ES2559029T3 - Composiciones que contienen al complejo HC.HA y metodos de uso de las mismas - Google Patents

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Abstract

Un método para producir un complejo HC*HA reconstituido (HC*HArc), que comprende a. proporcionar una mezcla de reacción que comprende: i. proteína de enlazamiento a HA (HABP) fijada a un soporte estacionario; ii. hialuronano (HA); iii. HC1 y HC2 (cadena pesada 1 y cadena pesada 2) de IαI (inhibidor de tripsina inter alfa) aisladas de suero; y iv. TSG-6; y b. incubar la mezcla de reacción durante un período de tiempo suficiente para producir un complejo HC*HA reconstituido.

Description

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Composiciones que contienen al complejo HC.HA y metodos de uso de las mismas.
Antecedentes de la invencion
La membrana amniotica (MA) es la membrana mas interna que envuelve el feto en la cavidad amniotica. La MA consiste en un epitelio simple, una membrana basal gruesa, y un estroma no vascularizado.
Rugg y colaboradores (JBC, 2005) y Sanggaard y colaboradores (JBC, 2008) cada uno describe el mecanismo de como surgen los complejos HC^HA.
Resumen de la invencion
La presente invencion proporciona un metodo para producir un complejo reconstituido HC^HA (HC^HArc) como se expone en las reivindicaciones. En el presente documento se divulga, en ciertas realizaciones, un complejo HC^HA que comprende hialuronano y una cadena pesada de IaI, en donde la transferencia de la cadena pesada de IaI es catalizada, al menos en parte, por protefna TSG-6, TSG-6 recombinante, protefna tipo TSG-6, protefna tipo TSG-6 recombinante, o una combinacion de las mismas. En algunas realizaciones, el complejo HC^HA comprende HCl y HC2 de IaI. En algunas realizaciones, el complejo HC^HA tiene una pureza de al menos 75%.
Se divulga en el presente documento, en ciertas realizaciones, un complejo HC^HA que comprende hialuronano y una cadena pesada de IaI, en donde la transferencia de la cadena pesada de IaI es catalizada por la protefna tipo TSG-6 y/o una protefna tipo TSG-6 recombinante. En algunas realizaciones, el complejo HC^HA comprende HCl y HC2 de IaI. En algunas realizaciones, el complejo HC^HA tiene una pureza de al menos 75%.
Se divulga en el presente documento, un metodo para reducir o prevenir la inflamacion, que comprende administrar un HC^HA de la invencion a un individuo que requiera del mismo.
El metodo puede comprender ademas administrar un agente antibiotico adicional.
Se divulga en el presente documento, un metodo para reducir o prevenir la formacion de cicatrices que comprende administrar un complejo HC^HA de la invencion a un individuo que requiera del mismo. El metodo puede comprender ademas la administracion de un agente antiinflamatorio adicional. El metodo puede comprender ademas la administracion de un agente antibiotico adicional.
Se divulga en el presente documento, un metodo para reducir o prevenir la angiogenesis que comprende administrar un complejo HC^HA de la invencion a un individuo que requiera del mismo. El metodo puede comprender ademas la administracion conjunta de un agente quimioterapeutico adicional.
Se divulga en el presente documento, un metodo para prevenir el rechazo de trasplantes que comprende poner en contacto un tejido o una pluralidad de celulas con un complejo HC^HA de la invencion. El metodo puede comprender ademas poner en contacto el tejido o una pluralidad de celulas con solucion de reperfusion. El metodo puede comprender ademas la administracion conjunta de un agente inmunosupresor adicional.
Se divulga en el presente documento, de acuerdo con la invencion, un metodo de fabricacion de un complejo HC^HA como se expone en la reivindicacion 1. Al menos uno entre HA y TSG-6 es opcionalmente recombinante. En algunas realizaciones, el metodo comprende ademas un biorreactor. En algunas realizaciones, el metodo comprende ademas una pluralidad de celulas donde las celulas son modificadas por ingenierfa genetica para expresar constitutivamente protefna TSG-6 o tipo TSG-6.
Se divulga en el presente documento, un metodo de aislamiento de HC^HA a partir de material amniotico que comprende: (a) el procesamiento del material amniotico de tal manera que este sea adecuado para la extraccion de un complejo HC^HA; y (b) la extraccion del complejo HC^HA mediante un metodo seleccionado de: cromatograffa, filtracion por gel, centrifugacion, o solubilidad diferencial, precipitacion con etanol, o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el procesamiento comprende la homogenizacion del material amniotico. En algunas realizaciones, el metodo comprende ademas la extraccion del complejo HC^HA mediante centrifugacion en gradiente. En algunas realizaciones, el procesamiento se produce por debajo de la temperatura ambiente. En algunas realizaciones, el procesamiento se produce a 4°C. En algunas realizaciones, el material amniotico es de membrana amniotica. En algunas realizaciones, el material amniotico es de la membrana corionica.
Descripcion de los dibujos
Figura 1: Se trato el extracto A (por duplicado) con una serie de concentraciones de NaOH (0, 0,02, 0,05, 0,10, 0,2 N) antes de la transferencia tipo Western con un anticuerpo anti-Ial para determinar la concentracion optima NaOH para escindir el enlace entre HA y las HC (A, M: marcadores escalera de protefna y IaI: purificada a partir de plasma
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humano). Se analizaron los extractos A, B, y C con o sin digestion con HAasa o tratamiento con NaOH 0,05 N (B). La bikunina no se asocio con extractos de HA en MA cuando se analizaron las mismas muestras como se describe en B mediante trasferencias tipo Western con un anticuerpo anti-bikunina (C, bikunina purificada de orina, es decir, infeccion del tracto urinario, UTI, como control).
Figura 2. Se encontro que protefnas las TSG-6 y tipo TSG-6 estan presentes en el extracto A usando tres diferentes anticuerpos que reconocieron el TSG-6Q de control (25 ng) como una protefna de ~ 32 kDa (A, se observaron bandas de ~35 kDa y ~50 kDa en el extracto A). TSG-6 no se acoplo de forma covalente con HA en los extractos A, B, C que fueron tratados con o sin HAasa o NaOH y se analizo mediante transferencias tipo Western con anticuerpo MAB2104 anti-TSG-6 (B). Se encontro que la protefna tipo TSG-6 era diferente de TSG-6 en el peso molecular, y producida especfficamente por la membrana amniotica.
Figura 3. Se observo una relacion dependiente de la dosis en la supresion de la actividad del promotor del TGF-p1 por una serie de concentraciones de extracto P (A). Por el contrario, no hubo tal relacion por una serie de concentraciones de HA de alto peso molecular, APM (B). El efecto supresor de la actividad promotora del TGF-p1 se perdio cuando se digirio el extracto P (125 pg/ml de protefnas), pero no HA de APM (125 pg/ml) con hialuronidasa (C) o se lo trato con calor (95°C durante 10 min) (D). En A, B, C, y D, un asterisco (*) indica p < 0,05 (n = 4).
Figura 4. La fraccion # 8-15 de la primera ultracentrifugacion de CsCl/guanidina HCl 4 M (1era) comenzo a una densidad inicial de 1,35 g/ml (A) y la fraccion # 3-15 de la segunda ultracentrifugacion (2da) comenzo a una densidad inicial de 1,40 g/ml (B) se reunieron de acuerdo a la presencia de HA pero la ausencia de protefnas. La ultima fraccion, despues de la dialisis y la eliminacion del agua, fue denominada como el complejo nHC*HA, se la trato con o sin NaOH 0,05 N a 25°C durante 1 h, y se analizo en gel de agarosa al 0,5% antes de ser tenido con tintes de todos los colores (C), se tineron con el colorante azul de Coomassie (D), o sobre la transferencia tipo Western utilizando un anticuerpo anti-Ial (E). Los resultados confirmaron que el complejo HC^HAn fue formado por HA de APM y HC de IaI a traves de un enlace sensible a NaOH. Tengase en cuenta que las fracciones reunidas de la segunda ultracentrifugacion (etiquetada como segunda) en D se concentraron ~ 20 veces por liofilizacion antes de la carga para mejorar la deteccion mediante el colorante azul de Coomassie.
Figura 5. Se determino que la capacidad de enlazamiento de HA (%) en pozos entrecruzados de HABP era maxima a 25 pg/ml de HA de APM mediante la adicion tanto de IaI humana como TSG-6 humana recombinante (A, •) en comparacion con solo HA de APM (A, ▲) o HA de APM con IaI (A, ■). La transferencia tipo Western utilizando un anticuerpo anti-Ial (B) revelo que el HA de APM enlazado en pozos entrecruzados con HABP formo complejo HC^HA cuando se anadio tanto con IaI como con TSG-6 (HA + IaI + TSG-6, carriles 6, 10, y 14) en comparacion con HA solo de APM (carriles 3, 7, y 11), con IaI solo (HA + Ial, carriles 4, 8, 12) o TSG-6 sola (HA + TSG-6, carriles 5 , 9, 13), ya sea sin (carriles 3 -6) o con digestion con HAasa (carriles 7-10) o tratamiento con NaOH (carriles 11-14).
Figura 6. En comparacion con PBS como control (Ctrl), complejo HC*HA rc o nHC*HA suprimio significativamente la actividad promotora de TGF-p1, es decir, tal como se mide por el ensayo del promotor del TGF-p1 (A, p = 0,004 y 0,005, respectivamente), y promovio la muerte de macrofagos como se midio por el ensayo de MTT (B, p = 0,0003 y 0,0007, respectivamente). En contraste, HA solo e APM (HA) o con IaI adicional (HA + Ial) o TSG-6 (HA + TSG-6) no mostro ningun efecto (todos p> 0,05).
Figura 7. El ensayo de MTT mostro que el complejo HC^HA purificado a partir de AME (etiquetado como HC-HA) disminuyo significativamente la viabilidad celular mas que HA de APM o AME sola (P = 0,002 y 0,02, respectivamente). Figura 8. La morfologfa de las celulas HUVEC es cambiada por un complejo HC^HA pero no por HA de APM. Cuando un complejo HC^HA fue sembrado simultaneamente con HUVEC, HUVEC mantuvo una forma poliedrica tfpica sin (Ctrl) o con 4 pg/ml de HA de APM durante 2 dfas (HA). Por el contrario, HUVEC se tornaron pequenas, redondeadas y se agregaron con 4 pg/ml de complejo HC^HA durante 2 dfas. La Fig. 8B, un ensayo de MTT, muestra que no hay diferencia en la viabilidad celular entre el control (Ctrl) y HA de APM (P = 0,1). En contraste, se suprimio significativamente la viabilidad de HUVEC por un complejo HC^HA cuando se compara con el control o HA de APM (P = 0,01 o 0,003, respectivamente). Las Figuras 8C y 8d muestran que se inhibe la proliferacion. No hubo diferencia significativa en el porcentaje de nucleos positivos para BrdU entre el control (32,5%, n = 133) o 5 pg/ml HA de APM anadidos durante 48 h (31,9%, n = 144) y en el fndice de marcacion (es decir, el porcentaje de celulas en proliferacion) de HA de APM (P = 0,9). Por el contrario, se abolio completamente el etiquetado de BrdU cuando se les anadio a las celulas HUVEC 5 pg/ml del complejo HC^HA, resultando en una reduccion significativa del fndice de marcacion (1,9%, n = 69), que fue significativamente diferente de Ctrl y HA de APM (P = 0,00005 y P = 0,001, respectivamente). Finalmente, la Fig. 8E muestra que aumenta la muerte celular. El ensayo de Vida & Muerte mostro celulas HUVEC vivas en el control con o sin adicion de 25 pg/ml de HA de APM. Por el contrario, la reduccion notable de celulas vivas y el aumento de celulas muertas fue provocado por 25 pg/ml de complejo HC^HA.
Figura 9. Cuando se anadio el complejo HC^HA 24 h despues de la siembra de HUVEC, no causo el mismo redondeo morfologico en comparacion con el control de plastico (Ctrl) o HA de APM como se ha senalado, cuando se anadio el complejo HC^HA simultaneamente con la siembra de HUVEC (consultar la Fig. 9, micrograffas de contraste de fase. Sin embargo, la adicion del complejo HC^HA causo una reduccion significativa de la viabilidad (con base en el ensayo de MTT) cuando se compara con Ctrl y HA de APM (Fig. 9A). Curiosamente, la preincubacion de la CD44 que bloquea al anticuerpo no afecto la reduccion de la viabilidad de HUVEC causada por el complejo HC^HA (Fig. 9A). La preincubacion de CD44 que bloquea el anticuerpo no afecto la reduccion de la viabilidad de HUVEC (por el MTT) (Fig. 9B).
Figura 10. Densidad y Concentracion de la protefna despues de la primera (A) y segunda (B) ronda de ultracentrifugacion. Se centrifugaron mezclas de extracto de CH/CsCl/guanidina 4 M (1,35 g/ml) para 3 donantes a 125.000 g durante 48 h a 15°C. Se recolectaron fracciones desde la parte superior hasta la parte inferior de cada tubo
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(15 fracciones, 0,8 ml/fraccion). Se midieron el peso y las protefnas en cada fraccion y se reunieron las fracciones 9-15, que contenfan cantidades mfnimas de protefna. La muestra combinada se ajusto con CsCl y guanidina-HCl (1,40 g/ml) y se centrifugo de nuevo como anteriormente. Se recolectaron las fracciones y se midieron las protefnas. Las fracciones 13-15, que contenfan cantidades mfnimas de protefna, se agruparon y se dializaron para destilar agua para eliminar el CsCl y la guanidina.
Figura 11. Concentracion de HA en el extracto y despues de la primera y segunda ronda de ultracentrifugacion. Se midieron la concentracion de HA del extracto antes de la centrifugacion y despues de la primera y segunda ronda de ultracentrifugacion para 3 donantes por ELISA para HA. Se almaceno el complejo HA purificado a -80°C y se utilizo para su posterior caracterizacion bioqufmica.
Figura 12. Resultados de ELISA con BrdU (A 450-670 nm) para HC*HA (AME) y HC*HA (CHE). El ELISA con BrdU muestra la diferencia adecuada entre el control etiquetado y control de fondo (1,9 vs. 0,65). HC*HA (AME) inhibe significativamente la proliferacion (p <0,05) a razon de 5, 12,5 y 25 pg/ml. HC*HA (CHE) inhibe significativamente la proliferacion (p <0,05) a razon de 0,25, 0,5 y 1 pg/ml. La dosis efectiva mas baja para HC*HA (AME) y HC*HA (CHE) esta entre 1-5 pg/ml y 0,05-0,25 pg/ml respectivamente. En Aim2b de P-184, la dosis efectiva mas baja para HC*HA (ASE) esta entre 0,2-1 pg/ml (en fibronectina + colageno sin VEGF). No se encontro diferencia estadfstica entre los grupos de VEGF (antiguos o nuevos) y el control aunque se obtuvo un valor ligeramente inferior de absorbancia para el viejo VEGF en comparacion con el control.
Figura 13. Grafico logarftmico de ELISA con BrdU para HC*HA (AME) y HC*HA (CHE). Los valores de absorbancia graficados contra la concentracion de HC*HA (AME) y HC*HA (CHE) de 0,5-25 pg/ml ajustan las ecuaciones de la curva logarftmica: y = - 0,35 ln (x) + 0,98, R2 = 1 y y = - 0,39 ln (x) -0,22, R2 = 0,99, respectivamente. Los derivados de las funciones para HC*HA (aME) y HC*HA (ChE) son 0,35/[HA] y 0,39/[HA] respectivamente.
Descripcion detallada de la invencion
Se divulgan en el presente documento complejos HC^HA; particularmente un complejo HC^HA reconstituido (es decir, fabricado; en lo sucesivo, " HC^HArc"). En algunas de tales realizaciones, el HC^HArc comprende uno o mas componentes recombinantes. Tambien, se describen aquf complejos HC^HA que han sido aislados y purificados a partir de material amniotico, incluyendo la membrana amniotica, lfquido amniotico o la membrana corionica (en lo sucesivo "HC^HAn"). Dicho material amniotico es preferiblemente material de amniotico de mamffero, y mas preferiblemente material amniotico humano. El material amniotico puede ser de membrana amniotica humana, por ejemplo de membrana corionica humana. Tambien se divulgan en el presente documento formulaciones de complejos HC^Ha que incluyen tanto HC^HArc como HC^HAn.
Se divulgan en el presente documento metodos de fabricacion de un complejo HC^HA. En algunas realizaciones, el agente que facilita la transferencia de, que cataliza la transferencia de, y/o transfiere una cadena pesada (en lo sucesivo HC) de IaI en HA puede ser seleccionado de TSG-6; TSG-6 recombinante; un material biologico obtenido de extractos solubles e insolubles en agua de membrana amniotica que contiene TSG-6 o un material de 50 kDa como se determina por una transferencia tipo Western utilizando anticuerpos anti-TSG-6 (en lo sucesivo, la "protefna tipo TSG-6"); una forma recombinante de la protefna tipo TSG-6; o sus combinaciones. En algunas realizaciones, la protefna TSG-6 o de tipo TSG-6 se obtiene a partir de cultivos de celulas epiteliales amnioticas humanas o celulas mesenquimales estromales amnioticas. En algunas realizaciones, se fabrica HC^HArc utilizando (a) HA; (b) IaI del suero, donde el IaI es opcionalmente purificado a partir del suero; (c) protefna TSG-6 o de tipo TSG-6, en donde la protefna TSG-6 o de tipo tSG-6 es opcionalmente recombinante. El complejo HC^HA fabricado es al menos 25% purificado a partir de otros componentes del proceso de fabricacion; al menos 50% purificado a partir de otros componentes del proceso de fabricacion; al menos 75% purificado de otros componentes del proceso de fabricacion; o al menos 90% purificado a partir de otros componentes del proceso de fabricacion.
De acuerdo con la invencion es un metodo que produce la reconstitucion de HC^HA, que comprende proporcionar una mezcla de reaccion que comprende (i) protefna que se enlaza a HA (HABP) fijada a un soporte estacionario, (ii) HA; (iii) HCl y HC2 de IaI; aislado a partir de suero y (c) protefna TSG-6 o de tipo TSG-6. La protefna TSG-6 o de tipo TSG-6 es opcionalmente recombinante. En algunos formas de realizacion, el metodo comprende ademas una pluralidad de celulas en donde las celulas son modificadas por ingenierfa genetica para expresar constitutivamente protefna TSG-6 o de tipo TSG-6. En algunas realizaciones, el metodo comprende ademas una pluralidad de celulas en donde las celulas son modificadas por ingenierfa genetica para expresar constitutivamente HCl, HC2, o ambos. En algunas realizaciones, la fuente de HA, HCl y HC2 de IaI, y de protefna TSG-6 o de tipo TSG-6 es cualquier combinacion de las fuentes divulgadas en la Tabla 1. Sin embargo, la lista no pretende ser exclusiva, unicamente sirve de ejemplo. La fuente del HA y de la protefna TSG-6 o de tipo TSG-6 es cualquier fuente adecuada. El complejo HC^HA fabricado es al menos 25% purificado a partir de otros componentes del proceso de reconstitucion; al menos 50% purificado a partir de otros componentes del proceso de reconstitucion; al menos el 75% purificado a partir de otros componentes del proceso de reconstitucion; o al menos 90% purificado a partir de otros componentes del proceso de reconstitucion.
Tabla 1
Componente
Fuente
HA
Polvo comercialmente disponible Celulas que expresan hAs1, HAS2, o HAS3
5
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25
30
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50
(continuacion)
Componente
Fuente
HC1
Suero no purificado Purificado a partir de suero
HC2
Suero no purificado Purificado a partir de suero
TSG-6
Extracto de material amniotico Celulas mesenquimales estromales amnioticas Celulas epiteliales amnioticas humanas Celulas recombinantes
Protefna de tipo TSG-6
Extracto de material amniotico Celulas mesenquimales estromales amnioticas Celulas epiteliales amnioticas humanas Celulas recombinantes
Adicionalmente, se describen aquf metodos de aislamiento de HC^HA a partir de material amniotico. En algunas realizaciones, el metodo comprende (a) el procesamiento del material amniotico de tal forma que sea adecuado para la extraccion de un complejo HC^HA; y (b) la extraccion del complejo HC^HA mediante un metodo seleccionado a partir de: cromatograffa, filtracion en gel, centrifugacion, o solubilidad diferencial, precipitacion con etanol, o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el procesamiento comprende la homogenizacion del material amniotico. En algunas realizaciones, el procesamiento se produce por debajo de la temperatura ambiente. El complejo HC^HA es al menos 25% purificado a partir de otros componentes del proceso de aislamiento; al menos 50% purificado a partir de otros componentes del proceso de aislamiento; al menos 75% purificado a partir de otros componentes del proceso de aislamiento; o al menos 90% purificado a partir de otros componentes del proceso de aislamiento. En algunas realizaciones, el material amniotico es de membrana amniotica. En algunas realizaciones, el material amniotico es de la membrana corionica.
Tambien se divulga aquf un metodo para reducir o prevenir la inflamacion, que comprende la administracion de un complejo HC^HA divulgado aquf a un individuo que requiera del mismo. En algunas realizaciones, el metodo comprende el uso de HC^HAn y/o HC^HArc. En algunas realizaciones, el metodo comprende el uso de HC^HAn. En algunas realizaciones, el metodo comprende el uso de HC^HA reconstituido (HC^HArc). En algunas realizaciones, al menos una cadena pesada de HC^HArc es recombinante (por ejemplo, HCl es de una fuente recombinante, HC2 es de una fuente recombinante, o ambos son de fuentes recombinantes).
Se divulga ademas en este documento, un metodo para reducir o prevenir la formacion de cicatrices que comprende la administracion de un complejo HC^HA divulgado en este documento a un individuo que requiera del mismo. En algunas realizaciones, el metodo comprende el uso de HC^HAn y/o HC^HArc. En algunas realizaciones, el metodo comprende el uso de HC^HAn. En algunas realizaciones, el metodo comprende el uso de HC^HA reconstituido (HC^HArc). En algunas realizaciones, al menos una cadena pesada de HC^HArc es recombinante (por ejemplo, HCl es de una fuente recombinante, HC2 es de una fuente recombinante, o ambos son de fuentes recombinantes).
