CN102859363A - 免疫测定标准物以及利用内部测定校准标准物测量临床生物标志物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于创建定量标准物以校准被分析物的新组合物和方法。这些组合物为创建用于分析被分析物和测量临床生物标志物的标准物和校准物提供了条件。还提供了包含所述新组合物用于测定,例如夹心免疫测定的试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及新的组合物,能够在免疫测定中用作参照标准物和校准物以测量临床生物标志物。本发明还涉及使用所述组合物的方法和包含所述组合物的试剂盒。
发明背景
淀粉样蛋白β(Aβ)肽是由淀粉样蛋白前体蛋白(APP)通过β分泌酶和γ分泌酶酶复合物被剪切而生成的(Wolfe,Biochemistry,45:7931-7939(2006))。β分泌酶生成这些淀粉样蛋白肽的N末端,而γ分泌酶生成C末端(Wolfe,Biochemistry,45:7931-7939(2006))。后来人们制成了数种肽,长度典型地为38-42个氨基酸不等,取决于γ分泌酶在哪里切割APP。Aβ肽具有一个胞外域(氨基酸1-28)和一个包埋在脂双层膜内的跨膜域(氨基酸29-42)。长度为42个氨基酸的淀粉样蛋白肽(Aβ42)被认为是假定的神经毒性种类,或是单独地,或是作为聚集体。人们怀疑这些聚集体对脑的神经变性起贡献,结果导致阿尔茨海默病和痴呆。Aβ42对临床痴呆起贡献的假说称为淀粉样蛋白级联假说,如Hardy等人所述(Science,256:184-185(1992))。
Aβ肽的特征之一是在生理浓度下自组装成为寡聚体的能力(Burdick etal.,Journal of Biological Chemistry,267:546-554(1992);Cerf et al.,Biochemical Journal,421:415-423(2009).)。Aβ42种类较之Aβ40和Aβ38种类更易于形成寡聚体。已经证明寡聚体形成的机制是起源于位于氨基酸16-20处的一个小的五氨基酸区域(KLVFF),其介导Aβ肽们以反平行的方式结合。这个小区域因此得名“聚集域”(Tjernberg et al.,Journal of BiologicalChemistry,271:8545-8548(1996))。在特定的条件下,尤其是在低pH范围,Aβ肽聚集体的组装很迅速(即在数分钟之内),而在中性或更高的pH动力学则较之为慢(Burdick et al.,Journal of Biological Chemistry,267:546-554(1992))。聚集体在水性条件下,尤其是在盐存在下不易溶。Aβ肽的C末端藉由盐桥折叠翻过二聚体的中心,从而增加它们的疏水性并促进肽们进一步聚合形成纤丝或原纤维。Aβ42种类中额外的两个C末端残基提供较之其他的Aβ种类增加的疏水性(Kim et al.,Journal of Biological Chemistry,280:35069-35076(2005))。
临床数据提示,痴呆和认知减退与Aβ42浓度的相关性比与Aβ40或Aβ38种类更高。该结果与Aβ42的快速聚集性质一起已经导致人们提出抑制Aβ42具体可具有临床效益的假说。已经有多项研究显示可以利用不同的机制来抑制Aβ42聚集体的形成。Tjernberg et al.(Journal of Biological Chemistry,271:8545-8548(1996))显示,包含聚集域的肽可很好地与Aβ肽结合,并抑制聚集体的形成。还有人显示其他的几种结合聚集域的分子也可抑制淀粉样蛋白肽聚集(Martharu et al.,Journal of Neurological Sciences,280:49-58(2009);Kim et al.,Biochemical and Biophysical Research Communications,303:576-279(2003))。对聚集核心域中的氨基酸进行替代或删除整个聚集域也可防止Aβ聚集和原纤维形成(Tjernberg et al.,Journal of BiologicalChemistry,274:12619-12625(1999))。此外,人们已设计了多种药物来抑制γ分泌酶活性,以降低Aβ42和相关肽种类的量。这些手段在临床上的效用目前还在研究之中。
为了评估分子抑制Aβ42生成或防止其聚集的有效性,准确地测量Aβ42的量是必要的。有几种技术被用来对生物样品中的Aβ42进行检测和定量,包括免疫测定(Olsson et al.,Clinical Chemistry,51:336-345(2005);Verwey etal.,Journal of Immunological Methods,348:57-66(2009);Sjogren et al.,Journalof Neural Transmission,107:563-679(2000))和基于质谱(MS)的方法(Cantoneet al.,Journal of Neuroscience Methods,180:255-260(2009);Journal of MassSpectrometry,40:142-145(2005))。基于质谱的方法,包括MALDI-TOF和SELDI-TOF以及液相色谱制备质谱(liquid chromatography prepared massspectrometry)方法,能够检测生物样品中许多淀粉样蛋白β种类,但目前尚不能提供测量临床样品中的Aβ42所需的足够定量数值。
免疫测定方法是基于一种双夹心免疫测定法,其包含一种对Aβ42N末端特异性的抗体,和另一种对Aβ42C末端高度特异(即不识别其他Aβ肽种类)的抗体。免疫测定有两种基本形式。第一种形式藉由固定在固体表面的N末端区域特异性抗体捕捉生物样品中的Aβ肽。向该免疫测定中加入携带有标签的Aβ42特异性抗体以完成抗体夹心。第二种形式藉由固定在固体表面的C末端区域特异性抗体捕捉生物样品中的Aβ肽。向该免疫测定中加入携带有标签的N末端区域特异性抗体。在任何一种形式中,通过第二种抗体导入的标签容许对完整的复合物加以检测。通过使用Aβ42参照标准物(添加标准物代替生物样品)来使得这些测定定量化。用从参照标准物测量得到的信号产生标准曲线,然后用标准曲线来定量所述生物样品中Aβ42的量。
迄今为止,在免疫测定中使用Aβ42参照标准物都是依赖合成的全长Aβ42肽,通常产生它们的难度很小。但是,这些肽具有很强的疏水性质,因此在水性溶液中不可溶。此外,Aβ42作为参照标准物的贮存和使用都存在不少问题。如已经讨论的,Aβ42迅速地形成聚集体,而且这种形成在室温和中性pH条件下更容易发生。在低温(-20’C)和低pH下长期储存有助于最大程度地减小储存中的聚集,但不能防止之。在适于免疫测定的缓冲液中重溶Aβ42也可能造成困难。这些溶剂几乎总是水性的,缓冲于中性pH,含有盐,并且在室温下使用。这些条件都是加速Aβ42聚集的。由于不溶性沉淀物,以及在大小和可被检测抗体和捕捉抗体识别的性质上的不均一性,已经聚集的Aβ42肽是无法用作免疫测定中的参照标准物的。
因此,本发明通过提供可用于生成Aβ42肽或其蛋白质构建物和组合物的方法,所述Aβ42肽或其蛋白质构建物和组合物可以用作免疫测定或其他模式中的参照标准物或校准物来准确地测定液体或组织提取物样品中Aβ42肽的丰度,从而满足了本领域的需求。具体地说,本发明的组合物和方法旨在产生用于Aβ42的非聚集性的肽参照标准物,供免疫测定模式中使用。本文中描述的组合物可方法可以广泛地应用于其他许多难于测定和定量的肽。
发明内容
