ES2561949T3 - Reprogramación de células hacia un estado pluripotente - Google Patents

Abstract

Procedimiento para preparar in vitro células de mamífero reprogramadas sin el uso de un virus, que comprende a) proporcionar unas células de mamífero aisladas que van a ser reprogramadas, b) transfectar una o más moléculas de ARNm reprogramadoras en las células proporcionadas en la etapa a), en el que las moléculas de ARNm reprogramadoras codifican por lo menos una proteína reprogramadora seleccionada de entre el grupo constituido por Ronin, Oct4, Klf4, Sox2, Nanog y TERT, c) cultivar las células obtenidas en la etapa b) en un medio de cultivo celular y en una condición adecuada para permitir la traducción de las moléculas de ARNm reprogramadoras transfectadas, conteniendo el medio de cultivo celular por lo menos un inhibidor transitorio de la proteolisis, para obtener las células reprogramadas, siendo dichas células reprogramadas unas células de mamífero que presentan un carácter de célula madre pluripotente o multipotente.

Description

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DESCRIPCION

Reprogramación de células hacia un estado pluripotente.

La presente invención se refiere a un procedimiento para preparar células reprogramadas, en particular para preparar células madre pluripotentes y multipotentes, y a las células madre pluripotentes y multipotentes preparadas mediante dichos procedimientos.

El envejecimiento, ya sea in vivo durante el transcurso de la vida o in vitro durante una escalación, afecta a las células, en particular células madre. Por ejemplo, las células envejecidas muestran mayores tasas de apoptosls, menor capacidad de diferenciación y de proliferación, y menor eficacia terapéutica. Durante el envejecimiento, las células madre se diferencian a menudo en una forma menos proliferativa y menos flexible. El envejecimiento celular representa un problema, en particular cuando se usan células procedentes de pacientes/donantes ancianos como material de partida para cultivos celulares, cuando se expanden células in vitro, y cuando se usan células que tienen una capacidad limitada de diferenciación para la terapia o la investigación.

Un enfoque para desdiferenciar células envejecidas es para crear las denominadas células madre pluripotentes inducidas (IPS). El estado actual de la técnica prevé usar una transferencia vírica de factores de transcripción para inducir una mayor potencia de diferenciación en células y rejuvenecerlas. Sin embargo, esto es potencialmente peligroso debido a que la transferencia vírica cambia permanentemente el genoma de la célula y también puede conducir a complicaciones debido a las partes víricas dejadas atrás en el genoma celular. Además, se sabe que la integración vírica en el genoma incrementa el riesgo de cáncer en células. Esencialmente lo mismo se aplica al uso de plásmldos para reprogramar células (Okita et al., 2008, Science. 2008 Nov 7; 322(5903):949-53. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors).

Otro enfoque emplea la puesta en contacto de células que van a ser reprogramadas con extractos de células madre embrionarias humanas para reprogramar células. Sin embargo, este enfoque es ética y prácticamente problemático.

Algunos otros enfoques usan factores químicos para desdiferenciar células (por ejemplo, documentos US 2007/0254884 A1, US 2007/0020759 A1), pero estos factores no son eficaces a la hora de reprogramar completamente las células hasta un estado pluripotente por sí mismas.

El documento WO 2008/087442 A describe métodos para inducir la reprogramación de una célula diferenciada añadiendo ARNm de Nanog a un oocito de Xenopus que no contiene Nanog e introduciendo el extracto de ese oocito en una célula que va a ser reprogramada. Jaenisch et al., Cell 133 (4), Febrero 2008:567-582, describe la reprogramación de células somáticas mediante transplante nuclear de un núcleo somático en un óvulo enucleado y por medio de retrovlrus para introducir moléculas de ácido nucleico en una célula que va a ser reprogramada.

Zuk et al. “Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells”, Molecular Biology of the Cell, Diciembre 2002, Vol. 13, 4279-4295, describieron que el tejido adiposo contiene células madre multipotentes, en particular células madre mesenquimatosas que expresaron múltiples antígenos marcadores CD que son característicos de tales células multipotentes.

De este modo, el problema técnico que subyace a la presente Invención es proporcionar métodos mejorados para reprogramar células, en particular para desdiferenciar células, que supere las desventajas identificadas anteriormente, en particular permitan de una manera fácil, eficiente y segura la provisión de células reprogramadas, en particular desdlferencladas, que presenten preferentemente carácter de células madre multipotentes, muy preferentemente pluripotentes.

La presente Invención resuelve este problema técnico mediante la provisión de un procedimiento para preparar in vitro células reprogramadas, comprendiendo las etapas del procedimiento, preferentemente en el orden dado, a) proporcionar células que van a ser reprogramadas; b) introducir, preferentemente transfectar, moléculas de ARNm capaces de reprogramar las células en las células proporcionadas en la etapa a), en el que las moléculas de ARNm reprogramadoras codifican por lo menos una proteína seleccionada de entre el grupo constituido por: Ronin, Oct4, Klf4, Sox2, Nanog y TERT; y c) cultivar las células obtenidas en la etapa b) en un medio de cultivo celular y en una condición adecuada para permitir la traducción de las moléculas de ARNm reprogramadoras introducidas, preferentemente transfectadas, a fin de obtener células reprogramadas.

De este modo, la presente Invención prevé un procedimiento que es capaz de preparar células reprogramadas sin la necesidad de cambiar permanentemente el genoma de la célula y sin la necesidad de usar virus para transferir factores de transcripción o similares a la célula. La presente Invención también es ventajosa en tanto que, con respecto a células reprogramadoras, no se necesitan extractos de células madre embrionarias humanas o factores químicos costosos y potenclalmente peligrosos. De este modo, las preocupaciones éticas, los problemas de estabilidad genética y los riesgos de cáncer se reducen o incluso se evitan. Por el contrario, la presente invención proporciona la enseñanza ventajosa para introducir, preferentemente transfectar, moléculas de ARNm específicas, en lo siguiente denominadas “moléculas de ARNm reprogramadoras”, en las células, en el que estas moléculas de

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ARNm reprogramadoras son capaces de reprogramar las células receptoras de ARNm, preferentemente las células que son transfectadas con ellas, a un estado desdiferenciado. Ventajosamente, las moléculas de ARNm Introducidas, preferentemente transfectadas, según la presente invención no se Integrarán en el genoma del receptor, y por lo tanto no plantean un riesgo de cáncer o de inestabilidad genética. Por lo tanto, la Invención prevé un procedimiento para preparar una o más células reprogramadas in vitro, en el que dicho procedimiento no incluye ninguna amplificación de clonación o proliferación de las células receptoras del ARNm. La presente invención también prevé un procedimiento para preparar una o más células reprogramadas in vivo, esto es, en un órgano vivo, un organismo vivo o animal, más particularmente un mamífero.

En el contexto de la presente invención, el término “reprogramar” significa preferentemente remodelar, en particular borrar y/o remodelar, marcas epigenéticas de una célula tales como metilación del ADN, metilación de histonas, o activar genes induciendo sistemas de señales de factores de transcripción con respecto a oct4. En particular, la reprogramación de la presente invención proporciona por lo menos una célula desdiferenciada y/o rejuvenecida, en particular proporciona una célula que tiene la característica de una célula madre multipotente, en particular pluripotente. De este modo, en el caso de que las células que van a ser reprogramadas sean células que ya tienen un carácter multipotente o pluripotente, la presente invención es capaz de mantener estas células mediante la reprogramación de la presente invención en su estado multi- o pluripotente durante un período de tiempo prolongado. En el caso de que las células que van a ser reprogramadas estén en un estado envejecido o diferenciado, la presente invención permite la desdiferenciación en una célula madre multipotente o pluripotente. En una forma de realización particularmente preferida, las células multipotentes se pueden reprogramar para que se conviertan en células pluripotentes.

En particular, la expresión “células reprogramadas” designa células que se han cambiado para que tengan un mayor potencial de diferenciación y/o de proliferación. También, en una forma de realización preferida, la reprogramación de una célula diferenciada somática frente a una célula madre multipotente o célula diferenciada “joven” se denomina reprogramación, y el producto se denomina una célula reprogramada.

En particular, el presente procedimiento permite enriquecer células madre inmaduras, preferentemente que muestran una elevada actividad de telomerasa, varios marcadores multipotentes, preferentemente pluripotencia, y una secreción incrementada de factores de crecimiento. La presente invención proporciona la ventaja de que las células madre envejecidas se pueden expandir durante un período de tiempo más prolongado y con un mayor rendimiento de células madre. Además, las estirpes de células madre y las selecciones de constructos manipulados mediante ingeniería tisulares obtenidos o derivados de células reprogramadas mediante el presente procedimiento muestran un riesgo inmunológico mínimo reducido, en particular si las células propias del paciente se usan como fuente para la reprogramación. De este modo, la presente invención proporciona medios y métodos para preparar en particular células madre pluripotentes, para proporcionar células madre multipotentes, para proporcionar medios y métodos para una expansión incrementada de células o células madre in vitro, y para el rejuvenecimiento de células envejecidas o células madre envejecidas para terapias celulares o de manipulación mediante ingeniería genética de tejidos.

En particular, la presente invención prevé, preferentemente en una primera etapa, proporcionar células que van a ser reprogramadas. Preferentemente, las células que van a ser reprogramadas pueden ser células adultas o neonatales, pero no se limitan a ellas. Preferentemente, las células que van a ser reprogramadas son células no diferenciadas adultas o neonatales. En una forma de realización preferida, todas estas células pueden ser estirpes celulares, células inmortalizadas, células mantenidas en cultivo celular, poblaciones de células aisladas, preferentemente células aisladas de un donante, ya sea un donante vivo o muerto, o células aisladas del entorno. Los tipos celulares que se pueden reprogramar según la presente invención potencialmente son todos los tipos celulares, y en casos preferidos son fibroblastos, hepatocitos, células cardíacas, cardiomiocitos, células nerviosas, condrocitos, osteoblastos, adipocitos, mioblastos, hepatoblastos, células madre hepáticas, células productoras de insulina, células madre neuronales, células cardiomiogénicas, dermatocitos, queratinocitos, células pancreáticas, monocitos, células epiteliales, o células madre mesenquimatosas (MSC). Preferentemente, las células pueden ser células de mamífero, en particular células humanas o células de animales, preferentemente células ovinas, de caballo, de mono, o en particular de roedor, preferentemente células de hámster, células de ratón o células de rata. Las células también pueden ser células de pez, de reptil, de aves, de anfibios o de insectos. Preferentemente, las células que van a ser reprogramadas son células comprometidas con la estirpe. En una forma de realización preferida adicional, las células, en particular las células del origen identificado anteriormente, son células madre, en particular células madre post-natales o células madre no embrionarias.

Una fuente adecuada y preferida de células madre como células madre mesenquimatosas es un tejido en el cuerpo humano o animal que comprende las células madre para uso en la presente invención, opcionalmente junto con otros tipos celulares. Preferentemente, la fuente adecuada de células madre es médula ósea, tanto adulta como fetal, célula periférica movilizada mediante citocinas o quimioterapia, hígado fetal, sangre de cordón umbilical, y bazo, tanto adulto como fetal; más preferentemente, la fuente de células madre es médula ósea de adulto o sangre de cordón umbilical; más preferentemente, la fuente de células madre es médula ósea. Las células de médula ósea se pueden obtener de cualquier fuente conocida, incluyendo, pero sin limitarse a, íleo, esternón, tibias, fémures, espinazo u otras cavidades óseas. Preferentemente, las células madre se aíslan de un organismo mamífero tal

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como un ser humano, ratón o rata, y más preferentemente las células madre se aíslan de un organismo humano.

