ES2562609T3 - Patrones para inmunoensayo y medición de biomarcadores clínicos usando patrones de calibración intra-ensayo - Google Patents

Patrones para inmunoensayo y medición de biomarcadores clínicos usando patrones de calibración intra-ensayo Download PDF

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Abstract

Un peptido Aß42 modificado que comprende el dominio inmunorreactivo N-terminal y el dominio inmunorreactivo C-terminal de Aß42, en el que los aminoacidos del dominio de agregacion central 17-20 y diversas longitudes del peptido C-terminal adyacente estan reemplazados con un enlazador seleccionado de: - un enlazador que tiene la secuencia de aminoacidos EERP o DREPNR, - enlazadores que consisten en un numero entero de restos de lisina o un numero entero de restos de acido glutamico o un numero entero de restos de alanina, - polietilenglicoles (PEG) y - dendrimeros y copolimeros ramificados capaces de acoplar restos de aminoacidos.

Description

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Aβ42, Aβ40 o Aβ38.
El analito y/o patrón de referencia puede unirse a varias superficies. Una superficie podría ser cualquier superficie de fase sólida a la cual un anticuerpo o patrón de referencia pueda ser inmovilizado mediante enlace covalente,
5 absorbancia pasiva, biotina-estreptavidina o cualquier otro enlace conocido por experto con conocimientos ordinarios en la técnica. Por ejemplo, la superficie puede ser una esfera, placa, portaobjetos, fibra, sensores de resonancia de plasmones superficiales o cualquier superficie sólida.
En otra realización, el método se lleva a cabo en una placa multi-pocillos, filtro de nitrocelulosa o sobre un
10 portaobjetos de vidrio. En otra realización, la primera y segunda señales son detectadas por fluorescencia. Por ejemplo, la primera señal y segunda señal puede ser una señal seleccionada del grupo que consiste en ficoeritrina, Alexa 532, estreptavidina-ficoeritrina y estreptavidina-Alexa 532. En otra realización, la señal se detecta por actividad enzimática (es decir, peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina), quimioluminiscencia, radioactividad, emisión infraroja, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) o cualquier otro método conocido por
15 cualquier experto con conocimientos ordinarios en la técnica.
En otro aspecto, la invención comprende un kit para llevar a cabo un inmunoensayo para detectar un péptido Aβ42, comprendiendo el kit un patrón de referencia de la invención.
20 Comparación del rendimiento del patrón o calibrador del inmunoensayo novedoso frente a Aβ42 nativo
El rendimiento de los patrones o calibradores para inmunoensayo novedosos debe ser comparable al del Aβ42 nativo en un inmunoensayo. Los péptidos Aβ42 de longitud completa nativos pueden ser sintetizados usando técnicas en fase sólida patrones o pueden ser adquiridos comercialmente de diferentes proveedores como un artículo de
25 catálogo (Anaspec Inc., American Peptide Company, o Invitrogen, Inc.). Se pueden usar métodos estándar para verificar la abundancia de la construcción de longitud completa a partir de especies truncadas usando técnicas de espectrometría de masas, tales como análisis de aminoácidos que se conocen bien en la técnica (Kanu et al., Journal of Mass Spectrometry, 43:1-22 (2008); Bernstein et al., Journal of American Chemical Society 127:20752084 (2005); Li et al., Encyclopedia of Analytical Chemistry, Meyers, R.A., ed., John Wiley & Sons Ltd. (2009)).
