ES2587402T3 - Miembro productor de ácido carboxílico de la familia Pasteurellaceae - Google Patents

Miembro productor de ácido carboxílico de la familia Pasteurellaceae Download PDF

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Abstract

Una cepa bacteriana DD1 depositada en el DSMZ que tiene el número de depósito DSM 18541.

Description

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(continuación)
Compuesto Concentración [g/l]
L-cisteína (agente reductor) 0,24 MgCO3b 15 Lasalocidc 16 mg/l Monensinac 10 mg/l Anfotericina Bd 2,5 mg/l Licor de rumen (opcional)e 5 Extracto de lodo digerido (opcional)f 10 Extracto de pulpa (opcional)f 10 Bacto-Agar (solo para medio sólido) 12
a D-glucosa, D-xilosa o L-arabinosa b MgCO3 (Riedel-de Haen, número de producto: 13117 de Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH, Seelze, Alemania).c Solución madre en etanol. d Solución madre en dimetilsulfóxido e El líquido del rumen se centrifugó. El sobrenadante se esterilizó por filtración, el filtrado estéril se añadió a los ensayos de enriquecimiento con el contenido del rumen como inóculo.f Se mezclaron 10 g de lodo digerido o de pulpa con 25 ml de agua destilada y se agitó intensamente durante 15 min. Las partículas grandes se separaron usando un paño de filtro. Las suspensiones se esterilizaron por filtración, los filtrados estériles se añadieron a los ensayos de enriquecimiento respectivos.
Se autoclavaron MgCO3 y agua (0,75 g y 40 ml) en botellas de suero de 100 ml (121 °C, 20 min). El extracto de levadura, la peptona, la fuente de C, el NH4SO4 y el K2HPO4 se autoclavaron todos por separado. Para los cloruros de Ca, Mg y Na se preparó una solución madre que se autoclavó. Para asegurar que no hubiese oxígeno presente, se usaron los siguientes procedimientos convencionales:
-Los medios de cultivo se gasearon con CO2 estéril y libre de oxígeno después del autoclavado. -Se usó una caja anaerobia (Meintrup DWS Laborgeräte GmbH, Lähden-Holte, Alemania) para los experimentos que habían de realizarse en condiciones anaerobias. -La incubación de las placas de agar se produjo en frascos anaerobios. Para asegurar las condiciones anaerobias, se usó Anaerocult®A (Merck).
Las muestras de rumen y el lodo digerido se emplearon sin diluir como inóculo. Se diluyeron 50 g de pulpa sólida en 100 ml de solución de NaCl al 0,9 %, se filtró para eliminar las partículas grandes y después se usó como inóculo.
Se rellenaron botellas de100 ml (Zscheile & Klinger, Hamburgo, Alemania) con 50 ml de medio y 2 ml del inóculo respectivo, se cerraron con tapones de goma de butilo (Ochs GmbH, Bovenden/Lenglern, Alemania) y se gasearon con CO2. Se ajustó una sobrepresión de aproximadamente 80 kPa. Las botellas se incubaron en un incubador agitado (160 rpm, diámetro de agitación: 2,5 cm) a 37 °C.
Se cuantificó el consumo de glucosa, xilosa y arabinosa y la formación de ácido succínico y de subproductos mediante análisis HPLC de los sobrenadantes sin células sin diluir del caldo de cultivo usando detección IR. Se extrajeron muestras del caldo con una jeringuilla estéril a través del tapón de goma de butilo, se llevó a cabo la separación mediante filtración (0,22 μm). Se usaron una columna Aminex HPX-87 H (Biorad) de 300 x 7,8 mm de D.
I. y 5 mm de H2SO4 como fase móvil y estacionaria, respectivamente. La temperatura de la columna fue de 30 °C, el caudal fue de 0,5 ml min-1 .
1.3. Aislamiento de cultivos puros
El aislamiento de los cultivos puros de los cultivos de enriquecimiento se logró mediante siembra repetida en placas de agar.
1.4.
Ensayo de cultivos puros respecto de la producción de ácido succínico
Se ensayaron los cultivos puros en cultivo líquido respecto de la producción de AS. Se cuantificó el consumo de azúcar y la formación de AS y productos secundarios mediante HPLC. Las condiciones de cultivo y de HPLC fueron las mismas a aquellas descritas en la sección anterior "Cultivo de enriquecimiento".
2.
Resultados
2.1. Condiciones de enriquecimiento recomendadas
La siguiente tabla resume aquellas condiciones experimentales que son recomendables para el enriquecimiento de productores de ácido succínico (AS).
