ES2555864T3 - Ensayo para la medición de anticuerpos de unión a un anticuerpo monoclonal terapéutico - Google Patents

Abstract

Método de inmunoensayo para la determinación de un anticuerpo anti-<anticuerpo monoclonal terapéutico> (anti- AC) in vitro en una muestra de sangre completa, plasma o suero de un paciente tratado con un anticuerpo monoclonal terapéutico (ACmT), comprendiendo el método: a) proporcionar un fragmento F(ab) de dicho ACmT unido a una fase sólida, b) incubar la fase sólida proporcionada en (a) con la muestra, uniendo de esta manera el AC anti- a la fase sólida mediante el fragmento F(ab), c) incubar la fase sólida obtenida en (b) con un anticuerpo monoclonal <IgG-Ag_h>, en la que dicho anticuerpo monoclonal se une al AC anti-, en el que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo IgM que presenta un valor de la constante de disociación (>=KD) de entre aproximadamente 10-6 moles/l y 10-8 moles/l, y d) detectar el anticuerpo monoclonal <IgG-Ag_h> unido en (c) y determinar de esta manera el AC anti- en la muestra.

Description

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DESCRIPCION

Ensayo para la medicion de anticuerpos de union a un anticuerpo monoclonal terapeutico

La invencion se refiere a un metodo de inmunoensayo para la determinacion de un anticuerpo anti-<anticuerpo monoclonal terapeutico> (AC anti<ACmT>) in vitro en una muestra de sangre completa, plasma o suero de un paciente tratado con un anticuerpo monoclonal terapeutico (ACmT). El metodo comprende las etapas de: (a) proporcionar un fragmento F(ab) de dicho ACmT unido a una fase solida, (b) incubar la fase solida proporcionada en (a) con la muestra, uniendo de esta manera el AC anti-<ACmT> a la fase solida mediante el fragmento F(ab), (c) incubar la fase solida obtenida en (b) con un anticuerpo monoclonal <IgG-Ag_h>, en la que dicho anticuerpo monoclonal se une al AC anti-<ACmT>, en el que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo IgM que presenta un valor de la constante d edisociacion (=Kd) de entre aproximadamente 10"6 moles/l y 10"8 moles/l, y (d) detectar el anticuerpo monoclonal unido en (c) y determinar de esta manera el AC anti-<ACmT> en la muestra. La invencion se refiere ademas a un metodo para la determinacion de anticuerpos espedficos de antigeno de una clase de inmunoglobulina particular mediante un inmunoensayo en un formato de matriz en el que se realiza in vitro la deteccion de un Ac anti-<ACmT> de un ACmT en una muestra de sangre completa, plasma o suero obtenida de un paciente tratado con dicho ACmT. Se da a conocer ademas la utilizacion de dicho metodo para la deteccion de un anticuerpo anti-<ACmT> y para la identificacion de un paciente en riesgo de desarrollar una reaccion farmacologica adversa (RFA) durante el tratamiento con un ACmT.

Antecedentes de la invencion

Desde el desarrollo de los primeros anticuerpos monoclonales por Koehler y Milstein en 1974, se han dedicado grandes esfuerzos al desarrollo de anticuerpos que resulten apropiados para la terapia en el ser humano. Los primeros anticuerpos monoclonales disponibles se desarrollaron en ratones y ratas. En los ultimos diez anos han llegado al mercado un numero creciente de anticuerpos monoclonales quimericos, anticuerpos monoclonales humanizados o anticuerpos monoclonales humanos.

Son ejemplos bien conocidos de anticuerpos monoclonales terapeuticos (=ACmT), abciximab (ReoPro®), adalimumab (Humira®), alemtuzumab (Campath®), basiliximab (Simulect®), bevacizumab (Avastin®), cetuximab (Erbitux®), certolizumab pegol (Cimzia®), daclizumab (Zenapax®), eculizumab (Soliris®), efalizumab (Raptiva®), gemtuzumab (Mylotarg®), ibritumomab tiuxetan (Zevalin®), infliximab (Remicade®), muromonab-CD3 (Orthoclone OKT3®), natalizumab (Tysabri®), omalizumab (Xolair®), palivizumab (Synagis®), panitumumab (Vectibix®), ranibizumab (Lucentis®), rituximab (Rituxan®, MabThera®), trastuzumab (Herceptin®) y tositumomab (Bexxar®).

Se encuentran disponibles diferentes tipos de ACmT, algunos de los cuales podnan inducir reacciones farmacologicas adversas (RFA) o el fracaso del tratamiento secundario durante el tratamiento del paciente.

Los diversos tipos de ACmT disponibles actualmente comprenden anticuerpos quimericos, por ejemplo infliximab (un AC anti-<FNTa>), anticuerpos humanizados, por ejemplo el certolizumab (un AC anti-<FNTa>) y anticuerpos humanos, por ejemplo el adalumumab (tambien un Ac anti-<FNTa>) o el panitumumab (un AC anti-<receptor de factor de crecimiento epidermico>).

Se encuentra en el mercado o actualmente en desarrollo un numero bastante significativo de ACmT quimericos, humanizados o humanos, que merecen investigacion adicional. Son criterios importantes en estas investigaciones, la induccion de autoanticuerpos durante el tratamiento, reacciones farmacologicas adversas (RFA), la biodisponibilidad y la eliminacion de los anticuerpos, entre muchos otros.

La autorizacion de la Agencia Europea del Medicamento (AEM) para el tratamiento del paciente con ACmT en el futuro tambien dependera de los datos referentes a la formacion de AC anti-<ACmT>.

Se han utilizado muchos metodos diferentes en la tecnica anterior para la deteccion de los AC anti-<ACmT> y han conducido a resultados y consecuencias bastante diferentes e incluso conflictivos

Mire-Sluis A.R. et al., J. Immunol. Methods 289:1-16, 2004, resumen las recomendaciones de diseno y optimizacion de los inmunoensayos utilizados en la deteccion de anticuerpos anti-farmaco del huesped frente a anticuerpos terapeuticos producidos por la biotecnologfa (AC anti-<ACmT>). Segun Mire-Sluis et al., los bien conocidos formatos de ensayo de anticuerpos anti-farmaco muestran desventajas considerables. Se mencionan ensayos de anticuerpos anti-farmaco en, por ejemplo, los documentos n° WO 2005/045058 y n° WO 90/006515. Se mencionan ensayos de anticuerpos anti-idiotfpicos en, por ejemplo, la patente US n° 5.219.730, el documento n° WO 87/002778, y las patentes EP n° 0 139 389 y n° 0 170 302. Wadhwa M. et al., J. Immunol. Methods 278:1-17, 2003, informan de estrategias para la deteccion, medicion y caracterizacion de anticuerpos no deseados inducidos por agentes terapeuticos biologicos.

Arden et al., Current Opinion in Immunology 20:431-435, 2008, han revisado la inmunogenicidad de los anticuerpos anti-<factor de necrosis tumoral> y mejorado los metodos de medicion de anti-<anticuerpos>.

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El sistema inmunologico, por ejemplo de un organismo de mai^ero, produce anticuerpos que tambien se denominan inmunoglobulinas como respuesta a sustancias foraneas (no propias) o agentes infecciosos. Dichas sustancias no propias tambien se denominan antigenos. Un organismo de mairnfero utiliza anticuerpos para defenderse frente a sustancias foraneas o agentes infecciosos.

Las inmunoglobulinas (Ig) pueden dividirse en cinco clases diferentes. Se distinguen inmunoglobulinas de clases M, G, A, E y D. Estas cinco clases de inmunoglobulina difieren cada una con respecto a la composicion de la cadena pesada, que se denomina cadena |j, y, a, £ o 8.

Cada clase de inmunoglobulina presenta una funcion diferente en el organismo. Las inmunoglobulinas de la clase M se observan al producirse un primer contacto con el antfgeno, la denominada inmunizacion primaria. Sin embargo, la concentracion de estas inmunoglobulinas se reduce despues de dicha primera infeccion. Las inmunoglobulinas de la clase G en primer lugar se forman lentamente durante una inmunizacion primaria y se observan en grandes cantidades en el caso de que se produzca una segunda infeccion con el mismo antfgeno. Las inmunoglobulinas de la case A se observan sobre algunas de las superficies mucosales de los tejidos de mai^ero y son responsables de que los procesos de defensa que se producen en las mismas. Las inmunoglobulinas de la clase E son responsables principalmente de las reacciones alergicas. La funcion exacta de las inmunoglobulinas de la clase D hasta ahora es desconocida.

Las clases de inmunoglobulina individuales se observan en la sangre a concentraciones muy diferentes. Las inmunoglobulinas de la clase G (IgG) son las clase con la incidencia mas alta en el suero humano, estando presentes en una proporcion de aproximadamente 75%, que corresponde a un contenido serico de aproximadamente 8 a 18 mg/ml. La segunda clase de inmunoglobulina mas frecuente es la clase A (IgA), con una concentracion serica media habitualmente de entre 0,9 y 4,5 mg/ml. Las inmunoglobulinas de la clase M (IgM) normalmente se encuentran presentes a una concentracion de entre 0,6 y 2,8 mg/ml, y las inmunoglobulinas de la clase D (IgD) se encuentran presentes a uan concentracion de habitualmente entre 0,003 y 0,4 mg/ml. Los anticuerpos IgE se encuentran presentes en la proporcion mas baja y solo se observan a una concentracion de entre 0,02 y 0,05 jg/ml en el suero.

Para el diagnostico diferencial de muchas enfermedades resulta importante detectar los anticuerpos de una o mas clases particulares de inmunoglobulina. Un diagnostico satisfactorio en el caso de la infeccion vmca, bacteriana y parasitaria solo puede garantizarse mediante una deteccion de anticuerpos espedfica de clase y/o mediante la exclusion de la medicion interfiriente de determinadas otras clases de inmunoglobulina (por ejemplo la deteccion de anticuerpos IgG e IgA pero no la deteccion de anticuerpos IgM). Lo anterior resulta particularmente importante para diferenciar entre infecciones nuevas o agudas e infecciones mas antiguas, asf como para realizar un seguimiento clmico del curso de una infeccion. La deteccion espedfica de clase de los anticuerpos resulta especialmente importante para el VIH, la hepatitis A, la hepatitis B, la toxoplasmosis, la rubeola y las infecciones por clamidia. La deteccion espedfica de clase de los anticuerpos que son espedficos para un determinado antfgeno tambien resulta necesaria al determinar el tttulo de los anticuerpos protectores, por ejemplo para comprobar si una inmunizacion ha tenido exito.

Los anticuerpos espedficos de antfgeno de una clase particular con frecuencia se detectan mediante la union de anticuerpos espedficos de antfgeno comprendidos en una muestra a una fase solida recubierta con el antfgeno espedfico. Las inmunoglobulinas (Ig) unidas espedficamente a la fase solida mediante el antfgeno recubierto seguidamente se detectan con anticuerpos de deteccion dirigidos espedficamente contra una determinada clase de Ig humana. Sin embargo, este tipo de procedimiento de ensayo solo resulta posible en el caso de que todas las Ig no espedficas, no unidas a antfgeno, se desprendan mediante lavado antes de la reaccion con los anticuerpos marcados espedficos de clase dirigidos contra la Ig humana. De esta manera, por ejemplo al detectar moleculas de IgG espedficas en una muestra, se encuentran presentes cantidades relativamente grandes (4 a 20 mg/ml de suero) de IgG no espedficas que pueden unirse no espedficamente a la fase solida. En el caso de que se utilice un anticuerpo de deteccion contra IgG, dichas inmunoglobulinas unidas no espedficamente tambien resultaran reconocidas y seran ligadas por el anticuerpo de deteccion. Lo anterior resulta en senales de fondo elevadas y proporciones de senal a ruido reducidas y, por ultimo aunque no menos importante, en una menor sensibilidad.

Knight D. M. et al., Molecular Immunology 32:1271-1281, 1995, dan a conocer ensayos para la deteccion de anticuerpo antiquimerico humano (AAQH) y anticuerpo antimurino humano (AAMH), en los que dichos anticuerpos son reactivos con anticuerpos terapeuticos, mostrando que la inmunogenicidad del fragmento de region variable del anticuerpo Fab monoclonal murino 7E3 se reduce en el ser humano mediante la sustitucion de regiones constantes humanas por murinas.

El documento n° WO 2009/003082 A2 da a conocer metodos y medios para la deteccion de anticuerpos en muestras de sangre del paciente contra anticuerpos monoclonales terapeuticos tales como el rituximab. Los fragmentos F(ab)2 de rituximab se inmovilizaron en un soporte solido y las muestras del paciente se sometieron a ensayo para anticuerpos ligantes de dichos fragmentos de rituximab utilizando conjugados de IgG, IgM, IgA e IgE antihumano con peroxidasa para la deteccion. Ademas, se da a conocer la utilizacion de Fab y/o anticuerpos monoclonales como reactivo inmunologico alternativo.

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El documento n° EP 1 653 233 A1 da a conocer que pueden utilizarse anticuerpos monoclonales en la deteccion de Ig humanas. Dichos anticuerpos monoclonales se utilizan en la deteccion espedfica de clase de anticuerpos de Ig humana.

En el documento n° US2006/0115907A1 se describen anticuerpos espedficos de complejo inmunologico para una sensibilidad incrementada en ensayos de matriz inmunologica. Los anticuerpos espedficos de complejo inmunologico son anticuerpos de tipo factor reumatoide que preferentemente se unen a inmunoglobulinas agregadas u oligomerizadas, pero no a inmunoglobulinas individuales. La patente EP n° 1098198 (Berti et al.) se refiere a un metodo para la determinacion cualitativa y cuantitativa de anticuerpos IgG humanos en inmunoensayos enzimaticos. En dicho ensayo, se utiliza un anticuerpo monoclonal que se une espedficamente a anticuerpos IgG humanos mediante un neoepftopo formado con la union de un anticuerpo a su antigeno. En dicho metodo no se describe una reduccion de la senal de fondo debido a anticuerpos unidos no espedficamente a la fase solida.

Un metodo para reducir las senales de fondo es modificar la fase solida con el fin de evitar la union no espedfica de las inmunoglobulinas y utilizar aditivos tamponadores especiales que pretenden reducir o evitar la union no espedfica de las inmunoglobulinas a la fase solida (ejemplos: fase solida HydroGel (Perkin Elmer), portaobjetos FAST (Schleicher & Schull), detergentes y sales caotropicas). Las modificaciones de la fase solida son laboriosas y caras. Ademas, se ha constatado que los aditivos tamponadores pueden reducir la reactividad de algunos anticuerpos y de esta manera reducir tambien las senales positivas deseadas.

Tal como se ha indicado, las senales de fondo inducidas por inmunoglobulinas unidas no espedficamente incrementa el valor del blanco, lo que dificulta la deteccion de los anticuerpos unidos espedficamente. Lo anterior es especialmente aplicable a los sistemas de ensayo miniaturizados, tales como inmunoensayos en un formato de matriz. Dichas matrices pueden comprender una pluralidad de ensayos espedficos, en algunos casos incluso en diferentes formatos de ensayo, y el procedimiento de ensayo se lleva a cabo en un unico recipiente de reaccion. De esta manera, por ejemplo, la adicion de un determinado detergente puede suprimir la union no espedfica de anticuerpos a un primer analito en dicho ensayo, aunque el mismo detergente puede no presentar ningun efecto o incluso el efecto contrario en otro ensayo de deteccion de un segundo analito en el mismo sistema de matriz.

La utilizacion del factor de coagulacion C1q, que es una subunidad del primer componente del complemento, como posibilidad adicional para reducir la senales de fondo en los inmunoensayos se da a conocer en la patente n° EP 0222146 B1. En la patente US n° 5.698.449 A1, se da a conocer un fragmento de C1q para eliminar selectivamente los complejos inmunologicos de la sangre y para detectar y cuantificar los complejos inmunologicos. La patente US n° 4.062.935 A1 describe la adicion de factores reumatoides o C1q a la muestra y la union y cuantificacion de los complejos inmunologicos resultantes. Sin embargo, la tecnica anterior no muestra ninguna aplicacion de C1q a inmunoensayos en un formato de matriz.

