ES2546182T3 - Métodos y kits para análisis de metilación en trastornos proliferativos celulares colorrectales - Google Patents
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Abstract
Un método para la detección de carcinoma colorrectal en un sujeto, que comprende determinar el nivel de expresión de RASSF2 en una muestra biológica seleccionada del grupo que consiste en plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre completa, y células sanguíneas, aislada de dicho sujeto, en donde dicho nivel de expresión se determina por medio de la detección de la presencia o ausencia de metilación de CpG dentro de dicho gen, en donde la presencia de metilación indica la presencia de carcinoma colorrectal.
Description
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fases de CRC), el gráfico inferior presenta solamente muestras normales y con CRC. La sensibilidad se muestra en el eje de la Y, lametilación de ADN medida en (log 10 ng/mL) semuestra en el eje de la X.
La Figura 22 proporciona una visión general del funcionamiento de los ensayos de Septina 9+TFAP2E+RASSF2+PCDHGC3+SND1.
La Figura 23 proporciona una visión general del funcionamiento de los ensayos de Septina 9+TFAP2E+RASSF2+PCDHGC3.
La Figura 24 proporciona una visión general del funcionamiento de los ensayos de Septina 9+TFAP2E+RASSF2.
La Figura 25 proporciona una visión general del funcionamiento de los ensayos de Septina 9+TFAP2E. La Figura 26 proporciona una visión general del funcionamiento de los ensayos de Septina 9+RASSF2. Las Figuras 27 y 28 proporcionan una visión general de la metilación medida por medio del ensayo MSP de acuerdo con el Ejemplo 1. Cada figura consiste en tres gráficos, los gráficos superior e inferior de la izquierda proporcionan el ensayo binario y multi-clase respectivamente, la sensibilidad se muestra en el eje de la Y, la metilación del ADN se muestra en el eje de la X.
En cada figura, el panel de la derecha proporciona una ROC en donde la sensibilidad se muestra en el eje de la Y y 1-especificidad semuestra en el eje de la X. La Figura 27 proporciona una visión general del ensayo de MRPS21 de acuerdo con el Ejemplo 1. La Figura 28 proporciona una visión general del ensayo DOCK10 de acuerdo con el Ejemplo 1.
Compendio de la invención
La presente invención proporciona un método para detectar trastornos proliferativos de células colorrectales, según se define en las reivindicaciones. Se describe la determinación de los niveles de expresión del gen de RASSF2 en una muestra biológica aislada de dicho sujeto en donde la expresión reducida y/o la metilación de CpG son indicativas de la presencia o clase de dicho trastorno.
Los aspectos de la invención proporcionan un método para detectar trastornos proliferativos de células colorrectales en un sujeto que comprende determinar el nivel demetilación del gen de Septina 9 y RASSF2.
Varios aspectos de la presente invención proporcionan un marcador genético eficaz y único, por medio del cual el análisis de expresión de dicho marcador permite la detección de trastornos proliferativos celulares con una sensibilidad, especificidad y/o valor predictivo particularmente elevados. En el contexto del carcinoma colorrectal, los métodos de prueba de la invención tienen una utilidad particular para el escrutinio de poblaciones en riesgo. Los métodos de la invención tienen ventajas sobre los métodos de la técnica anterior (incluyendo el estándar industrial FOBT), debido a lamejor sensibilidad, especificidad y probable conformidad del paciente.
El kit dela presente invención se utiliza muy preferiblementepara detectar el carcinoma colorrectal.
La secuencia de nucleótidos de dicha región diana comprende al menos una secuencia de dinucleótidos CpG del gen de Septina 9 y RASSF2.