La expresión “población de células aisladas” pretende significar que las células no están en contacto con otras células con las que habitualmente están en contacto en el cuerpo del mamífero o en una muestra tisular obtenida directamente, es decir, sin ninguna etapa de purificación o de enriquecimiento, del mamífero. Una “población de células”, según la presente Invención, puede comprender no solamente células de un tipo celular, tales como fibroblastos o células madre mesenqulmatosas, como se define por ejemplo mediante la expresión de una combinación especifica de marcadores de superficie, sino también una mezcla de células de diferentes tipos celulares que muestran diferentes combinaciones de marcadores de superficie.

Las células cosechadas de dichas fuentes se pueden usar directamente para la transfección, o se pueden crioconservar congelándolas aúna temperatura de alrededor de -196°C hasta alrededor de -130°C.

Las células que van a ser reprogramadas reciben, según la presente invención, en una segunda etapa, por lo menos una especie de moléculas de ARNm reprogramadoras, en particular moléculas de ARNm lineales y aisladas, seleccionadas del grupo de moléculas de ARNm que codifican Ronin, moléculas de ARNm que codifican Oct4, moléculas de ARNm que codifican Klf4, moléculas de ARNm que codifican Sox2, moléculas de ARNm que codifican Nanog y moléculas de ARNm que codifican TERT. Ronin, Oct4, Klf4, Sox2, Nanog y TERT son proteínas con la capacidad para reprogramar células. En el contexto de la presente Invención, estas proteínas se denominan “proteínas reprogramadoras”, y se caracterizan por su capacidad para reprogramar células diana y por lo tanto por su función reguladora en términos de determinar el destino celular, siendo en particular capaces de desdiferenciar una célula diana y/o de mantener una célula en un estado desdlferenclado, al ser preferentemente factores de transcripción.

El comportamiento de diferenciación de las células y el estado de diferenciación se pueden detectar según los métodos expuestos más abajo. Sin embargo, igualmente es aplicable cualquier método para determinar el estado de diferenciación o potencia de una célula conocido por la persona experta.

En una forma de realización preferida, la célula que va ser reprogramada se transfiere con una o más moléculas de ARNm reprogramadoras según la presente Invención. En otra forma de realización preferida, la célula que va a ser reprogramada se suplementa con una o más moléculas de ARNm reprogramadoras según la presente Invención. En otra forma de realización preferida, la célula que va a ser reprogramada se inyecta con una o más moléculas de ARNm reprogramadoras según la presente invención.

La presente invención prevé de este modo usar una o más moléculas de ARNm que codifican Ronin, Oct4, Klf4, Sox2, Nanog o TERT. Estas moléculas de ARNm pueden ser, en una forma de realización preferida, moléculas que tienen la secuencia nucleotídica de tipo salvaje de mamífero, en particular ser humano, de animal, preferentemente roedor, más preferentemente ratón, hámster o rata, o cualquier otra secuencia nucleotídica de animal. En una forma de realización preferida de la presente invención, la molécula de ARNm reprogramadora se selecciona de entre el grupo constituido por moléculas de secuencia nucleotídica de ARNm que son codificadas por una cualquiera de las secuencias de ADN dadas en SEC ID No. 1 a 16.

Por supuesto, la invención también prevé usar moléculas de ARNm cuya secuencia es un equivalente funcional a la secuencia polinucleotídica dada anteriormente. En el contexto de la presente invención, un equivalente funcional es una molécula de secuencia nucleotídica que codifica con una secuencia nucleotídica diferente exactamente la misma proteína que la secuencia de ARNm codificada por una cualquiera de SEC ID No. 1 a 16, o es una secuencia de ARNm que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos diferente pero con la misma función o similar, siendo en particular capaz de reprogramar las células según la presente invención.

En una forma de realización particularmente preferida de la presente invención, el equivalente funcional de las moléculas de ARNm es un polinucleótido con una secuencia homologa al polinucleótido de ARNm de tipo salvaje como se codifica mediante la secuencia de ADN en una cualquiera de SEC ID No. 1 a 16. En una forma de realización preferida de la presente invención, el grado o porcentaje de homología es por lo menos 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 o 100%. En una forma de realización preferida adicional, un equivalente funcional de las moléculas de ARNm como se da en una cualquiera de SEC ID No. 1 a 16 es una secuencia de ARNm que es codificada por una secuencia de ADN que es sustancialmente complementaria a las secuencias de una cualquiera de SEC ID No. 1 a 16 o a su secuencia complementaria, preferentemente sustancialmente complementaria. En una forma de realización preferida adicional, el equivalente funcional de la molécula de ARNm como se codifica mediante una cualquiera de las secuencias de ADN de SEC ID No. 1 a 16 es una molécula de ARN que es codificada por una secuencia de ADN que es capaz de hibridarse en condiciones restrictivas o restrictivas reducidas a uno cualquiera de los polinucleótidos dados en SEC ID No. 1 a 16 o a su secuencia complementaria, preferentemente sustancialmente complementaria.

En el contexto de la presente invención, la expresión “molécula de ARNm” se refiere a un polímero lineal de moléculas ribonucleotídicas, que es monocatenario y sirve como molde para la síntesis de proteínas.

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Los polinucleótidos tienen secuencias “homologas” si la secuencia de nucleótidos en las dos secuencias es la misma cuando se alinean para la correspondencia máxima como se describe aquí. La comparación de secuencias entre dos o más polinucleótidos se lleva a cabo generalmente comparando porciones de las dos secuencias a lo largo de una ventana de comparación para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencias. La ventana de comparación tiene generalmente de alrededor de 20 a 200 nucleótidos contiguos.

El “porcentaje de homología de secuencia” para polinucleótidos, denominado aquí como homología de secuencia de 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99 o 100 por ciento, se puede determinar comparando dos secuencias óptimamente alineadas a lo largo de una ventana de comparación, en el que la porción de la secuencia polinucleotídica en la ventana de comparación puede incluir adiciones o supresiones (es decir, espacios) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula: (a) determinando el número de posiciones en las que la base de ácido nucleico idéntica aparece en ambas secuencias para producir el número de posiciones emparejadas; (b) dividiendo el número de posiciones emparejadas entre el número total de posiciones en la ventana de comparación; y (c) multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de homología de secuencia. El alineamiento óptimo de las secuencias para comparación se puede realizar mediante implementaciones computerizadas de algoritmos conocidos, o mediante inspección. Los algoritmos fácilmente disponibles de comparación de secuencias y de alineamiento múltiple de secuencias son, respectivamente, los programas Herramienta de Búsqueda de Alineamientos Locales Básica (BLAST) (Altschul, S.F. et al. 1990. J. Mol. Biol. 215:403; Altschul, S.F. et al. 1997. Nuclelc Acid Res. 25:3389-3402) y ClustalW, ambos disponibles en internet. Otros programas adecuados Incluyen GAP, BESTFIT y FASTA en el Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wl, USA).

Como se usa aquí, “Sustancialmente complementarias” significa que dos secuencias de ácido nucleico en cuestión tienen por lo menos alrededor de 65%, preferentemente alrededor de 70%, más preferentemente alrededor de 80%, Incluso más preferentemente 90%, y lo más preferible alrededor de 98%, complementarledad de secuencia entre sí. Esto significa que la secuencia de ADN que codifica el equivalente funcional y el pollnucleótldo dado en cualquiera de SEC ID No. 1 a 16, o su complemento, debe exhibir, en una forma de realización preferida, suficiente complementariedad para hibridarse en condiciones restrictivas. Una secuencia sustancialmente complementaria es preferentemente aquella que tiene suficiente complementariedad de secuencia con la secuencia nucleotídica en cuestión para dar como resultado la unión.

El término “cebador”, como se usa aquí, se refiere a un oligonucleótido que es capaz de hibridarse a la diana de amplificación, permitiendo que se una una ADN polimerasa que sirve de ese modo como un punto de iniciación de la síntesis de ADN cuando se coloca en condiciones en las que se induce la síntesis del producto del alargamiento del cebador que es complementario a una hebra de ácido nucleico, es decir, en presencia de nucleótidos y de un agente para la polimerización, tal como ADN polimerasa, y a una temperatura y pH adecuados. El cebador (de la amplificación) es preferentemente monocatenario para la eficiencia máxima en la amplificación. Preferentemente, el cebador es un oligodesoxirribonucleótido. El cebador debe de ser suficientemente largo para cebar la síntesis de productos de alargamiento en presencia del agente para la polimerización. Las longitudes exactas de los cebadores dependerán de muchos factores, incluyendo la temperatura y la fuente de cebador.

Un “par de cebadores bidireccionales”, como se usa aquí, se refiere a un cebador directo y a un cebador inverso como se usa habitualmente en la técnica de amplificación de ADN, tal como en la amplificación mediante PCR.

Los términos “restricción” o “condiciones de hibridación restrictivas” se refieren a las condiciones de hibridación que afectan a la estabilidad de los híbridos, por ejemplo temperatura, concentración de sal, pH, concentración de formamida, y similar. Estas condiciones se optimizan empíricamente para maximizar la unión específica y minimizar la unión no específica de un oligo- o polinucleótido a su secuencia de ácido nucleico diana. Los términos según se usan incluyen la referencia a condiciones en las que un oligo- o polinucleótido se hibridará a su secuencia diana, hasta un grado detectablemente mayor que otras secuencias (por ejemplo, por lo menos 2 veces con respecto al fondo). Las condiciones restrictivas dependen de la secuencia, y serán diferentes en circunstancias diferentes. Las secuencias más largas se hibridarán específicamente a mayores temperaturas.

Generalmente, las condiciones restrictivas se seleccionan para que sean alrededor de 5 grados C (grados Celsius) menores que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (a fuerza iónica y a pH definidos) a la que 50% de una secuencia diana complementaria se híbrida a un oligo- o polinucleótido perfectamente emparejado. Típicamente, las condiciones restrictivas serán aquellas en las que la concentración de sal es menor que alrededor de 1,0 M de ion <+>, típicamente alrededor de 0,01 a 1,0 M de concentración de ion Na <+> (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3, y la temperatura es por lo menos alrededor de 30 grados C para sondas o cebadores cortos (por ejemplo 10 a 50 nucleótidos) y por lo menos alrededor de 60 grados C para sondas o cebadores largos (por ejemplo, mayores que 50 nucleótidos). Las condiciones restrictivas también se pueden lograr con la adición de agentes desestabilizadores, tales como formamida.

Condiciones de baja restricción ejemplares o “condiciones de restricción reducida” incluyen la hibridación con una disolución tampón de 30% de formamida, 1 M de NaCI, 1% de SDS a 37 grados C, y un lavado en 2x SSC a 40 grados C. Las condiciones de restricción elevada ejemplares incluyen la hibridación en 50% de formamida, 1 M de

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NaCI, 1% de SDS a 37 grados C, y un lavado en 0,1x SSC a 60 grados C. Los procedimientos de hibridación son bien conocidos en la técnica, y se describen, por ejemplo, en Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., 1994.

De este modo, la presente invención prevé introducir, preferentemente transfectar, moléculas de ARNm reprogramadoras específicas en las células, moléculas de ARNm las cuales una vez Introducidas, preferentemente transfectadas, en las células son capaces de ser traducidas en las denominadas proteínas reprogramadoras que pueden encender genes específicos en las células, en particular genes de multipotencia y/o pluripotencia en la célula. La molécula de ARNm usada según la presente invención es preferentemente una molécula lineal que tiene una cola poli(A) muy preferentemente producida mediante transcripción in vitro. De este modo, en una forma de realización preferida, las moléculas de ARNm se producen mediante transcripción in vitro, en particular usando sistemas bacterianos. En una forma de realización preferida particular, las secuencias de ADN de las proteínas reprogramadoras se clonan en plásmidos y se amplifican en bacterias, por ejemplo E. coli.