Un elemento caractenstico de los inmunoensayos en un formato de matriz es la fase solida. En dichos inmunoensayos basados en una matriz, la fase solida consiste preferentemente de areas de ensayo localizadas, definidas y discretas. Estas areas de ensayo sobre la fase solida preferentemente se encuentran espacialmente separadas entre sf por areas inertes. Estas areas de ensayo discretas localizadas en la mayona de casos son puntos y preferentemente presentan un diametro de entre 10 pm y 1 mm y particularmente preferentemente un diametro de entre 100 y 200 pm. Los sistemas de matriz se describen en, por ejemplo, Ekins R.P. y Chu F.W. (Clin. Chem. 37:1955-1967, 1995) y en las patentes US n° 5.432.099, n° 5.516.635 y n° 5.126.276.

Los sistemas de matriz presentan la ventaja de que pueden llevarse a cabo varias determinaciones de analito simultaneamente en una muestra. La fase solida de estos sistemas de matriz puede recubrirse preferentemente con un ligante universal como estreptavidina o avidina, tal como se da a conocer en la patente EP n° 0939319 (Hornauer et al.). Resulta posible aplicar una pluralidad de parejas de union, tales como anticuerpos espedficos de antfgeno a las areas o puntos de ensayo individuales sobre la fase solida (soporte solido). En el caso de que se utilice, por ejemplo, estreptavidina, como matriz de union universal, cada pareja de union puede biotinilarse y facilmente aplicada/unida a dicha fase solida. Los componentes de la muestra y en particular las IgG pueden unirse no espedficamente a una o mas de dichas parejas de union o a la fase solida. En este caso resulta practicamente imposible identificar un aditivo tamponador universal para reducir las senales de fondo, ya que cada pareja de union individual podna requerir un aditivo tamponador muy particular. Los aditivos tamponadores que presentan efectos positivos en el caso de una pareja de union pueden presentar incluso efectos negativos sobre otras parejas de union. Tambien resulta muy diffcil modificar la fase solida para numerosas parejas de union diferentes.

Por lo tanto, un objetivo de la presente invencion es desarrollar un metodo sensible para la deteccion de un anticuerpo anti-<anticuerpo monoclonal terapeutico> (AC anti-<ACmT>) en una muestra obtenida de un paciente tratado con dicho ACmT.

Inesperadamente ha resultado que la utilizacion del metodo de inmunoensayo segun la presente invencion permite la deteccion muy precoz de AC anti-<ACmT> y, de esta manera, tambien permite identificar la mayona de aquellos pacientes en riesgo de desarrollar una reaccion farmacologica adversa (RFA) durante el tratamiento con un ACmT.

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Descripcion resumida de la invencion

La invencion se refiere a un metodo de inmunoensayo para la determinacion de un anticuerpo anti-<anticuerpo monoclonal terapeutico> (anti-AC<ACmT>) in vitro en una muestra de sangre completa, plasma o suero de un paciente tratado con un anticuerpo monoclonal terapeutico (ACmT), comprendiendo el metodo: a) proporcionar un fragmento F(ab) de dicho ACmT unido a una fase solida, b) incubar la fase solida proporcionada en (a) con la muestra, uniendo de esta manera el AC anti-<ACmT> a la fase solida mediante el fragmento F(ab), c) incubar la fase solida obtenida en (b) con un anticuerpo monoclonal <IgG-Ag_h>, en la que dicho anticuerpo monoclonal se une al AC anti-<ACmT>, en el que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo IgM que presenta un valor de la constante de disociacion (=Kd) de entre aproximadamente 10"6 moles/l y 10"8 moles/l, y d) detectar el anticuerpo monoclonal <IgG- Ag_h> unido en (c) y determinar de esta manera el AC anti-<ACmT> en la muestra.

En una realizacion, la presente invencion se refiere a la utilizacion del metodo de inmunoensayo para la identificacion de un paciente en riesgo de desarrollar una reaccion farmacologica adversa (RFA) mediante la determinacion de un Ac anti-<ACmT> in vitro en una muestra de sangre completa, plasma o suero de un paciente tratado con un anticuerpo monoclonal terapeutico (ACmT). El metodo comprende: a) proporcionar un fragmento F(ab) de dicho ACmT unido a una fase solida, b) incubar la fase solida proporcionada en (a) con la muestra, uniendo de esta manera el AC anti-<ACmT> a la fase solida mediante el fragmento F(ab), c) incubar la fase solida obtenida en (b) con un anticuerpo monoclonal <IgG-Ag_h>, en la que dicho anticuerpo monoclonal se une al AC anti- <ACmT>, en el que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo IgM que presenta un valor de la constante de disociacion (=Kd) de entre aproximadamente 10"6 moles/l y 10"8 moles/l, y d) detectar el anticuerpo monoclonal <IgG- Ag_h> unido en (c) y determinar de esta manera el AC anti-<ACmT> en la muestra durante el tratamiento con un ACmT, en el que el paciente con un resultado positivo en el ensayo para AC anti-<ACmT> en el metodo se encuentra en riesgo de desarrollar una RFA.

En una realizacion adicional, la presente invencion se refiere a un metodo de inmunoensayo segun la presente invencion para seleccionar un anticuerpo terapeutico alternativo para un paciente bajo tratamiento con un primer ACmT, en el que se encuentra disponible por lo menos un primer y uno o mas ACmT alternativos, que comprende: a) determinar in vitro un AC anti-<ACmT> contra el primer ACmT en una muestra procedente de un paciente tratado con dicho primer ACmT, y b) seleccionar un ACmT alternativo para la terapia futura, en caso de que se encuentre presente un AC anti-<ACmT> contra dicho primer ACmT.

Descripcion detallada de la invencion

La practica de la presente invencion utiliza, a menos que se indique lo contrario, tecnicas convencionales de biologfa molecular (incluyendo tecnicas recombinantes), microbiologfa, biologfa celular, bioqmmica e inmunologfa, que se encuentran comprendidas dentro de los conocimientos del experto en la materia. Dichas tecnicas se explican exhaustivamente en la literatura, tal como en "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edicion (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait, ed., 1984)); Animal Cell Culture (R.L. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F.M. Ausubel et al., editores, 1987, y actualizaciones periodicas); "PCR: The Polymerase Chain Reaction" (Mullis et al., editores, 1994).

A menos que se indique lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados en la presente memoria presentan los mismos significados entendidos comunmente por el experto ordinario en la materia a la que se refiere la presente invencion. Singleton P. y Sainsburg D. et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2a ed., J. Wiley & Sons, New York, N.Y., 1994; March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure, 4a ed., John Wiley & Sons, New York, N.Y. 1992; Lewin B., Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994, (ISBN 87 9); Kendrew J. et al. (editores), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994, ISBN 0-632-02182-9); y Meyers, R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc. (1995), ISBN 1-56081-569 8) que proporcionan al experto en la materia una grna general a muchos de los terminos y expresiones utilizados en la presente solicitud.

Todas las referencias citadas en la presente memoria, incluyendo solicitudes y publicaciones de patente, patentes se incorporan como referencia en su totalidad.

Definiciones

Tal como se utiliza en la presente memoria, cada uno de los terminos siguientes presenta el significado asociado a los mismos en la presente seccion.

Los artfculos "un" y "una" se utilizan en la presente memoria para referirse a uno o a mas de uno (es decir, a por lo menos uno) del objeto gramatical del artfculo. A tftulo de ejemplo, "un anticuerpo" se refiere a un anticuerpo o a mas de un anticuerpo. El termino "por lo menos" se utiliza para indicar que opcionalmente puede encontrarse presente uno o mas objetos adicionales. A tftulo de ejemplo, una matriz que comprende por lo menos dos areas discretas puede comprender opcionalmente dos o mas areas de ensayo discretas.

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La expresion "uno o mas" se refiere a 1 a 50, preferentemente 1 a 20, resultando preferentes tambien 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 o 15.

La expresion "de interes" se refiere a un analito o sustancia de posible relevancia que debe analizarse o determinarse.

La "deteccion" incluye cualesquiera medios de deteccion, incluyendo las detecciones directa e indirecta. El termino "deteccion" se utiliza en el sentido mas amplio, incluyendo mediciones tanto cualitativas como cuantitativas de un analito, en la presente memoria mediciones de un analito, tal como un anticuerpo anti-<anticuerpo terapeutico>. En un aspecto, se utiliza un metodo de deteccion tal como se indica en la presente memoria, con el fin de identificar la mera presencia de un analito de interes en una muestra. En otro aspecto, el metodo puede utilizarse para cuantificar una cantidad de analito en una muestra.

El termino "correlacionar" o "correlacionado" se refiere a la comparacion, de cualquier manera, entre el rendimiento y/o los resultados de un primer analisis o protocolo y el rendimiento y/o los resultados de un segundo analisis o protocolo. Por ejemplo, pueden utilizarse los resultados de un primer analisis o protocolo al levar a cabo un segundo protocolo, y/o pueden utilizarse los resultados de un primer analisis o protocolo para determinar si debena llevarse a cabo un segundo analisis o protocolo.

La expresion "reducir o inhibir" se refiere a disminuir o reducir una actividad, funcion y/o cantidad en comparacion con una referencia. La expresion "reducir o inhibir" se refiere a la capacidad de causar una reduccion global preferentemente de 20% o superior, mas preferentemente de 50% o superior, y todavfa mas preferentemente de 75%, 85%, 90%, 95% o superior. Reducir o inhibir puede referirse a los smtomas del trastorno bajo tratamiento.

El termino "muestra" o "muestra de ensayo" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una muestra biologica para el proposito de la evaluacion in vitro obtenida de un paciente. La muestra puede comprender anticuerpos que se unen al anticuerpo o farmaco con el que ha sido tratado el paciente, tal como anticuerpo humano anti-<anticuerpo quimerico> (AAQH) o anticuerpo humano anti-<anticuerpo humano> (AHAH), siendo ambos AC anti-<ACmT>. El termino "muestra", o "muestra de ensayo" incluye muestras biologicas que han sido manipuladas de cualquier manera tras su obtencion, tal como mediante tratamiento con reactivos, la solubilizacion, o el enriquecimiento en determinados componentes, tal como protemas o polinucleotidos. Tfpicamente la muestra es una muestra lfquida.

La muestra biologica puede ser, por ejemplo, sangre completa, suero, anticuerpos recuperados del paciente o plasma. La muestra preferentemente es de sangre completa, suero o plasma. La muestra biologica puede comprender anticuerpos recuperados del paciente. En una realizacion, la muestra es una muestra clmica. En otra realizacion, la muestra se utiliza en un ensayo diagnostico.

En una realizacion, se obtiene una muestra de un sujeto o paciente antes de la terapia con anticuerpos monoclonal terapeutico (ACmT). En una realizacion, se obtiene una muestra de un sujeto o paciente antes de la terapia de ACmT. En una realizacion, se obtiene una muestra de un sujeto o paciente despues de por lo menos un tratamiento con un ACmT.

En el caso de que se indique en la presente memoria que debe obtenerse una muestra en la semana 2, la muestra puede obtenerse entre el dfa 9 y el dfa 21 tras el inicio de la terapia con dicho ACmT. En el caso de que se indique en la presente memoria que debe obtenerse una muestra en la semana 6, la muestra puede obtenerse entre el dfa 28 y el dfa 64 tras el inicio de la terapia. En el caso de que se indique en la presente memoria que debe obtenerse una muestra en la semana 14, la muestra puede obtenerse entre las semanas 13 y 16 tras el inicio de la terapia.

Una "muestra de referencia" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier muestra, estandar o nivel que se utilice con fines comparativos. En una realizacion, se obtiene una muestra de referencia de un sujeto o paciente no tratado. En otra realizacion se obtiene una muestra de referencia de un individuo sano y/o no enfermo que no es el sujeto o paciente. En otra realizacion se obtiene una muestra de referencia de un individuo no tratado que no es el sujeto o paciente. En determinadas realizaciones, una muestra de referencia es una unica muestra o multiples muestras combinadas del mismo sujeto o paciente que se obtienen en uno o mas puntos temporales diferentes de cuando se ha obtenido la muestra de ensayo. Por ejemplo, se obtiene una muestra de referencia del mismo sujeto o paciente en un punto temporal anterior a cuando se ha obtenido la muestra de ensayo. En determinadas realizaciones, una muestra de referencia incluye todos los tipos de muestras biologicas definidas anteriormente bajo el termino "muestra", la cual se obtiene de uno o mas individuos que no son el sujeto o paciente. En determinadas realizaciones, una muestra de referencia es la combinacion de multiples muestras de uno o mas individuos sanos que no son el sujeto o paciente. En determinadas realizaciones una muestra de referencia es una combinacion de multiples muestras de uno o mas individuos con una enfermedad o trastorno (por ejemplo artritis reumatoide) que no son el sujeto o paciente. En determinadas realizaciones, una muestra de referencia es la agrupacion de muestras de plasma o suero procedentes de uno o mas individuos que no son el sujeto o paciente. En determinadas realizaciones, una muestra de referencia es la agrupacion de muestras de plasma o suero procedentes de uno o mas individuos con una enfermedad o trastorno que no son el sujeto o paciente.

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Tal como apreciara el experto en la materia, el metodo de inmunoensayo segun la presente invencion se lleva a cabo in vitro. Posteriormente se descarta la muestra del paciente. La muestra del paciente se utiliza unicamente para el metodo diagnostico in vitro de la invencion y el material de la muestra del paciente no se transfiere nuevamente al cuerpo del paciente.

El termino "anticuerpo" se utiliza en el sentido mas amplio y cubre espedficamente los anticuerpos monoclonales (incluyendo los anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespedficos (por ejemplo anticuerpos biespedficos) y fragmentos de anticuerpos.

Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de muchas especies de vertebrados pueden ser de dos tipos claramente diferenciados, denominados kappa y lambda. Esta clasificacion y nomenclatura se basa en las secuencias de aminoacidos de sus dominios constantes.

Dependiendo de la secuencia de aminoacidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se dividen en clases diferentes. Existen cinco clases principales de inmunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y algunas de ellas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo IgGi, IgG2, IgG3 e IgG4.

La notacion de un anticuerpo se escribe de manera que el antigeno, que es ligado espedficamente por el anticuerpo, se indica dentro de "<...>", por ejemplo un anticuerpo contra el antfgeno "X" se indica como "anticuerpo anti-<X>".

La expresion “fragmentos de anticuerpo” comprende una parte de un anticuerpo intacto, que preferentemente comprende la region de union a antfgeno o variable del mismo. Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpo se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, diacuerpos, anticuerpos lineales, moleculas de anticuerpo de cadena sencilla y anticuerpos multiespedficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. La digestion con papama de los anticuerpos produce dos fragmentos de union a antfgeno identicos, denominados fragmentos "Fab", cada uno con un unico sitio de union a antfgeno, y un fragmento residual "Fc", una denominacion que refleja la capacidad de cristalizar facilmente. El tratamiento con pepsina rinde un fragmento F(ab')2 que presenta dos sitios de union a antfgeno y todavfa es capaz de entrecruzarse con el antfgeno.

El fragmento "Fab" contiene los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo, aunque tambien el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada.

Los fragmentos "Fab" difieren de los fragmentos Fab en que presentan ademas de unos cuantos residuos aminoacidos en el extremo carboxi-terminal del dominio CH1 de cadena pesada, incluyendo una o mas cistemas de la region bisagra de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo Fab' originalmente se producen como parejas de fragmentos Fab' (F(ab')2) que presentan un puente de cistinas de bisagra entre ellas. El monomero de Fab' se obtiene a partir de F(ab')2 mediante reduccion del puente de cistemas.

Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena sencilla" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL de anticuerpo, en los que estos dominios se encuentran presentes en una unica cadena polipeptfdica. Preferentemente, el polipeptido Fv comprende ademas un conector polipeptfdico entre los dominios VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para la union de antfgeno. Para una revision de los fragmentos scFv, ver, por ejemplo, Pluckthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore (editores), Springer- Verlag, New York, paginas 269-315, 1994.

El termino "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo pequenos con dos sitios de union a antfgeno, comprendiendo los fragmentos un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptfdica (VH-VL). Mediante la utilizacion de un conector excesivamente corto para permitir el apareamiento los dos dominios en la misma cadena, se fuerza el apareamiento de los dominios con dominios complementarios de otra cadena y crea dos sitios de union a antfgeno. Los diacuerpos se describen en mayor detalle en, por ejemplo, la patente EP n° 404 097, en el documento n° WO 93/11161 y en Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993.