在一个方面中,本发明提供一种组合物,其包含N-末端免疫反应性区域、C-末端免疫反应性区域、以及接头区域。在另一个方面中,本发明提供一种组合物,其包含N-末端免疫反应性区域、C-末端免疫反应性区域、以及接头区域,其中所述组合物在免疫测定中用作参照标准物。在一个实施方案中,所述免疫测定选自下组:夹心免疫测定、单一抗体测定、双夹心免疫测定、和竞争测定。在另一个实施方案中,所述组合物选自下组:蛋白质、肽、片段和修饰的蛋白质。在一个实施方案中,所述N-末端免疫反应性区域结合Aβ42、Aβ40、Aβ38、tau或胰岛素生长因子受体1。在另一个实施方案中,所述C-末端免疫反应性区域结合Aβ42、Aβ40、Aβ38、tau或胰岛素生长因子受体1。在另一个实施方案中,所述接头区域是非免疫反应性区域。在另一个实施方案中,所述接头区域包含选自下组的接头:聚乙二醇、谷氨酰胺残基、丙氨酸残基、赖氨酸残基、脂质、球状蛋白质、核酸(包括但不限于DNA、RNA和PNA)、以及烷基链。
在另一个方面中,本发明提供具有SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6,7,8,9.10,11,12,13,14,15,17,19,21,22,23,24,25,26或27的氨基酸序列的分离的肽分子。
在另一个方面,本发明提供一种用于测量生物样品中被分析物的量的方法,该方法包括:将参照标准物附接到至少两个珠子上,从而形成第一珠子组和第二珠子组,其中所述参照标准物包含被第一检测抗体识别的表位,且其中每个珠子组包含不同浓度的所述参照标准物;将对所述被分析物特异的捕捉抗体附接到第三珠子组上;将全部所述珠子组混合到一起形成悬浮阵列(suspension array);将生物样品施加于该悬浮阵列,以致所述被分析物结合于所述第三珠子组上的捕捉抗体;添加第一检测抗体到该悬浮阵列,其中所述第一检测抗体结合参照标准物和结合于该捕捉抗体的被分析物;测量来自所述第一珠子组中结合于参照标准物的第一检测抗体的第一信号;测量来自所述第二珠子组中结合于参照标准物的第一检测抗体的第二信号,基于所述第一和第二信号产生标准曲线;并通过测量来自所述第一检测抗体的第三信号且将该第三信号与该标准曲线上所述第一和第二信号的度量值进行比较而确定该第三珠子组中被分析物的量。
在一个实施方案中,所述参照标准物包含组合物,所述组合物包含N-末端免疫反应性区域、C-末端免疫反应性区域和接头区域。在另一个实施方案中,所述参照标准物包含具有SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6,7,8,9.10,11,12,13,14,15,17,19,21,22,23,24,25,26或27的氨基酸序列的肽或修饰肽。
在另一个实施方案中,所述生物样品选自血液、血清、血浆、外周血单核细胞、外周血淋巴细胞、组织、脑脊液和细胞。在另一个实施方案中,被分析物选自Aβ42,Aβ40,Aβ38,tau或胰岛素生长因子受体1。
在另一个实施方案中,所述方法在多孔板、硝酸纤维素滤材、玻璃纤维中,或者在玻片上进行。在另一个实施方案中,所述第一信号和第二信号是选自藻红蛋白、alexa 532、链亲和素-藻红蛋白、和链亲和素-Alexa 532的信号。在另一个实施方案中,所述参照标准物共价附接于所述珠子。在另一个实施方案中,所述捕捉抗体共价附接于所述珠子。在另一个实施方案中,所述共价附接是碳二亚胺键。
在另一个方面,本发明人提供了用于实施免疫测定来检测Aβ42肽的试剂盒,所述试剂盒包含本发明的组合物。
表格简要说明
表格1显示了Aβ肽的理想的物理性质,以及用于测量这些性质的测试。
表格显示了Aβ42肽和修饰的肽序列以及说明。
表格3显示了tau肽和修饰的肽序列以及说明。
表格4在3份人脑脊液(CSF)样品中测得的Aβ42肽的浓度。
表格5是经过表征的新Aβ肽的列表。
表6显示动态光散射(DLS)数据的汇总。
附图简要说明
图1显示双侧(two-sided)或夹心式可溶性标准物的示意图。
图2显示来自示例性Aβ42夹心免疫测定的校准曲线。
图3显示使用修饰的Aβ42肽标准物的示例性Aβ42夹心测定。
图3A显示来自修饰的标准物2(SEQ ID NO:2)和4(SEQ ID NO:4)的校准曲线。
图3B显示来自修饰的标准物12(SEQ ID NO:12)和13(SEQ ID NO:13)的校准曲线。
图3C显示来自修饰的标准物14(SEQ ID NO:14)和6(SEQ ID NO:6)的校准曲线。
图4显示Aβ42内部测定珠子方法的示意图。
图5A显示共价偶联有不同浓度的Aβ1-40肽(SEQ ID NO:15)的6个不同的Luminex珠子组测得的中值荧光强度(MFI)。
图5B显示来自Aβ40内部测定标准物(圆)或来自作为可溶性标准物的天然Aβ42肽的4-PL生成的校准曲线,与图2中所示的曲线相似。
图5C显示利用从可溶型Aβ42肽产生的校准曲线或从内部测定Aβ40标准物生成的标准曲线在人CSF样品中测得的Aβ42肽。
图6显示人外周血单核细胞裂解物中磷酸化的胰岛素生长因子受体1(IGF-R1)的水平。从不同珠子组上的MFI值生成了4参数校准曲线(图6A),并用该曲线来确定PBMC裂解物中磷酸化IGF-R1的相对水平(图6B)。
图7显示DLS数据。
图8显示圆二色分析。
图9显示肽稳定性数据。对于全长Aβ42和7种修饰肽在不同温度下进行稳定性研究,长达40天(图9A-9F)。
图10显示全长Aβ42与7种修饰肽之间的标准曲线比较。
图11显示全长肽相对修饰肽的标准曲线分析。
图12显示使用全长肽相对使用修饰肽的CSF样品分析。
图13显示掺入修饰Aβ(1-42)肽的聚乙二醇间隔物的结构。
发明详述
通过参考下面对本发明的优选实施方式的详细说明以及包括在本文内的实施例,可以更容易地理解本发明。
本发明涉及新的组合物和方法,可以用来作为参照标准物和校准物,以在免疫测定中测量临床生物标志物。本发明还涉及使用所述组合物的方法和包含所述组合物的试剂盒。具体地,本发明的组合物和方法旨在产生非聚集性的用于Aβ42或tau的肽参照标准物,以供免疫测定模式中使用。
本发明还涉及包含本发明的组合物的试剂盒。
定义
如本文使用的,术语“Aβ”是指淀粉样蛋白β。
如本文使用的,术语“Aβ42”是指淀粉样蛋白β1-42。“Aβ42”是指一种42个氨基酸长的肽,其具有如表2,SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
如本文使用的,术语“Aβ38”是指淀粉样蛋白β1-38。“Aβ38”是指一种38个氨基酸长的肽,其具有序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG(SEQ IDNO:17)。
如本文使用的,术语“Aβ40”是指指淀粉样蛋白β1-40。“Aβ40”指一种40个氨基酸长的肽,其具有如表2,SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
如本文使用的,术语“tau”是指与表3,SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列对应的天然tau蛋白。
如本文使用的,术语“抗体”以其最广泛的意义使用,具体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(即双特异性抗体)、以及抗体片段(及Fab、F(ab’)2和Fv),只要它们展现针对选定抗原的结合活性或亲和力。“抗体”还可以指附着于(hang to)或融合于载体蛋白/生物,例如噬菌体或其他展示载体、具有与分离的抗体相同的性质的抗体或抗体片段。
如本文使用的,术语“分离的”,在指主题蛋白和蛋白复合物时,指蛋白或蛋白复合物的制备物基本不含通常会与该蛋白或复合物一起存在(例如该蛋白或复合物内源存在的细胞环境中)的污染蛋白。因此,分离的蛋白复合物与那些通常会“污染”或干扰对分离条件下该复合物的研究(例如当筛选其调节物时)的细胞组分是分离的。然而需要理解的是,这样的“分离”的复合物可以包含这样的其他蛋白质,所述主题蛋白或蛋白复合物对该蛋白质的调节作用是考察的对象。