Se divulga en el presente documento, en ciertas realizaciones, un metodo para reducir o prevenir la angiogenesis que comprende administrar un complejo HC^HA divulgado en este documento a un individuo que requiera del mismo. En algunas realizaciones, el metodo comprende el uso de HC^HAn y/o HC^HArc. En algunas realizaciones, el metodo comprende el uso de HC^HAn. En algunas realizaciones, el metodo comprende el uso de HC^HA reconstituido (HC^HArc). En algunas realizaciones, al menos una cadena pesada de HC^HArc es recombinante (por ejemplo, HCl es de una fuente recombinante, HC2 es de una fuente recombinante, o ambos son de fuentes recombinantes).
Adicionalmente, se divulga aquf, en ciertas realizaciones, un metodo para prevenir el rechazo de trasplantes que comprende poner en contacto una pluralidad de celulas (por ejemplo, las celulas madre, un organo o un injerto de tejido) con un complejo HC^HA. En algunas realizaciones, el metodo comprende el uso de HC^HAn y/o HC^HArc. En algunas realizaciones, el metodo comprende el uso de HC^HAn. En algunas realizaciones, el metodo comprende el uso de HC^HArc reconstituido (HC^HArc). En algunas realizaciones, al menos una cadena pesada de HC^HArc es recombinante (por ejemplo, HCl es de una fuente recombinante, HC2 es de una fuente recombinante, o ambos son de fuentes recombinantes).
Cierta terminologfa
A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en este documento tienen el mismo significado que entiende comunmente una persona ordinariamente capacitada en la tecnica a la que pertenece la materia reivindicada.
Se debe entender que la descripcion general anterior y la siguiente descripcion detallada son solo ejemplos y unicamente aclaratorios y no son restrictivos de cualquier materia reivindicada. En esta solicitud, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique especfficamente lo contrario. Debe tenerse en cuenta que, tal como se utiliza en la especificacion y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un, uno, una", y "el, la" incluyen los
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correspondientes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Tambien hay que senalar que el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Ademas, el uso del termino "incluyendo", asf como otras formas (por ejemplo, "incluyen", "incluye" e "incluido") no son limitantes.
El termino "aislado", como se usa aquf, se refiere a la separacion y la remocion de un componente de interes de los componentes que no son de interes. Las sustancias aisladas pueden estar, ya sea en estado seco o semiseco, o en solucion, incluyendo pero sin limitarse a una solucion acuosa. El componente aislado puede estar en un estado homogeneo o el componente aislado puede ser parte de una composicion farmaceutica que comprende portadores y/o excipientes adicionales farmaceuticamente aceptables. La pureza y la homogeneidad pueden determinarse utilizando tecnicas de qufmica analftica, incluyendo, pero sin limitarse a, electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatograffa lfquida de alto rendimiento. Ademas, cuando se afsla un componente de interes y es la especie predominante presente en una preparacion, el componente se describe en el presente documento como sustancialmente purificado. A modo de ejemplo solamente, las protefnas estan "aisladas" cuando tales protefnas estan libres de al menos algunos de los componentes celulares con los que estan asociadas en estado natural, o que la protefna se ha concentrado hasta un nivel mayor que la concentracion de su produccion in vivo o in vitro.
El termino "purificado", como se usa aquf, se refiere a un componente de interes que es al menos 85% puro, al menos 90% puro, al menos 95% puro, al menos 99% puro o mas.
El termino "sujeto" o "individuo" como se usa en el presente documento abarca mamfferos y no mamfferos. Ninguno de los terminos debe interpretarse como que se requiere la supervision de un profesional de la medicina (por ejemplo, un medico, enfermera, asistente, asistente social para pacientes terminales). En una realizacion de los metodos y composiciones proporcionados en este documento, el mamffero es un humano.
Los terminos "tratar", "que trata" o "tratamiento", y otros equivalentes gramaticales significan retardar o detener el desarrollo de un trastorno, provocar la regresion de un trastorno, mejorar un trastorno, los sfntomas de un trastorno, la prevencion del desarrollo o la presentacion de sfntomas adicionales, mejorar y/o prevenir la causa subyacente de un sfntoma, o combinaciones de los mismos. El termino incluye ademas la consecucion de un beneficio profilactico. Para el beneficio profilactico, se administra un complejo HC^HA o composicion de acuerdo con la invencion a un individuo en riesgo de desarrollar un trastorno particular, predispuesto a desarrollar un trastorno particular, o a un individuo que reporta uno o mas de los sfntomas fisiologicos de un trastorno.
Los terminos "cantidad efectiva", "cantidad terapeuticamente efectiva" o "cantidad farmaceuticamente efectiva" como se usan en el presente documento, se refieren a una cantidad de un complejo HC^HA que es suficiente para tratar un trastorno. En algunas realizaciones, el resultado es una reduccion en y/o el alivio de los signos, sfntomas o causas de un trastorno, o cualquier otra alteracion deseada de un sistema biologico. Por ejemplo, una "cantidad efectiva" para usos terapeuticos es la cantidad de la composicion que comprende un complejo HC^HA como se divulga aquf, requerida para proporcionar una disminucion clfnicamente significativa en un trastorno. Una cantidad "efectiva" apropiada en cualquier caso individual se determina utilizando cualquier tecnica adecuada, (por ejemplo, un estudio de escalamiento de la dosis).
El termino "farmaceuticamente aceptable" como se usa aquf, se refiere a un material, (por ejemplo, un portador o diluyente), que no anula la actividad biologica o las propiedades de uno de los complejos HC^HA descritos en este documento, y es relativamente no toxico (es decir, se administra el material a un individuo sin causar efectos biologicos indeseables o que interactue de una manera perjudicial con cualquiera de los componentes de la composicion en los que esta contenido).
El termino "acido nucleico" se refiere a desoxirribonucleotidos, desoxirribonucleosidos, ribonucleosidos, o ribonucleotidos y polfmeros de los mismos ya sea en forma monocatenaria o bicatenaria. A menos que se limite especfficamente, el termino abarca acidos nucleicos que contienen analogos conocidos de nucleotidos naturales que tienen propiedades de enlazamiento similares a las del acido nucleico de referencia y se metabolizan de una manera similar a nucleotidos de origen natural. A menos que se limite especfficamente de otra manera, el termino tambien se refiere a analogos de oligonucleotidos incluyendo PNA (acido peptidonucleico), analogos de ADN utilizados en la tecnologfa antisentido (fosforotioatos, fosforamidatos, y similares). A menos que se indique lo contrario, una secuencia particular de acido nucleico abarca implfcitamente tambien variantes modificadas de manera conservadora del mismo (incluyendo, pero sin limitarse a, sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias, asf como la secuencia indicada explfcitamente. Especfficamente, se logran las sustituciones de codones degenerados mediante la generacion de secuencias en las que se sustituye la tercera posicion de uno o mas codones seleccionados (o todos) con residuos de desoxiinosina y/o de una base mixta (Batzer y colaboradores, Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka y colaboradores, J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); y Cassol y colaboradores (1992); Rossolini y colaboradores, Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)).
El termino "aminoacido" se refiere a aminoacidos origen natural y de origen no natural, asf como analogos de aminoacidos y mimeticos de aminoacidos que funcionan de una manera similar a los aminoacidos de origen natural. Aminoacidos naturalmente codificados son los 20 aminoacidos comunes (alanina, arginina, asparagina, acido aspartico, cistefna, glutamina, acido glutamico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina,
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treonina, triptofano, tirosina y valina) y pirolisina y selenocistefna. Los analogos de aminoacidos se refieren a agentes que tienen la misma estructura qufmica basica que un aminoacido de origen natural, es dedr, un carbono a que esta enlazado a un hidrogeno, un grupo carboxilo, un grupo amino, y un grupo R, tal como, homoserina, norleucina, sulfoxido de metionina, metil sulfonio de metionina. Tales analogos tienen grupos R modificados (tales como, norleucina) o cadenas principales peptfdicas modificadas, pero conservan la misma estructura qufmica basica que un aminoacido de origen natural.
Los aminoacidos se denominan en el presente documento ya sea por sus sfmbolos comunmente conocidos de tres letras o por los sfmbolos de una letra recomendados por la Comision de Nomenclatura Bioqufmica IUPAC-IUB. Los nucleotidos, igualmente, se mencionan por sus codigos de una sola letra comunmente aceptados.
Los terminos "polipeptido", "peptido" y "protefna" se utilizan indistintamente en este documento para referirse a un polfmero de residuos de aminoacidos. Los terminos se aplican a polfmeros de aminoacidos de origen natural, asf como a polfmeros de aminoacidos en los que uno o mas residuos de aminoacidos son aminoacidos de origen no natural, por ejemplo, un analogo de aminoacido. Los terminos abarcan cadenas de aminoacidos de cualquier longitud, incluyendo protefnas de longitud completa, en donde los residuos de aminoacidos estan unidos por enlaces peptfdicos covalentes.
Para determinar el porcentaje de homologfa de dos secuencias de aminoacidos o de dos acidos nucleicos, las secuencias se pueden alinear para fines de una comparacion optima (por ejemplo, se introducen huecos en la secuencia de una primera secuencia de aminoacidos o de acido nucleico para una alineacion optima con una segunda secuencia de aminoacidos o de acido nucleico). Luego se pueden comparar los residuos de aminoacidos o de nucleotidos en las posiciones correspondientes de los aminoacidos o de los nucleotidos. Cuando una posicion en la primera secuencia esta ocupada por el mismo residuo de aminoacido o nucleotido que la posicion correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moleculas son identicas en esa posicion. El porcentaje de homologfa entre las dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = # de posiciones identicas / numero total de posiciones (por ejemplo, posiciones que se superponen) x 100). En algunas realizaciones las dos secuencias tienen la misma longitud.
Para determinar el porcentaje de homologfa entre dos secuencias, se usa el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87: 2264-2268, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90: 5873-5877. Tal algoritmo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul, y colaboradores (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. Las busquedas de nucleotidos mediante BLAST se realizan con el programa NBLAST, puntuacion = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleotidos homologas a moleculas de acido nucleico descritas o divulgadas en el presente documento. Las busquedas de protefnas mediante BLAST se realizan con el programa XBLAST, puntuacion = 50, longitud de palabra = 3. Para obtener alineamientos con huecos para fines de comparacion, se utiliza BLAST con huecos como se describe en Altschul y colaboradores ( 1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y BLAST con huecos, se usan los parametros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Vease el sitio web del Centro Nacional de Informacion Biotecnologica para obtener mas detalles (en la red mundial de informacion en ncbi.nlm.nih.gov). Las protefnas adecuadas para su uso en los metodos descritos en este documento tambien incluyen protefnas que tienen entre 1 a 15 cambios de aminoacidos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 , o 15 sustituciones, supresiones o adiciones de aminoacidos, en comparacion con la secuencia de aminoacidos de cualquier protefna descrita en este documento. En otras realizaciones, la secuencia alterada de aminoacidos es al menos 75% identica, por ejemplo, 77%, 80%, 82%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99%, o 100% identica a la secuencia de aminoacidos de cualquier inhibidor de protefna descrito en este documento. Tales protefnas con variantes de secuencia son apropiadas para los metodos descritos en el presente documento, siempre y cuando la secuencia alterada de aminoacidos retenga la suficiente actividad biologica para ser funcional en las composiciones y metodos descritos en el presente documento. Cuando se hacen sustituciones de aminoacidos, las sustituciones deben ser sustituciones conservadoras de aminoacidos. Entre los aminoacidos comunes, por ejemplo, se ilustra una "sustitucion conservadora de aminoacidos" por una sustitucion entre aminoacidos dentro de cada uno de los siguientes grupos: (1) glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina, (2) fenilalanina, tirosina, y triptofano, (3) serina y treonina, (4) aspartato y glutamato, (5) glutamina y asparagina, y (6) lisina, arginina e histidina. La tabla BLOSUM62 es una matriz de sustitucion de aminoacidos derivada de aproximadamente 2.000 alineaciones multiples locales de segmentos de secuencias de protefnas, que representan regiones altamente conservadas de mas de 500 grupos de protefnas relacionadas (Henikoff y colaboradores (1992), Proc. Natl Acad. Sci. EE.UU., 89: 10915-10919). Por lo tanto, las frecuencias de sustitucion de BLOSUM62 se utilizan para definir sustituciones conservadoras de aminoacidos que, en algunas formas de realizacion, se introducen en las secuencias de aminoacidos descritas o divulgadas en este documento. Aunque es posible disenar sustituciones de aminoacidos con base unicamente en propiedades qufmicas (como se discutio anteriormente), la expresion "sustitucion conservadora de aminoacidos" se refiere preferiblemente a una sustitucion representada por un valor de BLOSUM62 mayor que -1. Por ejemplo, una sustitucion de aminoacidos es conservadora si la sustitucion se caracteriza por un valor de BLOSUM62 de 0, 1, 2, o 3. De acuerdo con este sistema, las sustituciones conservadoras de aminoacidos preferidas se caracterizan por un valor de BLOSUM62 de al menos 1 (por ejemplo, 1, 2 o 3), mientras que las sustituciones conservadoras mas preferidas de aminoacidos se caracterizan por un valor de BLOSUM62 de al menos 2 (por ejemplo, 2 o 3).
Tal como se usa en este documento, "protefna de tipo TSG-6" significa un material biologico obtenido de membrana
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amniotica que presenta una banda de 50 kDa en una transferencia tipo Western de extractos de membrana amniotica solubles en agua e insolubles en agua utilizando anticuerpos anti-TSG-6. Vease la Fig. 2. En ciertos casos, protefna de tipo TSG-6 solo se encuentra en la membrana amniotica y producida por celulas epiteliales amnioticas o celulas mesenquimales estromales amnioticas.
Tal como se usa en el presente documento, "TSG-6 recombinante" significa una protefna TSG-6 que se produce por metodos recombinantes (es decir, se clona el gen para TSG-6 a partir de una primera fuente (por ejemplo, un gen para TSG-6 humano) en una molecula de ADN a partir de una segunda fuente (por ejemplo, un plasmido bacteriano)).
Tal como se usa en el presente documento, "protefna de tipo TSG-6 recombinante" significa una protefna de tipo TSG-6 que es producida por metodos recombinantes (es decir, se clona el gen del tipo para TSG- 6 de una primera fuente (por ejemplo, un gen del tipo para TSG-6 humano) en una molecula de ADN a partir de una segunda fuente (por ejemplo, un plasmido bacteriano)).
Tal como se usa en el presente documento, "HCl recombinante" significa una protefna de HCl que es producida por metodos recombinantes (es decir, se clona el gen para HCl a partir de una primera fuente (por ejemplo, un gen para HCl humano) en una molecula de ADN a partir de una segunda fuente (por ejemplo, un plasmido bacteriano)).
Como se usa en este documento, "HC2 recombinante" significa una protefna de HC2 que es producida por metodos recombinantes (es decir, se clona el gen para HC2 a partir de una primera fuente (por ejemplo, un gen para HC2 humano) en una molecula de ADN a partir de una segunda fuente (por ejemplo, un plasmido bacteriano)).
Tal como se utiliza aquf, el termino "biorreactor" se refiere a cualquier recipiente artificial en el que crecen las celulas de mamffero. En algunas realizaciones, un biorreactor es de 1 litro, 10 litros, 100 litros, 250 litros, 500 litros, 1000 litros, 2500 litros, 5000 litros, 8000 litros, 10000 litros, o 12000 litros. Un biorreactor esta compuesto de cualquier material que sea adecuado para contener cultivos de celulas de mamffero suspendidos en medios de cultivo (por ejemplo, vidrio, plastico o metal).
Tal como se usa en el presente documento, el "biorreactor de produccion" es el biorreactor en el que se reconstituye el complejo HC^HA divulgado en este documento.
HC^HA
Tal como se usa en el presente documento, "hialuronano" (o "HA") significa un glicosaminoglicano sustancialmente no sulfatado o no sulfatado con unidades lineales repetidas de disacarido de glucuronosil-N-acetilglucosamina. En algunas realizaciones, HA se obtiene a traves de un proveedor comercial (por ejemplo, Sigma Aldrich o Abbott Medical Optics, Irvine, CA). En algunas realizaciones, HA se obtiene a traves de un proveedor comercial como un polvo. En algunas realizaciones, HA se obtiene a traves de una celula que expresa hialuronano sintasas (por ejemplo, HAS1, HAS2 y HAS3). En ciertos casos, una HA sintasa prolonga un hialuronano mediante la adicion repetida de acido glucuronico y N-acetilglucosamina al polisacarido naciente a medida que es extrudido a traves de la membrana celular en el espacio extracelular.
En ciertos casos, HA de alto peso molecular (APM) promueve la quiescencia celular y la integridad estructural de dichos tejidos tales como el cartflago y el cuerpo vftreo (humor) en el ojo, y se asocia con la curacion de heridas fetales sin cicatrices. En ciertos casos, HA de APM inhibe la expresion genica de mediadores proinflamatorios y proangiogenicos.
En ciertos casos, HA de APM se degrada en fragmentos mas pequenos y oligosacaridos (por ejemplo, a traves de una hialuronasa o condiciones de oxidacion de radicales libres). En ciertos casos, HA de BPM estimula la proliferacion celular vascular endotelial, la migracion, la sfntesis de colageno, la formacion de brotes, y la angiogenesis en la piel de ratas, el infarto de miocardio, y el modelo de injerto de piel criolesionada mediante la promocion de la expresion genica de mediadores proinflamatorios y proangiogenicos.
En ciertos casos, HA forma un complejo covalente con las cadenas pesadas (HC) del inhibidor inter a (IaI) mediante el enlazamiento covalente a las cadenas pesadas (en lo sucesivo, " HC^HA"). (Vease la Fig. 1). En ciertos casos, IaI consta de dos cadenas pesadas (HCl y HC2), ambos de los cuales estan enlazados a traves de enlaces ester a una cadena de sulfato de condroitina que se une a la cadena ligera (es decir, Bikunina).
En ciertos casos, la protefna TSG-6 o de tipo TSG-6 facilita la transferencia de, cataliza la transferencia de, y/o transfiere las HCl y HC2 de IaI a HA. En ciertos casos, la expresion de TSG-6 es inducida por mediadores inflamatorios tales como TNF-a y la interleuquina 1. En ciertos casos, la expresion de protefna de tipo TSG-6 es independiente de mediadores inflamatorios tales como TNF-a.
Metodos de tratamiento
A. Cicatrices
Se describe aquf, en ciertas realizaciones, un metodo para prevenir, reducir o invertir la cicatrizacion en un sujeto que lo
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Tal como se usa en el presente documento, "cicatrizacion" se refiere a la formacion de una cicatriz. En un aspecto, la cicatriz es una cicatriz hipertrofica, o cicatriz queloide, o una cicatriz resultante de acne. Como se usa en este documento, un "cicatriz" es una zona de tejido fibroso que resulta de la sobreproduccion de colageno. En ciertos casos, la cicatrizacion de una herida comprende la migracion de fibroblastos al sitio de la lesion. En ciertos casos, los fibroblastos depositan colageno. En ciertos casos, los fibroblastos depositan exceso de colageno en el sitio de la herida, dando lugar a una cicatriz.
En ciertos casos, un complejo HC^HA divulgado aquf (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) impide o inhibe la senalizacion de TGF-p. En ciertos casos, el TGF-p regula la matriz extracelular mediante la estimulacion de fibroplasia y deposito de colageno y la inhibicion de la degradacion de la matriz extracelular (por sobrerregulacion de la sfntesis de inhibidores de proteasa). En ciertos casos, la prevencion o inhibicion de la expresion de TGF-p resulta en la prevencion de o una reduccion en la intensidad de una cicatriz. En algunas realizaciones, la administracion de un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) evita o reduce la cicatrizacion.
En algunas realizaciones, un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) inhibe o previene la capacidad de los fibroblastos para diferenciarse en miofibroblastos. En algunas realizaciones, un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) revierte los miofibroblastos diferenciados en fibroblastos.
En algunas realizaciones, un metodo divulgado en el presente documento se usa para prevenir, reducir o revertir la formacion de una cicatriz. En algunas realizaciones, un metodo divulgado en el presente documento comprende la administracion de un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) a un individuo con un trastorno que resulta en una cicatrizacion (por ejemplo, dermatitis). En algunas realizaciones, un metodo divulgado en este documento comprende la administracion de un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) a un individuo que requiera del mismo antes o despues de un trauma. En algunas realizaciones, un metodo divulgado en el presente documento comprende administrar un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) a un individuo que requiera del mismo antes o despues de una cirugfa.
En algunas realizaciones, se usa un metodo divulgado en el presente documento para prevenir o reducir la formacion de una cicatriz en un ojo o en el tejido circundante. En algunas realizaciones, un metodo divulgado en el presente documento comprende la administracion de un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) a un individuo con un trastorno que da lugar a cicatrices en el ojo o el tejido circundante (por ejemplo, retinopatfa del prematuro). En algunas realizaciones, un metodo divulgado en el presente documento comprende administrar un complejo HC^HA divulgad en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) a un individuo que requiera del mismo antes o despues de un traumatismo en un ojo o el tejido circundante. En algunas realizaciones, un metodo divulgado en el presente documento comprende la administracion de un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) a un individuo que requiera del mismo antes o despues de cirugfa en un ojo o el tejido circundante.
B. Inflamacion
Se describe en el presente documento, en ciertas realizaciones, un metodo para prevenir o reducir la inflamacion en un sujeto que requiera del mismo, que comprende administrar al sujeto una composicion que comprende un complejo HC^HA (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) divulgado en el presente documento. Como se usa aquf, "inflamacion" significa respuestas fisiologicas que resultan de la migracion de plasma y/o leucocitos (por ejemplo, linfocitos, macrofagos, granulocitos, y neutrofilos) al sitio de una infeccion o trauma (por ejemplo, traumatismo, traumatismo penetrante, o cirugfa).
En ciertos casos, los leucocitos secretan citoquinas tras el contacto con un antfgeno. Como se usa aquf, "citoquinas" son protefnas o glicoprotefnas de senalizacion. En ciertos casos, una citoquina se une a un receptor de la superficie de la celula. En ciertos casos, las citoquinas inducen la quimiotaxis de los leucocitos en el sitio de una infeccion. En ciertos casos, los receptores de la superficie de la celula en un leucocito detectan gradientes qufmicos de una citoquina. En ciertos casos, un leucocito sigue el gradiente hasta el sitio de la infeccion. En ciertos casos, el enlazamiento de una citoquina con un receptor de la superficie de la celula da como resultado la sobrerregulacion o la subregulacion de ciertos genes y sus factores de transcripcion. En ciertos casos, los cambios en la expresion genica dan como resultado la produccion de citoquinas, un aumento en la produccion de citoquinas, o un aumento en la presentacion de receptores de la superficie celular.