Un "fragmento F(ab)" segun la presente invencion incluye Fab, Fab', scFv y diacuerpos. Los fragmentos Fab o Fab' de un ACmT se producen mediante el procesamiento de dicho ACmT, por ejemplo mediante digestion del ACmT en fragmentos Fab o F(ab')2 y una parte Fc, respectivamente. En el caso de que un anticuerpo terapeutico sea un scFv o un diacuerpo, estas moleculas no necesitan digerirse adicionalmente sino que pueden utilizarse sin modificacion en el metodo de inmunoensayo segun la presente invencion.

La expresion "anticuerpo monoclonal" (MAb) tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un anticuerpo obtenido de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogenea, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la poblacion son identicos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden encontrarse presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente espedficos, estando dirigidos contra un unico sitio antigenico. Ademas, en contraste con las preparaciones de anticuerpos (policlonales) convencionales, que tfpicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epttopos), cada anticuerpo monoclonal presenta como diana un unico determinante del antfgeno. El modificador "monoclonal" indica el caracter

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del anticuerpo como obtenido de una poblacion sustancialmente homogenea de anticuerpos y no debe interpretarse como que requiere la produccion del anticuerpo mediante cualquier metodo particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que deben utilizarse segun la presente invencion pueden prepararse mediante el metodo del hibridoma descrito por primera vez por Kohler G. et al., Nature 256:495-497, 1975, o pueden prepararse mediante metodos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, la patente US n° 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" tambien pueden aislarse a partir de bibliotecas fagicas de anticuerpos utilizando las tecnicas descritas en Clackson T. et al., Nature 352:624-628, 1991, y en Marks J.D. et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991, por ejemplo.

Entre los anticuerpos monoclonales en la presente memoria se incluyen espedficamente anticuerpos (inmunoglobulinas) "quimericos" en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es identica u homologa de secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o perteneciente a una clase o subclase particular de anticuerpos, mientras que el resto de la cadena o cadenas es identico u homologo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, asf como fragmentos de dichos fragmentos, con la condicion de que muestren la actividad biologica deseada (patente US n° 4.816.567, y Morrison S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855, 1984).

Las formas "humanizadas" de anticuerpo no humanos (por ejemplo murinos) son anticuerpos quimericos que contienen una secuencia minima derivada de una inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpos receptores) en las que los residuos de una region hipervariable del receptor son sustituidos por residuos de una region hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como el raton, la rata, el conejo o primates no humanos, que presentan la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de region marco (FR) de Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los residuos no humanos correspondientes. Ademas, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprende sustancialmente la totalidad de por lo menos uno, y tfpicamente dos, dominios variables en los que la totalidad, o sustancialmente la totalidad, de los bucles hipervariables que corresponden a los de una inmunoglobulina no humana, y la totalidad, o sustancialmente la totalidad, de las FR corresponden a las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender por lo menos una parte de una region constante (Fc) de inmunoglobulina, tfpicamente la de una inmunoglobulina humana. Para mas detalles ver Jones P.T. et al., Nature 321:522-525, 1986; Riechmann L. et al., Nature 332:323-329, 1988, y Presta L.G., Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992.

Un "anticuerpo humano" es un anticuerpo que presenta una secuencia de aminoacidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o que ha sido preparado utilizando cualquiera de las tecnicas para preparar anticuerpos humanos tales como las dadas conocer en la presente memoria. Esta definicion de anticuerpo humano excluye espedficamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de union a antfgeno no humanos. Pueden producirse anticuerpos humanos utilizando diversas tecnicas conocidas. En una realizacion, el anticuerpo humano se selecciona de una biblioteca fagica, en la que la biblioteca fagica expresa anticuerpos humanos (Vaughan T.J. et al., Nature Biotechnology 14:309-314, 1996; Sheets M.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95:6157-6162, 1998; Hoogenboom H.R. y Winter G., J. Mol. Biol. 227:381-388, 1992; Marks J.D. et al., J. Mol. Biol., 222:581, 1991). Tambien pueden generarse anticuerpos humanos mediante la introduccion de loci de inmunoglobulina humana en animales transgenicos, por ejemplo ratones en los que los genes de inmunoglobulina endogenos han sido parcial o completamente inactivados. Con el reto, se observa la produccion de anticuerpos humanos, que es estrechamente similar a la observada en el ser humano en todos los aspectos, incluyendo la reorganizacion genica, el ensamblaje y el repertorio de anticuerpos. Este enfoque se describe en, por ejemplo, las patentes US n° 5.545.807, n° 5.545.806, n° 5.569.825, n° 5.625.126, n° 5.633.425 y n° 5.661.016, y en las publicaciones cientfficas siguientes: Marks J.D. et al., Bio/Technology 10:779-783, 1992; Lonberg N. et al., Nature 368:856-859, 1994; Morrison S.L., Nature 368:812-813, 1994; Fishwild D.M. et al., Nature Biotechnology 14:845-851, 1996; Neuberger M., Nature Biotechnology 14:826, 1996; Lonberg N. y Huszar D., Intern. Rev. Immunol. 13:65-93, 1995. Alternativamente, el anticuerpo humano puede prepararse mediante inmortalizacion de linfocitos B humanos productores de un anticuerpo dirigido contra un antfgeno diana (estos linfocitos B pueden recuperarse de un individuo o pueden haberse inmunizado in vitro). Ver, por ejemplo, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pag. 77, 1985; Boerner P. et al., J. Immunol. 147(1):86-95, 1991, y la patente US n° 5.750.373.

La expresion "anticuerpo terapeutico" se refiere a un anticuerpo que se somete a ensayo en estudios clfnicos para la autorizacion como terapeutico humano y que puede administrarse en un individuo para el tratamiento de una enfermedad. En una realizacion, el anticuerpo terapeutico es un anticuerpo monoclonal. En una realizacion adicional, el anticuerpo terapeutico se obtiene de uno de los grandes simios o de un animal transformado con un locus de anticuerpo humano o un anticuerpo monoclonal humano o un anticuerpo monoclonal humanizado. En una realizacion, el anticuerpo terapeutico es un anticuerpo monoclonal humano. En una realizacion adicional, el anticuerpo terapeutico es un anticuerpo monoclonal humanizado. Se estan utilizando ampliamente anticuerpos terapeuticos para el tratamiento de diversas enfermedades, tales como enfermedades oncologicas, enfermedades inmunologicas, enfermedades del sistema nervioso central, enfermedades vasculares, enfermedades inflamatorias cronicas o enfermedades infecciosas. Dichos anticuerpos son, por ejemplo, anticuerpos contra CD20, CD22, HLA-

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DR, CD33, CD52, EGFR, G250, GD3, HER2, PSMA, CD56, VEGF, VEGF2, CEA, antfgeno Y de Lewis, receptor de IL-6 (IL6R), TNFa, o receptor de IGF-1 (IGF1R). Tambien se describen anticuerpos terapeuticos en Groner B. et al., Curr. Mol. Meth. 4:539-547, 2004, y en Harris M., Lancet Oncol. 5:292-302, 2004.

Tal como se utiliza en la presente memoria, un "anticuerpo anti-<anticuerpo terapeutico>" es un anticuerpo que liga un anticuerpo terapeutico. Un "anticuerpo anti-<anticuerpo monoclonal terapeutico>" (AC anti-<ACmT>) es un anticuerpo que se une a un anticuerpo monoclonal terapeutico. Por ejemplo, un anticuerpo anti-<infliximab> es un anticuerpo que se une al infliximab, un anticuerpo monoclonal terapeutico, con diana en el FNTa.

Un anticuerpo que "se une espedficamente" o que es "espedfico para" un polipeptido particular o un epttopo en un polipeptido particular es uno que se une a dicho polipeptido particular o epftopo en un polipeptido particular sin unirse sustancialmente a ningun otro polipeptido o epftopo de polipeptido.

Un polipeptido “aislado” o un anticuerpo "aislado" es uno que ha sido identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su medio natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferinan con los usos diagnosticos o terapeuticos del polipeptido o anticuerpo, y entre ellos pueden incluirse enzimas, hormonas y otros solutos proteicos y no proteicos. En realizaciones preferentes, el polipeptido o anticuerpo se purifica (1) a mas de 95% en peso de polipeptido o anticuerpo segun se determina mediante el metodo de Lowry, y mas preferentemente mas de 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de secuencia de aminoacidos N-terminal o interna mediante la utilizacion de un secuenciador de taza giratoria, o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferentemente, tincion de plata. El polipeptido o anticuerpo aislado incluye el polipeptido o anticuerpo in situ dentro de celulas recombinantes, ya que no se encontrara presente por lo menos un componente del ambiente natural del polipeptido. Sin embargo, habitualmente el polipeptido o anticuerpo aislado se prepara mediante por lo menos una etapa de purificacion.

El termino "sujeto" o "paciente" se refiere a un mairnfero, incluyendo, aunque sin limitacion, un mamffero humano o no humano, tal como un bovino, equino, canino, ovino o felino. Preferentemente, el sujeto o paciente es un ser humano.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino “tratamiento” se refiere a la intervencion clfnica en un intento de alterar el curso natural del individuo o celula bajo tratamiento, y puede llevarse a cabo para la profilaxis o durante el curso de la patologfa clfnica. Entre los efectos deseables del tratamiento se incluyen la prevencion de la aparicion o de la recurrencia de una enfermedad, el alivio de los smtomas, la reduccion de cualquier consecuencia patologica directa o indirecta de la enfermedad, la reduccion de la tasa de progresion de la enfermedad, la mejora o mitigacion del estado de enfermedad, y la remision o mejora del pronostico. En algunas realizaciones, los metodos de la invencion resultan utiles en el intento de retrasar el desarrollo de una enfermedad o trastorno, especialmente una reaccion farmacologica adversa.

Una “cantidad eficaz” se refiere a una cantidad que resulta eficaz, a las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapeutico o profilactico deseado. Una "cantidad terapeuticamente eficaz" de un agente terapeutico puede variar segun factores tales como el estado de enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo de inducir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapeuticamente eficaz tambien es una cantidad en la que cualesquiera efectos toxicos o perjudiciales del agente terapeutico se ven superados por los efectos terapeuticamente beneficiosos. Una “cantidad profilacticamente eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, a las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado profilactico deseado. Tfpicamente, aunque no necesariamente, debido a que se utiliza una dosis profilactica en sujetos antes o durante un estadio mas temprano de la enfermedad, la cantidad profilacticamente eficaz sera inferior a la cantidad terapeuticamente eficaz.

El termino "diagnostico" se utiliza en la presente memoria para referirse a la identificacion de un estado molecular o patologico, enfermedad o condicion, o para referirse a la identificacion de un paciente que podna beneficiarse de un regimen de tratamiento particular. El termino "pronostico" se utiliza en la presente memoria para referirse a la prediccion de la probabilidad de beneficio clfnico de una terapia. El termino "prediccion" se utiliza en la presente memoria para referirse a la probabilidad de que un paciente responda favorablemente o desfavorablemente a una terapia particular. En una realizacion, la prediccion se refiere al grado de dichas respuestas. En una realizacion, la prediccion se refiere a la posibilidad y/o probabilidad de que un paciente sobreviva o mejore tras un tratamiento, por ejemplo un tratamiento con un agente terapeutico particular, y durante un periodo de tiempo determinado sin recurrencia de la enfermedad. Los metodos predictivos de la invencion pueden utilizarse clfnicamente para realizar decisiones de tratamiento seleccionando las modalidades de tratamiento mas apropiadas para cualquier paciente particular. Los metodos predictivos de la presente invencion son herramientas valiosas en la prediccion de si un paciente es probable que responda favorablemente a un regimen de tratamiento, tal como un regimen terapeutico dado, incluyendo, por ejemplo, la administracion de un agente terapeutico o combinacion dado, intervencion quirurgica, tratamiento de esteroides, etc., o si es probable la supervivencia a largo plazo del paciente tras un regimen terapeutico. El termino "seleccionar" y "seleccion" se utilizan en la presente memoria para referirse a una

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eleccion de entre varias alternativas. Un ejemplo de una "seleccion" es el procedimiento de seleccion de un ACmT de entre dos o mas ACmT disponibles para el tratamiento de una enfermedad.

La "respuesta del paciente" puede evaluarse utilizando cualquier criterio de valoracion que indique un beneficio para el paciente, incluyendo, aunque sin limitacion, (1) inhibicion, en cierto grado, de la progresion de la enfermedad, incluyendo el enlentecimiento y la detencion completa, (2) reduccion del tamano de la lesion, (3) inhibicion (es decir, reduccion, enlentecimiento o detencion completa) de la infiltracion celular patologica en organos y/o tejidos perifericos contiguos, (4) inhibicion (es decir, reduccion, enlentecimiento o detencion completa) de la expansion de la enfermedad, (5) alivio, en cierto grado, de uno o mas smtomas asociados al trastorno, (6) incremento de la duracion de la presentacion sin enfermedad tras el tratamiento, y/o (7) mortalidad reducida en un punto temporal dado tras el tratamiento.

Las "reacciones farmacologicas adversas" (RFA) describen los danos asociados a la utilizacion de medicaciones determinadas a una dosis normal. Las RFA pueden ser locales, es decir, limitadas a una localizacion determinada, o sistemicas, en las que una medicacion ha causado las RFA en todo el organismo y son medibles, por ejemplo, de la circulacion. Las RFA pueden clasificarse segun la causa (tipo A: efectos farmacologicos incrementados - dependientes de la dosis y predecibles (intolerancia, efectos secundarios), tipo B: efectos raros (o idiosincraticos) independientes de la dosis e impredecibles; tipo C: efectos cronicos; tipo D: efectos retardados; tipo E: efectos de final de tratamiento, o de tipo F: fracaso de la terapia), o segun la gravedad. La FDA estadounidense define una "reaccion farmacologica adversa" (RFA) grave como una en la que el resultado clmico es uno de los siguientes: muerte, potencialmente letal, hospitalizacion (inicial o prolongada), discapacidad (significativa, persistente o cambio permanente, alteracion, dano o disrupcion de la funcion/estructura corporal del paciente, actividades ffsicas o calidad de vida), anomalfa congenita, requiere la intervencion para evitar alteraciones o danos permanentes. Aunque no existe ninguna escala oficial para expresar el riesgo farmacologico global, el sistema de evaluacion de riesgo farmacologico iGuard (
www.iguard.org) es una escala de evaluacion de cinco colores: rojo (alto riesgo), naranja (riesgo elevado), amarillo (riesgo controlado

), azul (riesgo general), verde (riesgo bajo). Las RFA comprenden ademas las reacciones a la infusion. Entre estas reacciones a la infusion se incluyen, por ejemplo, urticaria, hipotension, opresion en el pecho, enrojecimiento o presion sangumea reducida.

La "falta de eficacia" (FE) se define como una actividad elevada de la enfermedad a pesar del tratamiento bajo condiciones que de otra manera se consideran adecuadas, por ejemplo con una cantidad habitualmente eficaz de un agente terapeutico.

La "eficacia del tratamiento" es una medida de la capacidad de una intervencion de producir un efecto clmico beneficioso deseado bajo condiciones promedio de aplicacion, habitualmente determinada en estudios de resultado no aleatorizados. La eficacia del tratamiento puede resultar afectada por la FE y/o el cumplimiento de los pacientes.