如本文使用的,术语“分离的”在本文中还对核酸如DNA或RNA使用,指以不出现于自然界中的状态存在的分子。此外,“分离的核酸分子”意图包括不会天然作为片段出现,也不会在自然状态下被发现的核酸片段。
如本文使用的,术语“核酸”是指多核苷酸例如脱氧核糖核酸(DNA),此外在合适时还可指核糖核酸(RNA)。该术语还可以理解为包括(作为等价物)从核苷酸类似物制成的RNA或DNA的类似物,以及单链(如有义或反义)和双链多核苷酸,这一点适用于现在描述的实施方案。“核酸”还可以指肽核酸“PNA”或人工合成的DNA或RNA。
如本文使用的,术语“肽”、“蛋白(质)”和“多肽”在本文中可以互换使用。术语“纯化的蛋白质”指这样的蛋白质制备物,其优选地与细胞或细胞裂解物中通常伴随于该蛋白质的其他蛋白质分离,抑或实质上不包含这样的其他蛋白质。如本文使用的,术语“修饰肽”指相对于该肽的天然序列已经被修饰的肽。例如,修饰可以包括在天然肽序列中去除有害的域或者添加接头。
如本文使用的,术语“结合”是指两个分子之间由于,例如,共价、静电、疏水、离子、和/或氢键相互作用等在生理条件下直接缔合。类似的,两个或更多个多肽之间的“复合物形成”是指多个多肽之间由于例如共价、静电、疏水、离子、和/或氢键相互作用等在生理条件下直接缔合。
如本文使用的,术语“域”是指蛋白质中包含特定结构和/或行使特定功能的区域(即,聚集域,“磷酸化域”)。术语“聚集域”如本文中所用的,是指位于氨基酸16-20(KLVFF(SEQ ID NO:18))的介导Aβ肽以反向平行的方式结合的五氨基酸区域。
如本文使用的,术语“免疫反应性域”是指蛋白质中包含能被抗体识别的特定氨基酸序列的区域。该区域包括含有修饰的氨基酸序列,所述修饰例如糖基化、甲基化、磷酸化、或任何本领域技术人员知道的其他翻译后修饰。可以被磷酸化的氨基酸的实例有酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸氨基酸。包含磷酸化氨基酸的“免疫反应性域”也可以表述为磷酸化域。“免疫反应性”域还可以包含蛋白质的两个或更多个如下所述的区域,这些区域在蛋白质的天然折叠状态下相互接近,共同构成抗体结合位点。
如本文使用的,术语“免疫测定”在本文中用来指这样的生化测试,其利用一种或多种抗体来测量生物学基质中被分析物的存在或浓度。这种测定可响应于抗体对特定蛋白或肽的免疫反应性域的特异性结合而产生可测量的信号。
参照标准物
在一个方面,本发明涉及能够用作参照标准物和校准物来测量临床生物标志物的组合物。在一个实施方案中,所述参照标准物包含肽。所述肽可以是修饰肽。所述修饰肽可以在非免疫反应性域中包含接头、删除或替代。在另一个实施方案中,所述非免疫反应性域是聚集域或磷酸化域。
聚集或非免疫反应性域中的改变
在一个方面,本发明提供可以用作参照标准物的修饰肽。有已知的域或氨基酸序列可导致粘性(sticky)肽如Aβ42与自身或其他分子发生自身聚集和非特异性相互作用。这样,有可能构建缺少这些有害域的标准物或校准物。本发明提供数种修饰肽来去除有害域的方式。在一个实施方案中,构成有害域的氨基酸从氨基酸序列中被删除,而N-末端免疫反应性域与C-末端免疫反应性域连接,缺少中央的17-20氨基酸序列以及不同长度的邻近C-末端肽(在Aβ42的情况下)。中央肽被删除的Aβ42肽的例子在表2,SEQ ID NO:2、3和4中显示。在一个实施方案中,中央聚集域加上邻近的氨基酸被替换为由多种不同物质构成的接头或者间隔物。
在另一个实施方案中,考虑以不聚集的氨基酸作为接头。在一个实施方案中,不聚集的氨基酸呈及氨基酸序列的亲水性间隔物或接头的形式,或者是EERP的形式,后者与Aβ42的C末端37-42序列(SEQ ID NO:5)及Aβ42的C末端32-42部分(SEQ ID NO:6)一起显示。在另一个实施方案中,Aβ42肽包含更长的亲水性接头,例如氨基酸序列DREPNR (SEQ ID NO:16),其带有Aβ42的C末端37-42(SEQ ID NO:7)和C末端32-42(SEQ ID NO:8)部分。
在还有一个实施方案中,使用一系列带电残基,以N-末端和C-末端免疫反应性域之间的接头的形式使用。在另一个实施方案中,创建由整数m个赖氨酸残基(SEQ ID NO:9)或整数n个谷氨酸残基(SEQ ID NO:10)构成的接头。在另一个实施方案中,使用一串中性残基作为接头。在另一个实施方案中,考虑由整数p个丙氨酸残基(SEQ ID NO:11)构成的构建体。
在本发明的另一个实施方案中,使用不同形式的聚乙二醇(PEG)作为接头。在优选的实施方案中,将PEG-6原子和PEG-20原子与不同的C-末端部分一起使用(SEQ ID NO:12-14)。在另一个实施方案中,使用任何具有能够偶联于氨基酸残基的化学的聚合物作为接头或间隔物。这种聚合物包括那些直链形式的聚合物和那些具有已知的分枝拓扑学的聚合物,如树突聚物(dendrimers)和分枝共聚物,以刺激Aβ42或其他类似的粘性或自聚集性分子等寡聚物的免疫反应性。
还可以利用tau的磷酸化区域来产生可用作参照标准物的修饰肽。异常高磷酸化的tau与神经纤维缠结有关。Tau有多个磷酸化位点;每个位点对其生物学功能有不同的影响。对磷酸化的tau在Ser202/Thr181/Thr212/Thr231或Ser262处的测量可以帮助了解哪个与MCI受试者中的认知衰退相关。因此,在另一个实施方案中,考虑用修饰的tau肽作为参照标准物。修饰的tau肽的例子示于表3。
在另一个实施方案中,接头可包含下述分子中的任一种:脂质、球状蛋白质、核酸(包括但不限于DNA、RNA和PNA)、烷基链、或任何其他增加免疫测定中感兴趣的两个免疫表位的稳定性的联接。在另一个实施方案中,肽骨架和接头之间的键包括共价键、亲和素-生物素复合物或任何其他稳定的键。在另一个实施方案中,构建体不导致自聚集或对实验室塑料制品的非特异性吸附,所述实验室塑料制品尤其是聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯(polycarbon)、或其他用于制备实验室塑料,移液器吸头、试管、平板、以及其他容纳可以在其中对感兴趣的被分析物进行测量的液体的容器的实验室塑料树脂。
在另一个实施方案中,新Aβ42或tau免疫测定标准物或校准物需要被N-末端特异性抗体识别的N-末端表位的存在。本领域已知有很多种Aβ42N-末端结合抗体。例如,6E010已知识别Aβ3-8表位,而3D6已知识别Aβ的N-末端表位。可设计重叠表位以容许根据免疫测定要求和检测***选择数种要使用的N-末端特异性抗体。
在另一个实施方案中,新Aβ42免疫测定标准物或校准物需要需要被C-末端Aβ42特异性抗体识别的C-末端表位的存在。有充分表征的C-末端Aβ42新表位抗体包括G2-11(来自Heidelberg大学)、21F12(来自AthenaDiagnostics)、4D7A3(来自Innogenetics)、和12F4(来自Covance,原Signet)。可设计重叠C-末端表位以容许根据免疫测定要求和检测***选择数种要使用的C-末端Aβ42特异性抗体。
在另一个实施方案中,在此可使用本领域技术人员已知的任何N-末端结合性、C-末端结合性或磷酸化tau结合性抗体。
本发明还涉及用于生成肽或蛋白构建体及其组合物的方法,所述构建体或其组合物可以用作免疫测定中的参照标准物或校准物来准确地测量液体或组织提取物样品中的肽的丰度。免疫测定往往需要生物学上特异性的捕捉试剂,如抗体,来捕捉感兴趣的被分析物或生物标志物。可以通过本领域公知的方法,即通过用生物标志物作为抗原免疫动物,来产生抗体。可以基于生物标志物的结合特征来从样品分离它们。或者,如果多肽生物标志物的氨基酸序列是已知的,可以合成该多肽并使用它们通过本领域已知的方法来生成抗体。生物标志物的例子包括Aβ肽和tau。