En una forma de realización preferida adicional, los plásmidos se aíslan entonces de las bacterias, se linealizan y se someten a digestión de restricción. En una forma de realización preferida adicional, ADNc preparado mediante dicho método se transcribe en ARNm, que a su vez se incuba para destruir los restos de ADNc y para obtener moléculas de ARNm para introducirlas en las células.

Puesto que las moléculas de ARNm reprogramadoras introducidas y las proteínas traducidas a partir de ellas se degradan con el tiempo en las células, no se pueden integrar permanentemente en el genoma de la célula, proporcionando algunas de las características ventajosas de la presente invención.

En una forma de realización preferida de la presente invención, la presente enseñanza prevé introducir, preferentemente transfectar, las moléculas de ARNm reprogramadoras en la célula mediante electroporación, mediante lipofección, mediante inyección, mediante magnetofección, mediante bombardeo de partículas, pistola génica, o mediante cualquier otro método conocido en la técnica adecuado para introducir moléculas de ARNm en una célula diana.

En una forma de realización particular preferida, la presente invención prevé además en su etapa c) cultivar las células en las que se han introducido las moléculas de ARNm reprogramadoras, en un medio de cultivo celular y en una condición adecuada para permitir la traducción de las moléculas de ARNm reprogramadoras transfectantes, para obtener las células reprogramadas.

En una forma de realización particularmente preferida de la presente invención, el presente procedimiento consiste por lo tanto en las etapas a), b) y c) identificadas anteriormente, preferentemente en este orden. En consecuencia, la presente invención excluye cualesquiera etapas del procedimiento adicionales, en particular cualquier etapa del procedimiento sustancial adicional, en particular cualesquiera etapas del procedimiento intermedias o subsiguientes. De este modo, la presente invención proporciona sus ventajas de una manera simple y rentable.

En una forma de realización particularmente preferida, el sistema de cultivo celular es un sistema de cultivo celular que comprende un medio de cultivo celular, preferentemente en una vasija de cultivo, en particular un medio de cultivo celular suplementado con por lo menos una denominada “sustancia ¡nductora”, que es una sustancia adecuada y determinada para proteger a las células del envejecimiento in vitro y/o para inducir una reprogramación no específica o específica. En una forma de realización particularmente preferida, una sustancia inductora según la presente invención es una sustancia seleccionada de entre el grupo constituido por reversina, resveratrol, selenio, un compuesto que contiene selenio, EGCG ((-)-epigalocatequina-3-galato), ácido valproico y sales de ácido valproico, en particular valproato de sodio.

En una forma de realización particularmente preferida, la por lo menos una sustancia inductora está presente en el medio de cultivo celular usado en la etapa c) del presente procedimiento en una concentración de 0,001 a 100 pM, preferentemente de 0,005 a 50 pM.

En una forma de realización particularmente preferida, la presente invención prevé usar una concentración de reversina de 0,5 a 10 pM, preferentemente de 1 pM. En una forma de realización preferida adicional, la presente invención prevé usar resveratrol en una concentración de 10 a 100 pM, preferentemente 50 pM. En una forma de realización preferida adicional, la presente invención prevé usar selenio o un compuesto que contiene selenio en una concentración de 0,05 a 0,5 pM, preferentemente de 0,1 pM. En una forma de realización preferida adicional, la presente invención prevé usar EGCG en una concentración de 0,001 a 0,1 pM, preferentemente de 0,01 pM. En una forma de realización preferida adicional, la presente invención prevé usar ácido valproico o valproato de sodio en una concentración de 1 a 10 pM, en particular de 5 pM.

La presente invención prevé en una forma de realización preferida adicional cultivar las células obtenidas en la etapa b) en un medio de cultivo celular, en el que el medio de cultivo celular comprende, opcionalmente en combinación con la sustancia inductora como se especifica anteriormente, por lo menos un inhibidor transitorio de la proteolisis. El

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uso de por lo menos un inhibidor de la proteolisis en el medio de cultivo celular de la presente invención incrementa el tiempo durante el cual las proteínas reprogramadoras derivadas del ARNm o de cualesquiera genes endógenos estarán presentes en las células, y de este modo facilita de una manera incluso más mejorada la reprogramación mediante los factores derivados de ARNm transfectado. La presente invención usa, en una forma de realización particularmente preferida, como inhibidor transitorio de la proteolisis, un inhibidor de proteasas, un inhibidor de proteosomas y/o un inhibidor de lisosomas. En una forma de realización particularmente preferida, el inhibidor de proteosomas se selecciona de entre el grupo constituido por MG132, TMC-95A, TS-341 y MG262.

En una forma de realización preferida adicional, el inhibidor de proteasas se selecciona de entre el grupo constituido por aprotinina, G-64 y hemisulfato de leupeptina. En una forma de realización preferida adicional, el inhibidor lisosómico es cloruro de amonio.

En una forma de realización preferida adicional, la presente invención también prevé un medio de cultivo celular que comprende por lo menos un inhibidor transitorio de la degradación del ARNm. El uso de un inhibidor transitorio de la degradación del ARNm incrementa asimismo la semivida de los factores reprogramadores.

En una forma de realización preferida adicional de la presente invención, una condición adecuada para permitir la traducción de las moléculas de ARNm reprogramadoras transfectadas en las células es un contenido de oxígeno en el medio de cultivo celular de 0,5 a 21%, preferentemente de 1 a 20%, más preferentemente de 5 a 19%, y particularmente preferido de 10 a 18%. Más particularmente, y sin desear estar atados por la teoría, el oxígeno se usa para inducir o incrementar adicionalmente Oct4 al disparar Oct4 vía Hifla.

En una forma de realización preferida, se seleccionan condiciones que son adecuadas para apoyar la reprogramación de las células mediante las moléculas de ARNm; más particularmente, estas condiciones requieren una temperatura de 30 a 38°C, preferentemente de 31 a 37°C, más preferentemente de 32 a 36°C.

El contenido de glucosa del medio está, en una forma de realización preferida de la presente invención, por debajo de 4,6 g/l, preferentemente por debajo de 4,5 g/l, más preferentemente por debajo de 4 g/l, incluso más preferentemente por debajo de 3 g/l, particularmente de forma preferible por debajo de 2 g/l, y lo más preferible es 1 g/l. Los medios DMEM que contienen 1 g/l de glucosa, que son los preferidos para la presente invención, están comercialmente disponibles como “DMEM con bajo contenido de glucosa” de compañías tales como PAA, Omega Scientific, Perbio y Biosera. Más particularmente, y sin desear estar atados por la teoría, las condiciones de alto contenido de glucosa apoyan de forma adversa el envejecimiento de las células (metilación, epigenética) in vitro, lo que puede hacer difícil la reprogramación.

En una forma de realización preferida adicional de la presente invención, el medio de cultivo celular contiene glucosa en una concentración de 0,1 g/l a 4,6 g/l, preferentemente de 0,5 g/l a 4,5 g/l, y lo más preferible de 1 g/l a 4 g/l.

Las expresiones “cultivo celular” y “cultivo de células” se refieren al mantenimiento y propagación de células, y preferentemente células humanas, derivadas de ser humano, y animales, in vitro.

“Medio de cultivo celular” se usa para el mantenimiento de células en cultivo in vitro. Para algunos tipos celulares, el medio también puede ser suficiente para apoyar la proliferación de las células en cultivo. Un medio según la presente invención proporciona nutrientes tales como fuentes de energía, aminoácidos e iones inorgánicos. Adicionalmente, puede contener un colorante como rojo fenol, piruvato de sodio, varias vitaminas, ácidos grasos libres, antibióticos, antioxidantes y oligoelementos.

Para cultivar las células madre según la presente invención, antes de la reprogramación es adecuado cualquier medio estándar tal como medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM), alfa-MEM, medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), medio RPMI y medio de McCoy. Una vez que las células se han reprogramado, en una forma de realización preferida se pueden cultivar en un medio de células madre embrionarias.

Preferentemente, el medio comprende adicionalmente uno o más aditivos seleccionados de entre el grupo constituido por vitamina D3 (1,25-dihidroxivitamina D3, calcitriol), resveratrol (trans-3,4’,5-trihidroxiestilbeno), reversina (2-(4-morfolinoanilino)-N6-ciclohexiladenina), vitamina E (RRR-a-tocoferol), ácido valproico (decapeno, valproato, valreleasa), EGCG (epigalocatequina-3-galato) y selenio. Preferentemente, dos de los aditivos mencionados anteriormente están presentes, más preferentemente están presentes tres de los aditivos mencionados anteriormente, incluso más preferentemente están presentes cuatro de los aditivos mencionados anteriormente, particularmente preferible están presentes cinco de los aditivos mencionados anteriormente, y lo más preferible están presentes todos los aditivos mencionados anteriormente.

Estos medios son bien conocidos por una persona experta en la técnica, y se pueden adquirir de compañías tales como Cambrex, Invitrogen, Sigma-Aldrich o Stem Cell Technologies.

En una forma de realización particular, el medio puede comprender además un componente sérico tal como suero de caballo, suero humano o suero fetal de ternera (FCS). Preferentemente, el medio contiene FCS. Si está presente,

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el suero está presente en una concentración de 1-20%, preferentemente de 3-18%, más preferentemente de 5-15%, incluso más preferentemente de 8-12%, y lo más preferible de 10%. Como alternativa, el componente sérico se puede sustituir por cualesquiera de las varias mezclas de sustitución de suero estándar, que incluyen típicamente insulina, albúmina y lecitina o colesterol.

Una “vasija de cultivo” es cualquier vasija que sea adecuada para hacer crecer células en un medio de cultivo, en particular seleccionado de, pero sin limitarse a, agar, matrigel y colágeno, ya sea en fase fluida o adherido a una superficie interior del recipiente. Los tipos de tales vasijas especializadas incluyen botellas giratorias, matraces de agitación, cápsulas de Petri y matraces de tejidos. Las vasijas de cultivo se diseñan para ser incubadas en entornos controlados de temperatura, humedad y gas, para facilitar el crecimiento máximo de células o tejidos. Generalmente, una capa de medio de cultivo celular o de agar cubre a la superficie de crecimiento. La porción de la vasija no utilizada como superficie de crecimiento encierra el entorno gaseoso interior que rodea al cultivo celular. Las células, tejidos, microorganismos, y similares, se introducen típicamente en el interior de las vasijas de cultivo celular a través de una abertura en la vasija. Tras la introducción de las células, la abertura se puede cerrar de manera que las células no estén en contacto con el entorno durante el cultivo de las células.

