ES2578993T3 - Moléculas de ácido nucleico y métodos para intercambiar uno o más exones mediante corte y empalme en trans - Google Patents

Moléculas de ácido nucleico y métodos para intercambiar uno o más exones mediante corte y empalme en trans Download PDF

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Universite Pierre et Marie Curie Paris 6
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Abstract

Molécula de ácido nucleico que comprende: a) dos dominios de unión a diana AS y AS' que dianizan la unión de la molécula de ácido nucleico al pre-ARNm del gen de la distrofina (DMD), en la que los dos dominios de unión a diana AS y AS' están ubicados en el extremo 5' y en el extremo 3', respectivamente, de la molécula de ácido nucleico, b) una región de corte y empalme en 3' que comprende un punto de ramificación, un tramo de polipirimidina y un sitio aceptor de corte y empalme en 3', c) una región de corte y empalme en 5' que comprende un sitio donante de corte y empalme en 5', d) una secuencia espaciadora que separa la región de corte y empalme en 3' del dominio de unión a diana de extremo 5' AS, e) una secuencia espaciadora que separa la región de corte y empalme en 5' del dominio de unión a diana de extremo 3' AS', y f) una secuencia de nucleótidos que debe cortarse y empalmarse en trans al pre-ARNm diana, en la que dicha secuencia de nucleótidos codifica por lo menos una parte del polipéptido distrofina y se encuentra ubicada entre la región de corte y empalme en 3' y la región de corte y empalme en 5' de dicho ácido nucleico, y en la que: * el dominio de unión a diana de extremo 5' AS dianiza la unión del ácido nucleico al intrón 22 del pre- ARNm del gen DMD; o * el dominio de unión a diana de extremo 5' AS comprende por lo menos 20 nucleótidos sucesivos de una de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de entre: SEC ID nº 13 y SEC ID nº 14; o * el dominio de unión a diana de extremo 3' AS' dianiza la unión del ácido nucleico al intrón 23 del pre-ARN del gen DMD; o * el dominio de unión a diana de extremo 5' AS dianiza la unión del ácido nucleico al intrón 22 del pre- ARNm del gen DMD y el dominio de unión a diana de extremo 3' AS' dianiza la unión del ácido nucleico al intrón 23 del pre-ARN del gen DMD; o * el dominio de unión a diana de extremo 5' AS comprende por lo menos 20 nucleótidos sucesivos de una de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de entre: SEC ID nº 13 y SEC ID nº 14, el dominio de unión a diana de extremo 3' AS' dianiza la unión del ácido nucleico al intrón 23 del pre-ARN del gen DMD.

Description

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del gen DMD (SEC ID nº 72 o SEC ID nº 73).
En una forma de realización específica, puede resultar deseable administrar las composiciones farmacéuticas localmente en el área que requiere tratamiento, es decir, en los músculos. Lo anterior puede llevarse a cabo mediante, por ejemplo, aunque de modo no limitativo, infusión local durante cirugía, infusión locorregional bajo presión en una extremidad en la que el flujo sanguíneo arterial y venoso se interrumpe intermitentemente con un torniquete, aplicación tópica, etc., conjuntamente con un vendaje sobre la herida tras la cirugía, mediante inyección, mediante un catéter, mediante un supositorio, o mediante un implante, siendo dicho implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas sialásticas, o fibras. Existen otros sistemas de administración de fármaco de liberación controlada, tales como nanopartículas, matrices tales como polímeros de liberación controlada e hidrogeles. La MPT doble se administra en cantidades que resultan eficaces para producir el efecto deseado en la célula diana. Las dosis eficaces de las MPT dobles pueden determinarse mediante procedimientos bien conocidos de la técnica que se refieren a parámetros tales como la semivida biológica, la biodisponibilidad y la toxicidad. La cantidad de la composición que resultará eficaz dependerá de la gravedad de la DMD bajo tratamiento y podrá ser determinada mediante técnicas clínicas estándares.
La MPT doble también puede administrarse en células o células madre ex vivo que pueden, en una segunda etapa después de la corrección ex vivo, transferirse en forma de trasplante celular a un individuo con el objetivo de corregir un órgano o un individuo afectado por una enfermedad genética mediante terapia celular.
