CN109387593B - 急性髓细胞白血病化疗敏感性测评试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及急性髓细胞白血病化疗敏感性测评试剂盒及其应用。本发明提供了急性髓细胞白血病化疗敏感性测评标志物，联合患者血清月桂酰胺和白三烯B4二甲酰胺水平建立了急性髓细胞白血病化疗敏感性的预测模型，能够对急性髓细胞白血病化疗敏感性进行测评，实际准确率达到80％以上，检测速度快，成本低，可量化，创伤小，无痛，患者易于接受。本发明为临床预测急性髓细胞白血病化疗敏感性提供了科学有效的方法，有助于确立更合理的治疗方案，延长病人的生命，缓解病人的化疗痛苦。

Description

急性髓细胞白血病化疗敏感性测评试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种基于血清月桂酰胺和白三烯B4二甲酰胺的急性髓细胞白血病化疗敏感性测评试剂盒和检测方法。

背景技术

急性髓细胞白血病(Acute myeloid leukemia，AML)是一组异质性血液***恶性肿瘤。当前，AML的诱导化疗以蒽环类药物联合阿糖胞苷为主，去甲柔红霉素+阿糖胞苷(IA方案)是AML标准的诱导化疗方案。临床结果表明，该方案能够使大多数AML病人获益，症状得到明显缓解。然而，由于AML是一组异质性肿瘤，AML患者对药物的反应性也不尽相同，临床上经过IA方案化疗后，仍然有30％-40％的AML患者症状未有任何缓解。由于治疗没有针对性，耽搁了最佳化疗时期，是导致AML病人快速死亡的原因之一。因此，化疗前预测AML病人对IA方案药物治疗的敏感性，对延长AML患者的生命至关重要。

目前，寻找AML化疗敏感性的临床预测指标的研究相对较少。研究发现AML病人体内核小体DNA片段、骨髓微小RNA-335、血清乳酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、ABC转运蛋白、去甲柔红霉素和阿糖胞苷的药物代谢酶与AML患者的化疗敏感性存在一定的相关性。期刊《中国综合临床》，2007年第23期第7卷刊出的论文“CXC亚家族趋化因子受体-4在急性白血病中的表达及临床意义”，作者采用四色流式细胞仪检测了33例AL患者和7例正常对照者骨髓单个核细胞表面CX-CR4的表达情况，并分析了其与临床表现及疗效的关系，结果表明化疗敏感组CXCR4的表达低于耐药组(P＜0.05)，AL患者CXCR4的高表达预示白血病细胞对化疗不敏感，是判断预后的指标之一。期刊《临床血液学杂志》2013年第4期刊出的论文“CD4+CD25+调节性T细胞检测在急性髓细胞白血病中的临床意义”，作者选取AML患者41例和体检健康者16例，用流式细胞仪检测CD4+CD25+调节性T细胞占CD4+T细胞的比例，结果：AML患者外周血的CD4+CD25+调节性T细胞表达明显高于对照者(P<0.01)；AML组内，化疗耐药者(15例)的CD4+CD25+调节性T细胞表达显著高于化疗敏感者(14例)(P<0.01)；14例化疗敏感者中，缓解后复发者(4例)的CD4+CD25+调节性T细胞表达显著高于持续缓解者(10例)(P<0.05)，得出结论：CD4+CD25+调节性T细胞可能诱导免疫耐受，从而导致AML细胞的恶性增殖，影响白血病化疗的疗效，也可能是引起缓解患者复发的原因之一。然而现有技术中各指标预测的准确度仍然较低，缺乏切实可行的急性髓细胞白血病化疗敏感性测评方法。

综上，深入的研究与IA方案化疗反应性相关的分子标志物，对于AML患者的个体化治疗至关重要。由于肿瘤的发生、发展与代谢状态直接相关，并且机体基因和蛋白表达水平的微小差异，都将在代谢物水平上得到放大，因此通过研究代谢物的变化，寻找具有代表意义的生物标志物，可建立科学的预测模式，为AML患者化疗敏感性的预测带来契机。目前还未见以血清中代谢物为生物标志物，快速、准确预测急性髓细胞白血病化疗敏感性的相关报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种急性髓细胞白血病化疗敏感性测评标志物。

