ES2581841T3 - Marcadores para la detección del cáncer gástrico - Google Patents

Marcadores para la detección del cáncer gástrico Download PDF

Info

Publication number
ES2581841T3
ES2581841T3 ES10775152.1T ES10775152T ES2581841T3 ES 2581841 T3 ES2581841 T3 ES 2581841T3 ES 10775152 T ES10775152 T ES 10775152T ES 2581841 T3 ES2581841 T3 ES 2581841T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
gtm
protein
gastric cancer
markers
rna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES10775152.1T
Other languages
English (en)
Inventor
Parry John Guilford
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pacific Edge Ltd
Original Assignee
Pacific Edge Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pacific Edge Ltd filed Critical Pacific Edge Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2581841T3 publication Critical patent/ES2581841T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57446—Specifically defined cancers of stomach or intestine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
    • G16B25/10—Gene or protein expression profiling; Expression-ratio estimation or normalisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4725—Mucins, e.g. human intestinal mucin

Abstract

Un método para detectar el cáncer gástrico, que comprende: (i) proporcionar una muestra de sangre, plasma o suero; (ii) detectar los niveles de proteína del gránulo de zimógeno humana 16 ("ZG16") en dicha muestra; y (iii) comparar la cantidad de ZG16 en dicha muestra con un valor obtenido a partir de una o más muestras control que no tienen cáncer gástrico, en el que la sobreexpresión de ZG16 en la muestra biológica es indicativa de cáncer gástrico.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
DESCRIPCION
Marcadores para la deteccion del cancer gastrico.
Campo de la invencion
Esta invencion se refiere a la deteccion del cancer. De modo especffico, esta invencion se refiere al uso de un marcador de protefna para la deteccion del cancer gastrico.
Antecedentes
La supervivencia de los pacientes con cancer aumenta enormemente cuando el cancer se detecta y se trata de forma temprana. En el caso del cancer gastrico, los pacientes diagnosticados con la enfermedad en un estadio temprano tienen una tasa de supervivencia a los 5 anos del 90%, comparado con aproximadamente 10% para los pacientes diagnosticados con la enfermedad avanzada. Sin embargo, la gran mayorfa de los pacientes con cancer gastrico en la actualidad se presentan con la enfermedad avanzada. Por tanto, los avances que conducen a un diagnostico temprano del cancer gastrico pueden conducir a una mejor prognosis para los pacientes.
La identificacion de marcadores asociados al cancer especfficos en muestras biologicas, que incluyen fluidos corporales, por ejemplo, sangre, orina, lavados peritoneales y extractos de deposiciones pueden proporcionar una estrategia valiosa para el diagnostico temprano del cancer, que conducirfan a un tratamiento temprano y una mejor prognosis. Los marcadores del cancer especfficos tambien pueden proporcionar un medio para controlar el avance de la enfermedad, que permitirfa seguir la eficacia de tratamientos quirurgicos, radioterapeuticos y quimioterapeuticos. Sin embargo, para una serie de canceres importantes, los marcadores disponibles tienen poca sensibilidad y especificidad. Por ejemplo, los marcadores que se emplean con mas frecuencia para el cancer gastrico, ca19-9, ca72-4 y el antfgeno carcinoembrionario (CEA) detectan solo aproximadamente 15-50% de los tumores gastricos de cualquier estadio, disminuyendo hasta aproximadamente 2-11% para la enfermedad en estadio temprano. Por tanto, hay una frecuencia muy alta de ensayos falsos negativos que puede conducir a que los pacientes y los profesionales sanitarios crean que no existe enfermedad, cuando, de hecho, el paciente puede padecer un cancer grave que necesite de una atencion inmediata. Ademas, estos marcadores pueden producir senales de falso positivo en hasta 1/3 de los individuos afectados por una enfermedad gastrica benigna.
El documento WO 2005/010213 describe marcadores para la deteccion del cancer gastrico. El documento WO 02/100336 describe protefnas de la membrana endotelial especfficas de tejido. Liang et al. (Proceedings of the American Associate for Cancer Research Annual Meeting, vol. 46, abril, 2005, p. 452) describen la perdida de ZG16 en el cancer colorrectal.
El set Affymetrix Gene Chip Human Genome U133 (
http://www.helmholtz-hzi.de/fileadmin/user
upload/research/Research/Programme/Technological-platforms/Gene_____________________________Expression
Analysis/Service/humangenomeu133) describe secuencias oligonucleotfdicas para un chip de genes Affymetrix.
Resumen de la invencion
En la presente se describen metodos, composiciones y dispositivos que pueden proporcionar la deteccion del cancer en un estadio temprano y disminuir la frecuencia de resultados del ensayo falsos positivos y falsos negativos.
Los analisis moleculares pueden emplearse para identificar genes que son altamente expresados en tejidos de tumor gastrico, pero que no esten necesariamente sobreexpresados, comparado con tejido gastrico no maligno. Estos analisis incluyen metodos de micromatrices de DNA ("microarrays’’) y de reaccion en cadena de polimerasa cuantitativa (qPCR). Los genes del cancer, los ARN y las protefnas codificadas por estos genes se denominan en la presente marcadores de tumores malignos gastricos (GTM). Debe entenderse que el termino GTM no necesita que el marcador sea especffico solo para los tumores gastricos. Por el contrario, la expresion de GTM puede estar aumentada en otros tipos de tumores, que incluyen tumores malignos o no malignos, que incluyen canceres gastricos, de vejiga, colorrectales, pancreaticos, de ovario, de piel (por ejemplo, melanomas), de hfgado, esofagicos, endometriales y de cerebro, entre otros. Sin embargo, debe entenderse que el termino GTM no incluye los marcadores de la tecnica anterior, tales como CA19-9, CA72-4, pepsinogeno y CEA, o cualquier otro marcador que haya sido previamente identificado como indicativo de tumores gastricos. Algunos GTM se segregan o escapan de los tumores a unos niveles suficientes como para ser un diagnostico del cancer gastrico con un alto grado de fiabilidad y, en otros casos, las mediciones de dos o mas GTM pueden proporcionar un diagnostico fiable del cancer gastrico.
Las protefnas que son segregadas o escindidas de las celulas, solas o en combinacion entre sf, tienen utilidad como marcadores sericos o de fluidos corporales para el diagnostico del cancer gastrico, o como marcadores para controlar el avance de una enfermedad establecida. La deteccion de marcadores de protefnas puede realizarse empleando metodos conocidos en la tecnica e incluye el uso de anticuerpos monoclonales, antisuero policlonal y similares.
En la presente se describe un metodo para detectar el cancer gastrico, que comprende:
(i) proporcionar una muestra biologica; y
(ii) detectar los niveles de protefna del granulo de zimogeno humana 16 ("ZG16") en dicha muestra.
La presente invencion proporciona un metodo para detectar el cancer gastrico, que comprende: (i) proporcionar una muestra de sangre, plasma o suero; (ii) detectar los niveles de protefna del granulo de zimogeno humana 16 5 ("ZG16") en dicha muestra; y (iii) comparar la cantidad de ZG16 en dicha muestra con un valor obtenido a partir de
una o mas muestras control que no presentan cancer gastrico, en el que la sobreexpresion de ZG16 en la muestra biologica es indicativa de cancer gastrico. La presente invencion proporciona ademas el uso de un anticuerpo especffico para la protefna del granulo de zimogeno humana 16 ("ZG16") para detectar el cancer gastrico en una muestra de sangre, plasma o suero.
10 En un aspecto, la sobreexpresion de ZG16 en un paciente es indicativa de que el paciente tiene cancer gastrico.
Puede seleccionarse otro miembro de la familia de GTM a partir del grupo que consiste en mucina 5AC ("MUC5AC"), o mucina 17 ("MUC17"). El metodo puede implicar la deteccion de ZG16 y MUC5AC, ZG16 y MUC17, o ZG16 y MUC5AC y MUC17.
El otro miembro de la familia de GTM tambien puede comprender uno o mas de otros miembros de la familia de 15 GTM, por ejemplo, cualquiera de MUC5AC, MUC17, ZG16, cadena de 83 kDa del polipeptido 2 de la carboxipeptidasa N (CPN2), metaloproteinasa de matriz 12 (MMP12), inhibina ("INHBA"), factor del crecimiento de tipo insulfnico 7 ("IGFBP7"), gamma-glutamil hidrolasa ("GGH"), proteoglicano enriquecido en leucina y prolina ("LEPRE1"), cistatina S ("CST4"), protefna relacionada con frizzled segregada 4 ("SFRP4"), asporina ("ASPN"), regulador del crecimiento celular con dominio de mano EF 1 ("CGREF1"), calicrefna 10 (KLK10), inhibidor tisular de 20 metaloproteinasa 1 ("TIMP1"), protefna rica en cistefna acida segregada ("SPARC"), factor del crecimiento transformante, 13-inducido ("TGFBI"), protefna de la matriz extracelular similar a fibulina que contiene EGF 2 ("EFEMP2"), lumicano ("LUM"), estanina ("SNN"), fosfoprotefna segregada 1 ("SPP1"), proteoglicano de sulfato de condroitina 2 ("CSPG2"), N-acilesfingosina amidohidrolasa ("ASAH1"), serina proteasa 11 ("PRSS11"), protefna relacionada con frizzled segregada 2 ("SFRP2"), fosfolipasa A2, grupo XIIB ("PLA2G12B"), espondina 2, protefna de 25 la matriz extracelular ("SPON2"), olfactomedina 1 ("OLFM1"), repeticion de tromboespondina que contiene 1 ("TSRC1"), tromboespondina 2 ("ThBS2"), adlicano, cistatina sA ("CST2"), cistatina SN ("CST1"), enzima de tipo lisil oxidasa 2 ("LOXL2"), tiroglobulina ("TG"), factor del crecimiento transformante beta1 ("TGFB1"), inhibidor de serina o cistefna proteinasa Clado H, miembro 1 ("SERPINH1"), inhibidor de serina o cistefna proteinasa Clado B, miembro 5 ("SERPINB5"), metaloproteinasa de matriz 2 ("MMP2"), proprotefna convertasa subtilisina/kexina de tipo 5 30 ("PCSK5"), protefna de enlace de glicoprotefna de hialuronano 4 ("HAPLN4"), CA19-9, CA72-4, pepsinogeno, CEA,
MUC5AC y MUC17.
Un ejemplo de una combinacion de marcadores de GTM que puede utilizarse segun la presente invencion es MUC5AC, MUC17, ZG16, cistatina SN, serpina H1 y serpina B5.
En la presente se describe cualquier metodo adecuado para detectar el nivel de GTM, y puede incluir detectar los 35 niveles de ARNm de GTM, ADNc de GTM, empleando un oligonucleotido complementario con al menos una porcion de dicho ADNc de GTM, empleando un metodo de qRT-PCR que utiliza un cebador directo y un cebador inverso, detectar los niveles de una protefna de GTM, detectar los niveles de un peptido de GTM, por ejemplo, empleando un anticuerpo dirigido contra dicho GTM. Puede emplearse cualquier anticuerpo adecuado, y puede ser un anticuerpo monoclonal o un antisuero policlonal. El metodo puede realizarse empleando un metodo de inmunoensayo de tipo 40 "sandwich" o empleando un chip de anticuerpos.
En la presente tambien se describe un dispositivo para detectar un GTM, que comprende: un sustrato que tiene un reactivo de captura de GTM sobre el; y un detector asociado con dicho sustrato, siendo capaz dicho detector de detectar un GTM asociado con dicho reactivo de captura.
El reactivo de captura de GTM puede ser un oligonucleotido o un anticuerpo especffico para un oligonucleotido de 45 GTM, una protefna de GTM o un peptido de GTM.
En la presente se describe ademas un kit para detectar el cancer, que comprende:
un sustrato que tiene un reactivo de captura de GTM sobre el;
un medio para visualizar un complejo de dicho agente de captura de GTM y un GTM; reactivos; e
instrucciones de uso, en el que dicho GTM comprende la protefna del granulo de zimogeno humana 16 ("ZG16").
50 El reactivo de captura de GTM es un oligonucleotido especffico de GTM o un anticuerpo especffico de GTM selectivo para un oligonucleotido de GTM, una protefna de GTM o un peptido de GTM.
En la presente tambien se describe un metodo para detectar un cancer gastrico, que comprende las etapas de:
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
proporcionar una muestra de ensayo para un paciente en riesgo de padecer cancer gastrico; medir la presencia de una protefna de GTM en dicha muestra de ensayo; y
comparar la cantidad de GTM presente en dicha muestra de ensayo con un valor obtenido a partir de una muestra control procedente de un sujeto que no padece cancer gastrico, en el que dicho GTM comprende la protefna del granulo de zimogeno humana 16 ("ZG16").
En la presente tambien se describe un metodo para seleccionar un cancer gastrico, que comprende las etapas de: proporcionar una muestra de ensayo procedente de un sujeto de ensayo; medir la presencia de un GTM en dicha muestra de ensayo; y
comparar la cantidad de GTM presente en dicha muestra de ensayo con un valor obtenido a partir de una muestra control procedente de un sujeto que no padece cancer gastrico, en el que dicho GTM comprende la protefna del granulo de zimogeno humana 16 ("ZG16").
El GTM puede ser una protefna o un peptido de GTM, o un oligonucleotido especffico para un GTM. El oligonucleotido puede ser ADN o ARN.
Segun el metodo, la etapa de medicion puede emplear un ensayo ELISA.
La muestra de ensayo puede obtenerse de plasma, tejido, orina, fluido gastrico, suero y deposiciones.
Breve descripcion de las figuras
Esta invencion se describe con referencia a realizaciones especfficas de la misma y con referencia a las figuras, en las que:
La figura 1 muestra una tabla resultado del analisis de la micromatriz de ADN que muestra genes con una alta expresion relativa en tejido tumoral. Se clasifico la intensidad de la senal para cada gen en tejido tumoral y en tejido no maligno. La tabla muestra los GTM con una clasificacion mas alta que el marcador del cancer gastrico existente CEA (codificado por el gen CEACAM5).