En un segundo aspecto, la presente exposición se refiere a una molécula de ácido nucleico destinada al corte y empalme en trans simple tal como se describe en los ejemplos siguientes.
En la presente forma de realización particular, la molécula de ácido nucleico comprende:
a) un dominio de unión a diana (AS) que dianiza la unión de la molécula de ácido nucleico al pre-ARNm del gen de la distrofina (DMD),
b) una región de corte y empalme 3' que comprende un punto de ramificación, un tramo polipirimidina y un sitio aceptor de corte y empalme 3',
c) una secuencia espaciadora que separa la región de corte y empalme 3' del dominio de unión a diana AS,
d) una secuencia de nucleótidos que debe cortarse y empalmarse en trans al pre-ARNm diana, en el que dicha secuencia de nucleótidos codifica por lo menos una parte del polipéptido DMD.
Dicha molécula de ácido nucleico en adelante se denomina "molécula de corte y empalme en trans simple" o "MPT simple".
Las diferentes partes de dicha molécula de corte y empalme en trans simple (sitio aceptor de corte y empalme 3', punto de ramificación, tramo polipirimidina, secuencia espaciadora) son iguales a las indicadas anteriormente para la MPT que media en el corte y empalme en trans doble, es decir, por ejemplo, SEC ID nº 29 para el sitio aceptor de corte y empalme 3', SEC ID nº 25 para el punto de ramificación, SEC ID nº 28 para el tramo polipirimidina y SEC ID nº 23 para el espaciador del extremo 3'.
De hecho, la presente exposición también muestra en la presente memoria por primera vez una MPT simple que permite la sustitución eficiente de uno o más exones (por ejemplo la sustitución del exón 70 anormal del gen DMD humano por el normal), demostrando de manera destacada que la sustitución del exón o exones específicos resulta posible y eficiente también con una tecnología de corte y empalme en trans "simple" (ver el Ejemplo 2).
En dicha MPT simple, la secuencia de nucleótidos que debe cortarse y empalmarse en trans con el pre-ARNm del gen de la distrofina (DMD) comprende preferentemente uno o varios exones del gen DMD normal, más preferentemente el exón 23 o cualquiera de los exones 59 a 79 del gen DMD. Todavía más preferentemente, la secuencia que debe cortarse y empalmarse en trans es el exón 70 del gen DMD, o el ADNc de todos los exones 59 a 79 del gen DMD, tal como se muestra en el Ejemplo 2, a continuación.
Más exactamente, en la MPT simple, la secuencia de nucleótidos que debe cortarse y empalmarse en trans es la secuencia del exón 23 del gen DMD normal (es decir, SEC ID nº 8 para el gen de ratón o SEC ID nº 60 para el gen humano), o la secuencia del exón 70 del gen DMD (es decir, SEC ID nº 72 para el gen humano, y SEC ID nº 73 para el gen de ratón) o el ADNc correspondiente a los exones 59 a 79 del gen DMD (es decir, SEC ID nº 69 para el gen de ratón o SEC ID nº 70 para el gen humano).
En una forma de realización preferida, el dominio de unión a diana del extremo 5' AS de las MPT simples dirige la unión del ácido nucleico al intrón 22 del pre-ARNm del gen DMD (SEC ID nº 11 para el gen de ratón, o SEC ID nº 61 para el gen humano), o al intrón 58 del pre-ARN del gen DMD (SEC ID nº 66 para el gen de ratón, SEC ID nº 67
para el gen humano).
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1. 2. Resultados
Diseño de moléculas de corte y empalme en trans (moléculas de TS)
En moléculas ExChange, el exón sustituyente se encuentra flanqueado por secuencias intrónicas artificiales con sitios de corte y empalme aceptores y donantes fuertes, las cuales se encuentran conectadas con secuencias antisentido diseñadas para hibridarse con el ARNm diana. La hibridación resulta crucial para permitir la reacción de corte y empalme en trans, aunque por sí sola no resulta suficiente. Idealmente, el sitio de hibridación debe alterar la definición del exón diana en el pre-mensajero parental, potenciando simultáneamente el corte y empalme cruzado entre los dos ARNm independientes. En el caso de ExChange, existen más restricciones, ya que deben sincronizarse dos reacciones de corte y empalme en trans en ambos límites del exón diana.