30 A modo de ejemplo, la Tabla 1 enumera las propiedades físicas deseables de péptidos Aβ42 y los diferentes métodos usados para analizar estas propiedades. Estos métodos pueden emplearse para determinar si las propiedades del patrón de referencia son comparables con las del péptido Aβ42 nativo.
35 Tabla 1
Propiedad
Prueba Rango objetivo Referencia
Solubilidad
SDS-PAGE Más de 90 % de forma monomérica Analy. Biochem., 316:223-231 (2003)
Dispersión dinámica de la luz
Menos de 5 % de péptidos agregados Meth. Enzymology, 309:429-459 (1999); J. Biol. Chem., 274:25945-25952 (1999)
Adsorción no específica
Recuperación selectiva en LCR o inmunoensayo de Aβ42 con tampón Recuperación de entre 80 y 120 % Aβ Immunoassay Olsson et al., Clinical Chemistry, 51:336-345 (2005)
Agregación
SDS-PAGE Transferencia Western Más de 90 % de forma monomérica PNAS, 100:330-335 (2003); Analy. Biochem., 316:223-231(2003)
Ensayo de tioflavina T
Más de 90 % de forma monomérica Meth. Enzymology, 309:274-284 (1999)
Formación de fibrillas
Microscopía (microscopía de transmisión de electrones, microscopía óptica (óptica, fuerza atómica) Niveles mínimos de oligómeros o fibrillas observables Protein Pep. Letters, 13:261-270 (2006); J. Am. Chem. Soc., 125:15359-15365 (2003)
8
imagen7
a un ensayo de biomarcador por pocillo. Se han desarrollado tecnologías más nuevas que permiten analizar varios biomarcadores en un solo pocillo o recipiente de reacción. Algunas de las tecnologías multiplexadas utilizan anticuerpos transferidos sobre una superficie sólida tal como portaobjetos de vidrio o placas de microtitulación especializadas. Otro enfoque es mediante micromatrices en suspensión en donde los anticuerpos son unidos a
5 esferas de látex las cuales se mezclan entre sí en solución para formar la micromatriz.
En una realización, se usa la tecnología de micromatrices en suspensión. En otra realización, la tecnología de micromatrices en suspensión es la tecnología Luminex xMAP. La tecnología Luminex xMAP usa esferas de látex que contienen una relación de dos colorantes fluorescentes. Se crean diferentes 'conjuntos' de esferas alterando la 10 relación entre estos dos colorantes. Las esferas se mezclan entre sí para formar una micromatriz en suspensión. La mezcla de esferas se analiza mediante un instrumento que identifica cada esfera por la relación de fluorescencia mientras pasa enfrente de un láser. Estos conjuntos de esferas tienen diferentes modificaciones sobre su superficie que se usan para la fijación covalente de moléculas tales como proteínas, péptidos, anticuerpos, etc. Esto permite que el ensayo se lleve a cabo sobre la superficie de estas esferas. Los ensayos son cuantificados a través de la
15 incorporación de un tercer marcador fluorescente tal como ficoeritrina a un anticuerpo reportero dirigido a los analitos de interés. Un segundo láser en el instrumento mide la fluorescencia de este marcador reportero a medida que las esferas se mueven a través del instrumento.
Ejemplos
20
Ejemplo 1 – Ensayo sándwich que se puede usar para medir Aβ42
En la Figura 1 se muestra un esquema de un patrón soluble de dos lados o sándwich. Brevemente, se inmovilizaron anticuerpos de captura específicos para el extremo C de Aβ42 sobre una superficie sólida. Se añadió una muestra
25 biológica, lo que permitió que Aβ42 fuera capturado por el anticuerpo inmovilizado. Se añadió un segundo anticuerpo de detección marcado que era específico para el extremo N del Aβ42. La señal medida generada por el anticuerpo de detección marcado se usó para cuantificación.
En la Figura 2 se muestra un ejemplo de un ensayo sándwich que se puede usar para medir Aβ42. Brevemente, un
