CN111239389A - 区分肝细胞肝癌和正常人的自身抗体标志物及其筛选方法 - Google Patents
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Abstract
区分肝细胞肝癌和正常人的自身抗体标志物及其筛选方法。本发明采用含有100个重组蛋白的聚焦肝细胞肝癌的蛋白小芯片(HCC Focused Arrays)进行肝癌患者和健康者对照检测肝细胞，通过响应的数据比对和分析，确定了16个具有一定区分能力或组合区分能力的候选自身抗体标志物。本发明有助于改变肝癌诊断和疗效监测的现状,对肝癌的诊断具有重要的临床价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域，与应用性基础医学研究和临床研究相联系；涵盖肿瘤学、诊断学和免疫学。
背景技术
肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,简称：HCC)是常见的恶性肿瘤之一,其发病隐匿,恶性程度高,病死率高,因此及时准确的诊断对于提高患者的生存率至关重要。目前临床上主要运用甲胎蛋白(Alpha fetoprotein,简称：AFP)结合影像学及病理学检查进行肝癌的早期诊断；但是AFP对于肝癌筛查的特异性及敏感性均不十分理想。随着分子生物学的不断发展，多种新的标志物被相继发现,特别是自身抗体的诊断价值。
自身抗体是机体针对肿瘤异常抗原发生免疫响应而产生的特异性抗体，具有以下特点：(1)伴随肿瘤的发生过程产生，先于临床症状，适用于早期诊断；(2)自身抗体的产生是免疫反应的结果，经过免疫***的放大，抗体比起蛋白更容易检测；(3)具有特定类型肿瘤特异性。研究发现存在一些抗原是肿瘤特有的，但不同肿瘤间无特异性，如p53；也有一些抗原是特定肿瘤特异性的，比如***癌的很多抗原是氧化应激相关的蛋白。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术不足，提供一种区分肝细胞肝癌和正常人的候选自身抗体标志物及其筛选方法，以改变肝癌诊断和疗效监测的现状。
本发明提供的一种区分肝细胞肝癌和正常人的候选自身抗体标志物，候选自身抗体标志物具有区分能力或组合区分能力，具体包括NPM1、DCAF4L2、TMOD1、CIAPN1、KDM1A、ANKRD13D、ZNF428、CA12、MAS1、C1QTNF3、ASAH1、MS4A3、WTAP、DAB1、SLC44A3、EGFR。
本发明还提供了区分肝细胞肝癌和正常人的候选自身抗体标志物的筛选方法为：采用含有100个重组蛋白的聚焦肝细胞肝癌的蛋白小芯片检测肝细胞肝癌患者和健康者对照，通过响应的数据比对和分析，确定所述候选自身抗体标志物。
进一步的，本发明的区分肝细胞肝癌和正常人的候选自身抗体标志物的筛选方法，具体包括如下步骤：
1)复温；
2)封闭：复温后的芯片，固定14blocks围栏，固定好之后，向每个block中加入封闭液，并放置侧摆摇床上，室温封闭。
3)血清样本孵育：封闭完成后，倒尽封闭液体，然后迅速加入预先准备好的血清孵育液，侧摆摇床，过夜孵育；
4)一次清洗：将芯片及芯片夹一同取出，吸去样本，然后迅速加入等体积的PBST，如此循环数次，保证在拆除芯片夹时血清样本间无交叉污染；拆除芯片夹后，将芯片置于加有清洗液的芯片清洗盒，水平摇床，室温，清洗；
5)二抗孵育：将芯片转移到加入二抗孵育液的孵育盒中，侧摆摇床，避光，室温；
6)二次清洗：将芯片取出，置于加入有清洗液的芯片清洗盒，至于水平摇床上，清洗；完成后用ddH2O清洗；
7)干燥：将芯片置于芯片干燥机离心干燥；
8)扫描；
9)数据提取；
10)数据处理：基于SNR，对样本进行统计学分析，确定候选自身抗体标志物。
进一步的，上述步骤中的复温是将芯片从-80℃冰箱取出，于4℃冰箱复温半小时，然后于室温复温15min。
进一步的，上述步骤中的室温封闭为室温封闭3hr。
进一步的，上述步骤中的血清样本孵育具体为：封闭完成后，倒尽封闭液体，然后迅速加入预先准备好的血清孵育液，每张芯片可孵育14个血清样本，每个血清样本的上样体积为200μl，侧摆摇床20rpm，4℃过夜孵育；所述样本预先放在4℃层析柜冻融，以1：100比例稀释。
进一步的，上述步骤中的一次清洗中的拆除芯片夹后，将芯片置于加有清洗液的芯片清洗盒，水平摇床，室温80rpm，清洗3次，每次10min。
进一步的，上述步骤中的二抗孵育具体是指：二抗为Fluor conjugated goatanti-human IgG/donkey anti-human IgM，侧摆摇床40rpm，避光，室温60min。二抗优选532nm Fluor conjugated goat anti-human IgG/635nm donkey anti-human IgM。
