ES2581627T3

ES2581627T3 - Anticuerpos frente a variante truncada CTF-611 de HER2

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Publication number: ES2581627T3
Application number: ES10193969.2T
Authority: ES
Inventors: Joaquín ARRIBAS LÓPEZ; Kim Pedersen; Pier-Davide Angellini; Josep Lluís Parra Palau; José BASELGA TORRES
Original assignee: Institucio Catalana de Recerca i Estudis Avancats ICREA; Fundacio Privada Institut dInvestigacio Oncologica Vall dHebron VHIO
Current assignee: Institucio Catalana de Recerca i Estudis Avancats ICREA; Fundacio Privada Institut dInvestigacio Oncologica Vall dHebron VHIO
Priority date: 2009-12-07
Filing date: 2010-12-07
Publication date: 2016-09-06
Anticipated expiration: 2030-12-07
Also published as: HRP20141257T1; SMT201500001B; EP2330131B1; US20110135653A1; SI2330131T1; EP3048117A1; EP2360187A1; JP5852306B2; PT2330131E; EP2330131A1; CY1115927T1; DK2330131T3; ES2527143T3; US8741586B2; PL2330131T3; JP2011121943A; EP2360187B1

Abstract

Anticuerpo o fragmento del mismo que reconoce un epítopo de una forma truncada del receptor HER2, estando dicho epítopo definido por una secuencia incluida en SEQ ID NO: 2, en el que dicho anticuerpo o fragmento del mismo puede discriminar entre la variante truncada de HER2 CTF-611 representada por SEQ ID NO: 1 y CTF-616 representada por SEQ ID NO: 7, entre la variante truncada de HER2 CTF-611 representada por SEQ ID NO: 1 y el receptor HER2, entre la variante truncada de HER2 CTF-611 representada por SEQ ID NO: 1 y la forma truncada del receptor HER2 648-CTF/p95 y entre la variante truncada de HER2 CTF-611 representada por SEQ ID NO: 1 y CTF-613 representada por SEQ ID NO: 6.

Description

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entre CTF-611 y CTF-616, y CTF-613 tal como se define en las reivindicaciones.

Métodos de diagnóstico

En el método de diagnóstico según la invención, la detección de la presencia de la forma truncada del receptor HER2 puede llevarse a cabo a través de medios seleccionados independientemente del grupo que comprende: detección mediante migración diferencial en un sistema de fase móvil – fase estacionaria de la forma truncada del receptor HER2 que consiste en SEQ ID NO: 1 con respecto a la forma completa de dicho receptor HER2; y detección mediante unión con anticuerpos específicos de la forma truncada del receptor HER2 que contiene la SEQ ID NO: 1.

Detección a través de migración diferencial debe entenderse que significa, en el contexto de la presente invención, cualquier técnica analítica que permite la separación de los compuestos que van a detectarse basándose en su diferente movilidad en un sistema de fase móvil – fase estacionaria específico, tal como una electroforesis. Tal movilidad diferente puede provocarse por una carga eléctrica diferente en el compuesto, peso molecular diferente, o afinidad diferente por otros compuestos.

Esta detección diferencial puede llevarse a cabo a través de técnicas analíticas conocidas por el experto en la técnica tales como electroforesis de proteínas, cromatografías de exclusión molecular, pruebas de afinidad de anticuerpos, inmunofluorescencia, inmunocitoquímica, inmunohistoquímica, citometría de flujo, etc. Se prefiere particularmente la inmunohistoquímica. Uno o más de estos métodos pueden combinarse para potenciar la fiabilidad.

La detección diferencial de la forma truncada del receptor HER2 que consiste en SEQ ID NO: 1, también denominada en esta invención CTF-611, con respecto al receptor HER2 completo o total, implica poder visualizar dos proteínas con diferentes pesos moleculares y diferentes secuencias tal como puede desearse a partir de la figura 1. La forma truncada con SEQ ID NO: 1 consiste en la proteína que resulta del inicio alternativo de la traducción a través de la metionina 611 de la secuencia completa del receptor HER2. Por tanto, esta forma o CTF comprende un nuevo dominio extracelular, un fragmento transmembrana y un dominio citosólico. El fragmento transmembrana y el dominio citosólico son iguales a los de la forma completa del receptor HER2. Otra forma truncada corresponde a la de la figura 1 denominada p95 o CTF-648. Esta última forma es el producto de la acción de las alfa-secretasas en el receptor HER2 completo, que dividen una gran parte del dominio extracelular.

