ES2573636T3 - Métodos para reducir la absorción de fosfato empleando un anticuerpo anti-Npt2B - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo IgY anti-cotransportador de sodio-fosfato de tipo 2B (Npt2B) intestinal que se une a Npt2B de la SEQ ID NO: 1 para su uso en un método para reducir la absorción de fosfato en un sujeto animal humano o no humano en riesgo de desarrollar o de haber desarrollado hiperfosfatemia, el método comprende la etapa de: administrar dicho anticuerpo por vía oral al sujeto en una cantidad eficaz para reducir o mantener la concentración de fosfato en suero en el sujeto.

Description

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Los fragmentos correspondientes pueden identificarse fácilmente por un experto en la materia mediante cualquier programa de alineamiento familiar. Por ejemplo, Gapped BLAST puede utilizarse como se describe en Altschul et al. (Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402, 1997). Gapped BLAST se encuentra disponible en la página web del CNIB. Cuando se utiliza el programa Gapped BLAST, pueden emplearse los parámetros por defecto del programa.

Ello se encuentra adecuadamente dentro de la capacidad de un experto en la técnica para fabricar un anticuerpo anti-Npt2B intestinal, tal como un anticuerpo IgY o anticuerpo que se une a un epítopo en un bucle extracelular de Npt2B. En algunas realizaciones, el anticuerpo empleado en el método se obtiene a partir de un huevo (p. ej., yema de huevo), en particular de un huevo aviar, tal como un huevo de gallina. El método de Polson, A., M. B. von Wechmar y M. H. van Regenmortel, "Isolation of Viral IgY Antibodies from Yolks of Immunized Hens," Immunological Communications 9:475-493 (1980), puede utilizarse para producir una preparación de anticuerpos de yema de huevo. Las gallinas ponedoras pueden inocularse con una proteína Npt2B intestinal o un fragmento inmunogénico de la misma de un bucle extracelular. Preferentemente, un adyuvante apto se administra junto con la inoculación para potenciar la inmunización. Un adyuvante útil para este fin es un adyuvante en emulsión de agua en aceite, tal como el adyuvante completo de Freund. La proteína Npt2B intestinal o un fragmento inmunogénico de la misma a partir de un bucle extracelular provoca que las gallinas produzcan anticuerpos anti-Npt2B intestinal que se transfieren de manera pasiva a la yema de huevo de los huevos puestos por las gallinas. Las yemas de huevo o los huevos enteros que contienen el anticuerpo pueden recogerse y homogeneizarse para formar una emulsión. La emulsión resultante puede secarse para formar un producto en polvo que contiene el anticuerpo. Este producto en polvo puede formularse a continuación de forma apropiada para la administración oral y luego se administra por vía oral a un sujeto animal humano o no humano. La preparación puede administrarse por vía oral como un complemento nutricional o alimenticio.

Se contemplan anticuerpos de cualquier clase o subclase de isotipo (p. ej., IgY, IgG, IgM, IgD, IgA, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) así como fragmentos de los mismos (cuando se producen por digestión enzimática o química de dichos anticuerpos) y la preparación de dichos anticuerpos por medios sintéticos o por expresión de secuencias génicas codificantes de dichos anticuerpos o fragmentos de los mismos, en una realización de IgY, los anticuerpos de las yemas de huevo de un animal aviar (p. ej., pollos, faisanes, patos, pavos, gansos y similares) se utilizan para practicar la presente invención (véanse, p. ej., las patentes de Estados Unidos n.º 5.080.895, 5.989.584 y 6.213.930). Los kits de purificación de anticuerpos de huevo comercialmente disponibles, tales como EGGstract® IgY Purification Systems (Promega; Madison, WI) o Eggcellent® Chicken IgY Purification (Pierce Biotechnology, Inc.; Rockford, IL), pueden utilizarse para purificar los anticuerpos. Los anticuerpos pueden purificarse asimismo en base a su afinidad con péptidos o fragmentos proteicos utilizando medios convencionales para la purificación por afinidad. Alternativamente, los huevos, las yemas de huevo o la yema de huevo seca en polvo que contienen los anticuerpos pueden mezclarse directamente con un alimento para el consumo oral o introducirse fácilmente en una pastilla, comprimido, o cápsula. Los genes codificantes de dichos anticuerpos también pueden identificarse empleando dichos anticuerpos por medio de técnicas de clonación molecular o de expresión en fagos bien establecidas que dan lugar a formas monoclonales completas o parciales de dichos anticuerpos que podrían utilizarse solos o en combinación.