第一方面，本发明提供了一种用于急性髓细胞白血病化疗敏感性测评的试剂组合，所述的试剂组合包含检测急性髓细胞白血病化疗敏感性生物标志物血清水平的试剂，所述的急性髓细胞白血病化疗敏感性生物标志物仅为月桂酰胺和白三烯B4二甲酰胺。

作为一个优选例，所述的检测急性髓细胞白血病化疗敏感性生物标志物血清水平的试剂为月桂酰胺和白三烯B4二甲酰胺标准品。

作为一个优选例，所述的试剂组合还包含超高效液相色谱中作为流动相的试剂。

作为一个优选例，所述的超高效液相色谱中作为流动相的试剂包含甲酸质量含量为0.1％的甲酸水溶液和甲酸质量含量为0.1％的甲酸乙腈。

第二方面，本发明提供了所述的试剂组合在制备急性髓细胞白血病化疗敏感性测评试剂盒中的应用。

第三方面，本发明提供了一种急性髓细胞白血病化疗敏感性测评试剂盒，所述的试剂盒包含如上任一所述的试剂组合。

第四方面，本发明提供了一种生物标志物在制备急性髓细胞白血病化疗敏感性测评试剂或试剂盒中的应用，所述的生物标志物为月桂酰胺和白三烯B4二甲酰胺。

作为一个优选例，测评样本为患者血清。

作为一个优选例，使用的预测模型为：

其中W_月桂酰胺和W_{白三烯B4二甲酰胺}分别代表质谱检测的血清样本中月桂酰胺和白三烯B4二甲酰胺的峰面积，W_内标代表血清样本中加入的内标物质L-2-氯苯丙氨酸质谱检测的峰面积。

第五方面，本发明提供了一种非诊断和治疗目的的急性髓细胞白血病化疗敏感性测评方法，所述的方法是以月桂酰胺和白三烯B4二甲酰胺的血清水平作为生物标志物。

本发明优点在于：

本发明提供了急性髓细胞白血病化疗敏感性测评标志物，联合患者血清月桂酰胺和白三烯B4二甲酰胺水平建立了急性髓细胞白血病化疗敏感性的预测模型，能够对急性髓细胞白血病化疗敏感性进行测评，并具备以下优势：

1、实际准确率达到80％以上，显著高于现有技术中的其他诊断方法，也显著高于按本发明思路所构建的其他预测模型，包括月桂酰胺、白三烯B4二甲酰胺与其它一种、两种或几种标志物联合诊断的预测模型；

2、只要采集患者血清，质谱分析样品中血清月桂酰胺和白三烯B4二甲酰胺即可，创伤小，无痛，患者易于接受，检测速度快，成本低，可量化。

综上，可将检测血清月桂酰胺和白三烯B4二甲酰胺水平的试剂组成试剂盒，该试剂盒将有效解决目前临床急性髓细胞白血病化疗敏感性测评的难题，有助于确立更科学的治疗方案，延长病人的生命，缓解病人的化疗痛苦。