La figura 2 expone una tabla que muestra las caracterfsticas de muestras de suero empleadas en el analisis con la matriz de anticuerpos.
La figura 3 expone histogramas que muestran la distribucion de muestras de tumor y no malignas segun su nivel de expresion de (a) ZG16 y (b) MUC17. El nivel de expresion de los dos genes se obtuvo mediante RT-qPCR.
La figura 4 expone diagramas de cajas que muestran la deteccion de (a) MUC17 y (b) ZG16 en el suero de pacientes con cancer gastrico y controles empleando matrices de anticuerpos y deteccion de RCA.
Descripcion detallada
Definiciones
Antes de describir las realizaciones de la invencion en detalle, sera util proporcionar algunas definiciones de terminos, tal como se emplean en la presente.
El termino "GTM" o las expresiones "marcador de tumor gastrico" o "miembro de la familia de GTM" significan un gen, un fragmento de gen, ARN, un fragmento de ARN, una protefna o un fragmento de protefna relacionada u otra molecula identificativa asociada con el cancer gastrico. Los GTM descritos en la presente no incluyen moleculas que son conocidas en la tecnica anterior por estar asociadas con el cancer gastrico, por ejemplo, CA19-9, CA72-4, pepsinogeno y CEA. Sin embargo, los marcadores descritos en la presente pueden utilizarse en combinaciones nuevas y de la invencion con GTM previamente descritos.
El termino "marcador" se refiere a una molecula que esta asociada cuantitativa o cualitativamente con la presencia de un fenomeno biologico. Los ejemplos de "marcadores" incluyen un polinucleotido, tal como un gen o fragmento de gen, ARN o fragmento de ARN; o un producto genico, que incluye un polipeptido tal como un peptido, oligopeptido, protefna o fragmento de protefna; o cualquier metabolito relacionado, subproducto, o cualquier otra molecula identificativa, tal como anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, que esten relacionados directa o indirectamente con un mecanismo que subyace al fenomeno. Los marcadores descritos en la presente incluyen las secuencias de nucleotidos (por ejemplo, secuencias de GenBank) tal como se describen en la presente, en particular, las secuencias de longitud completa, cualquier secuencia codificadora, cualquier fragmento, o cualquier complemento de los mismos, y cualquier marcador mensurable de los mismos, tal como se definio anteriormente.
Tal como se usa en la presente, "anticuerpos" y terminos similares se refieren a moleculas de inmunoglobulina y porciones inmunologicamente activas de moleculas de inmunoglobulina (Ig), es decir, moleculas que contienen un sitio de union al antfgeno que se une especfficamente (inmunorreacciona con) un antfgeno. Estas incluyen, aunque
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
no se limitan a moleculas policlonales, monoclonales, quimericas, monocatenarias, fragmentos Fc, Fab, Fab' y Fab2, y un banco de expresion de Fab. Las moleculas de anticuerpos estan incluidas en cualquiera de las clases IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, que difieren unas de otras por la naturaleza de cadena pesada presente en la molecula. Estas incluyen ademas las subclases, tales como IgG1, IgG2 y otras. La cadena ligera puede ser una cadena kappa o una cadena lambda. La referencia en la presente a anticuerpos incluye la referencia a todas las clases, subclases y tipos. Tambien se incluyen anticuerpos quimericos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos que son especfficos de mas de una fuente, por ejemplo, una secuencia de raton o humana. Se incluyen ademas anticuerpos de camelido, anticuerpos de tiburon o nanocuerpos.
Los terminos "cancer" y "canceroso" se refieren a o describen el proceso fisiologico en mamfferos que se caracteriza generalmente por un crecimiento celular anomalo o no regulado. El cancer y la patologfa de cancer pueden asociarse, por ejemplo, con metastasis, interferencia con el funcionamiento normal de celulas proximas, liberacion de citoquinas u otros productos secretores a niveles anomalos, supresion o agravamiento de la respuesta inflamatoria o inmunologica, neoplasia, premalignidad, malignidad, invasion de tejidos u organos circundantes o distantes, tales como nodulos linfaticos, etc. Especfficamente se incluyen los melanomas.
El termino "tumor" se refiere a todo el crecimiento y proliferacion de celulas neoplasicas, malignas o benignas, y a todas las celulas y tejidos precancerosos y cancerosos.
La expresion "cancer gastrico" se refiere a un tumor que se origina en el estomago. Estos tumores son capaces de metastatizar hasta cualquier organo.
Las expresiones "expresado diferencialmente", "expresion diferencial" y expresiones similares, se refieren a un marcador genico cuya expresion esta activada a un nivel mayor o menor en un sujeto (por ejemplo, una muestra de ensayo) que tiene un trastorno, especfficamente cancer, tal como melanoma, respecto a su expresion en un sujeto de control (por ejemplo, una muestra de referencia). Las expresiones tambien incluyen marcadores cuya expresion se activa a un nivel mayor o menor en diferentes estadios del mismo trastorno; en enfermedades con buena o mala prognosis; o en celulas con niveles mayores o menores de proliferacion. Un marcador expresado de forma diferencial puede estar activado o inhibido al nivel de polinucleotido o al nivel de polipeptido, o puede someterse a un corte y empalme alternativo para dar por resultado un producto de polipeptido diferente. Dichas diferencias pueden evidenciarse por un cambio en niveles de ARNm, expresion en la superficie, secrecion u otra particion de un polipeptido, por ejemplo.
La expresion diferencial puede incluir una comparacion de expresion entre dos o mas marcadores (por ejemplo, genes o sus productos genicos); o una comparacion de las proporciones de la expresion entre dos o mas marcadores (por ejemplo, genes o sus productos genicos); o una comparacion de dos productos procesados de forma diferente (por ejemplo, transcripciones o polipeptidos) del mismo marcador, que difieren entre sujetos normales y sujetos enfermos; o entre varias etapas de la misma enfermedad; o entre enfermedades con buena o mala prognosis; o entre celulas con niveles mayores y menores de proliferacion; o entre tejido normal y tejido enfermo, especfficamente cancer, o melanoma. La expresion diferencial incluye la cuantitativa y la cualitativa, diferencias en el modelo de expresion temporal o celular en un gen o sus productos de expresion, por ejemplo, entre celulas normales o enfermas, o entre celulas que han sufrido diferentes acontecimientos de enfermedad o estadios de enfermedad, o celulas con diferentes niveles de proliferacion.
El termino "expresion" incluye la produccion de polinucleotidos y polipeptidos, en particular, la produccion de ARN (por ejemplo, ARNm) desde un gen o una porcion de un gen, e incluye la produccion de un polipeptido codificado por un aRn o un gen o porcion de un gen, y la aparicion de un material detectable asociado con la expresion. Por ejemplo, la formacion de un complejo, por ejemplo, de una interaccion polipeptido-polipeptido, interaccion polipeptido-nucleotido, o similares, se incluye en el alcance del termino "expresion". Otro ejemplo es la union de un ligando de union, tal como una sonda de hibridacion o un anticuerpo, a un gen u otro polinucleotido u oligonucleotido, un polipeptido o un fragmento de protefna, y la visualizacion del ligando de union. Asf, la intensidad de una mancha en una micromatriz, en una transferencia de hibridacion tal como una transferencia Northern, o en una inmunotransferencia, tal como una transferencia Western, o en una matriz de esferas, o por analisis PCR, se incluye en el termino "expresion" de la molecula biologica subyacente.
Las expresiones "umbral de expresion" y "umbral de expresion definido" se usan de forma intercambiable y se refieren al nivel de un marcador en cuestion fuera del cual el polinucleotido o polipeptido sirve como un marcador predictivo para la supervivencia del paciente. El umbral depende del modelo predictivo establecido y se deriva experimentalmente de estudios clfnicos tales como los descritos en los ejemplos posteriores. Dependiendo del modelo de prediccion usado, el umbral de expresion puede fijarse para lograr la maxima sensibilidad, o para una maxima especificidad o para un error mfnimo (maxima tasa de clasificacion). Por ejemplo, un umbral mayor puede fijarse para alcanzar errores mfnimos, aunque puede dar por resultado una menor sensibilidad. Por lo tanto, para cualquier modelo predictivo dado, se emplearan estudios clfnicos para fijar un umbral de expresion que generalmente alcanza la mayor sensibilidad mientras que tiene una minima tasa de error. La determinacion del umbral de expresion para cualquier situacion esta dentro del conocimiento de los expertos en la tecnica.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
El termino "sensibilidad" significa la proporcion de individuos con la enfermedad positivos en el ensayo (con el modelo). Asf, una mayor sensibilidad significa menos resultados del ensayo falsos negativos.
El termino "especificidad" significa la proporcion de individuos sin la enfermedad negativos en el ensayo (con el modelo). Asf, una mayor especificidad significa menos resultados del ensayo falsos positivos.
El termino "micromatriz" se refiere a una disposicion ordenada o desordenada de agentes de captura, preferiblemente polinucleotidos (por ejemplo, sondas) o polipeptidos en un sustrato. Vease, por ejemplo, Microarray Analysis, M. Schena, John Wiley & Sons, 2002; Microarray Biochip Technology, M. Schena, ed., Eaton Publishing, 2000; Guide to Analysis of DNA Microarray Data, S. Knudsen, John Wiley & Sons, 2004; y Protein Microarray Technology, D. Kambhampati, ed., John Wiley & Sons, 2004.
El termino "oligonucleotido" se refiere a un polinucleotido, generalmente una sonda o cebador, que incluye, sin limitacion, desoxirribonucleotidos monocatenarios, ribonucleotidos monocatenarios o bicatenarios, hforidos de ARN: ADN, y ADN bicatenarios. Los oligonucleotidos, tales como oligonucleotidos de sonda de ADN monocatenarios, se sintetizan a menudo por metodos qrnmicos, por ejemplo, usando sintetizadores de oligonucleotidos automatizados que estan disponibles en el mercado, o por una diversidad de otros metodos, que incluyen sistemas de expresion in vitro, tecnicas recombinantes, y expresion en celulas y organismos.
El termino "sobreexpresion" o "sobreexpresado" se refiere a un nivel de expresion de un gen o marcador en un paciente que esta por encima del que se observa en tejido normal. La expresion puede considerarse sobreexpresada si es 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, o mayor que 2 veces la expresion en tejido normal.
El termino "polinucleotido", cuando se usa en el singular o plural, se refiere generalmente a cualquier polirribonucleotido o polidesoxirribonucleotido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. Esto incluye, sin limitacion, ADN monocatenario y bicatenario, ADN que incluye regiones monocatenarias y bicatenarias, ARN monocatenario y bicatenario, y ARN que incluye regiones monocatenarias y bicatenarias, moleculas hforidas que comprenden ADN y ARN que pueden monocatenarios o, mas generalmente, bicatenarios, o incluyen regiones monocatenarias y bicatenarias. Tambien se incluyen regiones tricatenarias que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. Se incluyen espedficamente ARNm, ADNc y ADN genomicos, y cualquier fragmento de los mismos. El termino incluye ADN y ARN que contienen una o mas bases modificadas, tal como bases tritiadas, o bases inusuales, tales como inosina. Los polinucleotidos de la invencion pueden incluir secuencias codificadoras o no codificadoras, o secuencias sentido o antisentido. Se entendera que cada referencia a un "polinucleotido" o termino similar, en la presente, incluira las secuencias de longitud completa ademas de cualquier fragmento, derivado o variante de las mismas.
"Polipeptido", como se usa en la presente, se refiere a un oligopeptido, un peptido, o una secuencia de protema, o fragmento de los mismos, y a moleculas que se dan de forma natural, recombinantes, sinteticas o semisinteticas. Cuando "polipeptido" se menciona en la presente para referirse a una secuencia de aminoacidos de una molecula de protema que se da de forma natural, "polipeptido" y terminos similares no pretenden limitar la secuencia de aminoacidos a la secuencia de aminoacidos nativa, completa, para la molecula de longitud total. Se entendera que cada referencia a un "polipeptido" o termino similar, en la presente, incluira las secuencias de longitud completa ademas de cualquier fragmento, derivado o variante de los mismos.
El termino "qPCR" o "QPCR" se refiere a la reaccion de cadena de polimerasa cuantitativa como se describe, por ejemplo, en PCR Technique: Quantitative PCR, J.W. Larrick, ed., Eaton Publishing, 1997, y A-Z of Quantitative pCr, S. Bustin, ed., IUL Press, 2004.
El termino RCA es una abreviatura de la amplificacion de drculo rodante. La RCA es una tecnica que implica el copiado repetido de un molde circular para amplificar una senal de una manera lineal.
La "rigurosidad" de las reacciones de hibridacion puede ser facilmente determinada por los expertos en la tecnica, y generalmente es un calculo emprnco dependiente de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado y la concentracion de sal. En general, las sondas mas largas necesitan temperaturas mayores para un reasociado apropiado, mientras que las sondas mas cortas necesitan menores temperaturas. La hibridacion depende generalmente de la capacidad del ADN desnaturalizado para reasociarse cuando estan presentes hebras complementarias en un medio por debajo de su temperatura de fusion. Cuanto mayor sea el grado de homologfa deseada entre la sonda y la secuencia hibridable, mayor sera la temperatura relativa que pueda usarse. Como resultado, se sigue que las temperaturas relativas mayores tenderan a hacer que las condiciones de reaccion sean mas rigurosas, mientras que unas temperaturas menores no tanto. Otros detalles y explicaciones de la rigurosidad de las reacciones de hibridacion se encuentran por ejemplo, en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).