Las composiciones que contienen anticuerpos anti-Npt2B intestinal según la presente invención pueden dosificarse,

p. ej., una vez, dos veces o tres veces al día. La dosificación puede opcionalmente subdividirse de modo en la que una parte de la dosis prescrita se ingiere antes del consumo de alimentos o bebidas, otra parte se ingiere junto con alimentos o bebidas, y otras partes se ingieren en el momento próximo posterior a la ingesta de alimentos o bebidas. Los principios activos pueden administrarse por vía oral en forma de partículas o polvo espolvoreados o distribuidos en, o dentro de, alimentos; o disueltos o suspendidos en bebidas; o proporcionados en formas de dosificación sólida farmacéuticas, tales como comprimidos, cápsulas, y polvos, o en formas de dosificación líquida, tales como elixires, jarabes, y suspensiones. En algunas realizaciones, el anticuerpo se administra con alimentos o próximo (es decir, aproximadamente una hora antes o después) al consumo de un alimento que contiene fosfato dietético. En algunas realizaciones, el anticuerpo se administra de forma concomitante con un aglutinante de fosfato.

Composiciones farmacéuticas a modo de ejemplo según la presente invención comprenden IgY y opcionalmente componentes de huevo, o IgY y opcionalmente componentes de yema de huevo, opcionalmente con estabilizadores adicionales o transportadores farmacéuticamente aceptables. Los huevos enteros, o yemas de huevo, o yemas de huevo de las cuales los lípidos se eliminan parcialmente o en gran parte pueden emulsionarse, mezclarse opcionalmente con un compuesto de encapsulación o lioprotector, y someterse a secado por pulverización o liofilización para formar un producto en polvo.

Los anticuerpos de yema pueden purificarse parcialmente, p. ej., para eliminar grandes cantidades de lípidos. Véase Camenisch C et al., FASEB J. 1999, 13:81-88; Akita E & Nakai S, J. Immunol. Methods 1993, 160:207-214; así como la publicación de la patente de Estados Unidos n.º 2004/0087522.

Las cápsulas o comprimidos pueden contener una formulación de liberación prolongada que puede proporcionarse en una dispersión de compuesto activo en hidroxipropilmetilcelulosa o material conocido relacionado para alterar la cinética de liberación del agente activo. Las formas de dosificación sólida pueden fabricarse como productos de liberación sostenida que proporcionan una liberación continua del medicamento durante un periodo de horas

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empleando técnicas farmacéuticas conocidas. Los comprimidos obtenidos por compresión pueden edulcorarse o recubrirse con una película para enmascarar cualquier sabor desagradable y proteger el comprimido de la atmósfera, o recubrirse de forma entérica para la desintegración selectiva en el tubo digestivo. Tanto las formas de dosificación oral sólida y líquida pueden contener colorantes y saborizantes que aumentan la aceptación del paciente.