A modo de ejemplo no limitativo, las citoquinas incluyen las interleuquinas IL-I, IL-6, IL-8, MCP-1 (tambien conocida como CCL2), y TNF-a. La interleuquina 1 esta presente en el cuerpo en dos isoformas: IL-1 a e IL-1 p. En ciertos casos, la presencia de IL-1 aumenta la expresion de factores de adhesion en las celulas endoteliales. Esto, a su vez, permite la transmigracion de leucocitos al sitio de la infeccion. En ciertos casos, IL-8 induce la quimiotaxis de los leucocitos. En
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ciertos casos, TNF-a induce la quimiotaxis de los leucocitos. En ciertos casos, MCP-1 recluta leucocitos hacia los sitios de lesion e infeccion de los tejidos.
En algunas realizaciones, un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) suprime la produccion de y/o la actividad de las citoquinas. En ciertos casos, una disminucion en la concentracion de citoquinas reduce o previene la inflamacion mediante la disminucion del numero de leucocitos y/o la velocidad a la que los leucocitos migran al sitio de una lesion.
En algunas realizaciones, un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) induce la apoptosis de un leucocito (por ejemplo, un macrofago, neutrofilo o linfocito). En algunas realizaciones, un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) disminuye el numero de leucocitos activados o la velocidad a la que se activan los leucocitos. En ciertos casos, una disminucion en la concentracion de leucocitos reduce o previene la inflamacion disminuyendo el numero (por ejemplo, facilita la muerte de dichas celulas a traves de apoptosis) de las celulas que migran al sitio de una lesion.
En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio es un trastorno autoinmune, una alergia, un defecto de los leucocitos, la enfermedad de injerto contra huesped, rechazo de trasplante de tejido, o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio es una infeccion bacteriana, una infeccion protozoaria, una infeccion viral, una infeccion fungica, o combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio es un trastorno inflamatorio mediado por celulas T. En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio es un trastorno inflamatorio mediado por macrofagos. En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio es un trastorno inmune mediado por Th-17. En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio es encefalomielitis aguda diseminada; la enfermedad de Addison; espondilitis anquilosante; sfndrome de anticuerpos antifosfolfpidos; anemia hemolftica autoinmune; hepatitis autoinmune; enfermedad autoinmune del ofdo interno; penfigoide bulloso; la enfermedad de Chagas; enfermedad pulmonar obstructiva cronica; enfermedad celfaca; dermatomiositis; diabetes mellitus tipo 1; diabetes mellitus tipo 2; endometriosis; sfndrome de Goodpasture; enfermedad de Graves; sfndrome de Guillain-Barre; enfermedad de Hashimoto; purpura trombocitopenica idiopatica; cistitis intersticial; lupus eritematoso sistemico (LES); sfndrome metabolico, esclerosis multiple; miastenia grave; miocarditis, narcolepsia; obesidad; penfigo vulgar; anemia perniciosa; polimiositis; cirrosis biliar primaria; artritis reumatoide; esquizofrenia; esclerodermia; sfndrome de Sjogren; vasculitis; vitiligo; granulomatosis de Wegener; rinitis alergica; cancer de prostata; carcinoma pulmonar de celulas no pequenas; cancer de ovario; cancer de mama; melanoma; cancer gastrico; cancer colorrectal; cancer de cerebro; trastorno oseo metastasico; cancer pancreatico; un linfoma; polipos nasales; cancer gastrointestinal; colitis ulcerativa; trastorno de Crohn; colitis colagenosa; colitis linfocftica; colitis isquemica; colitis por desviacion; sfndrome de Behcet; colitis infecciosa; colitis indeterminada; trastorno inflamatorio del hfgado, choque por endotoxinas, choque septico; espondilitis reumatoide, espondilitis anquilosante, artritis gotosa, polimialgia reumatica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, epilepsia, demencia por SIDA, asma, sfndrome de dificultad respiratoria del adulto, bronquitis, fibrosis qufstica, lesion pulmonar aguda mediada por leucocitos, proctitis distal, granulomatosis de Wegener, fibromialgia, bronquitis, fibrosis qufstica, uveitis, conjuntivitis, psoriasis, eczema, dermatitis, trastornos de proliferacion del musculo liso, meningitis, herpes, encefalitis, nefritis, tuberculosis, retinitis, dermatitis atopica, pancreatitis, gingivitis periodontal, necrosis coagulativa, necrosis licuefactiva, necrosis fibrinoide, hiperplasia neointimal, o combinaciones de las mismas.
En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio es un trastorno inflamatorio de un ojo o el tejido circundante. En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio es conjuntivitis. En ciertos casos, la conjuntivitis resulta de la exposicion a un alergeno. En ciertos casos, la conjuntivitis resulta de una infeccion bacteriana. En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio es queratitis. Como se usa en este documento, "queratitis" es un trastorno caracterizado por la inflamacion de la cornea. En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio es queratoconjuntivitis (es decir, una combinacion de conjuntivitis y queratitis (es decir, inflamacion de la cornea)). En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio es blefaritis. Como se usa aquf, "blefaritis" es un trastorno oftalmologico caracterizado por la inflamacion de los bordes de los parpados. En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio es blefaroconjuntivitis (es decir, una combinacion de conjuntivitis y blefaritis (es decir, la inflamacion de un parpado)). En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio es escleritis. Como se usa en este documento, "escleritis" es un trastorno caracterizado por la inflamacion de la esclerotica. En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio es epiescleritis. Como se usa aquf, "epiescleritis" es un trastorno inflamatorio de la epiesclerotica caracterizado por hiperemia y quemosis. En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio es uveitis. Como se utiliza aquf, "uveitis" es un trastorno inflamatorio de la uvea. En algunas realizaciones, el trastorno es retinitis. Como se usa en este documento, "retinitis" es un trastorno inflamatorio de la retina. En algunas realizaciones, el trastorno es coroiditis. Como se usa en este documento, "coroiditis" es un trastorno inflamatorio de la uvea, el cuerpo ciliar y la coroides.
C. Angiogenesis
Se divulga en el presente documento, en ciertas realizaciones, un metodo para prevencion o reduccion de la angiogenesis en un sujeto que lo requiera, que comprende administrar al sujeto una composicion que comprende un complejo HC^HA (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc ) divulgado en este documento. Como se usa aquf, "angiogenesis" significa la formacion de nuevos vasos sangufneos. En ciertos casos, la angiogenesis facilita el crecimiento y la metastasis de un tumor. Ademas, en ciertos casos, la angiogenesis anormal es la base de la degeneracion macular humeda relacionada con la edad (DMHRE) y la retinopatfa diabetica proliferativa. En ciertos casos, un complejo HC^HA
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En ciertos casos, el enlazamiento de un ligando al receptor 2 de VEGF (VEGFR-2) inicia una cascada de senalizacion tirosina quinasa que estimula la produccion de factores que estimulan de diversas formas la permeabilidad de los vasos (eNOS, que produce NO), la proliferacion/supervivencia (bFGF), migracion (los ICAM/VCAM/MMP) y finalmente la diferenciacion en los vasos sangufneos maduros. En ciertos casos, despues de la union de VEGFR-2 a su ligando, las celulas endoteliales forman estructuras tubulares que se asemejan a los capilares.
Como se utiliza en la presente invencion, "degeneracion macular humeda relacionada con la edad", "DMHRE", o "DMRE humeda" significa un trastorno de los ojos que se caracteriza por la proliferacion de vasos sangufneos de la coroides. En ciertos casos, la DMRE humeda causa la perdida de la vision debido a filtracion de sangre y protefna por debajo de la macula. En ciertos casos, el sangrado, la filtracion, y la cicatrizacion de estos vasos sangufneos causa danos irreversibles a los fotorreceptores y la perdida rapida de vision si no se trata.
Tal como se usa en el presente documento, "retinopatfa diabetica proliferativa" significa un trastorno de los ojos que se caracteriza por la incompetencia de las paredes vasculares. En ciertos casos, la falta de oxfgeno en la retina resulta en angiogenesis a lo largo de la retina y en el humor vftreo. En ciertos casos, los nuevos vasos sangufneos sangran, nublan la vision, y destruyen la retina.
En ciertos casos, la proliferacion de capilares le suministra nutrientes al tumor, permitiendo que el tumor se expanda. En ciertos casos, la proliferacion de capilares permite la rapida eliminacion de los desechos celulares permitiendo el crecimiento del tumor. En ciertos casos, la angiogenesis facilita la metastasis. En ciertos casos, la proliferacion de capilares aumenta las posibilidades de que una celula cancerosa sea capaz de entrar en un vaso sangufneo y por lo tanto establecer un nuevo tumor en un nuevo lugar.
Los ejemplos de tipos de cancer que pueden ser tratados utilizando un complejo HC^HA descrito en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) incluyen pero no se limitan a leucemia linfoblastica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma de la corteza suprarrenal, canceres relacionados con SIDA, linfoma relacionado con SIDA, cancer anal, astrocitoma, carcinoma de celulas basales, cancer del conducto biliar, cancer de vejiga, cancer de hueso, glioma del tronco encefalico, tumor cerebral, cancer de mama, adenomas bronquiales, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide, carcinoma, linfoma del sistema nervioso central, astrocitoma cerebeloso, cancer de cuello uterino, leucemia linfocftica cronica, leucemia mielogena cronica, trastornos mieloproliferativos cronicos, cancer de colon, cancer colorrectal, linfoma cutaneo de celulas T, cancer endometrial, ependimoma, cancer de esofago, tumor de celulas germinales extragonadales, cancer ocular, melanoma intraocular, retinoblastoma, cancer de la vesfcula biliar, tumor carcinoide gastrointestinal, tumor estromal gastrointestinal (TEGI), tumor de celulas germinales (extracraneal), tumor de celulas germinales (extragonadales), tumor de celulas germinales (ovario), tumor trofoblastico gestacional, glioma, leucemia de celulas pilosas, cancer de cabeza y cuello, cancer hepatocelular (hfgado), linfoma de Hodgkin, cancer hipofarfngeo, glioma de las vfas hipotalamica y visual, melanoma intraocular, carcinoma de celulas de los islotes (pancreas endocrino), sarcoma de Kaposi, cancer de rinon (celulas renales), cancer de laringe, Leucemia (linfoblastica aguda), leucemia (mieloide aguda), leucemia (linfocftica cronica), leucemia (mielogena cronica), cancer de la cavidad oral y el labio, cancer hepatico, cancer de pulmon (celulas no pequenas), cancer de pulmon (celulas pequenas), linfoma, (celulas T cutaneas), linfoma (no Hodgkin), histiocitoma fibroso maligno oseo/osteosarcoma, meduloblastoma, melanoma, carcinoma de celulas de Merkel, mesotelioma, cancer de cuello escamoso metastasico con tumor primario oculto, sfndrome de neoplasia endocrina multiple, mieloma multiple/neoplasia de celulas de plasma, micosis fungoide, sfndromes mielodisplasicos, enfermedades mielodisplasicas/mieloproliferativas, leucemia mielogena, leucemia mieloide, trastornos mieloproliferativos, cancer de la cavidad nasal y del seno paranasal, cancer nasofarfngeo, neuroblastoma, cancer oral, cancer orofaringeo, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno oseo, cancer de ovario, cancer epitelial de ovario, tumor de celulas germinales de ovario, tumor de bajo potencial maligno de ovario, cancer pancreatico, cancer paratiroideo, cancer de pene, feocromocitoma, pineoblastoma y tumores neuroectodermicos primitivos supratentoriales, tumor de la pituitaria, neoplasma de celulas plasmaticas/mieloma multiple, blastoma pleuropulmonar, cancer de prostata, cancer rectal, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cancer de glandula salival, sarcoma (de Kaposi), sarcoma (uterino), sfndrome de Sezary, cancer de piel (no melanoma), cancer de piel (melanoma), carcinoma de piel (celulas de Merkel), cancer del intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, carcinoma de celulas escamosas, cancer de estomago (gastrico), linfoma de celulas T, cancer testicular, timoma, cancer de tiroides, tumor trofoblastico, cancer gestacional, uretral, cancer uterino, endometrial, sarcoma uterino, cancer vaginal, glioma de las vfas opticas y del hipotalamo, cancer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom, tumor de Wilms, y similares.
Metodos de Produccion
Se describen aquf metodos que implican tecnicas biologicas. Tales tecnicas se describen en tratados tales como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ra ed., vol. 1-3, ed. Sambrook y colaboradores, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 2001; y Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel y colaboradores, Greene Publishing y Wiley-Interscience, Nueva York, 2003 (con actualizaciones periodicas). Se describen diversas tecnicas convencionales para el cultivo de celulas animales en Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4a ed., R. Ian Freshney, Wiley-Liss, Hoboken, Nueva Jersey, 2000, y Animal Cell Culture Techniques (Springer Lab Manual), M. Clynos, Springer-Verlag, Nueva York, NY, 1998. Los metodos que implican analisis y
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purificacion de protefnas tambien se conocen en la tecnica y se describen en Protein Analysis and Purification: Benchtop Techniques, 2da ed., Ian M. Rosenberg, Birkhauser, Nueva York, NY, 2004.
Se divulga en el presente documento, en ciertas realizaciones, un metodo de aislamiento de HC^HA a partir de material amniotico (por ejemplo, la membrana amniotica o la membrana corionica) (HC^HAn). Preferiblemente, el material amniotico es material amniotico humano. En algunas realizaciones, el material amniotico es de membrana amniotica humana. En algunas realizaciones, el material amniotico de la membrana corionica.
De acuerdo con la invencion, un metodo de reconstituir un complejo HC^HA (HC^HArc que comprende proporcionar una mezcla de reaccion que comprende (i) protefna de enlazamiento a HA (PEHA) fijada a un soporte estacionario; (ii) hialuronano (HA); (iii) cadenas pesadas de lal (por ejemplo, HCl y HC2) aisladas de suero; y (iv) protefna TSG-6, opcionalmente TSG-6 recombinante, tipo TSG-6, protefna tipo TSG-6 recombinante, o combinaciones de los mismos.
Preferiblemente se generan uno o mas componentes por una pluralidad de celulas vivas.
A. Aislamiento y purificacion de HC^HAn
Se describe tambien en el presente documento, un metodo de aislamiento de HC^HA a partir de material amniotico (por ejemplo, la membrana amniotica o la membrana corionica) (HC^HAn). Preferiblemente, el material amniotico es material amniotico humano. En algunas realizaciones, el material amniotico es de membrana amniotica humana. En algunas realizaciones, el material amniotico es de la membrana corionica humana.
En algunas realizaciones, HC^HAn es aislado de la membrana corionica. En algunas realizaciones, el complejo HC^HAn purificado a partir de la membrana corionica contiene una mayor relacion de protefna:HA que HC^HAn aislado de MA (vease la Tabla 3 en el Ejemplo 12). En algunas realizaciones, HC^HAn aislado de la membrana corionica ejerce actividad antiinflamatoria y antiangiogenica mas fuerte que HC^HAn aislado de membrana amniotica. En algunas realizaciones, HC^HAn aislado de la membrana corionica es 10 veces mas efectivo que una actividad antiinflamatoria y antiangiogenica de HC^HAn aislado de membrana amniotica. En algunas realizaciones, HC^HAn aislado de la membrana corionica es 15 veces mas efectivo que una actividad antiinflamatoria y antiangiogenica de HC^HAn aislado de membrana amniotica. En algunas realizaciones, HC^HAn aislado de la membrana corionica es 20 veces mas efectivo que una actividad antiinflamatoria y antiangiogenica de HC^HAn aislado de membrana amniotica. En algunas realizaciones, HC^HAn aislado de la membrana corionica es 25 veces mas efectivo que una actividad antiinflamatoria y antiangiogenica de HC^HAn aislado de membrana amniotica. Para los datos experimentales que muestran una mayor eficacia veanse las Figuras 12 y 13 y el Ejemplo 13.
En algunas realizaciones, se procesa el material amniotico (por ejemplo, la membrana amniotica en polvo o la membrana corionica en polvo) de tal manera que sea adecuado para la extraccion del complejo HC^HAn. En algunas realizaciones, se purifica HC^HAn a partir del material amniotico procesado por cualquier metodo adecuado. En algunas realizaciones, el complejo HC^HAn se purifica por cromatograffa (por ejemplo, cromatograffa de intercambio ionico, afinidad, exclusion por tamano, y de hidroxiapatita), filtracion por gel, centrifugacion (por ejemplo, centrifugacion en gradiente), o solubilidad diferencial, precipitacion con etanol o por cualquier otra tecnica disponible para la purificacion de protefnas (vease, por ejemplo, Scopes, Protein Purification Principles and Practice, segunda edicion, Springer- Verlag, Nueva York, 1987; Higgins, S.J. y Hames, B.D. (eds.), Protein Expression: A Practical Approach, Oxford Univ Press, 1999; y Deutscher, M.P., Simon, M.I., Abelson, J.N. (eds.), Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology (Methods in Enzymology Series, vol 182), Academic Press, 1997.
En algunas realizaciones, el complejo HC^HAn se purifica mediante cualquier metodo adecuado o combinacion de metodos. Las realizaciones descritas a continuacion no pretenden ser exclusivos, solamente a modo de ejemplo.
En algunas realizaciones, el complejo HC^HAn se purifica por cromatograffa de inmunoafinidad. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-HCl, los anticuerpos anti-HC2, o ambos se generan y se fija a un soporte estacionario. En algunas formas de realizacion, el complejo HC^HAn sin purificar (es decir, la fase movil) se pasa sobre el soporte. En ciertos casos, el complejo HC^HAn se enlaza a los anticuerpos (por ejemplo, a traves de la interaccion de (a) un anticuerpo HCl y HCl, (b) un anticuerpo HC2 y HC2, o (c) ambos). En algunas realizaciones se lava el soporte (por ejemplo, con PBS) para eliminar cualquiera de las moleculas no enlazadas o enlazadas debilmente. En algunas realizaciones, se lava luego el soporte con una solucion que permite la elucion del complejo HC^HAn del soporte (por ejemplo, SDS al 1%, guanidina-HCl 6 M, o urea 8 M).
En algunas realizaciones, el complejo HC^HAn se purifica por cromatograffa de afinidad. En algunas realizaciones, se genera HABP y se fija a un soporte estacionario. En algunas formas de realizacion, el complejo HC^HAn sin purificar (es decir, la fase movil) se pasa sobre el soporte. En ciertos casos, el complejo HC^HAn se enlaza a HABP. En algunas realizaciones se lava el soporte (por ejemplo, con PBS) para eliminar cualquiera de las moleculas no enlazadas o debilmente enlazadas. En algunas realizaciones, se lava luego el soporte con una solucion que permite la elucion del complejo HC^HAn del soporte.
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HABP, y cromatograffa de inmunoafinidad usando anticuerpos anti-HCl, anticuerpos anti-HC2, o ambos.
A modo de ejemplo no limitante: se mezcla polvo de membrana amniotica (MA) con el regulador PBS frfo sin inhibidores de proteasa en proporcion 1:1 (g/ml). La mezcla se centrifuga a 48.000 x g a 4°C durante 30 min. El sobrenadante (extracto P) se disuelve en una mezcla de CsCl/guanidina HCl 4 M a la densidad inicial de 1,35 g/ml, y se centrifuga a
125.000 x g durante 48 h a 15°C. Se extrae el sobrenadante y se dializa contra agua destilada para eliminar el CsCl y la guanidina HCl. Se mezcla el dializado con 3 volumenes de etanol al 95% (v/v) que contiene acetato de potasio al 1,3% (p/v) a 0°C durante 1 h. Despues de centrifugacion a 15.000 x g, se lava el sedimento con etanol al 70% (v/v) y se centrifuga. El sedimento se seco brevemente al aire, y se almacena a -80°C.
A modo de ejemplo no limitante: se mezcla polvo de membrana amniotica (MA) con el regulador PBS frfo sin inhibidores de proteasa en proporcion 1:1 (g/ml). La mezcla se centrifuga a 48.000 x g a 4°C durante 30 min. El sobrenadante (extracto P) se disuelve en una mezcla de CsCl/guanidina HCl 4 M a la densidad inicial de 1,35 g/ml, y se centrifuga a
125.000 x g durante 48 h a 15°C. Se recolectan un total de 15 fracciones (0,8 ml/fraccion) desde la parte superior a la parte inferior de cada tubo. Ademas de la densidad, se mide la concentracion de protefnas y HA en cada fraccion mediante el ensayo de protefnas BCA y el kit de ensayo cuantitativo de HA, respectivamente. Se reunen las fracciones # 8-15, que contienen hA pero no protefnas detectables, se ajusta con CsCl/ guanidina HCl 4 M a la densidad inicial de 1,40 g/ml, se centrifuga, y se fracciona en la misma forma que la descrita anteriormente. Las fracciones # 3-15 que contenfan HA pero no protefnas detectables, se reunen y se dializan frente a agua destilada para eliminar CsCl y guanidina HCl. Se mezcla el dializado con 3 volumenes de etanol al 95% (v/v) que contiene acetato de potasio al 1,3% (p/v) en 0°C durante 1 h. Despues de centrifugacion a 15.000 x g, se lava el sedimento con etanol al 70% (v/v) y se centrifuga. El sedimento se seca brevemente al aire y se almacena a -80°C.
A modo de ejemplo no limitante: se mezcla polvo de membrana corionica (MC) con el regulador PBS frfo sin inhibidores de proteasa en proporcion 1:1 (g/ml). La mezcla se centrifuga a 48.000 x g a 4°C durante 30 min. El sobrenadante (extracto P) se disuelve en una mezcla de CsCl/guanidina HCl 4 M a la densidad inicial de 1,35 g/ml, y se centrifuga a
125.000 x g durante 48 h a 15°C. Se extrae el sobrenadante y se dializa contra agua destilada para eliminar el CsCl y la guanidina HCl. Se mezcla el dializado con 3 volumenes de etanol al 95% (v/v) que contiene acetato de potasio al 1,3% (p/v) a 0°C durante 1 h. Despues de centrifugacion a 15.000 x g, se lava el sedimento con etanol al 70% (v/v) y se centrifuga. El sedimento se seco brevemente al aire, y se almacena a -80°C.