"Condiciones rigurosas" o "condiciones de alta rigurosidad", como se definen en la presente, generalmente: (1) emplean baja fuerza ionica y alta temperatura para el lavado, por ejemplo cloruro sodico 0,015 M/citrato sodico 0,0015 M/ dodecilsulfato sodico al 0,1% a 50 °C; (2) emplean un agente desnaturalizante durante la hibridacion, tal como formamida, por ejemplo, 50% (v/v) de formamida con 0,1% de albumina de suero bovino/0,1% de Ficoll/0,1% de polivinilpirrolidona/tampon de fosfato sodico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sodico 750 mM, citrato sodico 75 mM a
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
42 °C; o (3) emplean 50% de formamida, 5X SSC (NaCI 0,75 M, citrato sodico 0,075 M), fosfato sodico 50 mM (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato sodico, 5X, disolucion de Denhardt, ADN de esperma de salmon sonicado (50 ug/ml), 0,1% de SDS, y 10% de sulfato de dextrano a 42 °C, con lavados a 42 °C en 0,2X SSC (cloruro sodico/citrato sodico) y 50% de formamida a 55 °C, seguido por un lavado de alta rigurosidad que comprende 0,1X SSC que contiene EDTA a 55 °C.
Las "condiciones moderadamente rigurosas" pueden identificarse como se describe por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de una disolucion de lavado y condiciones de hibridacion (por ejemplo, temperatura, fuerza ionica y porcentaje de SDS) menos rigurosas que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas son una incubacion durante la noche a 37 °C en una disolucion que comprende: 20% de formamida, 5X SSC (NaCl 150 mM, citrato trisodico 15 mM), fosfato sodico 50 mM (pH 7,6), disolucion 5X de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano, y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmon cizallado desnaturalizado, seguido de un lavado de los filtros en 1X SSC a aproximadamente 37-50 °C. Los expertos en la tecnica sabran como ajustar la temperatura, la fuerza ionica, etc. como sea necesario para incluir factores tales como la longitud de sonda y similares.
El termino "MUC5AC" significa mucina 5AC (SEQ ID NO 1 y 4), e incluye el marcador MUC5AC, que incluye un polinucleotido, tal como un gen o un fragmento de gen, ARN o un fragmento de ARN; o un producto genico, que incluye un polipeptido tal como un peptido, un oligopeptido, una protefna o un fragmento de protefna; o cualquier metabolito relacionado, subproducto o cualquier otra molecula identificativa, tal como anticuerpos o fragmentos de anticuerpos.
El termino "MUC17" significa mucina humana 17, asociada a la superficie celular (SEQ ID NO 2 y 5), e incluye el marcador MUC17, que incluye un polinucleotido, tal como un gen o un fragmento de gen, ARN o un fragmento de
ARN; o un producto genico, que incluye un polipeptido tal como un peptido, un oligopeptido, una protefna o un
fragmento de protefna; o cualquier metabolito relacionado, subproducto o cualquier otra molecula identificativa, tal como anticuerpos o fragmentos de anticuerpos.
El termino "ZG16" significa la protefna del granulo de zimogeno humana 16 (SEQ ID NO 3 y 6), e incluye el marcador ZG16, que incluye un polinucleotido, tal como un gen o un fragmento de gen, ARN o un fragmento de
ARN; o un producto genico, que incluye un polipeptido tal como un peptido, un oligopeptido, una protefna o un
fragmento de protefna; o cualquier metabolito relacionado, subproducto, o cualquier otra molecula identificativa, tal como anticuerpos o fragmentos de anticuerpos.
La practica de la presente invencion empleara, a menos que se indique lo contrario, tecnicas convencionales de biologfa molecular (que incluyen tecnicas recombinantes), microbiologfa, biologfa celular y bioqufmica, que estan dentro de la tecnica. Dichas tecnicas se explican a fondo en la bibliograffa, tal como, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edicion, Sambrook et al., 1989; Oligonucleotide Synthesis, M.J. Gait, ed., 1984; Animal Cell Culture, R.I. Freshney, ed., 1987; Methods in Enzymology, Academic Press, Inc.; Handbook of Experimental Immunology, 4° edicion, D .M. Weir & CC. Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987; Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., 1987; y PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al., eds., 1994.
Debe entenderse que los anteriores terminos y expresiones se refieren a protefnas, secuencias de ADN y/o secuencias de ARN. Tambien debe entenderse que los anteriores terminos y expresiones se refieren tambien a protefnas, ADN y/o ARN no humanos que tengan secuencias homologas, tal como se muestran en la presente.
Descripcion de realizaciones de la invencion
Generalmente, los marcadores tumorales se expresan de modo diferencial en el tejido tumoral y el correspondiente tejido no maligno. Esto proporciona un medio para distinguir entre pacientes con y sin cancer. Sin embargo, es probable que la estructura anatomica y caracterfsticas fisiologicas de los tejidos tumorales conduzcan a diferencias en la acumulacion de marcadores en el suero y otros fluidos biologicos, incluso si esos marcadores no estan sobreexpresados en tejido tumoral. En particular, se preve que la polaridad anomala de las celulas tumorales, la vasculatura permeable y la alta presion intersticial del tejido tumoral favorezca la salida de marcadores especfficos fuera del tejido tumoral, comparado con tejido no maligno. Por consiguiente, se establece la hipotesis de que las protefnas segregadas que se expresan a niveles muy altos en tejido de tumor gastrico, pero que no estan necesariamente sobreexpresadas comparadas con tejido gastrico no maligno, constituiran marcadores del cancer gastrico utiles.
Empleando una combinacion de analisis de micromatrices y reaccion en cadena de polimerasa cuantitativa (qPCR), se han identificado nuevos marcadores para la deteccion del cancer gastrico. Estos nuevos marcadores de tumores gastricos (GTM) proporcionan mas herramientas para la deteccion temprana del cancer gastrico. De modo especffico, la invencion comprende los nuevos GTM: MUC5AC (SEQ ID nO 1 y 4), MUC17 (SEQ ID NO 2 y 5), y ZG16 (SEQ ID NO 3 y 6).
Los nuevos GTM puede emplearse aislados o, como alternativa, pueden combinarse como una firma (que comprende dos o mas GTM). Una firma descrita en la presente incluye al menos uno de MUC5AC, MUC 17, y ZG16,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
y al menos otro GTM, que puede ser un GTM segun la presente invencion o cualquier otro GTM, incluyendo los GTM conocidos.
Los GTM conocidos adecuados para su uso en combinacion con los GTM descritos en la presente incluyen la cadena de 83 kDa del polipeptido 2 de la carboxipeptidasa N (CPN2), metaloproteinasa de matriz 12 (MMP12), inhibina ("INHBA"), factor del crecimiento de tipo insulfnico 7 ("IGFBP7"), gamma-glutamil hidrolasa ("GGH"), proteoglicano enriquecido en leucina y prolina ("LEPREI"), cistatina S ("CST4"), protefna relacionada con frizzled segregada 4 ("SFRP4"), asporina ("ASPN"), regulador del crecimiento celular con dominio de mano EF 1 ("CGREF1"), calicrefna 10 (KLK10), inhibidor tisular de metaloproteinasa 1 ("TIMP1"), protefna rica en cistefna acida segregada ("SPARC"), factor del crecimiento transformante, 13-inducido ("TGFBI"), protefna de la matriz extracelular similar a fibulina que contiene EGF 2 ("EFEMP2"), lumicano ("LUM"), estanina ("SNN"), fosfoprotefna segregada 1 ("SPP1"), proteoglicano de sulfato de condroitina 2 ("CSPG2"), N-acilesfingosina amidohidrolasa ("ASAH1"), serina proteasa 11 ("PRSS11"), protefna relacionada con frizzled segregada 2 ("SFRP2"), fosfolipasa A2, grupo XIIB ("PLA2G12B"), espondina 2, protefna de la matriz extracelular ("SPON2"), olfactomedina 1 ("OLFM1"), repeticion de tromboespondina que contiene 1 ("TSRC1"), tromboespondina 2 ("THBS2"), adlicano, cistatina SA ("CST2"), cistatina SN ("CSTi"), enzima de tipo lisil oxidasa 2 ("LOXL2"), tiroglobulina ("TG"), factor del crecimiento transformante beta1 ("TGFB1"), inhibidor de serina o cistefna proteinasa Clado H, miembro 1 ("SERPINH1"), inhibidor de serina o cistefna proteinasa Clado B, miembro 5 ("SERPINB5"), metaloproteinasa de matriz 2 ("MMP2"), proprotefna convertasa subtilisina/kexina de tipo 5 ("PCSK5"), protefna de enlace de glicoprotefna de hialuronano 4 ("HAPLN4"), CA19-9, CA72-4, pepsinogeno y CEA, o cualquier otro marcador que haya sido previamente identificado como indicativo de tumores gastricos.
El termino "fiabilidad" incluye la baja incidencia de falsos positivos y/o falsos negativos. Asf, con un marcador de alta fiabilidad se asocian menos falsos positivos y/o falsos negativos con los diagnosticos realizados empleando ese marcador. Por tanto, en ciertas realizaciones, se proporcionan marcadores que permiten la deteccion del cancer gastrico con una fiabilidad mayor que la fiabilidad de los marcadores de la tecnica anterior de aproximadamente 50%. En otras realizaciones, se proporcionan marcadores con una fiabilidad mayor que aproximadamente 70%, en otras realizaciones, mayor que aproximadamente 73%, en otras realizaciones, mayor que aproximadamente 80%, en otras realizaciones, mayor que aproximadamente 90%, en otras realizaciones, mayor que aproximadamente 95%, en otras realizaciones, mayor que aproximadamente 98%, y en ciertas realizaciones aproximadamente 100% de fiabilidad.
Estrategias generales para la deteccion del cancer
A continuacion se resumen las metodologfas generales para determinar los niveles de expresion, aunque se apreciara que cualquier metodo para determinar los niveles de expresion sera adecuado.
PCR cuantitativa (qPCR)
La PCR cuantitativa (qPCR) puede realizarse en muestras de tumor, en suero y plasma utilizando sondas y cebadores especfficos de GTM. En reacciones controladas, la cantidad de producto formado en una reaccion de PCR (Sambrook, J., E. Fritsch, E. y T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (2001)) se correlaciona con la cantidad de molde de partida. La cuantificacion del producto de la PCR puede realizarse deteniendo la reaccion de PCR cuando se encuentre en la fase logarftmica, antes de que los reactivos se conviertan en limitantes. Los productos de la PCR despues se someten a una electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida, se tinen con bromuro de etidio o un tinte de ADN comparable, y se mide la intensidad de la tincion mediante una densitometrfa. Como alternativa, el avance de una reaccion de PCR puede medirse empleando maquinas de PCR, tales como Applied Biosystems' Prism 7000 o Roche LightCycler, que miden la acumulacion del producto a tiempo real. La PCR de tiempo real mide la fluorescencia de tintes intercalantes en el ADN, tales como Sybr Green en el producto de la PCR sintetizado, o la fluorescencia liberada por una molecula indicadora cuando se escinde de una molecula extintora; las moleculas indicadora y extintora se incorporan en una sonda oligonucleotfdica que se hibrida con la molecula de ADN diana despues de la extension de la hebra de ADN desde los oligonucleotidos cebadores. La sonda oligonucleotfdica se desplaza y es degradada mediante la accion enzimatica de la Taq polimerasa en el siguiente ciclo de PCR, liberando el indicador de la molecula extintora. En una variacion, conocida como Scorpion®, la sonda se une covalentemente al cebador.
PCR de transcripcion inversa (RT-PCR)
La RT-PCR puede utilizarse para comparar niveles de ARN en diferentes poblaciones de muestras, en tejidos normales y tumorales, con o sin tratamiento con farmaco, para caracterizar patrones de expresion, para discriminar entre ARN muy relacionados, y para analizar la estructura del ARN.
Para la RT-PCR, la primera etapa es el aislamiento del ARN de una muestra diana. El material de partida es generalmente ARN total aislado de tumores humanos o lfneas celulares tumorales, y se corresponde con tejidos normales o lfneas celulares, respectivamente. El ARN puede aislarse a partir de una diversidad de muestras, tales como muestras tumorales de tejidos de mama, pulmon, colon (por ejemplo intestino delgado o intestino grueso),
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
colorrectal, gastrico, esofagico, anal, rectal, de prostata, de cerebro, rinon, pancreas, bazo, timo, testfculo, ovario, utero, vejiga, etc., de tumores primarios o lfneas de celulas tumorales, y de muestras reunidas de donantes sanos. Si la fuente de ARN es un tumor, el ARN puede extraerse, por ejemplo, de muestras de tejido congelado o incorporado en parafina archivadas y fijadas (por ejemplo, fijado con formalina).
La primera etapa en la formacion de perfiles de expresion genica por RT-PCR es la transcripcion inversa del molde de ARN en ADNc, seguido por su amplificacion exponencial en una reaccion de PCR. Las dos transcriptasas inversas usadas de forma mas comun son la transcriptasa inversa del virus de mieloblastosis aviar (AMV-RT) y la transcriptasa inversa del virus de leucemia murina de Moloney (MMLV-RT). La etapa de transcripcion inversa se ceba generalmente usando cebadores especfficos, hexameros aleatorios, o cebadores de oligo-dT, dependiendo de las circunstancias y el objetivo de la formacion de perfiles de expresion. Por ejemplo, el ARN extrafdo puede transcribirse de forma inversa usando un equipo PCR de ARN GeneAmp (Perkin Elmer, CA, USA), siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADNc derivado puede usarse entonces como un molde en la posterior reaccion de PCR.
Aunque la etapa de PCR puede usar una variedad de ADN polimerasas dependientes de ADN termoestables, generalmente emplea la Taq ADN polimerasa, que tiene una actividad de 5'-3' nucleasa pero carece de una actividad endonucleasa correctora 3'-5'. Asf, TaqMan qPCR generalmente utiliza la actividad 5' nucleasa de Taq o Tth polimerasa para hidrolizar una sonda de hibridacion unida a su amplicon diana, aunque puede usarse cualquier enzima con actividad 5' nucleasa equivalente.