附图说明

图1为本发明实施例1中某一血清样本的UHPLC-Q-TOFMS代谢指纹图谱。

图2为本发明实施例1中完全缓解组与治疗失败组的主成分分析的三维得分图。

图3为本发明实施例1完全缓解组与治疗失败组的OPLS-DA得分图。

图4为本发明实施例1完全缓解组与治疗失败组的S-Plot图。

图5为本发明实施例2的受试者工作曲线。

图6为本发明实验例2的P值的分布图。

图7为本发明实施例3的受试者工作曲线。

图8为本发明实施例3的P值的分布图。

图9为模型A和F。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1化疗敏感性标志物的筛选

(1)病人信息及血清样本采集：54例初次诊断为AML、且无严重心、肝、肾功能障碍的AML患者(除M3型)收集于上海市徐汇区中心医院。AML患者采用去甲柔红霉素+阿糖胞苷治疗方案(IA方案)，即给予去甲氧柔红霉素8mg/m²/d静滴，第1-3天；阿糖胞苷100mg/m²/d静滴，第1-7天。完全缓解的AML患者再给予以高剂量阿糖胞苷为基础的联合化疗方案巩固治疗。根据治疗效果，将AML病人分为完全缓解组(complete remission,CR组)和治疗失败组(non-responders,NR组)。根据欧洲白血病工作组的急性髓细胞白血病诊断及疗效标准，完全缓解(CR)定义为经过化疗后患者白血病的症状和体征消失，外周血中性粒细胞绝对值≥1.0×10⁹/L，血小板≥100×10⁹/L，白细胞分类中无白血病细胞；骨髓象中原始及早幼(幼稚)细胞≤5％。治疗失败(NR)指经过化疗后骨髓象中原始及早幼(幼稚)细胞没有明显下降，或者第一轮诱导化疗后患者7天内死亡，或因化疗后骨髓发育不良导致死亡的患者。54例AML患者中经过诱导化疗后完全缓解(CR组)27例，治疗失败组(NR组)27例。在化疗开始前，采集受试者的血清于-80℃低温冰箱保存。

(2)血清样本预处理：化疗敏感性标志物的发现集的54例血清样本冻融后，各取100μL，分别加入400μL甲醇(含有12.5μg/ml L-2-氯丙苯氨酸，内标)涡旋1min，然后置于冰水浴中超声提取10min，4℃下14000g离心15min，吸取上清进样。

(3)样本质谱分析：对血清样本进行超高效液相色谱和质谱联用分析，液相色谱是Agilent1290Infinity液相色谱***，柱温40℃。色谱分离使用ACQUITY UPLC HSST3C₁₈column(2.1mm×100mm,1.7μm,Waters,Milford,MA)色谱柱。流动相：甲酸质量含量为0.1％的甲酸水溶液(A)，甲酸质量含量为0.1％的甲酸乙腈(B)，采用梯度洗脱，梯度洗脱条件：0～2min，5％B；2min～13min，5％～95％B；13min～15min，95％B。平衡色谱柱5min，流速400μL·min^-1，进样量为3μL。质谱为Agilent公司6530Accurate-Mass Q-TOFMS串联四极杆-飞行时间质谱仪。质谱采用正离子模式进行检测，检测参数：毛细管电压3500V、干燥气流速11L·min^-1、干燥气温度350℃、喷雾气压45psig、碎裂电压120V、Skimmer电压60V、数据采集范围质荷比(m/z)为50～1000，选取质荷比为121.0509和922.0098的内标离子作实时质量数校正，图1展示了某一血清样本1次进样分析后得到的血清代谢指纹图谱，横向坐标表示出峰时间，纵向坐标表示峰的相对强度。

(4)多元变量统计分析，筛选生物标志物：将样本质谱分析的原始数据(.d)经Agilent MassHunter Qualitative software软件转换为通用数据格式(.mzData)，并通过去同位素峰的处理。转换后的数据进一步通过XCMS数据处理软件，对AML患者血清代谢指纹图谱数据进行去噪音、质谱峰提取、反卷积处理、峰排列、对齐、合并、峰合并后开始列表去噪音、缝隙填补处理，得到各个离子峰的峰面积以及质荷比和保留时间等数据矩阵，并以内标L-2-氯苯丙氨酸峰面积进行各个离子色谱峰的归一化。根据CR组与NR组谱图的差异性比较，应用SIMCA-P统计软件(Version11.0)进行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)，并选择变量重要性因子对分类贡献最大的检测离子，这些离子对应的代谢物可被认为是AML相关的生物标志物。图2表示完全缓解组与治疗失败组经过主成分分析得到的三维得分图，图中每个点代表一个样本，图中可以看出二者具有一定的分离趋势，表明完全缓解组与治疗失败组化疗前血清代谢谱存在一定的差异。为进一步明确完全缓解组与治疗失败组化疗前血清代谢谱的差异，将血清代谢谱数据进一步进行正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)，图3是正交偏最小二乘法判别分析的得分图，完全缓解组与治疗失败组化疗前血清代谢谱明显的分成两大类，同时经过OPLS-DA分析得到S-Plot图(图4)，S-Plot图能够鲜明的突显出两组间差异最大的化合物，右上角和左上角的点(灰框内的变量点)是置信度和贡献度双高的化合物，这些检测离子贡献度最大，可被认为是完全缓解组与治疗失败组化疗前基础血清差异代谢物。