B. Produccion del biorreactor de un complejo HC^HArc sin el uso de celulas vivas
Los metodos para producir complejo HC-HA reconstituido (HC^HArc) se exponen en la reivindicacion 1.
Las cadenas pesadas de IaI se afslan a partir de suero. En algunas realizaciones, las cadenas pesadas de IaI no se afslan a partir de suero.
En algunas realizaciones, se afsla protefna TSG6 o de tipo TSG-6 a partir de una celula o de una pluralidad de celulas (por ejemplo, un extracto de tejido). En algunas realizaciones, no se afsla protefna TSG6 o de tipo TSG-6 a partir de una celula o de una pluralidad de celulas (por ejemplo, un extracto de tejido). En algunas realizaciones, se prepara protefna TSG6 o de tipo TSG-6 mediante tecnologfa recombinante.
En algunas realizaciones, se pone en contacto HA (por ejemplo, HA de APM) con HCl y HC2 de IaI (por ejemplo, a partir de suero no purificado o purificado a partir de suero; y TSG-6. En algunas realizaciones, se pone en contacto HA (por ejemplo, HA de APM) con HCl y HC2 de IaI (por ejemplo, a partir de suero no purificado o purificado a partir de suero); y TSG-6 recombinante (por ejemplo, TSG-6Q). En algunas realizaciones, se pone en contacto HA (por ejemplo, HA de APM) con HCl y HC2 de IaI (por ejemplo, a partir de suero no purificado o purificado a partir de suero); y protefna de tipo TSG-6. En algunas realizaciones, se pone en contacto HA (por ejemplo, HA de APM) con (a) cadenas pesadas de IaI (por ejemplo, HCl y HC2; a partir de suero no purificado o purificado a partir de suero); y (b) protefna TSG-6, TSG-6 recombinante, de tipo TSG-6, de tipo TSG-6 recombinante o combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, el contacto se produce durante al menos 6 horas, al menos 12 horas, al menos 24 horas, al menos 36 horas, al menos 48 horas, al menos 60 horas, o al menos 72 horas.
El metodo comprende protefna de enlace a HA (HABP) fijada a un soporte estacionario (por ejemplo, mediante entrecruzamiento). En algunas formas de realizacion, se pone en contacto el soporte estacionario que comprende HABP con HA (por ejemplo, HA de APM), una cadena pesada de IaI y una protema catalftica HC^HArc seleccionada de TSG- 6, TSG-6 recombinante, de tipo TSG-6, de tipo TSG-6 recombinante, o combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, el contacto se produce durante al menos 6 horas, al menos 12 horas, al menos 24 horas, al menos 36 horas, al menos 48 horas, al menos 60 horas, o al menos 72 horas. En algunas realizaciones, se lava el soporte estacionario para eliminar cualquier componente no enlazado.
En algunas realizaciones, el complejo HC^HArc se purifica mediante cualquier metodo adecuado o combinacion de metodos. Las realizaciones descritas a continuacion no pretenden ser exclusivas, solamente a modo de ejemplo.
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ionico, afinidad, exclusion por tamano, y de hidroxiapatita), filtracion en gel, centrifugacion (por ejemplo, centrifugacion en gradiente), o solubilidad diferencial, precipitacion con etanol o mediante cualquier otra tecnica disponible para la purificacion de protefnas (vease, por ejemplo, Scopes, Protein Purification Principles and Practice, segunda edicion, Springer-Verlag, Nueva York, 1987; Higgins, S.J. y Hames, B.D. (eds.), Protein Expression: A Practical Approach, Oxford Univ Press, 1999; y Deutscher, M.P., Simon, M.I., Abelson, J.N. (eds.), Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology (Methods in Enzymology Series, vol 182), Academic Press, 1997.
En algunas realizaciones, el complejo HC^HArc se purifica por cromatograffa de inmunoafinidad. En algunas realizaciones, se generan anticuerpos anti-HCl, anticuerpos anti-HC2, o ambos y se fijan a un soporte estacionario. En algunos formas de realizacion, el complejo HC^HArc sin purificar (es decir, la fase movil) se pasa sobre el soporte. En ciertos casos, el complejo HC^HArc se enlaza a los anticuerpos (por ejemplo, a traves de la interaccion de (a) un anticuerpo HCl y HCl, (b) un anticuerpo HC2 y HC2, o (c) ambos). En algunas realizaciones se lava el soporte (por ejemplo, con PBS) para eliminar cualquier molecula no enlazada o debilmente enlazada. En algunas realizaciones, se lava luego el soporte con una solucion que permite la elucion del complejo HC^HArc del soporte (por ejemplo, SDS al 1%, guanidina-HCl 6 M, o urea 8 M).
En algunas realizaciones, el complejo HC^HArc se purifica mediante cromatograffa de afinidad. En algunas realizaciones, se genera HABP y se fija a un soporte estacionario. En algunas realizaciones, el complejo HC^HArc sin purificar (es decir, la fase movil) se pasa sobre el soporte. En ciertos casos, el complejo HC^HArc se enlaza a HABP. En algunas realizaciones se lava el soporte (por ejemplo, con PBS) para eliminar cualquier molecula no enlazada o debilmente enlazada. En algunas formas de realizacion, se lava luego el soporte con una solucion que permite la elucion del complejo HC^HArc del soporte.
En algunas realizaciones, el complejo HC^HArc se purifica mediante una combinacion de cromatograffa de afinidad de HABP, y cromatograffa de inmunoafinidad usando anticuerpos anti-HCl, anticuerpos anti-HC2, o ambos.
C. Produccion del biorreactor de un complejo de HC^HArc mediante el uso de celulas vivas
Se divulga en el presente documento, en ciertas realizaciones, un metodo de reconstituir un complejo HC^HArc como se expone en la reivindicacion 1 mediante el uso de celulas vivas. Se generan o expresan uno o mas componentes mediante una pluralidad de celulas en un biorreactor.
En algunas realizaciones, el metodo comprende HA que se obtiene a traves de un proveedor comercial. En algunas realizaciones, el metodo comprende HA que se genera por una pluralidad de celulas en un biorreactor. En algunas realizaciones, la pluralidad de celulas genera constitutivamente hA. En algunas realizaciones, la pluralidad de celulas expresa constitutivamente HAS1, HAS2, HAS3, o una combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, la pluralidad de celulas se pone en contacto con al menos un factor que se sabe que sobrerregula HAS1, HAS2, HAS3, o una combinacion de los mismos.
De acuerdo con la invencion, el metodo comprende una cadena pesada de IaI aislada de suero.
En algunas realizaciones, el metodo comprende protefna TSG-6 o de tipo TSG-6 que se afsla a partir de una celula o una pluralidad de celulas (por ejemplo, un extracto de tejido). En algunas realizaciones, el metodo comprende protefna TSG-6 o de tipo TSG-6 que no se afsla de una celula o una pluralidad de celulas (por ejemplo, un extracto de tejido). En algunas realizaciones, el metodo comprende protefna TSG-6 o de tipo TSG-6 que se expresa mediante una pluralidad de celulas en un biorreactor. En algunas realizaciones, la pluralidad de las celulas genera constitutivamente protefna TSG-6 o de tipo TSG-6. En algunas realizaciones, la pluralidad de celulas constitutivamente expresa protefna TSG-6 o de tipo TSG-6. En algunas realizaciones, se pone en contacto la pluralidad de celulas con al menos un factor que se sabe que sobrerregula protefna TSG-6 o de tipo TSG-6.
Expresion constitutiva
En algunas realizaciones, una celula que expresa constitutivamente protefna TSG-6 o de tipo TSG-6 se genera mediante cualquier metodo adecuado. En algunas formas de realizacion, una celula que expresa constitutivamente protefna TSG-6 o de tipo TSG-6 se genera mediante la introduccion de mutaciones puntuales en el gen que codifica protefna TSG-6 o de tipo TSG-6. En algunas realizaciones, las mutaciones son mutaciones por sustitucion, mutaciones por supresion o mutaciones por insercion.
En algunas realizaciones, se produce una celula que genera constitutivamente HA por cualquier metodo adecuado. En algunos formas de realizacion, una celula que genera constitutivamente HA se produce mediante la introduccion de mutaciones puntuales en un gen que codifica HAS1, HAS2, HAS3, o una combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, las mutaciones son mutaciones por sustitucion, mutaciones por supresion, o mutaciones por insercion. En algunas realizaciones, se produce una celula que genera constitutivamente HA por contacto de la celula con al menos un factor que se sabe que sobrerregula HAS1, HAS2, HAS3, o una combinacion de los mismos.
Generacion de lfneas celulares
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En algunas realizaciones, la pluralidad de celulas comprende celulas de mamffero. En algunas realizaciones, la pluralidad de celulas comprende celulas CHO derivadas de ovario de hamster chino; celulas HeLa humanas; celulas HEK293; celulas epiteliales amnioticas; celulas mesenquimales estromales amnioticas; o combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, una secuencia genica de interes se clona en un vector de expresion adecuado que despues se inserta en una celula huesped. En algunas realizaciones, el vector es pMSG, o pcDNA3.1(+). En algunas realizaciones, la celula huesped se transforma con el vector mediante el uso del metodo de fosfato de calcio, el metodo con DEAE-dextrano, lipofeccion, o electroporacion. En algunas realizaciones, se clona una secuencia genica de interes en un vector de expresion adecuado que despues se inserta en el genoma de las celulas. En algunas realizaciones, el vector es un retrovirus, lentivirus, un adenovirus, o una combinacion de los mismos.
En algunas realizaciones, la pluralidad de celulas comprende celulas bacterianas (por ejemplo, E. coli). En algunas realizaciones, una secuencia genica de interes se clona en un vector de expresion adecuado que despues se inserta en una celula huesped. En algunas realizaciones, el huesped es una celula bacteriana. En algunas realizaciones, el vector es pET-3 o pGEX-1. En algunas realizaciones, la celula huesped se transforma con el vector por electroporacion o el metodo de Hanahan. En algunas realizaciones, una secuencia genica de interes se clona en un vector de expresion adecuado que despues se inserta en el genoma de las celulas. En algunas realizaciones, el vector es un retrovirus, lentivirus, un adenovirus, o una combinacion de los mismos.
En algunas realizaciones, la pluralidad de celulas comprende celulas de levadura. En algunas realizaciones, una secuencia genica de interes se clona en vectores de expresion adecuados que a continuacion se insertan en una celula huesped. En algunas realizaciones, la celula huesped se transforma con el vector mediante metodos de fusion de esferoplastos o acetato de litio. En algunas realizaciones, una secuencia genica de interes se clona en un vector de expresion adecuado que despues se inserta en el genoma de las celulas. En algunas realizaciones, el vector es un retrovirus, lentivirus, un adenovirus, o una combinacion de los mismos.
En algunas realizaciones, el metodo comprende ademas la confirmacion de la expresion de la secuencia genica de interes. En algunas realizaciones, se utiliza cualquier metodo adecuado. En algunos metodos se usa inmunohistoqufmica, inmunoprecipitacion, citometrfa de flujo, microscopfa de inmunofluorescencia, SDS-PAGE, transferencias tipo Western, un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), tecnicas de cromatograffa lfquida de alto rendimiento (HPLC), ensayos de actividad biologica o cromatograffa de afinidad.
Cultivos iniciadores
En algunas realizaciones, se cultiva una pluralidad de celulas descritas anteriormente mediante cualquier metodo adecuado.
En algunas realizaciones, se expanden primero las celulas en un cultivo iniciador (por ejemplo, 110 mL de cultivo, durante la noche). En algunas realizaciones, se cultivan las celulas en F10 de Ham (Sigma), medio basal (BEM), medio esencial mfnimo (MEM), RPMI-1640, medio hormonal que sirve de complemento (SHEM), o medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM). En algunas realizaciones, un cultivo de celulas comprende ademas suero (por ejemplo, suero de ternera fetal, suero de ternera recien nacida, sueros humanos, sueros equinos). En algunas realizaciones, se agita un cultivo celular para aumentar la oxigenacion del medio y la dispersion de nutrientes a las celulas.
En algunas realizaciones, se pasan las celulas varias veces en biorreactores de mayor volumen antes de colocar las celulas en el biorreactor de produccion. En algunas realizaciones, se pasan las celulas al biorreactor siguiente que aun en contacto con el medio en el que se hicieron crecer previamente las celulas. En algunas realizaciones, se retiran las celulas del medio, por ejemplo, mediante centrifugacion a baja velocidad antes de ser pasadas al biorreactor siguiente. En algunas realizaciones, se lavan las celulas con medio fresco antes de sembrar en el siguiente biorreactor para eliminar cualquiera de los productos metabolicos de desecho o componentes del medio no deseados. En algunas realizaciones, el medio es el mismo en cada biorreactor. En algunas realizaciones, los medios varfan entre los diferentes biorreactores.
En algunas realizaciones, las celulas expandidas de un biorreactor se diluyen antes de ser anadidas al biorreactor siguiente. En algunas realizaciones, la densidad celular de partida para el biorreactor de produccion es de
aproximadamente 2 x 102 celulas viables por mL hasta aproximadamente 2 x 103 106 celulas viables por mL y mayores.
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Biorreactor de produccion
En algunas realizaciones, se mantiene un cultivo celular en la fase inicial de crecimiento en condiciones que conducen a la supervivencia, crecimiento y viabilidad del cultivo celular. Las condiciones ambientales necesarias variaran dependiendo del tipo celular, del organismo del que se deriva la celula, y la naturaleza y caracter de los polipeptidos expresados, HA, y el complejo HC^HArc.
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principalmente en el rango de temperaturas a las que sigue siendo viable el cultivo celular. Por ejemplo, durante la fase de crecimiento inicial, las celulas CHO crecen bien a 37°C. En algunas realizaciones, la temperatura es de aproximadamente 25°C hasta aproximadamente 42°C. En algunas realizaciones, la temperatura es de aproximadamente 35°C a 40°C.
En algunas realizaciones, la temperatura de la fase inicial de crecimiento se mantiene a una unica temperatura, constante. En algunas realizaciones, la temperatura de la fase inicial de crecimiento se mantiene dentro de un rango de temperaturas. En algunas realizaciones, se aumenta o disminuye la temperatura durante la fase de crecimiento inicial. En algunas realizaciones, se aumenta o disminuye la temperatura durante la fase de crecimiento inicial de manera constante. En algunas realizaciones, la temperatura se aumenta o disminuye en cantidades discretas a diversos tiempos durante la fase de crecimiento inicial.
En algunas realizaciones, se cultivan las celulas durante un perfodo de tiempo suficiente para lograr una densidad de celulas viables que es un porcentaje dado de la densidad maxima de celulas viables que las celulas eventualmente alcanzarfan si se dejan crecer sin perturbacion. En algunas realizaciones, las celulas se cultivan durante un perfodo de tiempo suficiente para lograr una densidad de celulas viables deseada de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 por ciento de la densidad maxima de celulas viables.
En algunas realizaciones, las celulas se cultivan durante un perfodo de tiempo definido, independientemente de su densidad. En algunas realizaciones, las celulas se cultivaron durante 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o mas dfas. En algunas realizaciones, las celulas se cultivan durante un mes.
En algunas realizaciones, el cultivo celular se agita durante la fase de cultivo inicial a fin de incrementar la oxigenacion y la dispersion de los nutrientes a las celulas.
Cambio de las condiciones de cultivo
Despues de lograr la densidad celular deseada (o el final del tiempo de crecimiento prescrito), en algunas realizaciones se cambia al menos una de las condiciones de cultivo. En algunas realizaciones, las condiciones de cultivo se modifican cambiando la temperatura del cultivo. En algunas realizaciones, las condiciones de cultivo se modifican al cambiar la osmolaridad del cultivo. Por otro lado, en algunas realizaciones, se impide que cambien las condiciones de cultivo a condiciones no deseadas, por ejemplo, al mantener el pH de la condicion de cultivo en o alrededor de condiciones neutras, y si es necesario para evitar un cambio a un pH alcalino (que tiene el potencial de romper los enlaces covalentes entre HA y HC.
En algunas realizaciones, el cambio de condiciones es gradual. En algunas realizaciones, el cambio de condiciones se produce durante varias horas. En algunas realizaciones, el cambio de condiciones se produce durante alrededor de 24 horas. En algunas realizaciones, el cambio de condiciones se produce durante varios dfas. En algunas realizaciones, el cambio de condiciones es abrupto. En algunas realizaciones, el cambio de condiciones se produce en menos de aproximadamente una hora.
Fase de Produccion
En algunas realizaciones, las condiciones de cultivo celular durante la fase de produccion estan determinadas por a) las condiciones en las que el cultivo celular permanece viable b) las condiciones en las que la pluralidad de celulas (i) expresa protefna TSG-6 o de tipo TSG-6; o (ii) genera HA y c) las condiciones en las cuales se forma el complejo HC^HArc divulgado en este documento (por ejemplo, a niveles comercialmente adecuados).
En algunas realizaciones, se agita el cultivo durante la fase de produccion con el fin de incrementar la oxigenacion y la dispersion de nutrientes a las celulas.
Supervision de las condiciones de cultivo
En algunas realizaciones, se supervisan las condiciones del cultivo celular para asegurar que se produzca un complejo HC^HArc divulgado en este documento en niveles optimos. En algunas realizaciones, se retiran pequenas alfcuotas del cultivo para analisis. Como ejemplo no limitante, se hace seguimiento a la temperatura, el pH, la densidad celular, la viabilidad celular, la densidad integrada de celulas viables, los niveles de lactato, los niveles de amonio, la osmolaridad, o el tftulo de un complejo HC^HArc divulgado en este documento.
Se supervisan las condiciones del cultivo por cualquier metodo adecuado. En algunas realizaciones, la densidad celular se mide usando un hemocitometro, un contador Coulter, o un examen de densidad celular (CEDEX). En algunas realizaciones, la densidad de celulas viables se determina mediante la tincion de una muestra de cultivo con azul de tripano. En algunas realizaciones, se supervisan los niveles de lactato, de amonio o de un complejo HC^HArc divulgado en este documento mediante el uso de HPLC. En algunas realizaciones, se determina el nivel de un complejo HC^HArc divulgado en este documento por tincion de Coomassie de geles de SDS-PAGE, transferencia tipo Western, ensayos de Bradford, ensayos de Lowry, ensayos de Biuret, y absorbancia UV.
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Aislamiento del complejo HC^HArc obtenido mediante el uso de celulas vivas
En algunas realizaciones, se afsla del cultivo celular y purifica un complejo HC^HArc divulgado en este documento. En algunas formas de realizacion, se afsla un complejo HC^HArc divulgado en este documento de las celulas del cultivo y de cualesquiera otros solidos por centrifugacion o filtracion. En algunas formas de realizacion, se afsla un complejo HC^HArc divulgado en este documento de las celulas del cultivo y de cualesquiera otros solidos mediante la eliminacion de los medios y la lisis de las celulas. La lisis de las celulas se realiza mediante cualquier metodo adecuado.
En algunas realizaciones, el complejo HC^HArc se purifica mediante cualquier metodo adecuado o combinacion de metodos. Las realizaciones descritas a continuacion no pretenden ser exclusivas, solamente a modo de ejemplo.
En algunas realizaciones, se purifica un complejo HC^HArc divulgado en este documento por cromatograffa (por ejemplo, cromatograffa de intercambio ionico, afinidad, exclusion por tamano, y de hidroxiapatita), filtracion en gel, centrifugacion, o solubilidad diferencial, precipitacion con etanol o mediante cualquier otra tecnica disponible para la purificacion de protefnas (vease, por ejemplo, Scopes, Protein Purification Principles and Practice, segunda edicion, Springer-Verlag, Nueva York, 1987; Higgins, S.J. y Hames, B.D. (eds.), Protein Expression: A Practical Approach, Oxford Univ Press, 1999; y Deutscher, M.P., Simon, M.I., Abelson, J.N. (eds.), Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology (Methods in Enzymology Series, vol 182), Academic Press, 1997.
En algunas realizaciones, se purifica un complejo HC^HArc divulgado en este documento por cromatograffa de inmunoafinidad. En algunas realizaciones, se generan los anticuerpos anti-HCl, los anticuerpos anti-HC2, o ambos o HABP y se fijan a un soporte estacionario. En algunas realizaciones, el complejo HC^HArc (es decir, la fase movil) se pasa sobre el soporte. En ciertos casos, el complejo HC^HArc se enlaza a los anticuerpos. En algunas realizaciones se lava el soporte (por ejemplo, con PBS) para eliminar cualquiera de las moleculas no enlazadas o enlazadas debilmente. En algunas realizaciones, se lava luego el soporte con una solucion que permite la elucion de un complejo HC^HArc divulgado en este documento del soporte (por ejemplo, SDS al 1%, guanidina-HCl 6 M, o urea 8 M).
En algunas realizaciones, un complejo HC^HArc divulgado en este documento comprende una etiqueta de afinidad. En algunas realizaciones, la etiqueta de afinidad es una secuencia de una capa de influenza, poli-histidina, o una secuencia de glutation-S transferasa. En algunas realizaciones, el ligando para la etiqueta de afinidad esta fijado al soporte estacionario. En algunas realizaciones, el complejo HC^HArc sin purificar se pasa sobre el soporte. En ciertos casos, el complejo HC^HArc se enlaza al ligando. En algunas realizaciones se lava el soporte (por ejemplo, con PBS) para eliminar cualquiera de las moleculas no enlazadas o enlazadas debilmente. En algunas realizaciones, se lava luego el soporte con una solucion que permite la elucion de un complejo HC^HArc divulgado en este documento del soporte.
En algunas realizaciones, el complejo HC^HArc se purifica mediante una combinacion de cromatograffa de afinidad de HABP, y cromatograffa de inmunoafinidad usando anticuerpos anti-HCl, anticuerpos anti-HC2, o ambos.
En algunas realizaciones, se anaden inhibidores de proteasa (por ejemplo, fluoruro de fenil metil sulfonilo (PMSF), leupeptina, pepstatina o aprotinina) para reducir o eliminar la degradacion del complejo HC^HArc durante el proceso de purificacion. Se desean particularmente los inhibidores de proteasa cuando se deben lisar las celulas.