本发明考虑传统的免疫测定,包括例如夹心免疫测定,包括ELISA或基于荧光的免疫测定,以及其他酶免疫测定。在基于SELDI的免疫测定中,将针对生物标志物的生物特异性捕捉试剂附接在质谱(MS)探针,如预活化的阵列的表面上。然后通过该试剂特异性地将该生物标志物捕获在生物芯片上,并通过质谱检测被捕获的生物标志物。
因此,在一个方面,本发明涉及用本发明的参照标准物来测量临床标志物的方法。在一个实施方案中,参照标准物是通过免疫测定测量的。在另一个实施方案中,免疫测定是夹心免疫测定。在另一个实施方案中,免疫测定是单一抗体免疫测定,经常以对免疫反应性结合位点的竞争性或“竞争”模式运行。在另一个实施方案中,免疫测定是双重夹心免疫测定或酶联免疫吸附测定(ELISA)。
在一个优选的实施方案中,测量临床标志物的方法是通过使用免疫测定,所述免疫测定包含下述步骤:将参照标准物附接到至少两个珠子上,从而形成第一珠子组和第二珠子组,其中所述参照标准物包含被第一检测抗体识别的表位,且其中每个珠子组包含不同浓度的所述参照标准物;将对被分析物特异性的捕捉抗体附接到第三珠子组;将所有珠子组混合到一起而形成悬浮陈列;将生物样品施加到该悬浮阵列,以使得被分析物结合到所述第三珠子组上的捕捉抗体;向该悬浮阵列加入第一检测抗体,其中所述第一检测抗体结合参照标准物结合于和所述捕捉抗体的被分析物;测量来自结合于所述第一珠子组中的参照标准物的第一检测抗体的第一信号;测量来自结合于所述第二珠子组中的参照标准物的第一检测抗体的第二信号;基于所述第一和第二信号产生标准曲线;并通过测量来自所述第一检测抗体的第三信号且将该第三信号与该标准曲线上所述第一和第二信号的度量值进行比较而确定该第三珠子组中被分析物的量。不对本发明构成限制,应当理解珠子组可以替换为任何其中通过特定检测技术或仪器可独立测量多重信息的其他固相。
在一个实施方案中,所述参照标准物包含本文中描述的组合物。在另一个实施方案中,所述生物样品选自血液、血清、血浆、外周血单核细胞、外周血淋巴细胞组织、脑脊液和细胞。在另一个实施方案中,所述被分析物是Aβ42、Aβ40、Aβ38、tau或胰岛素生长因子受体1。
所述被分析物和/或参照标准物可结合于多种表面。表面可以是任何可通过共价联接、被动吸收、生物素-链亲和素或任何其他本领域技术人员已知的联接而固定抗体或参照标准物的固相表面。例如,所述表面可以是珠子、平板、载玻片(slide)、纤维、表面等离子共振传感器或任何固体表面。
在另一个实施方案中,所述方法在多孔板、硝酸纤维素纤维中,或在玻璃载玻片上形成。在另一个实施方案中,所述第一和第二信号是通过荧光检测的。例如,所述第一信号和第二信号可以是选自下组的信号:藻红蛋白、Alexa 532、链亲和素-藻红蛋白和链亲和素-Alexa 532。在另一个实施方案中,所述信号是通过酶活性(即辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光、放射性、红外发射、荧光共振能量转移(FRET)、或任何本领域技术人员已知的其他方法来检测的。
在另一个方面,本发明包含一种用于实施免疫测定来检测Aβ42或tau肽的试剂盒,所述试剂盒包含本发明的参照标准物。
新的免疫测定标准物或校准物与天然Aβ42的性能比较
新的免疫测定标准物或校准物在免疫测定中应当具有与天然Aβ42可比较的性能。天然全长Aβ42肽可以利用标准的固相技术合成,或者可以从多家供货商作为目录产品商购(Anaspec Inc.,American Peptide Company,或Invitrogen Inc.)。可以使用标准方法,利用本领域公知的质量分析技术,如氨基酸分析(Kanu et al.,Journal of Mass Spectrometry,43:1-22(2008);Bernstein et al.,Journal of American Chemical Society,127:2075-2084(2005);Li et al.,Encyclopedia of Analytical Chemistry,Meyers,R.A.,ed.,John Wiley &Sons Ltd.(2009)),根据截短的种类验证全长构建物的丰度。
举例而言,表1列出了Aβ42肽的理想的物理性质,以及多种用于测试这些性质的方法。这些方法可以用来确定参照标准物的这些性质是否与天然Aβ42肽的这些性质可比较。
表1
在基于抗体的免疫测定中使用修饰的参照标准物或校准物
在本发明的另一个实施方案中,在基于单一抗体的测定中使用修饰的参照标准物。在一个实施方案中,包含单一抗体的免疫测定可以用来通过竞争免疫测定来测量生物样品中的Aβ42或tau。将对Aβ42或tau特异性的单一抗体固定化到固体表面,如微量滴定板的孔、珠子、或其他与免疫测定相关的表面。抗体可以通过多种不同的方法共价连接,如EDC介导的羧基和胺基团的联接,或通过被动吸收,或通过蛋白A或蛋白G界面。然后从含有全长Aβ42或tau肽或者保持有捕捉抗体的表位的修饰形式的Aβ42或tau标准物或校准物生成Aβ42或tau竞争物。使用该Aβ42或tau竞争物来在生物样品中的天然Aβ42或tau与固定化的抗体上的结合位点(互补位)之间产生竞争。互补位(paratope)是用于描述抗体上识别被分析物上的表位或免疫反应性域的结合区域的术语。Aβ42或tau竞争物加有标签用于检测目的。在一个实施方案中,所述标签是酶,如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。在另一个实施方案中,所述标签是荧光素,如藻红蛋白。在又一个实施方案中,所述标签是另一种标签,如生物素或钌。在又一个实施方案中,所述标签是核酸,如DNA、RNA、或PNA,藉此使用敏感的技术,如聚合酶链式反应(PCR),来检测核酸旗帜(flag),来对抗体的检测定量。在测定中使用单一浓度的Aβ42或tau竞争物,该浓度将基于与生物样品中出现的Aβ42或tau的天然水平竞争的能力来确定。
在另一个实施方案中,通过建立校准曲线使得测定定量化。在另一个实施方案中,通过制作一组Aβ42或tau标准物或校准物来进行定量,所述标准物或校准物是全长Aβ42或tau肽或保持有捕捉抗体的表位的修饰形式。在缓冲液中或不含Aβ42或tau的生物基质中制备这些不带标签的标准物或校准物。在一个实施方案中,如下建立校准曲线:将多个浓度中的一个浓度的未带标签的标准物或校准物与带标签的Aβ42或tau竞争物同固定化的抗体混合。使用每个经测试的未带标签的标准物或校准物所产生的信号值来生成标准曲线;用未带标签的Aβ42或tau标准物或校准物的浓度对所得的信号值作图。一旦建立了标准定量曲线,就利用通过将相同的固定浓度的带标签的Aβ42或tau竞争物与生物样品混合而进行的测定来确定生物样品中天然Aβ42或tau的水平。将所得的信号值绘在标准曲线上以确定生物样品中Aβ42或tau的水平。
在本发明的另一个实施方案中,在基于夹心的免疫测定中使用所述修饰的参照标准物。
修饰的标准物或校准物在基于内部测定参照标准物(intra-assay referencestandard)的免疫测定中的应用
在本发明的另一个实施方案中,Aβ42或tau肽被整合到内部测定校准***中。在这种方式中,可以使用多重免疫测定模式,如基于Luminex珠子的***或者基于中规模发现ECL平板(Meso-Scale Discovery ECL plate)的***。产生含有包含检测抗体的抗体结合表位的氨基酸残基的肽。在一个实施方案中,这些肽包含使得它们能够被共价交联到固相的修饰,或增加它们在水性免疫测定中的溶解性或使用(use)的修饰。将肽以不同的浓度固定在相关的固相(由多重免疫测定***定义)上,以产生一套明确定义的标准物,用来产生标准曲线。