Los estabilizadores son agentes protectores que mantienen la actividad de unión del anticuerpo en condiciones desnaturalizantes, tales como calor o ácido. El estabilizador no inhibe la interacción de los anticuerpos con el antígeno diana, de modo que el efecto biológico deseado también se mantiene. Estabilizadores a modo de ejemplo incluyen clara de huevo, albúmina o compuestos sacáridos. Preferentemente, el compuesto sacárido está presente en aproximadamente 5 % a 30 % del huevo líquido entero (en peso), y más preferentemente en la cantidad de 10 % a 20 % del huevo líquido entero (en peso). El anticuerpo se mezcla con un compuesto sacárido en una suspensión líquida y la suspensión se seca después para producir un sólido que contiene la proteína y el sacárido. Los compuestos sacáridos útiles como estabilizadores incluyen monosacáridos, disacáridos, polisacáridos, monosacáridos alquilados, disacáridos alquilados, polisacáridos alquilados, alcoholes monosacáridos y alcoholes monosacáridos alquilados. Preferentemente, dichos compuestos sacáridos se componen o se basan en unidades monosacáridas de 5 o 6 átomos de carbono. Los monosacáridos son residuos de un único azúcar con la fórmula (CH2O)n, en la que n es 3 o más. Ejemplos de monosacáridos incluyen, entre otros, glucosa, ribosa, fructosa, galactosa, talosa, arabinosa, fucosa, manosa, xilosa y eritrosa. Los monosacáridos en todas las formas isómeras, tales como α-isómeros, ß-isómeros, isómeros D e isómeros L poseen actividad. Los disacáridos son moléculas con dos residuos monosacáridos unidos por un enlace glicosídico. Ejemplos de disacáridos que pueden emplearse en la presente invención incluyen, entre otros, trehalosa, maltosa, sacarosa, lactosa, maltosa y lactulosa. Los polisacáridos son moléculas con tres o más monosacáridos unidos entre sí en cadenas no ramificadas o cadenas ramificadas lineales. El almidón, el glicógeno y la celulosa son ejemplos de polisacáridos con cientos o incluso miles de residuos monosacáridos. El almidón puede contener cadenas no ramificadas lineales (amilosa) o cadenas altamente ramificadas (amilopectina). El glicógeno contiene cadenas ramificadas y la celulosa contiene cadenas no ramificadas lineales. Los monosacáridos alquilados, disacáridos alquilados y polisacáridos alquilados son monosacáridos, disacáridos y polisacáridos con al menos uno de los grupos hidrógeno sustituidos con un grupo alquilo. Los alcoholes monosacáridos son polioles acíclicos que contienen tres o más grupos hidroxilo. Estos pueden formarse al convertir los grupos cetona o aldehído de los monosacáridos a grupos hidroxilo. Ejemplos de alcoholes monosacáridos incluyen, entre otros, glicerina, manitol, sorbitol, xilitol, lactitol, isomalta, maltitol, e hidrolizados de almidón hidrogenado. Los alcoholes monosacáridos alquilados son alcoholes monosacáridos con al menos uno de los grupos hidrógeno sustituido con un grupo alquilo.

Los anticuerpos también pueden unirse a un sustrato de matriz (polimérica o no polimérica) para fines de potenciar la eficacia o estabilidad de los anticuerpos y a continuación se administran.

La invención se comprenderá mejor tras la consideración de los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1

Inhibición del transporte de fosfato por anticuerpos anti-Npt2B intestinal

Materiales y métodos

Animales: Se utilizaron gallinas ponedoras Single Comb White Leghorn para la producción de anticuerpos (3 gallinas por antígeno peptídico). Cada antígeno peptídico Npt2B intestinal humano (véase la Tabla 1 a continuación para la secuencia y la Fig. 1 para la localización de la proteína cotransportadora) se preparó conjugando un péptido a la globulina gamma bovina utilizando el procedimiento de glutaraldehído convencional.

Tabla 1. La secuencia aminoácida de péptidos se empleó para producir anticuerpos de huevo. Las secuencias de aminoácidos se basan en regiones conservadas previstas de Npt2B intestinal entre especies animales. Las regiones de interés incluyen una superficie hidrófila en los bucles extracelulares 1-3. 5

Péptido arbitrario n.º (SEQ ID NO) 11 (SEQ ID NO:5) 12 (SEQ ID NO:6) 13 (SEQ ID NO:7) 14 (SEQ ID NO:8) 15 (SEQ ID NO:9) 16 (SEQ ID NO:10) 17 (SEQ ID NO:11) 18 (SEQ ID NO:12) 19 (SEQ ID NO:13)

secuencia de aminoácidos (posiciones de aminoácidos en la SEQ ID NO:1) LVGGKMAG (124-131) FHFKNGED (252-259) LKVITKPF (264-271) LDKKVISQ (278-285) SLVKIWCK (297-304) TSPSLCWT (323-330) YPLTLGSN (455-462) TTAILAAL (467-474) VQSSSVFT (430-437) ubicación de la enzima ECL-11 ECL-2 PRÓXIMO A D-3 ECL-2 PRÓXIMO A D-3 ECL-2 SUPERIOR A D-3,4 ECL-2 SUPERIOR A D-3,4 ECL-2 PRÓXIMO A D-4 ECL-3 PRÓXIMO A D-6 ECL-3 PRÓXIMO A D-6 ECL-3 PRÓXIMO A D-5

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Péptido arbitrario n.º (SEQ ID NO) secuencia de aminoácidos ubicación de la enzima (posiciones de aminoácidos en la