Preferiblemente, la sensibilidad de dicha detección es de aproximadamente 75% a aproximadamente 96%, o de aproximadamente 80% a aproximadamente 90%, o de aproximadamente 80% a aproximadamente 85%. Preferiblemente, la especificidad es de aproximadamente 75% a aproximadamente 96%, o de aproximadamente 80% a aproximadamente 90%, o de aproximadamente 80% a aproximadamente 85%. El método es novedoso puesto que no existen métodos de análisis para el cáncer mediante análisis de fluidos corporales, con una sensibilidad y una especificidad suficientemente altas para su uso en un análisis aprobado del organismo regulador y asequible comercialmente. Por ejemplo, los métodos actuales utilizados para detectar y diagnosticar el carcinoma colorrectal incluyen colonoscopia, sigmoidoscopia, y cáncer de colon con sangre oculta en las heces. En comparación con estos métodos, la invención descrita es mucho menos invasiva que la colonoscopia, y tan sensible, si no más, que la sigmoidoscopia y la FOBT. El desarrollo de un análisis de fluidos corporales representa una clara ventaja técnica sobre los métodos actuales conocidos en la técnica ya que se prevé que, al menos para el escrutinio del carcinoma colorrectal, la conformidad del paciente para una única prueba basada en un fluido corporal será mayor que paralos análisis de deposiciones por triplicado recomendado para la FOBT.
La presente invención es particularmente adecuada para la detección de trastornos proliferativos celulares cancerosos colorrectales. Los métodos de la presente invención son particularmente eficaces en la detección del cáncer colorrectal que es permitido por medio de análisis del estatus de metilación de RASSF2, y sus elementos promotores o reguladores. Adicionalmente se prefiere que la detección de los trastornos proliferativos de células colorrectales sea habilitada por medio de análisis del estatus de metilación del gen de Septina 9 combinado con RASSF2, y sus elementos promotores o reguladores.
Se describe un método para el análisis de muestras biológicas para determinar características asociadas con el desarrollo de trastornos proliferativos celulares, caracterizado el método porque el al menos un ácido nucleico, o un
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de emparejamiento de bases diferenciales, que ahora pueden ser explotadas completamente. La técnica anterior, en términos de sensibilidad, se define mediante un método que comprende incluir el ADN que se va a analizar en una matriz de agarosa, evitando de ese modo la difusión y renaturalización del ADN (el bisulfito solamente reacciona con ADN de hebra sencilla), y remplazar todas las etapas de precipitación y purificación por una diálisis rápida (Olek A, et al., Amodified and improved method for bisulfite based cytosinemethylation analysis, Nucleic Acids Res. 24:50646, 1996). De este modo es posible analizar las células individuales para determinar el estado de metilación, que ilustra la utilidad y sensibilidad del método. Una visión general de los métodos reconocidos en la técnica para detectar 5-metilcitosina es proporcionada por Rein, T., et al., Nucleic Acids Res., 26:2255, 1998.
La técnica del bisulfito, con algunas excepciones (p. ej., Zeschnigk M, et al., Eur J Hum Genet. 5:94-98, 1997), actualmente solo se utiliza en investigación. En todos los casos, se amplifican fragmentos específicos, cortos de un gen conocido después del tratamiento con bisulfito, y se secuencian completamente (Olek y Walter, Nat Genet. 1997 17:275-6, 1997), se someten a una o más reacciones de extensión (Gonzalgo y Jones, Nucleic Acids Res., 25:252931, 1997; documento WO 95/00669; Patente de los Estados Unidos Núm. 6.251.594) para analizar posiciones de citosina individuales, o se tratan por medio de digestión enzimática (Xiong y Laird, Nucleic Acids Res., 25:2532-4, 1997). La detección por medio de hibridación también se ha descrito en la técnica (Olek et al., documento WO 99/28498). Adicionalmente, se ha descrito el uso de la técnica del bisulfito para la detección de la metilación con respecto a genes individuales (Grigg y Clark, Bioessays, 16:431-6, 1994; Zeschnigk M, et al., Hum Mol Genet., 6:387-95, 1997; Feil R, et al., Nucleic Acids Res., 22:695-, 1994; Martin V, et al., Gene, 157:261-4, 1995; documentosWO 97/46705 yWO 95/15373).
La presente invención proporciona el uso de la técnica del bisulfito, combinada con uno o más ensayos de metilación, para la determinación del estatus metilación de las secuencia de dinucleótidos de CpG, como se define en las reivindicaciones.
