ES2551854T3

ES2551854T3 - Procedimiento para la producción de anticuerpos de dominio

Info

Publication number: ES2551854T3
Application number: ES10719752.7T
Authority: ES
Inventors: Peter Schotte; Patrick Stanssens; Christine Labeur; Jean-Luc Jonniaux; Marc Jozef Lauwereys
Original assignee: Ablynx NV
Current assignee: Ablynx NV
Priority date: 2009-04-30
Filing date: 2010-04-30
Publication date: 2015-11-24
Anticipated expiration: 2030-04-30
Also published as: PT2424889E; ES2864956T3; CA2759370A1; EP2424889B1; US9464138B2; EP2982690B1; EP3828201A1; AU2010243551B2; HK1219741A1; PL2424889T3; HUE053480T2; US20170081692A1; WO2010125187A3; AU2010243551A1; WO2010125187A2; EP2424889A2; CY1124137T1; DK2982690T3; CA2759370C; US20120157664A1

Abstract

Procedimiento para producir, en una levadura, un anticuerpo de dominio capaz de formar una unidad de unión a antígeno única y caracterizado por un nivel reducido o ausencia de una variante de anticuerpo de dominio que carece de al menos un enlace disulfuro, que comprende I) aplicar condiciones que promuevan la formación de puentes disulfuro en anticuerpos de dominio, o II) retirar los anticuerpos de dominio que carecen de al menos un puente disulfuro aplicando condiciones seleccionadas de i) unión de anticuerpos de dominio que comprenden grupos tiol libres a grupos reactivos adecuados, opcionalmente en condiciones desnaturalizantes; y ii) cromatografía de alta resolución en fase inversa, o III) una combinación de (I) y (II); en el que las condiciones que promueven la formación de puentes disulfuro se seleccionan de una o más de las siguientes: a) adición de agentes oxidantes, preferiblemente iones metálicos oxidantes, preferiblemente uno o más seleccionados de Cu2+, Fe2+, Fe3+ y Zn2+; b) potenciación de la expresión de una proteína disulfuro isomerasa (PDI) con una secuencia de control adecuada o aumentando la dosis génica; c) adaptación de las condiciones de cultivo mediante uno o más seleccionados de los siguientes: rebajar la temperatura de cultivo y/u optimizar el medio de cultivo, mediante uno o más seleccionados de los siguientes: reducción de la alimentación de metanol para hospedadores que requieran una alimentación de metanol, rebaja de la conductividad del medio de cultivo o cualquier combinación de los mismos; d) replegamiento del anticuerpo de dominio en presencia de tampón rédox, preferiblemente en presencia adicional de desnaturalizante; e) tratamiento del anticuerpo de dominio por oxigenación, aumento de temperatura, aumento del pH o alta presión, o cualquier combinación de los mismos, y f) combinaciones de cualquiera de a) a e).

Description

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Anticuerpos de dominio

El término “anticuerpo de dominio”, usado intercambiablemente con “anticuerpo de dominio único”, “dominio variable único” y “dominio variable único de inmunoglobulina” define moléculas en las que el sitio de unión a antígeno está presente en, y formado por, un único dominio de inmunoglobulina. Esto distingue a los anticuerpos de dominio de las inmunoglobulinas “convencionales” o sus fragmentos, en los que interaccionan dos dominios de inmunoglobulina, en particular dos dominios variables, formando un sitio de unión a antígeno. Típicamente, en las inmunoglobulinas convencionales, interaccionan un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL) formando un sitio de unión a antígeno. En este caso, las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) tanto de VH como de VL contribuirán al sitio de unión a antígeno, concretamente estarán implicadas un total de 6 CDR en la formación de sitio de unión a antígeno.

En contraposición, el sitio de unión de un anticuerpo de dominio se forma por un único dominio VH o VL. Por ello, el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo de dominio se forma por no más de tres CDR.

El término “anticuerpo de dominio”, “anticuerpo de dominio único”, “dominio variable único” o “dominio variable único de inmunoglobulina” no comprende por ello inmunoglobulinas convencionales ni sus fragmentos, que requieren la interacción de al menos dos dominios variables para la formación de un sitio de unión a antígeno. Sin embargo, estos términos comprenden fragmentos de inmunoglobulinas convencionales en las que el sitio de unión a antígeno está formado por un dominio variable único.