IV. Composiciones farmaceuticas
Las composiciones farmaceuticas se pueden formular de una forma convencional usando uno o mas portadores fisiologicamente aceptables que incluyen excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de un complejo HC^HA en preparaciones que pueden usarse farmaceuticamente. La formulacion apropiada depende de la via de administracion elegida. Se pueden usar adecuadamente cualquiera de las tecnicas bien conocidas, portadores y excipientes y como se entiende en la tecnica. Un resumen de las composiciones farmaceuticas descritas en este documento puede ser hallado, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice de Pharmacy, novena Ed. (Easton, Pa:. Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pensilvania 1975; Liberman, H.A. y Lachman, L., Eds, Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, Nueva York, NY., 1980; y Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, septima Ed. (Lippincott Williams & Wilkins; 1999).
Se divulgan en este documento, en ciertas realizaciones, una composicion farmaceutica que comprende un complejo HC^HA (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) divulgado en este documento.
En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica comprende ademas al menos un portador farmaceuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica comprende ademas un adyuvante, excipiente, conservante, agente para retrasar la absorcion, relleno, aglutinante, adsorbente, regulador y/o agente solubilizante.
Formas de dosificacion
En algunas realizaciones, se administra un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) como una suspension acuosa. En algunas realizaciones, una suspension acuosa comprende un edulcorante
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o agente saborizante, materias colorantes o tintes y, si se desea, agentes emulsionantes o agentes de suspension, junto con los diluyentes agua, etanol, propilenglicol, glicerina, o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, una suspension acuosa comprende un agente de suspension. En algunas realizaciones, una suspension acuosa comprende carboximetilcelulosa sodica, metilcelulosa, hidroxipropilmetil-celulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y/o goma de acacia. En algunas realizaciones, una suspension acuosa comprende un agente dispersante o humectante. En algunas realizaciones, una suspension acuosa comprende un fosfatido de origen natural, por ejemplo lecitina, o productos de condensacion de un oxido de alquileno con acidos grasos, por ejemplo estearato de polioxietileno, o productos de condensacion de oxido de etileno con alcoholes alifaticos de cadena larga, por ejemplo heptadecaetilen-oxicetanol, o productos de condensacion de oxido de etileno con esteres parciales derivados de acidos grasos y un hexitol tal como monooleato de polioxietilen sorbitol, o productos de condensacion de oxido de etileno con esteres parciales derivados de acidos grasos y anhfdridos de hexitol, por ejemplo monooleato de polietilen sorbitol. En algunas realizaciones, una suspension acuosa comprende un conservante. En algunas realizaciones, una suspension acuosa comprende de etil, o n-propil p-hidroxibenzoato. En algunas realizaciones, una suspension acuosa comprende un agente edulcorante. En algunas realizaciones, una suspension acuosa comprende sacarosa, sacarina o aspartame.
En algunas realizaciones, se administra un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) como una suspension oleosa. En algunas realizaciones, se formula una suspension oleosa mediante la suspension del ingrediente activo en un aceite vegetal (por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sesamo o aceite de coco), o en aceite mineral (por ejemplo, parafina lfquida). En algunas realizaciones, una suspension oleosa comprende un agente espesante (por ejemplo, cera de abejas, parafina dura o alcohol cetflico). En algunas realizaciones, una suspension oleosa comprende agentes edulcorantes (por ejemplo, aquellos indicados anteriormente). En algunas realizaciones, una suspension oleosa comprende un antioxidante (por ejemplo, hidroxianisol butilado o alfa- tocoferol).
En algunas realizaciones, se formula un complejo HC^HA (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) divulgado en este documento para inyeccion parenteral (por ejemplo, a traves de inyeccion o infusion, incluyendo intraarterial, intracardiaca, intradermica, intraduodenal, intramedular, intramuscular, intraosea, intraperitoneal, intratecal, intravascular, intravenosa, intravftrea, epidural y/o subcutanea). En algunas realizaciones, se administra un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) como una solucion, suspension o emulsion esteril.
En algunas realizaciones, una formulacion para administracion parenteral incluye soluciones para inyeccion acuosas y/o no acuosas (oleosas) esteriles de un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) que puede contener antioxidantes, reguladores, bacteriostaticos y/o solutos que vuelven a la formulacion isotonica con la sangre del receptor pretendido; y/o suspensiones esteriles acuosas y/o no acuosas que pueden incluir un agente de suspension y/o un agente espesante. En algunas realizaciones, una formulacion para administracion parenteral incluye estabilizadores adecuados o agentes que aumentan la solubilidad de un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) para permitir la preparacion de soluciones muy concentradas.
En algunas realizaciones, se administra un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) como una suspension acuosa. En algunas realizaciones, una suspension acuosa que comprende agua, solucion de Ringer y/o solucion isotonica de cloruro de sodio.
En algunas realizaciones, se administra un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) como una emulsion micro de agua en aceite en donde se disuelve el ingrediente activo en la fase oleosa. En algunas realizaciones, se disuelve un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) en un aceite graso (por ejemplo, aceite de sesamo, o esteres de acidos grasos sinteticos, (por ejemplo, oleato de etilo o trigliceridos, o liposomas. En algunas realizaciones, se disuelve un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) en una mezcla de aceite de soja y/o lecitina. En algunas realizaciones, se introduce la solucion oleosa en una mezcla de agua y glicerol y se procesa para formar una microemulsion.
En algunas realizaciones, se administra una composicion formulada para administracion parenteral como una sola inyeccion en bolo. En algunas realizaciones, se administra una composicion formulada para administracion parenteral a traves de un dispositivo de administracion intravenosa continua (por ejemplo, una bomba intravenosa modelo 5400 Deltec CADD-PLUSmr).
En algunas realizaciones, se presenta una formulacion para inyeccion en forma de dosificacion unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes para multiples dosis, con un conservante anadido. En algunas realizaciones, se almacena una formulacion para inyeccion en forma de polvo o en una condicion secada por congelacion (liofilizada) que requiere solo la adicion del vehfculo lfquido esteril, por ejemplo, solucion salina o agua esteril libre de pirogenos, inmediatamente antes del uso.
En algunas realizaciones, se formula un complejo HC^HA (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) divulgado en este documento para administracion topica. Las formulaciones topicas incluyen, pero no se limitan a, unguentos, cremas, lociones, soluciones, pastas, geles, barras, liposomas, nanopartfculas. En algunas realizaciones, se administra una formulacion topica mediante el uso de un parche, vendaje o aposito para heridas.
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En algunas realizaciones, una formulacion topica comprende un agente gelificante (o espesante). Los agentes gelificantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, celulosas, derivados de celulosa, eteres de celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, metilcelulosa), goma guar, goma xantana, goma de algarrobo, alginatos (por ejemplo, acido algfnico), silicatos, almidon, tragacanto, polfmeros de carboxivinilo, carragenina, parafina, vaselina, acacia (goma arabiga), agar, silicato de aluminio y magnesio, alginato de sodio, estearato de sodio, fucus, bentonita, carbomero, carragenina, carbopol, xantano, celulosa, celulosa microcristalina (CMC), ceratonia, Chondrus, dextrosa, furcelarano, gelatina, goma Gatti, goma guar, hectorita, lactosa, sacarosa, maltodextrina, manitol, sorbitol, miel, almidon de mafz, almidon de trigo, almidon de arroz, almidon de patata, gelatina , goma esterculia, polietilenglicol (por ejemplo, PEG 2004500), goma tragacanto, etilcelulosa, etil hidroxietil celulosa, etil metil celulosa, metil celulosa, hidroxietil celulosa, hidroxietil metil celulosa, hidroxipropil celulosa, poli(metacrilato de hidroxietilo), oxipoligelatina, pectina, poligelina, povidona, carbonato de propileno, copolfmero de metil vinil eter/anhfdrido maleico (PVM/MA), poli(metacrilato de metoxietilo), poli(metacrilato de metoxietoxietilo), hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), carboximetilcelulosa sodica (CMC), dioxido de silicio, polivinilpirrolidona (PVP: povidona), o combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, una formulacion topica divulgada en este documento comprende un emoliente. Los emolientes incluyen, pero no se limitan a, esteres de aceite de ricino, esteres de manteca de cacao, esteres de aceite de cartamo, esteres de aceite de semilla de algodon, esteres de aceite de mafz, esteres de aceite de oliva, esteres de aceite de hfgado de bacalao, esteres de aceite de almendra, esteres de aceite de aguacate, esteres de aceite de palma, esteres de aceite de sesamo, esteres de escualeno, esteres de aceite de Kikui, esteres de aceite de soja, monogliceridos acetilados, monoestearato de glicerilo etoxilado, laurato de hexilo, laurato de isohexilo, palmitato de isohexilo, palmitato de isopropilo, palmitato de metilo, oleato de decilo, oleato de isodecilo, estearato de hexadecilo estearato de decilo, isoestearato de isopropilo, isoestearato de metilo, adipato de diisopropilo, adipato de diisohexilo, adipato de dihexildecilo, sebacato de diisopropilo, lactato de laurilo, lactato de miristilo, y lactato de cetilo, miristato de oleilo, estearato de oleilo, y oleato de oleilo, acido pelargonico, acido laurico, acido mirfstico, acido palmftico, acido estearico, acido isoestearico, acido hidroxiestearico, acido oleico, acido linoleico, acido ricinoleico, acido araqufdico, acido behenico, acido erucico, alcohol laurflico, alcohol miristflico, alcohol cetflico, alcohol hexadecflico, alcohol estearflico, alcohol isoestearflico, alcohol hidroxiestearflico, alcohol oleflico, alcohol ricinoleflico, alcohol behenflico, alcohol erucflico, alcohol 2-octil dodecanflico, lanolina y derivados de lanolina, cera de abejas, esperma de ballena, miristato de miristilo, estearato de estearilo, cera carnauba, cera de candelilla, lecitina y colesterol.
En algunas realizaciones, se formula un complejo HC^HA (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) divulgado en este documento para administracion a un ojo o un tejido relacionado con el mismo. Las formulaciones adecuadas para la administracion a un ojo incluyen, pero no se limitan a, soluciones, suspensiones (por ejemplo, una suspension acuosa), unguentos, geles, cremas, liposomas, niosomas, farmacosomas, nanopartfculas, o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, se administra un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) para administracion topica a un ojo mediante rociado, lavado, o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, se administra un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) a un ojo a traves de una preparacion inyectable de deposito.
Como se usa en este documento, un "preparacion de deposito" es una formulacion de liberacion controlada que se implanta en un ojo o un tejido relacionado con el mismo (por ejemplo, la esclerotica) (por ejemplo en forma subcutanea, intramuscular, intravftrea, o debajo de la conjuntiva). En algunas realizaciones, se formula una preparacion de deposito mediante la formacion de matrices microencapsuladas (tambien conocidas como matrices microencapsuladas) de un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) en polfmeros biodegradables. En algunas realizaciones, se formula una preparacion de deposito atrapando un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) en liposomas o microemulsiones.
Una formulacion para administracion a un ojo tiene una tonicidad oftalmicamente aceptable. En ciertos casos, el fluido lacrimal tiene un valor de isotonicidad equivalente al de una solucion de cloruro de sodio al 0,9%. En algunas realizaciones, un valor de isotonicidad de aproximadamente 0,6% hasta aproximadamente 0,8% de equivalencia de cloruro de sodio es adecuado para la administracion topica a un ojo. En algunas realizaciones, una formulacion para administracion a un ojo divulgada en este documento tiene una osmolaridad de aproximadamente 200 hasta aproximadamente 600 mOsm/L. En algunas realizaciones, una formulacion para administracion a un ojo divulgada en este documento es hipotonica y por lo tanto requiere la adicion de cualquier sustancia adecuada para alcanzar el rango de tonicidad adecuado. Las sustancias oftalmicamente aceptables que modulan la tonicidad incluyen, pero no se limitan a, cloruro de sodio, cloruro de potasio, tiosulfato de sodio, bisulfito de sodio y sulfato de amonio.
Una formulacion para administracion a un ojo tiene una trasparencia oftalmicamente aceptable. Ejemplos de agentes clarificantes oftalmicamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, Polisorbato 20, Polisorbato 80, o combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, una formulacion para administracion a un ojo comprende un potenciador de la viscosidad oftalmicamente aceptable. En algunas realizaciones, un potenciador de la viscosidad aumenta el tiempo que una
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formulacion divulgada en este documento se mantiene en un ojo. En algunas realizaciones, el aumento del tiempo que una formulacion divulgada en este documento permanece en el ojo permite una mayor absorcion y efecto del farmaco. Los ejemplos no limitantes de polfmeros mucoadhesivos incluyen carboximetilcelulosa, carbomero (polfmero de acido acrflico), poli(metacrilato de metilo), poliacrilamida, policarbofilo, copolfmero de acido acrflico/acrilato de butilo, alginato de sodio y dextrano.
En algunas realizaciones, se administra o suministra una formulacion para administracion a un ojo a los segmentos posteriores de un ojo (por ejemplo, a la retina, la coroides, el vftreo y el nervio optico). En algunas realizaciones, una formulacion topica para administracion a un ojo divulgada en el presente documento para suministro a la parte posterior del ojo comprende un agente solubilizante, por ejemplo, un sulfato de glucano y/o una ciclodextrina. Los sulfatos de glucano que se pueden utilizar incluyen, pero no se limitan a, sulfato de dextrano, sulfato de ciclodextrina y sulfato de p- 1,3-glucano, tanto naturales como sus derivados, o cualquier compuesto que pueda unirse temporalmente a y ser retenido en los tejidos que contienen factor de crecimiento de fibroblastos (FCF), lo que mejora la estabilidad y/o solubilidad de un farmaco, y/o que mejora la penetracion y la absorcion oftalmica de una formulacion topica para administracion a un ojo divulgada en este documento. Los derivados de ciclodextrina que pueden utilizarse como agente solubilizante incluyen, pero no se limitan a, a-ciclodextrina, p-ciclodextrina, Y-ciclodextrina, hidroxietil p-ciclodextrina, hidroxipropil Y-ciclodextrina, hidroxipropil p-ciclodextrina, p-ciclodextrina sulfatada, a-ciclodextrina sulfatada, sulfobutil eter de p-ciclodextrina.
En algunas realizaciones, se formula un complejo HC^HA (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) divulgado en este documento para administracion rectal o vaginal. En algunas realizaciones, se administra un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) como un supositorio. En algunas realizaciones, una composicion adecuada para administracion rectal se prepara mezclando un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) con un excipiente no irritante adecuado que sea solido a temperaturas ordinarias pero lfquido a la temperatura rectal y por lo tanto se fundira en el recto para liberar el farmaco. En algunas realizaciones, se prepara una composicion adecuada para administracion rectal mezclando un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) con manteca de cacao, gelatina glicerinada, aceites vegetales hidrogenados, mezclas de polietilenglicoles de diferentes pesos moleculares o esteres de acidos grasos de polietilenglicol.
Dosis
La cantidad de composiciones farmaceuticas administradas dependera en primer lugar del individuo que esta siendo tratado. En los casos en los que se administran las composiciones farmaceuticas a un sujeto humano, la dosificacion diaria normalmente sera determinada por el medico que prescribe con una dosis que varfa generalmente segun la edad, el sexo, la dieta, el peso, el estado general de salud y la respuesta del individuo, la severidad de los sfntomas del individuo, la indicacion o condicion precisa a tratar, la gravedad de la indicacion o condicion que se esta tratando, el tiempo de administracion, la via de administracion, la disposicion de la composicion, la velocidad de excrecion, la combinacion de farmacos y la discrecion del medico que hace la prescripcion.
En algunas realizaciones, la dosis de un complejo HC^HA (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) esta entre aproximadamente 0,001 hasta aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal/dfa. En algunas realizaciones, la cantidad del complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) esta en el intervalo de aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 50 mg/kg/dfa. En algunas realizaciones, la cantidad de complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) es de aproximadamente 0,001 hasta aproximadamente 7 g/dfa. En algunas realizaciones, la cantidad de complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) es de aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 7 g/dfa. En algunas realizaciones, la cantidad de complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) es de aproximadamente 0,02 hasta aproximadamente 5 g/dfa. En algunas realizaciones, la cantidad de complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) es aproximadamente de 0,05 hasta aproximadamente 2,5 g/dfa. En algunas realizaciones, la cantidad de complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) es de aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 1 g/dfa.
Un complejo HC^HA (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) divulgado en el presente documento y las terapias de combinacion se pueden administrar antes, durante o despues de la aparicion de una enfermedad o condicion, y el momento de administracion de la composicion que contiene un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) puede variar. Asf, por ejemplo, un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) se utiliza como un tratamiento profilactico y se administra continuamente a sujetos con una propension a desarrollar condiciones o enfermedades con el fin de prevenir la aparicion de la enfermedad o condicion. Un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) se puede administrar a un sujeto durante o tan pronto como sea posible despues de la aparicion de los sfntomas. La administracion de un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) puede ser iniciada dentro de las primeras 48 horas de la aparicion de los sfntomas, preferiblemente dentro de las primeras 24 horas de la aparicion de los sfntomas, mas preferiblemente dentro de las primeras 6 horas de la aparicion de los sfntomas, y lo mas preferiblemente dentro de las 3 horas de la aparicion de los sfntomas. La administracion inicial puede ser a traves de cualquier ruta practica, tal como, por ejemplo, una inyeccion intravenosa, una inyeccion de bolo, infusion durante 5
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minutos hasta aproximadamente 5 horas, una pfidora, una capsula, un parche transdermico, administracion bucal, y similares, o combinacion de los mismos. Un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) se administra preferiblemente tan pronto como sea posible despues de que se detecta la aparicion o se sospecha de una enfermedad o condicion, y durante un perfodo de tiempo necesario para el tratamiento de la enfermedad, tal como, por ejemplo, desde aproximadamente 1 mes hasta aproximadamente 3 meses. La duracion del tratamiento puede variar para cada sujeto, y puede ser determinado utilizando criterios conocidos. Por ejemplo, se puede administrar un complejo HC^hA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) o una formulacion que contiene un complejo durante al menos 2 semanas, preferiblemente aproximadamente 1 mes hasta aproximadamente 5 anos, y mas preferiblemente aproximadamente 1 meses hasta 3 anos.
En algunas realizaciones, un complejo HC^HA (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) divulgado en este documento se administra en una sola dosis, una vez al dfa. En algunas formas de realizacion, un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) se administra en dosis multiples, mas de una vez por dfa. En algunas realizaciones un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) se administra dos veces al dfa. En algunas realizaciones, un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) se administra tres veces por dfa. En algunas realizaciones, un complejo HC^HA se administra cuatro veces por dfa. En algunas realizaciones, un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o RCHC^HA) se administra mas de cuatro veces por dfa.
En algunas realizaciones, un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) se administra para tratamientos profilacticos y/o terapeuticos. En aplicaciones terapeuticas, un complejo Hc^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) se administra a un individuo que ya sufre de una enfermedad o condicion, en una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente los sfntomas de la enfermedad o condicion. Las cantidades efectivas para este uso dependeran de la gravedad y el trascurso de la enfermedad o condicion, la terapia previa, el estado de salud del individuo, el peso, y la respuesta a los farmacos, y el juicio del medico tratante.
En aplicaciones profilacticas, un complejo HC^HA divulgado aquf (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) se administra a un individuo que esta en riesgo de un trastorno particular. Tal cantidad se define como una "cantidad o dosis profilacticamente efectiva". En este uso, las cantidades precisas dependen tambien del estado de salud del individuo, peso, y similares.
En el caso en el que la condicion del individuo no mejora, se administra cronicamente a discrecion del medico un complejo HC^HA divulgado en el presente documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc), es decir, durante un perfodo prolongado de tiempo, incluyendo toda la vida del individuo con el fin de mejorar o bien de controlar o limitar los sfntomas de la enfermedad o condicion del individuo.
En el caso en el que el estado de la persona no mejora, se administra de forma continua a discrecion del medico un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc); alternativamente, la dosis de farmaco que se administra se puede reducir de forma temporal o suspender temporalmente por un cierto perfodo de tiempo (es decir, un "descanso de los medicamentos"). La duracion de suspension del medicamento puede variar entre 2 dfas y 1 ano, incluyendo a modo de ejemplo, 2 dfas, 3 dfas, 4 dfas, 5 dfas, 6 dfas, 7 dfas, 10 dfas, l2 dfas, 15 dfas, 20 dfas, 28 dfas, 35 dfas, 50 dfas, 70 dfas, 100 dfas, 120 dfas, 150 dfas, 180 dfas, 200 dfas, 250 dfas, 280 dfas, 300 dfas, 320 dfas, 350 dfas o 365 dfas. La reduccion de la dosis durante un descanso del medicamento puede ser de 10% - 100%, incluyendo, a modo de ejemplo solamente, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o 100%.
Una vez se ha producido la mejora de las condiciones del individuo, se administra una dosis de mantenimiento si es necesario. Posteriormente, se puede reducir la dosis o la frecuencia de administracion, o ambas, en funcion de los sfntomas, hasta un nivel en el que subsiste la mejorfa de la enfermedad, trastorno o condicion. Los individuos pueden, sin embargo, requieren un tratamiento intermitente a largo plazo por cualquier recurrencia de los sfntomas.
La composicion farmaceutica descrita en el presente documento puede estar en formas de dosificacion unitaria adecuadas para la administracion unica de dosis precisas. En una forma de dosificacion unitaria, la formulacion se divide en dosis unitarias que contienen cantidades apropiadas de un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc). La dosis unitaria puede estar en la forma de un empaque que contiene cantidades discretas de la formulacion. Ejemplos no limitantes son comprimidos o capsulas empacados, y polvos en viales o ampollas. Las composiciones acuosas en suspension pueden envasarse en contenedores que no pueden volver a cerrarse de una sola dosis. Alternativamente, se pueden usar recipientes que se pueden volver a cerrar de dosis multiples, en cuyo caso es tfpico incluir un conservante en la composicion. A modo de ejemplo solamente, las formulaciones para inyeccion parenteral pueden presentarse en forma de dosificacion unitaria, que incluyen, pero no se limitan a ampollas, o en recipientes para multiples dosis, con un conservante anadido.
Las dosis diarias adecuadas para un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) son de aproximadamente 0,01 a 2,5 mg/kg por peso corporal. Una dosis diaria indicada en mamffero mas grandes, incluyendo, pero no limitado a, seres humanos, esta en el intervalo de aproximadamente 0,5 mg hasta
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aproximadamente 100 mg, administrada convenientemente en dosis divididas, incluyendo, pero no limitado a, hasta cuatro veces al dfa o en forma de liberacion prolongada. Formas de dosificacion unitaria adecuadas para administracion oral incluyen aproximadamente de 1 a 50 mg de ingrediente activo. Los rangos anteriores son una mera sugerencia, ya que el numero de variables con respecto a un regimen de tratamiento individual es grande, y no son infrecuentes desviaciones considerables de estos valores recomendados. Tales dosificaciones se pueden alterar dependiendo de una cantidad de variables, no limitadas a la actividad de un complejo HC^HA utilizado (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc), la enfermedad o condicion a tratar, el modo de administracion, los requerimientos del sujeto individual, la gravedad de la enfermedad o condicion que se esta tratando, y el juicio del medico.