Los dinucleótidos de CpG genómicos pueden estar metilados o no metilados (alternativamente conocidos como metilados al alza o a la baja respectivamente). No obstante los métodos de la presente invención son adecuados para el análisis de muestras biológicas de una naturaleza heterogénea p. ej., una baja concentración de células tumorales en un fondo de sangre o deposiciones. Por consiguiente, cuando se analiza el estatus de metilación de una posición de CpG dentro de semejante muestra, el experto en la técnica puede utilizar un ensayo cuantitiativo para determinar el nivel (p. ej., porcentaje, fracción, razón, proporción o grado) de metilación en una posición de CpG concreta en oposición al estado de metilación. Por consiguiente, se debe considerar que el término estatus de metilación o estado de metilación también representa un valor que refleja el grado de metilación en una posición de CpG. A menos que se establezca específicamente, se debe considerar que los términos "hipermetilado" o "metilado al alza" representan un nivel de metilación por encima de un punto de corte especificado, en donde dicho corte puede ser un valor que representa el nivel de metilación promedio o mediana para una población dada, o es preferiblemente un nivel de corte optimizado. El “corte” también es referido en la presente memoria como “umbral”. En el contexto de la presente invención se considerará que los términos “metilado”, “hiper-metilado” o “metilado al alza”, incluyen un nivel de metilación por encima del corte de metilación cero (0) % (o equivalentes del mismo) para todas las posiciones de CpG dentro y asociadas con (p. ej., las regiones promotoras o reguladoras). La determinación del estatus de metilación de las secuencias de dinucleótidos de CpG dentro del SEQ ID NO: 7 tiene utilidad tanto en el diagnóstico como en la detección de lostrastornos proliferativos celulares.
Procedimientos de ensayo de la metilación. Se conocen en la técnica varios procedimientos de ensayo de metilación, y se pueden utilizar junto con la presente invención. Estos ensayos permiten la determinación del estado de metilación de uno o una pluralidad de dinucleótidos de CpG (p. ej., islas CpG ) dentro de una secuencia de ADN. Tales ensayos implican, entre otras técnicas la secuenciación de ADN del ADN tratado con bisulfito, la PCR (para la amplificación específica de la secuencia), el análisis de transferencia Southern, y el uso de enzimas de restricción sensibles ala metilación.
Por ejemplo, la secuenciación genómica se ha simplificado para el análisis de los patrones de metilación del ADN y la distribución de la 5-metilcitosinamediante el uso detratamiento con bisulfito (Frommer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831, 1992). Adicionalmente, se utiliza la digestión con enzimas de restricción de los productos de la PCR amplificados a partir del ADN convertido con bisulfito, p. ej., el método descrito por Sadri y Hornsby (Nucl. Acids Res. 24:5058-5059, 1996), o COBRA (Análisis de Restricción con Bisulfito Combinado) COBRA. El análisis COBRATM es un ensayo de metilación cuantitativo útil para determinar los niveles de metilación de ADN en loci de genes específicos en pequeñas cantidades de ADN genómico (Xiong y Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997). En resumen, se utiliza la digestión con enzimas de restricción para revelar las diferencias de secuencias dependientes de la metilación en los productos de la PCR de ADN tratado con bisulfito de sodio. Las diferencias de secuencias dependientes de la metilación se introducen primero en el ADN genómico mediante tratamiento con bisulfito convencional de acuerdo con el procedimiento descrito por Frommer et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831, 1992). A continuación se lleva a cabo la amplificación por PCR del ADN convertido con bisulfito para las islas CpG de interés, seguido de digestión con endonucleasas de restricción, electroforesis en gel, y detección utilizando sondas de hibridación marcadas, específicas. Los niveles de metilación en la muestra de ADN original se representan por medio de las cantidades relativas del producto de PCR digerido y no digerido de una manera linealmente cuantitativa a través de un amplio espectro de niveles de metilación del ADN. Además, esta técnica se puede aplicar de manera fiable a ADN obtenido de muestras de tejido incluidas en parafina diseccionadas al
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genes constitutivos, genes cuyos niveles de expresión se espera que permanezcan relativamente constantes con independencia de las condiciones, se utiliza a menudo para normalizar los resultados, eliminando cualquier diferencia evidente causada por una transferencia desigual de ARN a la membrana o una carga desigual de ARN sobre el gel.