En una forma de realización preferida de la presente invención, la vasija de cultivo se trata para el cultivo tisular, lo que significa que la superficie de la vasija de cultivo se trata de manera que las células que habitualmente crecen en un estado adherente crezcan adherentemente, pero las células que crecen en suspensión no se adhieran o se adhieran solamente de forma holgada. Tal tratamiento puede implicar la irradiación de la vasija o el revestimiento de la vasija, por ejemplo con un plástico especial, polímero o nanoestructura, o con proteínas de la matriz extracelular. Tales vasijas pueden comprender cápsulas de cultivo tisular y matraces de cultivo celular, y están disponibles de diferentes proveedores tales como Becton Dickinson, Greiner, Sigma y TPP.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para la producción de células que muestran un carácter de células madre multipotente, preferentemente pluripotente, en el que se lleva a cabo un procedimiento según lo anterior.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para mejorar la expansión de células madre in vitro, en el que se lleva a cabo un procedimiento según la presente invención. De este modo, la presente invención proporciona la ventaja de prolongar la expansión de células madre, puesto que la presente invención mantiene las células que van a ser expandidas en un estado desdiferenciado.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para el rejuvenecimiento de células envejecidas, en el que se lleva a cabo un procedimiento según la presente invención.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para inducir la desdiferenciación de células, en el que se lleva a cabo un procedimiento según la presente invención, y en el que en particular las células que van a ser reprogramadas son células diferenciadas, en particular células comprometidas con el linaje.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para reprogramar células receptoras de un mamífero in vivo, que comprende introducir moléculas de ARNm reprogramadoras en las células receptoras del mamífero, en el que las moléculas de ARNm reprogramadoras codifican por lo menos una proteína reprogramadora seleccionada de entre el grupo constituido por Ronin, Oct4, Klf4, Sox2, Nanog y TERT. De este modo, la presente invención también se refiere a un método in vivo para reprogramar células receptoras de un mamífero, que emplea las moléculas de ARNm reprogramadoras como se identifican anteriormente para la realización in vitro de la presente invención. La presente invención que se refiere al procedimiento para reprogramar células receptoras de un mamífero in vivo prevé de ese modo introducir directamente las moléculas de ARNm reprogramadoras en por lo menos una célula de un mamífero receptor, esto significa en por lo menos una célula receptora, por medios adecuados tales como inserción por pistola génica. Tal procedimiento permite la producción de un mamífero, en particular un ser humano, que tiene por lo menos una célula reprogramada. De este modo, esta forma de realización de la presente invención proporciona una aplicación terapéutica tremendamente mejorada, en particular en la medicina regenerativa y/o en la terapia de sustitución. De este modo, la presente invención se refiere a un método para tratar un mamífero, en particular un ser humano, en el que moléculas de ARNm reprogramadoras se introducen en por lo menos una célula del mamífero receptor, y en el que las moléculas de ARNm reprogramadoras codifican por lo menos una proteína reprogramadora seleccionada de entre el grupo constituido por Ronin, Oct4, Klf4, Sox2, Nanog y TERT.

La presente invención también se refiere a una célula madre multipotente, en particular pluripotente, preparada según uno cualquiera de los métodos de la presente invención. De este modo, las células reprogramadas según la presente invención son preferentemente células madre multipotentes, en particular pluripotentes. En una forma de realización preferida, las células obtenidas según la presente invención se distinguen de las células usadas como material de partida en la etapa a) de la presente invención por la falta de uno o más marcadores. En una forma de realización preferida, estas células también se pueden caracterizar por un patrón de metilación particular, por la expresión de oct4, sox2, nanog, hTERT o klf4. La expresión de oct4, que no se encuentra en células somáticas como fibroblastos, se expresa tras transfectar ARNm (klf4, sox2 y oct4) en fibroblastos humanos, mediante potencial mejorado de crecimiento, y mediante un mayor potencial de diferenciación. Para la pluripotencia, es decir, la

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formación de cuerpos embrioides, la producción de células de tres capas germinales in vitro e in vivo. Sus ejemplos se ¡lustran en las figuras y ejemplos que se acompañan.

Las células reprogramadas obtenidas mediante los presentes procedimientos se pueden caracterizar preferentemente por la expresión o no expresión de ciertos marcadores de superficie. A estos marcadores de superficie se les da habitualmente una designación de cúmulo de diferenciación (CD), que describe grupos de características ¡nmunofenotípicas de la superficie de las células. Habitualmente las moléculas de CD son glicoprotelnas unidas a la membrana que son reconocidas por un agrupamiento de anticuerpos monoclonales que presentan la misma reactividad celular. Estas moléculas de la superficie se pueden detectar, por ejemplo, por medio de un citómetro de flujo, tal como un clasificador celular activado por fluorescencia (FACS) fabricado por compañías tales como Becton Dickinson. Los métodos para identificar células según la presente invención son métodos para detectar proteínas específicas de células, métodos para detectar factores de transcripción específicos de células, o métodos para detectar cambios fisiológicos o morfológicos. Todos estos métodos son bien conocidos per se en la técnica anterior. En particular, estos métodos usan procedimientos de detección de proteínas o de ADN o de ARN bien conocidos, y/o los ensayos con genes informadores. Por supuesto, se pueden emplear inmunoensayos o ensayos que usan proteínas o ácidos nucleicos marcados fluorescente o radioactivamente, incluyendo métodos para medir actividades enzimáticas. Los métodos para detectar cambios morfológicos pueden incluir métodos de tinción, métodos visuales, o similares.

Las células reprogramadas según la presente invención se pueden usar para fines terapéuticos, de diagnóstico o científicos. En particular, estas células se pueden usar en medicina regenerativa y/o par terapia de sustitución.

El término “célula” no se refiere solamente a una única célula, sino también engloba una estirpe celular, una población de células o un clon celular.

La expresión “células madre” se refiere a células que han retenido la capacidad para proliferar y diferenciarse en uno o más tipos celulares. Las células madre creadas según la presente invención son preferentemente células madre pluripotentes, es decir, células madre que han retenido la capacidad para diferenciarse en distintas estirpes celulares y tipos celulares, o células madre multipotentes, que retienen un potencial de diferenciación más restringido.

Se entiende que la expresión “células madre” según la invención no comprende embriones humanos. Además, se entiende que la expresión “células madre” no comprende células madre pluripotentes que se han obtenido directamente de un embrión humano.

Una “célula madre”, como se usa aquí, se refiere a cualquier célula pluripotente o célula multipotente o célula progenltora o célula precursora que se autorregenera que es capaz de diferenciarse en uno o más tipos celulares. De este modo, las células madre son células capaces de diferenciarse en uno o más de un tipo celular, y tienen preferentemente un potencial de crecimiento ¡limitado. Las células madre Incluyen aquellas que son capaces de diferenciarse en células de estirpe osteoblástlca, una estirpe de células mesenquimatosas (por ejemplo, hueso, cartílago, tejido adiposo, músculo, estroma, Incluyendo estroma de soporte hematopoyético, y tendón). “Diferenciar” o “diferenciación”, como se usa aquí, se refiere al proceso mediante el cual las células precursoras o progenitores (es decir, células madre) se diferencian en tipos celulares específicos, por ejemplo osteoblastos. Las células diferenciadas se pueden identificar por sus patrones de expresión génlca y de expresión de proteínas de la superficie celular. “Desdiferenciar” o “desdlferenclaclón”, como se usa aquí, se refiere al procedimiento mediante el cual células comprometidas con la estirpe (por ejemplo, mloblastos u osteoblastos) invierten su compromiso con la estirpe y se convierten en células precursoras o progenitores (es decir, células madre multipotentes o pluripotentes). Las células desdiferenciadas se pueden Identificar, por ejemplo, mediante la pérdida de patrones de expresión génlca y de expresión de proteínas de la superficie celular asociados con las células comprometidas con la estirpe.

Una “célula comprometida con la estirpe”, como se usa aquí, se refiere a cualquier célula que se ha diferenciado o se diferenciará en un tipo celular particular o tipos celulares relacionados. Las células comprometidas con la estirpe Incluyen, por ejemplo, osteoblastos, mloblastos, condrocltos, y adlpocltos.

Las células madre totipotentes son capaces de crear todos los tipos celulares del cuerpo, incluyendo células placentarlas. Las células madre fetales de etapa más temprana son consideradas totipotentes, así como el óvulo fertilizado. También tienen la capacidad para replicarse en números ilimitados sin perder su potencial.

Las células madre pluripotentes son capaces de crear células de las tres capas germinales, a saber, el ecto-, endo- y mesodermo. También tienen la capacidad para replicarse en números ilimitados sin perder su potencial.

Las células madre multipotentes son capaces de producir células de una o más capas germinales o varios tipos de tejidos. A menudo tienen una capacidad de autorrenovaclón ya limitada.

De este modo, las células madre son células capaces de diferenciarse en uno o más de un tipo celular, y tienen preferentemente un potencial de crecimiento ilimitado.

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Las células progenitoras se pueden diferenciar en uno o más tipos celulares, pero tienen un potencial de crecimiento limitado.

Las células madre adultas son células madre derivadas de un organismo adulto, y pueden ser multipotentes o pluripotentes.

Las células madre embrionarias derivan de la masa interna de una blástula, y son pluripotentes. Las células madre embrionarias son únicas debido a que se pueden desarrollar en casi todos tipos celulares, un atributo denominado pluripotencia. Pero para acceder a estas células, los investigadores deben de destruir un embrión viable. En esta patente se describe una manera para crear células, con las características de células madre embrionarias, sin la necesidad de destruir embriones o sin el uso de células madre embrionarias.

Las células madre pluripotentes inducidas “IPS” son células madre pluripotentes derivadas artificialmente de células no pluripotentes, incluyendo células somáticas, células madre multipotentes adultas o células progenitoras. En principio, cada célula que contenga un núcleo se puede usar como una fuente de células IPS.

Formas de realización preferidas adicionales de la presente Invención son la materia objeto de las subreivindlcaclones.

El listado de secuencias muestra las secuencias de ADN de la técnica anterior que codifican las moléculas de secuencias nucleotídicas de ARNm usadas en la presente Invención:

Tabla 1

SEC ID n°

gen Número de acceso longitud

1

hNanog NM U24865 2098

2

mNanog NM 028016 1356

3

rNanog NM 001100781 2358

4

hSox2 NM 003106 2518

5

mSox2 NM 011443 2457

6

rSox2 NM 001109181 2323

7

hOct4 NM 002701 1411

8

mOct4 NM 013633 1346

9

hKlf4 NM 004235 2949

10

mKlf4 NM 010637 3057

11

rKlf4 NM 053713 2393

12

hTERT NM 198253 4018

13

mTert ENSMUSG00000021611 4237

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rTERT NM 053423 3378

15

hRonin NM 020457 1903

16

mRonin NM 021513 1832

abreviaturas: h = humano; m = ratón; r = rata

Las designaciones marcadas “NM” y ENSMUSG se refieren a los números de acceso de NM(NCBI) y de ENSMUSG -como se dan en los sitios web públicamente disponibles
http://www.ncib.nlm.nih.govy
http://www.ensembl.org.

SEC ID No. 17 y 18 muestran la secuencia de ADN de cebadores usados para clonar el gen Nanog humano.

SEC ID No. 19 y 20 muestran la secuencia de ADN de cebadores usados para clonar el gen de Klf4 humano.

SEC ID No. 21 y 22 muestran la secuencia de ADN de cebadores usados para clonar el gen de Sox2 humano.

SEC ID No. 23 y 24 muestran la secuencia de ADN de cebadores usados para clonar el gen de Oct4 humano.

SEC ID No. 25 y 26 muestran la secuencia de ADN de cebadores usados para clonar el gen de Tert humano.

SEC ID No. 27 y 28 muestran la secuencia de ADN de cebadores usados para clonar el gen de GFP.

La presente invención se ilustrará ahora con más detalle por medio de un ejemplo y figuras.

Las figuras muestran:

Figura 1: Metilación del promotor de rex1, nanog y oct4 en fibroblastos humanos antes y después de la reprogramación (Figura 1A: Rex; Figura 1AB: Nanog; Figura 1C: Oct4). Las islas CpG se representan como cuadrados. Los cuadrados negros representan islas CpG metiladas, y los

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Figura 2:

Figura 3:

Figura 4:

Figura 5:

Figura 6:

Figura 7:

Figura 8:

cuadrados blancos representan islas CpG no metiladas. Todas las muestras son fibroblastos primarios de un donante masculino joven.

Fluorescencia y morfología tras electroporación amaxa (klf4, sox2, oct4): Fibroblastos primarios humanos se transfectaron con 0,6 mg/|ml de ARNm por factor y 0,2 mg/|ml de ARNm de GFP para visualizar la eficiencia de la transfección. La línea superior muestra fotos de fluorescencia, y la línea inferior muestra la morfología de las células después de 2 días.

Fluorescencia y morfología tras la transfección Fugene (klf4, sox2, oct4): Fibroblastos primarios humanos se transfectaron con 0,6 mg/|ml de ARNm por factor y 0,2 mg/|ml de ARNm de GFP para visualizar la eficiencia de la transfección. La línea superior muestra fotos de fluorescencia, y la línea inferior muestra la morfología de las células después de 7 días.