30 anticuerpo anti-C terminal de Aβ42 marcado con biotina (565) se inmovilizó en una placa recubierta con estreptavidina Meso-Scale Discovery de 96 pocillos (MesoScale Discovery Inc., Gaithersburg, Maryland ((MSD)). Se añadieron a diferentes pocillos péptidos Aβ42 como patrones de referencia (longitud completa con secuencia nativa). Los péptidos Aβ42 fueron capturados por medio del anticuerpo de captura inmovilizado. Se añadió un segundo anticuerpo marcado con rutenio (Ru) al extremo N de Aβ42 (26D6), completando el sándwich. El complejo se detectó
35 usando un instrumento MSD sector 6000 usando ECL. Las unidades de fluorescencia brutas (RFU) medidas por el instrumento se ajustaron a un modelo logístico de 4 parámetros para crear una curva patrón. En otro ejemplo, se usan varios péptidos Aβ42 modificados como un patrón de referencia (tabla 2, SEC ID N.º: 2, 4,12, 13 y 14). Las curvas patrones generadas por estos calibradores modificados se muestran en la Figura 3.
40 TABLA 2: Secuencias y descripciones de péptidos Aβ42 y péptidos modificados
Secuencia del péptido/péptido modificado
Descripción de la secuencia del péptido/péptido modificado
imagen8
secuencia de Aβ42 nativo
DAEFRHDSGYEVHMVGGVVIA (SEC ID N.º: 2)
aminoácidos de Aβ42 nativo (114)(35-42) sin espaciador en medio
DAEFRHDSGYEVHHQKGGVVIA (SEC ID N.º: 3)
aminoácidos de Aβ42 nativo (116)(37-42) sin espaciador en medio
DAEFRHDSGYEVHHQKIGLMVGGVVIA (SEC ID N.º: 4)
aminoácidos de Aβ42 nativo (116)(32-42) sin espaciador en medio
DAEFRHDSGYEVHHQKEERPGGWIA (SEC ID N.º: 5)
aminoácidos de Aβ42 nativo (1-16)EERP-aminoácidos de Aβ42 nativo (37-42)
DAEFRHDSGYEVHHQKEERPIGLMVGGWIA (SEC ID N.º: 6)
aminoácidos de Aβ42 nativo (1-16)EERP-aminoácidos de Aβ42 nativo (32-42)
DAEFRHDSGYEVHHQKDREERPGGVVIA (SEC ID N.º: 7)
aminoácidos de Aβ42 nativo (1-16)enlazador hidrófilo DREERPaminoácidos de Aβ42 nativo (37-42)
aminoácidos de Aβ42 nativo (1-16)enlazador hidrófilo DREPNRaminoácidos de Aβ42 nativo (32-42)
10
(1-16)-(Lys)m-(37-42) (SEC ID N.º: 9)
aminoácidos de Aβ42 nativo (1-16)hasta 20 restos de lisinaaminoácidos de Aβ42 nativo (37-42)
(1-16)-(Glu)n-(37-42) (SEC ID N.º: 10)
aminoácidos de Aβ42 nativo (1-16)hasta 20 restos de ácido glutámicoaminoácidos de Aβ42 nativo (37-42)
(1-16)-(Ala)p-(37-42) (SEC ID N.º: 11)
aminoácidos de Aβ42 nativo (1-16)hasta 20 restos de alaninaaminoácidos de Aβ42 nativo (37-42)
imagen9
aminoácidos de Aβ42 nativo (1-16)enlazador (PEG_20)3-aminoácidos de Aβ42 nativo (37-42)
imagen10
aminoácidos de Aβ42 nativo (1-16)enlazador (PEG_9)6-aminoácidos de Aβ42 nativo (35-42)
imagen11
aminoácidos de Aβ42 nativo (1-16)enlazador (PEG_9)5-aminoácidos de Aβ42 nativo (32-42)
(X-Y)-Espaciador-(Z-42)
Genérico: X, Y, Z, espaciador a especificar
imagen12
Secuencia de Aβ42 nativo
También se puede usar un inmunoensayo para medir tau. Ejemplos de secuencias de péptidos tau modificados que se pueden usar como patrones de referencia de la presente invención se ilustran a continuación en la Tabla 3.
TABLA 3: Secuencias y construcciones del péptido tau
Secuencia del péptido/péptido modificado
Descripción de la secuencia del péptido/péptido modificado
imagen13
secuencia de tau nativo
EVMEDHAGTYGL-enlazador genérico-GAAPPGQKGQAN (SEC ID N.º: 21)
aminoácidos de tau nativo (9-20) -enlazador genérico-aminoácidos de tau nativo (156-167)
EVMEDHAGTYGL-enlazador genérico-SGDRSGYSSP (SEC ID N.º: 22)
aminoácidos de tau nativo (9-20)-enlazador genérico-aminoácidos de tau nativo (191-200)
GAAPPGQKGQAN-enlazador genéricoIPAKTPPAPKT(PO4)PPSSGEPPK (SEC ID N.º: 23)