La primera etapa del análisis Northern es el aislamiento del ARN intacto, puro de las células o tejido de interés. Debido a que las transferencias Northern distinguen los ARN por tamaños, la integridad de la muestra influye en el grado en el que se localiza la señal en una única banda. Las muestras de ARN parcialmente degradadas darán como resultado que la señal se esparza o se distribuya sobre varias bandas con una pérdida global de sensibilidad y posiblemente una interpretación errónea de los datos. En el análisis de transferencia Northern, se pueden utilizar sondas de ADN, ARN y oligonucleótidos y estas sondas están preferiblemente marcadas (p. ej. marcas radiactivas, marcas demasa omarcas fluorescentes). El tamaño del ARN diana, no la sonda, determinará el tamaño de la banda detectada, de manera que los métodos tales como el marcaje cebado al azar, que genera sondas de longitudes variables, son adecuados para la síntesis de la sonda. La actividad específica de la sonda determinará el nivel de sensibilidad, demanera que se prefiere utilizar sondas con actividades altamente específicas.
En el ensayo de protección de ARNasa, la diana de ARN y la sonda de ARN de una longitud definida se hibridan en solución. Después de la hibridación, el ARN se digiere con ARNasas específicas para ácidos nucleicos de hebra sencilla para eliminar cualquier ARN diana y sondas de hebra sencilla no hibridados. Las ARNasas se inactivan, y el ARN se separa p. ej. mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante. La cantidad de sonda de ARN intacta es proporcional a la cantidad de ARN diana en la población de ARN. Se puede utilizar la RPA para la cuantificación relativa y absoluta de la expresión génica y también para mapear la estructura del ARN, tal como los límites intrón/exón y los sitios de inicio de la transcripción. El ensayo de protección con ARNasa es preferible al análisis de transferencia Northern ya que generalmente tiene un límite de detección más bajo.
Las sondas de ARN antisentido utilizadas en RPA se generan mediante transcripción in vitro de un molde de ADN con un punto final definido y se encuentran normalmente en el intervalo de 50-600 nucleótidos. El uso de las sondas de ARN que incluyen secuencias adicionales no homólogas al ARN diana permite distinguir el fragmento protegido de la sonda completa. Las sondas de ARN se utilizan típicamente en lugar de las sondas de ADN debido a la facilidad de generar sondas de ARN de hebra sencilla y a la reproducibilidad y fiabilidad de la digestión de los dúplex de ARN:ARN con las ARNasas (Ausubel et al. 2003), son particularmente preferidas las sondas con actividades muy específicas.