RT-PCR para Oct4: Escalera L: 20 pb (Fermentas); 1: factores de hipoxia de hOct4 transfectados 1x; 2: factores de hipoxia de hOct4 transfectados 6x; 3: factores de hipoxia de hOct4 transfectados 6x + cóctel; 4: factores de normoxia de hOct4 transfectados 1x; 5: factores de normoxia de hOct4 transfectados 6x; 6: factores de normoxia de hOct4 transfectados 6x + cóctel; 7: factores de normoxia de hOct4 transfectados 6x + cóctel + MG-132; 1a: ARN de hOct4 tras digestión con

ADNasa; 2a: ARN de hOct4 tras digestión con ADNasa; 3a: ARN de hOct4 tras digestión con

ADNasa; 4a: ARN de hOct4 tras digestión con ADNasa; 5a: ARN de hOct4 tras digestión con

ADNasa; 6a: ARN de hOct4 tras digestión con ADNasa; 7a: ARN de hOct4 tras digestión con

ADNasa; 8: control negativo de Oct4.

RT-PCR para hOct4: Escalera L: 20 pb (Fermentas); 1: factores de hipoxia de hOct4 transfectados 1x (fibroblastos humanos); 2: factores de hipoxia de hOct4 transfectados 6x (fibroblastos humanos transfectados con ARNm); 3: factores de hipoxia de hOct4 transfectados 6x + cóctel (fibroblastos humanos transfectados con ARNm y cóctel reprogramador químico); 4: factores de normoxia de hOct transfectados 1x; 5: factores de normoxia de hOct4 transfectados 6x; 6: factores de normoxia de hOct4 transfectados 6x + cóctel; 7: factores de normoxia de hOct4 transfectados 6x + cóctel + MG-132; 8: control positivo de Oct4 (plásmido con hKlf4); 9: control negativo de hOct4 (agua).

RT-PCR para Oct4 y GAPDH: 1: factores de hipoxia de hOct4 transfectados 1x; 2: factores de hipoxia de hOct4 transfectados 6x; 3: factores de hipoxia de hOct4 transfectados 6x + cóctel químico; 4: factores de normoxia de hOct4 transfectados 1x; 5: factores de normoxia de hOct4 transfectados 6x; 6: factores de normoxia de hOct4 transfectados 6x + cóctel químico; 7: factores de normoxia de hOct4 transfectados 6x + cóctel químico + MG-132; 1a ARN de hOct4 tras digestión con ADNasa; 2a: ARN de hOct4 tras digestión con ADNasa; 3a: ARN de hOct4 tras digestión con

ADNasa; 4a: ARN de hOct4 tras digestión con ADNasa; 5a: ARN de hOct4 tras digestión con

ADNasa; 6a: ARN de hOct4 tras digestión con ADNasa; 7a: ARN de hOct4 tras digestión con

ADNasa; 8a: control negativo de Oct4; 1b: factores de hipoxia de GAPDH transfectados 1x; 2b:

factores de hipoxia de GAPDH transfectados 6x; 3b: factores de hipoxia de GAPDH transfectados 6x + cóctel químico; 4b: factores de normoxia de GAPDH transfectados 1x; 5b: factores de normoxia de GAPDH transfectados 6x; 6b: factores de normoxia de GAPDH transfectados 6x + cóctel químico; 7b: factores de normoxia de GAPDH transfectados 6x + cóctel químico + MG-132; 8b: control negativo de GAPDH.

RT-PCR para hKlf4 y hNanog: Escalera L: 20 pb (Fermentas); 1a: factores de hipoxia de hKlf4 transfectados 1x (fibroblastos humanos); 2a: factores de hipoxia de hKlf4 transfectados 6x (fibroblastos humanos transfectados con ARNm); 3a: factores de hipoxia de hKlf4 transfectados 6x + cóctel (fibroblastos humanos transfectados con ARNm + cóctel reprogramador químico); 4a: factores de normoxia de hKlf4 transfectados 1x; 5a: factores de normoxia de hKlf4 transfectados 6x; 6a: factores de normoxia de hKlf4 transfectados 6x + cóctel; 7a: factores de normoxia de hKlf4 transfectados 6x + cóctel + MG-132; 8a: control positivo de hKlf4 (plásmido con hKlf4); 9a: control negativo de hKlf4 (agua); 1b: factores de hipoxia de hNanog transfectados 1x (fibroblastos humanos); 2b: factores de hipoxia de hNanog transfectados 6x (fibroblastos humanos transfectados con ARNm); 3b: factores de hipoxia de hNanog transfectados 6x + cóctel (fibroblastos humanos transfectados con ARNm + cóctel reprogramador químico); 4b: factores de normoxia de hNanog transfectados 1x; 5b: factores de normoxia de hNanog transfectados 6x; 6b: factores de normoxia de hNanog transfectados 6x + cóctel; 7a: factores de normoxia de hNanog transfectados 6x + cóctel + MG-132; 8b: control positivo de hNanog (plásmido con hNanog); 9a: control negativo de hNanog (agua).

Resultados de RNA BioAnalyzer Analysis (Agilent Nano Chip; Agilent Technologies) para oct4, sox2, y klf4

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Ejemplo

1. Preparación de ARNm reprogramador

1. Al Preparación de plásmidos de expresión de ARNm

Para la construcción de plásmidos que comprenden los genes diana en un vector con el promotor T7 para la transcripción in vitro, usando PCR, se diseñaron sitios de digestión antes del codón de iniciación y después del codón de parada para la clonación directa de los insertos génicos (véase la Tabla 1) en la dirección correcta en el vector pCR®l I-Vector (Invitrogen).

Los cebadores usados se dan en la Tabla 2.

Tabla 2

Nombre del gen

Nuevos sitios de digestión para enzimas de restricción Secuencia del cebador 5’-3’ Tamaño del producto

Nanog humano

Xbal y Notl SEC ID n° 17 918 pb

Nanog humano

Spel y CLAI SEC ID n° 18

Klf4 humano

Xbal y Notl SEC ID n° 19 637 pb

Klf4 humano

Hindlll y Clal SEC ID n° 20

Sox2 humano

Xbal y BamHI SEC ID n° 21 996 pb

Sox2 humano

Hindlll y Clal SEC ID n°22

Oct4 humano

Xbal y Notl SEC ID n° 23 1100 pb

Oct4 humano

BamHI y Clal SEC ID n°24

Tert humano

Xbal y Notl SEC ID n° 25 783 pb

Tert humano

Hindlll y Clal SEC ID n° 26

GFP

Xbal y Notl SEC ID n° 27 724 pb

GFP

Hindlll y Clal SEC ID n° 28

Una PCR para obtener los sitios de digestión deseados se llevó a cabo con la Platinum Taq-Polymerase (Invitrogen).

Preparación de la reacción de PCR en hielo:

5 pl Tampón de PCR 10x

1 pl Mezcla de dNTP 10 mM, 0,2 mM cada uno

1.5 pl MgCI2 50 mM

1 pl Mezcla de cebadores (10 pM cada una), 0,2 pM cada uno

1 pl ADN molde

0,2 pl Platinum® Taq DNA Polymerase 1,0 unidades

hasta 50 pl DEPC-H20

Programa de PCR Biometra Tprofessionall:

95°C

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30 s

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30 s

70°C

30 s

70DC

10 min

4°C

para siempre

Tras la electroforesis en un gel de agarosa con TAE al 1%, las bandas de ADN específicas (para su tamaño, véase la Tabla 2) se cortaron y el ADN se extrajo y se purificó con el Kit de Extracción en Gel QIAquick (de Qiagen).

Procedimiento:

- córtese el fragmento de ADN del gel de agarosa con un escalpelo

- pésese la rebanada de gel

- añádanse 3 volúmenes de Tampón QG a 1 volumen de gel (por ejemplo, añádanse 300 pl de Tampón QG a

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- incúbese a 50°C durante 10 min. (o hasta que la rebanada de gel se ha disuelto completamente)

- añádase 1 volumen de gel de ¡sopropanol a la muestra y mézclese

- coloqúese una columna de centrifugación QIAquick en un tubo de recogida de 2 mi proporcionado

- para la unión a ADN, apliqúese la muestra a la columna QIAquick, y centrifúguese durante 1 min. a 13.000 rpm

- descártese la fracción no retenida

- añádanse 0,5 mi de Tampón QG a la columna QIAquick y centrifúguese durante 1 min. a 13.000 rpm

- para el lavado, añádanse 0,75 mi de Tampón PE a la columna QIAquick y centrifúguese durante 1 min. a 13.000 rpm

- descártese la fracción no retenida

- centrifúguese la columna QIAquick durante 1 min. adicional a 13.000 rpm

- coloqúese la columna QIAquick en un tubo de microcentrifuga de 1,5 mi

- para eluir el ADN, añádanse 50 pl de H20 al centro de la membrana QIAquick, déjese reposar la columna durante 1 min., y después centrifúguese durante 1 min. a 13.000 rpm

Digiérase el vector pCRIl con las enzimas de restricción especificas para clonar el ADN diana

Estrategia para digerir el vector pCRIl:

digiérase el vector pCRIl con Xbal y Spel para el gen diana Nanog humano

digiérase el vector pCRIl con Xbal y Hindlll para el gen diana Klf4 humano

digiérase el vector pCRIl con Xbal y BamHI para el gen diana Sox2 humano

digiérase el vector pCRIl con Xbal y BamHI para el gen diana Oct4 humano

digiérase el vector pCRIl con Xbal y Hindlll para el gen diana TERT humano

digiérase el vector pCRIl con Xbal y Hindlll para el gen diana GFP

Preparación de digestión en hielo:

- 5 pl de Tampón 10x

- >2 pg de plásmido

- 2 pl de enzima de restricción

- hasta 50 pl de agua con DEPC

- incúbese durante 1 h a 37°C (termobloque; Eppendorf)

- inactivar por calor durante 20 min. mediante la temperatura específica de la enzima

Ligación del ADN de los insertos del gen diana con el ADN del vector lineal mediante T4-DNA-Ligase (Fermentas) Preparación de la ligación en hielo:

- 50-400 ng de ADN de vector

- 50-400 ng de ADN de inserto

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- 2 pl de Tampón 10x

- 0,2 ni (1 u) de T4-DNA Ligase

- hasta 20 ni de agua con DEPC

- sométase a vórtice el tubo y centrifúguese en una mlcrocentrifugadora durante 3-5 segundos

- incúbese a temperatura ambiente durante 1 h

- inactívese con calor durante 20 min.

1. B1 Transformación de los plásmidos con bacterias DH5a químicamente competentes

- añádase 1 ni de los plásmidos a 10 ni de bacterias DH5a químicamente competentes

- incúbese durante 30 min. en hielo

- sométase a choque térmico a 42°C durante 45 s

- añádanse 250 ni de medio SOC a las bacterias

- incúbese a 37°C durante 1 h con agitación

- siémbrese la disolución bacteriana en una placa de agarosa con kanamicina y LB, e incúbese la placa durante 12 horas en una incubadora a 37°C

- recójase una colonia de la bacteria y coloqúese la colonia en 5 mi de medio LB, e incúbese la disolución durante 12 horas en una incubadora de bacterias con agitación

1. O Purificación de ADN plasmídico con NucleoSpin® Plasmid -KIT ÍMacherv&Naaeh

- 5 mi de un cultivo LB de E. coli saturado, células peletizadas en una microcentrífuga de mesa estándar durante 30 s a 11.000 x g

- deséchese el sobrenadante

- para la lisis celular, añádanse 250 pl de Tampón A1. Resuspéndase el pelete celular completamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo

- añádanse 250 pl de Tampón A2

- mézclese suavemente invirtiendo el tubo 10 veces, e incúbese a temperatura ambiente durante hasta 5 min.