El modelo murino de DMD, el ratón mdx, porta una mutación sin sentido en el exón 23 (E23m: SEC ID nº 9) del gen de la distrofina. Con el fin de localizar el mejor sitio de hibridación en el intrón 22, cadena arriba del exón mutado, se diseñaron tres moléculas de corte y empalme en trans (CET) para la sustitución 3' que únicamente diferían en los dominios de unión de las mismas (fig. 1A). Se seleccionaron secuencias antisentido de aproximadamente 150 nucleótidos (AS1=SEC ID nº 13, AS2=SEC ID nº 14 y AS3=SEC ID nº 15) para que fueran correspondientes con el extremo 5', la parte intermedia o el extremo 3' del intrón 22 (SEC ID nº 11). La idea era someter a ensayo si la situación de la molécula de CET próxima a su diana, el sitio donante de corte y empalme 5' del intrón 22, o por el contrario, enmascarando el sitio aceptor de corte y empalme 3', facilitaría el corte y empalme en trans. En las tres construcciones, el intrón artificial incluía una secuencia espaciadora (SEC ID nº 59), una secuencia de punto de ramificación de levadura conservado fuerte (SEC ID nº 25), un tramo polipirimidina (SEC ID nº 28) y un sitio aceptor de corte y empalme 3' canónico (SEC ID nº 29). Para facilitar la lectura, se decidió además utilizar el exón 24 (E24 (SEC ID nº 10)) en la molécula de CET en lugar de la versión normal del exón 23 (E23). En efecto, E24 es más pequeño que E23 (114 frente a 213 pb), permitiendo una diferenciación inequívoca mediante RT-PCR del ARNm reparado (E22-E24-E24) de los transcritos parentales no reparados (E22-E23m-E24). De esta manera, se construyeron tres moléculas de CET para la sustitución 3': AS1-E24 (SEC ID nº 40), AS2-E24 (SEC ID nº 41) y AS3-E24 (SEC ID nº 42). A modo de control se utilizó una molécula de corte y empalme en trans sin dominio de unión (AS-, SEC ID nº 43).
Con el fin de facilitar el análisis del corte y empalme de DMD en el cultivo de tejidos, se generó un gen informador de DMD constituido por un fragmento genómico de 3.993 pb que comprendía E22 a E24 con intrones naturales de longitud completa (SEC ID nº 39). Los patrones de corte y empalme en cis y en trans se ilustran en la figura 1B. Se diseñó una estrategia de RT-PCR para detectar específicamente el ARN resultante de los sucesos de corte y empalme en cis y en trans mediante la utilización de un cebador directo E22-F (SEC ID nº 36) (flecha A en la fig. 1B) específico para E22, y un cebador inverso pSMD2-R1 (SEC ID nº 37) (flecha B) específico para una secuencia anterior a la señal poliA en el minigén DMD y las moléculas de CET. Resulta importante que dichos cebadores también permitieron discriminar los amplicones E22-E24 resultantes del corte y empalme en trans o el salto de exones.
Sustitución 3' en transcritos de DMD
Se cotransfectaron plásmidos con minigén informador de DMD y CET en la línea celular de fibroblastos NIH3T3 embrionarios de ratón. Se recolectaron las células 72 h después de la transfección y se aisló el ARN total. Se evaluaron mediante RT-PCR los patrones de ARN cortado y empalmado en cis y en trans. Tal como se esperaba, las muestras que sólo recibieron el minigén DMD expresaron un único amplicón de 638 pb correspondiente al transcritp de DMD cortado y empalmado en cis E22-E23m-E24 (Ctrl en la fig. 1C). Además, los ADNc procedentes de las células transfectadas tanto con el minigén DMD como los constructos de corte y empalme en trans (AS2-E24) no proporcionaron productos de PCR al omitir la transcripción inversa (RT-AS2), garantizando la especificidad del presente ensayo. En presencia de plásmidos U7-SD23-BP22 (U7) que se ha descrito que inducen el salto de E23 (Goyenvalle et al., 2004), se detectó una banda de 425 pb correspondiente al transcrito E22-E24 del corte y empalme en cis.