10
Tabla 2: Condiciones experimentales recomendadas para la producción de productores de AS.
Contenido del
Lodo digerido Pulpa
rumen
Fuente de C
L-arabinosa L-arabinosaa D-glucosa, L-arabinosa
Tampón
MgCO3 MgCO3 MgCO3
Antibióticos
lasalocid, lasalocid, anfotericina B
monensina
monensina
Tiempo de
< 16 h < 24 h < 50 h
incubación
a no se usaron glucosa y xilosa en los ensayos con lodo digerido.
Para el enriquecimiento de productores de AS del contenido del rumen, la mejor fuente de C es arabinosa (3/3 cultivos de enriquecimiento que muestran producción de AS, 0/3 con glucosa, 2/3 con xilosa). Los resultados se 5 resumen en la siguiente tabla. La adición de los antibióticos ionóforos lasalocid y monensina al medio de enriquecimiento dio como resultado una producción de AS sustancialmente mayor (1,9-5,4 frente a 0,9-1,2 g/l en 17 h) y una menor producción de ácido láctico y propiónico. Estos resultados confirman, por lo tanto, que los microorganismos productores de AS pueden de hecho favorecerse añadiendo estos compuestos al medio de enriquecimiento (Lee y col., 2002a). Los cultivos de enriquecimiento con tampón de MgCO3 mostraron una mayor
10 producción de AS que los ensayos con TRIS (1,9-5,4 frente a 1,2-1,4 g/l en 17 h). Probablemente, esto está causado por i) la mayor capacidad tamponadora del MgCO3 ii) su menor estrés osmótico debido a una menor solubilidad y iii) por la liberación de CO2 a partir del ión carbonato, que es necesario para la biosíntesis del AS.
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2.2. Mejores resultados de los experimentos de enriquecimiento En la tabla 6 a continuación se listan los mejores resultados obtenidos en cultivos de enriquecimiento respecto de
productores de AS. Tabla 6: Mejores resultados en cultivos de enriquecimiento respecto de productores de AS.
Material de muestra Rumen Lodo digerido Pulpa
Fuente de C L-arabinosa L-arabinosa L-arabinosa AS [g/l] 7,1 6,9 8,4 STY[g/(l*h)]a 0,2 0,4 0,1 Rendimiento [g/g]a 0,5 0,5 0,6
a Rendimiento espaciotemporal y rendimiento de ácido succínico.
Dicha tabla indica que con cada uno de los tres materiales de muestra es posible recibir cultivos de enriquecimiento que producen AS. Los cultivos de enriquecimiento cuyo origen es lodo digerido mostraron mayores rendimientos espaciotemporales que aquellos del rumen y pulpa (0,4 frente a 0,2 y 0,1 g[l*h]). Sin embargo, se obtuvieron aislados productores de AS exclusivamente de cultivos de enriquecimiento productores de AS con material del rumen como inóculo. Aparentemente, el aislamiento de productores de AS a partir de lodo digerido y pulpa necesita estrategias más sofisticadas.
2.3. Aislados productores de ácido succínico
Los mejores aislados (= cultivos puros) que muestran producción de AS en experimentos de cultivos puros y sus características se resumen en la tabla siguiente. Se lograron la mayor concentración de AS (8,8 g/l) y rendimiento espaciotemporal (0,6 g/[l*h]) con DD1, un aislado de rumen.
Tabla 7: Características de los mejores aislados productores de ácido succínico (AS).
Aislado
DD1 DD1a DD2
Origen Fuente de C, enr.b Fuente de C, purab
rumen L-arabinosa L-arabinosa rumen L-arabinosa D-glucosa rumen L-arabinosa L-arabinosa
AS [g/l] STY [g/(l*h)]c Rendimiento [g/g]c
8,8 0,6 0,6 7,3 0,5 0,5 3,5 0,1 0,3
subproductos [g/l]
-ácido fórmico
3,3 3,7 -
-ácido acético
4,5 4,2 2,7
-ácido láctico
- - 1,5
-etanol
- - 2,7
a El aislado DD1 se ensayó dos veces en cultivo puro, una vez con glucosa y una vez con arabinosa.
b Fuente de C, enr. = fuente de C durante el enriquecimiento, Fuente de C, pura = fuente de C durante el
experimento de cultivo puro.
c rendimiento espaciotemporal y rendimiento de ácido succínico.