SEQ ID NO:1) 20 (SEQ ID NO:14) LIGIGVIT (443-450) ECL-3 PRÓXIMO A D-5 31 (SEQ ID NO:15) EVATHYLE (235-242) ECL-2 PRÓXIMO A D-3 32 (SEQ ID NO:16) GIQNWTMK (332-339) ECL-2 PRÓXIMO A D-4 33 (SEQ ID NO:17) FVNFHLPD (354-361) ECL-2 PRÓXIMO A D-4 34 (SEQ ID NO:18) SPGNALRS (476-483) ECL-2 PRÓXIMO A D-4 35 (SEQ ID NO:19) ENIAKCQH (345-352) ECL-3 PRÓXIMO A D-6 1ECL = bucle extracelular. Existen 8 dominios transmembrana (D) en Npt2B intestinal y 4 bucles extracelulares (ECL). Próximo a D es el más próximo al dominio. T = superior que significa espaciado a intervalos iguales entre los dominios expuestos. Véase la Fig. 1.

Preparación de la conjugación: Si bien el procedimiento para la conjugación de péptidos a proteínas transportadoras puede variar considerablemente (puede obtenerse un número de kits de conjugación de Pierce Scientific), así como la naturaleza de las proteínas transportadoras, el método utilizado en los estudios descritos en este ejemplo implicaba el uso del procedimiento de glutaraldehído para la conjugación del péptido deseado a la proteína transportadora de globulina gamma bovina (GgB). GgB (4 mg) se mezcló en 0,8 ml de tampón de acetato de sodio 0,1 M (pH = 7) con 4 mg del péptido deseado. Se añadieron 0,52 ml de glutaraldehído 0,02 M (en tampón de acetato de sodio 0,1 M) gota a gota (para evitar la formación de espuma) a la mezcla de proteína transportadora peptídica. La mezcla se agitó durante 2 horas. A continuación se añadieron 20 mg de glicina para detener la reacción. La mezcla se dejó reposar durante 1 hora y luego se dializó contra la solución salina tamponada fosfato (pH = 7) durante la noche (PM = 6.000-8.000). El conjugado dializado se congeló a -80 ºC hasta su uso.

Preparado vacunal y uso: Para preparar una vacuna para cada gallina se diluyeron 0,5 mg de conjugado a una concentración final de 0,5 ml de STF y se mezcló con 0,5 ml de adyuvante completo de Freund (primera inyección) o adyuvante incompleto (vacuna de refuerzo) para formar una emulsión de agua en aceite capaz de resistir una microesfera cuando se aplicaron gotas en agua con hielo. A continuación, se le inyectó a la gallina en cuatro sitios (en cada muslo y en cada pechuga) con 0,25 ml de vacuna de emulsión por vía intramuscular. La inyección de refuerzo en adyuvante incompleto se realizó 7 días más tarde. Cada péptido mostrado en la Tabla 1 se conjugó por separado a GgB y se inyectó en 3 gallinas ponedoras.

Preparación de la muestra del anticuerpo: Los picos de los anticuerpos se alcanzaron a los 21 días, por lo tanto, los huevos se recogieron desde el día 21 al día 110. En aproximadamente 30 días, las yemas de huevo de cada gallina se separaron de los huevos enteros, se mezclaron y se liofilizaron. Se recogió una muestra de huevos de cada gallina, las yemas se separaron e IgY era polietileno purificado utilizando procedimientos descritos en Polson et al., Immunol. Commun. 1980, 9:475-493). Los anticuerpos preparados utilizando este método se congelaron (-20 ºC) y sirvieron como reactivos para cultivo celular y ensayo enzimático in vitro.

Células: Las células Caco-2 se obtuvieron de CACT (n.º HTB-37, CACT). La línea celular Caco-2 es una línea celular de adenocarcinoma colorrectal y se utilizó para mostrar los enterocitos intestinales en este estudio.