En muestras que recibieron los plásmidos con minigén DMD y CET, se generó un producto de 310 pb, correspondiente específicamente a la variante E22-E24 cortada y empalmada en trans, y no a un producto de salto de exón tal como se obtuvo con U7. En presencia de AS1-E24 (SEC ID nº 40) o AS2-E24 (SEC ID nº 41), el amplicón E22-E23m-E24 correspondiente al minigén DMD parental prácticamente había desaparecido por completo, confirmando de esta manera que, en este caso, las eficacias de corte y empalme en trans eran prácticamente totales. Resulta importante que el corte y empalme en trans no se produjo al eliminar AS (AS-) de los constructos de CET, demostrando que esta reacción requería una interacción estrecha entre las dos cadenas de ARNm a combinar. La molécula de CET AS3-E24 (SEC ID nº 42) aparentemente resultó ser menos eficiente. Inesperadamente, la extensión de AS3 con el fin de cubrir el sitio aceptor 3' de E23m no mejoró la reacción de corte y empalme en trans (no mostrado). Estos experimentos demuestran que el corte y empalme en trans no podían prescindir de las secuencias AS, aunque situar en posiciones más próximas a los dos ARNm no resulta suficiente.
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Reparación del ARNm mediante la utilización de ExChange
Con el fin de someter a ensayo la posibilidad de reparación del ARNm mediante ExChange, se desarrollaron varias moléculas de ExChange (EX) AS-E24-AS' basadas en las moléculas de CET eficientes indicadas anteriormente, y se modificaron para que se uniesen tanto al intrón 22 como al intrón 23 del minigén informador de DMD (fig. 2A). Las moléculas EX contenían los mismos elementos que los indicados anteriormente en las moléculas de CET AS1-E24 y AS2-E24 seguido de un sitio donante de corte y empalme 5' (SEC ID nº 30) y un segundo intrón 23 director antisentido de 150 nt (SEC ID nº 12). Se seleccionaron cinco antisentido, AS4 (SEC ID nº 16), AS5 (SEC ID nº 17), AS6 (SEC ID nº 18), AS7 (SEC ID nº 19) y AS8 (SEC ID nº 20) dentro del intrón 23 (SEC ID nº 12), que cubrían
2.607 pb. Se utilizaron las secuencias espaciadoras siguientes: para la secuencia espaciadora que separa la región de corte y empalme 3' del dominio de unión a diana del extremo 5' AS, se utilizó el espaciador 2 (SEC ID nº 24, 42 nucleótidos) y para la secuencia espaciadora que separa la región de corte y empalme 5' del dominio de unión a diana del extremo 3' AS', se utilizó el espaciador 1 (SEC ID nº 23, 34 nucleótidos).
Finalmente, se construyeron los MPT siguientes: AS1-E24-AS4 (SEC ID nº 44), AS1-E24-AS5 (SEC ID nº 45), AS1-E24-AS6 (SEC ID nº 46), AS1-E24-AS7 (SEC ID nº 47), AS2-E24-AS4 (SEC ID nº 48), AS2-E24-AS5 (SEC ID nº 49), AS2-E24-AS6 (SEC ID nº 50), AS2-E24-AS7 (SEC ID nº 51), AS2-E24-AS8 (SEC ID nº 52) y AS2-E24-2XAS4 (SEC ID nº 53).
Tal como se ha mencionado anteriormente, los constructos EX y minigén DMD se cotransfectaron en la línea celular NIH3T3. Se recolectaron las células 72 h después de la transfección y se aisló el ARN total. Con el fin de detectar específicamente el ARN resultante de los sucesos de corte y empalme en cis y/o de intercambio de exones, se utilizó un cebador directo E22-F (SEC ID nº 36) (flecha A en la fig. 2A-B) específico de E22 y un cebador inverso pSMD2-R5 (SEC ID nº 38) (flecha C) específico de una secuencia únicamente presente en el minigén DMD cadena arriba de su señal poliA. El direccionamiento de AS-E24-AS' en el pre-ARNm informador de DMD se ilustra en la figura 2A y los tamaños esperados de los diversos productos de amplificación se muestran en la figura 2B.