Es particularmente preferido el uso de micromatrices. El proceso de análisis con micromatrices se puede dividir en dos partes principales. Primero está la inmovilización de secuencias génicas conocidas sobre portaobjetos de vidrio u otro soporte sólido seguido de hibridación del ADNc marcado fluorescentemente (que comprende las secuencias que se van a interrogar) con los genes conocidos inmovilizados sobre el portaobjetos de vidrio (u otra fase sólida). Después de la hibridación, las matrices se escanean utilizando un escáner de micromatrices fluorescente. El análisis de la intensidad de fluorescencia relativa de los diferentes genes proporciona una medida de las diferencias en la expresión génica. Las matrices de ADN se pueden generar inmovilizando oligonucleótidos sintetizados previamente sobre portaobjetos de vidrio preparados u otras superficies sólidas. En este caso, se fabrican secuencias de genes representativos y se preparan utilizando métodos de síntesis de oligonucleótidos y de purificación convencionales. Estas secuencias de genes sintetizadas son complementarias a los transcritos de ARN de los genes de interés (en este caso el gen o la secuencia genómica de RASSF2 y Septina 9) y tienden a ser secuencias más cortas en el intervalo de 25-70 nucleótidos. Alternativamente, los oligonucleótidos inmovilizados pueden ser sintetizados químicamente in situ sobre la superficie del portaobjetos. La síntesis de oligonucleótidos in situ implica la adición consecutiva de los nucleótidos apropiados a las aplicaciones sobre la micromatriz; las aplicaciones que no reciben un nucleótido se protegen durante cada fase del proceso utilizando máscaras físicas o virtuales. Preferiblemente dichos ácidos nucleicos sintetizados son ácidos nucleicos bloqueados. En los experimentos con micromatrices de perfilado de la expresión, los moldes de ARN utilizados son representativos del perfil de transcripción de las células
o tejidos en estudio. El ARN se aísla primero de las poblaciones de células o los tejidos que se van a comparar. Cada muestra de ARN se utiliza a continuación como molde para generar ADNc marcado fluorescentemente a través de una reacción de transcripción inversa. El marcaje fluorescente del ADNc se puede completar mediante métodos de marcaje directo o de marcaje indirecto. Durante el marcaje directo, los nucleótidos modificados fluorescentemente (p. ej., Cy®3-o Cy®5-dCTP) se incorporan directamente al ADNc durante la transcripción inversa. Alternativamente, se puede lograr el marcaje indirecto incorporando nucleótidos modificados con aminoalilo durante la síntesis de ADNc y a continuación conjugando un éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) al ADNc modificado con aminoalilo después de que se complete la reacción de transcripción inversa. Alternativamente, la sonda puede no estar marcada, pero puede ser detectable por medio de unión específica con un ligando que está marcado, ya sea directamente o indirectamente. Las marcas y los métodos adecuados para el marcaje de ligandos (y sondas) se conocen en la técnica, e incluyen, por ejemplo, marcas radiactivas que se pueden incorporar por medio de métodos conocidos (p. ej., traslado de muescas o tratamiento con quinasa). Otras marcas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, biotina, grupos fluorescentes, grupos quimioluminiscentes (p. ej., dioxetanos, concretamente dioxetanos activados), enzimas, anticuerpos, y similares.
Para llevar a cabo el análisis de expresión génica diferencial, los ADNc generados a partir de diferentes muestras de ARN se marcan con Cy®3. El ADNc marcado resultante se purifica para eliminar los nucleótidos no incorporados, el
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Se describen nuevos usos para la secuencia genómica del SEQ ID NO: 7, las variantes modificadas de SEQ ID NO: 7 así como oligonucleótidos y/o oligómeros de PNA para el análisis de patrones de metilación de citosina dentro del SEQ ID NO: 7. Un objetivo de la descripción es el análisis de el estado de metilación de uno o más dinucleótidos de CpG dentro de al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 7, el SEQ ID NO: 12 al SEQ ID NO: 14 y las secuencias complementarias a estos.