(5)标志物结构鉴定：对筛选出的标志物，使用Agilent MassHunter软件进行分子式预测，再结合二级质谱的碎片离子进行结构推导和标准品的确证，最终对筛选出的标志物进行结构鉴定。表1给出了鉴定的10种标志物。

表1完全缓解组与治疗失败组化疗前基础血清代谢差异研究中涉及的重要化合物

其中次黄嘌呤、苯丙氨酸、白三烯B4二甲酰胺、磷脂酰胆碱(14:1/14:1)、神经酰胺(d18:0/17:0)的水平，治疗失败组患者治疗前基础血清中的浓度明显低于完全缓解组病人，而癸烷酰胺、鞘氨醇、月桂酰胺、十六烷基二酸、油酸酰胺的水平，治疗失败组患者治疗前基础血清中的浓度明显高于完全缓解组病人。在它们区分治疗失败组与完全缓解组的效能分析中发现，只有代谢物月桂酰胺、白三烯B4二甲酰胺、神经酰胺(d18:0/17:0)三种代谢物的区分特异度在80％以上，然而，10种代谢物中没有一种代谢物区分两组的灵敏度在80％以上。

(6)预测模型的建立：由于AML是一种多种代谢通路***失调的复杂疾病，因此AML化疗也应该涉及多条代谢通路的调节。由此可见，联合不同代谢通路上的多种代谢物较比单独一种代谢物将具有更好的诊断效能。接下来，以这10种代谢物为候选标志物群，采用Logistic逐步回归分析发现，联合月桂酰胺和白三烯B4二甲酰胺两种代谢物，可建立AML病人化疗敏感性最优预测方程。这是采用Logistic回归分析联合月桂酰胺和白三烯B4二甲酰胺两种代谢物，建立的AML病人化疗敏感性的预测模型：

其中W_月桂酰胺和W_{白三烯B4二甲酰胺}分别代表质谱检测的血清样本中月桂酰胺和白三烯B4二甲酰胺的峰面积，W_内标代表血清样品中加入的内标物质L-2-氯苯丙氨酸质谱检测的峰面积。

实施例2化疗敏感性预测效能的验证

为了定量评价模型对AML治疗缓解组与AML治疗失败组的测评效能，根据Logistic回归分析建立一条受试者工作曲线(ROC曲线，图5)。本研究中ROC曲线的结果表明，由27例完全缓解AML患者和27例治疗失败的AML患者的两种诊断标志物的定量数据计算的ROC曲线下的面积达到了0.945，灵敏度达85.2％，特异度达88.9％，这些结果表明这两种诊断标志物的组合对AML患者化疗的敏感性预测具有较高的准确性。P值的分布图如图6所示，当达到最高的灵敏度(85.2％)和特异度(88.9％)时，模型P的最佳截断值等于0.4486，以0.4486为截断值，54例分析样品有47例(87.0％)能够准确的预测。

实施例3测评试剂盒及测评试剂盒的预测效果验证

本实施例的测评试剂盒包括测评试剂和预测模型，测评试剂包括月桂酰胺和白三烯B4二甲酰胺两种标志物的标准品，预测模型为：

其中W_月桂酰胺和W_{白三烯B4二甲酰胺}分别代表质谱检测的血清样本中月桂酰胺和白三烯B4二甲酰胺的峰面积，W_内标代表血清样品中加入的内标物质L-2-氯苯丙氨酸质谱检测的峰面积。

