida: 14 muestras

22 tejido normal o adyacente a normal

26 muestras de sangre completa 40 otros tipos de cáncer (hígado, mama y próstata)

28 otros tejidos normales o adyacentes a normales (hígado, mama y próstata)

Extracción de ADN y tratamiento con bisulfito

El ADN fue aislado de todas las muestras de acuerdo con un protocolo modificado basado en el descrito en Qiagen Genomic DNA Handbook (Agosto de 2001) (págs. 28-31, 44-47). El producto eluido resultante de la purificación se convirtió a continuación de acuerdo con la siguiente reacción de bisulfito.

El producto eluido se mezcló con 354 μl de solución de bisulfito (5,89 moles/l) y 146 µl de dioxano que contenía un captador de radicales (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico, 98,6 mg en 2,5 ml de dioxano). La mezcla de reacción se desnaturalizó durante 3 min a 99°C y con posterioridad se incubó en el siguiente programa de temperatura durante un total de 7 h min 50°C; un Thermospike (99,9°C) durante 3 min; 1,5 h 50°C; un Thermospike (99°C) durante 3 min; 3 h 50°C. La mezcla de reacción se purificó con posterioridad por Ultrafiltración usando una columna Millipore Microcon TM. La purificación se llevó a cabo esencialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para este propósito, la mezcla de reacción se mezcló con 300 µl de agua, se cargó en la membrana de ultrafiltración, se centrifugó durante 15 min y posteriormente se lavó con 1 x tampón TE. El DNA permanece en la membrana en este tratamiento. A continuación, se lleva a cabo la desulfonación. Para este propósito, se añadió NaOH 0,2 moles/l y se incubó durante 10 min. A continuación, se llevó a cabo una centrifugación (10 min), seguido por una etapa de lavado con 1 x tampón TE. Después de esto, el ADN se hizo eluir. Para este propósito, la membrana se mezcló durante 10 minutos con 75 µl de 1 x tampón TE templado (50°C). La membrana se volteó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Posteriormente se realizó una centrifugación repetida, con la cual se eliminó el ADN de la membrana. Se utilizaron 10 μl de producto eluido para el ensayo de PCR en tiempo real LightCycler.

Las secuencias de los componentes del ensayo de PCR y las condiciones de ciclos térmicos se proporcionan en la Tabla 3.

Ensayo de control

Ensayo de control

El diseño del ensayo GSTP1-C3 lo hace adecuado para la cuantificación de ADN de diferentes fuentes, incluyendo muestras frescas/congeladas, muestras remotas, tales como plasma o suero, y ADN obtenido a partir de especímenes de archivo tales como material incluido en parafina. Los siguientes oligonucleótidos se utilizaron en la reacción para amplificar el producto amplificado de control:

Cebador de Control 1: GGAGTGGAGGAAATTGAGAT (SEQ ID NO: 71)

Cebador de Control 2: CCACACAACAAATACTCAAAAC (SEQ ID NO: 72)

Sonda de control: FAM-TGGGTGTTTGTAATTTTTGTTTTGTGTTAGGTT-TAMRA (SEQ ID NO: 73)

Programas de ciclos (40 ciclos): 95°C, 10 min

95°C, 15 seg

58°C, 1 min

Interpretación de datos

Cálculo de la concentración de ADN.

Los Cp (valores de punto de cruce) calculados por medio del soporte lógico del aparato Lightcycler se utilizaron para determinar la concentración de ADN. La concentración de ADN se calculó mediante la referencia del valor CP de cada pocillo con una curva patrón, tanto para los ensayos de metilación como para el ensayo C3.

Porcentaje de metilación

Para cada muestra se calculó el porcentaje de metilación detectado como la concentración medida de ADN cuantificada usando los ensayos de metilación por encima de la concentración de ADN en la muestra según lo cuantificado por el ensayo C3.

La detección de la metilación fue determinada a múltiples niveles umbral diferentes, véanse las tablas), así como a todos los niveles de metilación (es decir, cualquiera de las muestras en donde se detectó metilación se consideró positiva).

La sensibilidad de cada ensayo se determinó a partir de la tasa de detección positiva de la muestra de carcinoma colorrectal, en donde la sensibilidad fue determinada como % de las muestras en donde se detectó una metilación positiva (es decir, positivos verdaderos).

La especificidad de cada ensayo se determinó a partir de la tasa de detección negativa de las muestras de sangre (es decir, tasa de detección de verdaderos negativos) en donde los falsos positivos se descontaron del número total de muestras analizadas.

Resultados

El AUC de cada marcador analizado tanto solo como en algunos casos combinado con otros marcadores se proporciona en las Tablas 4 a 6 (con la excepción de MRPS21 y DOCK10). El término 'AUC' es una abreviatura para el área bajo una curva. En particular, se refiere a la zona bajo una curva Característica Operativa del Receptor (ROC). La curva ROC es una representación gráfica de la tasa de verdaderos positivos frente a la tasa de falsos positivos para los diferentes puntos de corte posibles de una prueba diagnóstica. Se muestra el compromiso entre la sensibilidad y la especificidad dependiendo del punto de corte seleccionado (cualquier aumento en la sensibilidad vendrá acompañado por una disminución en la especificidad). El área bajo una curva ROC (AUC) es una medida de la exactitud de una prueba de diagnóstico (cuanto mayor sea el área mejor, el óptimo es 1, una prueba aleatoria tendría una curva ROC reclinada en la diagonal con un área de 0,5; para una referencia: J.P. Signal Detection Theory and ROC Analysis, Academic Press, Nueva York, 1975).

La Tabla 4 proporciona una visión general de las AUC medidas de cada marcador en la detección del carcinoma colorrectal a todos los niveles de metilación, proporciona información sobre su complementariedad con Septina 9, y también su AUC de metilación en sangre completa. Es necesario determinar la metilación de un marcador en sangre completa, ya que el tipo de muestra preferido para un ensayo de escrutinio sería la sangre, en consecuencia no se prefieren los marcadores que están metilados en sangre y en cáncer.

La Tabla 5 proporciona una visión general de las AUC medidas de cada marcador en la detección del carcinoma colorrectal a valores de corte de metilación de 10%, 20% y 30%.