Ensayo de absorción de fosfato: El medio procedente de una monocapa subconfluente de células Caco-2 se eliminó y las células se lavaron con un tampón A (137 mM de NaCl, 5,4 mM de KCl, 2,8 mM de CaCl2, 1,2 mM de MgSO4, 14 mM de Tris-HCl, pH 7,4 = tampón de sodio) o con un tampón B (137 mM de cloruro de colina, 5,4 mM de KCl, 2,8 mM de CaCl2, 1,2 mM de MgSO4, 14 mM de Tris-HCl, pH 7,4 = tampón libre de sodio). Un ml de tampón A o B que contiene el anticuerpo a 0,1 mg/ml se añadió a las células y se incubó durante 1 hora a 37 ºC. Después de una hora de incubación, el tampón A o tampón B se aspiró y se añadieron 100 µl de tampón A o tampón B que contiene K2H32PO4 (1 µCi/ml). Las células se incubaron durante otros 20 min a 37 ºC. Durante el periodo de incubación, la placa se agitó de forma continua a 100 rpm/minuto. La absorción de fosfato finalizó por la eliminación de los tampones de absorción y lavando las células con una solución quelante helada (14 mM de Tris-HCl, pH 7,4 y 137 mM de cloruro de colina). Se lisaron las células y se recogieron utilizando una solución al 1 % de Triton X-100. Las alícuotas se añadieron al líquido de centelleo y la radiactividad se determinó mediante recuento por centelleo líquido. La diferencia de radiactividad recuperada entre los ensayos, utilizando los dos tampones (tampón A y tampón B), representa el transporte de sodio dependiente de fosfato.

Resultados

Como se muestra en la Fig. 2 con células Caco-2, los anticuerpos contra los péptidos 12, 14, 15, 16, 17, y 18 inhibieron el transporte de fosfato. La eficacia relativa de inhibición era 16>17>18>12>15=14. Los anticuerpos contra el péptido 16 y péptido 17 eran más eficaces que la nicotinamida (control positivo para inhibir la absorción de fósforo) en la inhibición de transporte de fosfato.

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Ejemplo 2

Efecto de anticuerpos anti-Npt2B intestinal en la ganancia de peso corporal, concentración de fosfato en plasma, y excreta de fosfato.

Materiales y métodos

La producción de anticuerpos anti-Npt2B intestinal humano utilizando diversos péptidos Npt2B se ha descrito en el Ejemplo 1 previo. En lugar de anticuerpos IgY purificados, se empleó directamente yema seca en polvo que contiene los anticuerpos del estudio de alimentación expuesto en este ejemplo.

Se asignaron pollos macho Single Comb White Leghorn de un día de vida (2 cercados de cinco pollos) a una dieta control o una dieta de anticuerpos (1 g/kg dieta de anticuerpo de yema de huevo liofilizada) a uno de los 14 péptidos de Npt2B (péptidos 11-20 y 31-34 de la Tabla 1). La dieta control es una dieta adecuada de nutrientes convencionales basada en harina de maíz-soja y contenía 1 g/kg dieta de adyuvante inyectado en la yema de huevo seca en polvo del control. La dieta de anticuerpo es la misma que la dieta control salvo que el producto en polvo del anticuerpo específico para péptido sustituyó al polvo de control. Los pollos se alimentaron con las dietas durante 21 días. A continuación, se determinaron los pesos corporales, se recogieron muestras de sangre para determinar el nivel total de fósforo en plasma empleando un analizador Roche/Hitachi (basado en la reacción de fosfato con molibdato de amonio para formar fosfomolibdato de amonio sin reducción), y la muestra de excretas de los últimos 3 días de dietas se recogieron para cada cercado y se analizaron para el fósforo total (peso seco).

Resultados

Como se muestra en la Tabla 2, los anti-péptidos 11, 13, 15-17, 20, 31, y 32 suprimieron la ganancia de peso corporal; los anti-péptidos 20, 32, y 34 redujeron los niveles de fosfato en plasma; y los anti-péptidos 11, 12, 14, 1720, y 32 aumentaron las excretas de fósforo.

Tabla 2. El efecto de alimentación con un anticuerpo de huevo (1 g/kg dieta) para seleccionar péptidos de Npt2B intestinal en la ganancia de peso corporal, concentración de fósforo en plasma, y excretas de fósforo.1

Ganancia de peso Fosfato en sangre Excreta de fosfato Promedio de tratamiento corporal (g)2 (mg/dl)3 (%)4 excreta de fosfato4

control

183 ± 8,4 6,6 ± 0,5 1,24, 1,26 1,25

anti-péptido 11 anti-péptido 12 anti-péptido 13 anti-péptido 14 anti-péptido 15 anti-péptido 16 anti-péptido 17 anti-péptido 18