Se describen ácidos nucleicos tratados, derivados de los SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 14 genómicos, en donde el tratamiento es adecuado para convertir al menos una base de citosina no metilada de la secuencia de ADN genómico en uracilo u otra base que es detectablemente diferente de la citosina en términos de hibridación. Las secuencias genómicas en cuestión pueden comprender una o más posiciones de CpG metilado consecutivas. Dicho tratamiento comprende preferiblemente el uso de un reactivo seleccionado del grupo que consiste en bisulfito, sulfito de hidrógeno, disulfito, y sus combinaciones. Se prefiere un ácido nucleico modificado de origen no natural que comprende una secuencia de al menos 16 bases de nucleótidos contiguas de longitud de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 27 al SEQ ID NO: 28 y del SEQ ID NO: 37 al SEQ ID NO: 42 y del SEQ ID NO: 55 al SEQ ID NO: 56 y del SEQ ID NO: 65 al SEQ ID NO: 70. Preferiblemente, dicho ácido nucleico tiene al menos 50, 100, 150, 200, 250 ó 500 pares de bases de longitud de un segmento de la secuencia de ácido nucleico descrita en el SEC ID NO: 27 al SEQ ID NO: 28 y del SEQ ID NO: 55 al SEQ ID NO: 56. Es particularmente preferida una molécula de ácido nucleico que no es idéntica o complementaria a toda o una porción de las secuencias del SEQ ID NO: 27 al SEQ ID NO: 28 y del SEQ ID NO: 37 al SEQ ID NO: 42 y del SEQ ID NO: 55 al SEQ ID NO: 56 y del SEQ ID NO: 65 al SEQ IDNO: 70, pero no el SEQ ID NO: 7, del SEQ ID NO: 12 al SEQ ID NO: 14 u otro ADN de origen natural. Se prefiere que dicha secuencia comprenda al menos un dinucleótido CpG, TpA o CpA y secuencias complementarias a estos. Las secuencias del SEQ ID NO: 27 al SEQ ID NO: 28 y del SEQ ID NO: 37 al SEQ ID NO: 42 y del SEQ ID NO: 55 al SEQ ID NO: 56 y del SEQ ID NO: 65 al SEQ ID NO: 70 proporcionan versiones de origen no natural modificadas del ácido nucleico de acuerdo con el SEQ ID NO: 7, del SEQ ID NO: 12 al SEQ ID NO: 14 en donde la modificación de cada secuencia genómica da como resultado la síntesis de un ácido nucleico que tiene una secuencia que es única y distinta de dicha secuencia genómica de la siguiente manera. Para cada ADN genómico de hebra efectora se describen versiones convertidas. Una primera versión en donde "C" se convierte en "T", pero "CpG" sigue siendo "CpG" (es decir, corresponde al caso en el que, para la secuencia genómica, todos los residuos "C" de las secuencias de dinucleótidos CpG están metilados y por lo tanto no son convertidos); una segunda versión describe el complemento de la secuencia de ADN genómico descrita (esto es, hebra antisentido), en donde "C" se convierte en "T", pero "CpG" sigue siendo "CpG" (esto es, corresponde al caso en el que, para todos los residuos "C" de las secuencias de dinucleótido CpG están metilados y por lo tanto no son convertidos). Las secuencias convertidas metiladas al alza del SEQ ID NO:7, SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 14 corresponden al SEQ ID NO: 27 al SEQ ID NO: 28 y al SEQ ID NO: 37 al SEQ ID NO: 42. Se proporciona una tercera versión convertida químicamente de cada secuencia genómica, en donde “C” se convierte en “T” para todos los residuos “C”, incluyendo aquellos de las secuencias de dinucleótidos "CpG" (es decir, corresponde al caso en el que, para las secuencias genómicas, todos los residuos "C" de las secuencias de dinucleótidos CpG no están metiladas); una versión químicamente convertida final de cada secuencia, describe el complemento de la secuencia de ADN genómico descrita (esto es hebra antisentido), en donde "C" se convierte en "T" para todos los residuos de "C", incluidos aquellos de las secuencia de dinucleótidos "CpG" (esto es, corresponde al caso en el que, para el complemento (hebra antisentido) de cada secuencia genómica, todos los residuos "C" de las secuencias de dinucleótidos CpG no están metilados). Las secuencias convertidas “metiladas a la baja” del SEQ ID NO: 7, el SEQ ID NO: 12 al SEQ ID NO: corresponden al SEQ ID NO: 55 al SEQ ID NO: 56 y del SEQ ID NO: 65 al SEQ ID NO: 70. Véase la Tabla 1 para más detalles. De manera significativa, hasta ahora, las secuencias de ácidos nucleicos y las moléculas de acuerdo con el SEQ ID NO: 27 al SEQ ID NO: 28 y el SEQ ID NO: 55 al SEQ ID NO: 56 no estaban implicados en o conectados conla detección de trastornos proliferativos celulares.