临床样品中可溶型生物标志物的测量常常使用双抗体夹心测定来完成。这些抗体需要两种对生物标志物特异性的抗体,以及一种技术,其中使用另一种“报告”抗体或称“检测”抗体来检测被捕获的抗体。为了使该测定定量化,需要蛋白质参照标准物。这些标准物常常是重组蛋白的形式,但是它们也可以从生物样品获得。这些测定的传统的测定模式包括ELISA技术,该技术提供适用于分析临床样品的定量。但是它们往往限于每个孔一个生物标志物测定。已经开发出更新的技术,可以在单个孔或反应容器中分析多个生物标志物。这样的多重技术中的一些使用点样到固体表面(如载玻片或专用的微量滴定板)的抗体。另一种方式是通过悬浮陈列(suspension array),其中将抗体结合到胶乳珠子上,将胶乳珠子在溶液中混合到一起形成陈列。
在一个实施方案中,使用悬浮陈列技术。在另一个实施方案中,所述悬浮陈列技术是Luminex xMAP技术。Luminex xMAP技术使用含有一定比例的两种荧光染料的胶乳珠子。通过改变这两种染料的比例来形成不同的珠子“组”。将珠子混合到一起以形成悬浮阵列。用仪器来分析珠子混合物,该仪器通过每个珠子在激光器前通过时的荧光比来鉴别每个珠子。这些珠子组在它们的表面上有不同的修饰,用来共价附接分子,如蛋白质、肽、抗体等等。这容许测定在这些珠子的表面上进行。通过将第三种荧光标记物(如藻红蛋白)整合到针对感兴趣的被分析物的报告抗体中来对测定定量(quantitate)。当珠子运功穿过仪器时,该仪器中的另一个激光器测量该报告标记物的荧光。
实施例
实施例1可以用来测量Aβ42的基于夹心的测定
图1显示了一种双侧,或称夹心式可溶标准物的示意图。简而言之,将对Aβ42的C末端特异性的捕捉抗体固定化到固体表面上。添加生物样品,让Aβ42被固定化的抗体所捕获。添加第二种带标签对Aβ42的N末端特异性的检测抗体。测得的由该带标签的检测抗体产生的信号用于定量。
图2中显示了可以用来测量Aβ42的夹心测定的一个例子。简单地说,将生物素标记的抗C末端Aβ42抗体(565)固定化到96孔Meso-Scale Discovery链亲和素包被的平板(MesoScale Discovery Inc.,Gaithersburg,Maryland((MSD))上。将参照标准物Aβ42肽(全长,天然序列)添加到不同的孔中。Aβ42肽被固定化的捕捉抗体所捕获。添加第二种带钌标签的(Ru)针对Aβ42的N末端的抗体(26D6),从而完成夹心。使用MSD 6000型仪器使用ECL检测复合物。将该仪器测量得到的原始荧光单位(RFU)对4参数逻辑斯谛模型拟合以产生标准曲线。在另一个例子中,使用数种修饰的Aβ42肽作为参照标准物(表2、SEQ ID NO:,4,6,12,13,和14)。由这些修饰的校准物产生的标准曲线如图3所示。
表2:Aβ42肽和修饰的肽序列和说明
还可以用免疫测定来测量tau。可以用作本发明的参照标准物的修饰的tau肽序列的例子如下表3所示。
表3:tau肽序列和构建体
实施例2-测量生物样品中Aβ42的夹心Aβ42测定
在表3中显示了测定生物样品中Aβ42的夹心Aβ42测定的一个例子。将生物素标记的抗C末端Aβ42抗体(565)固定化到96孔MSD链亲和素包被平板上。将参照标准物Aβ42肽(全长,天然序列)或修饰的Aβ42参照标准物(SEQID NO:2)添加到不同的孔中。将不同稀释度的人CSF样品置入不同的孔中。将平板在室温温育2小时以让Aβ42肽被固定化的捕捉抗体所捕获。添加第二种带钌标签的(Ru)针对Aβ42的N末端的抗体(26D6),从而完成夹心。使用MSD 6000型仪器使用ECL检测复合物。将该仪器测量得到的原始荧光单位(RFU)对4参数逻辑斯谛模型拟合以产生标准曲线。测得的人CSF样品中的Aβ42的浓度如图3所示。
表4:三份人脑脊液(CSF)样品中测得的Aβ42肽的浓度
实施例3-基于Aβ肽的内部测定LUMINEX测定
图4显示了Aβ42内部测定珠子方式的示意图。将与不同浓度的Aβ42标准肽(或其他天然的或修饰的Aβ肽)偶联的珠子组同与抗Aβ42C末端特异性捕捉抗体偶联的珠子组组合,形成悬浮阵列。将该阵列与生物样品温育,其中该生物样品中的Aβ42肽被偶联有抗Aβ42捕捉抗体的珠子所捕获。向悬浮阵列中加入带有标签的对Aβ42肽的N末端特异性的检测抗体,该抗体从而结合到被捕获的Aβ42肽,并结合到表面上偶联有Aβ42肽的珠子。使用从表面上偶联有Aβ42肽的珠子获得的MFI值来产生内部测定校准曲线。根据偶联有抗Aβ42捕捉抗体的珠子上捕获的Aβ42的量,利用该内部测定标准曲线来确定生物样品中Aβ42的量。
抗体和参照标准物
天然全长Aβ42和全长Aβ40肽(分别为SEQ ID NO:1和15)获自AmericanPeptide Company。116B565.1小鼠抗人Aβ42C末端抗体以及26D6-B2-B3小鼠抗人Aβ42N末端抗体通过对由相关的BMS所有的杂交瘤细胞系产生的培养上清液进行蛋白-G纯化获得。
藻红蛋白-链亲和素缀合物获自Jackson Immunoresearch(West Grove,PA)。Tween-20、1-乙基-3-[3二甲基氨基丙基]碳二亚酰胺盐酸盐(EDC)、叠氮化钠、无IgG的牛血清白蛋白(BSA)、以及磷酸钠购自Sigma-AldrichCorporation(St.Louis,MO)。磷酸盐缓冲盐水(PBS)获自MediatechIncorporated(Herndon,VA)。羧基化Luminex珠子购自Bio-Rad Incorporated(Hercules,CA)。藻红蛋白标记的山羊抗小鼠IgG抗体获自JacksonImmunoresearch(West Grove,PA)。
抗Aβ42抗体与Luminex珠子的共价偶联
使用两步碳二亚酰胺方法将116B565.1小鼠抗人Aβ42C末端抗体共价偶联到羧基化珠子的表面。通过将1.25107个珠子在Eppendorf 5415D离心机(Westbury,NY)中14000xg、4℃离心5分钟来洗涤珠子。小心地移出上清液,再分加1.25 107个珠子并14000xg、4℃离心5分钟。再次小心地移出上清液,并重悬于800μl 0.1M磷酸钠缓冲液pH 4.8(活化缓冲液)中。然后将珠子涡旋混合15秒,并使用SPERLTD超声清洗仪(Scottsdale,AZ)超声处理15秒。珠子用活化缓冲液再洗涤2次,重悬于200μl新鲜制备的5mg/ml EDC(在活化缓冲液中制备)中。将珠子在避光的回转器中室温温育20分钟。在EDC步骤结束时,洗涤珠子并重悬于1000μl 250μg/ml捕捉抗体(在PBS中制备)中,在避光的回转器中室温温育1小时。洗涤珠子并与1ml封闭缓冲液(PBS,1%(w/v)BSA,0.02%(w/v)Tween-20)在避光的回转器中室温温育1小时。最后,珠子用血细胞计数器计数,以2x106个珠子/ml重悬于封闭缓冲液中,避光条件下4℃保存直到准备使用。
Aβ42捕捉抗体对Luminex珠子的共价偶联效率的表面测试
利用表面测试来确认捕捉抗体在珠子表面的存在。将含有2500个珠子的50μl测定缓冲液(PBS,1%(w/v)BSA,0.05%(w/v)Tween 20,0.05%(w/v)叠氮)添加到Millipore过滤底平板孔(Bedford,MA)中。通过将平板放在Millipore真空歧管(Bedford,MA)之上以去除液体来洗涤珠子,然后将珠子重悬在100μl/孔的PBST洗涤缓冲液中。最后,通过真空从孔中去除洗涤缓冲液,将珠子与100μl/孔的1/100稀释于测定缓冲液的PE-山羊抗小鼠IgG一起温育。将平板在96孔平板摇床(Lab Line Instruments,Melrose Park,IL)上300rpm避光条件下室温温育30分钟。然后使用100μl/孔的洗涤缓冲液通过真空抽滤将珠子洗涤3次,再重悬于100μl/孔的测定缓冲液中。利用获自Bio-Rad Laboratories(Hercules,CA)的、运行有Bioplex manager 4.1.1软件的Luminex100仪器测量至少50个珠子/孔的MFI。使用至少20,000的MFI来确认珠子表面上抗体的可用量的存在。