La toxicidad y la eficacia terapeutica de dichos regfmenes terapeuticos se pueden determinar mediante procedimientos farmaceuticos estandar en cultivos celulares o animales experimentales, incluyendo, pero no limitado a, la determinacion de la DL50 (la dosis letal para el 50% de la poblacion) y la DE50 (la dosis terapeuticamente efectiva en el 50% de la poblacion). La relacion de la dosis entre los efectos toxicos y terapeuticos es el mdice terapeutico y puede expresarse como la relacion entre DL50 y DE50. Se prefieren los complejos HC^HA que exhiben altos indices terapeuticos. Los datos obtenidos de ensayos de cultivo celular y estudios en animales pueden usarse para formular un intervalo de dosis para uso en humanos. La dosis de un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) se encuentra preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con toxicidad minima. La dosificacion puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificacion empleada y la via de administracion utilizada.
VI. Combinaciones
En algunas realizaciones, las composiciones y metodos descritos aqrn se utilizan en combinacion con un segundo agente terapeutico. En algunas formas de realizacion, se administran un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) y un segundo agente terapeutico en la misma forma de dosificacion. En algunas formas de realizacion, se administran un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) y un segundo agente terapeutico en formas de dosificacion separadas.
En algunas realizaciones, un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) y un segundo agente terapeutico se administran al mismo tiempo (por ejemplo, simultaneamente, esencialmente simultaneamente o dentro del mismo protocolo de tratamiento).
En algunas realizaciones, se administran un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) y un segundo agente terapeutico, secuencialmente. En algunas realizaciones, se administra un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) antes o despues del segundo agente terapeutico. En algunas realizaciones, el penodo de tiempo entre la administracion de un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) y un segundo agente activo vana desde unos pocos minutos hasta varias horas, dependiendo de las propiedades de cada agente farmaceutico, tales como la potencia, solubilidad, biodisponibilidad, vida media en plasma y perfil cinetico del agente farmaceutico. La variacion circadiana de la concentracion de la molecula objetivo tambien puede determinar el intervalo de dosis optima. En algunas realizaciones, el tiempo entre la administracion de un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) y un segundo agente activo es de aproximadamente menos de una hora, menos de un dfa, menos de una semana, o menos de un mes.
En algunas realizaciones, la coadministracion de un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) da como resultado el requerimiento de una menor dosis del complejo HC^HA que la requerida cuando se administra un complejo HC^HA solo. En algunas realizaciones, la coadministracion de un segundo agente terapeutico da como resultado el requerimiento de una menor dosis del segundo agente que la requerida cuando se administra el segundo agente solo. Los metodos para determinar experimentalmente las dosis terapeuticamente efectivas de farmacos y otros agentes para uso en regfmenes de tratamiento de combinacion se describen en la literatura. Por ejemplo, el uso de dosificacion metronomica, es decir, proporcionar dosis menores mas frecuentes, con el fin de minimizar los efectos secundarios toxicos, ha sido descrito ampliamente en la literatura. El tratamiento de combinacion incluye ademas tratamientos periodicos que se inician y se detienen en diferentes ocasiones para ayudar en el manejo clmico del individuo.
En algunas realizaciones, el segundo agente terapeutico se selecciona a partir de agentes citotoxicos, agentes antiangiogenesis y/o agentes antineoplasicos. En algunas realizaciones, el segundo agente terapeutico se selecciona a partir de agentes alquilantes, antimetabolitos, epidofilotoxinas; enzimas antineoplasicas, inhibidores de la topoisomerasa, procarbazinas, mitoxantronas, complejos de coordinacion de platino, modificadores de la respuesta biologica e inhibidores de crecimiento, agentes terapeuticos hormonales/antihormonales, factores de crecimiento hematopoyeticos, inhibidores de aromatasa, antiestrogenos, antiandrogenos, corticosteroides, agonistas de gonadorelina, agentes activos de microtubulos, nitrosoureas, lfpido o agentes dirigidos a protema quinasa, IMiD, protema o agentes dirigidos a lfpido fosfatasa, agentes antiangiogenicos, inhibidores de Akt, inhibidores de IGF-I, moduladores de FGF3, inhibidores de mTOR, mimeticos de Smac, inhibidores de HDAC, agentes que inducen la diferenciacion celular, antagonistas del receptor de bradiquinina 1, antagonistas de angiotensina II, inhibidores de ciclooxigenasa, inhibidores de heparanasa, inhibidores de linfoquina, inhibidores de citoquina, inhibidores de IKK,
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inhibidores de P38MAPK, inhibidores de HSP90, inhibidores de multiquinasa, bisfosfonato, derivados de rapamicina, inhibidores de la ruta antiapoptotica, agonistas de la ruta apoptotica, agonistas de PPAR, agonistas de RAR, inhibidores de isoformas de Ras, inhibidores de telomerasa, inhibidores de proteasa, inhibidores de metaloproteinasa, inhibidores de aminopeptidasa, activadores de SHIP-AQX-MN100, Humax-CD20 (ofatumumab), antagonistas de CD20, fusiones de la toxina difteria-IL2, o combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, el segundo agente terapeutico se selecciona de ARRY-797, dacarbazina (DTIC), actinomicinas C2, C3, D, y F1, ciclofosfamida, melfalan, estramustina, maitansinol, rifamicina, estreptovaricina, doxorubicina, daunorubicina, epirubicina, idarubicina, detorrubicina, carminomicina, idarrubicina, epirrubicina, esorrubicina, mitoxantrona, bleomicinas A, A2 y B, camptotecina, irinotecano, topotecano, 9-aminocamptotecina, 10,11- metilendioxicamptotecina, 9-nitrocamptotecina, bortezomib, temozolomida, TAS103, NPI0052, Combretastatina, Combretastatina A-2, Combretastatina A-4, calicheamicinas, neocarcinostatinas, epotilonas AB, C y variantes semisinteticas, Herceptina, Rituxan, anticuerpos CD40, asparaginasa, interleucinas, interferones, leuprolida, y pegaspargasa, 5-fluorouracilo, fluorodesoxiuridina, ptorafur, 5'-desoxifluorouridina, UFT, MITC, capecitabina S-1, dietilestilbestrol, tamoxifeno, toremefina, tolmudex, timitaq, flutamida, fluoximesterona, bicalutamida, finasteride, estradiol, trioxifeno, dexametasona, acetato de leuproelina, estramustina, droloxifeno, medroxiprogesterona, acetato de megesterol, aminoglutetimida, testolactona, testosterona, dietilestilbestrol, hidroxiprogesterona, mitomicinas A, B y C, porfiromicina, cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, tetraplatino, platino-DACH, ormaplatino, talidomida, lenalidomida, CI- 973, telomestatina, CHIR258, Rad 001, sAhA, tubacina, 17-aAg, sorafenib, JM-216, podofilotoxina, epipodofilotoxina, etoposido, teniposido, Tarceva, Iressa, imatinib, miltefosina, Perifosina, aminopterina, metotrexato, metopterina, dicloro- metotrexato, 6-mercaptopurina, tioguanina, azatioprina, alopurinol, cladribina, fludarabina, pentostatina, 2- cloroadenosina, desoxicitidina, arabinosido de citosina, citarabina, azacitidina, 5-azacitosina, gemcitabina, 5-azacitosina- arabinosido, vincristina, vinblastina, vinorelbina, leurosina, leurosidina y vindesina, paclitaxel, taxotere y/o docetaxel.
En algunas realizaciones, el segundo agente activo es niacina, un fibrato, una estatina, un polipeptido mimetico de Apo- A1 (por ejemplo, DF-4, Novartis), un sobrerregulador transcripcional de apoA-I, un inhibidor de ACAT, un modulador de CETP, antagonistas de los receptores de la glicoprotefna (GP) IIb/IIIa, antagonistas del receptor de P2Y12, inhibidores de Lp-PLA2, un agente anti-TNF, un antagonista del receptor de IL-1, un antagonista del receptor de IL-2, un agente citotoxico, un agente inmunomodulador, un antibiotico, un bloqueador coestimulador de celulas T, un agente antirreumatico modificador del trastorno, un agente agotador de celulas B, un agente inmunosupresor, un anticuerpo antilinfocito, un agente alquilante, un antimetabolito, un alcaloide vegetal, terpenoides, un inhibidor de la topoisomerasa, un antibiotico antitumoral, un anticuerpo monoclonal, una terapia hormonal (por ejemplo, inhibidores de aromatasa), o combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, el segundo ingrediente activo es la niacina, bezafibrato; ciprofibrato; clofibrato; gemfibrozilo; fenofibrato; DF4 (Ac-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-NH2); DF5; RVX-208 (Resverlogix); avasimibe; sulfato de pactimiba (CS-505); CI-1011 (2,6-diisopropilfenil[(2, 4,6-triisopropilfenil)acetil]sulfamato); CI-976 (2,2-dimetil-N-(2,4,6- trimetoxifenil)dodecanamida); VULM1457 (1-(2,6-diisopropil-fenil)-3-[4-(4'-nitrofeniltio)fenil]urea); CI-976 (2,2-dimetil-N- (2,4,6-trimetoxifenil)dodecanamida); E-5324 (n-butil-N'-(2-(3-(5-etil-4-fenil-1H-imidazol-1-il)propoxi)-6-metilfenil)urea); HL-004 (N-(2,6-diisopropilfenil) tetradeciltioacetamida); kY-455 (N-(4,6-dimetil-1 -pentilindolin-7-il) -2,2-dimetil-propan- amida); Fy-087 (N-[2-[N'-pentil-(6,6-dimetil-2,4-heptadiinil)amino]etil]-(2-metil-1-naftil-tio)acetamida); MCC-147 (Mitsubishi Pharma); F 12511 ((S)-2',3',5'-trimetil-4'-hidroxi-alfa-dodeciltioacetanilida); SMP-500 (Sumitomo Pharmaceuticals); CL 277082 (2,4-difluoro-fenil-N[[4-(2,2-dimetilpropil)fenil]metil]-N-(heptil)urea); F-1394 ((1s,2S)-2-[3- (2,2-dimetilpropil)-3-nonilureido]aminociclohexano-1-il-3-[N-(2,2,5,5-tetrametil-1,3-dioxano-4-carbonil)amino]propionato); CP-113818 (amida del acido N-(2,4-bis(metiltio)-6-metilpiridin-3-il)-2-(hexiltio)decanoico); yM-750; torcetrapib; anacetrapid; JTT-705 (Japan Tobacco/Roche); abciximab; eptifibatida; tirofiban; roxifiban; variabilin; XV 459 (N(3)-(2-(3- (4-formamidinofenil)isoxazolin-5-il)acetil)-N(2)-(1-butiloxicarbonil)-2,3-diaminopropionato); SR 121566A (acido 3-[N-{4-[4- (aminoiminometil)fenil]-1,3-tiazol-2-il}-N-(1-carboximetilpiperid-4-il)amino]propionico, triclorhidrato); FK419 (acido (S)-2- acetilamino-3- [(R)- [1-[3- (piperidin-4-il) propionil] piperidin-3-ilcarbonil] amino] propionico trihidratado); clopidogrel; prasugrel; cangrelor; AZD6140 (AstraZeneca); MRS 2395 (3-(2-cloro-6-metilaminopurin-9-il)-2-(2,2-dimetil- propioniloximetilo)-propil ester del acido 2,2-dimetil-propionico); BX 667 (Berlex Biosciences); BX 048 (Berlex Biosciences); darapladib (SB 480848); SB-435495 (GlaxoSmithKline); SB-222657 (GlaxoSmithKline); SB-253514 (GlaxoSmithKline); alefacept, efalizumab, metotrexato, acitretina, isotretinofna, hidroxiurea, mofetil micofenolato, sulfasalazina, 6-tioguanina, Dovonex, Taclonex, betametasona, tazaroteno, hidroxicloroquina, sulfasalazina, etanercept, adalimumab, infliximab, abatacept, rituximab, trastuzumab, anticuerpo monoclonal anti-CD45 AFIN-12 (NCI), anticuerpo anti-B1 yodo-131 (Corixa Corp.), anticuerpo monoclonal anti-CD66 BW 250/183 (NCI, Hospital General de Southampton), anticuerpo monoclonal anti-CD45 (NCI, Baylor College of Medicine), anticuerpo anti-integrina anb3 (NCI), BIW-8962 (BioWa Inc.), anticuerpo FC8 (NCI), anticuerpo muJ591 (NCI), anticuerpo monoclonal MN-14 indio In111 (NCI), anticuerpo monoclonal MN-14 itrio Y 90 (NCI), Anticuerpo Monoclonal F105 (NiAID), anticuerpo monoclonal RAV 12 (Raven Biotechnologies), CAT-192 (anticuerpo monoclonal anti-TGF-Beta1 humano, Genzyme), anticuerpo 3F8 (NCI), 177Lu-J591 (Weill Medical College de la Universidad de Cornell), TB-403 (Biolnvent International AB), anakinra, azatioprina, ciclofosfamida, ciclosporina A, leflunomida, d-penicilamina, amitriptilina o nortriptilina, clorambucilo, mostaza nitrogenada, prasterona, LJP 394 (abetimus sodico), lJp 1082 (La Jolla Pharmaceutical), eculizumab, belibumab, rhuCD40L (NIAID), epratuzumab, sirolimus, tacrolimus, pimecrolimus, talidomida, globulina antitimocftica equina (Atgam, Pharmacia Upjohn), globulina antitimocftica de conejo (Timoglobulina, Genzyme), Muromonab-CD3 (Oficina de la FDA para el Desarrollo de Productos Huerfanos), basiliximab, daclizumab, riluzol, cladribina, natalizumab, interferon beta-1b,
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interferon beta-1a, tizanidina, baclofeno, mesalazina, asacol, pentasa, mesalamina, balsalazida, olsalazina, 6- mercaptopurina, AIN457 (anticuerpo monoclonal anti-IL-17, Novartis), teofilina, D2E7 (mAb anti-TNF humano de Knoll Pharmaceuticals), Mepolizumab (anticuerpo anti-IL-5, SB 240563), Canakinumab (anticuerpo anti-IL-1 Beta, NIAMS), anticuerpo receptor anti-IL-2 (Daclizumab, NHL-BI), CNTO 328 (anticuerpo anti-IL-6, Centocor), ACZ885 (anticuerpo monoclonal anti-interleuquina1beta completamente humano, Novartis), CNTO 1275 (anticuerpo monoclonal anti-IL-12 completamente humano, Centocor), (3S)-N-hidroxi-4-({4-[(4-hidroxi-2-butinil)oxi]fenil}sulfonil)-2,2-dimet-hil-3-tiomorfolina carboxamida (apratastat), golimumab (CnTO 148), Onercept, BG9924 (Biogen Idec), Certolizumab Pegol (CDP870, UCB Pharma), AZD9056 (AstraZeneca), AZD5069 (AstraZeneca), AZD9668 (AstraZeneca), AZD7928 (AstraZeneca), AZD2914 (AstraZeneca), AZD6067 (AstraZeneca), AZD3342 (AstraZeneca), AZD8309 (AstraZeneca), [acido (1R)-3- metil-1- ({(2S)-3-fenil-2-[(pirazin-2-ilcarbonil)amino]propanoil}amino)butil]boronico (Bortezomib), AMG-714 (anticuerpo monoclonal anti-IL-15 humano, Amgen), ABT-874 (anticuerpo monoclonal anti-IL-12, Abbott Labs.), MRA (Tocilizumab, un anticuerpo monoclonal receptor anti-IL-6, Chugai Pharmaceutical), CAT-354 (un anticuerpo monoclonal anti- interleuquina-13 humana, Cambridge Antibody Technology, Medlmmune), aspirina, acido salicflico, acido gentfsico, salicilato de magnesio colina, salicilato de colina, salicilato de magnesio colina, salicilato de colina, salicilato de magnesio, salicilato de sodio, diflunisal, carprofeno, fenoprofeno, fenoprofeno de calcio, flurobiprofeno, ibuprofeno, ketoprofeno, nabutona, ketolorac, ketorolac trometamina, naproxeno, oxaprozina, diclofenaco, etodolac, indometacina, sulindac, tolmetina, meclofenamato, meclofenamato de sodio, acido mefenamico, piroxicam, meloxicam, celecoxib, rofecoxib, valdecoxib, parecoxib, etoricoxib, lumiracoxib, CS-502 (Sankyo), JTE- 522 (Japan Tobacco Inc.), L-745.337 (Almirall), NS398 (Sigma), betametasona (Celestone), prednisona (Deltasone), alclometasona, aldosterona, amcinonida, beclometasona, betametasona, budesonida, ciclesonida, clobetasol, clobetasona, clocortolona, cloprednol, cortisona, cortivazol, deflazacort, desoxicorticosterona, desonida, desoximetasona, desoxicortona, dexametasona, diflorasona, diflucortolona, difluprednato, fluclorolona, fludrocortisona, fludroxicortida, flumetasona, flunisolida, acetonido de fluocinolona, fluocinonida, fluocortina, fluocortolona, fluorometolona, fluperolona, fluprednideno, fluticasona, formocortal, formoterol, halcinonida, halometasona, hidrocortisona, aceponato de hidrocortisona, buteprato de hidrocortisona, butirato de hidrocortisona, loteprednol, medrisona, meprednisona, metilprednisolona, aceponato de metilprednisolona, furoato de mometasona, parametasona, prednicarbato, prednisona, rimexolona, tixocortol, triamcinolona, ulobetasol; cisplatino; carboplatino; oxaliplatino; mecloretamina; ciclofosfamida; clorambucilo; vincristina; vinblastina; vinorelbina; vindesina; azatioprina; mercaptopurina; fludarabina; pentostatina; cladribina; 5-fluorouracilo (5FU); floxuridina (FUDR); arabinosido de citosina; metotrexato; trimetoprima; pirimetamina; pemetrexed; paclitaxel; docetaxel; etoposido; teniposido; irinotecano; topotecano; amsacrina; etoposido; fosfato de etoposido; teniposido; dactinomicina; doxorrubicina; daunorubicina; valrubicina; idarubicina; epirubicina; bleomicina; plicamicina; mitomicina; trastuzumab; cetuximab; rituximab; bevacizumab; finasteride; goserelina; aminoglutetimida; anastrozol; letrozol; vorozol; exemestano; 4-androsteno-3,6,17-triona ("6-OXO"; 1,4,6-androstatrien-3,17-diona (ATD); formestano; testolactona; fadrozol, o combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, el segundo agente terapeutico es un antibiotico. En algunas realizaciones, el segundo agente terapeutico es un agente antibacteriano. En algunas realizaciones, el segundo agente terapeutico es amikacina, gentamicina, kanamicina, neomicina, netilmicina, estreptomicina, tobramicina, paromomicina, geldanmicina, herbimicina, loracarbef, ertapenem, doripenem, imipenem, cilastatina, meropenem, cefadroxil, cefazolina, cefalotina, cefalexina, cefaclor, cefamandol, cefoxitina, defprozil, cefuroxima, cefixima, cefdinir, cefditoren, cefoperazona, cefotaxima, cefpodoxima, ceftazidima, ceftibuten, ceftizoxima, ceftriaxona, cefepima, ceftobiprol, teicoplanina, vancomicina, azitromicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina, roxitromicina, troleandomicina, telitromicina, espectinomicina, aztreonam, amoxicilina, ampicilina, azlocilina, carbenicilina, cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina, mezlocilina, meticilina, nafcilina, oxacilina, penicilina, piperacilina, ticarcilano, bacitracina, colistina, polimixina B, ciprofloxacina, enoxacina, gatifloxacina, levofloxacina, lomefloxacina, moxifloxacina, norfloxacina, ofloxacina, trovfloxacina, mafenida, prontosil, sulfacetamida, sulfametizol, sulfanimilimida, sulfsalazina, sulfsioxazol, trimetoprima, demeclociclina, doxiciclina, minociclina, oxtetraciclina, tetraciclina, arsfenamina, cloranfenicol, clindamicina, lincomicina, etambutol, fosfomicina, acido fusfdico, furazolidona, isoniazida, linezolida, metronidazol, mupirocina, nitrofurantoina, platensimicina, pirazinamida, quinuspristina/dalfopristina, rifampicina, tinidazol, y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, el segundo agente terapeutico es un antibiotico. En algunas realizaciones, el segundo agente terapeutico es un agente antiviral. En algunas realizaciones, el segundo agente terapeutico es aciclovir, famciclovir, valaciclovir, abacavir, aciclovir, adfovir, amantadina, amprenavir, arbidol., atazanavir, artipla, brivudina, cidofovir, combivir, edoxudina, efavirenz, emtricitabina, enfuvirtida, entecavir, fomvirsen, fosamprenavir, foscarnet, fosfonet, ganciclovir, gardasilo, ibacitabina, imunovir, idoxuridina, imiquimod, indinavir, inosina, inhibidores de la integrasa, interferones, incluyendo el interferon tipo III, el interferon de tipo II, el interferon tipo I, lamivudina, lopinavir, lovirida, MK- 0518, maraviroc, moroxidina, nelfmavir, nevirapina, nexavir, analogos de nucleosidos, oseltamivir, penciclovir, peramivir, pleconaril, podofilotoxina, inhibidores de proteasa, inhibidores de transcriptasa inversa, ribavirina, rimantadina, ritonavir, saquinavir, estavudina, tenofovir, tenofovir disoproxil, tipranavir, trifluridina, trizivir, tromantadina, truvada, valganciclovir, vicriviroc, vidarabina, viramidina, zalcitabina, zanamivir, zidovudina, y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, el segundo agente terapeutico es un antibiotico. En algunas realizaciones, el segundo agente terapeutico es un agente antifungicida. En algunas realizaciones, el segundo agente terapeutico es amrolfina, utenafina, naftifina, terbinafina, flucitosina, fluconazol, itraconazol, ketoconazol, posaconazol, ravuconazol, voriconazol, clotrimazol, econazol, miconazol, oxiconazol, sulconazol, terconazol, tioconazol, nikomicina Z, caspofungina, micafungina, anidulafungina, anfotericina B, nistastina liposomal, pimaricina, griseofulvina, ciclopirox olamina, haloprogina, tolnaftato,
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undecilinato, clioquinol, y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, el segundo agente terapeutico es un antibiotico. En algunas realizaciones, el segundo agente terapeutico es un agente antiparasitario. En algunas realizaciones, el segundo agente terapeutico es amitraz, amoscanato, avermectina, carbadox, dietilcarbamizina, dimetridazol, diminazeno, ivermectina, macrofilaricida, malation, mitaban, oxamniquina, permetrina, praziquantel, prantel pamoato, selamectina, estibogluconato de sodio, tiabendazol, y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) es administrado conjuntamente con un trasplante de tejido. En algunas formas de realizacion, un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) se administra conjuntamente con un trasplante de celulas madre. En algunas realizaciones, un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) se administra conjuntamente con un trasplante de organo.