3. Conclusión
El procedimiento establecido es adecuado para el enriquecimiento de productores de AS del rumen, lodo digerido y pulpa. Sin embargo, se obtuvieron aislados productores de AS exclusivamente de cultivos de enriquecimiento productores de AS con material del rumen como inóculo. El aislado más prometedor es la bacteria DD1 del rumen. Usa glucosa y arabinosa para la producción de AS. En condiciones aún no optimizadas, se producen prácticamente 9 g/l de AS a partir de 15 g/l de arabinosa. La figura 4 muestra una imagen de DD1 obtenida con un microscopio óptico.
Ejemplo 2: Preparación del banco celular de DD1
1. Preparación del medio
La composición de los medios de cultivo se describe en la tabla 8.
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Compuesto
Concentración [g/l]
Concentración de la solución madre [g/l]
MgCO3 (Riedel-de Haen 13117) 30
a Las concentraciones fueron 50 g/l de glucosa en el cultivo de siembra y de 10 g/l del glicerol respectivo en el
cultivo principal.
Se esterilizaron MgCO3 y agua (1,5 g y 40 ml) en botellas de suero de 100 ml (121 °C, 20 min). Después de enfriar, se añadieron soluciones estériles separadas de los otros compuestos. El extracto de levadura, la peptona, el sulfato de amonio y el K2HPO4 se esterilizaron todos por separado mediante filtración de la solución madre respectiva. Para los cloruros de Ca, Mg y Na se preparó una solución madre que se esterilizó por filtración. La glucosa y los diferentes gliceroles se esterilizaron todos por separado (121 °C, 20 min). Para el ensayo de referencia con glicerol puro (P1) se usó la calidad "Glicerol 99 % de pureza" (Riedel-de Haen, número de producto: 15523-1 L-R) de Honeywell Specialty Chemicals Seelze GmbH, Seelze, Alemania.
2. Cultivos y analíticas
El cultivo de siembra se cultivó en una botella de suero de 100 ml con tapón de goma de butilo hermético a gases (véase más arriba) que contenía 50 ml del medio descrito en la tabla 12 con 50 g/l de glucosa y una atmósfera de CO2 con una sobrepresion de 80 kPa. la inoculación se llevó a cabo con 1 ml del WCB (ejemplo 2). La incubación se llevó a cabo durante 15 h a 37 °C y a 170 rpm (diámetro de agitación: 2,5 cm). Al final del cultivo, la concentración de glucosa se había reducido hasta aproximadamente 17 g/l.
La suspensión celular se centrifugó (Biofuge primo R, Heraeus) a 5000 g durante 5 minutos y el sedimento celular se lavó y después se resuspendió en 50 ml del medio sin glucosa y sin MgCO3 para generar un inóculo sin glucosa.
Los cultivos principales se cultivaron en botellas de suero de 100 ml que contenían en su interior 50 ml del medio con 10 g/l del glicerol respectivo y una atmósfera de CO2 con una sobrepresión de 80 kPa. La inoculación se llevó a cabo con 2,0 ml del inóculo sin glucosa. Las botellas se incubaron durante 9 h a 37 °C, y 170 rpm (diámetro de agitación, 2,5 cm).
El consumo de la fuente de C respectiva (glucosa en el cultivo de siembra, glicerol ene l cultivo principal) y la producción de AS y subproductos se midió mediante HPLC como se ha descrito en el ejemplo 5.
3. Resultados
En la tabla 13 a continuación se resumen los resultados.

Tabla 13: Formación de AS y subproducto a partir de diferentes gliceroles por DD1.
Tipo de glicerol
C1 C2 C3 P1
Productora
ecoMotion Biopetrol Glacon Chemie Sigma-Aldrich
Pureza [%]b
90 42 76 99
tc[h]c
9 9 9 9
ΔcGI[g/l]d
-6,3 -6,9 -6,5 -5,4
ΔcSA [g/l]e
+7,6 +8,4 +7,4 +6,2
ΔcLA[g/l]e
0 +0,1 +0,1 +0,1
ΔcFA [g/l]e
+0,3 +0,3 +0,3 +0,3
ΔcAA [g/l]e STY [g/(l*h)]f
+0,3 0,8 +0,5 0,9 +0,3 0,8 +0,3 0,7
a ecoMotion GmbH, Stemberg, Alemania; Biopetrol Schwarzheide GmbH, Schwarzheide, Alemania; Glacon Chemie, Merseburg, Alemania; Riedel de Haen (número de producto: 15523-1 L-R) de Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH, Seelze, Alemania.b Análisis del productor. c tiempo de cultivo. d consumo de glicerol.e formación de ácido succínico, láctico, fórmico y acético.f rendimiento espaciotemporal y rendimiento de ácido succínico.