进一步的，上述步骤中的二次清洗具体为：将芯片取出，不能触及或划破芯片的上表面，置于加入有清洗液的芯片清洗盒，至于水平摇床上，80rpm，清洗3次，每次10min；完成后用ddH2O清洗2次，每次10min。
进一步的，上述步骤中的封闭液为10％BSA，加入1x PBS溶液，体积比优选3:7，混匀，置于冰上；孵育液为10％BSA，加入1x PBST溶液，体积比优选1:9，混匀，置于冰上；清洗液为1x PBST，存放于4℃冰箱。
本发明的有益效果为：本发明为肝癌提供自身抗体的诊断思路，这些自身抗体经过免疫***的放大，更易检测并且先于临床症状，适用于早期诊断。这16种潜在的自身抗体标志物更利用挑选并建立标志物组合，将多个标志物联合使用是一种有效的策略，既可以避免单个分子的缺陷，又可以提升临床诊断能力，有助于改变肝癌诊断和疗效监测的现状,对肝癌的诊断具有重要的临床价值。
附图说明
图1为HCC Focused Arrays检测原理图；
图2为16个具有一定区分肝细胞肝癌和正常人的候选自身抗体标志物汇总；
图3为t检验(双尾)结果汇总。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步的描述。根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施案例所描述的内容仅用于说明和解释本发明，并不用于限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
采用含有100个重组蛋白的聚焦肝细胞肝癌的蛋白小芯片检测了557例肝细胞肝癌患者和343例健康对照，通过响应的数据比对和分析，最终确定了16个具有一定区分能力或组合区分能力的候选自身抗体标志物。
一、实验所需试剂
1)封闭液：3ml 10％BSA，加入7ml 1x PBS溶液，混匀，置于冰上。
2)孵育液：1ml 10％BSA，加入9ml 1x PBST溶液，混匀，置于冰上。
3)清洗液：1x PBST，存放于4℃冰箱。
二、实验操作步骤
1)复温：将芯片从-80℃冰箱取出，于4℃冰箱复温半小时，然后于室温复温15min；
2)封闭：复温后的芯片，固定14blocks围栏，固定好之后，向每个block中加入封闭液，并放置侧摆摇床上，室温封闭3hr。
3)血清样本孵育：封闭完成后，倒尽封闭液体，然后迅速加入预先准备好的血清孵育液，每张芯片可孵育14个血清样本，每个血清样本的上样体积为200μl，侧摆摇床20rpm，4℃过夜孵育。(样本先放在4℃层析柜冻融，以1：100比例稀释)
4)清洗：将芯片及芯片夹一同取出，吸去样本，然后迅速加入等体积的PBST，如此循环数次，保证在拆除芯片夹时血清样本间无交叉污染。拆除芯片夹后，将芯片置于加有清洗液的芯片清洗盒，水平摇床，室温80rpm，清洗3次，每次10min。
5)二抗孵育：二抗为Fluor conjugated goat anti-human IgG(532nm)/donkeyanti-human IgM(635nm)，将芯片转移到加入了3ml二抗孵育液的孵育盒中，侧摆摇床40rpm，避光，室温60min。
6)清洗：将芯片取出(注意不能触及或划破芯片的上表面)，置于加入有清洗液的芯片清洗盒，至于水平摇床上，80rpm，清洗3次，每次10min。完成后用ddH2O清洗2次，每次10min。
7)干燥：将芯片置于芯片干燥机离心干燥。
8)扫描：按照扫描仪(LuxscanTM 10K-A)的操作规范和使用说明操作。
9)数据提取：使用GenePix Pro 6.0将对应GAL文件打开，将芯片图像和GAL文件整体对齐，按下自动对齐按钮，提取数据并保存GPR。
三、数据处理步骤
1)数据定义：
F635 Median：635nm通道下的信号前景值的中位数值，指每个信号点对应所有的像素点的强度中位值，用以表示信号强度。
B635 Median：635nm通道下的背景值的中位数值，指每个信号点周围背景一定范围内的像素点的强度中位值，用以表示背景值。
F532 Median：532nm通道下的信号前景值的中位数值，指每个信号点对应所有的像素点的强度中位值，用以表示信号强度。
B532 Median：532nm通道下的背景值的中位数值，指每个信号点周围背景一定范围内的像素点的强度中位值，用以表示背景值。
2)对于提取出的数据，为消除不同样本间由于背景值不一致带来的偏差，故通过计算每个蛋白的前景值与背景值比值，即F median/B median，并此基础上定义SNR(信噪比)，即两个重复蛋白F median/B median的均值。基于SNR，对样本进行统计学分析。
16个具有一定区分肝细胞肝癌和正常人的候选自身抗体标志物汇总见图2。t检验(双尾)结果汇总见图3。
Claims (11)