El termino "beneficio" se utiliza en el sentido mas amplio y se refiere a cualquier efecto deseado e incluye espedficamente el beneficio clmico tal como se define en la presente memoria. El beneficio clmico puede medirse mediante la evaluacion de diversos criterios finales, por ejemplo la inhibicion, en cierto grado, de la progresion de la enfermedad, incluyendo el enlentecimiento y la detencion completa; la reduccion del numero de episodios y/o smtomas de la enfermedad; la reduccion del tamano de la lesion; la inhibicion (es decir, la reduccion, enlentecimiento o detencion completa) de la infiltracion de celulas patologicas en organos y/o tejidos perifericos contiguos; la inhibicion (es decir, la reduccion, enlentecimiento o detencion completa) de la expansion de la enfermedad; la reduccion de la respuesta autoinmunologica, que puede, aunque no necesariamente, resultar en la regresion o ablacion de la lesion de la enfermedad; el alivio, en cierto grado, de uno o mas smtomas asociados al trastorno; el incremento de la duracion de la presentacion sin enfermedad tras el tratamiento, por ejemplo la supervivencia sin progresion; la supervivencia global incrementada; una tasa de respuesta mas alta y/o la mortalidad reducida en un punto temporal dado tras el tratamiento.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "inmunoensayo" (IE) se refiere a un ensayo de union espedfico en el que se detecta un analito mediante la utilizacion de por lo menos un anticuerpo como pareja de union o agente espedfico. Entre los inmunoensayos se incluyen, aunque sin limitacion, el radioinmunoensayo (RIA), el ensayo de fluoroluminiscencia (FLA), el ensayo de quimioluminiscencia (CLA), el ensayo de electroquimioluminiscencia (ECLA) y el ensayo de inmunosorcion ligada a enzima (ELISA). Los metodos de ELISA se describen en, por ejemplo, el documento n° WO 2001/36972.

La expresion "agente de deteccion" se refiere a un agente que se une a un analito y es marcado detectablemente. Entre los ejemplos de agentes de deteccion se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, receptor soluble, fragmento de receptor y similares. La deteccion de un agente de deteccion es posible directamente, es decir, mediante un marcaje unido directamente al agente, o indirectamente mediante una segunda pareja de union marcada, tal como un anticuerpo o receptor adicional que se une espedficamente al agente de deteccion.

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El termino "marcaje" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier sustancia que es capaz de producir una senal detectable, visiblemente o mediante la utilizacion de instrumentacion adecuada. Entre los diversos marcajes adecuados para la utilizacion en la presente invencion se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, cromogenos, compuestos fluorescentes, quimioluminiscentes o electroquimioluminiscentes, catalizadores, enzimas, sustratos enzimaticos, pigmentos, partfculas metalicas y no metalicas coloidales y partfculas de latex y polfmero organico.

Un "marcaje directamente detectable" es, por ejemplo, un cromogeno (grupo fluorescente o luminiscente y pigmento), un grupo activo en RMN o una partfcula metalica. Los quelatos metalicos que pueden detectarse mediante electroquimioluminiscencia tambien son grupos emisores de senales adecuados, resultando de particular interes los quelatos del rutenio, por ejemplo el quelato (bispiridilo)32+ de rutenio. se describen grupos de marcaje de rutenio adecuados en, por ejemplo, la patente EP n° 0 580 979 y en los documentos n° WO 90/05301, n° WO 90/11511 y n° WO 92/14138.

El termino "luminiscencia" se refiere a cualquier emision de luz que no derive energfa de la temperatura de una fuente energetica (por ejemplo una fuente de radiacion electromagnetica, una reaccion qmmica o energfa mecanica). En general, la fuente provoca que un electron de un atomo se desplace de un estado de energfa mas bajo a un estado de energfa mas alto "excitado"; entonces el electron libera esa energfa en forma de luz emitida al retornar a un estado de energfa mas bajo. Dicha emision de luz habitualmente se produce en el rango visible o proximo al visible del espectro electromagnetico. El termino "luminiscencia" incluye, aunque sin limitarse a ellos, fenomenos de emision lummica tales como la fosforescencia, la fluorescencia, la bioluminiscencia, la radioluminiscencia, la electroluminiscencia, la electroquimioluminiscencia y la termoluminiscencia.

La expresion "marcaje luminiscente" se refiere a un marcaje que genera una senal luminiscente, por ejemplo una emision de luz que no deriva energfa de la temperatura de la fuente emisora. El marcaje luminiscente puede ser, por ejemplo, una molecula fluorescente, una molecula fosforescente, una molecula radioluminiscente, un quelato luminiscente, un compuesto de fosforo o que contiene fosforo, o un punto cuantico.

Un "ensayo de electroquimioluminiscencia" o "ECLA" es un ensayo electroqmmico en el que la molecula de analito unida se detecta con un marcaje unido a un agente de deteccion (molecula diana). Un electrodo inicia electroqmmicamente la luminiscencia de un marcaje qmmico unido a un agente de deteccion. La luz emitida por el marcaje se mide con un fotodetector e indica la presencia o cantidad de complejos de molecula de analito/molecula diana unidos. Los metodos ECLA se describen en, por ejemplo, las patentes US n° 5.543.112, n° 5.935.779 y n° 6.316.607. La modulacion de la senal puede maximizarse para diferentes concentraciones de molecula de analito para conseguir mediciones precisas y sensibles.

En un procedimiento de ECLA pueden suspenderse micropartfculas en la muestra para la union eficiente al analito. Por ejemplo, las partfculas pueden presentar un diametro de entre 0,05 pm y 200 pm, de entre 0,1 pm y 100 pm, o de entre 0,5 pm y 10 pm, y un componente de superficie capaz de unirse a una molecula de analito. En un sistema de ECLA utilizado frecuentemente (Elecsys, Roche Diagnostics, Alemania), las micropartfculas presentan un diametro de aproximadamente 3 pm. Las micropartfculas pueden estar formadas de almidon entrecruzado, dextrano, celulosa, protema, polfmeros organicos, copolfmero de estireno, tal como copolfmero de estireno/butadieno, copolfmero de acrilonitrilo/butadieno/estireno, copolfmero de acrilato de vinilacetilo, copolfmero de cloruro de vinilo/acrilato, partfculas inorganicas inertes, dioxido de cromo, oxidos de hierro, sflice, mezclas de sflice, materia proteica, o mezclas de los mismos, incluyendo, aunque sin limitacion, perlas de sefarosa, perlas de latex, partfculas de cubierta-nucleo, y similares. Las micropartfculas preferentemente estan monodispersadas y pueden ser magneticas, tales como perlas paramagneticas. Ver, por ejemplo, las patentes US n° 4.628.037, n° 4.965.392, n° 4.695.393, n° 4.698.302 y n° 4.554.088. Las micropartfculas pueden utilizarse en una cantidad de entre aproximadamente 1 y 10.000 pg/ml.

Un "lfmite de deteccion" para una molecula de analito en un ensayo particular es una concentracion minima de la molecula de analito que puede detectarse, superior a los niveles de fondo para ese ensayo. Por ejemplo, en el IE y el ECLA, el lfmite de deteccion para una molecula de analito que se une espedficamente a una molecula diana puede ser la concentracion a la que la molecula de analito produce una senal IE o una senal de ECLA superior a la producida por un anticuerpo de control que no se une, o que se une no espedficamente, al antfgeno diana. Las moleculas que presentan una respuesta de IE inferior al lfmite de deteccion de IE son IE". Las moleculas que presentan una respuesta de IE igual o superior al lfmite de deteccion de IE son IE+. Las moleculas que presentan una respuesta de ECLA inferior al lfmite de deteccion de ECLA son ECLA". Las moleculas que presentan una respuesta de ECLA igual o superior al lfmite de deteccion de ECLA son ECLA+. Los lfmites de deteccion pueden elevarse o bajarse para conseguir un resultado de ensayo deseado.

Una "fase solida", tambien conocida como "soporte solido", es material polimerico insoluble funcionalizado al que pueden engancharse o unirse covalentemente elementos de biblioteca o reactivos (con frecuencia mediante un conector) para inmovilizarse o dejar que se separen facilmente (mediante filtracion, centrifugacion, lavado, etc.) de los reactivos en exceso, los productos secundarios de reaccion solubles, o los solventes. Las fases solidas para los inmunoensayos segun la invencion se encuentran ampliamente descritos en el estado de la tecnica (ver, por

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ejemplo, Butler J.E., Methods 22:4-23, 2000). La expresion "fase solida" se refiere a una sustancia no fluida e incluye partmulas (incluyendo micropartmulas, perlas, perlas magneticas y partmulas metalicas o no metalicas) preparadas con materiales tales como poKmero, metal (partmulas ferromagneticas, paramagneticas), vidrio y ceramica; sustancias de gel, tales como los geles de s^lice, alumina y polfmero; capilares, que pueden prepararse con poKmero, metal, vidrio y/o ceramica; zeolitas y otras sustancias porosas; membranas; electrodos; placas de microtitulacion; tiras solidas; y cubetas, tubos, chips u otros recipientes de muestra para espectrometro. Un componente de fase solida de un ensayo se distingue de las superficies solidas inertes con las que el ensayo puede encontrarse en contacto en que una "fase solida" contiene por lo menos una fraccion sobre su superficie, que esta destinado a interactuar con el anticuerpo de captura o molecula de captura. Una fase solida puede ser un componente estacionario, tal como un tubo, tira, cubeta, chip o placa de microtitulacion, o pueden ser componentes no estacionarios, tales como perlas y micropartmulas. Las micropartmulas tambien pueden utilizarse como fase solida para formatos de ensayo homogeneo. Puede utilizarse una diversidad de micropartmulas que permiten la union no covalente o covalente de protemas y otras sustancias. Entre dichas partmulas se incluyen partmulas de polfmero tales como poliestireno y poli(metilmetacrilato); partmulas de oro, tales como nanopartmulas de oro y coloides de oro, y partmulas ceramicas, tales como partmulas de sflice, vidrio y de oxido metalico. Ver, por ejemplo, Martin C.R. et al., Analytical Chemistry-News & Features 70:322A-327A, 1998, que se incorpora como referencia en la presente memoria.

Los terminos "chip", "biochip", "chip de polfmero" o "chip de protema" se utilizan intercambiablemente y se refieren a una coleccion de un gran numero de sondas, marcadores o marcadores bioqmmicos dispuestos sobre un sustrato compartido (por ejemplo una fase solida) que podna ser una parte de una oblea de silicio, una tira de nilon, una tira de plastico o un portaobjetos de vidrio.

La expresion "area de ensayo discreta" segun la presente invencion se utiliza para contener un unico tipo de molecula de captura. Las areas de ensayo discretas vecinas sobre una fase solida de componente estacionario, por ejemplo una matriz o un chip, no se solapan entre sf En el caso de que la fase solida sea, por ejemplo, una matriz o un chip, las areas de ensayo discretas pueden ser contiguas entre sf Ademas, resulta posible un espaciado entre por lo menos dos "areas de ensayo discretas" sobre un componente estacionario. Las areas de ensayo discretas sobre una fase solida de componente estacionario, por ejemplo una matriz o un chip, pueden organizarse en patrones geometricos. En el caso de que la fase solida sea un componente no estacionario, tal como perlas y micropartmulas, la expresion "area de ensayo discreta" se refiere a que sobre cada componente no estacionario se inmoviliza un tipo de molecula de captura.

Una "matriz", "macromatriz" o "micromatriz" es una coleccion deliberadamente creada de sustancias, tales como moleculas, marcadores, aberturas, microbobinas, detectores y/o sensores, unidos o fabricados en un sustrato o superficie solida, tal como vidrio, plastico, chip de silicio u otro material que forma una matriz. Las matrices pueden utilizarse para medir los niveles de gran numero, por ejemplo decenas, miles o millones, de reacciones o combinaciones simultaneamente. Una matriz puede contener ademas un numero reducido de sustancias, por ejemplo una, unas cuantas o una docena. Las sustancias en la matriz pueden ser identicas o diferentes. La matriz puede adoptar una diversidad de formatos, por ejemplo bibliotecas de moleculas solubles, bibliotecas de moleculas inmovilizadas, bibliotecas de anticuerpos inmovilizados, bibliotecas de compuestos anclados en perlas de resina, chips de sflice u otras fases solidas. La matriz puede ser una macromatriz o una micromatriz, segun el tamano de las almohadillas en la matriz. Una macromatriz generalmente contiene tamanos de almohadilla de aproximadamente 300 micrometros o mayores y puede obtenerse una imagen facilmente mediante escaners de gel y de filtro. Una micromatriz generalmente contendna tamanos de almohadilla inferiores a 300 micrometros.

Metodo:

Se utilizan crecientemente anticuerpos monoclonales terapeuticos (ACmT) para combatir una amplia diversidad de enfermedades. La aplicacion de un ACmT al factor de necrosis tumoral (<FNTa>) o CD20 (<CD20>), es de importancia crucial para muchos pacientes con un diagnostico de enfermedad inflamatoria cronica, tal como la artritis reumatoide (AR). Estos ACmT tambien se utilizan frecuentemente para el tratamiento de la enfermedad de Crohn (EC), la espondilitis anquilosante (EA), la artritis idiopatica juvenil poliarticular (AIJ), la artritis soriatica (AS), la enfermedad de Bechterew o la soriasis de placas cronica (S), asf como otras enfermedades. Varios ACmT utilizados en la terapia de las enfermedades inflamatorias cronicas pertenecen al grupo de los anticuerpos anti-<FNTa>.

Tal como se ha comentado en detalle anteriormente, los ACmT son ACmT quimericos de raton-humano (por ejemplo el infliximab) o ACmT humanos (por ejemplo el adalimumab). Los ACmT contienen elementos que pueden ser "foraneos" para el sistema inmunologico del paciente. Dichos AC anti-<ACmT> pueden aparecer durante el tratamiento con dicho ACmT como reaccion inmunologica de defensa del paciente (Pan Y. et al., FASEB J. 9:43-49, 1995).

En el caso de que el sistema inmunologico trate un elemento de un ACmT como foraneo, debe esperarse que la administracion de esta protema inducira una respuesta inmunologica. Los AC anti-<ACmT> pueden dirigirse contra cualquier region del ACmT, tal como la region variable, la region constante o la glucoestructura del ACmT. Las

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regiones de dominio variable que comprenden elementos de secuencia raros son dominios que podnan provocar una respuesta imunologica del sistema inmune de un paciente tratado con un ACmT.

Los presentes inventores han desarrollado un metodo de inmunoensayo para la deteccion de anticuerpos anti- <anticuerpo monoclonal terapeutico> (AC anti-<ACmT>) contra un anticuerpo monoclonal terapeutico (ACmT).

En una realizacion, la presente invencion se refiere a un metodo de inmunoensayo para la determinacion de un anticuerpo anti-<anticuerpo monoclonal terapeutico> (anti-AC<ACmT>) in vitro en una muestra de sangre completa, plasma o suero de un paciente tratado con un anticuerpo monoclonal terapeutico (ACmT), comprendiendo el metodo: a) proporcionar un fragmento F(ab) de dicho ACmT unido a una fase solida, b) incubar la fase solida proporcionada en (a) con la muestra, uniendo de esta manera el AC anti-<ACmT> a la fase solida mediante el fragmento F(ab), c) incubar la fase solida obtenida en (b) con un anticuerpo monoclonal <IgG-Ag_h>, en la que dicho anticuerpo monoclonal se une al AC anti-<ACmT>, en el que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo IgM que presenta un valor de la constante de disociacion (=Kd) de entre aproximadamente 10"6 moles/l y 10"8 moles/l, y d) detectar el anticuerpo monoclonal <IgG-Ag_h> unido en (c) y determinar de esta manera el AC anti-<ACmT> en la muestra.

El sujeto o paciente puede ser cualquier especie de mairnfero. En una realizacion preferente, el sujeto o paciente es un ser humano. En una realizacion, se determina un AC anti-<ACmT> humano en el metodo de inmunoensayo.

En una realizacion, la muestra se selecciona de entre el grupo que consiste de una muestra lfquida, tal como anticuerpos recuperados del paciente, sangre completa, plasma o suero. En una realizacion adicional, la muestra se selecciona de entre el grupo que consiste de sangre completa, plasma o suero, siendo el suero el mas preferente. En una realizacion, la muestra se deriva de un ser humano.

El antfgeno unido a la fase solida para la determinacion de AC anti-<ACmT> contra un ACmT se selecciona de entre el grupo que consiste de un fragmento Fab' de un ACmT, un fragmento Fab de un ACmT, un scFv que representa un ACmT y un diacuerpo que representa un ACmT. En una realizacion preferente, el fragmento F(ab) de dicho ACmT se selecciona de entre el grupo que consiste de un fragmento Fab' de dicho ACmT y un fragmento Fab de dicho ACmT. En una realizacion preferente, el antfgeno unido a una fase solida para la determinacion de un AC anti- <ACmT> es un fragmento Fab del ACmT de interes. En una realizacion preferente, el antfgeno unido a una fase solida para la determinacion de un AC anti-<ACmT> es un fragmento Fab' del ACmT de interes.