En algunas realizaciones, un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) se administra simultaneamente (por ejemplo, simultaneamente, esencialmente simultaneamente o dentro del mismo protocolo de tratamiento) con un trasplante de tejido. En algunas realizaciones, un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) se administra antes o despues de un trasplante de tejido. En algunas realizaciones, el perfodo de tiempo entre la administracion de un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) y el trasplante de tejido va desde un par de minutos a varias horas, dependiendo de las propiedades de cada agente farmaceutico, tal como la potencia, solubilidad, biodisponibilidad, vida media en plasma y perfil cinetico del agente farmaceutico. La variacion circadiana de la concentracion molecula objetivo tambien puede determinar el intervalo optimo de dosis. En algunas realizaciones, el tiempo entre la administracion de un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) y un segundo agente activo es de aproximadamente menos de una hora, menos de un dfa, menos de una semana, o menos de un mes.
En algunas realizaciones, un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) es administrado conjuntamente con un trasplante de tejidos y un agente inmunosupresor. En algunas realizaciones, un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) se administra conjuntamente con un trasplante de tejido y un inhibidor de calcineurina (por ejemplo, ciclosporina o tacrolimus); un inhibidor de mTOR (sirolimus, everolimus); un agente antiproliferativo (azatioprina o acido micofenolico); un corticosteroide (por ejemplo, prednisolona o hidrocortisona); un anticuerpo monoclonal receptor anti-IL-2Ra (por ejemplo, basiliximab o daclizumab); anticuerpos policlonales anti-celulas T (por ejemplo, anti-timocito globulina (ATG) o anti-linfocito globulina (ALG)); o combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, se recubre un tejido con un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc). En algunas realizaciones, se recubre una pluralidad de celulas madre con un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc). En algunas realizaciones, se recubre un organo con un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc). En algunas realizaciones, el recubrimiento de un tejido con un complejo HC^HA divulgado en este documento evita que sobre un tejido actue el sistema inmunologico del huesped.
En algunas realizaciones, se pone en contacto un organo, tejido, o una pluralidad de celulas madre con un complejo HC^HA divulgado en este documento. En algunas realizaciones, se pone en contacto un organo, tejido, o una pluralidad de celulas madre con una composicion que comprende un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc). En algunas realizaciones, la composicion tiene un pH de aproximadamente 7,0 hasta aproximadamente 7,5. En algunas realizaciones, la composicion tiene un pH de 7,4. En algunas realizaciones, la composicion comprende ademas potasio, magnesio, y Rafinosa. En algunas realizaciones, la composicion comprende ademas al menos uno de adenosina, glutatina, alopurinol, y almidon de hidroxietilo. En algunas realizaciones, la composicion es una solucion UW complementada con un complejo HC^HA divulgado en este documento.
En algunas realizaciones, se pone en contacto el organo, tejido o pluralidad de celulas madre con un complejo HC^HA divulgado en este documento (por ejemplo, HC^HAn y/o HC^HArc) durante aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 36 horas, o aproximadamente 48 horas. En algunas realizaciones, el contacto se produce a una temperatura que protege a los tejidos y en acondicionamiento vascular (por ejemplo, por debajo de la temperatura ambiente). En algunas realizaciones, el contacto se produce a 4°C.
Ejemplos
Preparacion de AME, y AMP
Todos los procedimientos para los materiales anteriores se llevan a cabo de forma aseptica.
Se lava la MA humana congelada obtenida a traves de Bio-tissue (Miami, FL) 2-3 veces con PBS para eliminar el medio de almacenamiento. Para preparar AME, se pesa la MA (~ 10 mg/cm2), se transfiere a un tubo de centrffuga esteril de
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50 ml y se centrifuga a 4°C durante 5 min a 5000 x g para eliminar el exceso de liquido. Se pesa la MA, se transfiere a una placa de Petri esteril de 100 mm o 150 mm, y se congela en la fase aerea de un recipiente con nitrogeno liquido durante 20 min antes de ser cortada en trozos pequenos con un bisturf desechable y se homogeniza con un Tissue Tearor (Biospec Products, Inc., Dremel, WI) en PBS. Se mezcla el homogeneizado a 4°C durante 30 min y se centrifuga a 15.000 x g durante 30 min. Se recoge el sobrenadante, denominado como AME, y se almacena en alicuotas (0,5 ml) a - 80°C.
Para preparar AMP liofilizado, se liofiliza AME mediante un SpeedVac (Savant Instruments Inc., Farmingdale, NY) a 4°C durante 4 h para eliminar el 89% del peso debido al agua y se almacena a - 80°C.
Ejemplo 1 - Extraccion secuencial de la MA
La MA criopreservada humana, obtenida a traves de Bio-tissue, Inc. (Miami, FL), se corto en trozos pequenos, se congelo en nitrogeno liquido, y se molio hasta un polvo fino mediante un BioPulverizer. Se mezclo el polvo con Regulador A (Tris-HCl 100 mM, pH 7,6, NaCl 150 mM, EDTA 4 mM, Triton X-100 al 1% (v/v)) en proporcion 1:1 (g/ml) a 4°C durante 1 h. Se centrifugo la mezcla a 48.000 x g durante 30 min a 4°C y se almaceno el sobrenadante (Extracto A) a -80°C. Se lavo luego el sedimento tres veces con Regulador A antes de ser extrafdo con Regulador B (Tris-HCl 100 mM, pH 7,6, NaCl 1 M, EDTA 4 mM, Triton X-100 al 1% (v/v)) a 4°C durante 1 h. Despues de la centrifugacion, se almaceno el sobrenadante (Extracto B). Se lavo el sedimento restante con Regulador B antes de la adicion de Regulador C (acetato de sodio 100 mM, pH 5,8, clorhidrato de guanidina 4 M, EDTA 4 mM, Triton X-100 al 1%) a 4°C durante 24 h. Nuevamente despues de la centrifugacion, se almaceno el sobrenadante (Extracto C). Se complementaron los Reguladores A, B, y C con los siguientes inhibidores de proteasa y fosfatasa: coctel inhibidor de proteasa (dilucion 1:100 de acuerdo con la sugerencia del fabricante), PMSF 0,5 mM, fluoruro de sodio 50 mM, y vanadato de sodio 0,2 mM. Se determinaron las concentraciones de protefna en los extractos de MA mediante el kit de ensayo de protefna BCA, mientras que las concentraciones de HA mediante un kit de ensayo cuantitativo de HA con base en ELISA.
Ejemplo 2 - Purificacion del complejo nativo (HC^HAn)
El procedimiento completo para la preparacion de extractos de MA humana se llevo a cabo de forma aseptica para experimentos posteriores basados en el cultivo de celulas como se reporto recientemente. La mayorfa de las etapas de preparacion fueron las mismas descritas anteriormente con las siguientes modificaciones. Se mezclo el polvo de MA con el regulador PBS frfo sin inhibidores de proteasa en proporcion 1:1 (g/ml). Se centrifugo la mezcla a 48.000 x g a 4°C durante 30 min. El sobrenadante se denomino como Extracto P.
Se disolvio el Extracto P (preparado en PBS) en mezcla de CsCl/guanidina HCl 4 M a la densidad inicial de 1,35 g/ml, y se centrifugo a 125.000 x g durante 48 h a 15°C. Se recolectaron un total de 15 fracciones (0,8 ml/fraccion) desde la parte superior hasta la parte inferior de cada tubo. Ademas de la densidad, se midio la concentracion de protefnas y HA en cada fraccion mediante el ensayo de protefnas BCA y el kit de ensayo cuantitativo de HA, respectivamente. Se reunieron las fracciones # 8-15, que contenfan HA pero no protefnas detectables, se ajusto con CsCl/guanidina HCl 4 M a la densidad inicial de 1,40 g/ml, se centrifugo, y se fracciono en la misma forma descrita anteriormente. Se reunieron las fracciones # 3-15, que contenfan HA pero no protefnas detectables, y se dializaron contra agua destilada para eliminar CsCl y guanidina HCl. Se mezclo el dializado con 3 volumenes de etanol al 95% (v/v) que contenfa 1,3% (p/v) de acetato de potasio a 0°C durante 1 h. Despues de centrifugacion a 15.000 x g, se lavo el sedimento con etanol al 70% (v/v) y se centrifugo. Se seco el sedimento brevemente al aire, se almaceno a -80°C, y se denomino como el complejo HC^HAn.
Ejemplo 3 - Caracterizacion bioqufmica del complejo covalente HC^HA y su asociacion con TSG-6 en AME
Se obtuvo membrana amniotica de tres donantes distintos. Se extrajo la membrana amniotica secuencialmente con Reguladores A, B, y C, que consistfan de concentraciones crecientes de sal (NaCl 0,15 M, NaCl 1,0 M, y guanidina HCl 4 M, respectivamente). Se utilizaron entonces el ensayo cuantitativo de HA basado en ELISA y el ensayo de protefna BCA para medir los niveles de HA y de protefna de estos 3 extractos.
El resultado mostro que HA estaba presente en todos, pero era en su mayorfa (mas de 70%) extrafdo por el Regulador A en el Extracto A soluble en agua, asf como en AME, dando como resultado una proporcion mucho mayor de HA/protefna, y tenia un PM promedio de 6 x 106 Daltons (Da).
Ya que el inhibidor inter-a (IaI) es un inhibidor natural de HAasa, se confirmo la presencia de IaI en estroma de MA por inmunocoloracion.
La transferencia tipo Western mostro que el IaI purificado (Fig. 1B, carril 2) consistfa de una banda principal a -250 kDa, que representa el IaI intacto, y varias bandas con PM mas pequenos, que son presumiblemente productos de degradacion del IaI. Sin tratamiento (Ninguno), el Extracto A contenfa una banda correspondiente a IaI, pero tambien tenia una banda de APM, que como se muestra a continuacion era un complejo formado por HA de APM y HC de IaI (complejo HC^HA), que no pudo entrar al gel debido a su gran tamano, y otras dos bandas principales de 75 kDa
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(correspondientes a una HC libre) y de 120 kDa (que consiste de una HC acoplada covalentemente ya sea a la bikunina o a TSG-6) (Fig. 1B, carril 3). Se observaron resultados similares en el Extracto C (Fig. 1B, carril 5), pero no en el Extracto B (Fig. 1B, carril 4). Para caracterizar mejor al complejo HC^HA, se utilizo HAasa para digerir HA en pequenos fragmentos para que HC pudiera entrar en el gel. La digestion con HAasa (Fig. 1b, carriles 6-8) eliminaron completamente un complejo HC^HA retenido en el pozo para producir una banda de HC de 75 kDa en los Extractos A, B y C. Tambien se utilizaron NaOH 0,02 N durante 1 h para hidrolizar cualquier enlace ester formado entre HC y HA, y se observo que tal tratamiento causo una gran reduccion de las bandas inmunorreactivas de lal, con la excepcion de la 120 especie de 120 kDa, y aumento dramaticamente la intensidad de la banda de HC de 75 kDa. (Fig. 1B, carriles 9-11).
Se encontro un resultado similar en AME preparado por centrifugacion a baja velocidad (15.000 x g, L) o a alta velocidad (48.000 x g, H) centrifugacion (Fig. 1D).
Ejemplo 4 - Purificacion bioqufmica del complejo HC^HA de AME
Se utilizaron columnas de centrifugacion Microcon con un corte de PM de 30, 50, o 100 kDa (Millipore, Billerica, MA) para obtener un "filtrado" y un "retenido" de AME. Se observo que se suprimio significativamente la actividad promotora de TGF-p1 por el retenido, pero no por el filtrado, de estos tres cortes de PM de hasta 100 kDa. Este resultado sugiere que se retuvo la actividad supresora en el complejo de APM mayor a 100 kDa.
Para probar esta hipotesis, se purifico un complejo HC^HA sometiendo AME a dos rondas sucesivas de ultracentrifugacion con CsCl en presencia de guanidina HCl 4 M con la densidad inicial de 1,35 g/ml y 1,40 g/ml, respectivamente.
Despues de ultracentrifugacion, se subdividio cada tubo en un total de 15 fracciones (desde baja densidad hasta alta densidad) y supervisado por el ensayo cuantitativo de HA con base en ELISA y el ensayo de protefna BCA para HA y los contenidos de protefna, respectivamente. Se agruparon las fracciones que contenfan HA, pero no las protefnas de estas dos rondas. Como resultado, se reunieron las fracciones # 8-15 de la primera ronda antes de someterlas a la segunda ronda. Del mismo modo, se reunieron las fracciones # 4-15 de la segunda ronda y se las denomino como "complejo HC^HA purificado".
En comparacion con AME, que comenzo con 1.370 pg de protefna y 62 pg de HA por ml, el complejo HC^HA purificado no contenfa protefnas detectables. Incluso si se lo concentro 10 veces, el complejo HC^HA purificado aun no contenfa protefnas detectables mediante el ensayo de protefna BCA. A juzgar por el lfmite de deteccion del ensayo de BCA de 25 pg/ml, se estimo que nuestra purificacion bioqufmica resulto en al menos una purificacion de 550 veces.
El analisis en gel de agarosa confirmo que HA en complejo HC^HA purificado era de especies de APM, tenfan un PM promedio mayor a 1 x 106 Da (Fig. 4C). Se concentro Hc^HA purificado 20 veces antes de cargarlo en SDS-PAGE. La posterior coloracion con azul de Coomassie confirmo que excepto por la banda visible correspondiente a HC del individuo (75-80 kDa), habfa pocas bandas de protefna visibles en complejo HC^HA purificado (Fig. 4D). La identidad de esta banda de protefna de HC se confirmo adicionalmente mediante analisis de transferencias tipo Western (Fig. 4E). Se detecto el complejo HC^HA purificado en el pozo (incapaz de entrar en el gel debido a su APM junto con HA) (consultar las FIG. 4D y 4E), pero desaparecieron por completo despues de la digestion con HAasa y parcialmente por tratamiento con NaOH. Mientras tanto, la intensidad de la banda de Hc (75-80 kDa) se mejoro notablemente, ya que fue liberado de HA de APM o porque se rompio el enlace ester formado entre HC y HA, respectivamente (Fig. 4E).
El analisis de la transferencia tipo Western con un anticuerpo anti-TSG-6 no detecto ninguna TSG-6 en la preparacion del complejo HC^HA purificado.
Ejemplo 5 - Reconstitucion in vitro del complex HC^HA (HC^HArc)
Para definir aun mas la funcion biologica del complejo HC^HA purificado, se reconstituyo el complejo HC^HA in vitro utilizando tres componentes definidos incluyendo HA de APM (HealonMR, Advanced Medical Optics, CA), IAI (purificado por nuestro laboratorio) y TSG-6 (amablemente proporcionados por el Dr. Anthony J Day).
HABP (protefna de enlace a HA) se entrecruza con una placa de 96 pozos Covalink-NH. En resumen, las placas Covalink-NH (NUNC, Placerville, NJ) se esterilizan y se secan en alcohol al 70% durante 2 h antes de anadirles 50 pl de 0,184 mg/ml de sulfo-NHS (Pierce, Rockford, IL) en H2O destilada que contiene 0,04 mg/ml de HABP (Seikagaku, Corporation, Tokio, Japon) por 96 pozos. El entrecruzamiento se realizo mediante la adicion de 1 pl de 0,123 mg/ml de 1-etil-1-3-(3-dimetilaminopropil)carbidodiimida (EDAC) en H2O destilada por pozo. La placa se incuba durante la noche a 4°C o durante 2 horas a 23°C antes de remover la solucion de acoplamiento, y se lavo 3 veces con PBS que contenfa NaCl 2 M y MgSO4 50 mM seguido por 3 lavados con PBS.
Para determinar la capacidad maxima de enlazamiento a HA, se usaron placas entrelazadas con HABP inmediatamente mediante la adicion de 50 pl de 1,5 a 200 pg/ml de HA de APM (> 4 x 106 Da, Advanced Medical Optics, Santa Ana, CA) en PBS con MgCh 5 mM con o sin 40 pg/ml de lal humano (purificado por nuestro laboratorio) y/o 6 pg/ml de TSG-6 recombinante humana (proporcionada por el Dr. AJ Day). La mezcla se incubo a 25°C durante 24 h, y se remueve el
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componente no enlazado por lavados con PBS 4 veces. Se cuantifico HA enlazado mediante el mismo kit de HA y se lo sometio a digestion con HAasa o tratamiento con NaOH antes de la transferencia tipo Western.
A continuacion, se anaden 50 pl de concentraciones seriadas de 1,5 a 200 pg/ml de HA solo de APM (▲) o con concentracion adicional de 40 pg/ml de IaI solo (■) o ambos 40 pg/ml de IaI y 6 pg/ml de TSG-6 (•) (Fig. 5A).
Despues del lavado, el ensayo cuantitativo de HA basado en ELISA mostro que la cantidad de HA enlazado se redujo significativamente cuando se anade con IaI, pero aumenta significativamente cuando se anade tanto con IaI como con TSG-6. Este resultado es consistente con la nocion de que la adicion de IaI solo podrfa interferir con el enlazamiento de HA con HABP, mientras que la adicion de TSG-6 facilita el entrecruzamiento entre HA y IaI, promoviendo, por lo tanto, el enlazamiento con HABP.
El resultado anterior tambien indico que en la reconstitucion in vitro del complejo que contiene HA sobre una superficie plastica inmovilizada se optimiza alcanzando una capacidad de enlazamiento del 100% cuando se utilizaron 25 pg/ml de HA de APM (Fig. 5A).
Con base en los datos anteriores, se aplico el mismo volumen de 50 pl de 25 pg/ml de HA de APM a cada pozo de las condiciones anteriores (Fig. 5A). Despues de un extenso lavado para eliminar los componentes no enlazados, se sometio cada pozo que contenfa el HA enlazado a 50 unidades/ml de digestion con HAasa o tratamiento con NaOH 0,05 N como se menciono anteriormente, y se solubilizaron en el regulador de muestras de Laemmli para la transferencia tipo Western con un anticuerpo anti-Ial. En comparacion con IaI (Fig. 5B, carril 2) y HA de APM solos (Fig. 5B, carril 3), IaI intacto, pero no sus fragmentos degradados, estaba presente en los pozos recubiertos con HABP/HA y retenido despues de un lavado extensivo (Fig. 5B, carril 4). Como era de esperar, no habfa banda inmunorreactiva de Ial donde se anadio HA con TSG-6 sola (Fig. 5B, carril 5).
Es importante destacar que, cuando se incubaron juntos HA, IaI, y TSG-6 (Fig. 5B, carril 6), se observo una banda adicional de APM en la parte inferior del pozo de carga mientras que se redujo la intensidad de la banda de IaI, presumiblemente porque algunos IaI habfa sido consumidos en la transferencia de HC a HA de APM por TSG-6. Esta banda de HC^HA y IaI fueron eliminados por digestion con HAasa (Fig. 5B, carril 10) o tratamiento con NaOH (Fig. 5B, carril 14), resultando en la liberacion (aparicion) de una banda de HC de ~75-80 kDa.
Por comparacion, se digirio IaI intacto (Fig. 5B, carril 4) mediante HAasa en al menos dos bandas, incluyendo una banda de 120 kDa de mayor PM y una banda de ~75-80 kDa, donde la primera probablemente corresponda a un complejo HC^bikunina enlazado por sulfato de condroitina ya que pudo ser escindido por NaOH (Fig. 5B, carril 12), pero resistente al tratamiento con hialuronidasa (Fig. 5B, carril 8).
Estos datos verificaron que un complejo HC^HA podrfa ser efectivamente reconstituido in vitro a partir de HA y IaI en presencia de TSG-6. Una vez que se formo el complejo, TSG-6 no estaba covalentemente asociada en este complejo, ya que puede ser lavada, un hallazgo que fue apoyado por la transferencia tipo Western utilizando un anticuerpo anti- TSG-6.
Ejemplo 6 - Acciones antiinflamatorias y anticicatrizantes del complejo HC^HA purificado a partir de AME o por reconstitucion in vitro
Para las celulas RAW264.7 macrofagos de raton, el complejo HC^HA purificado a partir de AME redujo la propagacion de las celulas y aumento el redondeo de las celulas tan pronto como 2 horas despues de la introduccion al medio. El ensayo de MTT mostro que el complejo HC^HA purificado a partir de AME disminuyo significativamente la viabilidad celular mas que HA de aPm o AME solos (P = 0,002 y 0,02, respectivamente) (Fig. 7).
Para confirmar ademas que dicha actividad inhibidora sobre la viabilidad de los macrofagos residfa en el complejo HC^HA, se comparo el complejo HC^HA purificado a partir de AME (denominado HC^HA nativo o HC^HAn) con aquel reconstituido in vitro (HC^HArc; vease mas arriba) usando el ensayo de MTT de macrofagos.
En comparacion con el control cultivado en la placa recubierta con HABP (Ctrl), la adicion de HA solo de APM (HA) y la adicion de HA de APM, ya sea con 40 pg/ml de IaI (HA/Ial) o 6 pg/ml de TSG-6 (HA/TSG-6) no provoco ninguna diferencia significativa en la viabilidad de los macrofagos (P = 0,30, 0,19, y 0,08, respectivamente) (Fig. 6A).
Por el contrario, tanto HC^HArc como HC^HAn redujeron significativamente la viabilidad de los macrofagos (P = 0,0003 y 0,007, respectivamente, Fig. 6A), mientras que HC^HArc y HC^HAn mostraron un actividad inhibidora similar (P = 0,64, Fig. 6A).