Según otra realización de la invención, la etapa de detectar la presencia en la muestra de la forma truncada del receptor HER2 que consiste en SEQ ID NO: 1, comprende la detección con al menos un anticuerpo tal como se define en las reivindicaciones. En una realización particular, el método de diagnóstico según la invención comprende la detección del epítopo definido por SEQ ID NO: 3.

En una realización de la invención, los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la presente invención se usan como agentes para el diagnóstico y la determinación del pronóstico, o bien marcados directamente en su propia secuencia peptídica (por ejemplo con radioisótopos) o bien indirectamente (por ejemplo mediante la adición o unión de un agente fluorescente o un agente que puede producir fluorescencia mediante la reacción en un medio de reacción seleccionado), teniendo todos los anteriores el objetivo de generar una señal visible, y si es posible cuantificable, con la que detectar la presencia de la forma truncada del receptor HER2 que consiste en la secuencia SEQ ID NO: 1 en una muestra.

De la misma manera, se contempla el agente de diagnóstico que contiene al menos los anticuerpos que van a adherirse a un soporte sólido, directa o indirectamente por medio de un brazo espaciador. Un agente de este tipo permite capturar la forma de secuencia SEQ ID NO: 1 de una muestra, con el fin de determinar su presencia después con otros anticuerpos no específicos (tales como CB11).

Los agentes de diagnóstico y determinación del pronóstico según la invención también pueden aplicarse en protocolos de inmunohistoquímica. Para este efecto, los anticuerpos monoclonales o policlonales (primarios o secundarios) deben estar debidamente marcados para producir una señal visible, y en los mejores casos cuantificable, una vez que han entrado en contacto con el tejido sometido a prueba y han podido interaccionar con las proteínas cuya detección se desea, en otras palabras, con el fragmento CTF de HER2 de secuencia SEQ ID NO:

1.

Con el objetivo de facilitar la tarea de análisis, diagnóstico y determinación del pronóstico al médico, se contempla que el agente de diagnóstico se proporcione en forma de un kit que incluye, además de los anticuerpos, los reactivos (por ejemplo reactivos requeridos para la tinción inmunohistoquímica), tampones y disoluciones de detección adaptadas para determinar la presencia de la forma truncada de SEQ ID NO: 1 en una muestra, posiblemente portaobjetos de control que representan diferentes niveles de expresión de CTF-611 y posiblemente también instrucciones detalladas, que ayudan al médico en la evaluación del diagnóstico. Este kit también puede comprender un medio para llevar a cabo un ensayo inmunohistoquímico semicuantitativo para la determinación de HER2 (tal como Herceptest™).

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Por tanto, la divulgación incluye un kit para el diagnóstico y la determinación del pronóstico, que comprende al menos un anticuerpo o un fragmento del mismo, pudiendo dicho anticuerpo o fragmento reconocer el epítopo definido por SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 5, pero no pudiendo reconocer SEQ ID NO: 6, ni SEQ ID NO: 7, ,además de los medios reactivos y tampones adecuados para llevar a cabo la interacción del anticuerpo con el epítopo y que conocen ampliamente los expertos en la técnica.

El método de diagnostico de la presente invención, y el kit de la presente invención, puede permitir la predicción de metástasis ganglionar, mal pronóstico y resistencia a Herceptin™.

Otro tipo de kit también dado a conocer en la invención, comprende todos los medios necesarios para llevar a cabo la detección a través de migración diferencial de la forma truncada del receptor HER2 que consiste en la secuencia SEQ ID NO: 1, en relación con la forma completa del receptor HER2.