Inesperadamente los inventores han encontrado que un metodo de inmunoensayo basado en la utilizacion de un fragmento F(ab) de un ACmT de interes unido a una fase solida puede superar por lo menos algunas de las limitaciones actuales referentes a la especificidad y sensibilidad de deteccion de un AC anti-<ACmT> en una muestra de un paciente tratado con dicho ACmT.

El antfgeno (por ejemplo un fragmento F(ab)) proporcionado en el metodo de inmunoensayo, en una realizacion se une a la fase solida mediante un sistema de union seleccionado de entre el grupo que consiste de union covalente, union directa e interaccion de afinidad. Una union covalente de un antfgeno (por ejemplo un fragmento F(ab)) proporcionado en el metodo de inmunoensayo puede llevarse a cabo mediante, por ejemplo, una activacion con epoxi, NHS o carboximetilo de la fase solida y la posterior reaccion con un grupo funcional apropiado del antfgeno. Una union directa de un antfgeno (por ejemplo un fragmento F(ab)) proporcionado en el metodo de inmunoensayo puede basarse en, por ejemplo, interacciones hidrofobicas o hidrofflicas, la union de quelatos o interacciones adsortivas. Una interaccion de afinidad de un antfgeno (por ejemplo un fragmento F(ab)) puede basarse en, por ejemplo, interacciones de biotina/estreptavidina, biotina/avidina, etiqueta/anti-etiqueta, lecitina/anticuerpo o biotina/anticuerpo anti-<biotina>.

En una realizacion, el antfgeno proporcionado en el metodo de inmunoensayo se une a la fase solida mediante un sistema de union seleccionado de entre el grupo que consiste de biotina/estreptavidina, biotina/avidina y biotina/anticuerpo anti-<biotina>. Para permitir dicha union, el antfgeno se biotinila (por ejemplo el fragmento F(ab)- Bi). En una realizacion preferente, un fragmento F(ab) proporcionado en el metodo se une a la fase solida mediante un sistema de union seleccionado de entre el grupo que consiste de biotina/estreptavidina y biotina/avidina. En una realizacion preferente adicional, un fragmento F(ab) proporcionado en el metodo se une a la fase solida mediante un sistema de union seleccionado de entre el grupo que consiste de biotina/estreptavidina y biotina/avidina. En una realizacion preferente adicional, un fragmento Fab' proporcionado en el metodo se une a la fase solida mediante un sistema de union seleccionado de entre el grupo que consiste de biotina/estreptavidina y biotina/avidina.

Los metodos de biotinilacion son conocidos por el experto en la materia. Una descripcion detallada de variantes de reaccion y condiciones de reaccion para conjugar fragmentos de anticuerpo, asf como otras protemas y biomoleculas, se proporciona en G.T. Hermanson: Bioconjugate Techniques, Elsevier/AP, 2008, 2a edicion (ISBN: 978-01-3). El metodo para la produccion de un fragmento Fab conjugado con biotina (Fab-Bi) de un ACmT segun la presente invencion se describe en el Ejemplo 1.

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La union del antigeno (por ejemplo el fragmento F(ab)) a la fase solida puede llevarse a cabo bajo condiciones laterales controladas, de manera que el dominio de union a antfgeno se presente hacia afuera de la superficie de la fase solida, proporcionando la accesibilidad mas alta del antigeno, utilizando (i) la conjugacion espedfica de sitio (por ejemplo una conjugacion en la region de bisagra de un fragmento F(ab) o una conjugacion asistida por etiqueta, o (ii) una interaccion espedfica de sitio a con la fase solida (por ejemplo una interaccion estericamente orientada espedfica de un antfgeno con una fase solida recubierta con lecitina).

En una realizacion, la region bisagra de un fragmento F(ab) se conjuga con la fase solida. En una realizacion, la region bisagra de un fragmento Fab se conjuga con la fase solida. En una realizacion, la region bisagra de un fragmento Fab' se conjuga con la fase solida.

En una realizacion, un fragmento F(ab) se conjuga con la fase solida mediante una interaccion orientada estericamente de dicho fragmento F(ab) con una fase solida recubierta con lecitina. En una realizacion, un fragmento Fab se conjuga con la fase solida mediante una interaccion orientada estericamente de dicho fragmento Fab con una fase solida recubierta con lecitina. En una realizacion, un fragmento F(ab) se conjuga con la fase solida mediante una interaccion orientada estericamente de dicho fragmento Fab' con una fase solida recubierta con lecitina.

Un acoplamiento estocastico no dirigido estericamente de un fragmento F(ab) a la fase solida proporciona resultados equivalentes al acoplamiento dirigido estericamente. Sin embargo, sin deseo de restringirse a dicha teona, el acoplamiento dirigido puede, bajo algunas circunstancias, resultar ventajoso.

En una realizacion, el metodo segun la presente invencion se pone en practica con un ACmT de interes seleccionado de entre el grupo que consiste de anticuerpos quimericos (AQ) y anticuerpos humanizados (AH).

En una realizacion, el metodo segun la presente invencion se pone en practica con un F(ab) biotinilado (F(ab)-Bi) de un anticuerpo monoclonal terapeutico (ACmT) seleccionado de entre el grupo que consiste de abciximab, adalimumab, alemtuzumab, basiliximab, bevacizumab, cetuximab, certolizumab pegol, daclizumab, eculizumab, efalizumab, gemtuzumab, ibritumomab tiuxetan, infliximab, muromonab-CD3, natalizumab, omalizumab, palivizumab, panitumumab, ranibizumab, rituximab, tositumomab y trastuzumab En una realizacion preferente, el metodo segun la presente invencion se pone en practica con un fragmento F(ab)-Bi de un anticuerpo monoclonal terapeutico (ACmT) seleccionado de entre el grupo que consiste de infliximab, adalimumab, certolizumab y rituximab. En otra realizacion preferente, el metodo segun la presente invencion se pone en practica con un fragmento F(ab)-Bi de un anticuerpo monoclonal terapeutico (ACmT) seleccionado de entre el grupo que consiste de infliximab, y adalimumab. En otra realizacion preferente, el metodo segun la presente invencion se pone en practica con un fragmento F(ab)-Bi del anticuerpo monoclonal terapeutico (ACmT) infliximab.

En una realizacion, el metodo segun la presente invencion se pone en practica con un F(ab) biotinilado (F(ab)-Bi) de un anticuerpo monoclonal terapeutico (ACmT) seleccionado de entre el grupo que consiste de abciximab, adalimumab, alemtuzumab, basiliximab, bevacizumab, cetuximab, certolizumab pegol, daclizumab, eculizumab, efalizumab, gemtuzumab, ibritumomab tiuxetan, infliximab, muromonab-CD3, natalizumab, omalizumab, palivizumab, panitumumab, ranibizumab, rituximab, tositumomab y trastuzumab. En una realizacion preferente, el metodo segun la presente invencion se pone en practica con un fragmento Fab-Bi de un anticuerpo monoclonal terapeutico (ACmT) seleccionado de entre el grupo que consiste de infliximab, adalimumab, certolizumab y rituximab. En otra realizacion preferente, el metodo segun la presente invencion se pone en practica con un fragmento F(ab)-Bi de un anticuerpo monoclonal terapeutico (ACmT) seleccionado de entre el grupo que consiste de infliximab y adalimumab. En otra realizacion preferente, el metodo segun la presente invencion se pone en practica con un fragmento F(ab)-Bi del anticuerpo monoclonal terapeutico (ACmT) infliximab.

En una realizacion, el metodo segun la presente invencion se pone en practica con un Fab' biotinilado (Fab'-Bi) de un anticuerpo monoclonal terapeutico (ACmT) seleccionado de entre el grupo que consiste de abciximab, adalimumab, alemtuzumab, basiliximab, bevacizumab, cetuximab, certolizumab pegol, daclizumab, eculizumab, efalizumab, gemtuzumab, ibritumomab tiuxetan, infliximab, muromonab-CD3, natalizumab, omalizumab, palivizumab, panitumumab, ranibizumab, rituximab, tositumomab y trastuzumab. En una realizacion preferente, el metodo segun la presente invencion se pone en practica con un fragmento Fab'-Bi de un anticuerpo monoclonal terapeutico (ACmT) seleccionado de entre el grupo que consiste de infliximab, adalimumab, certolizumab y rituximab. En otra realizacion preferente, el metodo segun la presente invencion se pone en practica con un fragmento Fab'-Bi de un anticuerpo monoclonal terapeutico (ACmT) seleccionado de entre el grupo que consiste de infliximab y adalimumab. En otra realizacion preferente, el metodo segun la presente invencion se pone en practica con un fragmento Fab'-Bi del anticuerpo monoclonal terapeutico (ACmT) infliximab.

Es conocido por el experto en la materia que tras la union del AC anti-<ACmT> a una fase solida mediante el fragmento F(ab) formando un complejo AC anti-<ACmT>-F(ab), pueden eliminarse compuestos unidos laxamente no espedficos, por ejemplo mediante una etapa de lavado.

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El AC anti-<ACmT> que debe determinarse se une espedficamente al fragmento F(ab) del ACmT de interes. En una realizacion preferente, el anticuerpo de interes es un ACmT anti-<FNTa>. En otra realizacion preferente, el anticuerpo de interes se selecciona de entre el grupo que consiste de infliximab, adalimumab, certolizumab y rituximab. En otra realizacion preferente, el anticuerpo de interes se selecciona de entre el grupo que consiste de infliximab y adalimumab. En otra realizacion preferente el anticuerpo de interes es el infliximab. Se forma un complejo "Ac anti-<ACmT>-fragmento F(ab), en caso de hallarse presente AC anti-<ACmT> en la muestra obtenida de un paciente tratado con un ACmT y se une al fragmento F(a) de dicho ACmT unido a la fase solida. Tal como resultara evidente para el experto en la materia, el fragmento F(ab) del ACmT y del AC anti-<ACmT> se incuban bajo condiciones que permiten la formacion de un complejo de AC anti-<ACmT>-F(ab).

La tecnica de ensayo de inmunosorcion ligada a enzima (ELISA) es un tipo de ensayo comun en la investigacion de la respuesta inmunogenica de un paciente a un ACmT. Existen varios formatos de ELISA diferentes conocidos por el experto en la materia, por ejemplo el "ensayo indirecto", el "ensayo de tipo sandwich", el "ensayo competitivo", el "ensayo de puente de doble antigeno (EPDA)" o el "ensayo inverso". Mire-Sluis A.R. et al., J. Immunol. Methods 289:1-16, 2004, resumen las recomendaciones de diseno y optimizacion de los inmunoensayos utilizados en la deteccion de anticuerpos del huesped, por ejemplo los AC anti-<ACmT> frente a los productos biotecnologicos (por ejemplo los ACmT).

En una realizacion preferente, se lleva a cabo el metodo segun la presente invencion en un formato de ensayo indirecto. Inesperadamente, en el formato de ensayo indirecto los fragmentos Fab resultan en una diferenciacion mucho mejor entre resultados verdaderamente negativos y positivos, tal como se muestra en los Ejemplos 4 y 5. En dicho formato de ensayo indirecto se utiliza un anticuerpo monoclonal <IgG ag_h> como anticuerpo monoclonal de deteccion.

El metodo de inmunoensayo segun la presente invencion en una realizacion se pone en practica con un anticuerpo de deteccion <IgG-Ag_h> que presenta una baja afinidad para la union de los anticuerpos espedficos de antfgeno (AC anti-<ACmT>). La afinidad de un anticuerpo para un epftopo se define como la intensidad de todas las interacciones no covalentes entre el sitio individual de union a antfgeno en un anticuerpo y el epftopo individual. Los anticuerpos con una baja afinidad se unen debilmente y se disocian rapidamente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad se unen mas fuertemente y siguen unidos durante un periodo de tiempo mas prolongado. La afinidad en un sitio de union no siempre refleja la intensidad real de una interaccion de antfgeno-anticuerpo. Por ejemplo, en el caso de antfgenos complejos, con muchos determinantes antigenicos repetidos y con anticuerpos complementarios que presentan varios sitios de union de baja afinidad, se observa sin embargo una union bastante union debido a fenomenos de union cooperativa. La interaccion de un antfgeno y un sitio de union a antfgeno de un anticuerpo en un primer sitio incrementa la probabilidad de una reaccion en un segundo sitio de union a antfgeno del mismo anticuerpo. La fuerza de dichas multiples interacciones entre el anticuerpo multivalente y un antfgeno se denomina avidez. Una avidez elevada compensa una baja afinidad tal como es el caso, por ejemplo, de la inmunoglobulina pentamerica IgM. En el metodo segun la invencion, preferentemente se utiliza un anticuerpo con una baja afinidad para el anticuerpo espedfico de antfgeno, que presenta varios, es decir por lo menos dos, preferentemente por lo menos cuatro y tambien preferentemente diez y mas paratopos, tal como la inmunoglobulina IgM o IgG que se entrecruzan uno con otro. Son ejemplos de lo anterior los factores reumatoides, que habitualmente estan compuestos de moleculas de IgM y mas raramente tambien de moleculas de IgG, IgA e IgE.

Un experto en la materia conoce que el valor de la afinidad de una pareja de union, preferentemente un anticuerpo, se determina a partir del coeficiente de afinidad definido con el modelo de Langmuir. Una molecula con una constante de tasa de disociacion (Kdisoc.) elevada es probable que presente una baja afinidad, ya que la constante de equilibrio de disociacion KD=Kdisoc./Kasoc. Predice que el coeficiente de afinidad para una afinidad de union muy elevada es de entre aproximadamente 10"9 y 10"11, para una afinidad de union intermedia, de aproximadamente 10, para una afinidad de union baja, de aproximadamente 10"7 y para una afinidad de union muy baja, de aproximadamente 10"6. El anticuerpo monoclonal de deteccion <Ag_h-IgG< de la presente invencion presenta una afinidad de union baja. En una realizacion, el anticuerpo monoclonal de deteccion <IgG ag_h> utilizado en el inmunoensayo de la presente invencion es un anticuerpo que presenta un valor de Kd de entre aproximadamente 10" 6 moles/l y 10-8 moles/l. En una realizacion preferente, el anticuerpo monoclonal de deteccion <IgG ag_h> es un anticuerpo con un valor de Kd de entre aproximadamente 10-7 moles/l y 10-8 moles/l.

Tal como se ha comentado anteriormente, la determinacion del AC anti-<ACmT> en la muestra unida en la etapa (c) del metodo de inmunoensayo dado a conocer en la presente invencion se lleva a cabo con un anticuerpo monoclonal de deteccion <IgG ag_h>. En una realizacion, dicho anticuerpo monoclonal de deteccion es de la clase de inmunoglobulina IgM. Preferentemente el anticuerpo monoclonal <IgG ag_h> se une a anticuerpos de la clase de inmunoglobulina IgG que se unen a su antfgeno de una manera espedfica. Dicho anticuerpo monoclonal solo reconoce los AC anti-<ACmT> densamente empaquetados y unidos espedficamente, es decir, aquellos AC anti- <ACmT> que se han unido a los fragmentos F(ab) de los ACmT de interes aplicados en puntos sobre la fase solida. Dicho anticuerpo de deteccion no reacciona con los IgG unidos o adsorbidos no espedficamente.

En una realizacion, el metodo segun la presente invencion se pone en practica utilizando un anticuerpo monoclonal marcado <IgG ag_h>. En una realizacion preferente, el anticuerpo monoclonal <IgG ag_h> se marca con Dig (<IgG

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ag_h>Dig). El anticuerpo monoclonal marcado con Dig <IgG ag_h>-Dig se detecta facilmente con un anticuerpo anti- <Dig> conjugado con un marcaje detectable. Dicho marcaje detectable, por ejemplo, puede seleccionarse de entre marcajes luminiscentes, marcajes quimioluminiscentes, marcajes electroquimioluminiscentes, marcajes fluorescentes o marcajes radioactivos.

El anticuerpo monoclonal <IgG ag_h> utilizado en el metodo segun la presente invencion en una realizacion es espedfico para la clase de Ig seleccionada que debe determinarse. En una realizacion preferente, el anticuerpo monoclonal <IgG ag_h> utilizado en el metodo segun la presente invencion es espedfico para la clase IgG. En una realizacion, el anticuerpo monoclonal <IgG ag_h> es capaz de detectar todas las subclases de IgG.