164 ± 6,16 180 ± 5,9 166 ± 107 175 ± 3,9 170 ± 8,67 145 ± 145 165 ± 7,56 178 ± 6,2 6,6 ± 0,2 6,2 ± 0,4 6,3 ± 0,4 6,6 ± 0,2 6,7 ± 0,4 6,7 ± 0,3 6,3 ± 0,1 6,6 ± 0,1 1,3, 1,44 1,38, 1,46 1,16, 1,34 1,42, 1,22 1,38, 1,18 1,02, 1,22 1,32, 1,5 1,7, 1,2 1,37 1,42 1,25 1,32 1,28 1,12 1,41 1,45

anti-péptido 19 anti-péptido 20 anti-péptido 31 anti-péptido 32 anti-péptido 33 anti-péptido 34

176 ± 8,0 170 ± 107 169 ± 7,07 163 ± 9,25 177 ± 9,5 182 ± 5,2 6,4 ± 0,3 6,0 ± 0,29 6,3 ± 0,2 5,7 ± 0,38 6,6 ± 0,2 6,0 ± 0,210 1,32, 1,34 1,36, 1,5 1,16, 1,12 1,28, 1,4 1,14, 1,18 1,22, 1,24 1,33 1,43 1,14 1,34 1,16 1,23

1Dos cercados de cinco pollos macho Single Comb White Leghorn de un día de vida se alimentaron con un nutriente adecuado (dieta de iniciación de pollo para aves de corral UW-Standard) con yema de huevo en polvo de control (1 g/kg dieta de yema de huevo seca de gallinas inyectadas con solo adyuvantes) o yema de huevo en polvo (1 g/kg dieta) de gallinas inmunizadas con los antígenos peptídicos indicados. Los pollos se criaron durante 3 semanas y se midió la ganancia de peso corporal durante este periodo (menos peso inicial). A los 21 días de vida, a todos los pollos se les tomó muestras de sangre, se recogió y se analizó el plasma del fósforo. Se recogieron todas las excretas a partir de los soportes para excrementos situados bajo cada cercado para pollos durante los últimos 3 días del estudio, se recogieron y se analizaron para el fósforo total.2Ganancia ± error estándar = peso en el día 21 menos peso inicial.3Fósforo en plasma ± error estándar.4Se tomaron muestras a dos cercados y se analizaron. Se muestran los valores brutos (% de materia seca) y la media. 6*, 5**, 7*** indican p <0,05**, p <0,07* y p <0,1*** con respecto al control.5p <0,05; 6p <0,07; 7p <0,1; 8p = 0,07; 9p = 0,13; y 10p = 0,16.

Ejemplo 3

Efecto de anticuerpos anti-Npt2B intestinal en la ganancia de peso corporal, concentración de fosfato en plasma, y ceniza ósea

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Materiales y métodos

La producción de anticuerpos anti-Npt2B intestinal humano utilizando el péptido 16 se ha descrito en el Ejemplo 1 previo. En lugar de anticuerpos IgY purificados, se empleó directamente yema seca en polvo que contiene los anticuerpos del estudio de alimentación expuesto en este ejemplo.

A los pollos de engorde de siete días de vida se les asignó una dieta control (4 cercados de 5 pollos de engorde) o una dieta con anticuerpos (1 g/kg dieta de anticuerpo de yema de huevo liofilizada) (8 cercados de 5 pollos de engorde). La dieta control es una dieta adecuada de nutrientes convencionales y contenía 1 g/kg dieta de yema de huevo en polvo inyectada con adyuvante de control. La dieta de anticuerpo es la misma que la dieta de control salvo que el producto en polvo del anticuerpo anti-péptido 16 sustituye el polvo de control. Las dietas se iniciaron cuando los pollos tenían 7 días de vida y se alimentaron hasta los 21 días de edad. Los pesos corporales se determinaron en el día 14 y día 21. En el día 21, se recogieron muestras de sangre para determinar el nivel total de fósforo en plasma empleando un analizador Roche/Hitachi (basado en la reacción de fosfato con molibdato de amonio para formar fosfomolibdato de amonio sin reducción), y la tibia derecha se extrajo para determinar la ceniza ósea seca libre de grasa (el éter se extrae, se seca, y se calcina en un horno de mufla y la relación de ceniza/hueso libre de grasa seco se determinó y se convirtió en %).