La tabla 13 muestra que después de 9 h, la concentración de AS y por lo tanto el STY obtenido con los gliceroles C1 a C3 en bruto (7,4 a 8,4 g AS/l y 0,8 a 0,9 AS/[l*h]) es en todos los casos mayor que los valores respectivos obtenidos con el glicerol puro P1 (6,2 g AS/L y 0,7 g AS/[l*h]). Los gliceroles en bruto tienen, por lo tanto, además de un menor precio, la ventaja de una mejor productividad. Los rendimientos obtenidos con los gliceroles en bruto C1 a
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Glucosa Extracto de levadura Bacto (Becton Dickinson) Peptona Bacto (Becton Dickinson) (NH4)2SO4 CaCl2*2H2O MgCl2*6H2O NaCl K2HPO4 L-cisteína MgCO3 (Riedel-de Haen 13117)
C3 (1,1 a 1,2 g AS/g de glicerol) son similares al valor respectivo obtenido con el glicerol puro P1 (1,1 g AS/g de glicerol).
Ejemplo 8: Tolerancia de DD1 al amoniaco y la glucosa
Una estrategia común para la producción fermentativa de ácido succínico y/o sales de amonio de ácido succínico a partir de glucosa podría ser un cultivo por lotes alimentado controlado por NH3 con un determinado nivel inicial de glucosa. Esta configuración necesita que la cepa sea tolerante tanto a NH3/NH4OH-como a la glucosa. Para probar a DD1 respecto de estas propiedades, se llevaron a cabo cultivos con NH4OH como agente de control del pH y diversos niveles de glucosa.
1. Preparación del medio
La composición del medio de cultivo se describe en la tabla 14. Tabla 14: Composición del medio para los cultivos por lotes controlados por pH con diversos niveles de glucosa.
Compuesto
Concentración [g/l]
Concentración de la solución madre [g/l]
Variantea 5
5 1 0,2 0,2 1 3 0,24 2
a La concentración inicial de glucosa en el precultivo fue de 50 g/l y en los fermentadores de 25, 50 o 75,
respectivamente.
El extracto de levadura, la peptona y el MgCO3 se autoclavaron juntos en los fermentadores y las botellas de suero. La glucosa, el sulfato de amonio y el K2HPO4 se autoclavaron todos por separado. Los cloruros de Ca, Mg y Na se autoclavaron juntos. Después de enfriar los fermentadores y las botellas de suero, se añadieron los componentes faltantes como soluciones madre estériles. Para los precultivos, se usó la misma composición del medio pero el MgCO3 se ajustó a 30 g/l.
2.
Cultivos y analíticas
Los precultivos se cultivaron en condiciones anaerobias en botes de suero de 100 ml con tapones de goma de butilo estancos al aire (Ochs GmbH, Bovenden/Lenglern, Alemania) que contenían 50 ml de medio de precultivo a 37 °C en un incubador agitado (velocidad de rotación: 160 rpm, diámetro de agitación: 2,5 cm). La inoculación de los precultivos se llevó a cabo con 1 ml de un banco celular de trabajo de DD1 en la cámara anaerobia (MAKS MG 500, meintrup-dws). Inmediatamente después de la inoculación se sustituyó la atmósfera de gas (80 % de N2, 15 % de CO2 y 5 % de H2) por CO2 puro con una sobrepresión de aproximadamente 80 kPa. Después de 16 a 18 h de incubación, se reunieron dos botellas en la caja anaerobia y en cada caso se usaron 15 ml para inocular los fermentadores (Six-fors, Infors, Suiza) que contenían 300 ml de medio de cultivo que se había gaseado durante toda la noche con CO2 para asegurar condiciones sin oxígeno. La temperatura de cultivo fue de 37 °C, el pH de 6,5 se mantuvo con NH4OH al 25 %. La corriente de gas CO2 y la velocidad del agitador se ajustaron a 0,1 l/min y 500 rpm, respectivamente. Se cuantificaron el consumo de glucosa y la producción de AS mediante HPLC, como se ha descrito en el ejemplo 1.
3.
Resultados
Los resultados se muestran en la figura 5.