Se detectó un producto de RT-PCR de 408 pb en las muestras transfectadas con plásmidos AS2-E24-AS' (fig. 2C). La secuenciación directa confirmó que dicho producto correspondía a la variante de ARNm intercambiado E22-E24-E24 (fig. 2D). Dicho producto se encontraba ausente en caso de que se omitiese uno de los dos antisentidos, demostrando que el codireccionamiento de intrón 22 e intrón 23 resulta crucial para el intercambio. Entre las combinaciones de antisentidos sometidas a ensayo por los presentes inventores, los niveles de la banda de 408 pb fueron más fuertes con AS2-E24-2XAS4 (SEC ID nº 53), -AS7 (SEC ID nº 51) y -AS8 (SEC ID nº 52). Resulta interesante que la molécula AS2-E24-2XAS4 (SEC ID nº 53), que portaba dos AS4, resultó más eficiente que su contrapartida de un sólo AS4. En la muestra de AS2-E24-AS7, se detectó una banda complementaria de 294 pb correspondiente al transcrito E22-E24 generó por el salto del exón 23. Esto no resultó inesperado considerando que AS7 se unía al sitio donante de corte y empalme 5' del intrón 23 y que enmascararía su reconocimiento por parte del empalmosoma. Es probable que AS4, AS7 y AS8 volviesen a atraer moléculas EX a una posición más próxima a E23 que AS5 y AS6, sugiriendo que resulta esencial un marco estrecho para un intercambio eficiente.
Optimización de la eficacia de ExChange mediante la adición de intensificadores intrónicos de corte y empalme
Con el fin de mejorar la reacción de ExChange, se añadió el potenciador intrónico de corte y empalme (IICE, SEC ID nº 26) rico en G del gen GH-1 humano cadena arriba del sitio aceptor 3' de AS2-E24-E24 y AS2-E24-AS8 (McCarthy y Phillips, 1998) y la secuencia de DISE del gen FGFR2 de rata cadena abajo del sitio donante 5' (SEC ID nº 27) (Kierun-Duncan y Sullenger, 2007) (fig. 3A). Tal como se muestra en la figura 3B, el análisis de RT-PCR reveló que la inserción de la secuencia de DISE en las moléculas AS2-E24-AS4 (SEC ID nº 54) y AS2-E24-AS8 (SEC ID nº 55) incrementó significativamente la banda de 408 pb correspondiente a la variante de ARNm E22-E24-E24, mientras que la adición de la secuencia de IICE no incrementó la eficacia de intercambio. Tal como se esperaba, no se observó intercambio con los vectores de control que no presentan el AS' cadena abajo: AS2-IICE-E24 y AS2-E24-DISE. La figura 3C muestra la eficacia de intercambio de diversos vectores mediante la utilización de RT-PCR cuantitativa. La molécula AS2-DISE-E24-E24 (SEC ID nº 54) permitió obtener un 53% de intercambio de exones. Se mejoró su eficacia en aproximadamente 7,5 veces en comparación con su contrapartida AS2-E24-AS4 (SEC ID nº 48) que no presentaba el motivo DISE.
Resulta interesante que la introducción de dos AS' cadena abajo redundantes (en la presente memoria AS4) mejoró la eficacia de intercambio, que era de aproximadamente 30%. Sin embargo, AS2-E24-DISE-2XAS4 (SEC ID nº 57) no resultó más eficiente que AS2-DISE-E24-AS4 (SEC ID nº 54) (datos no mostrados).
2. Molécula de corte y empalme en trans simple
2.1. Materiales y métodos:
Construcciones de plásmido
Se construyeron los diferentes dominios de las moléculas de MCET mediante PCR y se subclonaron en pSMD2. Se
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amplificaron los exones de distrofina humana 59 a 79 hasta el codón de parada (2.390 pb, ver la SEC ID nº 70) a partir de ADNc de miotubos humanos, mientras que las secuencias antisentido procedían de ADN genómico humano. La secuencia antisentido se une al intrón 58 de la distrofina: nucleótidos -445 a -295 (en la que el nucleótido +1 es el primer nucleótido de E59, SEC ID nº 68). Los casetes de corte y empalme en trans se subclonaron en el plásmido pRRL-cPPT-mcs-WPRE bajo el promotor PGK_h (Zufferey R. et al., 1997). Todos los constructos se verificaron mediante secuenciación.
Secuencias
El intrón artificial incluía una secuencia espaciadora, una secuencia de punto de ramificación (PR) de levadura conservada fuerte, un tramo polipirimidina (TPP) y un sitio aceptor de corte y empalme (ACE) 3' canónico: las mismas secuencias ya indicadas para la MPT doble del Ejemplo 1.