内部测定Aβ42肽对Luminex珠子的共价偶联
Aβ40天然全长肽(SEQ ID NO:15)如下制备:将冻干的肽在2.5ml PBS中复原,得到10mg/ml的终浓度。选择Aβ40肽代替Aβ42肽进行此测定,因为它们仍然表达26D6抗体结合所需的N末端Aβ42表位,且Aβ40肽在缀合所需的水性缓冲液中更稳定。将Aβ40肽用稀释缓冲液(PBS,1%(w/v)BSA,0.02%(w/v)Tween-20)稀释到不同浓度(如图5A所示)。使用两步碳二亚酰胺方法将每个Aβ肽制备物共价偶联到选定的珠子组(每个珠子组不同浓度)的表面。每个珠子组如下洗涤:将1.25x 107个珠子在Eppendorf5415D离心机(Westbury,NY)中14000x g 4°C离心5分钟。小心地移出上清液,加入800μl 0.1M磷酸钠缓冲液pH 4.8(活化缓冲液)。然后将珠子涡旋混合15秒,并使用SPERLTD超声清洗仪(Scottsdale,AZ)超声处理15秒。珠子用活化缓冲液再洗涤2次,重悬于200μl新鲜制备的5mg/ml EDC(在活化缓冲液中制备)中。将珠子在避光的回转器中室温温育20分钟。在EDC步骤结束时,洗涤每个珠子组并用预定浓度的Aβ40肽重悬,在避光的回转器中室温温育1小时。洗涤珠子组并与1ml封闭缓冲液(PBS,1%(w/v)BSA,0.02%(w/v)Tween-20)在避光的回转器中室温温育1小时。最后,通过用血细胞计数器计数珠子来评估每个珠子组制备物的浓度。将每个珠子组以2x106个珠子/ml重悬于封闭缓冲液中,避光条件下4℃保存直到准备使用。
Aβ40肽偶联的Luminex珠子的测试
使用表面测试来确认珠子表面上含有Aβ42N末端特异性抗体的N末端表位的Aβ40肽的存在。将含有2500个珠子的50μl测定缓冲液(PBS,1%(w/v)BSA,0.05%(w/v)Tween 20,0.05%(w/v)叠氮)添加到Millipore过滤底平板孔(Bedford,MA)中。通过将平板放在Millipore真空歧管(Bedford,MA)之上以去除液体来洗涤珠子,然后将珠子重悬在100μl/孔的PBST洗涤缓冲液中。最后,通过真空从孔中去除洗涤缓冲液,将珠子与100μl/孔的稀释于测定缓冲液的生物素标记的26D6-B2-B3抗体一起温育。将平板在96孔平板摇床(Lab Line Instruments,Melrose Park,IL)上300rpm避光条件下室温温育30分钟。在温育步骤之后,将珠子洗涤4次,在50μl/孔的1μg/ml的藻红蛋白-链亲和素缀合物中重悬,并在平板摇床上室温避光温育20分钟。然后使用100μl/孔的洗涤缓冲液通过真空抽滤将珠子洗涤3次,再重悬于100μl/孔的测定缓冲液中。利用获自Bio-Rad Laboratories(Hercules,CA)的、运行有Bioplex manager 4.1.1软件的Luminex100仪器测量至少50个珠子/孔的MFI。对每个珠子组测得的MFI显示于图5A。
生物样品的Aβ42内部测定分析
使用基于内部测定Luminex的测定的样品分析如下进行:首先将偶联有抗C末端特异性Aβ42565捕捉抗体的珠子组与偶联有不同浓度的Aβ40肽的珠子组混合(图5A所示)。向预湿润的过滤底96孔平板的每个孔中加入50μl/孔所有珠子组的合并的混合物(在测定缓冲液中制备的50000个珠子/ml的悬液)。使用100μl/孔的测定缓冲液通过真空抽滤洗涤珠子。以一式二孔将被捕获的珠子重悬于50μl的稀释的人CSF样品、质量控制样品(QC)、作为参照标准物的不同浓度的全长天然Aβ42肽,或不同浓度的修饰的Aβ42肽标准物,并在避光的平板摇床上室温温育1小时。添加1.0μg/ml的生物素标记的抗-Aβ4226D6报告抗体,然后在避光的平板摇床上室温温育0.5小时。在温育步骤之后,将珠子洗涤4次,在50μl/孔的1μg/ml的藻红蛋白-链亲和素缀合物中重悬,并在平板摇床上室温避光温育20分钟。最后,将珠子洗涤4次,然后重悬于100μl/孔的测定缓冲液中。利用运行有Bioplex manager5.1软件的Bioplex Luminex仪器(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)测量至少50个珠子/孔的MFI。利用加权的4参数逻辑斯谛曲线拟合,从可溶性Aβ42肽、或从由包被有不同浓度的Aβ40肽的珠子组(内部标准物)产生的信号产生标准曲线(图5B)。从相关的标准曲线计算CSF或QC样品中的Aβ42肽的浓度,示于图5C。
实施例4-使用LUMINEX珠子的针对IGFR1的基于肽的内部测定(intra-assay)
下面是另一例基于肽内部测定的测定,用于检测人IGR-R1受体上的磷酸化的酪氨酸残基1162和1163。Tau的磷酸化区域也可以用同样方式使用。
抗体和参照标准物
定制的IGF 1R[PYPY1162/1163]肽由Cambridge Research Biochemicals Ltd(UK)提供。小鼠抗IGF1R捕捉抗体获自Calbiochem(San Diego,CA),家兔抗磷酸-酪氨酸(1162/1163)-IGF1R报告抗体购自Millipore(Billerica,MA)。藻红蛋白标记的山羊抗家兔抗体获自Jackson Immunoresearch(West Grove,PA)。Tween-20,1-乙基-3-[3二甲基氨基丙基]碳二亚酰胺盐酸盐(EDC)、叠氮化钠、无IgG的牛血清白蛋白(BSA),和磷酸钠购自Sigma-AldrichCorporation(St.Louis,MO)。磷酸盐缓冲盐水(PBS)获自MediatechIncorporated(Herndon,VA)。羧基化Luminex珠子购自Bio-Rad Incorporated(Hercules,CA)。正常健康PBMC样品获自公司内部供者(BMS,NJ)。将PBMC样品用PBS或100ng/ml纯化的人IGF1(Genetex Inc,TX)37℃处理10分钟以诱导细胞上存在的IGFR的磷酸化。将细胞洗涤,用修饰的RIPA缓冲液裂解,并在-80℃保存。
抗IGF-R1捕捉抗体与Luminex珠子的共价偶联
使用两步碳二亚酰胺方法将小鼠抗人IGF1R捕捉抗体共价偶联到羧基化的珠子的表面。珠子如下洗涤:将1.25x 107个珠子在Eppendorf5415D离心机(Westbury,NY)中14000x g 4°C离心5分钟。小心地移出上清液,再分加1.25107个珠子并14000xg、4℃离心5分钟。再次小心地移出上清液,并重悬于800μl 0.1M磷酸钠缓冲液pH 4.8(活化缓冲液)中。然后将珠子涡旋混合15秒,并使用SPERLTD超声清洗仪(Scottsdale,AZ)超声处理15秒。珠子用活化缓冲液再洗涤2次,重悬于200μl新鲜制备的5mg/ml EDC(在活化缓冲液中制备)中。将珠子在避光的回转器中室温温育20分钟。在EDC步骤结束时,洗涤珠子并重悬于1000μl 250μg/ml捕捉抗体(在PBS中制备)中,在避光的回转器中室温温育1小时。洗涤珠子并与1ml封闭缓冲液(PBS,1%(w/v)BSA,0.02%(w/v)Tween-20)在避光的回转器中室温温育1小时。最后,珠子用血细胞计数器计数,以2x 106个珠子/ml重悬于封闭缓冲液中,避光条件下4℃保存直到准备使用。
IGF-R1捕捉抗体对Luminex珠子的共价偶联的测试