La Tabla 6 proporciona una visión general de las AUC medidas de paneles de marcadores que comprenden el gen de Septina 9 y otros 2 marcadores en la detección del carcinoma colorrectal a valores de corte de metilación de 0%, 10%, 20% y 30%. Los datos del panel se recopilaron determinando la proporción o el número de muestras analizadas con la metilación medida dentro de un umbral determinado, utilizando al menos un ensayo del panel.

Para MRPS21 y DOCK10 el rendimiento del ensayo se proporciona en las Figuras 27 y 28. La sensibilidad del ensayo de DOCK10 fue de 0,48 medida a una especificidad de 0,97 (el corte fue -3). La sensibilidad del ensayo de MRPS21 fue de 0,63 medida a una especificidad de 0,96 (el corte fue -1,422).

Ejemplo 2

En la siguiente investigación, se seleccionó el funcionamiento de los marcadores seleccionados del ejemplo 1, de acuerdo con la Tabla 7 para su posterior análisis por medio del ensayo HM (Heavymethy). Las regiones diana de cada gen fueron convertidas con bisulfito y amplificadas por medio de cebadores no MSP, en presencia de oligonucleótidos bloqueadores diseñados para suprimir los productos amplificados que no habían sido metilados antes del tratamiento con bisulfito. Los productos amplificados fueron detectados a continuación por medio de sondas Lightcycler (duales).

Se analizaron muestras de plasma de las siguientes clases de pacientes:

-

Carcinoma colorrectal (131 en total)

Fase 0 = 1

Fase I = 13

Fase II = 32

Fase III = 27

Fase IV = 8

Sin clasificación = 50

Colorrectal Sano (verificado por colonoscopia) = 169

Enfermedades no cancerosas (NCD) = 29

Cánceres de origen no colorrectal (NCC) = 31

En total, 360 muestras fueron analizadas.

Extracción de ADN y tratamiento con bisulfito

El ADN fue aislado de todas las muestras por medio del método de Magna Pure (Roche) de acuerdo con las

instrucciones del fabricante. El producto eluido resultante de la purificación se convirtió a continuación de acuerdo con la siguiente reacción de bisulfito.

El producto eluido se mezcló con 354 μl de solución de bisulfito (5,89 moles/l) y 146 μl de dioxano que contenía un captador de radicales (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico, 98,6 mg en 2,5 ml de dioxano). La mezcla de reacción se desnaturalizó durante 3 min a 99°C y posteriormente se incubó con el siguiente programa de temperatura durante un total de 7 h min 50°C; un Thermospike (99,9°C) durante 3 min; 1,5 h 50°C; un Thermospike (99°C) durante 3 min; 3 h 50°C. La mezcla de reacción se purificó posteriormente mediante ultrafiltración utilizando una columna Millipore Microcon™. La purificación se llevó a cabo esencialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para este propósito, la mezcla de reacción se mezcló con 300 μl de agua, se cargó en la membrana de ultrafiltración, se centrifugó durante 15 min y posteriormente se lavó con 1 x tampón TE. El ADN permanece en la membrana en este tratamiento. A continuación, se lleva a cabo la desulfonación. Para este propósito, se añadieron 0,2 moles/l de NaOH y se incubaron durante 10 min. A continuación, se llevó a cabo una centrifugación (10 min), seguido por una etapa de lavado con 1 x tampón TE. Después de esto, el ADN se hizo eluir. Para este propósito, la membrana se mezcló durante 10 minutos con 75 μl de 1 x tampón TE templado (50°C). La membrana se volteó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Posteriormente se llevó a cabo una centrifugación repetida, con lo cual el ADN se eliminó de la membrana. Se utilizaron10 μl de producto eluido para el ensayo de PCR LightCycler en tiempo real.

Soluciones de reacción y condiciones del ciclo térmico

Las secuencias componentes del ensayo de PCR se proporcionan en la Tabla 10. Cada ensayo se realizó dos veces (independientemente) en cada muestra.

Las condiciones de los ciclos térmicos fueron las siguientes:

PCDHGC3

activación:

95°C 10 minutos

50 ciclos:

95°C 10 seg (20°C/s)

56°C

30 seg (20°C/s)

60°C

3 seg (20°C/s) de detección

72°C

10 seg (20°C/s)

curva de fusión: 95°C 10 seg (20°C/s) 40°C 10 seg (20°C/s) 95°C 0 seg (0,1°C/) Continuo

refrigeración: 40°C 5 seg

Todos los otros ensayos: activación: 95°C 10 minutos 55 ciclos: 95°C 10 seg (20°C/s)

56°C 30 seg (20°C/s) de detección 72°C 10 seg (20°C/s)

curva de fusión: 95°C 10 seg (20°C/s) 40°C 10 seg (20°C/s) 95°C 0 seg (0,1°C/s) Continuo

refrigeración: 40°C 5 seg

Resultados:

Con el fin de predecir la presencia de ADN de tumor CRC en las muestras de plasma medidas los autores de la presente invención utilizaron un modelo de regresión logística. El modelo de regresión logística se construye de la siguiente manera.

En primer lugar los datos de medición para cada ensayo marcador se codifican de forma cualitativa por medio de los siguientes 3 niveles:

 Nivel 0 – ambas reacciones de PCR repetidas no mostraron amplificación

 Nivel 1 - exactamente una de las dos repeticiones de la PCR mostró una curva de amplificación

 Nivel 2 - ambas repeticiones de PCR mostraron curvas de amplificación

Si cualquiera de las dos repeticiones de PCR no se podía medir satisfactoriamente, la respectiva medición del marcador se consideraba no válida.

Los cinco marcadores de metilación de ADN diferentes fueron utilizados como factores independientes con 3 niveles en un modelo de regresión logística. Se incluyó en el modelo un factor de intercepción adicional, pero no interacciones de los factores. El modelo de regresión logística fue entrenado y los pesos óptimos para todos los niveles de los factores se determinaron mediante el uso del procedimiento de máxima verosimilitud.

Las Figuras 1 a 10 proporcionan los gráficos de metilación media log medida de los ensayos individuales. Cada figura consiste en tres gráficos, los gráficos de la parte superior y en el medio proporcionan el análisis binario y multiclase, respectivamente, el gráfico de la parte inferior proporciona una ROC en donde la sensibilidad se muestra en el eje de la Y y 1-especificidad se muestra en el eje de la X. La Tabla 8 y las Figuras 1 a 5 proporcionan una visión general de las actuaciones de marcadores en todos los grupos de la muestra. La Tabla 9 y las Figuras 6 a 10 proporcionan una visión general de las actuaciones de los marcadores en los grupos con carcinoma colorrectal y colorrectales normales.