Generalmente, los dominios variables únicos serán secuencias aminoacídicas que consisten esencialmente en 4 regiones estructurales (FR1 a FR4 respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3 respectivamente); o cualquier fragmento adecuado de dicha secuencia aminoacídica (que contendrá entonces habitualmente al menos algunos de los residuos aminoacídicos que forman al menos una de las CDR, como se describe adicionalmente en la presente memoria). Dichos dominios variables únicos y fragmentos son lo más preferiblemente aquellos que comprenden un plegamiento de inmunoglobulina o que son capaces de formar, en condiciones adecuadas, un plegamiento de inmunoglobulina. Como tal, el dominio variable único puede comprender, por ejemplo, una secuencia de dominio variable de cadena ligera (p.ej. una secuencia VL) o un fragmento adecuado de la misma; o una secuencia de dominio variable de cadena pesada (p.ej. una secuencia VH o VHH) o un fragmento adecuado de la misma; a condición de que sea capaz de formar una unidad de unión a antígeno única (concretamente, una unidad de unión a antígeno funcional que consiste esencialmente en el dominio variable único, de tal modo que el dominio de unión a antígeno único no necesite interaccionar con otro dominio variable para formar una unidad de unión a antígeno funcional, como es el caso por ejemplo de los dominios variables que están presentes, por ejemplo, en anticuerpos convencionales y fragmentos scFv que necesitan interaccionar con otro dominio variable, p.ej., mediante una interacción VH/VL, formando un dominio de unión a antígeno funcional). Por ejemplo, el dominio variable único de un anticuerpo de dominio (o una secuencia aminoacídica que sea adecuada para uso como anticuerpo de dominio) puede ser un anticuerpo de dominio único (o una secuencia aminoacídica que sea adecuada como anticuerpo de dominio único), un “dAb" o dAb (o una secuencia aminoacídica que sea adecuada para uso como dAb) o un nanocuerpo® (como se define en la presente memoria, e incluyendo pero sin limitación una secuencia VHH) [Nota: nanocuerpo® y nanocuerpos® son marcas registradas de Ablynx N.V.]; otros dominios variables únicos o cualquier fragmento adecuado de uno cualquiera de los mismos. Para una descripción general de los anticuerpos de dominio (único), se hace también referencia a la técnica anterior citada en la presente memoria, así como al documento EP 0368684. Para el término "dAb", se hace referencia, por ejemplo, a Ward et al. (Nature 12 de octubre de 1989; 341 (6242): 544-6), a Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 23 (11): 484-490 así como por ejemplo a los documentos WO 04/068820, WO 06/030220, WO 06/003388 y otras solicitudes de patente publicadas de Domantis Ltd. Debería observarse también que, aunque menos preferido en el contexto de la presente invención porque no son de origen mamífero, los anticuerpos de dominio único o dominios variables únicos pueden derivar de ciertas especies de tiburón (por ejemplo, los denominados “dominios IgNAR”, véase por ejemplo el documento WO 05/18629).

En particular, la secuencia aminoacídica de la invención puede ser un nanocuerpo o un fragmento adecuado del mismo. Para una descripción adicional de VHH y nanocuerpos, se hace referencia al artículo de revisión de Muyldermans en Reviews in Molecular Biotechnology 74 (2001), 277-302, así como a las siguientes solicitudes de patente, que se mencionan como antecedentes de la técnica generales: WO 94/04678, WO 95/04079 y WO 96/34103 de la Vrije Universiteit Brussel; WO 94/25591, WO 99/37681, WO 00/40968, WO 00/43507, WO 00/65057, WO 01/40310, WO 01/44301, EP 1134231 y WO 02/48193 de Unilever; WO 97/49805, WO 01/21817, WO 03/035694, WO 03/054016 y WO 03/055527 del Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB); WO 03/050531 de Algonomics K. V. y Ablynx N. V.; WO 01/90190 del National Research Council of Canada; WO 03/025020 (= EP 1.433.793) del Institute of Antibodies; así como los documentos WO 04/041867, WO 04/041862, WO 04/041865, WO 04/041863, WO 04/062551, WO 05/044858, WO 06/40153, WO 06/079372, WO 06/122786, WO 06/122787 y WO 06/122825 de Ablynx N. V. y las solicitudes de patente publicadas adicionales de Ablynx N. V. Se hace también referencia a la técnica anterior adicional mencionada en estas solicitudes, y en particular a la lista de referencias mencionada en las páginas 41-43 de la solicitud internacional WO 06/040153. Como se describe en estas referencias, los nanocuerpos (en particular secuencias de VHH y nanocuerpos parcialmente humanizados) pueden

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formarse constructos biespecíficos, triespecíficos, etc. Por ejemplo, un anticuerpo de dominio según la invención puede comprender dos o tres anticuerpos de dominio dirigidos contra la misma diana, o dos anticuerpos de dominio dirigidos contra la diana A y un anticuerpo de dominio contra la diana B. Dichos constructos y modificaciones de los mismos, que el especialista puede fácilmente concebir, están todos englobados por el término anticuerpo de dominio como se usa en la presente memoria.

El número total de residuos aminoacídicos en un nanocuerpo puede estar en la región de 110-120, es preferiblemente de 112-115, y es lo más preferiblemente de 113. Debería observarse sin embargo que las partes, fragmentos, análogos o derivados (como se describen adicionalmente en la presente memoria) de un nanocuerpo no están particularmente limitados en cuanto a su longitud y/o tamaño, a condición de que dichas partes, fragmentos, análogos o derivados satisfagan los requisitos adicionales esbozados en la presente memoria y sean también preferiblemente adecuados para los fines descritos en la presente memoria.