对测评试剂盒的预测效果进行验证：

(1)病人信息及血清样本采集：28例初次诊断为AML、且无严重心、肝、肾功能障碍的AML患者(除M3型)收集于上海市徐汇区中心医院。AML患者采用去甲柔红霉素+阿糖胞苷治疗方案(IA方案)，即给予去甲氧柔红霉素8mg/m²/d静滴，第1-3天；阿糖胞苷100mg/m²/d静滴，第1-7天。完全缓解的AML患者再给予以高剂量阿糖胞苷为基础的联合化疗方案巩固治疗。根据治疗效果，将AML病人分为完全缓解组(complete remission,CR组)和治疗失败组(non-responders,NR组)。根据欧洲白血病工作组的急性髓细胞白血病诊断及疗效标准，完全缓解(CR)定义为经过化疗后患者白血病的症状和体征消失，外周血中性粒细胞绝对值≥1.0×10⁹/L，血小板≥100×10⁹/L，白细胞分类中无白血病细胞；骨髓象中原始及早幼(幼稚)细胞≤5％。治疗失败(NR)指经过化疗后骨髓象中原始及早幼(幼稚)细胞没有明显下降，或者第一轮诱导化疗后7天内患者死亡，或因化疗后骨髓发育不良导致死亡的患者。28例AML患者中经过诱导化疗后完全缓解(CR组)15例，治疗失败组(NR组)13例。在化疗开始前，采集受试者的血清于-80℃低温冰箱保存。

(2)血清样本预处理：28例血清样本冻融后，各取100μL，分别加入400μL甲醇(含有12.5μg/ml L-2-氯丙苯氨酸，内标)涡旋1min，然后置于冰水浴中超声提取10min，4℃下14000g离心15min，吸取上清进样。

(3)样本质谱分析：对血清样本进行超高效液相色谱和质谱联用分析，液相色谱是Agilent1290Infinity液相色谱***，柱温40℃。色谱分离使用ACQUITY UPLC HSST3C₁₈column(2.1mm×100mm,1.7μm,Waters,Milford,MA)色谱柱。流动相：甲酸质量含量为0.1％的甲酸水溶液(A)，甲酸质量含量为0.1％的甲酸乙腈(B)，采用梯度洗脱，梯度洗脱条件：0～2min，5％B；2min～13min，5％～95％B；13min～15min，95％B。平衡色谱柱5min，流速400μL·min^-1，进样量为3μL。质谱为Agilent公司6530Accurate-Mass Q-TOFMS串联四极杆-飞行时间质谱仪。质谱采用正离子模式进行检测，检测参数：毛细管电压3500V、干燥气流速11L·min^-1、干燥气温度350℃、喷雾气压45psig、碎裂电压120V、Skimmer电压60V、数据采集范围质荷比(m/z)为50～1000，选取质荷比为121.0509和922.0098的内标离子作实时质量数校正。

(4)多元变量统计分析：获取各个峰的峰面积以及质量数和保留时间：将样本质谱分析的原始数据(.d)经Agilent MassHunter Qualitative software软件转换为通用数据格式(.mzData)，并通过去同位素峰的处理。转换后的数据进一步通过XCMS数据处理软件，对AML患者血清代谢指纹图谱数据进行去噪音、质谱峰提取、反卷积处理、峰排列、对齐、合并、峰合并后开始列表去噪音、缝隙填补处理，得到各个峰的峰面积以及质量数和保留时间等数据。

(5)血清中两种物质峰面积的获取及受试者工作曲线的建立：配制10ng/mL的月桂酰胺和白三烯B4二甲酰胺的混合标准溶液，按照血清样本的质谱分析条件进样分析，根据保留时间和质荷比，鉴定出血清样本中月桂酰胺和白三烯B4二甲酰胺，并得到血清样本中月桂酰胺和白三烯B4二甲酰胺各自峰面积与内标L-2-氯苯丙氨酸峰总面积的比值，代入预测模型：

其中W_月桂酰胺和W_{白三烯B4二甲酰胺}分别代表质谱检测的血清样本中月桂酰胺和白三烯B4二甲酰胺的峰面积，W_内标代表血清样品中加入的内标物质L-2-氯苯丙氨酸质谱检测的峰面积。