Las Figuras 12 a 21 proporcionan los gráficos de la metilación media mayoritaria log medida (la muestra analizada solamente se contabiliza como positiva si ambas repeticiones son positivas, la media de las dos mediciones se toma como la medición de la metilación cuantitativa) de los ensayos individuales. Cada figura consiste en tres gráficos, los gráficos de la parte superior y del medio proporcionan el análisis binario y multiclase, respectivamente, el gráfico de la parte inferior proporciona una ROC en donde la sensibilidad se muestra en el eje de la Y y 1-especificidad se muestra en el eje de la X. La Tabla 12 y las Figuras 12 a 16 proporcionan una visión general de las actuaciones de los marcadores en todos los grupos de la muestra. La Tabla 13 y las Figuras 18 a 21 proporcionan una visión general de las actuaciones de los marcadores en los grupos con carcinoma colorrectal y colorrectales normales.

La Tabla 11 proporciona una visión general de las AUC y sensibilidades snd de los ensayos individuales a una especificidad de 95% (todos los valores de p fueron menores de 0,00001). En donde dichas clases son:

Todo: Normal + NCD + NCC vs. CRC fases I a IV

I-IV: normal vs. CRC fases I a IV

I-III: normal vs. CRC fases I a III

A partir de la distribución multiclase de la Figura 6 (gráfico en el medio) y la Tabla 11 se puede determinar que el gen de RASSF2 es particularmente eficaz en la detección de los carcinomas colorrectales en Fase 1 y de los carcinomas colorrectales tempranos. Por consiguiente la expresión, muy preferiblemente la metilación de CpG, de dicho gen, además de ser un marcador de diagnóstico preferido, es particularmente preferido para el escrutinio de poblaciones generales (individuos que no presentan ningún indicador o síntoma de carcinoma colorrectal) para la detección precoz de los carcinomas colorrectales.

Combinaciones de marcadores (paneles)

Para identificar el subconjunto de marcadores de metilación de ADN que predice de forma óptima la presencia de CRC los autores de la presente invención utilizaron el procedimiento de eliminación hacia atrás. En cada etapa de eliminación el marcador de metilación del ADN con los niveles más bajos de factor se retiró del modelo. Los autores de la presente invención compararon la capacidad de predicción del modelo reducido con la del modelo completo mediante el uso de la prueba de razón de verosimilitud. Para identificar el subconjunto de marcadores de metilación de ADN que predice de forma óptima la presencia de CRC los autores de la presente invención utilizaron el procedimiento de eliminación hacia atrás. En cada etapa de eliminación el marcador de la metilación del ADN con los niveles más bajos de factor se retiró del modelo. Los autores de la presente invención compararon la capacidad de predicción del modelo reducido con la del modelo completo mediante el uso de la prueba de razón de verosimilitud. La Fig. 11 muestra que (en la comparación Normal vs. CRC fases I a IV) en cada etapa de eliminación la capacidad de predicción del modelo de regresión logística se redujo significativamente. Los autores de la presente invención concluyen que todos los modelos de marcadores de metilación del ADN enumerados proporcionan un rendimiento de predicción superior en comparación con el marcador único o los respectivos paneles de marcadores más simples.

Los autores de la presente invención concluyen que los siguientes modelos de marcador de ADN proporciona un rendimiento de predicción superior en comparación con el marcador único o los respectivos paneles de marcadores más simples.

Las Figuras 22 a 26 proporcionan una visión general del rendimiento de las siguientes combinaciones de marcadores:

Septina 9 + TFAP2E + RASSF2 + PCDHGC3 + SND1 (Figura 22)

Todo

AUC 80

Sens/Espec

57/95

Todo CRC

AUC 80

Sens/Espec

58/96

CRC I-III

AUC 76

Sens/Espec

50/96

Septina 9 + TFAP2E + RASSF2 + PCDHGC3 (Figura 23)

Todo

AUC 80

Sens/Espec

53/95

Todo CRC

AUC 80

Sens/Espec

55/96

CRC I-III

AUC 77

Sens/Espec

48/96

Septina 9 + TFAP2E + RASSF2 (Figura 24)

Todo

AUC 77

Sens/Espec

48/96

Todo CRC

AUC 79

Sens/Espec

52/96

CRC I-III

AUC 75

Sens/Espec

42/96

Septina 9 + TFAP2E (Figura 25)

Todo

AUC 77

Sens/Espec

45/96

Todo CRC

AUC 79

Sens/Espec

51/96

CRC I-III

AUC 75

Sens/Espec

41/96

Septina 9 + RASSF2 (Figura 26) Todo AUC 77 Sens/Espec 43/96 Todo CRC AUC 79 Sens/Espec 56/95 CRC I-III AUC 74 Sens/Espec 46/95

En cada caso, el gráfico superior presenta todas las muestras (Normales, Enfermedades no colorrectal, Cánceres no colorrectal y todas las fases CRC), el gráfico inferior muestra sólo las muestras Normales y con CRC.

Tabla 1: Secuencias de acuerdo con la presente invención.

SEQ ID NO: Genómico

Gen Secuencia convertida con bisulfito metilada (efectora) Secuencia convertida con bisulfito metilada (antisentido) Secuencia convertida con bisulfito no metilada (efectora) Secuencia convertida con bisulfito no metilada (antisentido)

1

SND1 15 16 43 44

2

PCDHGC3 17 18 45 46

3

EDNRB 19 20 47 48

4

STOM 21 22 49 50

5

GLI3 23 24 51 52

6

RXFP3 25 26 53 54

7

RASSF2 27 28 55 56

8

Q8N2B6 29 3C 57 58

9

PCDH10 31 32 59 60

10

LimK1 33 34 61 62

11

TFAP2E 35 36 63 64

12

Septina 9 37 38 65 66

13

Isla CpG Septina 9 39 40 67 68

14

Isla CpG Septina 9 41 42 69 70

132

MRPS21 134 135 138 139

133

DOCK10 136 137 140 141

Tabla 2: Genes de acuerdo con la presente invención

SEQ ID NO: Genómico

Gen Abreviatura Localización cromosómica* Localización cóntigo*

1

Proteína 1 que contiene el domino de estafilococos nucleasa (co-activador p100) (coactivador de 100 kDa) (coactivador p100 EBNA2 SND1 7 127530240 a 127532750 (+) AC008039.1.1.197346 141230 a 143740 (+)