Los anticuerpos de dominio comprenderán a menudo al menos un puente disulfuro intradominio entre la cisteína 22 y la cisteína 92 (residuos numerados según la numeración de Kabat). A veces, los nanocuerpos comprenden un puente disulfuro entre CDR3 y Cys45 en la región estructural FR2. Puede haber también un enlace disulfuro entre CDR2 y CDR3, por ejemplo entre la cisteína 45 y CDR3 o entre la cisteína 50 y CDR3 (Muyldermans, 2001). Más específicamente, el análisis de la estructura cristalina de los anticuerpos de dominio ha exhibido 9 hebras β plegadas en dos láminas que se empaquetan entre sí y se estabilizan por un enlace disulfuro conservado. Los abundantes puentes disulfuro que se conoce que se forman en los anticuerpos convencionales entre las diferentes cadenas están ausentes de los anticuerpos de dominio.

Se hace referencia también a todas estas moléculas como “polipéptido de la invención”, que es sinónimo de “secuencias de inmunoglobulina de la invención".

Además, el término “secuencia” como se usa en la presente memoria (por ejemplo, en términos como “secuencia de inmunoglobulina”, “secuencia de anticuerpo”, “secuencia de dominio variable”, “secuencia de VHH” o “secuencia de proteína”) debería entenderse que incluye tanto la secuencia aminoacídica relevante como las secuencias de ácido nucleico o secuencias nucleotídicas que codifican la misma, a menos que el contexto requiera una interpretación más limitada.

Para una descripción general y algunos ejemplos no limitantes de nanocuerpos (y de polipéptidos que comprenden los mismos) que están dirigidos contra RANKL y que pueden expresarse/producirse usando los procedimientos descritos en la presente memoria, se hace referencia a la solicitud internacional WO 08/142164. Para una descripción general y algunos ejemplos no limitantes de nanocuerpos (y de polipéptidos que comprenden los mismos) que están dirigidos contra IL-6R y que pueden expresarse/producirse usando los procedimientos descritos en la presente memoria, se hace referencia a la solicitud internacional WO 08/020079, y en particular al documento WO 2010/115998 y al documento WO 2010/115995.

Para una descripción general y algunos ejemplos no limitantes de nanocuerpos (y de polipéptidos que comprenden los mismos) que están dirigidos contra IL-23 (y en particular la subunidad p19 de IL-23) y que pueden expresarse/producirse usando los procedimientos descritos en la presente memoria, se hace referencia a la solicitud internacional WO 09/068627, y en particular al documento WO 2010/142534.

Hospedadores

Los términos “hospedador” y “células hospedadoras” se usan intercambiablemente. La presente invención se refiere a hospedadores sin limitación distintos de E. coli, a condición de que sean adecuados para la producción de un anticuerpo de dominio. En particular, la presente invención se refiere a hospedadores no E. coli productores de anticuerpos de dominio, en los que los anticuerpos de dominio producidos carecen de al menos un puente disulfuro.

En la presente invención, los hospedadores no E. coli son levaduras tales como Pichia, Hansenula, Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Torulopsis, Torulaspora, Schizosaccharomyces, Citeromyces, Pachysolen, Debaromyces, Metschunikowia, Rhodosporidium, Leucosporidium, Botryoascus, Sporidiobolus, Endomycopsis. Se prefiere particularmente P. pastoris.

El hospedador de la presente invención será capaz de producir un anticuerpo de dominio. Estará típicamente modificado genéticamente para comprender una o más secuencias de ácido nucleico que codifican uno o más anticuerpos de dominio. Los ejemplos no limitantes de modificaciones genéticas comprenden la transformación, p.ej. con un plásmido o vector, o la transducción con un vector vírico. Algunos hospedadores pueden ser genéticamente plásmidos o vectores, así como modificaciones directas del material genético del hospedador, p.ej. por integración en un cromosoma del hospedador, p.ej. por recombinación homóloga. A menudo, aparecerá una combinación de ambas, p.ej., un hospedador se transforma con un plásmido que, tras recombinación homóloga, se integrará (al menos parcialmente) en el cromosoma del hospedador. El especialista conoce procedimientos adecuados de modificación genética del hospedador para posibilitar que el hospedador produzca anticuerpos de dominio.

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Puente disulfuro

Puente disulfuro o enlace disulfuro (usados intercambiablemente) significa el enlace covalente formado entre dos residuos de cisteína que están en una localización apropiada dentro de la secuencia aminoacídica de un anticuerpo de dominio. La presente invención se refiere por tanto a puentes disulfuro intradominio intramoleculares.

Típicamente, los anticuerpos de dominio, incluyendo los anticuerpos de dominio VH y VHH, engloban un enlace disulfuro conservado, lo más a menudo que liga C22 y C92 (según la numeración de Rabat). Algunos VHH pueden tener un puente disulfuro adicional que liga dos CDR, tales como CDR2 (p.ej., posición 50 según la numeración de Rabat) y CDR3, CDR1 y CDR2 o CDR1 y CDR3.