Inesperadamente los inventores pudieron demostrar que la utilizacion de un anticuerpo monoclonal de deteccion <IgG ag_h> en un metodo de inmunoensayo tal como se da a conocer en la presente invencion conduce a una deteccion mejorada del AC anti-<ACmT> en una muestra y supera por lo menos algunas de las limitaciones actuales en la deteccion precoz de los AC anti-<ACmT>. Inesperadamente, la combinacion de un fragmento F(ab) del ACmT de interes aplicado en un punto sobre la fase solida con el anticuerpo de deteccion <IgG ag_h> en un formato de inmunoensayo indirecto ha permitido a los inventores la deteccion muy precoz de AC anti-<ACmT> de la clase IgG de dicho ACmT. Resulta posible detectar el AC anti-<ACmT> de la clase IgG in vitro en una muestra de un paciente tratado con un ACmT desde las 2 semanas posteriores a la primera administracion de dicho ACmT. En una realizacion preferente, la combinacion de un fragmento Fab del ACmT de interes aplicado en un punto sobre la fase solida con el anticuerpo de deteccion <IgG ag_h> en un formato de inmunoensayo indirecto ha permitido la deteccion de AC anti-<ACmT> de la clase IgG de dicho ACmT desde las 2 semanas posteriores a la primera administracion de dicho ACmT. En una realizacion tambien preferente, la combinacion de un fragmento Fab' del ACmT de interes aplicado en un punto sobre la fase solida con el anticuerpo de deteccion <IgG ag_h> en un formato de inmunoensayo indirecto ha permitido la deteccion de AC anti-<ACmT> de la clase IgG de dicho ACmT desde las 2 semanas posteriores a la primera administracion de dicho ACmT.

En una realizacion, el anticuerpo monoclonal <IgG ag_h> utilizado en el metodo segun la presente invencion se selecciona de entre el grupo que consiste de MAb <IgG ag_h>M-3.022.5-IgM (DSM ACC2873), MAb <IgG ag_h>M- 1.010.2-IgM y MAb <IgG ag_h>M-1.1.7-IgM (mostrado en la Tabla 1). En una realizacion preferente, el anticuerpo monoclonal de deteccion <IgG ag_h> es el MAb <IgG ag_h>M3.022.5-IgM-Dig (DSM n° ACC2873). Un elemento caractenstico del MAb <IgG ag_h>M3.022.5-IgM-Dig es que las inmunoglobulinas unidas no espedficamente a la fase solida, es decir, aquellas que no son espedficamente ligadas por un antfgeno, no resultan reconocidas o solo resultan reconocidas en un grado despreciable. Sin deseo de restringirse a dicha teona, la utilizacion de MAb <IgG ag_h>M3.022.5-IgM-Dig podna reducir sustancialmente la senal de fondo en el inmunoensayo y de esta manera mantenerlo a un nivel bajo constante independientemente de las IgG posiblemente interfirientes en una muestra que debe analizarse.

El metodo de inmunoensayo segun la presente invencion en una realizacion se lleva a cabo en un formato de matriz, por ejemplo sobre un chip o biochip. En dicho formato de matriz, el fragmento o fragmentos F(ab) de uno o mas ACmT se inmovilizan sobre areas discretas de la fase solida, las cuales se definen como areas de ensayo que se encuentran espacialmente separadas entre sf. Los metodos para inmovilizar las parejas de union de captura (por ejemplo el fragmento o fragmentos F(ab)) resultaran familiares al experto en la materia y se dan a conocer, por ejemplo, en la patente EP n° 0 929 319 (Hornauer et al.).

Las areas de ensayo que comprenden uno o mas puntos que contienen la misma pareja de union de captura pueden encontrarse presentes sobre la fase solida. En una realizacion, pueden formarse patrones que consisten de varios puntos identicos.

Resulta ventajoso de dicho inmunoensayo en formato de matriz (por ejemplo sobre un chip o biochip) que puedan determinarse simultaneamente diferentes analitos. En una realizacion, cada uno de diversas areas o puntos discretos en un formato de matriz contiene fragmentos F(ab) de uno de los diferentes ACmT de interes que son capaces de unirse espedficamente a un AC anti-<ACmT> que debe determinarse. En una realizacion, dicha matriz comprende por lo menos dos areas discretas, en la que en cada area se encuentra presente un fragmento F(ab) diferente de un ACmT de interes. Tambien resulta posible disponer de una combinacion de fragmentos F(ab) derivados de diferentes ACmT de interes y varios puntos, conteniendo cada uno el fragmento F(ab) de uno de dichos ACmT diferentes, respectivamente, sobre una matriz. En una realizacion, se encuentran presentes sobre dicha matriz por lo menos dos fragmentos F(ab) diferentes derivados de los ACmT de interes, presentando cada uno dos o mas puntos individuales. En una realizacion, la matriz utilizada en el metodo preferentemente consiste de un soporte realizado en metal, vidrio, plastico o poliestireno. Los soportes de poliestireno preferentemente se utilizan en el metodo segun la invencion, los cuales son conocidos por el experto en la materia y se describen en, por ejemplo, la patente EP n° 0939319 (Hornauer et al.). La utilizacion del anticuerpo <IgG ag_h>M3.022.5-IgM-Dig en dicho metodo realizado en un formato de matriz permite que puedan combinarse sobre una matriz entre varios y un gran numero de diferentes ensayos para AC anti-<ACmT> de interes. Una ventaja importante de un formato de ensayo de matriz es que solo se requiere una composicion tamponadora en cada etapa de manipulacion.

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En una realizacion, el metodo segun la presente invencion se lleva a cabo utilizando una muestra proporcionada por un paciente no mas tarde de 14 semanas despues de la primera administracion de un ACmT. En una realizacion, la deteccion de AC anti-<ACmT> se realiza a partir de las 2 semanas posteriores a la primera administracion de un ACmT. En una realizacion, la deteccion de AC anti-<ACmT> se realiza entre las semanas 2 y 6 posteriores a la primera administracion de un ACmT. En una realizacion, la deteccion de AC anti-<ACmT> se realiza a partir de las 6 semanas posteriores a la primera administracion de un ACmT.

Los metodos segun la presente invencion tambien resultan valiosos para la seleccion de una terapia de ACmT apropiada.

La falta de efectividad (FE) de una terapia de ACmT es un fenomeno raro pero conocido en pacientes bajo tratamiento con un ACmT, por ejemplo para los pacientes bajo tratamiento con un anticuerpo anti-<FNTa>. La determinacion de AC anti-<ACmT> en un paciente bajo tratamiento con un ACmT se ha utilizado en un intento de predecir la FE de una terapia de ACmT. Se ha demostrado en la tecnica anterior que los AC anti-<ACmT> pueden reducir la cantidad eficaz de ACmT disponible en la circulacion del paciente bajo tratamiento con dichos ACmT. Actualmente no esta claro que determina la magnitud de la respuesta de AC anti-<ACmT> en un paciente tratado con dicho ACmT (Aarden L. et al., Current Opinion in Immunology 20:431-435, 2008). En algunos enfoques terapeuticos, la dosis de dicho ACmT se ha elevado tras un diagnostico de FE para compensar el ACmT disponible en la circulacion del paciente, abriendo algunas preguntas cientffica y clmicamente relevantes. La determinacion del nivel serico de ACmT actualmente es el estandar de oro en el seguimiento de la eficacia del tratamiento con una terapia de ACmT. Aarden et al. han propuesto que debena realizarse un seguimiento frecuente de los pacientes para los niveles sericos de ACmT y que el nivel de los anticuerpos podna guiar en la decision de si incrementar la dosis o cambiar a otro ACmT/farmaco.

Tambien se conocen de la tecnica anterior efectos secundarios (efectos adversos, RFA) durante la terapia de ACmT, por ejemplo durante la terapia anti-<FNTa>. Es conocido por el experto en la materia que los pacientes bajo terapia de ACmT estan en riesgo de desarrollar una RFA. Sin embargo, aparentemente no se dispone de ningun metodo para evaluar dicho riesgo pronto despues del inicio de una terapia basada en ACmT, por ejemplo antes de que se produzcan RFA.

Inesperadamente se ha encontrado que una determinacion in vitro de anticuerpos contra un ACmT de interes en una muestra de un paciente bajo tratamiento con dicho ACmT permite predecir que pacientes estan en riesgo incrementado de desarrollar una RFA durante el tratamiento con un ACmT antes de que se produzca una RFA.

En una realizacion adicional, se utiliza una determinacion in vitro de los anticuerpos contra un ACmT en una muestra de sangre completa, plasma o suero de un paciente bajo tratamiento con dicho ACmT para identificar los pacientes en riesgo de desarrollar una RFA durante el tratamiento con un ACmT, en el que el paciente positivo para un AC anti-<ACmT> se encuentra en riesgo de desarrollar una RFA. Sin deseo de restringirse a dicha teona, bien podna ser el caso de que en un paciente con resultado positivo en el ensayo para AC anti-<ACmT> contra un ACmT determinado tratado con una dosis mas elevada de dicho ACmT, el riesgo de desarrollar posteriormente una RFA sea mucho mas alto. Por lo tanto, debe considerarse seriamente un cambio de terapia tras la determinacion de un AC anti-<ACmT> contra el primer ACmT administrado a otro (segundo) ACmT con el fin de reducir el riesgo de una RFA posteriormente.

En una realizacion, se utiliza el metodo de la presente invencion para determinar si un paciente esta en riesgo de desarrollar una RFA durante el tratamiento con un ACmT. En dicha realizacion, un paciente con un resultado positivo en el ensayo para AC anti-<ACmT> se encuentra en riesgo de desarrollar una rFa. Un paciente con un resultado positivo para AC anti-<ACmT> en el metodo dado a conocer en la presente memoria presenta un riesgo incrementado de desarrollar una RFA. Dicho riesgo puede determinarse como un riesgo relativo utilizando metodos matematicos conocidos por el experto en la materia. Tal como se muestra en los ejemplos, el desarrollo temprano de AC anti-<ACmT> precede al posterior desarrollo de una RFA y/o el abandono de los pacientes del estudio. En una realizacion, el riesgo de desarrollar una RFA es un riesgo relativo de por lo menos 40%; en una realizacion preferente, el riesgo es un riesgo relativo de por lo menos 45%.

Las graficas de serie temporal de AC anti-<ACmT> de las figs. 2 y 3 muestran la diferencia entre pacientes que no han abandonado y aquellos que se han retirado del estudio debido a una RFA. Los datos de estudio del Ejemplo 5 se representan en la fig. 2, mostrando los resultados para pacientes tratados con infliximab en forma de curvas de Kaplan-Meier (KM) con respecto al estatus de AC anti-<ACmT> en la semana 6. En la fig. 3, los resultados de los pacientes tratados con infliximab como curvas de KM con respecto al estatus de anti-<ACmT> en la semana 14. En ambas figuras para pacientes que han abandonado debido a una RFA (o para pacientes que han abandonado debido a la falta de efecto del tratamiento) las curvas de KM de los pacientes positivos para Ac anti-<ACmT> (AC anti-<ACmT>+) son mas bajas que las curvas de KM de los pacientes negativos para Ac anti-<ACmT> (AC anti- <ACmT>-). Esta diferencia es incluso mas visible en la semana 6 que en la semana 14.

En una realizacion, la presente invencion se refiere a un metodo para seleccionar un anticuerpo terapeutico alternativo para un paciente bajo tratamiento con un primer ACmT, en el que se encuentra disponible por lo menos

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un primer y uno o mas ACmT alternativos, que comprende: a) determinar segun un metodo de inmunoensayo de la presente invencion in vitro un AC anti-<ACmT> contra el primer ACmT en una muestra procedente de un paciente tratado con dicho primer ACmT, y b) seleccionar un ACmT alternativo para la terapia futura, en caso de que se encuentre presente un AC anti-<ACmT> contra dicho primer ACmT.

En una realizacion, el metodo para seleccionar un anticuerpo terapeutico alternativo se pone en practica utilizando una muestra obtenida de un paciente que presenta un diagnostico de enfermedad inflamatoria cronica. En una realizacion, la enfermedad inflamatoria cronica se selecciona de entre el grupo que consiste de artritis reumatoide (AR), enfermedad de Crohn (EC), espondilitis anquilosante (EA), artritis idiopatica juvenil poliarticular (AIJ), artritis soriatica (AS), enfermedad de Bechterew y/o soriasis de placas cronica (S). En una realizacion preferente el paciente presenta un diagnostico de artritis reumatoide (AR).

En una realizacion, el metodo para seleccionar un anticuerpo terapeutico alternativo se pone en practica utilizando una muestra obtenida de un paciente humano. En una realizacion, el AC anti-<ACmT> determinado es un AC anti- <FNTa>.

En una realizacion, la presente invencion se refiere a un metodo para seleccionar un ACmT alternativo para un paciente bajo tratamiento con un primer ACmT, en el que se encuentra disponible por lo menos un primer y uno o mas ACmT alternativos, que comprende: a) determinar in vitro un AC anti-<ACmT> de la clase IgG contra el primer ACmT en una muestra procedente de un paciente tratado con dicho primer ACmT, y b) seleccionar un ACmT alternativo para la terapia futura, en caso de que se encuentre presente un AC anti-<ACmT> contra dicho primer ACmT.

En una realizacion, el metodo para seleccionar un anticuerpo terapeutico alternativo se lleva a cabo utilizando una muestra proporcionada por un paciente no mas tarde de 14 semanas despues de la primera administracion de un ACmT. En una realizacion, la deteccion de AC anti-<ACmT> se realiza a partir de las 2 semanas posteriores a la primera administracion de un ACmT. En una realizacion, la deteccion de AC anti-<ACmT> se realiza entre las semanas 2 y 6 posteriores a la primera administracion de un ACmT. En una realizacion, la deteccion de AC anti- <ACmT> se realiza a partir de las 6 semanas posteriores a la primera administracion de un ACmT.

Es conocido por el experto en la materia como seleccionar un ACmT alternativo para la terapia futura, en el caso de que se halle presente un AC anti-<ACmT> contra dicho primer ACmT en una muestra obtenida de un paciente bajo tratamiento con dicho primer ACmT. En una realizacion, el ACmT alternativo se selecciona de entre el grupo que consiste de un anticuerpo monoclonal anti-<FNTa> y rituximab. En una realizacion, el ACmT alternativo se selecciona de entre el grupo que consiste de infliximab, adalimumab, certolizumab y rituximab. En una realizacion, el ACmT alternativo es un anticuerpo monoclonal anti-<FNTa>. En una realizacion, el ACmT alternativo es un anticuerpo anti-<CD20>. En una realizacion, el ACmT alternativo es el rituximab. En una realizacion, el primer ACmT es un anticuerpo monoclonal anti-<FNTa> y el ACmT alternativo es un anticuerpo anti-<CD20>. En una realizacion, el primer ACmT es un anticuerpo monoclonal anti-<FNTa> y el ACmT alternativo es el rituximab.

Utilizacion:

El metodo segun la presente invencion puede utilizarse generalmente para la deteccion de los AC anti-<ACmT>, tanto en ensayo clrnico como tambien en la rutina clrnica. En una realizacion, la presente invencion se refiere a la utilizacion del metodo de inmunoensayo de la presente invencion para la deteccion de los AC anti-<ACmT>.

En una realizacion, la presente invencion se refiere a la utilizacion del metodo de inmunoensayo tal como se da a conocer en la presente memoria para la identificacion de un paciente en riesgo de desarrollar una reaccion farmacologica adversa (RFA) mediante la determinacion de un AC anti-<ACmT> in vitro en una muestra de sangre completa, plasma o suero de un paciente tratado con un anticuerpo monoclonal terapeutico (ACmT).

En una realizacion, la presente invencion se refiere a la utilizacion de un metodo de inmunoensayo para la determinacion de un AC anti-<ACmT> in vitro, en el que se detecta el AC anti-<ACmT> utilizando una muestra de sangre completa, plasma o suero obtenida de un paciente no mas tarde de las 14 semanas despues de la primera administracion de un ACmT. En una realizacion, la deteccion de AC anti-<ACmT> se realiza a partir de las 2 semanas posteriores a la primear administracion de un ACmT. En una realizacion, la deteccion de AC anti-<ACmT> se realiza entre las semanas 2 y 6 posteriores a la primera administracion de un ACmT. En una realizacion, la deteccion de AC anti-<ACmT> se realiza no mas tarde de las 6 semanas despues de la primera administracion de un ACmT.