2

Precursor de Protocadherina gamma C5 (PCDH-gamma-C5) PCDHGC3 5 140835658 a 140837940 (+) AC008781.7.1.205516 172908 a 175190 (-)

3

precursor del receptor B de la endotelina EDNRB 13 77390505 a 77392740 (+) AL139002.18.1.183337 92863 a 95098 (+)

4

Proteína integral de membrane de banda de eritrocitos 7 (Estomatina) (Proteína 7.2b) STOM 9 123171727 a 123172921 (+) x

5

Proteína de dedo de Zinc GLI3 GLI3 7 42234131 a 42234437 (+) AC005158.3.1.266344 110482 a 110788(+)

6

Receptor 1 de relaxina RXFP3 5 -33970963 a 33973309 (+) AC139777.3.1.169254 141119 a 143465 (+)

7

Familia 2 del dominio de asociación de Ras 2 RASSF2 20 4750982 a 4752901 (+) AL133354.14.1.59726 44336 a 46255 (+)

8

Receptor 2 de Prokineticin (PK-R2) (1 similar al receptor 73 acoplado a la proteína G (GPR73b) (GPRg2) GPR73L1 20 5245129 a 5245935(+) AL121757.7.1.167013 166111 a 166917 (-)

9

Precursor de Protocadherin gamma C5 (PCDH-gamma-C5) PCDH10 4 134291880 a 134294130 (+) AC105383.3.1.173956 116476 a 118726 (+)

10

Quibasa 1 de dominio LIM (EC 2.7.1.37) LIMK1 7 73145461 a 73146401(+) AC005056.2.1.98188 7 a 947(-)

11

factor de transcripción AP-2 épsilon (activador potenciador de proteína e enlazamiento 2 épsilon) TFAP2E 1 35814650 a 35816448 (+) AC004865.1.1.120088 1091 a 2889 (-)

12

Septina-9 (Proteína de fusión similar a Septina MLL) (proteína de fusión similar a Septina MLL MSF-A) (Septina de OVario/Mama) (Septina de Ov/Br) (Septina D1) Septina 9 17 72789082 a 73008258 (+)** AC068594.15.1.168501 150580 a 151086 (+) a AC111170.11.1.158988 137268 a 138151 (+)**

13

Isla CpG Septina 9 Isla CpG Septina 9 17 72789082 a 72789757 (+) " AC068594.15.1.168501 150580 a 151255 (+)**

14

Isla CpG Septina 9 Isla CpG Septina 9

132

MRPS21 Dedicante de la proteína de la citoquinesis 10 (Proteína zizimin 3)

133

DOCK10 Proteína S21 ribosomal mitocondrial 28S (MRP-S21) (MDS016)

* A menos que se indique otroa cosa todas las ubicaciones se refieren a la base de datos Ensembl v39 (junio de 2006) ** Base de datos Ensembl v31.35d (8 de julio de 2005)

Tabla 3: Componentes de ensayo de acuerdo con el Ejemplo 1

Nombre gen

Cebador directo SEQ ID NO: Cebador inverso .sEa ID NO: Sonda SEQ ID NO: Condiciones de PCR

Activación

Activación Ciclos (50x)

LHFPL3

74 75 76 Grados C tiempo Grados C tiempo Grados C tiempo

PCDHGC3

77 78 79 10 min 95 15 seg 60 60 seg

EDNRB

80 81 82 95 10 min 96 15 seg 60 60 see

RASSF2

83 84 85 95 10 min 95 15 seg 60 60 see

LHFPL3

74 75 76 Grados C tiempo Grados C tiempo Grados C tiempo

STOM

86 87 88 95 10 min 95 15 seg 60 60 seg

TFAP2E

89 90 91 95 10 min 95 15 seg 60 60 seg

GLI3

92 93 94 95 10 min 95 15 seg 62 60 seg

RXFP3

95 96 97 95 10 min 95 15 seg 60 60 seg

LimK1

98 99 100 95 10 min 95 15 seg 60 60 seg

GPR73L1

101 102 103 10 min 95 15 seg 60 60 seg

PCDH10

104 105 106 95 10 min 95 15 seg 62 60 seg

MRPS21

142 143 144 95 10 min 95 15 seg 60 60 seg

DOCK10

145 146 147/148 95 10 min 95 15 seg 62 60 seg

Tabla 4: AUC de la detección de carcinoma colorrectal de acuerdo con el Ejemplo 1 con metilación por encima de 0% (genes individuales)

SND1

0.92 0.04 0.00

PCDHGC3

0.91 0.04 0.08

RASSF2

0.86 0.04 0.00

EDNRB

0.94 0.04 0.00

STOM

0.86 0.03 0.04

Septina 9

0.97 0.04 0.04

LimK1

0.83 0.07 0.00

TFAP2E

0.76 0.06 0.00

GLI3

0.71 0.04 0.00

GPR73L1

0.97 0.03 0.08

RXFP3

0.96 0.02 0.08

PCDH10

0.95 0.03 0.00

MRPS21

0.85

DOCK10

0.73

Tabla 5: AUC de detección de carcinoma colorrectal de acuerdo con el Ejemplo 1 con metilación dentro de diversos umbrales (genes individuales).

Marcador

Tasa de detección de CRC a diversos umbrales de metilación

10%

20% 30%

Septina 9

0.92 0.85 0.74

SND1

0.70 0.57 0.46

PCDHGC3

0.73 0.54 0.38

RASSF2

0.73 0.54 0.33

EDNRB

0.71 0.54 0.41

STOM

0.71 0.57 0.42

LimK1

0.91 0.85 0.73

TFAP2E

0.97 0.87 0.59

GLI3

0.80 0.64 0.44

GPR73L1

0.80 0.57 0.37

RXFP3

0.66 0.38 0.18

PCDH10

0.91 0.70 0.37

Tabla 6: AUC muestras de detección de carcinoma colorrectal de acuerdo con el Ejemplo 1 con metilación dentro de diversos umbrales (Paneles marcadores de Septina 9).