En constructos de anticuerpo de dominio que comprenden más de un dominio de anticuerpo, habrá un número respectivamente mayor de enlaces disulfuro. Por ejemplo, un constructo que comprende tres dominios de unión a antígeno (p.ej., tres dominios VHH), tendrá a menudo tres puentes disulfuro (uno por dominio VHH).

Cualquier referencia a enlace disulfuro o puente disulfuro ha de entenderse que hace referencia también a más de un enlace, concretamente a enlaces disulfuro o puentes disulfuro, a menos que se especifique otra cosa.

El puente disulfuro intramolecular en el anticuerpo de dominio se forma en el proceso de plegamiento de proteína y estabiliza la conformación apropiada del anticuerpo de dominio.

Se ha encontrado sorprendentemente que el enlace disulfuro en los anticuerpos de dominio, a pesar de su papel en la definición y/o estabilización de la estructura tridimensional en el transcurso del plegamiento de proteína, no es esencial para la producción eficaz del anticuerpo de dominio por el hospedador ni para su función. Esto representa una diferencia fundamental con informes en la materia según los cuales la unión disulfuro es decisiva para el rendimiento de producción y la función de los fragmentos de anticuerpo como fragmentos Fab (Gasser et al. Biotechnol. Bioeng. 94: 535, 2006).

En el contexto de esta solicitud, el término “variante relacionada con producto” significa un anticuerpo de dominio que carece de al menos un puente disulfuro. En un constructo que comprende, p.ej., tres dominios VHH, el término variante relacionada con producto englobará por consiguiente variantes que carecen, p.ej., de uno, dos o tres puentes disulfuro. En algunos casos, la variante relacionada con producto se abrevia como “variante”.

Procedimientos generales

El especialista es bien consciente de los procedimientos generales para producir anticuerpos de dominio en hospedadores no E. coli.

Por ejemplo, la producción de nanocuerpos en hospedadores eucarióticos inferiores tales como Pichia pastoris se ha descrito extensamente en el documento WO 94/25591. Se hace referencia explícitamente a los contenidos de esta solicitud con relación a las técnicas de cultivo y procedimientos generales, incluyendo medios y condiciones adecuados. El especialista puede también idear constructos genéticos adecuados para la expresión de anticuerpos de dominio en hospedadores no E. coli basándose en el conocimiento general común. La presente invención se refiere también a condiciones y constructos genéticos específicos descritos en la materia, por ejemplo a los procedimientos de cultivo, plásmidos, promotores y secuencias líder generales descritos en los documentos WO 94/25591, Gasser et al., Biotechnol. Bioeng. 94: 535, 2006; Gasser et al. Appl. Environ. Microbiol. 73: 6499, 2007 o Damasceno et al. Microbiol. Biotechnol. 74: 381, 2007.

En una fracción significativa de los anticuerpos de dominio, en particular nanocuerpos producidos por hospedadores no E. coli, en particular Pichia, se observa la presencia de tiol libre debido a residuos de cisteína desapareados (aunque en la mayoría de casos estos nanocuerpos siguen estando funcionales y bien expresados). La ausencia de estos puentes disulfuro podría tener efecto sobre la calidad y homogeneidad del producto nanocuerpo final. Sin embargo, una alta calidad y homogeneidad de producto es un prerrequisito para, p.ej., el uso terapéutico de estos productos.

La presente invención proporciona procedimientos para la fabricación de anticuerpos de dominio en los que se mejora la calidad de los anticuerpos de dominio (concretamente, con un nivel reducido de tiol libre o su ausencia). La calidad de los anticuerpos de dominio se mejora aplicando condiciones especificadas en las que se promueve la formación del puente o puentes disulfuro faltantes durante el crecimiento del hospedador, durante la expresión del anticuerpo de dominio y/o después de la expresión (concretamente antes o después de la purificación del anticuerpo de dominio). La presente invención proporciona también procedimientos de retirada de la variante relacionada con producto.

Se entiende igualmente que cualquier referencia a condiciones que promuevan la formación de enlaces disulfuro significa condiciones que retiran o reducen la variante relacionada con producto y viceversa.

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En el contexto de la presente invención, la “retirada” de variante relacionada con producto puede significar que se forman apropiadamente el puente o puentes disulfuro faltantes, de tal modo que la variante se vuelve estructuralmente idéntica al anticuerpo de dominio deseado. Como alternativa, retirada puede significar que se separa físicamente la variante relacionada con producto de la mezcla de anticuerpos de dominio que comprende tanto la especie de dominio de anticuerpo deseada que tiene todos los puentes disulfuro como la variante relacionada con producto. El significado correcto será evidente por el contexto. En una realización preferida, retirada tiene el primer significado, concretamente, la variante relacionada con producto forma todos los puentes disulfuro y se vuelve por tanto el anticuerpo de dominio deseado. En vista de la contribución cuantitativamente significativa de la variante relacionada con producto que, dependiendo de las condiciones de cultivo, puede ascender a 15-25 % del rendimiento de anticuerpo de dominio global, la conversión de la variante en el producto deseado en altamente ventajosa.