Se describen adicionalmente oligonucleótidos u oligómeros adecuados para su uso en los métodos para detectar el estado de metilación de la citosina en el ADN genómico o tratado (modificado químicamente), de acuerdo con el SEQ ID NO: 27 al SEQ ID NO: 28, el SEQ ID NO: 37 al SEQ ID NO: 42 y el SEQ ID NO: 55 al SEQ ID NO: 56 y el SEQ ID NO: 65 al SEQ ID NO: 70 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 12 al SEQ ID NO: 14. Dichos oligonucleótidos o ácidos nucleicos oligoméricos proporcionan nuevos medios de diagnóstico. Dicho oligonucleótido u oligómero que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene una longitud de al menos nueve (9) nucleótidos que es idéntica a, hibrida, en condiciones moderadamente restrictivas o restrictivas (como se ha definido en la presente memoria anteriormente), a una secuencia de ácido nucleico tratado de acuerdo con el SEQ ID NO: 27 al SEQ ID NO: 28, el SEQ ID NO: 37 al SEQ ID NO: 42, el SEQ ID NO: 55, el SEQ ID NO: 56, y SEQ ID NO: 65 al SEQ ID NO: 70 y/o secuencias complementarias a estas, o a una secuencia genómica de acuerdo con el SEQ ID NO: 12 al SEQ ID NO: 14 y/o secuencias complementarias a estas.
Por lo tanto, se describen moléculas de ácido nucleico (p. ej. oligonucleótidos y moléculas de ácido péptidonucleico (PNA) (oligómeros de PNA)) que hibridan en condiciones de hibridación moderadamente restrictivas y/o restrictivas con toda o una porción de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 27 al SEQ ID NO: 28, el SEQ ID NO: 37 al SEQ ID NO: 42, el SEQ ID NO: 55, el SEQ ID NO: 56, el SEQ ID NO: 65 al SEQ ID NO: 70, el SEQ ID NO: 12 al SEQ ID NO: 14 o con los complementos de las mismas. Se prefiere particularmente una molécula de ácido nucleico que hibrida en condiciones de hibridación moderadamente restrictivas y/o restrictivas con toda o una porción de las secuencias del SEQ ID NO: 27 al SEQ ID NO: 28, del SEQ ID NO: 37 al SEQ ID NO: 42, el
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Tabla 1: Secuencias utilizadas en los ejemplos
- SEQ ID NO: Genómico
- Gen Secuencia I convertida con bisulfito metilada (efectora) Secuencia I convertida con bisulfito metilada (antisentido) Secuencia I convertida con bisulfito no metilada (efectora) Secuencia I convertida con bisulfito no metilada (antisentido)
- 7
- RASSF2 27 28 55 56
- 12
- Septina 9 37 38 sesenta y cinco 66
- 13
- Septina 9 39 40 67 68
- 14
- Septina 9 41 42 69 70
Tabla 2: Genes utilizados en los ejemplos
- SEQ ID NO: Genómico
- Gen Abreviatura Localización cromosómica* Localización cóntigo*
- 7
- Familia 2 dominio asociación Ras RASSF2 20 AL 133354.14.1.5 9726 44336-46255
- 4750982 a 4752901 (+)
- 12
- Septina 9 (proteína de fusión de tipo Septina MLL) (proteína de fusión de tipo septina MLL Septina 9 17 7278908 2 a 730082 58 I (+) ** AC068594.15.1.1 68501 150580-151.086 (+) a AC111170.11.1.1 58988 137.268 a 138151 (+) **
- 13
- Isla CpG Septina 9 Isla CpG Septina 9 17 7278908 2 a AC068594.15.1.1 68501
- 14
- CpG Septina 9 Isla CpG Septina 9
Tabla 3: componentes del ensayo de acuerdo con el Ejemplo 1
- Nombre de gen
- Cebador directo SEC ID NO: Cebador inverso SEC ID NO: Sonda SEQ ID NO: Condiciones de PCR
- Activación
- Ciclos (50x
- grados C
- Tiempo grados C Tiempo grados C Tiempo
- RASSF2
- 83 84 85 95 10 min 95 15 seg 60 60 seg
38
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imagen1 imagen2
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