Dos cebadores oligonucleotfdicos se usan para generar un amplicon tfpico de una reaccion de PCR. Un tercer oligonucleotido, o sonda, se disena para detectar la secuencia de nucleotidos situada entre los dos cebadores de PCR. La sonda no es extensible por la enzima Taq ADN polimerasa, y se marca con un tinte fluorescente indicador y un tinte fluorescente extintor. Cualquier emision inducida por laser desde el tinte indicador se apaga por el tinte extintor cuando los dos tintes se situan bastante juntos como estan en la sonda. Durante la reaccion de amplificacion, la enzima Taq ADN polimerasa escinde la sonda de una manera dependiente del molde. Los fragmentos de sonda resultantes se disocian en disolucion, y la senal desde el tinte indicador liberado esta libre del efecto extintor del segundo fluoroforo. Una molecula de tinte indicador se libera por cada nueva molecula sintetizada, y la deteccion del tinte indicador no extinguido proporciona la base de la interpretacion cuantitativa de los datos.
TaqMan RT-PCR puede realizarse usando equipo disponible en el mercado, tal como, por ejemplo, ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, EeUU), o Lightcycler (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania). En una realizacion preferida, el procedimiento de 5' nucleasa se ejecuta en un dispositivo de PCR cuantitativa a tiempo real tal como ABI PRISM 7700 Sequence Detection System. El sistema consiste en un termociclador, laser, dispositivo acoplado por carga (CCD), camara y ordenador. El sistema amplifica muestras en un formato de 96 pocillos en un termociclador. Durante la amplificacion, la senal fluorescente inducida por laser se recoge en tiempo real a traves de cables de fibra optica por todos los 96 pocillos y se detecta en el CCD. El sistema incluye software para hacer funcionar el instrumento y para analizar los datos.
Los datos del ensayo de 5' nucleasa se expresan inicialmente como Ct, o el ciclo umbral. Tal como se analizo anteriormente, los valores de fluorescencia se recogen durante todo el ciclo y representan la cantidad de producto amplificado en ese punto en la reaccion de amplificacion. El punto en el que la senal fluorescente se registra por primera vez como estadfsticamente significativa es el ciclo umbral.
PCR cuantitativa a tiempo real (qRT-PCR)
Una variacion mas reciente de la tecnica RT-PCR es la PCR cuantitativa a tiempo real, que mide la acumulacion de producto de PCR a traves de una sonda fluorigenica con marcaje dual (es decir, sonda TaqMan). La PCR a tiempo real es compatible con la PCR competitiva cuantitativa y con la PCR comparativa cuantitativa. La primera emplea un competidor interno para cada secuencia diana para la normalizacion, mientras que la segunda emplea un gen de normalizacion contenido dentro de la muestra, o un gen constitutivo para RT-PCr. Se proporcionan mas detalles, por ejemplo, en Held et al., Genome Research 6: 986-994 (1996).
Los niveles de expresion pueden determinarse usando tejidos incorporados en parafina, fijados, como la fuente de ARN. Segun un aspecto de la presente invencion, los cebadores y sondas de PCR se disenan para que flanqueen secuencias de intron presentes en el gen a amplificar. En esta realizacion, la primera etapa en el diseno del cebador/sonda es la delineacion de secuencias de intron en los genes. Esto puede hacerse mediante software disponible publicamente, tal como el software DNA BLAT desarrollado por Kent, W. J., Genome Res. 12 (4): 656-64
(2002), o por el software BLAST que incluye sus variaciones. Las etapas posteriores siguen metodos bien
establecidos de diseno de cebadores y sondas de PCR.
Para evitar senales no especfficas, es util enmascarar secuencias repetitivas en los intrones cuando se disenan los cebadores y sondas. Esto puede conseguirse facilmente usando el programa Repeat Masker disponible en lfnea a traves del Baylor College of Medicine, que selecciona secuencias de ADN frente a un banco de elementos
repetitivos y devuelve una secuencia de consulta en la que los elementos repetitivos estan enmascarados. Las
secuencias enmascaradas pueden usarse entonces para disenar las secuencias de cebador y sonda usando
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
cualquier paquete de diseno de cebador/sonda disponible comercial o publicamente de otra forma, tal como Primer Express (Applied Biosystems); MGB assay-by-design (Applied Biosystems); Primer3 (Steve Rozen y Helen J. Skaletsky (2000), Primer3 on the VIMNV for general users and for biologist programmers en: Krawetz S., Misener S. (eds.) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pags. 365386).
Los factores mas importantes considerados en el diseno de cebador de PCR incluyen la longitud del cebador, la temperatura de fusion (Tm), y el contenido G/C, especificidad, secuencias de cebador complementarias y secuencia final 3'. En general, los cebadores de PCR optimos tienen generalmente 1730 bases de longitud, y contienen aproximadamente 20-80%, tal como por ejemplo, 50-60% de bases G+C. Las temperaturas de fusion entre 50 y 80°C, por ejemplo, aproximadamente 50 a 70°C, se prefieren generalmente. Para otras directrices para el diseno de cebadores y sondas de PCR vease, por ejemplo, Dieffenbach, C. W. et al., General Concepts for pCr Primer Design en: PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 1995, pp.133-155; Innis y Gelfand, Optimization of PCRs en: PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, CCR Press, Londres, 1994, pags. 5-11; y Plasterer, T. N. Primerselect: Primer and probe design. Methods Mol. Biol. 70: 520-527 (1997).
Analisis de micromatrices de ADN
Tambien puede identificarse la expresion diferencial, o confirmarse usando la tecnica de micromatrices. Asf, el perfil de expresion de GTM puede medirse en tejido tumoral tanto fresco como incorporado en parafina, usando la tecnologfa de micromatrices. En este metodo, las secuencias de polinucleotidos de interes (que incluyen ADNc y oligonucleotidos) se cultivan en placa, o se construyen matrices, sobre un sustrato de microchip. Las secuencias en matrices (es decir, sondas de captura) se hibridan entonces con polinucleotidos especfficos de celulas o tejidos de interes (es decir, dianas). Como en el metodo RT-PCR, la fuente de ARN es generalmente ARN total aislado de tumores humanos o lfneas celulares tumorales, y tejidos o lfneas celulares normales correspondientes. Asf el ARN puede aislarse de una variedad de tumores o lfneas celulares tumorales primarios. Si la fuente de ARN es un tumor primario, el ARN puede extraerse, por ejemplo, de muestras de tejido incorporadas en parafina fijadas en formalina (FFPE) archivadas o congeladas y muestras de tejido fijadas (por ejemplo, fijadas en formalina), que se preparan de forma rutinaria y se conservan en la practica clfnica diaria.
En una realizacion especffica de la tecnica de micromatrices, se aplican inserciones amplificadas por PCR de clones de ADNc a un sustrato. El sustrato puede incluir secuencias de hasta 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o 75 nucleotidos. En otros aspectos, el sustrato puede incluir secuencias de al menos 10.000 nucleotidos. Las secuencias en forma de micromatrices, inmovilizadas en el microchip, son adecuadas para la hibridacion en condiciones rigurosas. Como otras realizaciones, las dianas para las micromatrices pueden tener al menos 50, 100, 200, 400, 500, 1000 o 2000 bases de longitud; o 50-100, 100-200, 100-500, 100-1000, 100-2000 o 500-5000 bases de longitud. Como realizaciones adicionales, las sondas de captura para las micromatrices pueden tener al menos 10, 15, 20, 25, 50, 75, 80 o 100 bases de longitud; o 10-15, 10-20, 10-25, 10-50, 10-75, 10-80, o 20-80 bases de longitud.
Las sondas de ADNc marcadas de forma fluorescente pueden generarse mediante la incorporacion de nucleotidos fluorescentes por transcripcion inversa de ARN extrafdo de tejidos de interes. Las sondas de ADNc marcadas aplicadas al chip se hibridan con especificidad a cada mancha de ADN en la matriz. Despues del lavado riguroso para eliminar las sondas unidas de forma no especffica, el circuito se barre por microcopia de laser confocal o por otro metodo de deteccion, tal como una camara CCD. La cuantificacion de la hibridacion de cada elemento en la matriz permite la evaluacion de la abundancia de ARNm correspondiente. Con la fluorescencia de color dual, las sondas de ADNc marcadas de forma separada generadas a partir de dos fuentes de ARN se hibridan en pares a la matriz. La abundancia relativa de las transcripciones de las dos fuentes que se corresponden a cada gen especificado se determina asf de forma simultanea.
La escala miniaturizada de la hibridacion permite una evaluacion conveniente y rapida del diseno de expresion para grandes numeros de genes. Dichos metodos han demostrado tener la sensibilidad necesaria para detectar transcripciones raras, que se expresan en unas pocas copias por celula, y para detectar de forma reproducible diferencias de al menos aproximadamente dos iteraciones en los niveles de expresion (Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (2): 106-149 (1996)). El analisis de micromatrices puede realizarse mediante un equipo disponible en el mercado, siguiendo los protocolos del fabricante, tal como usando la tecnologfa GenChip Affymetrix, tecnologfa de micromatriz Illumina o tecnologfa de micromatriz de Incyte. El desarrollo de metodos de micromatrices para el analisis a gran escala de la expresion genica hace posible buscar sistematicamente marcadores moleculares de clasificacion para el cancer y la prediccion de resultados en una variedad de tipos de tumor.
Aislamiento, purificacion y amplificacion de ARN
Los metodos generales para la extraccion de ARNm se conocen bien en la tecnica y se describen en libros de texto convencionales de la biologfa molecular, que incluyen Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997). Los metodos para la extraccion de ARN de tejidos incorporados en parafina se describen, por ejemplo, en Rupp y Locker, Lab Invest. 56: A67 (1987), y De Sandres et al., BioTechniques 18: 42044 (1995). En particular, el aislamiento de ARN puede realizarse usando un kit de purificacion, un conjunto de tampones, y
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
proteasa de fabricantes comerciales, tales como Qiagen, segun las instrucciones del fabricante. Por ejemplo, el ARN total de celulas en cultivo puede aislarse usando mini-columnas Qiagen RNeasy. Otros equipos de aislamiento de ARN disponibles en el mercado incluyen MasterPure Complete DNA and RnA Purification Kit (EPICENTRE (D, Madison, WI), y Paraffin Block RNA Isolation Kit (Ambion, Inc.). El ARN total de las muestras de tejido puede aislarse usando ARN Stat-60 (Tel-Test). El ARN preparado a partir de un tumor puede aislarse, por ejemplo, por centrifugado en gradiente de densidad en cloruro de cesio.
Las etapas de un protocolo representativo para la formacion del perfil la expresion genica usando tejidos incorporados en parafina, fijados, como fuente de ARN, que incluyen el aislamiento del ARNm, la purificacion, la extension con cebador y la amplificacion se ofrecen en varios artfculos periodicos publicados (por ejemplo: T. E. Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000); K. Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)). Brevemente, un procedimiento representativo comienza con el corte de secciones de aproximadamente 10 micrometros de espesor de muestras de tejido tumoral incorporado en parafina. El ARN se extrae entonces, y la protefna y el ADN se eliminan. Despues del analisis de la concentracion de ARN, pueden incluirse las etapas de reparacion de ARN y/o amplificacion, si fuera necesario, y el ARN se transcribe de forma inversa usando promotores especfficos de gen, seguido de una RT-PCR. Por ultimo, los datos se analizan para identificar la mejor o mejores opciones de tratamiento disponibles para el paciente en base al patron de expresion genica caracterfstico identificado en la muestra tumoral examinada.
Inmunohistoqufmica y proteomica
Los metodos de la inmunohistoqufmica son tambien adecuados para detectar los niveles de expresion de los marcadores de proliferacion descritos en la presente. Asf, se emplean anticuerpos o antisueros, preferiblemente antisueros policlonales y lo mas preferiblemente anticuerpos monoclonales especfficos para cada marcador, para detectar la expresion. Los anticuerpos pueden detectarse marcando de forma directa los anticuerpos en sf mismos, por ejemplo, con marcadores radiactivos, marcadores fluorescentes, marcadores de haptenos, tales como biotina, o una enzima tal como peroxidasa de rabano picante o fosfatasa alcalina. De forma alternativa, se usa un anticuerpo primario no marcado junto con un anticuerpo secundario marcado, que comprende antisueros, antisueros policlonales o un anticuerpo monoclonal especffico para el anticuerpo primario. Los protocolos y equipos de inmunohistoqufmica se conocen bien en la tecnica y estan disponibles en el mercado.
Puede emplearse la proteomica para analizar los polipeptidos presentes en una muestra (por ejemplo, de tejido, organismo o cultivo celular) en un cierto momento. En particular, las tecnicas proteomicas pueden usarse para evaluar los cambios globales de expresion de polipeptidos en una muestra (tambien denominado proteomica de expresion). El analisis proteomico incluye generalmente: (1) separacion de polipeptidos individuales en una muestra por electroforesis en gel 2-D (2-D PAGE); (2) identificacion de los polipeptidos individuales recuperados del gel, por ejemplo, por espectrometrfa de masas o secuenciacion N-terminal, y (3) analisis de los datos usando bioinformatica. Los metodos proteomicos son complementos valiosos para otros metodos de formacion de perfiles de expresion genica, y pueden usarse, solos o en combinacion con otros metodos, para detectar los productos de los marcadores de proliferacion descritos en la presente.