Marcadores de Septina 9+2

Tasa de detección de CRC a diversos umbrales de metilación

0%

10% 20% 30%

Septina 9

0.97 0.92 0.85 0.74

TFAP2E+LimK1

0.84 0.98 0.97 0.89

GL13+LimK1

0.88 0.97 0.95 0.88

EDNRB+SND1

0.94 0.96 0.90 0.83

PGDHGC3+RASSF2

0.93 0.96 0.92 0.83

PCDHGC3+SND1

0.94 0.96 0.92 0.84

Tabla 7: Genes y secuencias particularmente preferidas de los mismos de acuerdo con la presente invención

SEQ ID NO: Genómico

Gen Secuencia convertida con bisulfito metilada (efectora) Secuencia convertida con bisulfito metilada (antisentido) Secuencia convertida con bisulfito no metilada (efectora) Secuencia convertida con bisulfito no metilada (antisentido)

1

SND1 15 16 43 44

2

PGDHGG3 17 18 45 46

7

RASSF2 27 28 55 56

11

TFAP2E 35 36 63 64

Tabla 8: Funcionamiento del ensayo HM (Ejemplo 2) en todas las muestras de tejido

RASSF2

Septina 9 SND1 PCDHGC3 TFAP2E

AUC (intervalo de confianza del 95%)

4.72 (0.6 7, 0.77) 0.75(0.7, 0.79) 0.66(0.6, 0.71) 0.66(0.61, 0.72) 0.69 (0.63, 0.74)

Sens/Espec

0.4/0.95 0.47/0.95 0.25/0.95 0.32/0.95 0.29/0.95

Corte Sens/Espec

-3.029 -2.706 -3.089 -2.378 -2.692

P de Wilcoxon

0 0 0 0 0

CRC+Adenoma - (pos)

131 131 118 119 119

Normal+enfermedad no cancerosa (NCD)+carcinoma diferente de colorrectal (NCC)-(neg)

228 228 205 206 206

Tabla 9: Funcionamiento del ensayo HM (Ejemplo 2) en muestras de tejido de carcinoma colorrectal y de colorrectal normal.

RASSF2

Septina 9 SND1 PCDHGC3 TFAP2E

AUC (intervalo de confianza del 95%)

0.73(0.67,0.78 ) 0.76(0.7.0.8 ) 0.67(0.61,0.73 ) 0.68(0.62,0.73 ) 0.71(0.65.0.76 )

Sens/Espec

0.47/0.95 0.48/0.95 0.39/0.95 4.32/0.95 0.39/0.95

Corte Sens/Espec

-3.272 -2.858 -3.473 -2.417 -3.446

P de Wilcoxon

0 0 0 0

CRC+Adenoma (pos)

131 131 118 119 119

Normal (neg)

168 169 148 1481 148

10 Tabla 10: Cebador, bloqueador y secuencias de la sonda de acuerdo con el Ejemplo 2.

Septina 9

RASSF2 SND1 PCDHGC3 TFAP2E

Cebador directo SEQ ID NO:

107 112 117 122 127

Cebador inverso SEQ ID NO:

108 113 118 123 128

Bloqueador SEQ ID NO:

109 114 119 124 129

Sonda SEQ ID NO:

110 115 124 125 130

Sonda SEQ ID NO:

111 116 121 126 131

Tabla 11: AUC y sensibilidad (al 95% de especificidad) para ensayos individuales de marcadores de acuerdo con la clase

AUC

Sensibilidad

All

I-IV I-II All I-IV I-II

Septina 9 (Media mayoritaria)

73 73 67 49 49 37

RASSF2 (Media Log)

72 73 70 45 48 41

TFAP2E (Media Log)

68 71 67 32 38 30

SND1 (Media Log)

64 65 621 25 35 29

PCDHGC3 (Media Log)

65 66 64 30 32 29

* todos los valores de p fueron menos de 0.00001

Tabla 12: Funcionamiento del ensayo HM (Ejemplo 2) en todas las muestras de tejido.

RASSF2

RASSF2

Septina 9 SND1 PCDHGC3 TFAP2E

AUC (intervalo de confianza de 95%)

0.67(0.62,0.72 ) 0.74(0.69,0.79 ) 0.63(0.57,0.68 ) 10.65(0.6,0.7 ) 05(0.6,0.7 )

Sens/Espec

0.37(0.96) 0.51 0.28/0.95 0.34/0.95 10.34/0.9 6

Corte Sens/Espec

-4 -4 -3.45 -2.523 -4

P de Wilcoxon

0 0 0 0 0

CRC+Adenoma -(pos)

121 127 113 127 120

Normal+ enfermedad no cancerosa (NCD)+carcinoma diferente de colorrectal (NCC) - (neg)

206 220 194 224 203

Tabla 13: Funcionamiento del ensayo HM (Ejemplo 2) en muestras de tejido de carcinoma colorrectal y de colorrectal normal.

RASSF2

Septina 9 SND1 PCDHGC3 TFAP2E

AUC (intervalo de confianza de 95%)

0.67(0.61.0.73 ) 0.74(0.69,0.79 ) 0.64(0.58,0.7 ) 0 66(0.6,0.71 ) 0.66(0.6.0.72 )

Sens/Espec

0.37/0.97 0.51/0.97 0.3/0.97 0.35/0.95 0.34/0.98

Corte Sens/Espec

-4 -4 -4 -2.599 -4

P de Wilcoxon

0 0 0 0 0

CRC+Adenoma (pos)

121 121 113 127 120

Normal (neg)