Dentro del grupo de cánceres que expresan el receptor HER2 o sus variantes truncadas, destaca el cáncer de mama. Otros cánceres en los que también se expresan estas proteínas incluyen el cáncer de pulmón, páncreas, colon, estómago, próstata, cabeza y cuello, piel, riñón, testículo, tiroides, vejiga urinaria, útero, vulva, endometrio, ovario, esófago, boca, glándula salival, laringe, peritoneo, región nasofaríngea, trompas de Falopio, tumores de Wilms así como linfomas, sarcomas de Swing, sarcoma sinovial, meduloblastomas, tumores trofoblásticos, gliomas, glioblastomas, colangiocarcinomas, colesteatoma, condrosarcoma, ependimoma, neurilemomas, neuromas, rabdomiosarcomas. Por tanto, el método de diagnóstico de la presente invención es particularmente adecuado para diagnosticar uno de estos cánceres. Además de la detección ex vivo de CTF, los anticuerpos pueden usarse para la obtención de imágenes in vivo.

Métodos terapéuticos

Los anticuerpos de la presente invención, o fragmentos de los mismos, también son útiles en terapia, particularmente en la terapia del cáncer, particularmente en aquellos cánceres que expresan el receptor HER2 o sus variantes truncadas. Se prefieren anticuerpos humanizados y humanos, y fragmentos de los mismos.

También se usan los anticuerpos de esta invención en composiciones farmacéuticas útiles para el tratamiento de cánceres en los que se expresa al menos la forma truncada del receptor HER2 que consiste en SEQ ID NO: 1. La composición comprende aquellos vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables y al menos un anticuerpo que reconoce el epítopo definido por las secuencias SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, pero no reconoce SEQ ID NO: 6 ni SEQ ID NO: 7. La composición farmacéutica también puede comprender una mezcla de anticuerpos que, además de un anticuerpo de la presente invención, contiene otros anticuerpos contra HER2 o fragmentos de los mismos, tales como Herceptin™.

Basándose en las figuras proporcionadas en el presente documento y siempre a modo de ejemplo ilustrativo pero no limitativo, a continuación se describen el método de diagnóstico y determinación del pronóstico de cánceres en los que se expresan el receptor HER2 y/o sus fragmentos carboxilo terminales (variantes truncadas); nuevos péptidos y anticuerpos específicos contra dichos péptidos; nuevas líneas celulares; agentes y kits de diagnóstico para detección.

Aunque no se especifica, todos los términos técnicos y científicos usados en la memoria descriptiva tienen el significado que un experto en la técnica les asignaría. En la práctica de la presente invención pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, la palabra “comprende” y variaciones de la palabra, tal como “que comprende”, no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o etapas. Los objetos, ventajas y características adicionales de la invención se volverán evidentes para los expertos en la técnica tras el examen de la descripción o puede aprenderse mediante la puesta en práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no pretender ser limitativos de la presente invención que se define en las reivindicaciones.

Además, se entenderá que la presente divulgación cubre todas las posibles combinaciones de grupos preferidos y particulares descritos anteriormente.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos muestran diferentes maneras de detectar la presencia de la forma truncada de secuencia SEQ ID NO: 1, en una muestra aislada de cáncer del tipo que expresa el receptor HER2 y/o sus variantes truncadas.

Procedimientos experimentales

Células. Se mantuvieron células MCF7 Tet-Off (BD bioscience) a 37ºC y CO2 al 5% en DMEM/F-12 (1:1) (Gibco) que contenía FBS al 10% (Gibco), L-glutamina 4 mM (PAA Laboratories), G418 0,2 mg/ml (Gibco) y doxiciclina 1 g/ml (Sigma). Se transfectaron las células con los diversos plásmidos de expresión usando FuGENE6 (Roche). Se

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Peroxidasa 5 min y lavado con tampón de lavado.

Bloqueo de proteínas al 5%, 15-20 min.

Lavar con tampón de lavado.

 214D8c12h4 o 226H4e8d10 a 0,2 g/ml, 2 horas.

 Lavar con tampón de lavado.

 Secundario (Flex HRP, Flex+ratón/conejo) 20 min.

 Lavar con tampón de lavado.

 DAB 5 min.

 Lavar con tampón de lavado.

 Hematoxilina.

 Lavar con agua destilada.