Más particularmente, la presente invención proporciona un procedimiento para producir una inmunoglobulina que comprende al menos las etapas de: i) cultivo de un hospedador o célula hospedadora (como se define en la presente memoria) en condiciones que sean tales que dicho hospedador o célula hospedadora se multiplique, ii) mantenimiento de dicho hospedador o célula hospedadora en condiciones que sean tales que dicho hospedador o célula hospedadora exprese y/o produzca la inmunoglobulina, opcionalmente seguido de: iii) aislamiento y/o purificación de la inmunoglobulina secretada a partir del medio, en el que se aplican condiciones que promueven la formación de un puente disulfuro en la etapa i), en la etapa ii), después de la etapa ii) y/o en o después de la etapa iii).

En una realización de la invención, se aplican las condiciones que promueven la formación de un puente disulfuro en la etapa i). Por consiguiente, dicho procedimiento comprende al menos las etapas de: i) cultivo de un hospedador o célula hospedadora en condiciones que sean tales que dicho hospedador o célula hospedadora se multiplique y que promuevan la formación de un puente disulfuro, p.ej., incluyendo al menos las siguientes: a) adición de agentes oxidantes, preferiblemente iones metálicos oxidantes, preferiblemente uno o más seleccionados de Cu2+, Fe2+, Fe3+ y Zn2+; b) potenciación de la expresión de una tiol isomerasa, que puede seleccionarse ventajosamente de PDI, calsecuestrina y otras proteínas relacionadas con PDI comprendiendo, pero sin limitación, ERp72, ERp57, ERp60, ERp44, ERp5, ERp27 y PDIR, preferiblemente PDI; c) adaptación de las condiciones de cultivo por uno o más seleccionados de los siguientes: rebaja de la temperatura de cultivo y/u optimización del medio de cultivo incluyendo, pero sin limitación, reducción de la alimentación de metanol para hospedadores que requieren una alimentación de metanol, rebaja de la conductividad del medio de cultivo, adición de extracto de levadura y/o peptona, todo como se describe adicionalmente en la presente memoria, o cualquier combinación de los mismos; y combinaciones de cualquiera de a) a c); ii) mantenimiento de dicho hospedador o célula hospedadora en condiciones que sean tales que dicho hospedador o célula hospedadora exprese y/o produzca un anticuerpo de dominio, opcionalmente seguido de: iii) aislamiento y/o purificación del anticuerpo de dominio secretado a partir del medio.

En una realización de la invención, se aplica la condición que promueve la formación de un puente disulfuro en la etapa ii). Por consiguiente, dicho procedimiento comprende al menos las etapas de: i) cultivo de un hospedador o célula hospedadora en condiciones que sean tales que dicho hospedador o célula hospedadora se multiplique y que promuevan la formación de un puente disulfuro, p.ej., incluyendo al menos las siguientes: a) adición de agentes oxidantes, preferiblemente iones metálicos oxidantes, preferiblemente uno o más seleccionados de Cu2+, Fe2+, Fe3+ y Zn2+; b) potenciación de la expresión de una tiol isomerasa, que puede seleccionarse ventajosamente de PDI, calsecuestrina y otras proteínas relacionadas con PDI comprendiendo, pero sin limitación, ERp72, ERp57, ERp60, ERp44, ERp5, ERp27 y PDIR, preferiblemente PDI; c) adaptación de las condiciones de cultivo por uno o más seleccionados de los siguientes: rebaja de la temperatura de cultivo y/u optimización del medio de cultivo incluyendo, pero sin limitación, reducción de la alimentación de metanol para hospedadores que requieren una alimentación de metanol, rebaja de la conductividad del medio de cultivo, adición de extracto de levadura y/o peptona, todo como se describe adicionalmente en la presente memoria, o cualquier combinación de los mismos; y combinaciones de cualquiera de a) a c); opcionalmente seguido de iii) aislamiento y/o purificación del anticuerpo de dominio secretado a partir del medio.

En una realización de la invención, las condiciones que promueven la formación de un puente disulfuro se aplican después de la etapa ii). En una realización de la invención, las condiciones que promueven la formación de un puente disulfuro se aplican antes de la etapa iii).

Por consiguiente, el procedimiento para producir un anticuerpo de dominio en un hospedador no E. coli, preferiblemente levadura, comprende al menos las etapas de: i) cultivo de un hospedador o célula hospedadora en condiciones que sean tales que dicho hospedador o célula hospedadora se multiplique; ii) mantenimiento del hospedador o célula hospedadora en condiciones que sean tales que dicho hospedador o célula hospedadora exprese y/o produzca el anticuerpo de dominio; mantenimiento del anticuerpo de dominio obtenido en la etapa ii) en

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En contraposición, la coexpresión con PDI no es un requisito para la producción eficaz de anticuerpos de dominio, p.ej. en E. coli. Se han conseguido buenos rendimientos de anticuerpos de dominio completamente funcionales mediante expresión recombinante en E. coli.