Resultados

Como se muestra en la Tabla 3, los pollos de engorde alimentados con anticuerpos contra péptido 16 redujeron en el día 14 la ganancia de peso corporal en comparación con los pollos de engorde alimentados con el anticuerpo de yema en polvo con adyuvante del control (413 g contra 495 g del grupo de dieta del antipéptido 16 y grupo de dieta del control, respectivamente, p = 0,08). El fósforo en plasma no difirió entre estos dos grupos de tratamiento (6,12 mg/dl frente a 6,14 mg/dl para el grupo de dieta del anti-péptido 16 y grupo de dieta de control, respectivamente). Los pollos de engorde alimentados con el anticuerpo contra péptido 16 redujeron el contenido mineral óseo en comparación con los pollos de engorde alimentados con el anticuerpo de yema en polvo con adyuvante del control (0,524 % frente a 0,539 % para el grupo de dieta de anti-péptido 16 y grupo de dieta de control, respectivamente). Los pollos de engorde son razas de crecimiento muy rápido en relación con Leghorn. El peso corporal durante las primeras 3 semanas en pollos de engorde aumenta desde 35 gramos a aproximadamente 500-600 gramos (un aumento de más de 15 veces), mientras que en Leghorn el incremento es de 35 g hasta solo aproximadamente 180 g (incremento 5-6 veces). Por consiguiente, la ganancia de peso corporal en el pollo de engorde puede ser un indicador sensible al fósforo disponible dietético. A partir de los datos de ceniza ósea, la prioridad para mantener fosfato en sangre es mayor en esta raza que el fortalecimiento de huesos y el crecimiento muscular. Esto respalda que el crecimiento es el indicador más sensible en esta raza.

Tabla 3. El efecto de alimentación con un anticuerpo de huevo (1 g/kg dieta) contra péptido 16 de Npt2B intestinal en la ganancia de peso corporal, concentración de fósforo en plasma, y ceniza ósea.

Control

Anti-péptido 16

Ganancia de peso corporal (g)

495 ± 15* 413 ± 16*

Fosfato en plasma (mg/dl)

6,14 ± 0,31 6,12 ± 0,19*

Ceniza ósea (%)

0,539 ± 0,005** 0,524 ± 0,005**

*Los pollos de engorde alimentados con anticuerpo contra péptido 16 redujeron en el día 14 la ganancia de peso corporal en comparación con los pollos de engorde alimentados con el anticuerpo de yema en polvo con adyuvante del control (p = 0,0003). **Los pollos de engorde alimentados con anticuerpo contra péptido 16 redujeron el contenido de mineral óseo en comparación con los pollos de engorde alimentados con el anticuerpo de yema en polvo con adyuvante del control (p = 0,02).

Ejemplo 4

El anticuerpo administrado por vía oral puede alcanzar y bloquear la actividad de una proteína asociada a la membrana del borde en cepillo intestinal

Materiales y métodos

Preparación del anticuerpo: Las gallinas ponedoras Single Comb White Leghorn se utilizaron para la producción de anticuerpos (3 gallinas por antígeno peptídico). La fosfatasa alcalina intestinal de pollo se adquirió en Worthington. Para preparar una vacuna para cada gallina se diluyeron 0,5 mg de fosfatasa alcalina intestinal de pollo a una concentración final de 0,5 ml de STF y se mezcló con 0,5 ml de adyuvante completo de Freund (primera inyección) o adyuvante incompleto (vacuna de refuerzo) para formar una emulsificación de agua en aceite capaz de resistir una microesfera cuando se aplicaron gotas en agua con hielo. A continuación, se le inyectó a la gallina en cuatro sitios

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(en cada muslo y en cada pechuga) con 0,25 ml de vacuna de emulsión por vía intramuscular. La inyección de refuerzo en adyuvante incompleto se realizó 7 días más tarde.

Los picos de los anticuerpos se alcanzaron a los 21 días, por lo tanto, los huevos se recogieron desde el día 21 al día 110. En aproximadamente 30 días, las yemas de huevo de cada gallina se separaron de los huevos enteros, se mezclaron y se liofilizaron. La yema de huevo seca en polvo que contiene el anticuerpo se almacenó a temperatura ambiente hasta su uso en estudios de alimentación animal.