En los cultivos por lotes controlados por NH4OH con hasta 40 g/l de glucosa se forma AS en 48 h. Por lo tanto, DD1 tiene un fuerte potencial de síntesis de ácido succínico y/o de sales de amonio de ácido succínico que son favorables para la conversión química a THF/BDO/GBL y pirrolidonas (documento WO-A-2006/066839).
La tasa de producción inicial de AS en los ensayos con 75 g/l de glucosa es ligeramente menor que en los ensayos con 50 y 25 g/l. Sin embargo, entre las 6 y las 12 h no ya no se observa dicha diferencia, lo que indica que la inhibición del sustrato no es un problema a niveles de glucosa de hasta 75 g/l.
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650 -
-500 20 20 100 500 120 -
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si DD1 también tolera la presencia de oxígeno. Si este fuera el caso, la cepa podría manejarse en condiciones aerobias, lo que hace que el trabajo de laboratorio sea mucho más fácil y rápido. Por lo tanto, se ensayó la cepa DD1 en experimentos en matraces agitados con glucosa.
1.
Preparación del medio
La composición y preparación del medio fueron iguales a las descritas en la tabla 8.
2.
Cultivos y analíticas
Los cultivos de siembra anaerobios se cultivaron en botellas de suero de 100 ml con tapones de goma herméticos a gases (véase más arriba) que contenían 50 ml de medio con 50 g/l de glucosa y 30 g/l de MgCO3 y una atmósfera de CO2 con una sobrepresión de 80 kPa a 37 °C y 160 rpm (diámetro de agitación: 2,5 cm) durante 16 h. La inoculación se llevó a cabo con 1 ml del WCB (ejemplo 2). Se usaron 7,5 ml de estos precultivos para inocular los cultivos aerobios principales.
Los cultivos aerobios principales (150 ml de medio con 60 g/l de glucosa y 80 g/l de MgCO3) se cultivaron a 37 °C y 200 rpm (diámetro de agitación: 2,5 cm) en matraces Erlenmeyer de 500 ml con dos deflectores y tapones de algodón. Se midieron el consumo de sustrato y la formación de producto mediante HPLC, comos e ha descrito en el ejemplo 1.
3. Resultados
Los resultados se muestran en la figura 9. Los resultados muestran claramente consumo aerobio de glucosa por la cepa DD1. Los productos principales son ácido acético y láctico, que también son los productos dominantes de las células cultivadas en condiciones aerobias de "Mannheimia succiniciproducens" MBEL 55E, (Lee y col., 2002a). Los niveles iniciales de AS se introducen por el precultivo anaerobio y se consumen ampliamente después 15 h de cultivo. Los datos demuestran claramente que DD1 es tolerante al oxígeno.
Ejemplo 12: Pueda de DD1 en condiciones descritas por KAIST
El familiar más próximo de DD1 es "Mannheimia succiniciproducens" MBEL 55E, una cepa aislada por KAIST (véase más arriba). Para comparar a DD1 con dicha cepa se llevó a cabo el experimento de cultivo descrito por KAIST (Fig. 2b en Lee y col., 2002a y Fig. 3 en Lee y col., 2002b) con DD1.
1. Preparación del medio
La composición del medio de cultivo fue idéntico al experimento respectivo de Lee y col., 2002b y se describe en la tabla 15 a continuación.

Tabla 15: Composición del medio para cultivos por lotes de DD1 en las condiciones descritas por Lee y col., 2002b.
Compuesto
Concentración [g/l] Concentración de la solución madre [g/l]
Glucosa
20 650
Extracto de levadura Bacto (Becton Dickinson)
5 -
Polipeptona peptona (Becton Dickinson)
5 -
(NH4)2SO4
1 500
CaCl2*2H2O
0,2 20
MgCl2*6H2O
0,2 20
NaCl
1 100
K2HPO4
3 500
MgCO3 (Riedel-de Haen 13117)
10 -
El extracto de levadura, la peptona y el MgCO3 se autoclavaron juntos en los fermentadores y las botellas de suero. Se autoclavaron por separado la glucosa, el sulfato de amonio y el fosfato de potasio. Los cloruros de Ca, Mg y Na se autoclavaron juntos. Después de enfriar los fermentadores y las botellas de suero, se añadieron los componentes faltantes como soluciones madre estériles. Para los cultivos de siembra se usó el mismo medio.