Sin embargo, en una fracción de los anticuerpos de dominio, en particular nanocuerpos obtenidos de levaduras, más particularmente Pichia, se observó la presencia de tiol libre debido a residuos de cisteína desapareados. Este descubrimiento era enteramente inesperado, porque la mayoría de estos dominios de anticuerpo, en particular nanocuerpos, seguían estando funcionales y bien expresados.

En consecuencia, en una realización adicional de la invención, puede potenciarse la expresión de una tiol isomerasa en el hospedador mediante medios comúnmente conocidos, incluyendo p.ej. el uso de secuencias de control adecuadas, p.ej. un promotor fuerte, y/o aumentando la dosis génica, p.ej. aumentando el número de copias del gen respectivo. El número de copias puede aumentarse, p.ej., introduciendo constructos genéticos adecuados para la expresión de tiol isomerasa. Si el hospedador comprende ya tiol isomerasa endógena, la presencia adicional del plásmido aumentará el número de copias global. En este caso, la tiol isomerasa puede ser la misma o diferente que la tiol isomerasa endógena del hospedador. En el caso de que el hospedador no contenga tiol isomerasa endógena, la introducción de tiol isomerasa exógena, p.ej. en forma de un plásmido o vector, aumenta también el número de copias en este hospedador, incluso si está presente como una única copia.

Además, pueden usarse constructos genéticos que pueden multiplicarse independientemente del genoma del hospedador y que están presentes en múltiples copias en el hospedador. Por ejemplo, pueden estar presentes plásmidos o vectores de múltiples copias en números de copias de entre 5 y 50 en la célula hospedadora.

El especialista conocerá una multitud de posibilidades de potenciación de la expresión de tiol isomerasa, todas las cuales están englobadas por la presente invención. El especialista puede valorar también fácilmente, basándose en medios rutinarios, que esté presente la correlación esperada entre dosis génica potenciada y actividad enzimática potenciada. Lo más importante, puede monitorizarse la reducción de la variante relacionada con producto.

Por ello, puede coexpresarse el anticuerpo de dominio en el hospedador con una tiol isomerasa. Este enfoque puede tomarse solo o en combinación con cualquier otro enfoque para evitar, reducir o retirar variantes relacionadas con producto como se describen en la presente memoria.

Los ejemplos específicos de tiol isomerasas incluyen, pero sin limitación, calsecuestrina y otras proteínas relacionadas con PDI como ERp72, ERp57, ERp60, ERp44, ERp5, ERp27 y PDIR, preferiblemente proteína disulfuro isomerasa (PDI).

La tiol isomerasa y el anticuerpo de dominio pueden expresarse a partir del mismo o diferentes ácidos nucleicos, p.ej. el mismo o diferentes vectores o plásmidos. Se hace referencia también a un ácido nucleico adecuado para la transformación en un hospedador y/o la expresión del anticuerpo de dominio en el hospedador como constructo genético. Dicho constructo genético comprende a menudo elementos reguladores, tales como promotores, elementos potenciadores, secuencias de poliadenilación, etc. adecuados.

Por consiguiente, la presente invención se refiere también a ácidos nucleicos o constructos genéticos que codifican un anticuerpo de dominio y una tiol isomerasa. Además, la presente invención se refiere a hospedadores que comprenden dichos constructos genéticos o ácidos nucleicos.

El especialista puede introducir los ácidos nucleicos de la invención en hospedadores mediante medidas rutinarias, p.ej. mediante transformación. El especialista puede seleccionar entonces las células hospedadoras adecuadas que comprenden los ácidos nucleicos, p.ej., monitorizando la expresión de la tiol isomerasa al nivel de ácido nucleico y/o proteína. Se seleccionará una cepa con un nivel satisfactorio de expresión. Es deseable una alta expresión de tiol isomerasa, sin embargo, no debería ser tan alta como para dar como resultado la competición con la expresión del anticuerpo de dominio. Esto puede determinarse mediante procedimientos rutinarios.

Para orientación adicional, el especialista puede consultar la secuencia ejemplar de PDI proporcionada en la parte experimental de la solicitud, la entrada de GenBank NP_009887 o las secuencias reseñadas en la materia (véanse, p.ej., Wilkinson et al. J. Biol. Chem. 280: 11483, 2005; Mayer et al. 341: 1077, 2004). Son conocidas en la materia proteínas adicionales que tienen actividades de replegamiento oxidativo y pueden usarse en el contexto de la presente invención, solas o preferiblemente en combinación con las tiol isomerasas expuestas anteriormente (Kimura et al. J. Biol. Chem. 280: 31438, 2005). Se consideran también para expresión en combinación con tiol isomerasas factores conocidos por potenciar la secreción de proteína heteróloga en levaduras, como se describen, p.ej., en Gasser et al. (Appl. Environm Microbiol. 73: 6499, 2007) o Damascene et al. (Microbiol. Biotechnol. 74: 381, 2007).