3. Deshidratar y estabilizar con medio de preparación

3.1 Lavar gradualmente con concentraciones crecientes de etanol (50%, 70%, 95%, 2 min cada lavado).

3.2 Llevar gradualmente a agua destilada (etanol al 95%, al 70%, al 50%, agua destilada, 3 min cada lavado).

3.3 Lavar con xileno/eucaliptol (3 lavados 2 min cada uno).

3.4 Realizar preparación con DPX.

Ratones transgénicos

Se modificaron por ingeniería genética ratones TG 611 y TG 687 clonando las secuencias que codifican para 687-CTF y 611-CTF en el sitio de clonación múltiple II en el sentido de 3’ de la repetición terminal larga del virus del tumor mamario de ratón potenciado por el virus del sarcoma de Rous del vector pMB (un amable obsequio del Dr. Marcos Malumbres, CNIO, Madrid). Se generaron las líneas fundadoras microinyectando ADN de plásmido linealizado en oocitos fertilizados recogidos de ratones FVB superovulados en el Centro de Biotecnología Animal y Terapia Génica (Centre de Biotecnologia Animal i Terapia Gènica, Universitat Autònoma de Barcelona). Se genotiparon los ratones fundadores mediante análisis de hibridación de tipo Southern. Tras la identificación de los animales fundadores, se realizó mantenimiento de colonias de rutina mediante genotipado por PCR. Se obtuvieron los ratones FVB/N-Tg(MMTVneu)202J macho y hembra del Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).

Histología y preparaciones completas

Se prepararon las glándulas mamarias en portaobjetos de vidrio, se fijaron durante la noche en paraformaldehído al 4% y se transfirieron a etanol al 70%. Se aclararon los portaobjetos en agua durante 5 min y se tiñeron en una disolución filtrada de carmín al 0,2% durante 24 horas. Entonces se deshidrataron secuencialmente las glándulas con concentraciones decrecientes de etanol, luego se desgrasaron y almacenaron en salicilato de metilo. Para el análisis histológico, se bloquearon en parafina las glándulas fijadas, se realizaron cortes, y se tiñeron con hematoxilina y eosina.

Ejemplo 1: Detección del fragmento de SEQ ID NO: 1 a través de migración diferencial.

En la figura 2, que corresponde a una imagen de un gel de electroforesis y la posterior transferencia de tipo Western (inmunotransferencia de tipo Western), se cargaron diferentes muestras de cáncer de mama (108, 114, 101, 103, 131, 134 y 145) en los carriles. A partir de cada muestra se analizaron tanto la fracción soluble (S) como la fracción de membrana (M) del lisado celular, con el fin de visualizar qué tipo de molécula de HER2 estaba presente y en qué fracciones. En principio, se espera que tanto el receptor completo como la forma de la SEQ ID NO: 1 estén en la membrana celular. Para la detección de HER2 completo y de la forma CTF-611, se usaron anticuerpos (CB11) dirigidos al dominio citoplasmático de las proteínas, que es un dominio común en ambas formas de proteína. Como control de análisis se detectó la presencia de la enzima lactato deshidrogenasa (DHL). En la mayoría de las muestras, aparecen bandas correspondientes al receptor HER2 completo y en la fracción de membrana, una banda correspondiente a la forma CTF-611 de SEQ ID NO: 1.

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Por tanto, la figura 2 muestra que la detección del tipo de formas truncadas del receptor HER2 puede llevarse a cabo a través de un análisis de electroforesis de proteínas. Además, la presencia de un fragmento de HER2 de secuencia SEQ ID NO: 1 es indicativo de un determinado tipo de cáncer, en el caso del ejemplo, cáncer de mama, que necesita evaluarse y tratarse como un caso individual dentro de los cánceres que expresan HER2.

Ejemplo 2: Detección de la presencia del fragmento de HER2 de secuencia SEQ ID NO: 1 con anticuerpos monoclonales dirigidos a neo-epítopos definidos por SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.

Usando el péptido que tiene la secuencia SEQ ID NO: 4, se obtuvieron anticuerpos monoclonales. Este péptido corresponde a los 32 aminoácidos del extremo N-terminal de la forma CTF-611 o de SEQ ID NO: 1, en el que la mayoría de las cisteínas se han sustituido por serinas con el fin de conjugarlas con el inmunógeno conocido como hemocianina de lapa californiana (KLH).