- añádanse 300 pl de tampón A3. Mézclese a conciencia invirtiendo el tuvo 10 veces

- centrifúguese durante 5 min. a 11.000 x g a temperatura ambiente

- coloqúese una columna de plásmido NucleoSpin® en un tubo de recogida (2 mi) y cárguense 750 pl del sobrenadante en la columna

- centrifúguese durante 1 min. a 11.000 x g

- deséchese la fracción no retenida, y coloqúese la columna de plásmido NucleoSpin® nuevamente en el tubo de recogida (2 mi)

- para lavar la membrana con ADN: añádanse 600 pl de tampón A4 (suplementado con etanol)

- centrifúguese durante 1 min. a 11.000 x g

- deséchese la fracción no retenida, y coloqúese la columna de plásmido NucleoSpin® nuevamente en el tubo de recogida (2 mi)

- membrana de sílice seca: centrifúguese durante 2 min. a 11.000 x g y deséchese el tubo de recogida (2 mi)

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- elución del ADN: coloqúese la columna de plásmldo NucleoSpin® en un tubo de microcentrffuga de 1,5 mi y añádanse 50 p,l de H20 e incúbese durante 1 mln. a temperatura ambiente

- centrifugúese durante 1 min. a 11.000 x g

- mídase la concentración de ADN con el NanoDrop

- almacénese el ADN a -20°C

1. DI Linealización de los plásmidos pCRII-hoct4. pCRII-hSox2. pCRII-hKlf4 para la transcripción in vitro

- digiérase pCRII-hoct4 con BamHI

- digiérase pCRII-hSox2 con Hindlll

- digiérase pCRII-hKlf4 con Hindlll Preparación de la digestión en hielo:

- 5 p.1 de Tampón 10x

- 2 p,g de plásmido

- 2 p,l de enzima de restricción

- hasta 50 p,l de agua con DEPC

- incúbese durante 1 h a 37°C (termobloque; Eppendorf)

- inactivar por calor durante 20 min. mediante la temperatura específica de la enzima

- inactivar con calor ambas enzimas durante 20 min. a 80°C

1. El Purificación de los plásmidos pCRII-hoct4, pCRII-hSox2, pCRII-hKlf4 Idealizados con el Kit de Purificación de PCR QlAauick íde Qiaaenl

- añádanse 5 volúmenes de Tampón PB a 1 volumen de la muestra de digestión, y mézclese

- coloqúese una columna de centrifugación QIAquick en un tubo de recogida de 2 mi proporcionado

- para la unión a ADN, apliqúese la muestra a la columna QIAquick y centrifúguese durante 60 s

- deséchese la fracción no retenida

- coloqúese la columna QIAquick nuevamente en el mismo tubo

- para el lavado, añádanse 0,75 mi de Tampón PE a la columna QIAquick y centrifúguese durante 60 s

- deséchese la fracción no retenida, y coloqúese la columna QIAquick nuevamente en el mismo tubo

- para secar la membrana, centrifúguese la columna durante 1 min. adicional

- coloqúese la columna QIAquick en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mi

- para eluir el ADN, añádanse 10 pJ de H20 al centro de la membrana QIAquick, déjese reposar la columna durante 1 min., y centrifúguese la columna durante 1 min.

- mídase la concentración de ADN con el NanoDrop

- almacénese el ADN a -20°C

1. F1 Transcripción in vitro de los plásmidos pCRII-hoct4. pCRII-hSox2. pCRII-hKlf4 linealizados con el Kit de Transcripción de ARN encaperuzado de alto rendimiento mMessaae mMachine íde Ambioní v añádase una cola poliíAI a los transcritos de ARN (Kit de Adición de Cola de PolvíA) de Ambioní

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Preparación de la transcripción in vitro (reacción mMessaae mMachine):

- a 20 ¡al de agua libre de nucleasas

- 10 jal de NTP/CAP 2x

- 2 pl de tampón de reacción 10x

- 1 pg de plásmldc mclde lineal

- 2 pl de mezcla de enzimas

- pipetéese la mezcla suavemente hacia arriba y hacia abaje

- centrifugúese brevemente para recoger la mezcla de reacción en la parte inferior del tubo

- Incúbese durante 2 h a 37°C

- añádase 1 pl de TURBO DNase al ARNm y mézclese bien

- incúbese a 37°C durante 15 mln.

- directamente tras la reacción tratada con ADNasa, añádase la cola de poli(A) al ARNm Preparación para la reacción de la cola de poliíAI

- 20 pl de reacción mMESSAGE mMACHINE

- 36 pl de agua libre de nucleasas

- 20 pl de tampón E-PAP 5x

- 10 pl de MnCI2 25 mM

- 10 pl de ATP mM

- 4 pl de E-PAP

- mézclese suavemente

- incúbese a 37°C durante 1 h

- coloqúese la reacción en hielo

- precipitación con cloruro de litio del ARNm con cola de poli(A):

- añádanse 30 pl de disolución de precipitación de LiCI

- mézclese a conciencia

- enfríese durante 30 min. a -20°C

- centrifúguese a 4°C durante 15 min. a velocidad máxima para peletizar el ARN

- elimínese el sobrenadante

- lávese el pelete una vez con 1 mi de etanol al 70%

- centrifúguese a 4°C durante 15 min. a velocidad máxima para peletizar el ARN

- elimínese el etanol al 70%

- séquese al aire el pelete

- disuélvase el pelete de ARN con 30-50 pl de agua libre de nucleasas

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- la concentración del ARN se mide con el NanoDrop

- la calidad del ARN se mide con el nanochip de Agilent

2. Preparación de células diana

2. Al Preparación de MSCs de ratón v de rata

- sacrifiqúese la rata o el ratón con gasificación mediante C02

- rocíense las ratas y los ratones con etanol al 70% para matar las bacterias y las esporas fúngicas

- elimínese el pelo de la piel

- elimínense las extremidades posteriores limpiamente en la articulación de la cadera

- en condiciones estériles, retírese todo el tejido blando y sepárense los huesos

- retírense las placas de crecimiento tanto del fémur como de la tibia

- insértense orificios con una aguja en los huesos en ambos extremos

- coloqúense los huesos en tubos eppendorf (para ratones) o en tubos falcon (para ratas), y centrifúguense a 2000 rpm durante 1 min. (toda la médula ósea se depositará en la parte inferior del tubo que se aloja en los espaciadores); retírense los huesos y el espaciador

- resuspéndase la médula en 0,5 mi de medio (DMEM con bajo contenido de glucosa; 10% de FCS; 1% de Pen/Estrep)

- disemínese la médula de una pata de una rata en 1 matraz T-75 con 12 mi de medio

- disemínese la médula de las dos patas de un ratón en 1 cápsula de Petri de 10 cm con 12 mi de medio

2. B) Preparación de MSC humana

- obténgase un aspirado de médula ósea

- resuspéndase en DMEM (bajo contenido de glucosa, 10% de FCS)

- siémbrese en un matraz de cultivo tisular

- hágase crecer durante 5 días y después cámbiese el medio

- después cámbiese el medio dos veces a la semana

- cultívese el matraz de cultivo tisular hasta 80% de confluencia, y subcultívese hasta que sea necesario 2. C1 Preparación de fibroblastos de ratón v de rata

- córtese la cola

- aféitese la cola con un escalpelo

- rocíese la cola con etanol al 70% para matar las bacterias y esporas fúngicas

- retírese la piel de la cola

- coloqúese la piel en una cápsula de Petri de 10 cm

- en condiciones estériles, córtese la piel en trozos pequeños (5x5 mm)

- digiéranse los trozos de piel con 0,05% de tripsina EDTA durante 20 min. en una incubadora de C02 a 37°C

- lávese la tripsina de las cápsulas con piel con medio (DMEM con alto contenido en glucosa, 10% de FCS, 1% de Pen/Estrep), elimínese el medio y lávese nuevamente durante 3-4 veces

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- incúbense entonces los trozos de piel en una incubadora de CO2 a 37°C y cámblese el medio cada día; después de 1 semana, los fibroblastos crecen

2. DI Preparación de fibroblastos humanos

- coloqúese prepucio en cápsula de Petri

- lávese dos veces con PBS

- elimínese la grasa

- lávese con PBS una vez

- córtese la piel en pequeños trozos (2 mm)

- añádanse 10 mi de dispasa (2 U/ml)

- Incúbese a 4°C durante 16-18 h

- deséchese la disolución de dispasa

- añádanse 5 mi de PBS

- sepárense la dermis y la epidermis

- transfiérase la dermis a una nueva cápsula y añádanse 10 mi de colagenasa (500 U/ml)

- obténganse trozos muy pequeños

- transfiéranse los trozos a un tubo falcon de 50 mi con disolución, e incúbese durante 45 min. (37°C; 5% de C02)

- centrifúguese a 1000 rpm durante 5 min.

- deséchese el sobrenadante y resuspéndase el pelete en DMEM (10% de FCS)

- centrifúguese nuevamente

- resuspéndase el pelete en 2 mi de DMEM (10% de FCS) y transfiérase a un falcon de cultivo celular T75

- expándanse las células hasta el uso

3. Transfección de ARNm

3. Ai Transfección de ARNm de fibroblastos humanos. MSC humana, fibroblastos de rata. MSC de rata, fibroblastos de ratón v MSC de ratón con AMAXA. FuaeneHD. Lipofectamine™ LTX Reaaent v PLUS™ Reaaent

1) Transfección de AMAXA con el kit Nucleofector® de fibroblastos dérmicos humanos íplaca de 6 pocilios):

Preparación para una electroporación en cubeta Amaxa certificada:

- ARNm de oct4, sox2 y klf4 en total de 2 pg

- 4 x105 células

- 100 pl de disolución de Nucleofector®

- escójase el programa U-023 por la máquina de electroporación Amaxa

- resuspéndanse las células en la cubeta con 500 pl de medio de fibroblastos o de MSC

- proporciónense 5 mi de medio de fibroblastos o de MSC con o sin cóctel en cada pocilio de una placa de 6 pocilios

- siémbrense 100.000 células en cada pocilio de una placa de 6 pocilios

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Composición del cóctel:

- Resveratrol 0,05 mM

- selenio0,1pM

- EGCG (galato de (-)-Eplgalocatequina) 0,01 pM

- TSA (Tricostatlna A) 0,015 pM

- Reversina 1 pM

- VPA (ácido libre de ácido 2-propilpentanoico) 6 pM

- 5’Aza (5-Aza-2’-desoxicitidina) 1 pM

- en el día 1: el cóctel es con 5’Aza y sin TSA; después de 48 horas, 5’Aza se sustituye por TSA

- cada 72 horas nueva transfección con el reactivo de transfección FuGENE® HD (Roche)

2) Reactivo de transfección FuGENE® HD ÍRochel

- antes de la transfección: cámbiese a medio libre de antibióticos Procedimiento de transfección

- diluyase ARNm con medio libre de suero y libre de antibióticos hasta una concentración de 2 pg de ARNm a un volumen de 100 pl para cada pocilio (placa de 6 pocilios)

- pipetéense 8 pl de reactivo de transfección FuGENE® HD (relación: 8:2 de reactivo de transfección a ARNm) directamente en el medio, y pipetéese hacia arriba y hacia abajo

- Incúbese el complejo de reactivo de transfecc¡ón:ARNm durante 15 minutos a temperatura ambiente

- añádase el complejo de transfección a las células gota a gota

- háganse girar los pocilios para asegurar la distribución a lo largo de toda la superficie de la placa

- después de 4-6 horas, cámbiese a medio (que contiene 10% de FCS, 1% de Pen/Estrep) con o sin cóctel

- incúbese una placa de 6 pocilios transfectada a una condición de 21% de 02 (normoxia), e incúbese una segunda placa a una condición de 1% de 02 (hipoxia) en una incubadora a 37°C