Se ejemplifican también procedimientos para clonar PDI en un vector adecuado y transformar hospedadores, así como la selección de transformantes adecuados. El especialista puede seleccionar uno cualquiera o más de estos aspectos para llegar a realizaciones de la invención, solos o en combinación con cualquiera de las enseñanzas

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generales de la solicitud.

Según la invención, la coexpresión de una tiol isomerasa con un anticuerpo de dominio puede dar como resultado una reducción significativa de la variante relacionada con producto. La invención incluye el tratamiento adicional de anticuerpos de dominio obtenidos a partir de la expresión en hospedadores que coexpresan una tiol isomerasa para reducir o retirar la variante relacionada con producto.

c) Adaptación de las condiciones de cultivo

En una realización adicional de la invención, que puede emplearse sola o en combinación con cualquier otra realización como se describen en la presente memoria para reducir la formación de variantes relacionadas con producto que carecen de al menos un enlace disulfuro, pueden adaptarse las condiciones de cultivo.

El especialista conoce las condiciones de cultivo estándares para hospedadores no E. coli adecuadas para la producción recombinante de anticuerpos de dominio. Como ejemplo específico, se cultiva típicamente la levadura Pichia, en particular P. pastoris, en lotes alimentados con glicerol y se inicia la inducción mediante la adición de metanol. El protocolo estándar es el protocolo de Invitrogen, expresión a 30 ºC en medio salino basal con una velocidad de alimentación de metanol de 10 ml/l·h. Serán conocidos por el especialista otros procedimientos de cultivo de hospedador no E. coli y se describen, por ejemplo, en “Methods in Molecular Biology, Pichia protocols”, segunda edición, Humana Press.

En comparación con las condiciones estándares, incluyendo pero sin limitación aquellas ejemplificadas para P. pastoris, pueden aplicarse una o más seleccionadas de las siguientes adaptaciones de las condiciones de cultivo: reducción de la alimentación de metanol, rebaja de la conductividad del medio de cultivo, rebaja de la temperatura de cultivo, adición de extracto de levadura y/o peptona o cualquier combinación de las mismas.

Se dará la siguiente descripción detallada en el contexto del protocolo estándar (el protocolo de Invitrogen) para cultivar P. pastoris, como se expone anteriormente. El especialista estará fácilmente en disposición de adaptar esta enseñanza a los protocolos estándares usados para otros hospedadores no E. coli. Por ejemplo, cuando la temperatura estándar para cultivar P. pastoris es de 30 ºC, una reducción de la temperatura de cultivo significa, p.ej. 25 ºC. Resulta evidente para el especialista que, para un hospedador no E. coli cuya temperatura de cultivo estándar es de 37 ºC, 32 o 30 ºC pueden representar una temperatura de cultivo reducida.

Sin querer ligarse a teoría alguna, se concibe que las condiciones de cultivo que reducen el estrés metabólico para el hospedador no E. coli reducirán o anularán la formación de variante relacionada con producto que carece de un enlace disulfuro.

Una posible adaptación de las condiciones de cultivo se refiere a una alimentación de metanol reducida. Es un ejemplo de una alimentación de metanol reducida una reducción de un 30, 50, 70 u 80 % en comparación con el protocolo estándar, por ejemplo ≤7 ml/l·h, ≤5 ml/l·h, ≤4 ml/l·h, ≤3 ml/l·h.

Es una adaptación adicional de las condiciones de cultivo, para aplicar sola o junto con una alimentación de metanol reducida o cualquier otra realización de la invención descrita en la presente memoria, la reducción de la conductividad del medio de cultivo, p.ej. el medio salino basal. Dicha reducción puede ser una reducción de un 30, 50, 70 u 80 % en comparación con el protocolo estándar, por ejemplo ≤28 mS/Cm, ≤20 mS/Cm, ≤12 mS/Cm.

Es una adaptación adicional de las condiciones de cultivo, para aplicar sola o junto con una o más de una alimentación de metanol reducida, una conductividad reducida y/o cualquier otra realización de la invención descrita en la presente memoria, rebajar la temperatura de cultivo. Por ejemplo, la temperatura de cultivo puede rebajarse en 2, 3, 4, 5 o 6 ºC. En una realización preferida, la temperatura de cultivo se rebaja en 5 ºC, p.ej. de 30 a 25 ºC.

Es una adaptación adicional de las condiciones de cultivo, para aplicar sola o junto con una o más de una alimentación de metanol reducida, una conductividad reducida, rebajar la temperatura de cultivo y/o cualquier otra realización de la invención descrita en la presente memoria, la adición de extracto de levadura y/o peptona. Por ejemplo, pueden añadirse extracto de levadura y/o peptona a una concentración en la alimentación de 0 a 20 % al medio de cultivo.