Metodos de hibridacion empleando sondas de acidos nucleicos selectivas para un marcador
Estos metodos implican unir la sonda de acido nucleico a un soporte e hibridar bajo condiciones apropiadas con ARN o ADNc derivado de la muestra de ensayo (Sambrook, J., E. Fritsch, E. y T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (2001)). Estos metodos pueden aplicarse a GTM derivados de un tejido tumoral o muestra de fluido. Las preparaciones de ARN o ADNc generalmente se marcan con una molecula fluorescente o radiactiva para permitir la deteccion y la cuantificacion. En algunas aplicaciones, el ADN hibridante puede marcarse con una estructura ramificada marcada con fluorescencia para potenciar la intensidad de la senal (Nolte, F.S., Branched DNA signal amplification for direct quantitation of nucleic acid sequences in clinical specimens, Adv. Clin. Chem., 33, 201-235 (1998)). El marcador no hibridado se retira mediante un lavado a fondo con disoluciones de baja salinidad, tales como 0,1x SSC, 0,5% de SDS antes de cuantificar la cantidad de hibridacion mediante deteccion de fluorescencia o densitometrfa de imagenes de gel. Los soportes pueden ser solidos, tales como nailon o membranas de nitrocelulosa, o consistir en microesferas o esferas que se hibridan cuando se encuentran en una suspension lfquida. Para permitir el lavado y la purificacion, las esferas pueden ser magneticas (Haukanes, B-1 y Kvam, C., Application of magnetic beads in bioassays, Bio/Technology, 11, 60-63 (1993)) o pueden estar marcadas por fluorescencia para permitir una citometrfa de flujo (vease, por ejemplo: Spiro, A., Lowe, M. y Brown, D., A Bead-Based Method for Multiplexed Identification and Quantitation of dNa Sequences Using Flow Cytometry, Appl. Env. Micro., 66, 4258-4265 (2000)).
Una variacion de la tecnologfa de la hibridacion es el ensayo QuantiGene Plexe (Genospectra, Fremont) que combina un soporte de esferas fluorescentes con una amplificacion de la senal del ADN ramificado. Otra variacion de la tecnologfa de la hibridacion es el ensayo de ARNm Quantikine® (R&D Systems, Minneapolis). La metodologfa se describe en las instrucciones del fabricante. Brevemente, el ensayo emplea sondas de hibridacion oligonucleotfdicas conjugadas con digoxigenina. La hibridacion se detecta empleando anticuerpos anti-digoxigenina acoplados a fosfatasa alcalina en ensayos colorimetricos.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Otros metodos son muy conocidos en la tecnica y no es necesario describirlos con mas detalle en la presente. Ensayos inmunologicos ligados a enzimas (ELISA)
Brevemente, en los ensayos de ELISA en "sandwich", un anticuerpo policlonal o monoclonal contra el GTM se une a un soporte solido (Crowther, J.R., The ELISA guidebook. Humana Press: Nueva Jersey (2000); Harlow, E. y Lane, D., Using antibodies: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (1999)) o esferas en suspension. Otros metodos son muy conocidos en la tecnica y no es necesario describirlos con mas detalle en la presente. Los anticuerpos monoclonales pueden derivarse de hibridomas o seleccionarse de bancos de anticuerpos de fagos (Hust M. y Dubel S., Phage display vectors for the in vitro generation of human antibody fragments, Methods Mol. Biol., 295:71-96 (2005)). Los sitios de union no especffica se bloquean con detergentes y preparaciones de protefnas que no son la diana. Despues el anticuerpo de captura se incuba con una preparacion de muestra o tejido del paciente que contiene el antfgeno de GTM. La mezcla se lava antes de que el complejo de antfgeno/anticuerpo se incube con un segundo anticuerpo que detecta el GTM diana. El segundo anticuerpo generalmente esta conjugado con una molecula fluorescente u otra molecula indicadora que puede detectarse en una reaccion enzimatica o con un tercer anticuerpo conjugado con un indicador (Crowther, Id.). Como alternativa, en ELISA directos, la preparacion que contiene el GTM puede unirse al soporte o esfera, y el antfgena diana puede detectarse directamente con un conjugado de anticuerpo-indicador (Crowther, Id.).
Los metodos para producir anticuerpos monoclonales y antisueros policlonales son muy conocidos en la tecnica y no es necesario describirlos con mas detalle en la presente.
Inmunodeteccion
Los metodos tambien pueden emplearse para la inmunodeteccion de miembros de la familia de marcadores en suero o plasma procedente de pacientes con cancer gastrico antes y despues de una cirugfa para retirar el tumor, una inmunodeteccion de miembros de la familia de marcadores en pacientes con otros canceres que incluyen, pero no se limitan a cancer colorrectal, pancreatico, ovarico, melanoma, de hfgado, esofagico, de estomago, endometrial y de cerebro, y la inmunodeteccion de miembros de la familia de marcadores en orina y deposiciones de pacientes con cancer gastrico.
Los GTM tambien pueden detectarse en tejidos o muestras empleando otras tecnicas de inmunodeteccion convencionales, tales como inmunotransferencia o inmunoprecipitacion (Harlow, E. y Lane, D., Using antibodies: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (1999)). En la inmunotransferencia, las preparaciones de protefnas de tejido o fluido que contiene el GTM se someten a una electroforesis a traves de geles de poliacrilamida bajo condiciones desnaturalizantes o no desnaturalizantes. Las protefnas despues se trasladan a un soporte de membrana, tal como nailon. El GTM despues se hace reaccionar directa o indirectamente con anticuerpos monoclonales o policlonales segun se describen para la inmunohistoqufmica. Como alternativa, en algunas preparaciones, las protefnas pueden rociarse directamente sobre membranas sin una separacion electroforetica previa. La senal puede cuantificarse mediante densitometrfa.
En la inmunoprecipitacion, una preparacion soluble que contiene el GTM se incuba con un anticuerpo monoclonal o policlonal contra el GTM. La reaccion despues se incuba con esferas inertes fabricadas de agarosa o poliacrilamida con protefna A o protefna G unida covalentemente. Las esferas de protefna A o de protefna G interaccionan especfficamente con los anticuerpos que forman un complejo inmovilizado de anticuerpo-GTM-antfgeno unido a la esfera. Despues de lavar, el GTM unido puede detectarse y cuantificarse mediante inmunotransferencia o ELISA.
Determinacion del umbral
Para los ensayos que emplean GTM, se obtendran umbrales que permitiran denominar a una muestra positiva o negativa para el cancer gastrico. Estos umbrales seran determinados mediante el analisis de cohortes de pacientes que esten siendo investigados para la presencia del cancer gastrico. Los umbrales pueden variar para diferentes aplicaciones de ensayo; por ejemplo, los umbrales para la utilizacion del ensayo en la seleccion de una poblacion se determinaran empleando cohortes de pacientes que esten en gran parte exentos de sfntomas urologicos, y estos umbrales pueden ser diferentes de los utilizados en ensayos para pacientes que estan siendo observados para la recurrencia del cancer gastrico. Puede seleccionarse un umbral para proporcionar un nivel practico de especificidad de ensayo en el emplazamiento clfnico necesario, es decir, una especificidad que permita una sensibilidad razonable sin que un numero excesivo de pacientes reciban resultados falsos positivos. Esta especificidad puede estar en el intervalo del 80-90%. Un metodo alternativo para obtener un umbral de ensayo es representar graficamente la sensibilidad frente a la especificidad para diferentes umbrales de ensayo (curvas ROC) y despues seleccionar el punto de inflexion de la curva.
Como alternativa a los umbrales individuales, el ensayo puede emplear intervalos de ensayo, que proporcionan diferentes grados de probabilidad de la presencia de la enfermedad y que tienen diferentes consecuencias clfnicas asociadas a ellos. Por ejemplo, un ensayo puede tener tres intervalos; uno asociado con un alto riesgo (por ejemplo, 90%) de presencia de cancer gastrico, un segundo asociado con un bajo riesgo de cancer gastrico, y un tercero considerado como sospechoso de enfermedad. El intervalo "sospechoso" puede asociarse con una recomendacion para repetir el ensayo en un periodo de tiempo definido.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Anticuerpos contra marcadores del cancer gastrico
En la presente tambien se describe la preparacion de anticuerpos contra GTM. Empleando los metodos descritos en la presente pueden identificarse nuevos GTM empleando metodos de micromatrices y/o qRT-PCR. Tras haber identificado un marcador putativo, este puede producirse en una cantidad suficiente para que pueda suscitar una respuesta inmunologica. En algunos casos, puede utilizarse un GTM de longitud completa, y en otros, un fragmento peptfdico de un GTM puede ser suficiente como inmunogeno. El inmunogeno puede inyectarse en un hospedante adecuado (por ejemplo, raton, conejo, etc.) y si se desea puede inyectarse un adyuvante, tal como adyuvante incompleto de Freund, para aumentar la respuesta inmunologica. Se apreciara que la preparacion de anticuerpos es algo habitual en la tecnica inmunologica y no es necesario describirla mas fondo en la presente. Como resultado, se pueden producir anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales o de presentacion de fagos, contra GTM identificados empleando los metodos descritos en la presente.
En otras realizaciones, pueden prepararse anticuerpos contra la protefna o el nucleo de la protefna de los marcadores tumorales identificados en la presente, o contra una secuencia oligonucleotfdica exclusiva de un GTM. Aunque ciertas protefnas pueden estar glicosiladas, las variaciones en el patron de glicosilacion, en ciertas circunstancias, pueden conducir a la no deteccion de formas de GTM que no presentan los patrones de glicosilacion habituales. Asf, los inmunogenos de GTM pueden incluir GTM desglicosilado o fragmentos de GTM desglicosilados. La desglicosilacion puede lograrse empleando una o mas glicosidasas conocidas en la tecnica. Como alternativa, el ADNc de GTM puede expresarse en lfneas celulares deficientes en la glicosilacion, tales como lfneas de celulas procariotas, que incluyen E. coli y similares.
Pueden prepararse vectores que tengan en su interior oligonucleotidos que codifican GTM. Muchos de estos vectores pueden basarse en vectores convencionales conocidos en la tecnica. Los vectores pueden utilizarse para transfectar una diversidad de lfneas celulares para producir lfneas celulares que producen GTM, que pueden emplearse para producir las cantidades deseadas de GTM para el desarrollo de anticuerpos especfficos u otros reactivos para la deteccion de GTM o para la estandarizacion de ensayos desarrollados para GTM.
Kits
Basandose en los descubrimientos descritos en la presente pueden preverse y producirse varios tipos de kits de ensayo. En primer lugar, pueden fabricarse kits que tengan un dispositivo de deteccion precargado con una molecula de deteccion (o "reactivo de captura"). En realizaciones para la deteccion de ARNm de GTM, estos dispositivos pueden comprender un sustrato (por ejemplo, vidrio, silicio, cuarzo, metal, etc.) sobre el cual se unen oligonucleotidos como reactivos de captura que se hibridan con el ARNm que se va a detectar. En algunas realizaciones, puede lograrse la deteccion directa del ARNm mediante la hibridacion del ARNm (marcado con cy3, cy5, un marcador radiactivo u otro marcador) a los oligonucleotidos sobre el sustrato. En otras realizaciones, puede lograrse la deteccion del ARNm fabricando, en primer lugar, un ADN complementario (ADNc) con el ARNm deseado. Despues, el ADNc marcado puede hibridarse con los oligonucleotidos sobre el sustrato y detectarse.
Los anticuerpos tambien pueden emplearse en kits como reactivos de captura. En algunas realizaciones, un sustrato (por ejemplo, una placa de multiples pocillos) puede tener unido un reactivo de captura especffico de GTM. En algunas realizaciones, un kit puede incluir un reactivo bloqueante. Los reactivos bloqueantes pueden emplearse para reducir la union no especffica. Por ejemplo, la union de oligonucleotidos no especfficos puede reducirse empleando ADN en exceso proveniente de cualquier fuente adecuada que no contenga oligonucleotidos de GTM, tal como ADN de esperma de salmon. La union de anticuerpos no especfficos puede reducirse empleando un exceso de protefna bloqueante, tal como albumina de suero. Se apreciara que en la tecnica se conocen numerosos metodos para detectar oligonucleotidos y protefnas, y que puede emplearse cualquier estrategia que detecte especfficamente moleculas asociadas con GTM.
Los anticuerpos tambien pueden emplearse cuando estan unidos a un soporte solido, por ejemplo, empleando un chip de anticuerpos, que permite la deteccion de multiples marcadores con un unico chip.
Ademas de un sustrato, un kit de ensayo puede comprender reactivos de captura (tales como sondas), disoluciones de lavado (por ejemplo SSC, otras sales, tampones, detergentes y similares), asf como restos de deteccion (por ejemplo, cy3, cy5, marcadores radiactivos y similares). Los kits tambien pueden incluir instrucciones para su uso y un envase.
Los marcadores del cancer pueden detectarse en una muestra empleando cualquier tecnica adecuada y pueden incluir, pero no se limitan a sondas oligonucleotfdicas, qPCR o anticuerpos generados contra marcadores del cancer.
Se apreciara que la muestra que se va a ensayar no se limita a una muestra del tejido sospechoso de ser un tumor. El marcador puede ser segregado hacia el suero u otro fluido corporal. Por tanto, una muestra puede incluir cualquier muestra corporal, e incluye muestras de biopsias, sangre, suero, lavados peritoneales, fluido cerebroespinal, orina y deposiciones.
Tambien se apreciara que la presente descripcion no se limita a la deteccion del cancer en seres humanos, sino que es adecuada para la deteccion del cancer en cualquier animal que incluye, pero no se limita a perros, gatos,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
caballos, ganado vacuno, ovejas, ciervos, cerdos y cualquier otro animal del cual se sabe que puede padecer cancer.
Ensayos para marcadores del cancer gastrico en fluidos corporales
En varias realizaciones, los ensayos para GTM pueden realizarse de modo deseable en muestras obtenidas de sangre, plasma, suero y fluido peritoneal obtenido, por ejemplo, empleando lavados peritoneales, u otros fluidos corporales, tales como orina, linfa, fluido cerebroespinal, fluido gastrico o muestras de deposiciones.