Por tanto, la SEQ ID NO: 4 corresponde a un péptido equivalente al de SEQ ID NO: 3, aunque adaptado con el fin de llevar a cabo la técnica de inmunización. Un experto en la técnica entenderá que los anticuerpos dirigidos contra la SEQ ID NO: 4 del péptido sintetizado también reconocerán el epítopo definido por la SEQ ID NO: 3 presente en la forma truncada del receptor HER2 (SEQ ID NO: 1 o CTF-611). De manera similar, un experto en la técnica puede deducir que si el péptido sintetizado usado para la inmunización consiste en SEQ ID NO: 2, que comprende todos los aminoácidos del receptor CTF-611 ubicados en la zona extracelular, los resultados con anticuerpos dirigidos contra este otro péptido son equivalentes y por tanto útiles para el mismo fin.

Se seleccionaron el anticuerpo monoclonal 214D8c12h4 producido por la línea celular de hibridoma con número de registro DSM ACC3016 y el anticuerpo monoclonal 226H4e8d10 producido por la línea celular de hibridoma con número de registro DSM ACC3017. Los resultados obtenidos con este anticuerpo se muestran en la figura 4 y la figura 5.

Se llevaron a cabo SDS-PAGE y la posterior transferencia de tipo Western con lisados celulares de células MCF7 transfectadas de manera estable con constructos de ADNc que codifican para HER2, 611-CTF y 648-CTF. Éstos se analizaron con CB11, un anticuerpo monoclonal comercial dirigido contra el dominio intracelular de HER2, o con el anticuerpo monoclonal 214D8c12h4 o el 226H4e8d10. El anticuerpo CB11 reconoce HER2, 611-CTF y 648-CTF (figura 4). Los anticuerpos monoclonales 214D8c12h4 y 226H4e8d10 reconocen 611-CTF y HER2 de longitud completa cuando se analizan por inmunotransferencia de tipo Western. Ninguno de los anticuerpos monoclonales reconoce 648-CTF, que carece del epítopo. Se muestran sólo los resultados correspondientes a 214D8. Se obtuvieron resultados similares con 226D8.

De hecho, CTF-611 apareció como dos fragmentos de peso molecular similar. Tal como puede deducirse de pruebas realizadas con glicosidasa-F, una enzima que elimina N-glicanos de proteínas (no mostrado), el fragmento CTF-611 es un sustrato de modificaciones postraduccionales. Específicamente, un fragmento con aproximadamente 110 kDa corresponde a la forma que se sintetiza y posteriormente entra en la ruta secretora, en la que se convierte en N-glicosilado.

Además, se llevó a cabo un ensayo de inmunoprecipitación con los anticuerpos monoclonales 214D8c12h4 y 226H4e8d10 en comparación con el anticuerpo CB11 (que reconoce el dominio citosólico de los receptores) y el anticuerpo Trastuzumab (que reconoce un epítopo en el dominio extracelular de HER2 que es diferente del epítopo reconocido por los anticuerpos según la presente invención y no reconoce CTF-611). Se incubó una mezcla 1:1:1 de lisados celulares de células MCF7 transfectadas de manera estable con constructos de ADNc que codifican para HER2, 611-CTF y 648-CTF con los anticuerpos CB11, trastuzumab, 214D8c12h4 o 226H4e8d10. Se recogieron los complejos inmunitarios con la proteína A, se lavaron y se analizaron mediante inmunotransferencia de tipo Western con CB11 (figura 5). Se muestran sólo los resultados correspondientes a 214D8c12h4. Se obtuvieron resultados similares con 226H4e8d10.

Mientras que CB11 inmunoprecipita especies de HER2 a partir de los tres constructos de ADNc, trastuzumab inmunoprecipita sólo HER2 de longitud completa. 214D8c12h4 y 226H4e8d10 se unen preferentemente a CTF-611, lo que indica que estos anticuerpos son específicos para este fragmento de HER2 y que el epítopo que reconocen está enmascarado en la molécula de longitud completa.

En el carril correspondiente a inmunoprecipitación con el anticuerpo monoclonal 214D8c12h4 (figura 5, carril de la derecha), sólo pueden distinguirse las bandas de la forma glicosilada y no glicosilada de la forma truncada CTF-611. Se obtuvieron resultados similares con el anticuerpo monoclonal 226H4e8d10. Por tanto, los anticuerpos monoclonales 214D8c12h4 y 226H4e8d10 pueden inmunoprecipitar CTF-611 pero no HER2 de longitud completa ni CTF-648. A partir de esto puede concluirse que los anticuerpos monoclonales 214D8c12h4 y 226H4e8d10 reconocen específicamente CTF-611 y no muestran ninguna reactividad con HER2 de longitud completa ni CTF-648. Por consiguiente, pueden usarse para la detección diferencial y altamente selectiva de qué forma del receptor HER2 se expresa en una muestra aislada de tejido tumoral.