Para determinar si HC^HAn y HC^HArc ejercieron una accion anticicatrizante similar, se sembraron 3 x 104/ml de fibroblastos corneales humanos, que habfan sido transfectados con adenovirus que contenfa o bien promotor TGF-p1 - luciferasa o CMV-p-gal durante 48 h antes de ser sometidos al ensayo de actividad promotora de TGF-p1. En comparacion con el control (Ctrl), no se suprimio significativamente la actividad promotora de TGF-p1 por HA, HA/Ial, o
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HA/TSG-6 (P = 0,07, 0,06 y 0,10, respectivamente, Fig. 6B). Por el contrario, tanto HC^HArc como HC^HAn mostraron una supresion significativa (P = 0,004 y 0,005, respectivamente, Figura 6B).
Nuevamente, el grado de supresion de la actividad promotora de TGF-p1 ejercida por HC^HAn no fue significativamente diferente de HC^HArc (P =0,20). El mismo resultado se obtuvo mediante la adicion de estos componentes como una solucion en el pozo (sin estar ligados a la placa entrecruzada con HABP).
Ejemplo 7 - HA en AM se enlaza covalentemente con las HC de IaI
Para investigar si IaI se enlaza covalentemente con HA de APM en extractos de MA, se utilizo ya sea HAasa para digerir HA en pequenos fragmentos (que correrfan en SDS-PAGE) o NaOH debil para hidrolizar cualquiera de los enlaces ester entre las He y HA. HA de APM en estos extractos fue digerido completamente por 20 unidades/ml de HAasa a 37°C durante 2 h, pero no se hidroliza por NaOH 0,2 N a 25°C durante 4 h. Sin embargo, se encontro la cantidad de protefnas totales visualizadas por coloracion con azul de Coomassie de los Extractos A, B y C despues de que el tratamiento con NaOH 0,2 N parecfa ser menor que aquellos sin tal tratamiento.
Para optimizar el tratamiento con NaOH a fin de no causar la hidrolisis de la protefna, se sometio el Extracto A a una gama de concentraciones de NaOH a 25°C durante 1 h. En forma similar a lo que se habfa reportado, IaI purificado (Fig. 1A, carril 2) produjo una banda principal a ~250 kDa cuando se analizo mediante una transferencia tipo Western, que representa IaI intacto. Tambien se observaron otras bandas con PM mas pequenos, que son presumiblemente productos de degradacion de IaI.
El Extracto A no tratado contenfa una banda correspondiente a IaI, pero tambien tenia una banda de APM que aun permanecen en el pozo con la carga de gel y otras dos bandas grandes de 75 y 120 kDa (Fig. 1A, carriles 3 y 4). La banda de APM probablemente es de componentes de IaI enlazados covalentemente con HA de APM, donde su tamano les impide entrar en el gel. La banda de 75 kDa se presume que corresponden a una HC libre y la banda de 120 kDa es probable que sea una HC acoplada covalentemente ya sea a la bikunina o a TSG-6.
El tratamiento con NaOH 0,02 N causo una gran reduccion de las bandas inmunorreactivas de IAI, con la excepcion de la especie de 120 kDa, y se incremento dramaticamente la intensidad de la banda de 75 kDa y la aparicion de una banda de 80 kDa, donde es probable que las especies de 75 y 80 kDa correspondan a HC1 y HC2, respectivamente.
El tratamiento con NaOH 0,05-0,2 N condujo a la eliminacion completa de todas las bandas, excepto para las bandas de 75 y 80 kDa, donde las mayores concentraciones de NaOH tenian una intensidad algo menor de estas bandas, presumiblemente debido a la hidrolisis de la protefna. Por lo tanto, en los experimentos subsiguientes se escogio NaOH 0,05 N para el tratamiento de extractos de mA y se compararon los resultados con los digeridos con HAasa.
La coloracion con azul de Coomassie mostro que la carga de la muestra de los Extractos A, B y C fue similar para las muestras no tratada (ninguno), digerida con HAasa (HAasa), y tratada con NaOH (NaOH). Por lo tanto, se usaron luego las mismas muestras para el analisis de transferencia tipo Western con el anticuerpo anti-Ial. Como se muestra en la Fig. 1B, el Extracto C no tratado (carril 5) tenia perfiles de banda similares a los del Extracto A descrito anteriormente (Fig. 1A, carril 3 y Fig. 1B, carril 3), mientras que no se detecto IaI en el Extracto B (carril 4). La digestion con HAasa (carriles 6-8) elimino por completo la banda de APM (retenida en el pozo) en los Extractos A y C, lo que sugiere que esta banda es un complejo IaI-HA de APM. Para los Extractos A y C, se incremento la banda de 75 kDa despues de la digestion con HAasa, por lo que tambien se hizo visible en el Extracto de B. Estos resultados demostraron claramente que las HC y HA estaban enlazados y presentes tanto en los extractos solubles en agua (Extractos A, B y P) como en los insolubles en agua (Extracto C).
Notablemente, las bandas de 250 y 120 kDa se volvieron mucho mas agudas y mas intensas despues de la digestion con HAasa (Fig. 1B, carriles 6 y 8) lo que indica que algunas de estas especies pueden ser liberadas de HA.
Debido a que tanto la banda de 250 como de 120 kDa fueron completamente eliminadas por NaOH 0,05 N (Fig. 1A), lo que resulta en el mayor aumento de la banda de 75 kDa (la banda de 80 kDa era diffcil de observar en la mayorfa de los puntos de tiempo) (Fig. 1B, carriles 9-11), esto indicaba que las bandas de 250 y 120 kDa son complejos de las HC y otros componentes enlazados por enlaces ester. Estos resultados son, por tanto, consistentes con la conclusion de que la especie de 250 y de 120 kDa corresponden a IAI intacto y un complejo que contiene HC (por ejemplo, HC^bikunina o TSG-6^HC), respectivamente.
Ejemplo 8 - Supresion de TGF-p por Extracto isotonico de MA
Para probar si el Extracto P suprime la transcripcion de TGF-p, se utilizo un ensayo promotor de TGF-p1 basado en la luciferasa. La supresion de la actividad promotora de TGF-p1 en fibroblastos corneales humanos era dependiente de la dosis en el rango de concentraciones de protefna de 0,2 a 125 pg/ml de Extracto P (Fig. 3A). Un valor tan bajo como 1 pg/ml de protefnas suprimio significativamente la activacion promotora de TGF-p1 y hubo una supresion mayor al 50%, cuando se anadieron 125 pg/ml de protefnas (que contenfa ~5 pg/ml de HA) (p = 0,008). Por el contrario, 1 pg/ml del HA de APM de control (grado medico) no suprimio significativamente la activacion promotora de TGF-p1 (P = 0,20, Fig. 3B).
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No se logro una supresion significativa de la actividad promotora por 5, 25, y 125 pg/ml de HA de APM (P = 0,10, 0,09, y 0,06, respectivamente, Fig. 3B).
A fin de probar adicionalmente si esta actividad estaba relacionada con HA solo o con el complejo HA-protefna, se digirieron tanto HA de APM como el Extracto P con HAasa o se calento a 95°C durante 10 min antes de la prueba. Los resultados mostraron que ambos tratamientos eliminaron significativamente el efecto supresor del Extracto P (P = 0,06 y 0,12 para HAasa y el tratamiento termico, respectivamente, Fig. 3C y 3D). Por el contrario, no causan un cambio significativo en el grupo tratado con HA de APM (P = 0,31 y 0,70, para HAasa y el tratamiento termico, respectivamente, Fig. 5C y 5D). Estos datos indicaron que tanto HA como las protefnas en el extracto de P eran necesarias para la supresion de la actividad promotora de TGF-B1.
Ejemplo 9 - Caracterizacion y validacion de acciones antiangiogenicas de un complejo HC^HA
AME se prepara como se describio anteriormente. Se purifica el complejo HC^HA a partir de la AME usando dos rondas de ultracentrifugacion en CsCl y guanidina HCl 4 M. aMe y el complejo Hc^HA se diluyen en serie.
Experimentos 1A
La potencia antiangiogenica relativa de AME y HC^HA se compara con base a los mismos pg/ml de HA en los siguientes 4 ensayos in vitro usando HUVEC cultivadas en el medio de crecimiento de celulas endoteliales complementado con 2% de FBS, 0,1 ng/ml de EGF, 1 pg/ml de hidrocortisona, y 1 ng/mL de bFGF, con o sin 1 a 100 pg/ml de VEGF: (1) Actividad de MMP con base en el ensayo del zimogeno utilizando sustratos de MMP tales como colageno, fibrinogeno, o gelatina, (2) Proliferacion con base en la morfologfa, el ensayo de MTT, la marcacion con BrdU y el ensayo de Vida & Muerte; (3) Migracion con base en la quimiotaxis, y (4) Formacion de tubos de HUVEC en Matrigel.
Experimento 1B
Despues, en el Experimento # 1B, la accion antiangiogenica del complejo HC^HA purificado se examina en los siguientes ensayos in vivo: (1) Ensayo de la membrana corioalantoidea (CAM) de pollito, (2) Ensayo in vivo en Matrigel en el abdomen inferior derecho de ratones hembra, y (3) Ensayo de angiogenesis de la cornea. Para estos tres ensayos in vivo, se inducira la angiogenesis por impregnacion de bFGF o VEGF o ambos ya sea en Matrigel o en ELVAX (copolfmero de vinilo - etileno) con o sin un complejo HC^HA a una concentracion determinada en el Experimento # 1A.
Tanto en el Experimento # 1A como en el Experimento # 1B, se comparara la accion antiangiogenica de un complejo HC^HA con aquel del control de HA de APM de grado medico (Healon, Advanced Medical Optics, CA) con los mismos pg/ml de HA, y aquellos de PBS como control negativo. Se usara un mfnimo de tamano de muestra de 5 para los analisis estadfsticos.
Ejemplo 10 - Exploracion de como un complejo HC^HA interrumpe la senalizacion mediada por receptores de HA y VEGFR
Para ambos experimentos a continuacion, se comparara la accion antiangiogenica de un complejo HC^HA con la de HA de APM.
Experimento # 2A
Se incuban previamente celulas HUVEC con anticuerpos para CD44 (Cat. # 16-0441, eBioscience, San Diego, CA), RHAMM, HARE, o TLR mientras se utilizan sus respectivos anticuerpos de isotipo como control. Se evaluaran similarmente la morfologfa, viabilidad, proliferacion y muerte de HUVEC como se describe en el Experimento # 1B y se hizo la comparacion entre el control de PBS, HA de APM, y un complejo HC^HA.
Experimento # 2B
Para un marco de tiempo de 15 min a 2 h con o sin adicion de VEGF, del cual se ha determinado la concentracion optima en el Experimento # 1B, se recolectan lisados de celulas HUVEC y se someten a analisis de transferencias tipo Western utilizando anticuerpos especfficos para ERK, PBK y Akt fosforilados o totales utilizando la histona 3 como control de carga.
Ejemplo 11 - Validacion de la potencia del complejo HC^HA purificado para ejercer acciones antiinflamatorias y anticicatrizantes in vivo
La potencia del complejo HC^HA en ejercer acciones antiinflamatorias y anticicatrizantes se demuestra por el ensayo de MTT de macrofagos con o sin activacion por 200 U/ml de IFN-y en DMEM con ITS, asf como por el ensayo promotor de TGF-p1 utilizando fibroblastos corneales humanas cultivados en DMEM/FBS, respectivamente. Estos resultados se comparan con los controles positivos incluyendo AM y AME criopreservados, y los controles negativos, incluyendo plastico y HA de APM solo.
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Ademas, la potencia relativa entre el complejo HC^HA y AME basado en los mismos pg/ml de HA se determina sometiendo sus diluciones en serie a estos dos ensayos que utilizan HA de APM solo como control negativo. La concentracion mas apropiada del complejo HC^HA basado en los pg/ml de HA se utiliza a continuacion para validar su potencia antiinflamatoria mediante la correlacion de su ensayo de MTT con otros ensayos de muerte/apoptosis de macrofagos tales como el ensayo de VIDA/MUERTE (Molecular Probes), tincion nuclear Hoechst-33342 y el kit de deteccion ELISAPLUS (Roche) de muerte celular. Ademas, estos resultados se correlacionan con la activacion de macrofagos juzgada por la expresion en la membrana de MHCII, CD80 y CD86, con el analisis de transferencias tipo Western de expresion de Cox-2 (Fig. 12), y con la relacion de PGE2/PGD2 (Fig. 13), y los niveles antiinflamatorio (IL-10) y proinflamatorio (IL-I, IL-6, y las citoquinas TNF-a) por ensayos ELISA. Del mismo modo, la potencia anticicatrizante juzgada por la supresion de la actividad promotora de TGF-p1 se correlaciona con el cambio fenotfpico de queratocitos humanos o celulas mesenquimales estromales amnioticas humanas en fibroblastos y miofibroblastos, como se juzga por la expresion de keratocano, Factina, fibronectina ED-A, S-100A4, y a-SMA usando inmunocoloracion y analisis de transferencias tipo Western, y mediante el control de la senalizacion mediada por Smad usando inmunocitolocalizacion de los Smad 2, 3 y 4.
Ejemplo 12 - Comparativa del complejo HC^HA extrafdo de membrana amniotica y de membrana corionica
Se extrajo complejo HC^HA de la membrana corionica utilizando los mismos protocolos utilizados para la extraccion de complejo HC^HA de la membrana amniotica.
| Donante 1 | Donante 2 | Donante 3
Promedio
Rendimiento del extracto
Peso humedo (g)
10,0 17,7 29,1 59,0 38±18
Peso del polvo (g)
5,5 11,4 19,2 54,6 30±21
Perdida de tejido (%)
45 36 34 7 31±16
PBS (ml)
11,1* 11,4 19,2 54,6 36±25***
Extracto (ml)
12,0* 12,5 24,0 63,0 44±28***
Protefna & HA
Antes de la purificacion
Concentracion de protefna (pg/ml de extracto)
1884 1764 1828 1826±60
Protefna total (pg)
23555** 42343 115201 78772±51519***
Concentracion de HA (pg/ml de extracto)
0,90 0,96 0,92 0,93±0,03
HA total (pg)
11,3** 22,9 57,7 40,3±24,6***
Relacion HA:Protefna
1:2093 1:1868 1:1987 1:1982±113
Despues de la purificacion
Concentracion de protefna (pg/ml de extracto purificado)
172 62 136 123±56
Protefna total (pg)****
825,4 297,6 650,7 591±269
HA (pg/ml de extracto purificado)
0,59 - 0,84 0,72±0,02
HA total (pg)****
2,85 - 4,02 3,43±0,83
Relacion HA:Protefna
1:292 - 1:162 1:227±93
Factor de pureza de la protefna (pg/ml de Extracto) / (pg/ml de extracto purificado)
11 28 13 17±8
Rendimiento de HA (%) (HA total despues de purificacion / HA total antes de purificacion)
25,2 7,0 16,1±12,9
Rendimiento total de HA/ml de CHE (pg/ml de CHE)
0,26 - 0,37 0,31±0,08
Rendimiento total de HA/corion (pg/extracto total (ml) de corion total)
6,36 23,09 14,7±11,8
Tabla 2: Rendimiento del extracto, contenido de protefna & HA para 3 donantes con corion entero excepto para el donante 1, del cual se incluyo una parte. Los datos con respecto a HA para el donante 2 fueron excluidos debido a la perdida de la muestra como resultado de la rotura de un tubo de dialisis. El volumen de extracto muestreado para cada uno de los donantes para la purificacion es de 10,97 ml).
*Se anadio PBS al Extracto en proporcion de 1:2 (Extracto:PBS). Esta porcion de extracto fue excluida del resto de las mediciones.
**Calculado con base en una porcion de extracto de 12,5 ml
***Promedio con base en el donante 2 y el donante 3 unicamente
****Con base en el volumen final del extracto purificado que es de 4,8 ml por donante
Hubo una perdida significativa de tejido durante la pulverizacion (31±16%) y una perdida adicional de tejido durante la homogeneizacion para reducir el tejido humedo en la forma en polvo y del extracto posteriormente. Una alternativa es utilizar un mezclador y un homogeneizador para una preparacion a gran escala de mA & lisado de gelatina y extracto de
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placenta.
Extracto Extracto purificado
Protefna (pg/ml) HA (pg/ml) Relacion de HA:Protefna Protefna (pg/ml) HA (pg/ml) Relacion de HA:Protefna Rendimiento de HA (pg/ml de extracto) Rendimiento de HA (pg/ml de extracto total (ml) de MA/CH total)
AME
214±36 28,6±5,3 1:7,5 Indetectable 41,2±1,8 - 72,1 ~2163*
CHE
1826±60 0,93±0,03 1:1963 123±56 0,72±0,02 1:227±93 0,31±0,08 14,73±11,83
Tabla 3: Protefna promedio & concentracion de HA y relacion de CHE en comparacion con AME antes y despues de la purificacion.
(1) * Calculado con base al volumen de extracto de AM ~30 ml (el rendimiento de HC^HA purificado a partir de un MA- Hua He)
A partir de la Tabla 3, se observa que el contenido de protefna en CHE es significativamente como el de AME tanto en el extracto como en el extracto purificado. Por el contrario, el contenido de HC^HA (medido por el contenido de HA) es significativamente menor en CHE comparado con AME antes y despues de la purificacion. El bajo porcentaje de rendimiento de HA (6-25%) como se observa en la Tabla 1 se debe al alto contenido de protefna despues de ultracentrifugacion lo que resulta en un pequeno volumen final de fraccion reunida (4,8 ml por donante). La alta concentracion de protefna en CHE despues de las 2 rondas de ultracentrifugacion puede ser debida al alto contenido de protefnas antes de la purificacion con relacion a AME (~8,5 veces) y puede ser necesaria una tercera ronda de ultracentrifugacion para aumentar la pureza. Otra razon para las protefnas que permanecen presentes incluso despues de dos rondas de ultracentrifugacion con CsCl y guanidina es que puede haber un fuerte enlazamiento entre las protefnas y los complejos HC^HA. Estas protefnas pueden tener potencialmente un papel importante en la promocion de la formacion y/o la regulacion de la funcion del complejo HC^HA. Actualmente estamos en el proceso de identificacion y caracterizacion de estas protefnas
Ejemplo 13: Curva de dosificacion de ELISA con BrdU para HC^HA (AME) y HC^HA (CHE) con recubrimiento de fibronectina y VEGF.
Se recubrieron placas de 96 pozos (n = 3) con fibronectina. Se siembran luego HUVEC a razon de 4000 celulas/pozo de HC^HA en los pozos previamente recubiertos durante 48 horas (vease la tabla mas abajo). Se incluyen dos grupos (n = 3) con 10 ng/ml de VEGF (VEGF viejo (fecha de recepcion) o VEGF nuevo (fecha de recepcion: 3/10/10)) anadido de forma simultanea durante la siembra. Se anade la etiqueta de BrdU durante las ultimas 6 horas del periodo de cultivo. ELISA con BrdU se realizo como se describe en H-095.
Concentracion de HA (pg/ml)
HCHA (AME)
25 12,5 5 1 0,5 0,25 0,05 0,025 0,01 0,005
HCHA (CHE)
- - - 1 0,5 0,25 0,05 0,025 0,01 0,005
Control (Medio)
0
VEGF viejo
0
VEGF nuevo
0
Tabla 4: Concentraciones de HA para HC^HA (AME) y HC^HA (CHE) para establecer una curva de dosis.
A las 48 horas, las celulas de control son en su mayorfa en forma de huso y la densidad celular se ha incrementado significativamente desde las 24 horas. No se observa ninguna diferencia entre el grupo de VEGF nuevo y el grupo de control. La densidad celular en el grupo de VEGF viejo parece ser notablemente inferior al de control. En los grupos HC^HA (AME) y HC^HA (CHE), la densidad celular es significativamente menor en las muestras de 25 pg/ml y 1pg/ml, respectivamente, y aumenta al disminuir la concentracion de HC^HA. No se puede observar ninguna diferencia entre las celulas en el grupo de control y las celulas en los grupos con concentracion de HC^HA por debajo de 1 pg/ml para HC^HA (AME) y 0.05 pg/ml para HC^HA (CHE). Comparadas a las 24 horas, las celulas tratadas con HC^Ha (aMe y CHE) se han vuelto mas planas.
Conclusiones:
ELISA con BrdU es mas sensible y mejor para ilustrar los cambios dependientes de la dosis que los cambios morfologicos.
La inhibicion dependiente de la dosis de la proliferacion por HC^HA (CHE) y HC^HA (AME) sigue una curva logarftmica.
La dosis efectiva mas baja de HC^HA (CHE), como la medida por ELISA con BrdU esta entre 0,25 y 1 pg/ml, mientras que la de HC^HA (AME) esta entre 1 y 5 pg/ml.
HC^HA (CHE) es 25 veces mas potente que HC^HA (AME) de acuerdo con IC50 (3,0 versus 0,12), con base en la concentracion de HA.

Claims (6)

  1. 5
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    25
    Reivindicaciones
    1. Un metodo para producir un complejo HC^HA reconstituido (HC^HArc), que comprende
    a. proporcionar una mezcla de reaccion que comprende:
    . protefna de enlazamiento a HA (HABP) fijada a un soporte estacionario;
    1. hialuronano (HA);
    ii. HC1 y HC2 (cadena pesada 1 y cadena pesada 2) de IaI (inhibidor de tripsina inter alfa) aisladas de suero; y v. TSG-6; y
    b. incubar la mezcla de reaccion durante un perfodo de tiempo suficiente para producir un complejo HC^HA reconstituido.
  2. 2. Un metodo como el reivindicado en la reivindicacion 1, en donde se genera al menos una de HA, TSG-6 por una pluralidad de celulas en la reaccion de mezcla.
  3. 3. Un metodo como el reivindicado en la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2 que comprende ademas aislar y purificar el complejo HC^HArc.
  4. 4. Un metodo como el reivindicado en la reivindicacion 3, en donde el complejo HC^HArc se afsla por centrifugacion, filtracion, o una combinacion de los mismos.
  5. 5. Un metodo como el reivindicado en la reivindicacion 3, en donde el complejo HC^HArc se purifica por cromatograffa, filtracion en gel, centrifugacion, solubilidad diferencial, precipitacion con etanol, o una combinacion de los mismos.
  6. 6. Un metodo como el reivindicado en la reivindicacion 3, en donde el complejo HC^HArc se purifica por cromatograffa de afinidad.
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