154 164 146 167 154

<110> Epigenomics AG

<120> MÉTODOS Y ÁCIDOS NUCLEICOS PARA ANÁLISIS DE TRASTORNOS CELULARES PROLIFERATIVOS

<130> 536-115 EPT1

<150> US 60/832,509

<151> 2006-07-21

<150> US 60/853,097

<151> 2006-10-20

<160> 148

<210> 1

<211> 2519

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 2283

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 2 <210> 3

<211> 2236

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 3 <210> 4

<211> 2204

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 4 <210> 5

<211> 2137

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 5 <210> 6

<211> 2461

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 6 <210> 7

<211> 1920

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 7 <210> 8

<211> 2225

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 8 <210> 9

<211> 2251

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 9 <210> 10

<211> 2553

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 10 <210> 11

<211> 2001

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 11 <210> 12

<211> 219909

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 12

<210> 13

<211> 1405

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 13 <210> 14

<211> 1818

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 14 <210> 15

<211> 2519

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 15 <210> 16

<211> 2519

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 16 <210> 17

<211> 2283

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 17 <210> 18

<211> 2283

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 18 <210> 19

<211> 2236

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 19 <210> 20

<211> 2236

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 20 <210> 21

<211> 2204

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 21 <210> 22

<211> 2204

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 22 <210> 23

<211> 2137

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 23 <210> 24

<211> 2137

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 24 <210> 25

<211> 2461

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 25 <210> 26

<211> 2461

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 26 <210> 27

<211> 1920

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 27 <210> 28

<211> 1920

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 28 <210> 29

<211> 2225

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 29 <210> 30

<211> 2225

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 30 <210> 31

<211> 2251

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 31 <210> 32

<211> 2251

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 32 <210> 33

<211> 2553

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 33 <210> 34

<211> 2553

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 34 <210> 35

<211> 2001

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 35 <210> 36

<211> 2001

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 36 <210> 37

<211> 219909

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 37

<210> 38

<211> 219909

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 38

<210> 39

<211> 1405

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 39 <210> 40

<211> 1405

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 40

<210> 41

<211> 1818

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 41 <210> 42

<211> 1818

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 42 <210> 43

<211> 2519

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 43 <210> 44

<211> 2519

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 44 <210> 45

<211> 2283

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 45 <210> 46

<211> 2283

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 46 <210> 47

<211> 2236

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 47 <210> 48

<211> 2236

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 48 <210> 49

<211> 2204

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 49 <210> 50

<211> 2204

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 50 <210> 51

<211> 2137

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 51 <210> 52

<211> 2137

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 52 <210> 53

<211> 2461

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 53 <210> 54

<211> 2461

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 54 <210> 55

<211> 1920

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 55 <210> 56

<211> 1920

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 56 <210> 57

<211> 2225

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 57 <210> 58

<211> 2225

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 58 <210> 59

<211> 2251

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 59 <210> 60

<211> 2251

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 60 <210> 61

<211> 2553

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 61 <210> 62

<211> 2553

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 62 <210> 63

<211> 2001

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 63 <210> 64

<211> 2001

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 64 <210> 65

<211> 219909

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 65

<210> 66

<211> 219909

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 66

<210> 67

<211> 1405

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 67 <210> 68

<211> 1405

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 68 <210> 69

<211> 1818

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 69 <210> 70

<211> 1818

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 70

<210> 71

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 71 ggagtggagg aaattgagat 20

<210> 72

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 72 ccacacaaca aatactcaaa ac 22

<210> 73

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 73 tgggtgtttg taatttttgt tttgtgttag gtt 33

<210> 74

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 74 tttcgtttcg gtttttagcg tag 23

<210> 75

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 75 aaccaaccgc gactccg 17

<210> 76

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 76 cgatttcaac cgcgcgatcg aa 22

<210> 77

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 77 cgtggtttcg gggacg 16

<210> 78

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 78 cgtctacacg cgaaacgc 18

<210> 79

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 79 cacatcgaaa tcgtacgcgc tctcg 25

<210> 80

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 80 caccttcccg aaaaacgaa 19

<210> 81

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) <400> 81 atggtagtag agatttcgag taaacgg 27

<210> 82

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 82 cgaatccgac tctaacgaaa cgctacga 28

<210> 83

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 83 gaagtagtcg gggtcgttta cg 22

<210> 84

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 84 gcaaaatacg cgaaaaccgt 20

<210> 85

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 85 acgtcttctc tcgccccgaa cga 23

<210> 86

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 86 tcgtgtgtgt cgtttttcgg 20

<211>

87

<211>

19

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 87 attcccgacg actccgaat 19

<210> 88

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 88 caacgaaaac gaaaaaatac gactacgtct cga 33

<210> 89

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 89 tttgaagcgg ttttcgtatc 20

<210> 90

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 90 ccgaacgctt acctacaatc 20

<210> 91

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 91 ttgcggtggg cgttttcggg tt 22

<210> 92

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 92 tttgtagtcg cgtcgtcgt 19

<210> 93

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 93 ctaactaaaa cgcgccgaaa 20

<210> 94

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 94 tcgacgtaaa cttccccgcg ct 22

<210> 95

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 95 atttcggaaa gcgtttttcg 20

<210> 96

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 96 caactccgaa taaattacca acgac 25

<210> 97

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 97

ttacgataac acttacacga ccaaaacgac gaa 33

<210> 98

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 98 cgtttttcgt tttattttcg c 21

<210> 99

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 99 gacaaaaaac gccacgtc 18

<210> 100

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 100 ccgacaattc accgaatcac cg 22

<210> 101

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 101 tcgcgagttt agttattcgt tg 22

<210> 102

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 102 ccactctcga aatatacgtc ga 22

<210> 103

<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 103 cgataaacga aatctataat atacgaacgc gaaca 35

<210> 104

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 104 tagtcgtttt ggcggcg 17

<210> 105

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 105 aacgcacgac caacacga 18

<210> 106

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 106 aaaaaacacc gaacccaacg cgataataaa 30

<210> 107

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 107 gtagtagtta gtttagtatt tatttt 26

<210> 108

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 108 gatttagagt tgaatgtaaa gtaa 24

<210> 109

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 109 ttttttggag ttgaaagg 18

<210> 110

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 110 ttaggaaatg aaattggaga 20

<210> 111

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 111 aaacccaaac ctaaattaaa 20

<210> 112

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 112 cccaccaacc atcatat 17

<210> 113

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 113 ctaaaacctc aacctaac 18

<210> 114

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 114 aaattactac catctccaac tac 23

<210> 115

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 115 tataaaaaat tacttcccac atc 23

<210> 116

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 116 ggaagtgtgt ggtaaag 17

<210> 117

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 117 accatcatat caaaccccac aatcaacaca ca 32

<210> 118

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) <400> 118 cctaacatct tctctcaccc caaacaaaac a

<210> 119

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 119 caactacaac ccaacccaat ctacaaacat t 31