aminoácidos de tau nativo (156-167)-enlazador genérico-aminoácidos de tau nativo (171-190); el aminoácido T180 está fosforilado
11
imagen14
imagen15
imagen16
imagen17
50.000 esferas/ml de los cuatro conjuntos de esferas diferentes de péptido mencionados en la sección 2.2.3. Las esferas se filtraron, se resuspendieron en 50 μl/pocillo de 1,0 μg/ml de anticuerpo reportero anti-fosfo IGF1R y se incubaron en un agitador de placa durante 0,5 horas a temperatura ambiente protegidas de la luz. Después de la etapa de incubación, las esferas se lavaron 4 veces, se resuspendieron en 50 μl/pocillo de 1 μg/ml de IgG anti5 conejo de cabra- PE y se incubaron en un agitador de placa durante 20 minutos a temperatura ambiente protegida de la luz. Finalmente, las esferas se lavaron cuatro veces y se resuspendieron en 100 μl/pocillo de tampón de ensayo. La MIF de al menos 50 esferas por pocillo se midió usando un instrumento Bioplex Luminex ejecutando el software Bioplex manager 4.1 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). La curva patrón generada a partir de la curva intra-patrón de fosfo-IGF-1R se muestra en la Figura 6A. La concentración de fosfo-IGF-1R en cada una de las
10 muestras de lisados de SMCP usando el ajuste de curva logística de 4 parámetros intra-ensayo se muestra en la Figura 6B.
Ejemplo 5 – Caracterización de péptidos Aβ
15 Péptidos
Todos los péptidos fueron recibidos como polvo liofilizado. Los péptidos modificados se obtuvieron de GenScript (GS) y Anaspec (AN). Estos péptidos fueron sintetizados usando métodos en fase sólida conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Barany, G. et al., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology - Special Methods in
20 Peptide Synthesis, Parte A, vol. 2, págs. 3-284, Gross, E. et al., eds., Academic Press, Nueva York, publ. (1980); y en Stewart, J.M. et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, 2ª edición, Pierce Chemical Co., Rockford, IL, publ. (1984)).
Los péptidos GS1-6 y AN7 fueron recibidos y reconstituidos en ddH20 hasta una concentración de 1 mg/ml. Estos se distribuyeron a continuación en alícuotas de 100 μl en los tubos blanco de 1,4 ml PP, matriz redonda (Thermo
25 Scientific, cat#4249, lote 1030509). El péptido Aβ42 de longitud completa se adquirió a MSD (lote # T03080X1). Este péptido se diluyó en DMSO para preparar una solución de 0,1 mg/ml. Después se hicieron alícuotas de 100 μl en los tubos blanco de 1,4 ml. Estos péptidos se mantuvieron congelados a -70 °C durante su almacenamiento. La Figura 13 muestra las estructuras de los separadores de polietilenglicol incorporados en los péptidos Aβ(1-42) modificados.
30 TABLA 5: Lista de péptidos Aβ
GS#
Secuencia del péptido % de pureza (HPLC) PM
GS 1
imagen18 95 3406,71
GS 2
imagen19 95 3553,02
GS 3
imagen20 95 3691,15
GS 4
DAEFRHDSGYEVHHQKEERPIGLMVGGVVIA (SEC ID N.º: 6) 96 3476,91
GS 5
DAEFRHDSGYEVHHQKDREPNRIGLMVGGVVIA (SEC ID N.º: 8) 97 3733,17
GS 6
DAEFRHDSGYEVHHQKIGLMVGGVVIA (SEC ID N.º: 4) 98 2965,37
AN 7
DAEFRHDSGYEVHMVGGVVIA (SEC ID N.º: 2) 90 2288,49
FL
imagen21
Dispersión de luz dinámica
Los péptidos novedosos (GenScript) se recibieron como polvos secos y se prepararon dos conjuntos de muestras de 35 trabajo pesando pequeñas cantidades (∼0,5 mg cada una) en tubos de polipropileno de 1,8 ml y disolviendo en un tampón fosfato simple (Na2HPO4 10 mM pH 7,4, Na Cl 10 mM, preparado en 99,9 % de D2O; filtrado a través de un
16
imagen22

Claims (1)

  1. imagen1
    imagen2
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