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La caracterización de anticuerpos monoclonales dirigidos contra un péptido correspondiente a una secuencia de CTF-611 larga de 32 aminoácidos N-terminal confirma la existencia de epítopo(s) enmascarado(s) en HER2 de longitud completa pero expuesto(s) en CTF-611. Estos epítopos están enmascarados tanto en la molécula solubilizada como en células intactas.

Ejemplo 3: Caracterización de los epítopos reconocidos por los anticuerpos monoclonales 214D8c12h4 y 226H4e8d10 contra el extremo N-terminal de CTF-611

La figura 6A muestra un esquema que representa la secuencia primaria de la región yuxtamembrana de CTF-611. Se indican los extremos N y C-terminales de la molécula. Los dominios transmembrana y cinasa se indican con un recuadro rayado y gris, respectivamente. Se indica la secuencia de los constructos de deleción CTF-613 y CTF-616.

Con el fin de caracterizar el epítopo reconocido por los anticuerpos 214D8c12h4 y 226H4e8d10, se usaron células transfectadas con constructos de ADNc que expresan CTF-611, CTF-613 o CTF-616. Se analizaron los lisados celulares mediante inmunotransferencia de tipo Western con CB11 (figura 6B, panel de la izquierda), un anticuerpo contra el dominio citoplasmático de HER2, con 214D8c12h4 (figura 6B, panel central) o con 226H4e8d10 (figura 6B, panel de la derecha).

Conclusiones. El análisis de inmunotransferencia de tipo Western de los lisados de células que expresan CTF-611, CTF-613 y CTF-616 muestra que los anticuerpos 214D8c12h4 y 226H4e8d10 reconocen diferentes epítopos. El epítopo reconocido por 214D8c12h4 está alterado en el constructo de CTF-613. En contraposición, el epítopo reconocido por 226H4e8d10 está conservado en el mismo constructo.

Ejemplo 4: Caracterización de los anticuerpos monoclonales 214D8c12h4 y 226H4e8d10 contra el extremo Nterminal de CTF-611 mediante inmunofluorescencia

Se analizaron células MCF7 transfectadas de manera estable con constructos de ADNc que codifican para HER2, 611-CTF y 648-CTF mediante inmunofluorescencia indirecta con CB11, un anticuerpo monoclonal comercial dirigido contra el dominio intracelular de HER2, con el anticuerpo monoclonal 214D8c12h4 o con el anticuerpo monoclonal 226H4e8d10 (figura 7).

Tal como se esperaba, los anticuerpos CB11 tiñen las tres líneas celulares. Los anticuerpos monoclonales 214D8c12h4 y 226H4e8d10 sólo tiñen CTF-611. Este resultado muestra que los anticuerpos 214D8c12h4 y 226H4e8d10 reconocen un epítopo en el constructo de CTF-611 que está enmascarado en las moléculas de longitud completa. Por tanto, estos anticuerpos son herramientas útiles para detectar específicamente la presencia de CTF-611.

Ejemplo 5: Caracterización de los anticuerpos monoclonales 214D8c12h4 y 226H4e8d10 contra el extremo Nterminal de CTF-611 mediante inmunohistoquímica

Se analizaron células MCF7 transfectadas de manera estable con constructos de ADNc que codifican para HER2, CTF-611 y 648-CTF mediante inmunohistoquímica con CB11, un anticuerpo monoclonal comercial dirigido contra el dominio intracelular de HER2, con el anticuerpo monoclonal 214D8c12h4 o con el anticuerpo monoclonal 226H4e8d10. Se muestra el resultado en la figura 8. Se muestran sólo los resultados correspondientes a 214D8c12h4. Se obtuvieron resultados similares con 226H4e8d10.