3) Transfección alternativa con Lipofectamine™ LTX Reagent o PLUS™ Reagent (Invitrogen)

a) Reactivo de transfección FuGENE® HD ÍRochel

- siémbrense 7000 células en 500 pl de medio por pocilio de una placa de 24 pocilios

- incúbese toda la noche

- para la transfección: cámbiese a medio libre de antibióticos

- dilúyanse 0,5 pg de ARNm en 25 pl de medio libre de suero y libre de antibióticos para cada pocilio (placa de 24 pocilios)

- pipetéense 2 pl del reactivo de transfección FuGENE® HD (relación: 8:2 de reactivo de transfección a ARNm) directamente en el medio

- pipetéese hacia arriba y hacia abajo

- incúbese el complejo de reactivo de transfección:ARNm durante 15 minutos a temperatura ambiente

- añádase el complejo de transfección a las células gota a gota

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- háganse girar los pocilios para asegurar la distribución a largo de toda la superficie de la placa

- después de 4-6 horas, cámbiese a medio (que contiene 10% de FCS, 1% de Pen/Estrep) con o sin cóctel bí Lipofectamine™ LTX Reaaent and PLUS™ Reaaent ílnvitroaení

- siémbrense 7000 células en 500 pl de medio por pocilio de una placa de 24 pocilios

- incúbese durante toda la noche

- antes de la transfección: cámbiese a medio libre de antibióticos

- diluyanse 0,5 pg de ARNm en 100 pl de medio libre de suero y libre de antibióticos para cada pocilio (placa de 24 pocilios)

- mézclese suavemente

- mézclese PLUS™ Reagent suavemente antes del uso

- añádanse 0,5 pl de PLUS™ Reagent en la mezcla del medio de ARNm, mézclese suavemente e Incúbese 5 mln. a temperatura ambiente

- mézclese Lipofectamine™ LTX Reagent suavemente antes del uso

- añádanse 1,25 pl directamente al ARNm diluido; mézclese suavemente

- Incúbese durante 30 min. a temperatura ambiente

- añádanse los 100 pl del complejo de ARNm-Lipofectamine™ LTX Reagent al pocilio

- mézclese suavemente moviendo la placa hacia delante y hacia atrás

- incúbense las células a 37°C en la incubadora de C02 durante 4-6 horas

- cámbiese a medio con o sin cóctel

- durante la optimización de la eficiencia de la transfección increméntese la cantidad de la concentración de ARNm a 1 pg por pocilio (placa de 24 pocilios)

- cada 72 h repítase la transfección con FuGENE® HD o Lipofectamine™ LTX Reagent y PLUS™ Reagent

4. Tratamiento con inhibidor de proteasas (MG132) para incrementar la semivida de las proteínas producidas por el ARNm transfectado:

- 48 h después de la transfección: trátense dos pocilios en cada placa con MG-132 (10 pM/pocillo) con y sin cóctel durante 6 h, y cámbiese después el medio

5. Resultados

Análisis de la cantidad de ARNm (por PCR1 de los genes transfectados o internos íoct4. nanoa. hTERT. sox2. klf41 v análisis del promotor íde nanoa. sox. oct41

Los resultados de la reprogramación se exponen en las figuras 1 a 8.

6. Herramientas y métodos

6.1 Aislamiento de ARN con TriFaSt™ ÍPealabl

- 1 mi de Trifast por 10 cm2 del área de la cápsula de cultivo

- las muestras se pueden almacenar durante un tiempo prolongado a -80°C, o se pueden usar directamente

- las muestras se deberían de mantener durante 5 minutos a temperatura ambiente

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- añádanse 0,2 mi de cloroformo

- agítense vigorosamente las muestras de forma manual durante 15 segundos

- incúbese durante 3 minutos a temperatura ambiente

- centrifúguese a 12.000 x g

- transfiérase la fase acuosa con ARN a un nuevo tubo (guárdese la interfase y la fase orgánica a 4°C para el aislamiento de ADN y proteínas)

- precipítese el ARN con 0,5 mi de isopropanol por 1 mi de Tri-Fast™ usado para la homogeneización inicial

- incúbese en hielo durante 15 min.

- centrifúguese durante 10 minutos a 4°C a 12.000 x g

- elimínese el sobrenadante

- lávese dos veces el pelete de ARN con etanol al 75% mediante vórtice

- centrifúguese subsiguientemente durante 8 minutos a 7.500 x g (4°C)

- elimínese el exceso de Isopropanol del pelete de ARN mediante secado al aire

- resuspéndase el pelete de ARN en agua libre de ARNasa (DEPC-H20) -> 30 p.l-50 pl

- disuélvase el pelete de ARN haciendo pasar la disolución a través de una punta de pipeta varias veces

- incúbese la disolución durante 10 min. a 55°C

- pipetéese hacia arriba y hacia abajo

- el calentamiento de la muestra a 55-60°C puede ayudar a disolver el pelete

- mídase la concentración de ARN —» NanoDrop

- almacénense las muestras a -80°C durante 2-3 meses

6.2 Aislamiento del ADN

- elimínese cualquier fase acuosa que quede tras la eliminación del ARN

- hágase precipitar el ADN con 0,3 mi de etanol al 100% por mi de Tri-Fast™

- mézclese bien por inversión

- almacénense las muestras a temperatura ambiente durante 2-3 minutos

- centrifúguese a 2.000 x g a 4°C durante 5 minutos

muévase el sobrenadante del ADN (almacénese a 4°C para el aislamiento de proteína) lávese el pelete de ADN dos veces con 1 mi de citrato de sodio 0,1 M en etanol al 10%

- en cada etapa de lavado, manténgase el ADN en citrato de sodio 0,1 M/etanol al 10% durante 30 minutos a temperatura ambiente (con mezclamiento periódico)

- centrifúguese a 4°C durante 5 minutos a 2.000 x g

- después de estos dos lavados, suspéndase el pelete de ADN en 2 mi de etanol al 75%

- manténgase a temperatura ambiente con mezclamiento periódico durante 15 minutos

- centrifúguese a 2.000 x g durante 5 minutos a 4°C

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- séquese brevemente el pelete de ADN durante 5-10 minutos a vacío, y

- disuélvase en NaOH 8 mM haciendo pasar lentamente el pelete a través de una pipeta de calibre ancho

- ajústese la concentración final de ADN a 0,2-0,3 pg/pl con NaOH 8 mM

6.3 Tratamiento del ARN con DNase I (Fermentas):

- 1 pg de ARN

- 1 pl de tampón de reacción 10x con MgCI2

- 1 pl (1 u) de ADNasa

- hasta 9 pl de DEPC-H20

- incúbese a 37°C durante 30 minutos

- Inactivación de DNase 1: añádase 1 pl de EDTA25 mM e incúbese a 65°C durante 10 min.

6.4 RT-PCR con transcriptasa inversa SuperScript™ III (Invitroaen)

Condición de reacción:

- 1 pl de cebador ollgo(dT)20

- 1 pg de ARN

- 1 pl de mezcla de dNTP 10 mM (10 mM de cada uno de dATP, dGTP, dCTP y dTTP)

- hasta 13 pl de DEPC-H20

- caliéntese la mezcla hasta 65°C durante 5 minutos

- incúbese en hielo durante 1 min.

Añádanse:

- 4 pl de Tampón de Primera Hebra 5x

- 1 pl de DTT 0,1 M

- 1 pl de SuperScript™ III RT (200 unidades/pl)

- mézclese pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo

- incúbese a 50°C durante 60 min.

- inactívese la reacción calentando a 70°C durante 15 minutos

- almacénese el ADNc a -20°C

6.5 PCR de oct4 humana (control de los fibroblastos humanos):

Secuencia de cebador: hoct4_S: gaggatcaccctgggatataca hoct4_as: agatggtcgtttggctgaatac

Tamaño de producto: 100 pb

6.6 PCR con Platinum Taa-Povmerase (Invitroaení Preparación de la reacción de PCR en hielo:

- 5 pl de Tampón de PCR 10x

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- 1 pl de mezcla de dNTP 10 mM, 0,2 mM cada uno

- 1,5 ni de MgCI2 50 mM

- 1 pl de mezcla de cebadores (10 pM cada una), 0,2 pM cada uno

- 1 pl de ADN molde

- 0,2 pl de Platlnum® Taq DNA Polymerase 1,0 unidades

- hasta 50 pl de DEPC-H20 Programa de PCR (Biometra Tprofessionah:

95°C 95°C 60°C 70° C 70°C

4°C para almacenamiento

Control de PCR con gel de agarosa y TAE al 3% para electroforesis

6.7 Protocolo para producir células ¡PS

6.7.1 Matriz cualificada para hESC Matriael™ de BD

- coloqúese la caja de puntas esterilizadas y los tubos eppendorf toda la noche en un congelador a -20°C

- descongélese la botella de Matrlgel en hielo en el refrigerador a 4°C toda la noche

- distribuyase Matrlgel en alícuotas para hESC a su llegada, almacénese a -80°C, descongélese solamente una vez y no se vuelva a congelar para evitar la ruptura de los factores de crecimiento

- con fines de revestimiento, dilúyase Matrlgel apropiadamente usando medio libre de suero (0,3 pg/pl para

¡PS, 1 pg/pl para hESC)

- añádanse 50 pl de dilución de Matrigel por cm2 de superficie de crecimiento

- incúbese 60 min. a RT en condiciones estériles o toda la noche a 4°C

- empápese el Matrigel/medio restante

- medio: mTeSRI (Stem Cell Technology)

La receta del revestimiento (0,3 pg/pl) depende del tipo celular que se use para generar iPS. Se recomienda revestir y no gelificar plásticos para cultivo de hESC usando 1 ug de Matrigel/pl. Úsense las placas inmediatamente o almacénense durante un máximo de 7 días a 4°C cubiertas con medio libre de suero en condiciones asépticas (cerradas herméticamente).

Las placas de Matrigel revestidas siempre se deberían de procesar, almacenar y usar exactamente de la misma manera para evitar variabilidades (principalmente a través de la ruptura de los factores de crecimiento). Al comienzo o para el establecimiento, es necesario valorar un volumen de revestimiento y una concentración (por ejemplo, 3 diluciones 0,3, 0,6, 1 ug/ul) que se adecúan lo mejor posible a su tipo de células específico.

6.7.2 Matriz de membrana de basamento de Matriael™ de BD. reducida en factores de crecimiento (GFR)

- tómense alícuotas de Matrigel, tal como Matrigel cualificada para hESC

- descongélese el tubo toda la noche en hielo a 4°C

2 min 30 s 30 s 30 s 10 min

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- dilúyase con 6 mi de medio basal frío, y mézclese bien

- añádase 1 mi por pocilio de placa de 6 pocilios

- incúbese la placa a temperatura ambiente durante una hora o toda la noche a 4°C

- la placa se puede usar ya sea inmediatamente o se puede almacenar a 4°C (la placa durará bien durante por lo menos una semana)

- elimínese el líquido en exceso y lávese una vez con medio basal

- componente de medio basal: D-MEM/F-12; 20% de KO Serum Replacer; 1% de aminoácidos no esenciales; L-glutamina 1 mM, 2-mercaptoetanol 0,1 mM; bFGF 100 ng/ml

- úsense células de ratón y después añádase sobrenadante de LIF al medio basal

6.7.3 Producción de sobrenadante de LIF

- cápsula de Petri revestida (145 mm) con 0,1% de gelatina (bovina tipo B, Sigma)

- siémbrense 3 x 1010 células alimentadoras SNL productoras de LIF en cada cápsula

- componente del medio: D-MEM rico en glucosa, 10% de FCS, 1% de Pen/Estrep; 1% de L-glutamina

- después de 24 horas, recójase el medio de la cápsula y fíltrese a través de un filtro de 0,22 pm

- distribúyase en alícuotas el medio que contiene LIF en alícuotas de 500 pl y almacénese a -20°C

- cámbiese el medio tras 24 horas o 48 horas Listado de secuencias

<110> Fraunhofer-Gesellachaft zur Fórderung der angewandten Forschung e. V.