1.区分肝细胞肝癌和正常人的候选自身抗体标志物，候选自身抗体标志物具有区分能力或组合区分能力，其特征在于：包括NPM1、DCAF4L2、TMOD1、CIAPN1、KDM1A、ANKRD13D、ZNF428、CA12、MAS1、C1QTNF3、ASAH1、MS4A3、WTAP、DAB1、SLC44A3、EGFR。
2.如权利要求1所述的的区分肝细胞肝癌和正常人的候选自身抗体标志物的筛选方法，其特征在于：采用含有100个重组蛋白的聚焦肝细胞肝癌的蛋白小芯片检测肝细胞肝癌患者和健康者对照，通过响应的数据比对和分析，确定了所述候选自身抗体标志物。
3.如权利要求2所述的区分肝细胞肝癌和正常人的候选自身抗体标志物的筛选方法，其特征在于包括如下步骤：
1)复温；
2)封闭：复温后的芯片，固定14blocks围栏，固定好之后，向每个block中加入封闭液，并放置侧摆摇床上，室温封闭。
3)血清样本孵育：封闭完成后，倒尽封闭液体，然后迅速加入预先准备好的血清孵育液，侧摆摇床，过夜孵育；
4)一次清洗：将芯片及芯片夹一同取出，吸去样本，然后迅速加入等体积的PBST，如此循环数次，保证在拆除芯片夹时血清样本间无交叉污染；拆除芯片夹后，将芯片置于加有清洗液的芯片清洗盒，水平摇床，室温，清洗；
5)二抗孵育：将芯片转移到加入二抗孵育液的孵育盒中，侧摆摇床，避光，室温；
6)二次清洗：将芯片取出，置于加入有清洗液的芯片清洗盒，至于水平摇床上，清洗；完成后用ddH2O清洗；
7)干燥：将芯片置于芯片干燥机离心干燥；
8)扫描；
9)数据提取；
10)数据处理：基于SNR，对样本进行统计学分析，确定所述候选自身抗体标志物。
4.如权利要求3所述的区分肝细胞肝癌和正常人的候选自身抗体标志物的筛选方法，其特征在于其中的复温是将芯片从-80℃冰箱取出，于4℃冰箱复温半小时，然后于室温复温15min。
5.如权利要求3所述的区分肝细胞肝癌和正常人的候选自身抗体标志物的筛选方法，其特征在于其中的封闭中的室温封闭为3hr。
6.如权利要求3所述的区分肝细胞肝癌和正常人的候选自身抗体标志物的筛选方法，其特征在于其中的血清样本孵育具体为：封闭完成后，倒尽封闭液体，然后迅速加入预先准备好的血清孵育液，每张芯片可孵育14个血清样本，每个血清样本的上样体积为200μl，侧摆摇床20rpm，4℃过夜孵育；所述样本预先放在4℃层析柜冻融，以1：100比例稀释。
7.如权利要求3所述的区分肝细胞肝癌和正常人的候选自身抗体标志物的筛选方法，其特征在于其中的一次清洗中的拆除芯片夹后，将芯片置于加有清洗液的芯片清洗盒，水平摇床，室温80rpm，清洗3次，每次10min。
8.如权利要求3所述的区分肝细胞肝癌和正常人的候选自身抗体标志物的筛选方法，其特征在于其中的二抗为Fluor conjugated goat anti-human IgG/donkey anti-humanIgM，侧摆摇床40rpm，避光，室温60min。
9.如权利要求8所述的区分肝细胞肝癌和正常人的候选自身抗体标志物的筛选方法，其特征在于其中的二抗为532nm Fluor conjugated goat anti-human IgG/635nm donkeyanti-human IgM。
10.如权利要求3所述的区分肝细胞肝癌和正常人的候选自身抗体标志物的筛选方法，其特征在于其中的二次清洗具体为：将芯片取出，不能触及或划破芯片的上表面，置于加入有清洗液的芯片清洗盒，至于水平摇床上，80rpm，清洗3次，每次10min；完成后用ddH2O清洗2次，每次10min。
11.如权利要求3所述的区分肝细胞肝癌和正常人的候选自身抗体标志物的筛选方法，其特征在于其中的封闭液为10％BSA，加入1x PBS溶液，体积比3:7，混匀，置于冰上；孵育液为10％BSA，加入1x PBST溶液，体积比1:9，混匀，置于冰上；清洗液为1x PBST，存放于4℃冰箱。
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Application publication date: 20200605 Assignee: SHANGHAI PHARMACEUTICALS HOLDING Co.,Ltd. Assignor: ZHONGSHAN HOSPITAL, FUDAN University Contract record no.: X2022310000120 Denomination of invention: Autoantibody markers for distinguishing hepatocellular carcinoma from normal people and their screening methods License type: Common License Record date: 20220922 |
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