使用表面测试来确认珠子表面上捕捉抗体的存在。将含有2500个珠子的50μl测定缓冲液(PBS,1%(w/v)BSA,0.05%(w/v)Tween 20,0.05%(w/v)叠氮)添加到Millipore过滤底平板孔(Bedford,MA)中。通过将平板放在Millipore真空歧管(Bedford,MA)之上以去除液体来洗涤珠子,然后将珠子重悬在100μl/孔的PBST洗涤缓冲液中。最后,通过真空从孔中去除洗涤缓冲液,将珠子与100μl/孔的以1/100稀释于测定缓冲液的PE-GAM一起温育。将平板在96孔平板摇床(Lab Line Instruments,Melrose Park,IL)上300rpm避光条件下室温温育30分钟。然后使用100μl/孔的洗涤缓冲液通过真空抽滤将珠子洗涤3次,再重悬于100μl/孔的测定缓冲液中。利用获自Bio-RadLaboratories(Hercules,CA)的、运行有Bioplex manager 4.1.1软件的Luminex100仪器测量至少50个珠子/孔的MFI。使用至少20,000的MFI来确认珠子表面上抗体的可用量的存在。
内部测定IGF-R1肽标准物对Luminex珠子的共价偶联
IGF1R[PYPY1162/1163]参照标准物肽如下制备:将冻干的肽在2.5mlPBS中复原,得到10mg/ml的终浓度。使用稀释缓冲液(PBS,1%(w/v)BSA,0.02%(w/v)Tween-20)进行最初的10倍稀释和后续的10倍。使用两步碳二亚酰胺方法将磷酸-IGF1R肽以四种不同的浓度共价偶联到四个不同的羧基化珠子组的表面上。珠子组如下洗涤:将1.25x 107个珠子在Eppendorf5415D离心机(Westbury,NY)中14000x g 4°C离心5分钟。小心地移出上清液,加入800μl 0.1M磷酸钠缓冲液pH 4.8(活化缓冲液)。然后将珠子涡旋混合15秒,并使用SPERLTD超声清洗仪(Scottsdale,AZ)超声处理15秒。珠子用活化缓冲液再洗涤1次,重悬于200μl新鲜制备的5mg/ml EDC(在活化缓冲液中制备)中。将珠子在避光的回转器中室温温育20分钟。在EDC步骤结束时,洗涤每个珠子并用各浓度(从10mg/ml连续10倍稀释而得到,在PBS中制备)的磷酸-IGF1R重悬:1000、100、10和1ng/ml。然后将珠子在避光的回转器中室温温育1小时。洗涤珠子并与1ml封闭缓冲液(PBS,1%(w/v)BSA,0.02%(w/v)Tween-20)在避光的回转器中室温温育1小时。最后,珠子通过用血细胞计数器计数,以2x 106个珠子/ml重悬于封闭缓冲液中,避光条件下4℃保存直到准备使用。
偶联有IGF-R1肽的Luminex珠子的测试
使用表面测试来确认珠子表面上磷酸-IGF1R肽的存在。将含有2500个珠子的50μl测定缓冲液(PBS,1%(w/v)BSA,0.05%(w/v)Tween 20,0.05%(w/v)叠氮)添加到Millipore过滤底平板孔(Bedford,MA)中。通过将平板放在Millipore真空歧管(Bedford,MA)之上以去除液体来洗涤珠子,然后将珠子重悬在100μl/孔的PBST洗涤缓冲液中。最后,通过真空从孔中去除洗涤缓冲液,将珠子与100μl/孔的稀释于测定缓冲液的家兔抗-磷酸-IGF-R1抗体一起温育。将平板在96孔平板摇床(Lab line Instruments,Melrose Park,IL)300rpm室温避光温育30分钟。在温育步骤之后,将珠子洗涤4次,在50μl/孔的1μg/ml的藻红蛋白标记的山羊抗家兔IgG缀合物中重悬,并在平板摇床上室温避光温育20分钟。然后使用100μl/孔的洗涤缓冲液通过真空抽滤将珠子洗涤3次,再重悬于100μl/孔的测定缓冲液中。利用获自Bio-Rad Laboratories(Hercules,CA)的、运行有Bioplex manager 4.1.1软件的Luminex100仪器测量至少50个珠子/孔的MFI。磷酸-IGF1R肽,
生物样品的IGF-R1内部测定分析
使用基于Luminex的测定的样品分析如下进行:向预湿润的过滤底96孔平板的每个孔中加入50μl/孔的在测定缓冲液中制备的50000个珠子/ml的捕捉抗体悬液。使用100μl/孔的测定缓冲液通过真空抽滤洗涤珠子。以一式二孔将被捕获的珠子重悬于50μl的稀释的样品或质量控制样品(QC),并在避光的平板摇床上室温温育1小时。将珠子洗涤4次,重悬于50μl 50,000珠子/ml的如2.2.3节所述的肽的四种不同的珠子组。过滤出珠子,重悬于50μl/孔的1.0μg/ml抗-磷酸IGF1R报告抗体,然后在避光的平板摇床上室温温育0.5小时。在温育步骤之后,将珠子洗涤4次,在50μl/孔的1μg/ml的PE-山羊抗家兔IgG中重悬,并在平板摇床上室温避光温育20分钟。最后,将珠子洗涤4次,然后重悬于100μl/孔的测定缓冲液中。利用运行有Bioplex manager 4.1软件的Bioplex Luminex仪器(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)测量至少50个珠子/孔的MFI。从磷酸-IGF-R1内部标准曲线生成的标准曲线示于图6A。使用内部测定4参数逻辑斯谛曲线拟合的每个PBMC裂解物样品中的磷酸-IGF1R浓度示于表6B。
实施例5-Aβ肽的表征
肽
所有肽均作为冻干粉收到。修饰的肽获自GenScript(GS)和Anaspec(AN)。这些肽是使用本领域技术人员已知的固相技术合成的(参见例如,Barany,G.et al.,The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology-Special Methodsin Peptide Synthesis,Part A,Vol.2,pp.3-284,Gross,E.et al.,eds.,AcademicPress,New York,publ.(1980);和Stewart,J.M.et al.,Solid-Phase PeptideSynthesis,2nd Edition,Pierce Chemical Co.,Rockford,IL,publ.(1984))。
收到GS1-6和AN7肽并在ddH2O中复原到1mg/ml的浓度。然后等分成100μl等份,装在1.4ml空管PP,圆基质(Thermo Scientific,目录号4249,批号1030509)中。全长Aβ42肽购自MSC(批号T03080X1)。将该肽稀释在DMSO中以形成0.1mg/ml的溶液。然后将该溶液等分成100μl等份,装在1.4ml空管中。将这些肽保持在-70℃下保存。图13显示了掺入修饰的Aβ(1-42)肽的聚乙二醇间隔物的结构。
表5:Aβ肽的列表
动态光散射
新肽(GenScript)作为干粉收到,并如下制备两组样品储液(stock sample):称取少量(各~0.5mg)到1.8ml聚丙烯管中,并溶于简单磷酸盐缓冲液(10mMNa2HPO4,pH 7.4,10mM NaCl,在99.9%D2O中制备;通过0.2μm滤器过滤)中。1组制备为1.0mg/ml,另一组制备为0.10mg/ml,并保存在室温。肽通过涡旋混合1分钟溶解,然后在微型离心机中14,000rpm室温离心5分钟。对于Aβ42样品(MSD),将含有0.1mg肽的小管重悬在1.0ml缓冲液中,并如上处理。将一定体积(200μl)的每种经过离心的1.0mg/ml储液转移到0.5ml聚丙烯管中,并提供给NMR分析。
使用ND-1000仪器记录所有样品的吸收光谱(220-750nm),并用缓冲液作为空白对照。在384孔聚苯乙烯平板(3440型)中使用Wyatt DLS DynaPro酶标仪对肽进行动态光散射分析。使用制造商提供的软件(DYNAMICS,版本7.0.0.94和7.0.1.12)完成数据收集和分析。每种肽一式三份地进行评估,每孔上样30μl,并覆盖5μl矿物油以最小化蒸发。还在分析中纳入缓冲液空白以用于比较。平板加样后,在平板上贴上透明粘性密封胶带封皮,并将平板1000rpm离心2分钟。对平板上的每个样品读取30次,每次获取5秒钟,温度保持在25℃。在27天的时间里对1.0mg/ml和0.1mg/ml的样品采集数据组。在27天的时程中,去除粘性封皮以便在酶标仪中读取样品,并在各次读取之间用该封皮覆盖平板。