En general, los metodos de ensayo para detectar oligonucleotidos, protefnas y peptidos en estos fluidos son conocidos en la tecnica. La deteccion de oligonucleotidos puede realizarse empleando metodos de hibridacion, tales como transferencias Northern, transferencias Southern o metodos de micromatrices, o qPCR. Los metodos para detectar protefnas incluyen ensayos inmunoadsorbentes ligados a enzimas (ELISA), chips de protefnas que portan anticuerpos, radioinmunoensayo de esferas en suspension (RIA), transferencia Western y union de lectina. Sin embargo, como ilustracion, los niveles en fluidos de un GTM pueden cuantificarse empleando un ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas de tipo "sandwich" (ELISA). Para los ensayos de plasma, se anaden 5 uL de una parte alfcuota de una muestra diluida de modo adecuado o un patron de GTM diluido en serie y 75 uL de anticuerpo anti-GTM humano conjugado con peroxidasa a los pocillos de una placa de microtitulacion. Despues de un periodo de incubacion de 30 minutos a 30 °C, los pocillos se lavan con 0,05% de Tween 20 en disolucion salina tamponada con fosfato {PBS) para eliminar el anticuerpo no unido. Los complejos unidos de GTM y anticuerpo anti- GTM despues se incuban con o-fenilendiamina que contiene H2O2 durante 15 a 30 °C. La reaccion se detiene anadiendo H2SO4 1 M y se mide la absorbancia a 492 nm con un lector de placas de microtitulacion.
Se apreciara que los anticuerpos anti-GTM pueden ser anticuerpos monoclonales o antisuero policlonal. Tambien se apreciara que puede estudiarse cualquier otro fluido corporal de modo adecuado.
No es necesario que un marcador se segregue, en sentido fisiologico, para que sea util. Por el contrario, cualquier mecanismo mediante el cual un gen o protefna de marcador entra en el suero puede resultar eficaz para producir un nivel detectable y cuantificable del marcador. Asf, la secrecion normal de protefnas solubles desde las celulas, el desprendimiento de protefnas de membrana desde las membranas plasmaticas, la secrecion de formas de ARNm cortadas y empalmadas de modo alternativo o las protefnas expresadas a partir de estas, y la muerte celular (que puede ser apoptotica) pueden producir unos niveles suficientes de marcador que sean utiles.
Cada vez existen mas pruebas del uso de marcadores del suero como herramientas para diagnosticar y/o evaluar la eficacia de una terapia para una diversidad de tipos de cancer.
Yoshikawa et al. (Cancer Letters, 151: 81-86 (2000) describen el inhibidor tisular de la metaloproteinasa de matriz-1 en el plasma de pacientes con cancer gastrico.
Rudland et al. (Cancer Research, 62: 3417-3427 (2002) describen la osteopontina como una protefna asociada a metastasis en el cancer de mama humano.
Buckhaults et al. (Cancer Research, 61:6996-7001 (2002)) describen ciertos genes de la superficie celular y segregados en tumores colorrectales.
Kim et al. (JAMA, 287(13): 1671-1679 (2002)) describen la osteopontina como un biomarcador de diagnostico potencial para el cancer de ovario.
Hotte et al. (A.J. American Cancer Society, 95(3): 507-512 (2002)) describen la osteopontina plasmatica como una protefna detectable en fluidos corporales humanos que esta asociada con ciertas malignidades.
Martin et al. (Prostate Cancer Prostatic Dis., 9 de marzo, 2004 (PMID: 15007379) (resumen)) describen el uso de la calicrefna 2 humana, el antfgeno especffico de prostata (PSA) y el PSA libre como marcadores para la deteccion del cancer de prostata.
Hall et al. (Laryngoscope, 113(1): 77-81 (2003) (PMID: 12679418) (resumen)) describen el valor predictivo de la tiroglobulina de suero en el cancer de tiroides.
Mazzaferri et al. (J. Clin. Endocrinol. Metab., 88(4): 1433-1441 (2003) (resumen)) describen la tiroglobulina como un metodo de control potencial para pacientes con carcinoma de tiroides.
Whitley et al. (Dim. Lab. Med., 24(1): 29-47 (2004) (resumen)) describen la tiroglobulina como un marcador serico para el carcinoma de tiroides.
Kuo et al. (Clin. Chim. Acta., 294(1-2): 157-168 (2000) (resumen)) describen la metaloproteinasa de matriz-2 y -9 sericas en pacientes infectados por HCF y HBV.
Koopman et al. (Cancer Epidemiol. Biomarkers Prey, 13(3): 487-491 (2004) (resumen)) describen la osteopontina como un biomarcador para el adenocarcinoma pancreatico.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Pellegrini et al. (Cancer Immunol. Immunother., 49(7): 388-394 (2000) (resumen)) describen mediciones del antfgeno carcinoembrionario soluble y TIMP 1 como marcadores para el cancer colorrectal preinvasivo.
Melle et al. (Clin. Chem., 53(4), 629-635 (2007) (resumen)) describen HSP27 como marcador serico para el adenocarcinoma pancreatico.
Leman et al. (Urology, 69(4), 714-20 (2007) (resumen)) describen EPCA-2 como marcador serico para el cancer de prostata.
Tsigkou et al. (I. Clin. Endocrinol. Metab., 92(7), 2526-31 (2007) (resumen)) describen la inhibina total como marcador serico potencial para el cancer de ovario.
Marchi et al. (Cancer, 112, 1313-1324 (2008) (resumen)) describen la proapolipoprotefna Al como marcador serico de la metastasis cerebral en pacientes con cancer de pulmon.
Metodos
Se emplearon los siguientes metodos generales para evaluar la idoneidad de diversas estrategias para la identificacion molecular de marcadores asociados con tumores gastricos.
Recoleccion de tumores
Se recolectaron muestras de tumores gastricos y tejidos gastricos no malignos de especfmenes quirurgicos extrafdos en Seoul National University Hospital. El diagnostico del cancer gastrico se realizo basandose en los sfntomas, los descubrimientos ffsicos y el examen histologico de los tejidos.
Extraccion de ARN
En algunas realizaciones, la expresion de genes asociados con los tumores gastricos se analizo determinando los niveles de ARN en muestras tomadas de tumores. Especfmenes quirurgicos congelados se introdujeron en medio OCT. Se cortaron secciones de 60 micrometros de los bloques de tejidos empleando un microtomo, se homogeneizaron en una mezcla de TriReagent:agua (3:1), y despues se extrajeron en cloroformo. Despues el ARN total se purified de la fase acuosa empleando el procedimiento RNeasy™ (Qiagen). En total, se extrajo ARN de 58 muestras de tumores gastricos y 58 muestras de tejido gastrico no maligno ("normal") y se empleo en el analisis de micromatrices descrito a continuacion. Tambien se extrajo ARN de 16 lfneas de celulas de cancer y se reunio para actuar como ARN de referencia.
Preparacion de los portaobjetos de la micromatriz
Se obtuvieron portaobjetos de vidrio revestidos con epoxi en MWG Biotech AG, Ebersberg, Alemania, y fueron impresos con aproximadamente 30.000 oligonucleotidos 50-meros empleando un robot de construccion de micromatrices Gene Machines, segun el protocolo del fabricante.
Marcaje e hibridacion del ARN
El ADNc se transcribio a partir de 10 ug de ARN total empleando la transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen) en reacciones que contenfan 5-(3 -aminoalil)-2'-desoxiuridina-5'-trifosfato. La reaccion entonces se desionizo en una columna Microcon antes de incubarse con Cy3 o Cy5 en tampon bicarbonato durante 1 hora a temperatura ambiente. Los tintes no incorporados se retiraron empleando una columna Qiaquick (Qiagen) y la muestra se concentro hasta 15 ul en un SpeedVac. Entonces los ADNc marcados con Cy3 y Cy5 se mezclaron con tampon Ambion ULTRAhyb, se desnaturalizaron a 100 °C durante 2 minutos y se hibridaron con los portaobjetos de las micromatrices en camaras de hibridacion a 42 °C durante 16 horas. Los portaobjetos despues se lavaron y se barrieron dos veces en un escaner Axon 4000A con dos ajustes de potencia para producir los datos de fluorescencia primarios sobre la expresion genica.
Procedimiento de normalizacion
Para medir la expresion de los genes del cancer en tumores y tejidos no cancerosos, se corrigieron las medianas de las intensidades de fluorescencia mediante el software GenepixTm mediante la resta de las intensidades de fluorescencia del fondo local. Se excluyeron las manchas con una intensidad corregida del fondo menor que cero. Para facilitar la normalizacion, las proporciones de intensidad y las intensidades de las manchas globales se transformaron logarftmicamente. Las proporciones de intensidad transformadas logarftmicamente se corrigieron para el sesgo del tinte y espacial empleando una regresion local aplicada en el paquete LOCFITTm. Las proporciones de intensidad transformadas logarftmicamente se regresaron simultaneamente con respecto a la localizacion y la intensidad de las manchas global. Los residuales de la regresion local proporcionaron los cambios corregidos en numero de veces logarftmicas. Para el control de calidad, las proporciones de cada micromatriz normalizada se representaron graficamente con respecto a la intensidad de las manchas y la localizacion. Las graficas despues se inspeccionaron de modo visual para detectar posibles artefactos remanentes. Ademas, se aplico un modelo de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
analisis de la varianza (ANOVA) para la deteccion del sesgo de la punta de la horquilla. Todos los resultados y parametros de la normalizacion se insertaron en una base de datos Postgres para el analisis estadfstico.
Seleccion de los marcadores
Los datos de la expresion de genes en micromatrices para cada uno de los 29.718 genes se clasificaron segun la intensidad relativa de la senal para cada gen en tejido tumoral y no maligno. Los posteriores analisis se limitaron a (i) los genes que codifican protefnas segregadas, (ii) los genes con una clasificacion de intensidad en tejido tumoral mayor que la observada para el gen (CEACAM5) que codifica el marcador tumoral existente CEA, y (iii) los genes sin expresion significativa en sangre o tejido vascular, segun se determina mediante los recuentos EST en la base de datos Unigene (Wheeler D.L. et al., 2003). Se predijeron las protefnas segregadas identificando las transcripciones que se espera que contengan un peptido senal N-terminal. Las protefnas con helices transmembrana previstas que no estaban en los 20 primeros aminoacidos N-terminales [Krogh A. et al., 2001] se rechazaron. Se predijeron otras localizaciones subcelulares empleando TARGETP [Emanuelsson O. et al., 2000].
Los numeros de referencia (MWG oligo n.°) para los oligonucleotidos pertinentes y las secuencias de referencia de protefnas y ARNm de NCBI de los GTM seleccionados se muestran en la figura 1. La figura 1 tambien muestra la clasificacion de intensidad de los GTM en tejido tumoral y no maligno. A continuacion se muestran las secuencias de ADN completas de los GTM de esta invencion.
PCR a tiempo real cuantitativa
En otras realizaciones puede utilizarse una PCR a tiempo real o cuantitativa (qPCR) para la cuantificacion absoluta o relativa del numero de copias del molde de PCR. El conjunto de cebadores para MUC17 (Directo: GAGGTGGTCAGCAGCATTGAC; Inverso: CCTGGGAAGAGTGGTTTTTTAGC) se diseno empleando Primer Express V 2.0TM (Applied Biosystems) y el producto amplificado se detecto empleando marcaje verde SYBR. El ZG16 se representa por el ensayo de expresion Assay-on-Demand™ Hs.00380609_ml (Applied Biosystems). La amplificacion se realizo en un sistema de deteccion de secuencias ABI Prism™ 7000 bajo condiciones de ciclacion convencionales.
Se realizaron ensayos en dos placas de 96 pocillos y cada muestra de ARN esta representada por un unico ADNc. Se analizaron hasta 45 muestras de ARN procedente de tumores gastricos y tejido gastrico no maligno. Cada placa contiene una curva patron de ADNc de referencia, a lo largo de un intervalo de concentracion de 625 veces, por duplicado. El analisis consiste en calcular el ACT (CT del gen diana - media del CT del ADNc de referencia). El ACT es directamente proporcional al cambio en numero de veces log2 negativo. Los cambios en numero de veces log2 con relacion a la mediana del cambio en numero de veces log2 no maligno se calcularon (cambio en numero de veces log2 - mediana del cambio en numero de veces log2 normal). Estos cambios en numero de veces entonces se agruparon en clases de frecuencia y se representaron graficamente.
Expresion de protefnas y generacion de anticuerpos
Para validar ZG16 al nivel de protefnas fue necesario generar nuevos anticuerpos contra la protefna recombinante. La region codificadora 17-167 de ZG16 se amplifico mediante PCR a partir del ADNc de una lfnea celular humana empleando el cebador director CACCAATGCCATTCAGGCCAGGT y el cebador inverso TCAGCATCTGCTGCAGCTA. El producto de la PCR se purifico en gel y se clono en el vector de entrada "Gateway" "pENTR/dTOPO" de Invitrogen antes de ser secuenciado para verificar la insercion correcta. Utilizando el sistema "Gateway", el ZG16 se clono desde pENTR/dTOPO al vector de expresion de Invitrogen pDEST17 que contiene un marcador 6xHIS N-terminal. La expresion de ZG16 se realizo en celulas BL21-AI E.coli (Invitrogen), las celulas se cultivaron a 37 °C en un agitador hasta que alcanzaron la fase semilogarftmica (OD600 = 0,5), tras lo cual se indujeron a una concentracion final de 0,2% de arabinosa y se cultivaron durante 3 horas mas a 37 °C en un agitador. Las celulas se recolectaron mediante una centrifugacion a 6000 x g durante 15 minutos y se rechazo el sobrenadante. Las celulas se resuspendieron en PBS (pH 7,0) y se lisaron mediante sonicacion empleando una celula Sonics Vibra a 60% de potencia. Las celulas lisadas se aclararon mediante una centrifugacion a 12000 x g durante 10 minutos y se rechazo el sobrenadante. El sedimento celular se lavo tres veces en tampon PBS (pH 7,0) que contenfa 0,5% de Triton X-100, seguido de un lavado con PBS (pH 7,0). Despues, el sedimento se lavo otra vez mas empleando urea 8 M en PBS (pH 7,0). Cada etapa de lavado se aclaro mediante una centrifugacion a 12000 x g y se rechazo el sobrenadante. Despues el sedimento se solubilizo en tampon de solubilizacion que contenfa TRIS 10 mM (pH 8,0), urea 8 M, NaCl 100 mM durante la noche a temperatura ambiente. El tampon de solubilizacion se volvio a centrifugar a 12000 x g, se filtro a traves de una membrana de 0,45 nm y se cargo en una columna de NiSepharose prelavada con tampon de lavado que contenfa PBS (pH 7,0), urea 8 M e imidazol 20 mM. Despues de cargar, la columna se lavo con 10 volumenes de columna de tampon de lavado y las protefnas solubilizadas se eluyeron en tampon de lavado, suplementado con imidazol 500 mM. Las protefnas eluidas se desalaron en PBS (pH 7,0) y tampon urea 8 M y despues se volvieron a plegar mediante la dilucion gota a gota en tampon de replegamiento que contenfa acetato de sodio 50 mM (pH 4.5), NDSB-201 0,1 M, glicerol al 10%, GSH/GsSH 1 mM/0,1 mM. El tampon de replegamiento se aclaro mediante centrifugacion a 12000 x g y las protefnas replegadas se concentraron utilizando filtros Centriprep con un lfmite de exclusion nominal de 10 KDa (Millipore). Las protefnas replegadas se sometieron a un intercambio de tampon en un tampon que contenfa acetato de sodio 100 mM (pH
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
5,0) suplementado con glicerol al 10% empleando una columna de desalacion G25 y se conservaron partes alfcuotas a -80 °C. El analisis de un gel de SDS al 10%-PAGE con tincion de Coomassie y un analisis de la transferencia Western indicaron colectivamente la presencia de una protefna marcada con His de 18 KDa con hasta 95% de pureza. La banda tenida con Coomassie de 18 KDa se corto, y se determino mediante MALDI-TOF/TOF MS/MS que contenfa ZG16.