Cultivos celulares
Se establecieron cultivos celulares de mioblastos DMD primarios a partir de explantes de bíceps tal como se ha descrito anteriormente (Mouly V. et al., 1993), siguiendo la legislación francesa sobre procedimientos éticos. Se cultivaron mioblastos CHQ de DMD y de control (Edom et al., 1994) en medio de crecimiento para células musculares esqueléticas (PromoCell). Para inducir la diferenciación, los cultivos se cambiaron a DMEM suero de caballo al 2% con apotransferrina (100 µg/ml) e insulina (10 µg/ml). Todos los cultivos se cultivaron en incubadores humidificados a 37ºC en 5% de CO2.
Producciones lentivíricas
Se produjeron vectores lentivíricos pseudotipados con la proteína VSV-G, mediante cuadri-transfección transitoria en células 293T, determinada mediante transducción de células HCT116 y sometidas a ensayo mediante PCR en tiempo real cuantitativa en ADN genómico [Charrier S. et al., 2005]. La valoración de los lentivirus se expresa como genomas víricos/ml (vg/ml) (comprendida entre 2,5x109 y 5x109 vg/ml). Se utilizaron 5x106 vg para transducir 4x105 mioblastos sembrados en placa el día anterior en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos en 500 µl de DMEM complementado con SFB al 10%. Cuatro horas después de la transducción, se diluyó el medio mediante la adición de 200 µl por pocillo del medio anterior. Las placas se incubaron durante 24 h a 37ºC y con 5% de CO2 antes del lavado.
Análisis de RT-PCR
Se extrajo el ARN total con miotubos transducidos con reactivo TRIzol (Invitrogen). Se transcribieron inversamente cinco microgramos de ARN utilizando la mezcla SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen) y el cebador inverso Pst1-WPRE-Ro, AACTGCAGcaggcggggaggcggcccaaag (Ro en la fig. 2A). Los ADNc se sometieron a amplificación por PCR anidada con mezcla maestra de PCR de alta fidelidad Phusion con tampón GC (Finnzymes) bajo las condiciones siguientes: 95ºC durante 5 minutos, 20 ciclos de 30 s a 95ºC, 2 minutos a 56ºC, 45 s a 1 minuto a 72ºC, y una etapa final de 7 minutos a 72ºC, utilizando los cebadores externos E58-Fo CATGAGTACTCTTGAGACTG (Fo en la fig. 2A) y WPRE-Ro AGCAGCGTATCCACATAGCG (Ro). A continuación, cinco microlitros de cada una de dichas reacciones se reamplificaron durante 30 ciclos utilizando los cebadores internos E58-Fi, AGGACTAGAGAAACTCTACC (Fi) y WPRE-Ri, TTGTCGACCAGCGTTTCTAG (Ri) Se separaron los productos de RT-PCR mediante electroforesis en geles de agarosa al 1% con bromuro de etidio y se secuenciaron.
Análisis de proteínas
Se cargaron cuarenta mg de proteína en un gel Bis-Tris NuPAGE® Novex 4-12% (Invitrogen), se sometieron a electroforesis, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se sondearon con 1:50 NCL-DYS1 o NCL-DYS2 (NovoCastra), seguido de la incubación con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante
1:15.000 (Jackson ImmunoResearch) y el sistema de análisis SuperSignal® West Pico (Thermo Scientific).
2.2. Resultados
El objetivo del presente trabajo era reparar mediante corte y empalme en trans simple pre-ARNm de distrofina que portaban alguna anomalía genética entre los exones 59 y 79, lo que representa el 8% de los pacientes de Duchenne. Estos pacientes no pueden tratarse con la terapia de salto de exones, ya que estos exones son indispensables para la función de la proteína.
La molécula de corte y empalme en trans simple contiene una secuencia antisentido de 150 nucleótidos complementaria al intrón 58 (SEC ID nº 68), un intrón artificial que incluye una secuencia espaciadora (SEC ID nº 23), una secuencia de punto de ramificación (PR) de levadura conservada fuerte (SEC ID nº 25), un tramo polipirimidina (TPP) (SEC ID nº 28) y un sitio aceptor de corte y empalme 3' canónico (SEC ID nº 29) y el ADNc de distrofina humana normal del exón 59 al codón de parada del exón 79 (SEC ID nº 70) (ver la figura 4). Se diseñó una
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