<120> Reprogramación de células hacia un estado pluripotente

<130> 201763 EP <160> 28

<170> Patentln versión 3.5

<210> 1

<211 >2098

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 1 attataaatc tagagactcc aggattttaa cgttctgctg gactgagctg gttgcctcat

•60

gtfcacbatgc aggcaactca ctttatccca atttcttgat «ettttectt ctggaggtcc

120

tatttctcta acatcttcca gaaaagtctt aaagctgcct taaccttttt tccagtccac

íeo

ctcttaaatt ttttcctcct cttcctetat actaacatga gtgtggatcc agcfctgtccc

240

caaagcttgc cttgctttga agcatccgac tgtaaagaat cttcaccCat gcctgtgatt

loo

tgtgggcctg aagaaaacta tccatccttg cuatgtctt ctgetgagat gcctcacacg

360

gagactgtct ctcctcttcc ttcctccaCg gatctgctta ttcaggacag ccctgattct

420

tccaccagtc ccaaaggcaa acaacccact tetgcagaga agagtgtcgc aaaaaaggaa

480

gacaaggtcc eggtcaagaa acagaagacc agaactgtgt tctcttceac ccagctgtgt

540

gtactcaatg atagatttca gagacagaaa tacctcagcc tccagcagat gcaagaactc

600

tccaacatec tgaacctcag ctacaaacag gtgaagacct ggttccagaa ccagagaatg

660

aaatctaaga ggtggcagaa aaacaaetgg ccgaagaata gcaatggtgt gacgcagaag

720

gcctcagcac ctacctaccc cagcetttae tctlcctacc accagggatg cctggtgaac

7B0

ccgactggga accctccaat gtggagcaac cagaccCgga acaattcaac ctggagcaac

840

cagacccaga acatccagtc ctggagcaac -caetcccgga acactcagae ctggtgcacc

900

caatcctgga acaateaggc ctggaacagt cecttctata actgeggaga ggaatctctg

960

cagtcctgca tgcagttcca gccaaattct cctgccagfeg acttggaggc tgccttggaa

1020

gctgctgggg aaggccttaa tgtaatacag cagaccacta ggtattttag tactccacaa

1080

accatggatt tattcetaaa etactccatg aacatgcaac ctgaagacgt gtgaagatga

1140

gtgaaactga tattactcaa tttcagtctg gacactggct gaatcccccc tctcccctcc

1200

tcccatccct cacaggattt ttcttgtttg gaaaccacgt gttctggtfct ccatgatgcc

1260

catccagtca atcteatgga gggtggagta tggttggagc ctaatcagcg aggtttcttt

1320

tttttttttt ctcctatcgg atcctcctgg agaaaatact tttttttttt ttttttttga

1380

aacggagtct tgctctgtcg cccaggctgg agtgcagtgg•cgcggtcttg gctcactgca

1440

agctccgtct cccgggttca cgccactctc ctgcctcagc ctcccgagca gctgggacta

1500

caggcgcccg ccacctcgcc cggctaatat tttgtatttt tagtagagac ggggtttcac

1560

tgtgttagcc aggatggtct cgatctcctg accttgtgat ccacccgcct cggcctccct

1620

aacagctggg atttacagge gtgagceace gcgccctgcc tagaaaagac attttaataa

1680

ccttggctgc cgtctctggc tatagataag cagatctaat accagtttgg atatctttag

1740

ggtttagaat ctaacctcaa gaataagaaa tacaagtaca aattggtgat gaagatgtat

1800

tcgtattgtt tgggattggg aggctttgct cattttttaa aaactattga ggtaaagggt

1860

taagctgtaa catacttaat tgatttctta ccgtttttgg ctctgttttg ctatatcccc

1920

taatttgttg gttgtgctaa tctttgtaga aagaggtetc gtatttgctg catcgtaatg

1980

acatgagtac tgctttagtt ggtttaagtt caaatgaatg aaacaactat ttttccttta

2040

gttgatttta ccctgatttc accgagtgtt tcaatgagta aatatacagc ttaaacat 5 <210> 2 <211> 1356 <212> ADN <213> Mus musculus

2098

25

<400>2

tctatcgcct tgagccgttg gcettcagat aggcCgattt ggttggtgtc ttgctctttc 60

tgtgggaagg ctgcggctca cttccttctg. accccttgat utttcjcac tagieattta 120

actcttcttt ctatgatctt tccttctaga cactgagttt tttggccgcc gcctaaaacc leo

cettcagaaa tccctcccct cgccatcaca ctgacatgag tgtgggtctt cctggtcccc 1240

acagCttgcc tagttctgag gaagcaccga actccgggaa egcctcatca, atgccCgcag 300

tttttcatcc cgagaactac tcttgctCac aagggtctgc tactgagatg ctctgcacag 360

aggccgeete teetcgccct tcctctgaag acctgcctct tcaaggeagc cctgattctt 420

ctaccagtcc caaacaaaag ctctcaajtc ctgaggctga caagggccct gaggaggagg 460

agaaeaaggt ccctgccagg aagcagaaga tgcggactgt gttctctcag gcccagctgt $40.

gtgcactcaa ggacaggttt cagaagcaga agtacctcag ectccagcag atgcaagaac 600

tctcctccat tctgaacctg agccacaagc aggCCaagac eeggccccaa aaccaaagga 660

tgaagtgeaa gcggtggcag aaaaaccagt ggttgaagac tageaatggt ctgattcaga 32o

agggcteagc accagtggag tatcccagca tccategeag etatecccag ggctatctgg ?BO

tgaaegcacc' tggaagcctC cccatgtggg gcagccagac ttggaccaac ccaaettgga 6*0

gcageeagae ccggaccaae ceaacttgga acaaceagac ccggaccaac ccaactcgga 900

geageeaggc ccggaccgct cagtcctgga acggccagcc ttggaacgct gctccgctcc 960

ataacttcgg ggaggacttt ctgcagccbC acgCacagtt geagcaaaae ttctctgcca 1020

gtgatttgga ggcgaatttg gaagccacta gggaaageca tgcgcatttt agcaccceac iobo

aagccttgga attattcctg aaccactctg tgactccacc aggtgaaata cgagacccac 1140

gcaaeatctg ggettaaagt cagggcaaag ccaggttcct tccttcttec aaacatttcc 1200

atattttttt taaagattta tetateeatt atacgtaagt acactgtagc tgtcttcaga 1260

cactccagaa gagggcgtca gatcttgtta cgtatggttg tgagccacca tgtggttgct 1320

5 gggatecgaa ctcctgacct tcggaagagc agtegg 1356

<210>3 <211 >2358 <212> ADN

10 <213> Rattus norvegicus

Claims (13)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento para preparar//? vitro células de mamífero reprogramadas sin el uso de un virus, que comprende

   a) proporcionar unas células de mamífero aisladas que van a ser reprogramadas,

   b) transfectar una o más moléculas de ARNm reprogramadoras en las células proporcionadas en la etapa a), en el que las moléculas de ARNm reprogramadoras codifican por lo menos una proteína reprogramadora seleccionada de entre el grupo constituido por Ronin, Oct4, Klf4, Sox2, Nanog y TERT,

   c) cultivar las células obtenidas en la etapa b) en un medio de cultivo celular y en una condición adecuada para permitir la traducción de las moléculas de ARNm reprogramadoras transfectadas, conteniendo el medio de cultivo celular por lo menos un inhibidor transitorio de la proteolisis, para obtener las células reprogramadas, siendo dichas células reprogramadas unas células de mamífero que presentan un carácter de célula madre pluripotente o multipotente.
2. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la condición adecuada para permitir la traducción es un contenido de oxígeno en el medio de cultivo celular comprendido entre 0,5% y 21%.
3. 3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que la condición adecuada para permitir la traducción es una temperatura comprendida entre 30°C y 38°C.
4. 4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el medio de cultivo celular tiene un contenido de glucosa comprendido entre 0,1 g/l y 4,6 g/l.
5. 5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el medio de cultivo celular contiene por lo menos una sustancia inductora seleccionada de entre el grupo constituido por reversina, resveratrol, selenio, compuestos que contienen selenio, EGCG (epigalocatequina-3-galato), ácido valproico, sales de ácido valproico y valproato de sodio.
6. 6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el inhibidor transitorio de la proteolisis se selecciona de entre el grupo constituido por inhibidor de proteasa, inhibidor de proteosoma e inhibidor de lisosoma.
7. 7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que dicho inhibidor de proteosomas se selecciona de entre el grupo constituido por MG132, TMC-95A, TS-341, y MG262.
8. 8. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que dicho inhibidor de proteasa se selecciona de entre el grupo constituido por aprotinina, G-64 y hemisulfato de leupeptina.
9. 9. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que dicho inhibidor de lisosoma es cloruro de amonio.
10. 10. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células que van a ser reprogramadas son células humanas.
11. 11. Procedimiento para inducir la desdiferenciación de células de mamífero, en el que se lleva a cabo un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
12. 12. Procedimiento para mejorar la expansión in vitro de células madre de mamífero, en el que se lleva a cabo un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende

    a) proporcionar células de mamífero aisladas que van a ser reprogramadas,

    b) transfectar una o más moléculas de ARNm reprogramadoras en las células proporcionadas en la etapa a), codificando las moléculas de ARNm reprogramadoras por lo menos una proteína reprogramadora seleccionada de entre el grupo constituido por Ronin, Oct4, Klf4, Sox2, Nanog y TERT,

    c) cultivar las células obtenidas en la etapa b) en un medio de cultivo celular y en una condición adecuada para permitir la traducción de las moléculas de ARNm reprogramadoras transfectadas, conteniendo el medio de cultivo celular por lo menos un inhibidor transitorio de la proteolisis, para obtener células reprogramadas, siendo dichas células reprogramadas unas células de mamífero que presentan un carácter de célula madre pluripotente o multipotente,

    en el que dicho cultivo en la etapa c) se caracteriza por que prolonga la expansión de las células madre

    pluripotentes o multipotentes obtenidas, siendo dichas células madre que van a ser expandidas mantenidas en

    un estado desdiferenciado.
13. 13. Procedimiento para el rejuvenecimiento de células de mamífero envejecidas, en el que se lleva a cabo un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

    tx de cotrol de promotor de Rex1

    imagen1

    imagen2

    Fig. 1A

    en

    K)

    tx de control de promotor de Nanog

    imagen3

    tx de ARNm de factor de célula madre

    imagen4

    Fig. IB

    tx de control de promotor de Oct4

    imagen5

    tx de ARNm de factor de célula madre

    imagen6

    Fig. IC

    Electroporación Amaxa (klf4, sox2, oct4)

    Amaxa 1 % 02 Amaxa 1 % 02.Cóctel Amaxa 21 % 02 Amaxa 21 % 02. Cóctel

    imagen7

    Fig.2

    Transfección de Fugene (klf4, sox2, oct4)

    Fugenel%02 Fugene 1% 02.Cóctel Fugene 21% 02 Fugene 21% 02_ Cóctel

    imagen8

    ri9.3

    L 1

    en

    en

    RT-PCR Oct4

    2 3 4 5 6 7 1a 2a 3a 4a 5a 6a 7a 8

    Fig.4

    RT-PCR hOct4

    imagen9

    Fig. 5

    imagen10

    rag.e

    RT-PCR hKlf4 y hNanog

    imagen11

    Fig.7

    oCt4_l S0X2JI

    imagen12

    ( WH I MI * I»

    1 H»

    BJ0|EOS3

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    imagen13

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