<210> 120

<211> 37

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 120 ccacatcaaa atcatacaca ctctcaaaca aaaaaca

<210> 121

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 121 taaagtgttg gggttttgtt tggttgtt 28

<210> 122

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 122 gttcgaaatg attttattta gttgc 25

<210> 123

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 123 aacgaaacaa ataccgtaaa cga 23

<211>

124

<211>

22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 124 ggttgggttt tttaacgttc gt 22

<210> 125

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 125 ggtttcgggg acgcgt 16

<210> 126

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 126 aaacaaacgt ccgaaaaaaa cga 23

<210> 127

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 127 cgttgatcgc ggggttc 17

<210> 128

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 128 ccgactactt ctacatttcg aacg 24

<210> 129

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 129 atcgggtcgg gttgtagttg 20

<210> 130

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 130 ttcgttcgag agcgcgt 17

<210> 131

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 131 caaacgaaac cccgacgc 18

<210> 132

<211> 4333

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 132

<210> 133

<211> 2333

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 133 <210> 134

<211> 4333

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 134

<210> 135

<211> 4333

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 135

<210> 136

<211> 2333

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 136 <210> 137

<211> 2333

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 137 <210> 138

<211> 4333

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 138

<210> 139

<211> 4333

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 139

<210> 140

<211> 2333

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 140

<210> 141

<211> 2333

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 141 <210> 142

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 142 ggtttttacg tacgttgttt ttttcg 26

<210> 143

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) <400> 143 tcactaccga aaacgaaaat tacga 25

<210> 144

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 144 atcgccaacg ccgcgcaaa 19

<210> 145

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 145 tcctctaaac gtcccgcgta 20

<210> 146

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 146 caaacgcgcc cccgatcctt 20

<210> 147

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 147 gcgaggtagc gttatcgacg 20

<210> 148

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 148 ttttttttcg tcgtttttgc g 21

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un método para la detección de cáncer colorrectal en un sujeto, que comprende determinar el nivel de expresión de al menos el gen PCDHGC3 en una muestra biológica aislada de dicho sujeto en donde la metilación y/o la expresión a la baja de CpG es indicativa de la presencia o clase de cáncer colorrectal.

2. 2.

   Un método para detectar el cáncer colorrectal en un sujeto que comprende la determinación del nivel de expresión del gen Septina 9 y al menos el gen PCDHGC3 en una muestra biológica aislada de dicho sujeto, en donde la metilación y/o la expresión a la baja de CpG es indicativa de la presencia de cáncer colorrectal.

3. 3.

   Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 en donde el nivel de expresión de 2, 3 o 4 genes seleccionados del grupo que consiste en RASSF2, TFAP2E, SND1, EDNRB, STOM, GLI3, RXFP3, LimK1, GPR73L1, PCDH10, DOCK10 y MRPS21 están determinadas.

4. 4.

   Un método de acuerdo con la reivindicación 3 en donde dicha pluralidad seleccionada de genes se selecciona del grupo que consiste en: Septina 9+RASSF2+TFAP2E+PCDHGC3+SND1; Septina 9+RASSF2+TFAP2E +PCDHGC3; Septina 9+TFAP2E+PCDHGC3; y Septina 9+PCDHGC3

5. 5.

   El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en donde dicho nivel de expresión se determina por:

   (i)

   detectar la presencia, ausencia o nivel de ARNm transcrito a partir de dicho gen;

   (ii)

   detectar la presencia, ausencia o nivel de un polipéptido codificado por dicho gen o secuencia del mismo; o

   (iii) detectar la presencia o ausencia de metilación de CpG dentro de dicho gen, en donde la presencia de metilación indica la presencia de cáncer colorrectal.
6. 6. Un método para detectar cáncer colorrectal en un sujeto, de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende poner en contacto el ADN genómico aislado de una muestra biológica obtenida de dicho sujeto con al menos un reactivo, o serie de reactivos que distinguen entre dinucleótidos CpG metilados y no metilados:

   (i)

   dentro de al menos una región diana del ADN genómico, en donde la región diana comprende, o hibrida en condiciones rigurosas con una secuencia de al menos 16 nucleótidos contiguos de al menos la secuencia de SEQ ID NO: 2;

   (ii)

   dentro de al menos dos regiones diana del ADN genómico, en donde una primera región diana comprende, o hibrida en condiciones rigurosas con una secuencia de al menos 16 nucleótidos contiguos de al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 14, respectivamente, y en donde una segunda región diana comprende, o hibrida en condiciones rigurosas con una secuencia de al menos 16 nucleótidos contiguos de al menos la secuencia de SEQ ID NO: 2,

   en donde dichos nucleótidos contiguos comprenden al menos una secuencia de dinucleótido CpG, y por medio del cual se proporciona la detección de carcinoma colorrectal, al menos en parte.
7. 7. Un método para la detección de cáncer colorrectal, de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende:

   a.

   extraer o aislar de otra forma ADN genómico a partir de una muestra biológica obtenida del sujeto;

   b.

   tratar el ADN genómico de a), o un fragmento del mismo, con uno o más reactivos, para convertir las bases de citosina que están sin metilar en su posición 5' en uracilo o en otra base que sea detectablemente distinta de la citosina en términos de propiedades de hibridación;

   c.

   poner en contacto el ADN genómico tratado, o el fragmento tratado del mismo, con una enzima de amplificación y al menos un cebador que comprende, una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos que es complementaria a,

   o hibrida en condiciones moderadamente restrictivas o restrictivas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 17, 18, 45 y 46, y complementos de las mismas, en donde el ADN genómico tratado o el fragmento del mismo es amplificado para producir al menos un producto amplificado, o no es amplificado; y

   d.

   determinar, basándose en la presencia o ausencia de, o en una propiedad de dicho producto amplificado, el estado o el nivel de metilación de al menos un dinucleótido CpG de la secuencia del SEC ID NO: 2, o un promedio, o un valor que refleja un estado o nivel de metilación promedio de una pluralidad de dinucleótidos CpG de la secuencia del SEC ID NO: 2, por medio del cual se proporciona la detección del carcinoma colorrectal, al menos en parte.

8. 8.

   El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la muestra biológica obtenida del sujeto se selecciona del grupo que comprende líneas celulares, cortes histológicos, biopsias, tejido incluido en parafina, fluidos corporales, deposiciones, efluente colónico, orina, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa, células sanguíneas aisladas, células aisladas de la sangre y combinaciones de los mismos.