Se obtuvieron anticuerpos contra ZG16 mediante inmunoadsorcion de un banco de anticuerpos de presentacion de fagos con la protefna ZG16 purificadas (Antibodies by Design; una division de Morphosys AG, Alemania,
www.morphosys.com).
Micromatrices de anticuerpos
Se emplearon matrices de anticuerpos para validar los marcadores candidatos. Se obtuvieron muestras de suero de pacientes con cancer gastrico, cancer colorrectal (antes y despues de una cirugfa) y de pacientes quirurgicos con una enfermedad no maligna. Las muestras fueron entregadas por Dunedin Public Hospital, Nueva Zelanda, y el banco de tejidos de the Christchurch Cancer Society, Christchurch, Nueva Zelanda. Los anticuerpos contra ZG16 y MUC17 que se obtuvieron de fuentes comerciales o se seleccionaron de bancos de fagos (Morphosys) se imprimieron sobre portaobjetos de vidrio (Schott Nexterion Slide H) empleando el robot de matrices GeneMachines OmniGrid 100. Cada matriz se rodeo con un trazo de un rotulador hidrofobo. Los portaobjetos despues se lavaron en 3X PBS-0,5% de Tween 20 (3X PBS-T) antes de bloquear con etanolamina 50 mM en tampon borato de sodio 50 mM, pH 8,0, seguido de un tampon bloqueante de caseinato (3X PBS-T, caseinato de sodio al 1%). Entonces se anadieron las muestras de suero marcadas con biotina a los portaobjetos antes de una incubacion durante la noche a 4 °C. Despues los portaobjetos se lavaron en 3X PBS-T antes de secarse al aire. Despues se detecto el anticuerpo unido empleando una amplificacion de cfrculo rodante (RCA), en gran medida tal como se ha descrito previamente (Haab B.B., Lizardi P.M., RCA-enhanced protein detection arrays, Methods Mol. Biol., 2006, 328: 15-29). Brevemente, los portaobjetos se incubaron con anticuerpos anti-biotina que se habfan conjugado con un cebador oligonucleotfdico (5' - cCt GGT GCT CAA ATT TCA GtT CTG C - 3'). Entonces un molde de ADN circular se hibrido con los portaobjetos a 37 °C durante 30 min en una camara sellada humidificada antes de lavar los portaobjetos en concentraciones decrecientes de PBS-T (3X PBS-0,05% de Tween 20, 1X PBS-0,05% de Tween 20 y 0,1X PBS-0,05% y Tween 20) y se secaron. Despues el molde se extendio empleando phi29 a 30 °C durante 3 hr antes de la lavar los portaobjetos y secar mediante centrifugacion. El molde amplificado despues se detecto empleando sondas marcadas con fluorescencia homologas. Los portaobjetos se barrieron con un escaner Axon 4000A y se midio la senal con el software GenePix Pro 6.1.0.4.
Se ajusto la intensidad de fluorescencia de Cy5 empleando una normalizacion de cuantiles, empleando la funcion normalizeBetweenArrays del paquete limma (Smith, 2005) para R (el paquete R para el calculo estadfstico (R Development Core). La normalizacion de cuantiles ajusta los valores de las intensidades de modo que la distribucion de las intensidades es la misma para cada bloque (cada bloque se corresponde con una muestra distinta) ajustando los cuantiles de las intensidades de los diferentes bloques al mismo valor. La clasificacion de cada valor de intensidad no cambia durante este procedimiento, solo la magnitud relativa de las intensidades. Se supone que la funcion de distribucion de probabilidad subyacente que describe el intervalo de concentracion de antfgeno es la misma para todas las muestras. Este procedimiento mejora el promedio de correlacion de senales entre bloques a traves de todas las muestras y tambien cuando se consideran solo los bloques de referencia, lo cual indica una mejora en la calidad de los datos. Las manchas marcadas con Genepix se retiraron antes de tomar la mediana a traves de los duplicados para obtener las intensidades normalizadas para cada anticuerpo.
Asf, los inventores han identificado tres genes y/o protefnas que son utiles para desarrollar reactivos, dispositivos y kits para detectar y evaluar el cancer gastrico. Pueden utilizarse uno o mas marcadores, por si solos o en combinacion para proporcionar un ensayo molecular fiable para el cancer gastrico.
Ejemplos
Los ejemplos descritos en esta memoria son con proposito de ilustrar realizaciones de la invencion. Otras realizaciones, metodos y tipos de analisis estan dentro del alcance de los expertos en las tecnicas de diagnostico molecular y no necesitan describirse con mas detalle en la presente.
Ejemplo 1: Identificacion de marcadores para una malignidad gastrica
Se seleccionaron marcadores empleando los datos de expresion genica obtenidos de las muestras de tumores gastricos y no malignos. Se emplearon los siguientes criterios para la seleccion de marcadores: (i) la presencia de una secuencia senal caracterfstica de una protefna segregada, (ii) la clasificacion de intensidad de la senal de la micromatriz en el tejido tumoral, y (iii) los niveles de EST correspondientes en la sangre o en tejidos vasculares. El uso de estos criterios permite la identificacion de marcadores segregados que se expresan en abundancia en tejido tumoral, pero que es probable que tengan un fondo bajo en suero, sangre o plasma. La figura 1 ofrece una tabla que muestra los tres marcadores para la malignidad gastrica seleccionados empleando los anteriores criterios, MUC5AC, MUCI7 y ZG16. La figura 1 incluye el sfmbolo para el gen ("sfmbolo"), el MWG oligo n.°, el numero de secuencia de referencia de ARNm de NCBI, el numero de secuencia de referencia de la protefna, la clasificacion de intensidad del
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
gen en las micromatrices obtenidas empleando tejido tumoral, y la clasificacion de intensidad del gen en las micromatrices obtenidas empleando tejido no maligno. Los tres GTM mostraban una mayor clasificacion de expresion (intensidad) que CEACAM5, el gen que codifica el marcador del cancer gastrico existente CEA. La clasificacion de expresion mas baja posible es de 29.718. El estudio de la clasificacion tambien demuestra que la expresion de estos GTM en tejido tumoral es comparable al tejido no maligno, lo cual indica que los genes no habfan sido fuertemente infrarregulados durante la carcinogenesis. Los recuentos Unigene EST (Wheeler et al., 2003) para los tres GTM en sangre y tejido vascular fueron todos cero.
Ejemplo 2: Analisis de qRT-PCR
Se confirmo la abundancia e identidad de los GTM ZG16 y MUC17 en tejido tumoral empleando la tecnica de cuantificacion de expresion genica mas sensible y precisa qPCR. Hasta 45 muestras de tumores gastricos y el mismo numero de muestras de tejido gastrico no maligno de los mismos pacientes se analizo mediante RT-qPCR empleando los cebadores y las sondas descritas en la seccion de metodos. La expresion de estos genes se cuantifico empleando el numero de ciclos de PCR necesarios para alcanzar un nivel umbral de amplificacion del producto (Ct).
El analisis de qPCR confirmo los datos de las matrices: ambos marcadores se detectaron con facilidad en tejido tumoral mediante qPCR y no se obtuvieron pruebas de una disminucion significativa en la expresion en tejido tumoral, comparado con tejido no maligno. La abundancia de estos ARN en tejido tumoral, comparado con tejido no maligno, se ilustra mediante los histogramas en la figura 2a-b.
Ejemplo 3: Deteccion de protefnas de marcadores de tumores gastricos en suero
En ciertas realizaciones, la deteccion de protefnas de GTM puede lograrse empleando anticuerpos dirigidos contra la protefna completa, un fragmento de la protefna (peptido) o el nucleo de la protefna. Los metodos para detectar y cuantificar la expresion de protefnas y peptidos son conocidos en la tecnica y pueden incluir metodos que se basan en anticuerpos especfficos generados contra la protefna o el peptido. Pueden prepararse anticuerpos monoclonales y antisueros policlonales empleando metodos que son muy conocidos en la tecnica y no es necesario describirlos con mas detalle en la presente.
Para detectar los GTM en suero, los anticuerpos contra los GTM se imprimieron sobre portaobjetos de vidrio empleando un robot Gene Machine OmniGrid ™. Cada anticuerpo se repitio 8 veces en la matriz. Despues se marcaron con biotina muestras de suero procedentes de 33 pacientes con cancer gastrico y 41 controles antes de ser incubadas con los portaobjetos de anticuerpos. Las protefnas unidas se detectaron con anticuerpos anti-biotina y la senal se amplifico empleando amplificacion de cfrculo rodante (RCA) y marcaje fluorescente. La cantidad de protefna unida se cuantifico empleando un escaner Axon 4000a y el software Genepix 6.1.0.4. Las caracterfsticas de los pacientes se muestran en la figura 2.
La senal fluorescente de cada anticuerpo en la matriz se normalizo y la senal de la mediana para los 8 duplicados se expresa en unidades fluorescentes arbitrarias. En la figura 3 se muestran diagramas de cajas que ilustran los datos. La senal de la mediana para MUC 17 fue de 18.836 AU para pacientes con cancer gastrico, y de 16.130 para el grupo control. Estas medianas fueron significativamente diferentes (p = 0,007). Se observaron diferencias significativas entre las medianas para los dos anticuerpos de ZG16 de presentacion de fagos (5902 y 5905) obtenidos en MorphoSys. La senal de la mediana para ZG16_5902 en las muestras de pacientes con cancer gastrico fue de 2139 AU, comparado con 1837 AU para los controles; la mediana de la senal de ZG16_5905 en pacientes fue de 3063 AU, comparado con 1675 AU para los controles. La senal de la mediana entre pacientes y controles para ambos ZG16_5902 y ZG16_5905 fue significativamente diferente (p = 0,05 y p = 0,005, respectivamente).
Estos datos demuestran que MUC17 y ZG16 estan presentes a niveles significativamente mayores en el suero de pacientes con cancer gastrico que en los controles. Se lograra una mayor diferenciacion entre los grupos de pacientes y control refinando el procedimiento de ensayo inmunologico, la identificacion de anticuerpos con mayor especificidad para los antfgenos diana y el uso de combinaciones de marcadores.
Ejemplo 4: Celulas transfectadas con vectores que contienen GTM
En otras realizaciones, se proporcionan celulas que pueden expresar GTM, fragmentos de GTM o marcadores de peptidos. Pueden utilizarse celulas procariotas y eucariotas. Por ejemplo, puede emplearse E. coli (una celula procariota) para producir grandes cantidades de GTM que carecen de glicosilacion madura (si el GTM concreto normalmente esta glicosilado). Pueden utilizarse celulas COS, celulas 293 y una diversidad de otras celulas eucariotas para producir GTM que esten glicosilados, o que tengan un plegamiento adecuado y, por tanto, la estructura tridimensional de la forma nativa de la protefna de GTM. Los metodos para transfectar estas celulas son muy conocidos en la tecnica y no es necesario describirlos con mas detalle en la presente.
5
10
15
20
25
30
35
40
Ejemplo 5: Kits
Basandose en los descubrimientos descritos en la presente pueden producirse varios tipos de kits de ensayo. En primer lugar, pueden fabricarse kits que tengan un dispositivo de deteccion precargado con una molecula de deteccion (o "reactivo de captura"). En realizaciones para la deteccion de ARNm de GTM, estos dispositivos pueden comprender un sustrato (por ejemplo, vidrio, silicio, cuarzo, metal, etc.) sobre el cual se unen oligonucleotidos como reactivos de captura que se hibridan con el ARNm que se va a detectar. En algunas realizaciones, puede lograrse la deteccion directa del ARNm mediante la hibridacion del ARNm (marcado con cy3, cy5, un marcador radiactivo u otro marcador) a los oligonucleotidos sobre el sustrato. En otras realizaciones, puede lograrse la deteccion del ARNm fabricando, en primer lugar, un ADN complementario (ADNc) con el ARNm deseado. Despues, el ADNc marcado puede hibridarse con los oligonucleotidos sobre el sustrato y detectarse.