El metodo segun la presente invencion puede utilizarse para el seguimiento de los pacientes tratados con un anticuerpo monoclonal terapeutico (ACmT) que estan en riesgo de desarrollar una RFA. El metodo se utiliza en una realizacion para investigar la frecuencia de desarrollo de AC anti-<ACmT> en pacientes durante el tratamiento con ACmT y para determinar si el desarrollo de dichos AC anti-<ACmT> se asocia a una RFA temprana y/o al fracaso del tratamiento.

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Los ejemplos y la figura siguientes se proporcionan con el fin de ayudar a la comprension de la presente invencion, el alcance real de la cual se proporciona en las reivindicaciones adjuntas. Debe entenderse que resulta posible llevar a cabo modificaciones de los procedimientos indicados sin apartarse del espmitu de la invencion.

Descripcion de las figuras

Figura 1

Figura 2

Figura 3

Figura 4

Figura 5a

Figura 5b

Ejemplo 1

La fig. 1 muestra el formato de inmunoensayo indirecto tal como se indica en el Ejemplo 3. AC anti-<ACmT> = anticuerpo anti-<anticuerpo monoclonal terapeutico> que debe detectarse en una muestra que debe investigarse; MAb <IgG ag_h>; Dig = anticuerpo monoclonal marcado con Dig <IgG ag_h>; F(ab')2-Bi y Fab-Bi = sobre fase solida, anffgenos biotinilados inmovilizados de union espedfica a AC anti-<ACmT>.

La fig. 2 muestra las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier para pacientes tratados con infliximab que abandonaron el estudio debido a RFA <= 50 semanas. Eje X = abandono del estudio en dfas (ab_dfas); eje Y = funcion de distribucion de la supervivencia; lmea inferior = pacientes con anticuerpos antifarmaco detectados (AC anti-<ACmT>+) en la semana 6: total = 31, fracaso = 15; lmea superior = pacientes sin anticuerpos antifarmacos detectados (AC anti- <ACmT>) en la semana 6: total = 94, fracaso = 12; valor de p de la prueba de rangos logantmicos < 0,0001; cociente de riesgos=5,06, IC al 95% cociente de riegos = [2,36, 10,84]. Se muestran los datos en la Tabla 4.

La fig. 3 muestra las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier para pacientes tratados con infliximab que abandonaron el estudio debido a RFA <= 50 semanas. Eje X = abandono del estudio en dfas (ab_dfas); eje Y = funcion de distribucion de la supervivencia; lmea inferior = pacientes con anticuerpos antifarmaco detectados (AC anti-<ACmT>+) en la semana 14: total = 43, fracaso = 16; lmea superior = pacientes sin anticuerpos antifarmaco detectados (AAF) en la semana 14: total = 88, fracaso = 12; valor de p de la prueba de rangos logantmicos < 0,0009; cociente de riesgos=3,30, IC al 95% cociente de riegos = [1,56, 6,99]. Se muestran los datos en la Tabla 4.

La fig. 4 muestra un formato de inmunoensayo de tipo sandwich tal como se menciona en la descripcion. AC anti-<ACmT> = anticuerpo anti-<anticuerpo monoclonal terapeutico> que debe detectarse en una muestra que debe investigarse; F(ab')2-Dig = fragmento F(ab')2 marcado con Dig; F(ab')2-Bi o Fab-Bi = sobre fase solida, anffgenos biotinilados inmovilizados de union espedfica a AC anti-<ACmT>.

La fig. 5a muestra los resultados de fragmentos de infliximab F(ab')2-Bi como anticuerpo de captura. VN = muestras de suero obtenidas de donantes de sangre humanos aparentemente sanos (verdaderos negativos). VP = muestras de suero obtenidas de pacientes con AR tratados con infliximab (verdaderos positivos). La altura de las columnas de 50, 500 y 150.000 ha sido truncada.

La fig. 5b muestra los resultados de fragmentos de infliximab Fab-Bi como anticuerpo de captura. TN = muestras de suero obtenidas de donantes de sangre humanos aparentemente sanos (verdaderos negativos). VP = muestras de suero obtenidas de pacientes con AR tratados con infliximab (verdaderos positivos). La altura de las columnas de 50, 75000, 100.000 y 150.000 ha sido truncada.

Preparacion de fragmentos Fab y F(ab')2 conjugados con biotina del anticuerpo monoclonal terapeutico espedfico.

Fragmento Fab: El anticuerpo monoclonal terapeutico de longitud completa de la inmunoglobulina de clase G (IgG) en fosfato 100 mM, tampon de EDTA 2 mM, pH 7,0, se incubo con papama en presencia de cistema 10-20 mM (5 a 20 mU de papama por mg de IgG). Se analizo la fragmentacion mediante cromatograffa analftica de permeacion en gel y se detuvo tras 60 a 120 minutos mediante la adicion de solucion de yodoacetamida (10 mM).

Fragmento F(ab')2: El anticuerpo terapeutico de longitud completa de la clase de inmunoglobulina G (IgG) en tampon de citrato sodico 100 mM, pH 3,7, se incubo con pepsina (1 a 15 mg de pepsina por mg de IgG). Se analizo la fragmentacion mediante cromatograffa analftica de permeacion en gel y se detuvo tras 90 minutos mediante ajuste del valor del pH a 6,5 mediante la adicion de fosfato potasico.

Purificacion: ambas mezclas de fragmentacion se dializaron, cada una frente a tampon de fosfato sodico 10 mM con cloruro sodico 10 mM, pH 5,5; la solucion se aplico en una columna de cromatograffa de SP-sefarosa; las fracciones aisladas eluidas en un gradiente salino se analizaron individualmente mediante filtracion analftica en gel. El pool que contema los fragmentos de anticuerpo Fab o F(ab')2 se aplicaron a una matriz de afinidad con anticuerpos policlonales inmovilizados frente a Fcg humano para eliminar las cantidades traza de fragmentos Fcg, se agrupo el eluido y se analizo hasta un contenido residual de Fcg. Se repitio por lo menos tres veces el procedimiento de purificacion por afinidad hasta que la concentracion de Fcg residual cayo a menos de 0,5 ppm. Se concentro el producto a aproximadamente 10 mg/ml y finalmente se aplico a una columna de filtracion en gel (Superdex 200).

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Conjugacion: los fragmentos purificados libres de Fcg se conjugaron utilizando marcajes de biotina activados con NHS a un valor de pH de entre 8,2 y 8,4. La estequiometna de reaccion era 1:5 (IgG:marcaje); se detuvo la reaccion mediante la adicion de solucion de lisina 1 M tras 1 hora y los conjugados en bruto se purificaron en una columna de filtracion en gel (Superdex 200).

Preparacion de fragmento Fab conjugado con biotina del anticuerpo terapeutico espedfico:

se incubo el fragmento F(ab')2 purificado con cisteamina 5 mM durante 1 hora; se realizo un seguimiento de la reduccion a un fragmento A mediante cromatograffa analftica de permeacion en gel. El producto en bruto se aplico en una columna de filtracion en gel (Superdex 200) y las fracciones Fab agrupadas se conjugaron inmediatamente con marcajes de biotina activados con MEA (estequiometna 1:10, 1 hora). La primera caracterizacion analftica se llevo a cabo mediante EM-IEP con el fin de confirmar el sitio de conjugacion y el rendimiento.

Ejemplo 2

Produccion de anticuerpos IgM monoclonales de raton con especificidad de tipo factor reumatoide Inmunogeno: poftmero H-IgG:

Se disolvieron 10 mg de IgG1 humana (Sigma Company) en 0,6 ml de tampon bicarbonato 25 mM, pH 9,5. Tras anadir 3,5 pl de solucion de glutaraldehfdo al 12,5%, se incubo durante 2 horas a temperatura ambiente. A continuacion se enfrio en un bano de hielo, se ajusto el pH a 8,3 con solucion de trietanolamina 50 mM, pH 8,0 y se anadieron 0,15 ml de solucion recien preparada de borohidruro sodico (8 mg de hidruro de boro/ml de agua). Tras 2,5 horas a 0°C, se dializo la preparacion durante 16 horas a 4°C frente a tampon de fosfato potasico 10 mM/NaCl 0,2 M, pH 7,5. Se almaceno el dializado que contema el poftmero de IgG en aftcuotas a -80°C o se utilizo para la inmunizacion y para los ensayos de especificidad en sobrenadantes de cultivo de celulas de hibridoma.

Se produjo el poftmero H-IgG3 de manera similar, partiendo de IgG3 humana (Sigma Company).

Inmunizacion de ratones:

En primer lugar se inmunizaron por via intraperitoneal ratones Balb/c hembra de 12 semanas de edad, con 100 pg de poftmero H-IgG1 o IgG3 conjuntamente con el adyuvante ACF (adyuvante completo de Freund). Tras 8 dfas se llevo a cabo una inmunizacion adicional con 100 pg del poftmero de IgG respectivo en ACF. Trece dfas despues de la inmunizacion inicial se administraron por via intraperitoneal 200 pg del poftmero respectivo, sin adyuvante, 14 y 15 dfas despues de la inmunizacion inicial se administraron 100 pg en cada caso por vfas intraperitoneal e intravenosa. Se llevo a cabo la fusion tras 16 dfas.

Produccion de clones de hibridoma:

Fusion y clonacion:

Se fusionaron celulas de bazo de un raton inmunizado con celulas de mieloma siguiendo el metodo de Galfre G., Methods in Enzymology 73:3-46, 1981. Se mezclaron aproximadamente 1x108 celulas de bazo del raton inmunizacion con 2x107 celulas de mieloma (P3X63-Ag8-653, ATCC n° CRL 1580) y se centrifugaron (10 min. a 300g y a 4°C). A continuacion, las celulas se lavaron una vez con medio RPMI-1640 sin suero de feto bovino (SFB) y se centrifugaron nuevamente a 400g en un tubo conico de 50 ml. Se anadio 1 ml de PEG (polietilenglicol) peso molecular: 4.000, Merck, Darmstadt) y se mezclo mediante pipeteado. Tras 1 min. en un bano de agua a 37°C, se anadieron gota a gota 5 ml de RPMI 1640 sin SFB, se mezclaron, se enrasaron a 50 ml con medio (RPMI 1640 + SFB al 10%) y seguidamente se centrifugaron. Las celulas sedimentadas se introdujeron en medio RPMI 1640 que contema SFB al 10% y se sembraron en medio de seleccion de hipoxantina-azaserina (100 mmoles/l de hipoxantina, 1 mg/ml de azaserina en RPMI 1640 + SFB al 10%). Se anadio interleuquina-6 (100 U/ml) al medio a modo de factor de crecimiento. Tras aproximadamente 10 dfas, se sometieron a ensayo los cultivos primarios para la smtesis de anticuerpos espedficos. Se clonaron cultivos primarios que mostraban una reaccion positiva con IgG1 humana agregada pero ninguna reaccion cruzada con IgG monomerica, utilizando un separador celular activado por fluorescencia en placas de cultivo celular de 96 pocillos. Se anadio interleuquina-6 (100 U/ml) al medio a modo de factor de crecimiento.

Se obtuvieron de esta manera los clones de hibridoma siguientes:

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Tabla 1:

Nombre de anticuerpo monoclonal

Inmunogeno Especificidad de subclase

MAb <IgG ag h>M-3.022.5-IgM

polfmero de IgG1 h IgG 1>IgG3>IgG4>IgG2

MAb <IgG ag h>M-1.010.2-IgM

polfmero de IgG1 h IgG1>IgG3>IgG4>IgG2

MAb <IgG ag h>M-1.1.7-IgM

polfmero de IgG3 h IgG1>IgG3>IgG2>IgG4

Ensayo de cribado para anticuerpos monoclonales con especificidad para IgG humana agregada.

Se recubrieron PMT recubiertas con estreptavidina con IgG1 o IgG3 humana biotinilada. Despues se incubaron con el anticuerpo monoclonal en el sobrenadante de cultivo celular. A continuacion se detectaron los anticuerpos unidos de la manera habitual utilizando anti-<IgM de raton>-POD mediante reaccion con un sustrato de POD.

Determinacion de la especificidad de subclase utilizando IgG humana unida a una fase solida:

Con el fin de determinar la especificidad de los anticuerpos en el sobrenadante de cultivo de las celulas de hibridoma, las PMT recubiertas con estreptavidina recombinante (MicroCoat Company, n° de pedido 12-K 96 N) se recubrieron con 1 pg/ml de IgG_h biotinilada (=IgG_h-Bi) de subclase 1, 2, 3 o 4 en tampon de incubacion. Debido a que la IgG unida mediante la biotina a una fase solida se comporta con IgG polimerica agregada, este enfoque experimental puede utilizarse para determinar la especificidad de subclase. Para ello, se incubaron 100 pl de solucion de IgG_h-Bi durante 60 minutos a temperatura ambiente bajo agitacion y se lavaron seguidamente 3 veces con NaCl al 0,9%/Tween®-20 al 0,05%.

En la siguiente etapa se anadieron 100 pl de la solucion de anticuerpo que debfa examinarse (sobrenadante de cultivo) a un pocillo recubierto y se incubo durante 1 hora a temperatura ambiente bajo agitacion. Tras lavar 3 veces con cloruro sodico al 0,9%/Tween®-20 al 0,05%, se anadieron 100 pl de un fragmento Fab marcado con POD de un anticuerpo policlonal de cabra contra IgM de raton (Dianova Company, n° de pedido 115-036-075, concentracion utilizada: 0,16 pg/ml de tampon de incubacion) en cada caso para detectar el anticuerpo unido de la muestra, se incubo durante 1 hora a temperatura ambiente bajo agitacion y seguidamente se lavo 3 veces con cloruro sodico al 0,9%/Tween®-20 al 0,05%.

Finalmente, se anadieron 100 pl/pocillo de sustrato ABTS® (Roche Diagnostics GmbH, n° de pedido 1684 302) y se midio la absorbancia a 405/492 nm tras 30 min. a temperatura ambiente en un lector de microplacas MR700 de Dynatech Company.

Tampon de incubacion:

Fosfato de Na 40 mM, pH 74, tartrato de Na 200 mM, Tween®-20 al 0,1%, albumina de suero bovino al 0,2%. Determinacion de la reactividad/reaccion cruzada con IgG1 humana monomerica:

Con el fin de determinar la reactividad/reaccion cruzada con H-IgG1 no agregada monomerica, el anticuerpo monoclonal que debfa examinarse se preincubo en el ensayo indicado anteriormente con IgG1 no agregada monomerica a concentraciones crecientes o en exceso. En el caso de que la senal medida no experimentase cambios a un nivel elevado, se conclrna que no se habfa producido reaccion cruzada. En el caso de que la senal medida decreciese, se conclrna que se habfa producido una reaccion cruzada.

Para dichas placas de microtitulacion (PMT) (MicroCoat Company, n° de pedido 12-K 96 N) recubiertas con estreptavidina recombinante se utilizo un recubrimiento de 1 pg/ml de H-IgG1 biotinilada (=H-IgG1-Bi) en tampon de incubacion. Se utilizaron 100 pl de solucion de H-IgG1-Bi en cad pocillo y se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente bajo agitacion y se lavaron seguidamente 3 veces con NaCl al 0,9%/Tween®-20 al 0,05%.

El anticuerpo monoclonal que debfa someterse a ensayo para la reaccion cruzada se preincubo con concentraciones en serie de hasta 1 pg/ml de IgG1 no agregada monomerica. Tuvo lugar la preincubacion en PMT de 96 pocillos no recubiertas durante 1 hora a temperatura ambiente bajo agitacion.

En la siguiente etapa se anadieron 100 pl de dicha solucion (anticuerpo + IgG1 monomerica no agregada en exceso) a un pocillo recubierto y se incubo durante 1 hora a temperatura ambiente bajo agitacion. Tras lavar 3 veces con cloruro sodico al 0,9%/Tween®-20 al 0,05%, se anadieron 100 pl de un fragmento Fab marcado con POD de un anticuerpo policlonal de cabra contra IgM de raton (Dianova Company, n° de pedido 115-036-075, concentracion utilizada: 0,16 pg/ml de tampon de incubacion) en cada caso para detectar el anticuerpo unido de la muestra, se incubo durante 1 hora a temperatura ambiente bajo agitacion y seguidamente se lavo 3 veces con cloruro sodico al 0,9%/Tween®-20 al 0,05%.