由该诊断模型计算P值，并建立ROC曲线，表2给出了月桂酰胺和白三烯B4二甲酰胺的峰面积分别与内标L-2-氯苯丙氨酸的比值及由预测模型得出的P值。

表2 AML完全缓解患者与治疗失败患者血清样本中两种预测标志物峰面积与内标L-2-氯苯丙氨酸峰面积的比值及计算得到的P值

ROC曲线分析显示，根据建立的预测模型，由15例完全缓解病人和13例治疗失败病人的两种诊断标志物的定量数据计算得到的ROC曲线(图7)下的面积达到了0.944，灵敏度(Sens)达84.6％，特异度(Spec)达80.0％，P值的分布图如图8所示，根据实施例2中得到的P的最佳截断值0.4486，28例分析样品有23例(82.1％)能够准确的预测。结果表明本发明的诊断标志物对AML患者化疗敏感性的预测具有较高的准确性。

实施例4其他预测模型

本申请发明人在实施例1的预测模型建立过程中，考虑到多种代谢物联合预测将获得更好的诊断效能，因此以上述10种代谢物为候选标志物群，采用Logistic回归分析还建立了其他的AML病人化疗敏感性预测模型，包括：联合月桂酰胺、白三烯B4二甲酰胺、神经酰胺(d18:0/17:0)三种标志物的预测模型A，以及联合黄嘌呤、月桂酰胺、白三烯B4二甲酰胺、神经酰胺(d18:0/17:0)四种标志物的预测模型F(图9)。模型A中，W_月桂酰胺、W_{白三烯B4二甲酰胺}、W_{神经酰胺(d18：0/17：0)}分别代表质谱检测的血清样本中月桂酰胺、白三烯B4二甲酰胺和神经酰胺(d18:0/17:0)的峰面积，W_内标代表血清样品中加入的内标物质L-2-氯苯丙氨酸质谱检测的峰面积。模型F中，W_黄嘌呤、W_月桂酰胺、W_{白三烯B4二甲酰胺}、W_{神经酰胺(d18:0/17:0)}分别代表质谱检测的血清样本中黄嘌呤、月桂酰胺、白三烯B4二甲酰胺和神经酰胺(d18:0/17:0)的峰面积，W_内标代表血清样品中加入的内标物质L-2-氯苯丙氨酸质谱检测的峰面积。

根据Logistic回归分析建立ROC曲线以评价预测模型对AML治疗缓解组与AML治疗失败组的测评效能。结果显示，模型A的ROC曲线下的面积为0.732，灵敏度62.5％，特异度68.1％；当达到最高的灵敏度和特异度时，模型A的最佳截断值等于0.4038，以0.4038为截断值，54例分析样品有35例(64.8％)能够准确的预测。模型F的ROC曲线下的面积为0.788，灵敏度61.7％，特异度72.9％；当达到最高的灵敏度和特异度时，模型F的最佳截断值等于0.4989，以0.4989为截断值，54例分析样品有36例(66.7％)能够准确的预测。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种试剂组合在制备急性髓细胞白血病化疗敏感性测评试剂盒中的应用，所述的试剂组合包含检测急性髓细胞白血病化疗敏感性生物标志物血清水平的试剂，所述的急性髓细胞白血病化疗敏感性生物标志物仅为月桂酰胺和白三烯B4二甲酰胺。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的检测急性髓细胞白血病化疗敏感性生物标志物血清水平的试剂为月桂酰胺和白三烯B4二甲酰胺标准品。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的试剂组合还包含超高效液相色谱中作为流动相的试剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的超高效液相色谱中作为流动相的试剂包含甲酸质量含量为0.1％的甲酸水溶液和甲酸质量含量为0.1％的甲酸乙腈。

5.一种生物标志物在制备急性髓细胞白血病化疗敏感性测评试剂或试剂盒中的应用，所述的生物标志物为月桂酰胺和白三烯B4二甲酰胺。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，测评样本为患者血清。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，使用的预测模型为：

其中W_月桂酰胺和W_{白三烯B4二甲酰胺}分别代表质谱检测的血清样本中月桂酰胺和白三烯B4二甲酰胺的峰面积，W_内标代表血清样本中加入的内标物质L-2-氯苯丙氨酸质谱检测的峰面积。

8.一种非诊断和治疗目的的急性髓细胞白血病化疗敏感性测评方法，其特征在于，所述的方法是以月桂酰胺和白三烯B4二甲酰胺的血清水平作为生物标志物。

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