Independientemente del metodo de deteccion empleado, la comparacion de la expresion del GTM de ensayo con una medicion patron de expresion resulta deseable. Por ejemplo, la expresion del ARN puede estandarizarse a ADN celular total, a la expresion de ARN expresados de forma constitutiva (por ejemplo, ARN ribosomico) o a otros marcadores relativamente constantes.
Los anticuerpos tambien pueden emplearse en kits como reactivos de captura. En algunas realizaciones, un sustrato (por ejemplo, una placa de multiples pocillos) puede tener unido un reactivo de captura especffico de GTM. En algunas realizaciones, un kit puede incluir un reactivo bloqueante. Los reactivos bloqueantes pueden emplearse para reducir la union no especffica. Por ejemplo, la union de oligonucleotidos no especfficos puede reducirse empleando ADN en exceso proveniente de cualquier fuente adecuada que no contenga oligonucleotidos de GTM, tal como ADN de esperma de salmon. La union de anticuerpos no especfficos puede reducirse empleando un exceso de protefna bloqueante, tal como albumina de suero. Se apreciara que en la tecnica se conocen numerosos metodos para detectar oligonucleotidos y protefnas, y que puede emplearse cualquier estrategia que detecte especfficamente moleculas asociadas con GTM.
En realizaciones que se basan en la deteccion de anticuerpos, las protefnas o los peptidos de GTM pueden expresarse sobre una base de una celula, o sobre una base de protefna en fluido, tejido o celular total, volumen de fluido, masa de tejido (peso). Ademas, los GTM en suero puede expresarse basandose en una protefna serica relativamente muy abundante, tal como la albumina.
Ademas de un sustrato, un kit de ensayo puede comprender reactivos de captura (tales como sondas), disoluciones de lavado (por ejemplo, SSC, otras sales, tampones, detergentes y similares), asf como restos de deteccion (por ejemplo, cy3, cy5, marcadores radiactivos y similares). Los kits tambien pueden incluir instrucciones para su uso y un envase.
Aunque esta invencion se describe con referencia a sus realizaciones especfficas, puede apreciarse que pueden emplearse otras realizaciones que implican el uso de los marcadores descritos.
Aplicabilidad industrial
Los metodos para detectar miembros de la familia de GTM incluyen la deteccion de acidos nucleicos que emplean micromatrices y/o metodos de PCR a tiempo real y deteccion de protefnas y peptidos. Las composiciones y los metodos descritos en la presente son utiles para la fabricacion de dispositivos de diagnostico y kits, el diagnostico de enfermedades, la evaluacion de la eficacia de una terapia, y para producir reactivos adecuados para medir la expresion de miembros de la familia de GTM en muestras biologicas.

Claims (7)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    REIVINDICACIONES
    1. - Un metodo para detectar el cancer gastrico, que comprende:
    (i) proporcionar una muestra de sangre, plasma o suero;
    (ii) detectar los niveles de protefna del granulo de zimogeno humana 16 ("ZG16") en dicha muestra; y
    (iii) comparar la cantidad de ZG16 en dicha muestra con un valor obtenido a partir de una o mas muestras control que no tienen cancer gastrico,
    en el que la sobreexpresion de ZG16 en la muestra biologica es indicativa de cancer gastrico.
  2. 2. - El metodo de la reivindicacion 1, que comprende detectar el nivel de uno o mas miembros adicionales de la familiaGTM.
  3. 3. - El metodo de la reivindicacion 2, en el que:
    (i) dicho metodo comprende ademas detectar los niveles de un miembro adicional de la familia de GTM seleccionado del grupo que consiste en mucina 5AC ("MUC5AC"), y mucina 17 ("MUC17"); y/o
    (ii) el o los miembros adicionales de la familia de GTM se seleccionan de MUC5AC, MUC17, ZG16, cadena de 83 kDa del polipeptido 2 de la carboxipeptidasa N ("CPN2"), metaloproteinasa de matriz 12 ("MMP12"), inhibina ("INHBA"), factor del crecimiento de tipo insulfnico 7 ("IGFBP7"), gamma-glutamil hidrolasa ("GGH"), proteoglicano enriquecido en leucina y prolina ("LEPRE1"), cistatina S ("CST4"), protefna relacionada con frizzled segregada 4 ("SFRP4"), asporina ("ASPN"), regulador del crecimiento celular con dominio de mano EF 1 ("CGREF1"), calicrefna
    10 (KLK10), inhibidor tisular de metaloproteinasa 1 ("TIMP1"), protefna rica en cistefna acida segregada ("SPARC"), factor del crecimiento transformante, P-inducido ("TGFBI"), protefna de la matriz extracelular similar a fibulina que contiene EGF 2 ("EFEMP2"), lumicano ("LUM"), estanina ("SNN"), fosfoprotefna segregada 1 ("SPP1"), proteoglicano de sulfato de condroitina 2 ("CSPG2"), N-acilesfingosina amidohidrolasa ("ASAH1"), serina proteasa
    11 ("PRSS11"), protefna relacionada con frizzled segregada 2 ("SFRP2"), fosfolipasa A2, grupo XIIB ("PLa2g12B"), espondina 2, protefna de la matriz extracelular ("SPON2"), olfactomedina 1 ("OLFM1"), repeticion de tromboespondina que contiene 1 ("TSRC1"), tromboespondina 2 ("THBS2"), adlicano, cistatina SA ("CST2"), cistatina SN ("CST1"), enzima de tipo lisil oxidasa 2 ("LOXL2"), tiroglobulina ("TG"), factor del crecimiento transformante beta1 ("TGFB1"), inhibidor de serina o cistefna proteinasa Clado H, miembro 1 ("SERPINH1"), inhibidor de serina o cistefna proteinasa Clado B, miembro 5 ("SERPINB5"), metaloproteinasa de matriz 2 ("MMP2"), proprotefna convertasa subtilisina/kexina de tipo 5 ("PCSK5"), protefna de enlace de glicoprotefna de hialuronano 4 ("HAPLN4"), CA19-9, CA72-4, pepsinogeno, y CEA; y/o
    (iii) los marcadores de GTM ensayados comprenden MUC5AC, MUC17, ZG16, cistatina SN, serpina H1 y serpina B5.
  4. 4. - El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que:
    (i) dicha etapa de deteccion se realiza detectando los niveles de una protefna de GTM; o
    (ii) dicha etapa de deteccion se realiza detectando los niveles de un peptido de GTM.
  5. 5. - El metodo de la reivindicacion 4, en el que dicha etapa de deteccion se realiza empleando un anticuerpo dirigido contra dicho GTM, opcionalmente en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, o un antisuero policlonal.
  6. 6. - El metodo de la reivindicacion 4 o 5, en el que dicha etapa de deteccion se realiza empleando un metodo de inmunoensayo de tipo "sandwich", o empleando un chip de anticuerpos.
  7. 7. - El uso de un anticuerpo especffico para la protefna del granulo de zimogeno humana 16 ("ZG16") para detectar el cancer gastrico en una muestra de sangre, plasma o suero.
ES10775152.1T 2009-05-15 2010-05-14 Marcadores para la detección del cáncer gástrico Active ES2581841T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NZ57701209 2009-05-15
NZ57701209 2009-05-15
PCT/NZ2010/000089 WO2010131984A1 (en) 2009-05-15 2010-05-14 Markers for detection of gastric cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2581841T3 true ES2581841T3 (es) 2016-09-07

Family

ID=43085203

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10775152.1T Active ES2581841T3 (es) 2009-05-15 2010-05-14 Marcadores para la detección del cáncer gástrico

Country Status (8)

Country Link
US (2) US9310370B2 (es)
EP (1) EP2430193B1 (es)
JP (1) JP5892701B2 (es)
CN (1) CN102459646B (es)
AU (1) AU2010248227B2 (es)
CA (1) CA2762082C (es)
ES (1) ES2581841T3 (es)
WO (1) WO2010131984A1 (es)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6004247B2 (ja) * 2011-07-15 2016-10-05 国立研究開発法人理化学研究所 生化学反応用基体、生化学反応処理システム、及び当該基体からの排液方法
WO2013104102A1 (zh) * 2012-01-09 2013-07-18 苏州工业园区为真生物医药科技有限公司 乳腺癌诊断和预示的标志物
CN103940996B (zh) * 2013-05-07 2016-03-16 上海良润生物医药科技有限公司 Cystatin SN和AFP在制备诊断和预示肝癌标志物中的应用
CN103913574B (zh) * 2013-05-07 2016-04-06 上海良润生物医药科技有限公司 半胱氨酸蛋白酶抑制剂s与癌胚抗原的联合应用
CN103901206B (zh) * 2013-05-07 2016-03-16 上海良润生物医药科技有限公司 半胱氨酸蛋白酶抑制剂sn与糖类抗原19-9的联合应用
CN103941016B (zh) * 2013-05-07 2016-04-27 上海良润生物医药科技有限公司 半胱氨酸蛋白酶抑制剂sn与癌胚抗原的联合应用
TWI777195B (zh) * 2013-08-05 2022-09-11 德商伊瑪提克斯生物科技有限公司 新穎肽類，細胞及其用於治療多種腫瘤的用途，其製造方法及包含其等之醫藥組成物（三）
CN103966348B (zh) * 2014-05-29 2015-09-16 苏州工业园区为真生物医药科技有限公司 CST1mRNA和CST4mRNA或其编码的蛋白质在制备膀胱癌标志物中的应用及其试剂盒
CN104792998B (zh) * 2015-03-09 2016-06-08 中国人民解放军第四军医大学 Loxl2抗原用于制备甲状腺癌预示、侵袭、转移试剂盒的应用
CN106290899A (zh) * 2016-07-29 2017-01-04 上海良润生物医药科技有限公司 用于定量检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂s的试剂盒
ES2921701T3 (es) 2016-08-05 2022-08-30 Univ New York State Res Found Queratina 17 como un biomarcador para el cáncer de vejiga
CN109568597B (zh) * 2017-09-28 2021-07-27 中国科学院深圳先进技术研究院 靶向胎盘样硫酸软骨素a的多肽药物偶联物及其制备方法和应用
CN108977511A (zh) * 2018-07-03 2018-12-11 张罗 检测鼻腔脱落细胞中cst1基因表达量的方法及应用
WO2020077532A1 (zh) * 2018-10-16 2020-04-23 中国科学院深圳先进技术研究院 一种基于胎盘样硫酸软骨素a的癌症筛查和早期诊断的试剂方法
CN111781356A (zh) * 2019-04-04 2020-10-16 清华大学 一种胃癌极早期细胞标志和胃癌前病变早期细胞标志及其在诊断试剂盒中的应用
CN110146705B (zh) * 2019-04-28 2022-05-13 北京谷海天目生物医学科技有限公司 检测早期胃癌的试剂盒或芯片、胃癌蛋白标志物在制备试剂盒和/或芯片中的应用
CN111239389A (zh) * 2020-01-20 2020-06-05 复旦大学附属中山医院 区分肝细胞肝癌和正常人的自身抗体标志物及其筛选方法
CN111739641A (zh) * 2020-06-23 2020-10-02 杭州和壹医学检验所有限公司 一种胃癌风险预测方法、***、计算机设备及可读存储介质
CN112014578B (zh) * 2020-10-22 2021-01-22 上海良润生物医药科技有限公司 半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN与Cathepsin L1复合物作为胃癌诊断标志物的应用
CN114836539B (zh) * 2022-05-06 2022-12-06 皖南医学院第一附属医院（皖南医学院弋矶山医院） 一种用于胃癌转移预测和预后判断的circRNA标志物及应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998044160A1 (en) * 1997-03-31 1998-10-08 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting diseases of the gastrointestinal tract
WO2002100336A2 (en) 2001-06-08 2002-12-19 Utah Ventures Ii, L.P. Tissue-specific endothelial membrane proteins
US20060188889A1 (en) * 2003-11-04 2006-08-24 Christopher Burgess Use of differentially expressed nucleic acid sequences as biomarkers for cancer
JP4936887B2 (ja) * 2003-07-17 2012-05-23 パシフィック エッジ バイオテクノロジー リミティド 胃ガンの検出用マーカー
CN102099485A (zh) * 2007-10-23 2011-06-15 临床基因组学有限公司 诊断新生物的方法-ⅱ

Also Published As

Publication number Publication date
CA2762082A1 (en) 2010-11-18
US10024859B2 (en) 2018-07-17
WO2010131984A1 (en) 2010-11-18
US20170292956A1 (en) 2017-10-12
CN102459646A (zh) 2012-05-16
EP2430193A1 (en) 2012-03-21
EP2430193A4 (en) 2012-10-24
AU2010248227B2 (en) 2016-02-25
CA2762082C (en) 2018-06-19
JP2012526550A (ja) 2012-11-01
JP5892701B2 (ja) 2016-03-23
EP2430193B1 (en) 2016-03-09
CN102459646B (zh) 2016-08-10
AU2010248227A1 (en) 2011-12-08
US9310370B2 (en) 2016-04-12
US20120135881A1 (en) 2012-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2581841T3 (es) Marcadores para la detección del cáncer gástrico
ES2524333T3 (es) Relaciones de expresión génica en orina para la detección del cáncer
EP1649064B1 (en) Markers for detection of gastric cancer
ES2538504T3 (es) Marcadores en la orina para la detección del cáncer de vejiga
ES2658921T3 (es) Ensayo de pronóstico multigénico para el cáncer de pulmón
KR101974135B1 (ko) 방광암 및/또는 방광의 염증성 병태의 검출을 위한 새로운 마커
US9102706B2 (en) Newly identified colon cancer marker and diagnostic kit using the same
KR20100121949A (ko) 대장암 및 전이에 대한 바이오마커, 이를 이용한 대장암 진단 및 치료제 스크리닝
KR102061891B1 (ko) 폐암 질환의 진단용 마커
ES2906203T3 (es) Variante de CIP2A novedosa y usos de la misma
AU2012216703B2 (en) Markers for detection of gastric cancer
NZ577012A (en) Human zymogen granule protein 16 as a marker for detection of gastric cancer