图7A到7F显示动态光散射数据。在图7中,对全长Aβ42肽进行DLS分析,并与四种代表性的修饰肽比较。显示全长肽是聚集的,其结果算出不同聚集种类的半径的长度为82-231nm。这构成(add up to)溶液中的大分子量聚集体。但是,从分子量以及半径可以确定,修饰肽保持为单体。GS#3与其他肽形成对照,因为它的确保留了一些聚集(图7E)。这些结果表明,缺少聚集域的修饰肽确实在溶液中保持单体形式。图7a呈现了对所有5种肽积累的原始数据。显示的是强度自关联(intensity autocorrelation)与时间的相对关系。强度自关联数越高表明溶液中肽的直径越大。图7b-7f描绘的是肽的百分比质量(percent mass)与半径的相对关系。单体肽在更小的半径大小有更大的百分比质量。更大的聚集肽在更大的半径大小具有更小的百分比质量。
表6:DLS数据的汇总
圆二色
使用Aviv Model 202圆二色谱仪采集圆二色(CD)谱。将样品移液到1mm光径的石英比色杯中,从260至185nm扫描。采集数据的参数包括带宽1.00nm、步长(step size)1.0nm,平均时间每点20秒,温度定为25℃。将样品室温下保存在石英比色杯中,以23天的时程进行扫描。对原始数据校正了空白缓冲液的贡献,并以mdeg对波长的格式呈现。
图8显示圆二色分析。对全长Aβ42和四种代表性肽进行了圆二色分析以确定这些肽的秩序(order)和二级结构。如图8所示,全长肽显示比其他肽更有序(more ordered)的结构。所述四种代表性肽与全长肽相比含有无序的CD谱。这些数据提示,修饰肽不像全长肽,它们不聚集或形成任何高级结构(higher order structures)。
MSD ELISA
通过添加30μl/孔将生物素标记的抗-C-末端Aβ42抗体(565-20μg/ml)固定化到96孔MSD链亲和素包被的平板。然后将平板盖住,在500rpm震荡下25℃温育过夜。然后用300μl/孔洗涤缓冲液(R&D system目录号WA126)洗涤平板3次。洗涤之后,将225μl/孔封闭缓冲液(1%BSA+0.1%Tween-20,溶于PBS)添加到平板,并在500rpm震荡下室温温育30分钟。一旦封闭步骤完成,如前文所述洗涤平板。将参照标准物Aβ42(全长或修饰肽)添加到孔中。Aβ42肽被固定化的捕捉抗体所捕获。添加第二种针对Aβ42的N-末端的带有钌标签(Ru)的抗体(26D6),从而完成夹心。使用MSD 6000型仪器利用ECL检测复合物。将该仪器测量得到的原始荧光单位(RFU)对4参数逻辑斯谛模型拟合以产生标准曲线。
图9显示了肽稳定性数据。对全长Aβ42和7种修饰的肽在不同温度下进行稳定性研究,历时最长到40天(图9A-9F)。将这些肽在4℃、25℃和37℃保持如规定的时间长度,然后冷冻直到实施测定。然后收集肽并以MSDElisa模式运行。结果以相比于每种肽在0时间测得的基线信号的百分比来显示。实际上,已经有人用37℃下的短期温育来估计分子在4℃和室温的长期稳定性(Anderson et al.,Clinical Chemistry,37(3):398-402(1991))。因此,将肽在37℃短期温育来进行短期分析,可以用来评估肽的长期稳定性。如图9所示,从37℃温育第16小时起,全长Aβ42肽信号剧烈下降。与之相对照的是,修饰的肽在所有被测温度下保持稳定。该数据可提示这些修饰肽比全长Aβ42更稳定。
图10A-10I显示了对全长Aβ42和7种修饰的肽在不同温度下进行稳定性研究,历时最长达60天。将这些肽在25℃和37℃保持规定长的时间,然后冷冻直到进行测定。然后收集肽并以MSD Elisa模式进行实验。结果被显示为一条标准曲线,其以信号对肽浓度作图。如图10所示,全长肽在25℃和37℃给出了递减的标准曲线。相比之下,所有被分析的7种肽在所有的时间点和温度范围均给出了相似的曲线(只显示了37℃)。这些结果提示,当用作测定可重复性的标准物时,修饰肽会提供比全长Aβ42肽更一致的信号。
图11显示了全长肽与修饰肽相对比的标准曲线分析。将全长Aβ42和7种修饰肽稀释以形成8点校准曲线并以MSD Elisa模式进行实验。如图11所示,所有肽均产生了几乎相同的标准曲线。该结果提示,可以用修饰肽代替全长肽用于计算样品基质中的Aβ。
图12显示了使用全长肽和使用修饰肽相对比的CSF样品分析。将全长Aβ42和7种修饰肽稀释以形成8点校准曲线并以MSD Elisa模式用13个CSF样品进行实验。基于每种肽的标准曲线计算每份CSF样品中Aβ的浓度。如图12所示,反算出的CSF样品中的Aβ浓度是相等的,并且与标准曲线使用哪种Aβ肽无关。这提示,这些修饰肽可以用来代替这些测定中的全长Aβ肽而不会影响Aβ水平的计算。
Claims (15)
1.一种组合物,其包含N-末端免疫反应性区域、C-末端免疫反应性区域,和接头区域。
2.一种组合物,其包含N-末端免疫反应性区域、C-末端免疫反应性区域,和接头区域,其中所述组合物用作免疫测定中的参照标准物。
3.权利要求2的组合物,其中所述免疫测定选自下组:夹心免疫测定、单一抗体免疫测定、双夹心免疫测定、和竞争测定。
4.权利要求1或2的组合物,其中所述N-末端免疫反应性区域结合Aβ42。
5.权利要求1或2的组合物,其中所述C-末端免疫反应性区域结合Aβ42。
6.权利要求1或2的组合物,其中所述接头区域是非免疫反应性域。
7.权利要求6的组合物,其中所述接头区域包含选自下组的接头:聚乙二醇、谷氨酰胺残基、丙氨酸残基、赖氨酸残基、脂质、球状蛋白质、核酸、和烷基链。
8.一种分离的修饰肽分子,其具有选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6,7,8,9.10,11,12,13,14,15,17,19,21,22,23,24,25,26和27。
9.一种测量生物样品中被分析物的量的方法,所述方法包括:
(a)将参照标准物附接于至少两种珠子,从而形成第一珠子组和第二珠子组,其中所述参照标准物包含被第一检测抗体识别的表位,且其中每个珠子组包含不同浓度的所述参照标准物;
(b)将对所述被分析物特异的捕捉抗体附接到第三珠子组上;
(c)将全部所述珠子组混合到一起形成悬浮阵列;
(d)将生物样品施加于该悬浮阵列,藉此所述被分析物结合于所述第三珠子组上的捕捉抗体;
(e)添加第一检测抗体到该悬浮阵列,其中所述第一检测抗体结合所述参照标准物和结合于所述捕捉抗体的被分析物;
(f)测量来自结合于所述第一珠子组中的参照标准物的第一检测抗体的第一信号;
(g)测量来自结合于所述第二珠子组中的参照标准物的第一检测抗体的第二信号;
(h)基于所述第一和第二信号产生标准曲线;和
(i)通过测量来自所述第一检测抗体的第三信号且将该第三信号与该标准曲线上所述第一和第二信号的度量值进行比较来确定该第三珠子组中被分析物的量。
10.权利要求9的方法,其中所述参照标准物包含权利要求1、2或8的组合物。
11.权利要求9的方法,其中所述生物样品选自下组:血液、血清、血浆、外周血单核细胞、外周血淋巴细胞、组织、脑脊液、和细胞。
12.权利要求9的方法,其中所述被分析物选自下组:Aβ42、Aβ40、Aβ38、tau、和胰岛素生长因子受体1。
13.权利要求9的方法,其中所述方法是在多孔板、硝酸纤维素滤材、玻璃纤维或玻璃载玻片上进行的。
14.权利要求9的方法,其中所述第一信号和第二信号是选自下组的信号:藻红蛋白、Alexa 532、链亲和素-藻红蛋白、和链亲和素-Alexa 532。
15.一种用于实施免疫测定以检测Aβ42肽的试剂盒,所述试剂盒包含权利要求1、2或8的组合物。
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