2. Cultivos y analíticas
El cultivo de siembra se cultivó de manera anaerobia en un bote de suero de 100 ml con tapones de goma de butilo estancos al gas que contenían 50 ml de medio a 39 °C en un incubador agitado (velocidad de rotación: 160 rpm, diámetro de agitación: 2,5 cm). La inoculación del cultivo de siembra se llevó a cabo con 1 ml del WCB (ejemplo 2) en la cámara anaerobia (MAKS MG 500, meintrup-dws). Inmediatamente después de la inoculación se sustituyó la atmósfera de gas (80 % de N2, 15 % de CO2 y 5 % de H2) por CO2 puro con una sobrepresión de aproximadamente 80 kPa. Después de 9 h de incubación, se inoculó el fermentador con 30 ml para iniciar el cultivo en el fermentador (Six-fors, Infors, Suiza) que contenían 300 ml de medio de cultivo que se había gaseado durante toda la noche con
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(continuación)
Metabolización de glicerol
c tiempo de cultivo. d consumo de glicerol.e formación de ácido succínico, láctico, fórmico y acético.f rendimiento espaciotemporal y rendimiento de ácido succínico.g relación en g/l de ácido succínico por g de producto secundario de ácido fórmico (AF) y ácido acético (AA)
2. Resultados:
Se obtuvieron los siguientes resultados, como se describe en la tabla 18. DD1 produjo 35,3 g/l de ácido succínico a partir de 28,4 g/l de glicerol en 24 h, dando lugar a un rendimiento espaciotemporal de 1,47 g/l de ácido succínico por h, que es superior a otros ejemplos documentados de metabolización del glicerol (Lee y col., 2001). El rendimiento de 1,24 g/g era próximo al rendimiento teórico descrito de 1,29 g de ácido succínico por g de glicerol, si se logra la conversión de 1 M de glicerol y 1 M de CO2 a 1 M de ácido succínico (Song y Lee, 2006).
Ejemplo 15: Producción de succinato a partir de glicerol y maltosa
Se determinó la productividad de DD1 en presencia de dos fuentes de carbono. Se cultivó DD1 en presencia del disacárido maltosa y de glicerol simultáneamente.
1. Preparación del medio y cultivo
Se sembraron células de una solución madre congelada en una placa de BHI-agar (Becton Dickinson). Se desprendieron las células y se suspendieron en medio BHI y se incubaron en una botella de suero anaerobia a 37 °C durante 5,5 h. El medio se describe en la tabla 19. Se usaron botellas de suero de 200 ml. Las células se inocularon con una DO inicial de 0,1 (determinada en un recorrido de 1 ml con un fotómetro Pharmacia a 600 nm). Se burbujearon las botellas de suero al menos tres veces con CO2 a través de los tapones de goma de butilo y se dejó una sobrepresión de CO2 de 80 kPa. Las botellas de suero se incubaron a 200 rpm y 37 °C.

Tabla 19: Preparación del medio para el ejemplo 15
Compuesto
Concentración [g/l]
Maltosa * H2O
22
Glicerol
56,82
Extracto de levadura Bacto
10
(NH4)2SO4
2
CaCl2*2H2O
0,2
MgCl2*6H2O
0,2
NaCl
2
K2HPO4
3
NaHCO3
8,4
MgCO3
50
Propilenglicol 1200 antiespumante
0,1
El cultivo de siembra se inoculó con 2 ml de un cultivo congelado cultivado en condiciones anaerobias en una botella de suero de 200 ml con tapones de goma de butilo herméticos a gases que contenían 50 ml de medio a 37 °C en un incubador agitado (velocidad de rotación: 160 rpm, diámetro de agitación: 2,5 cm). La botella se burbujeó con CO2 puro con una sobrepresión de aproximadamente 80 kPa. Después de 8 h de incubación se inoculó el fermentador con 50 ml para iniciar el cultivo en el fermentador que contenía 1 l de medio de cultivo que se gaseó con CO2 para asegurar condiciones sin oxígeno. La temperatura de cultivo se mantuvo a 37 °C y el pH a 6,5 sin adición de bases, salvo el tampón de MgCO3 en el medio. La corriente de CO2 gaseoso se ajustó a 0,2 wm. La velocidad del agitador se ajustó a 300 rpm. Se midieron el consumo de maltosa y glicerol y la formación de AS y subproducto mediante HPLC, como se ha descrito en el ejemplo 1. Las células se cultivaron a 37 °C y se determinó la biomasa y disolviendo el MgCO3 residual mediante la adición de HCl 1M. Después de disolver el MgCO3, las células se lavaron con agua y se secaron mediante liofilización. La biomasa seca se determinó mediante pesada.
28
imagen21

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