Finalmente, se anadieron 100 pl/pocillo de sustrato ABTS® (Roche Diagnostics GmbH, n° de pedido 1684 302) y se midio la absorbancia a 405/492 nm tras 30 min. a temperatura ambiente en un lector de microplacas MR700 de Dynatech Company.

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Los anticuerpos monoclonales de union a factor reumatoide que resultan adecuados en el sentido de la invencion reconocen todas las subclases de IgG humana y muestran una reaccion cruzada inferior a 10% con IgG_h monomerica en un ensayo de competicion. En el caso de que se utilice polfmero de H-IgG1 para determinar la reactividad, se reduce en gran medida la senal medida. La Tabla 1 muestra las propiedades principales de los anticuerpos monoclonales que se encontraron.

Fermentacion de clones de hibridoma para aislar anticuerpos monoclonales:

Se sembraron las celulas de hibridoma a una densidad de 1x105 celulas por ml en medio RPMI 1640 que contema FCS al 10% y se propagaron durante 7 dfas en un fermentador (Thermodux Company, Wertheim/Main, modelo MCS-104XL, n° de pedido 144-050). Se alcanzaron concentraciones medias de 100 mg de anticuerpo monoclonal por ml en el sobrenadante de cultivo.

Aislamiento de MAb monoclonal <IgG ag._h>M-3.022.5-IgM:

Se ajustaron 5 mg de MAb <IgG ag._h>M-3.022.5-IgM (DSM n° ACC2873) a un volumen total de 2 ml con tampon de fosfato sodico 0,1 M, pH 8,6. Se anadieron 50 pl de una solucion 1,11 mM de N-hidroxisuccinimida-ester de acido digoxigenm-3-O-metil-carbonil-£-aminocaproico en dimetilsulfoxido a dicha solucion y posteriormente se agito durante 60 min. a 25°C. La proporcion de IgM a digoxigenina activada era de 1:10. La IgM-digoxigenina que se formaba se dializo frente a tampon de fosfato potasico 20 mM/NaCl 0,1 M/sacarosa al 3%, pH 7,5. La IgM-Dig dializada se almaceno en alfcuotas a -80°C.

Ejemplo 3

Ensayo ELISA totalmente automatizado en una plataforma de biochip multiparametro

Se describe una plataforma de biochip multiparametro en Hornauer H. et al., BlOspectrum, Special Proteomics 10:564-565, 2004, y Hornauer H. et al., Laborwelt 4:38-39, 2004.

Se aplico un recubrimiento de estreptavidina sobre el area completa de un area de ensayo de aproximadamente 2,5 x 6 mm en un soporte de poliestireno tenido de negro (fase solida). Se aplicaron en el area de ensayo lmeas de puntos identicos, aproximadamente 10 a 20 por lmea, consistentes de fragmentos biotinilados del anticuerpo terapeutico, utilizando un procedimiento de chorro de tinta; el diametro por punto era de aproximadamente 150 pm.

Se utilizaron los reactivos espedficos de ensayo siguientes:

Tampon de dilucion de las muestras:

Tris 50 mM, pH 7,6; NaCl 150 mM; detergente al 0,1% (polidocanol); ASB al 0,6%, conservante al 0,2% (oxypyrion e hidrocloruro de metilisotiazolona (MIT))

Tampon de lavado:

Tris 10 mM, polidocanol al 0,01%, oxypyrion al 0,001%, MIT al 0,001%.

Muestras:

Se obtuvieron sueros humanos, muestras positivas, mediante el cribado de las poblaciones de estudio que se habfan tratado con el anticuerpo terapeutico correspondiente; las muestras negativas fueron donantes de sangre sanos no tratados con el anticuerpo terapeutico correspondiente.

Se utilizaron fragmentos Fab de infliximab como antfgenos biotinilados. Se detectaron autoanticuerpos (AC anti- <ACmT>) contra dichos antfgenos en un formato de ensayo indirecto. Se utilizaron 50 pg/ml del antfgeno biotinilado correspondiente en cada solucion de punto aplicado.

Descripcion del procedimiento de ensayo:

Las muestras se diluyeron 1:50 con el tampon de dilucion de muestras para las mediciones. Las muestras diluidas se incubaron durante 12 min. a 37°C. Tras aspirar la muestra y lavar el campo de ensayo con tampon de lavado, se incubaron con el Mab <IgG ag._h>M-3.022.5-IgM (DSM n° ACC2873), un anticuerpo marcado con digoxigenina (anticuerpo monoclonal marcado con Dig <IgG ag_h> durante 6 min. a 37°C con una etapa de lavado posterior. Tras la incubacion con un anticuerpo <Dig> marcado fluorescentemente durante 3 min. a 37°C y posteriormente lavado y secado por succion el campo de ensayo, se detectaron las senales con una camara de CCD.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Ejemplo 4

Comparacion entre los fragmented F(ab')2 y Fab en un formato de ensayo indirecto

Se aplicaron puntos de infliximab biotinilado, en forma de fragmentos F(ab')2-Bi o Fab-Bi, sobre un area diferenciada sobre la superficie de un chip (fase solida). Se utilizo anti-<IgG humana> digoxigenado como reactivos de deteccion. Debido a que el infliximab es una IgG1 humanizada, el anticuerpo de deteccion se unina directamente al anticuerpo aplicado en punto. Por lo tanto, unicamente la utilizacion de fragmentos de infliximab (mas en general, anti- <fragmentos de anticuerpo de FNTa>), F(ab')2-Bi o Fab-Bi en este formato de ensayo.

En total se obtuvieron 100 muestras de suero de donantes de sangre aparentemente sanos (TN) asf como 155 muestras de suero de pacientes de artritis reumatoide (AR) tratados con infliximab (VP) con el fin de comparar la especificidad de los dos ensayos diferentes, utilizando los fragmentos de infliximab Fab-Bi o F(ab')2-Bi como anticuerpos de captura. La utilizacion de infliximab biotinilado como F(ab')2-Bi resulta en senales falsamente elevadas en muestras obtenidas de varios donantes de sangre aparentemente sanos (TN) que eran practicamente tan fuertes como las senales de muestras obtenidas de pacientes de artritis reumatoide verdaderamente positivos (VP) tratados con infliximab (se muestran los resultados en la Tabla 2 y una representacion grafica de los resultados en la figura 5a).

Tabla 2:

Fragmento de infliximab F(ab’),-Bi

Recuentos

50 500 5000 10000 25000 50000 75000 100000 150000

VN (n=100)

58 26 9 1 : ■ J ’ - ; : • 0 0 0

VP (n=155)

0 0 0 mm sp&ii 0 . ' ' •• till 1 9 145

La utilizacion de fragmento biotinilado Fab-Bi de infliximab como anticuerpo de captura permitio a los presentes inventores una mucho mejor diferenciacion entre muestras verdaderamente positivas (VP) y verdaderamente negativas (VN). Se muestran los resultados en la Tabla 3 y se proporciona una representacion grafica de los resultados en la figura 5b.

Tabla 3:

Fragmento Fab-Bi del infliximab

Recuentos

50 500 5000 10000 25000 50000 75000 100000 150000

VN (n=100)

87 10 2 0 0 0 0 0 0

VP (n=155)

0 0 0 0 0 6 33 34 82

Ejemplo 5

Ensayos de cribado para la deteccion de anticuerpos anti-<anticuerpo de FNTa> (AC anti->AC de FNTa>)

Los datos de estudio se basan en muestras de la cohorte Copenhague. Se extrajeron muestras de sangre de un total de 218 pacientes con artritis reumatoide (AR) tratados con infliximab. Se analizaron estas muestras de sangre para la presencia de AC anti-<ACmT> de infliximab (AC anti-<AC de FNTa>). Se obtuvo una muestra de lmea base (muestra de referencia) en la semana 0, antes de la primera administracion de un ACmT. En el caso de que se indique en la presente memoria que debe obtenerse una muestra en la semana 2 tras la primera administracion de un ACmT, la muestra puede obtenerse entre el dfa 9 y el dfa 21. En el caso de que se indique en la presente memoria que debe obtenerse una muestra en la semana 6 tras la primera administracion de un ACmT, la muestra puede obtenerse entre los dfas 28 y 64. En el caso de que se indique en la presente memoria que debe obtenerse una muestra en la semana 14 tras la primera administracion de un ACmT, la muestra puede obtenerse entre las semanas 13 y 16.

Se determinaron los AC anti-<ACmT> utilizando un formato de ensayo indirecto tal como se describe. En el Ejemplo 3 se proporciona una revision completa de reactivos raros, tampones, calibradores y controles.

Formato de ensayo indirecto:

Se aplico en puntos sobre la superficie de un chip infliximab biotinilado, en forma de Fab-Bi. Se utilizo anti-<IgG humana> digoxigenado como reactivos de deteccion. Debido a que el infliximab es una IgG1 humanizada, el anticuerpo de deteccion se unina directamente al anticuerpo aplicado en punto. Por lo tanto, unicamente la utilizacion de fragmentos de infliximab (mas en general, anti-<fragmentos de anticuerpo de FNTa>), F(ab')2-Bi o Fab- Bi en este formato de ensayo.

Tal como muestran los resultados del Ejemplo 4, resulta preferente la utilizacion de fragmentos Fab. En el formato de ensayo indirecto, los fragmentos Fab resultan en una diferenciacion mucho mejor entre resultados negativos y verdaderamente positivos.

5 _____________Tabla 4: ensayo indirecto de AC anti-<ACmT> (optimizado para sensibilidad) ___________

Punto temporal

Semana 2 Semana 6 Semana 14

N° de pacientes con resultado de ensayo AC anti-<ACmT>+

4 31 43

N° de pacientes retirados debido a RFA antes de la semana 50

3 15 16

Porcentaje de abandonos

75% 48% 37%

N° de pacientes con resultado de ensayo AC anti-<ACmT>-

94 88

N° de pacientes retirados debido a RFA antes de la semana 50

12 12

Porcentaje de abandonos

13% 14%

Cociente de riesgos (IC al 95%)

5,06 (2,3610,84) 3,30 (1,546,99)

valor de p

< 0,0001 0,0009

El formato de ensayo indirecto de AC anti-<ACmT> mostrado en la figura 1 con una sensibilidad superior detecta AC anti-<ACmT> en muestras obtenidas de pacientes tan pronto como 2 semanas despues de la primera administracion terapeutica de infliximab. Posteriormente el abandono del estudio debido a una RFA puede predecirse mediante la 10 determinacion de AC anti-<ACmT>:

El desarrollo temprano de AC anti-<ACmT> en la semana 2 o 6 permite predecir una RFA posterior y el abandono de los pacientes del estudio con una probabilidad de 75% y 48%, respectivamente (datos mostrados en la Tabla 4).

15 El tratamiento con un ACmT, por ejemplo el infliximab, conduce a la formacion de AC anti-<ACmT> contra dicho ACmT en un numero menor, aunque significativo, de pacientes. Mas importante, un numero elevado de estos pacientes abandonaron el estudio debido a RFA en un tiempo posterior. Estos resultados podnan indicar que los anticuerpos antifarmaco, evaluados en un metodo segun la presente invencion, pueden detectarse antes de que se produzcan RFA y, de esta manera, podna resultar posible utilizar un ensayo positivo para anticuerpos anti-<ACmT> 20 para dirigir mejor la terapia, por ejemplo para cambiar de un primer ACmT a un segundo ACmT alternativo.

Claims (19)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   REIVINDICACIONES

   1. Metodo de inmunoensayo para la determinacion de un anticuerpo anti-<anticuerpo monoclonal terapeutico> (anti- AC<ACmT>) in vitro en una muestra de sangre completa, plasma o suero de un paciente tratado con un anticuerpo monoclonal terapeutico (ACmT), comprendiendo el metodo:

   a) proporcionar un fragmento F(ab) de dicho ACmT unido a una fase solida,

   b) incubar la fase solida proporcionada en (a) con la muestra, uniendo de esta manera el AC anti-<ACmT> a la fase solida mediante el fragmento F(ab),

   c) incubar la fase solida obtenida en (b) con un anticuerpo monoclonal <IgG-Ag_h>, en la que dicho anticuerpo monoclonal se une al AC anti-<ACmT>, en el que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo IgM que presenta un valor de la constante de disociacion (=Kd) de entre aproximadamente 10"6 moles/l y 10"8 moles/l, y

   d) detectar el anticuerpo monoclonal <IgG-Ag_h> unido en (c) y determinar de esta manera el AC anti-<ACmT> en la muestra.
2. 2. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el ACmT se selecciona de entre el grupo que consiste de anticuerpos quimericos (AQ) y anticuerpos humanizados (AH).
3. 3. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el ACmT se selecciona de entre el grupo que consiste de infliximab, adalimumab, certolizumab y rituximab.
4. 4. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el fragmento F(ab) se une a la fase solida mediante un sistema de union seleccionado de entre el grupo que consiste de biotina/estreptavidina, biotina/avidina y biotina/anticuerpo anti-<biotina>.
5. 5. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1a 4, en el que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo que presenta una constante de disociacion (=Kd) de entre aproximadamente 10"7 moles/l y 10"8 moles/l.
6. 6. Metodo segun cualquiera de las realizaciones 1 a 5, en el que se marca el anticuerpo monoclonal <IgG Ag_h>.
7. 7. Metodo segun cualquiera de las realizaciones 1 a 6, en el que se marca con Dig el anticuerpo monoclonal <IgG Ag_h>.
8. 8. Metodo segun la reivindicacion 7, en el que el anticuerpo monoclonal marcado con Dig <Ag_h-IgG> se detecta mediante incubacion con un anticuerpo anti-<Dig> conjugado con un marcaje detectable.
9. 9. Metodo segun la reivindicacion 8, en el que el marcaje detectable se selecciona de entre el grupo que consiste de marcajes luminiscentes, marcajes quimioluminiscentes, marcajes electroquimioluminiscentes, marcajes fluorescentes y marcajes radioactivos.
10. 10. Utilizacion del metodo de inmunoensayo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para la deteccion de anticuerpos anti-<ACmT>.
11. 11. Utilizacion de un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para una identificacion de un paciente que se encuentra en riesgo de desarrollar una reaccion farmacologica adversa (RFA) durante el tratamiento con un ACmT, en el que el paciente con resultado positivo en el ensayo para un AC anti-<ACmT> en el metodo se encuentra en riesgo de desarrollar una RFA.
12. 12. Utilizacion segun la reivindicacion 11, en la que se detecta un AC anti-<ACmT> en una muestra obtenida de un paciente no mas tarde de 14 semanas despues de la primera administracion de dicho primer ACmT.
13. 13. Metodo para seleccionar un anticuerpo terapeutico alternativo para un paciente bajo tratamiento con un primer ACmT, en el que se encuentra disponible por lo menos un primer y uno o mas ACmT alternativos, que comprende:

    a) determinar segun el metodo de inmunoensayo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 in vitro un AC anti- <ACmT> contra el primer ACmT en una muestra de un paciente tratado con dicho primer ACmT, y

    b) seleccionar un ACmT alternativo para la terapia futura, en caso de hallarse presente un AC anti-<ACmT> de dicho primer ACmT.
14. 14. Metodo segun la reivindicacion 13, en el que puede determinarse un AC anti-<ACmT> in vitro en una muestra obtenida de un paciente no mas tarde de 14 semanas despues de la primera administracion de dicho primer ACmT.
15. 15. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14, en el que el ACmT alternativo se selecciona de entre el grupo que consiste de un anticuerpo monoclonal anti-<FNTa> y rituximab.
16. 16. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que el ACmT alternativo se selecciona de entre el grupo que consiste de infliximab, adalimumab, certolizumab y rituximab.
17. 17. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en el que el ACmT alternativo es un anticuerpo monoclonal anti-<FNTa>.
18. 18. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, en el que el ACmT alternativo se selecciona de entre el 5 grupo que consiste de infliximab, adalimumab y certolizumab.
19. 19. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, en el que el primer ACmT alternativo es un anticuerpo monoclonal anti-<FNTa> y el ACmT alternativo es el rituximab.