Experimento animal: El modelo de pollo utilizado en este estudio se describió en Biehl y Baker, J. Nutr. 1997, 127:2054-2059, con la excepción de anticuerpos contra fosfatas alcalinas intestinales. El control negativo utilizado en este estudio era una dieta deficiente en Pi (Pi = fosfato inorgánico, que es en gran medida fosfatos minerales o fosfato procedente de tejidos animales y productos tales como leche y huevos), en la que el fósforo dietético utilizado era fosfato fítico. Como se muestra en los resultados siguientes, este tratamiento dietético produjo niveles bajos de fósforo en plasma. El control positivo era la misma dieta que el control negativo, pero suplementado con 1αhidroxivitamina D3 (20 µg/kg dieta, Sigma). Como se muestra en los resultados siguientes, este tratamiento dietético aumentó los niveles de fósforo en sangre en comparación con el control negativo. Todos los tratamientos dietéticos restantes eran el control positivo más el anticuerpo (1 g de yema de huevo seca en polvo producida como ya se ha descrito). Los controles positivos y negativos se alimentaron con 1 g/kg dieta de yema seca en polvo de gallinas inyectadas con el adyuvante. Estas yemas de huevo en polvo carecían de anticuerpos específicos.

Se utilizó un total de 3 tratamientos (control negativo, control positivo, control positivo más anticuerpos anti-fosfatasa alcalina intestinal de pollo). A cada uno de los pollos macho Single Comb White Leghorn de seis días de vida se les asignó los tratamientos dietéticos. Los pollos se alimentaron con los tratamientos dietéticos durante 10 días, se pesaron, después se recogieron muestras de sangre para determinar la concentración de fósforo en plasma empleando un analizador Roche/Hitachi (basado en la reacción de fosfato con molibdato de amonio para formar fosfomolibdato de amonio sin reducción).

Resultados

Los anticuerpos contra fosfatasa alcalina intestinal de pollo eran eficaces en reducir los niveles de fósforo en plasma (Tabla 4).

Tabla 4. Fósforo en plasma de los pollos alimentados con anti-fosfatasas alcalinas intestinales (FAI) en presencia de

1Los pollos Leghorn de un día de vida (n=6) se alimentaron con una dieta deficiente en Pi que contiene fósforo fítico

vitamina DI activa

Tratamiento dietético

(mg/dl) Fosfato en plasma Error estándar

Deficiente en Pi Vitamina D2 activa

3,92 6,70 0,35 0,51

FAI*** de pollo

4,73 0,29

con la adición de solo 1α-hidroxivitamina D3 (vitamina D activa, 20 µg/kg dieta) o la adición de 1α-hidroxivitamina D3 más un anticuerpo de huevo (1 g/kg dieta de anticuerpo de yema de huevo seca en polvo) contra fosfatasa alcalina intestinal de pollo. El fósforo en plasma se midió tras 10 días con alimentación a base de la dieta.2Los pollos de la dieta de vitamina D activa (1α-hidroxivitamina D3) habían aumentado el fósforo en plasma en relación con los pollos con dieta deficiente en Pi (p = 0,0004). **Los pollos alimentados con la dieta de vitamina D activa (1α-hidroxivitamina D3), suplementada con anticuerpos contra fosfatasa alcalina intestinal de pollo habían reducido el fósforo en plasma en relación con el tratamiento único con vitamina D activa a p <0,05.

Ejemplo 5

Reducir el nivel de fosfato en suero en animales urémicos inducidos por adenina

El modelo animal utilizado en este ejemplo es el modelo de rata urémica inducida por adenina (véanse, p. ej., Yokazawa et al., Nephron 1986, 44:230-234; Katsumata et al., Kid Intl 2003, 64:441-450; y Levi R et al., J Am Soc Nephrol 2006, 17:107-112).

Las ratas (p. ej., ratas macho Sprague Dawley de aproximadamente 175-250 g, hasta 10 ratas por grupo) se alimentaron con una dieta control o una dieta de adenina inducida por uremia (p. ej., que contiene adenina al 0,75 %) durante un periodo de semanas (p. ej., 3 a 5 semanas o más). Las ratas alimentadas con la dieta de adenina desarrollarán hiperfosfatemia con un nivel de fosfato en suero superior a 4,4 mmol/l. Estas ratas también desarrollarán deficiencia en vitamina D3, (1α-hidroxivitamina D3 y 1α, 25-dihidroxivitamina D3). El tratamiento oral diario de estas ratas alimentadas con la dieta de adenina aumentó la cantidad del anticuerpo anti-Npt2B intestinal, como los descritos en el Ejemplo 1 dará lugar a una reducción dependiente de la dosis de los niveles de fosfato en suero. Si estos anticuerpos se administran en las primeras 4 semanas de tratamiento con adenina y de aquí en

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