9. 9.

   El método de la reivindicación 7,

   (i)

   que comprende adicionalmente en la etapa d) el uso de al menos una molécula de ácido nucleico o una molécula de ácido peptidonucleico que comprende en cada caso una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos de longitud que es complementaria a, o hibrida en condiciones moderadamente restrictivas o restrictivas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 15, 16, SEQ ID NO: 19 a SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 43, 44, SEQ ID NO: 47 a SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 134 a SEQ ID NO: 141, y complementos de los mismos, en donde dicha molécula de ácido nucleico o molécula de ácido peptidonucleico suprime la amplificación del ácido nucleico al que se hibrida,

   (ii)

   en donde la determinación en d) comprende la hibridación de al menos una molécula de ácido nucleico o una molécula de ácido peptidonucleico en cada caso que comprende una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos de longitud que es complementaria a, o hibrida en condiciones moderadamente restrictivas o restrictivas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 15, 16, SEQ ID NO: 19 a SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 43, 44, SEQ ID NO: 47 a SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 134 a SEQ ID NO: 141, y complementos de los mismos, preferiblemente en donde al menos una de tales molécula de molécula de ácido nucleico o una molécula de ácido peptidonucleico que hibrida se une a una fase sólida o que comprende además que se extiende al menos una de tales moléculas de ácido nucleico hibridado por al menos una base de nucleótidos; y/o

   (iii) en donde determinar en d), comprende la secuenciación del amplificado;

   (iv) en donde ponerse en contacto con o amplificar en c), comprende el uso de cebadores específicos de metilación.
10. 10. Un método para la detección de cáncer colorrectal, de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende

    a.

    extraer o aislar de otra forma ADN genómico a partir de una muestra biológica obtenida del sujeto;

    b.

    digerir el ADN genómico de a), o un fragmento del mismo, con una o más enzimas de restricción sensibles a la metilación;

    poner en contacto el producto digerido con la enzima de restricción de ADN de b), con una enzima de amplificación y al menos dos cebadores adecuados para la amplificación de una secuencia que comprende al menos un dinucleótido CpG de la secuencia del SEC ID NO: 2;

    c. determinar, basándose en la presencia o ausencia de un producto amplificado, el estado o el nivel de metilación de al menos un dinucleótido CpG de la secuencia del SEC ID NO: 2, por medio del cual se proporciona la detección del carcinoma colorrectal, al menos en parte.
11. 11. El uso de un ácido nucleico

    (i)

    derivado de la secuencia de ADN genómico del SEQ ID NO: 2, mediante tratamiento que es adecuado para convertir al menos una base de citosina no metilada de la secuencia de ADN genómico en uracilo u otra base que es detectablemente distinta de la citosina en términos de hibridación,

    (ii)

    que comprende al menos 16 nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN genómico tratado seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 17, 18, 45 y 46, y secuencias complementarias a estos, en donde el tratamiento es adecuado para convertir al menos una base de citosina no metilada de la secuencia de ADN genómico en uracilo u otra base que sea detectablemente diferente a la citosina en términos de hibridación; o

    (iii) que comprende al menos 50 nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 17, 18, 45 y 46, y secuencias complementarias a estos en donde la secuencia de bases del ácido nucleico comprende preferiblemente al menos una secuencia de dinucleótido CpG, TpG o CpA o

    (iv) que comprende al menos 16 nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN genómico tratado seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 17, 18, 45 y 46, y secuencias complementarias a estos, en donde el tratamiento es adecuado para convertir al menos una base de citosina no metilada de la secuencia de ADN genómico en uracilo u otra base que sea detectablemente diferente a la citosina en términos de hibridación en donde la secuencia de base del ácido nucleico comprende al menos una secuencia de dinucleótido CpG, o CpA y secuencias complementarias a estos, para diagnosticar o detectar cáncer colorrectal.
12. 12. Uso de un kit adecuado para realizar el método de acuerdo con las reivindicaciones 1-3 que comprende:

    (i)

    a) una pluralidad de oligonucleótidos o polinucleótidos capaces de hibridar en condiciones rigurosas o moderadamente rigurosas a los productos de transcripción de al menos el gen PCDHGC3; (b) un recipiente adecuado para contener los oligonucleótidos o polinucleótidos y una muestra biológica del paciente, que comprende los productos de transcripción en donde los oligonucleótidos o polinucleótidos pueden hibridar en condiciones rigurosas o moderadamente rigurosas a los productos de transcripción, (c) medios para detectar la hibridación de (b); y, opcionalmente, (d) instrucciones para uso y la interpretación de los resultados del kit;

    (ii)

    (a) un medio para detectar polipéptidos de al menos el gen PCDHGC3; (b) un recipiente adecuado para contener los dichos medios y la muestra biológica del paciente, que comprende los polipéptidos en donde los medios pueden formar complejos con los polipéptidos; (c) un medio para detectar los complejos de (b); o

    (iii) (a) un reactivo de bisulfito; (b) un recipiente adecuado para contener dicho reactivo de bisulfito y la muestra

    5 biológica del paciente; (c) al menos un conjunto de oligonucleótidos que contienen dos oligonucleótidos cuyas secuencias en cada caso son idénticas, son complementarias, o hibridan en condiciones rigurosas o altamente rigurosas a un segmento de 9 o más preferiblemente 18 bases de longitud de una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 17, 18, 45 y 46 para la detección o el diagnóstico del cáncer colorrectal.
13. 13. Un kit adecuado para realizar el método de acuerdo con la reivindicación 10 que comprende (a) un reactivo de

    10 una enzima de restricción sensible a la metilación; (b) un recipiente adecuado para contener el dicho reactivo y la muestra biológica del paciente; (c) al menos un conjunto de oligonucleótidos o uno o una pluralidad de ácidos nucleicos o ácidos peptidonucleicos que son idénticos, son complementarias, o hibridan en condiciones restrictivas o altamente restrictivas con un segmento de al menos 9 bases de longitud de la secuencia del SEC ID NO: 2; y opcionalmente (d) instrucciones para el uso e interpretación de los resultados del kit.

    15 14. El uso de un kit de acuerdo con la reivindicación 13 en el diagnóstico de cáncer colorrectal.