Conclusiones. Tal como se esperaba los anticuerpos CB11 tiñen las tres líneas celulares. Los anticuerpos monoclonales 214D8c12h4 y 226H4e8d10 sólo tiñen CTF-611. Este resultado muestra que los anticuerpos 214D8c12h4 y 226H4e8d10 reconocen un epítopo en el constructo de CTF-611 que está enmascarado en las moléculas de longitud completa. Por tanto, estos anticuerpos son herramientas útiles para detectar específicamente la presencia de CTF-611. Este resultado es particularmente relevante debido al hecho de que la inmunohistoquímica es la técnica de elección para la mayoría de las pruebas de rutina en la práctica clínica.

Ejemplo 6: Generación de modelos animales para caracterizar el efecto de la expresión de CTF in vivo

Los modelos de ratón han jugado un papel decisivo a la hora de mostrar el potencial oncogénico y la relevancia de HER2 en la evolución tumoral. Para caracterizar su potencial oncogénico, se han establecido ratones transgénicos (TG) que expresan CTF-611 bajo el control de la repetición terminal larga de virus del tumor mamario de ratón, que es preferentemente activo en la glándula mamaria. Aunque los modelos celulares indicaron que los CTF intracelulares solubles son inactivos, para explorar adicionalmente las consecuencias de la expresión de estos fragmentos, también se generaron animales TG que expresaban 687-CTF. Como control, se ha usado el modelo clásico y bien caracterizado que expresa HER2 de tipo natural (es decir rat neu).

A las 7 semanas de edad, los niveles de CTF-611 expresados en las líneas F3 y F2 de TG 611 heterocigotas eran  iguales a y 1/3 de, respectivamente, los niveles de HER2 endógeno, aunque el nivel en F1 era inferior al umbral de detección. Los niveles de 687-CTF en las líneas homocigotas desarrolladas variaron desde  el doble hasta la mitad

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de los niveles de HER2 en las líneas F2 y F1 de TG 687, respectivamente.

Las glándulas mamarias de los animales TG no presentaron anomalías macroscópicas a las 7 semanas de edad. Sin embargo, el examen morfológico de preparaciones completas teñidas con carmín reveló anomalías hiperplásicas en los árboles ductales mamarios de ratones TG HER2. Estaban presentes anomalías similares, aunque menos pronunciadas, en las tres líneas de ratones TG 611. En contraposición, las glándulas de ratones TG 687 no podían distinguirse de las de ratones de tipo natural.

Ejemplo 7: La expresión de CTF-611 conduce al desarrollo de tumores mamarios agresivos

A pesar de la hiperplasia más pronunciada en ratones TG HER2, las tres líneas de animales TG 611 desarrollaron tumores más agresivos en cuanto al número de tumores por animal, crecimiento tumoral y aparición del tumor:

Glándulas mamarias

Ratones Promedio (semanas) n HER2 (Neu) 30,3 ± 7,5 22 611-F1 26,3 ± 4,6 6 611-F2 22,2 ± 4,8 12 611-F3 23,7 ± 5,5 3

(Se monitorizó la aparición de los tumores mamarios mediante palpación semanalmente.)

No se observaron tumores o anomalías en animales TG 687 incluso tras un seguimiento de más de un año.

El análisis histológico de los tumores mostró los mismos carcinomas nodulares sólidos invasivos típicos inducidos por HER2 en los ratones TG 611. La única diferencia histológica entre los tumores iniciados por HER2 y CTF-611 fue un número mayor de imágenes mitóticas en los de los ratones TG 611.

Tal como se mostró anteriormente, los ratones TG HER2 desarrollaron metástasis pulmonar. Tres a seis semanas tras la detección de tumores,  1/4 de los animales TG HER2 tenían nódulos detectables en los pulmones:

imagen7Ratones Metástasis pulmonar n HER2 (Neu) 22 9 611-F1, F2, F3 56 9 (Se sacrificaron los ratones 3-6 semanas tras la detección del tumor mediante palpación y se monitorizó la aparición de metástasis mediante inmunohistoquímica).

El análisis histológico de las metástasis pulmonares confirmó la expresión de HER2 y la tinción con citoqueratina 18 verificó que las células se originaban del tumor primario. En comparación con TG HER2, el número de animales que expresan CTF-611 con metástasis detectables fue más del doble. Esto muestra que los tumores iniciados por este CTF tienen una tendencia más pronunciada a invadir los pulmones.

Secuencias

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Claims

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