Para el proceso de producción global, la adición de extracto de levadura y/o peptona tiene la ventaja adicional de reducir en gran medida, o evitar completamente, la aparición de fragmentos de anticuerpos de dominio. Esta variante estructural adicional se forma probablemente por la actividad proteolítica. Sin querer ligarse a teoría alguna, la adición de extracto de levadura y/o peptona puede proporcionar sustratos alternativos para proteasas, de tal modo que se reduzca o evite la formación de anticuerpos de dominio degradados en conjunto.

Es una adaptación adicional de las condiciones de cultivo, para aplicar sola o junto con una o más de una alimentación de metanol reducida, una conductividad reducida, rebajar la temperatura de cultivo, la adición de extracto de levadura y/o peptona y/o cualquier otra realización de la invención descrita en la presente memoria, el

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al tiol libre en la variante. Pueden usarse técnicas estándares que comprenden, pero sin limitación, cromatografía, para separar la forma variante unida del producto deseado.

Los grupos tiol libre pueden usarse para la separación de la variante relacionada con producto en el caso de que el anticuerpo de dominio deseado no contenga grupos tiol libres una vez se han formado todos los puentes disulfuro. Por ejemplo, si el anticuerpo de dominio contiene una o más cisteínas que no participan en la formación de puente disulfuro en el producto deseado, la unión a grupos tiol no distinguirá entre el producto y la variante relacionada con producto.

Preferiblemente, los anticuerpos de dominio se exponen a los grupos reactivos en condiciones desnaturalizantes. Esto asegura que todos los tioles libres presentes en la variante relacionada con producto serán accesibles a los grupos reactivos. Pueden emplearse condiciones desnaturalizantes como se ejemplifica en el contexto de la estrategia de replegamiento (desnaturalizante + tampón rédox), aunque con omisión del tampón rédox. Los ejemplos incluyen clorhidrato de guanidinio y urea a las concentraciones especificadas anteriormente en la presente memoria. Además, pueden aplicarse condiciones como se usan en la sección de ejemplos (p.ej. urea 6 M).

Un enfoque adicional para retirar la variante relacionada con producto según la presente invención reside en el uso de HPLC-FI. Entre los varios procedimientos cromatográficos discutidos en la parte experimental de esta solicitud, la HPLC-FI ha mostrado sorprendentemente tener una buena resolución para el anticuerpo de dominio deseado y la variante relacionada con producto. Por ello, la HPLC-FI puede usarse no solo para monitorizar los efectos de diversos tratamientos según la presente invención, sino para evaluar la calidad de un producto anticuerpo de dominio en términos de homogeneidad de producto. Además, la HPLC-FI puede usarse para la separación física de la variante del producto deseado.

La retirada de la variante relacionada con producto por separación física del anticuerpo de dominio deseado puede efectuarse sola, o en combinación con cualquiera de las demás realizaciones de la invención, como se describe en la presente memoria. Ventajosamente, en el caso de una combinación, se efectuarán primero uno o más procedimientos o tratamientos que reduzcan la cantidad de variante relacionada con producto mediante la formación del puente o puentes disulfuro faltantes, seguido de una etapa de retirada de la variante restante por separación física.

Anticuerpo de dominio de la invención

La solicitud da a conocer también el anticuerpo de dominio obtenible mediante los procedimientos de la invención como se describen en la presente memoria. Se caracteriza por un nivel reducido, o la ausencia completa, de la variante relacionada con producto que carece de al menos un puente disulfuro. Por ejemplo, el anticuerpo de dominio obtenible mediante los procedimientos de la presente invención comprende un 0-5 %, más preferiblemente un 0-4 %, 0-3 %, 0-2 % o 0-1 % de variante relacionada con producto. Lo más preferiblemente, el anticuerpo de dominio de la presente invención estará libre de la variante relacionada con producto. El especialista puede determinar fácilmente la proporción de variante relacionada con producto como un porcentaje del total, p.ej. por HPLC-FI como se describe en la presente memoria.

En otras palabras, el anticuerpo de dominio obtenible mediante los procedimientos de la presente invención se caracteriza por una homogeneidad estructural mejorada en comparación con preparaciones de la técnica anterior. En particular, las preparaciones de la técnica anterior pueden comprender un 15-25 %, o incluso proporciones mayores, de variante relacionada con producto.

En vista de la homogeneidad estructural mejorada, el anticuerpo de dominio obtenible mediante el procedimiento de la presente invención es ventajoso en comparación con preparaciones de la técnica anterior. Por ejemplo, el anticuerpo de dominio de la presente invención es ventajoso para aplicaciones terapéuticas. Con relación al uso de anticuerpo terapéutico, la homogeneidad estructural es de la mayor importancia clínica y reguladora. Aunque sorprendentemente la variante relacionada con producto sea totalmente funcional, su presencia en preparaciones terapéuticas es indeseada.

Por consiguiente, la solicitud da a conocer también preparaciones farmacéuticas y otras composiciones que comprenden el anticuerpo de dominio obtenible mediante los procedimientos de la presente invención. La solicitud da a conocer también el uso médico del anticuerpo de dominio obtenible mediante el procedimiento de la presente invención.

El especialista puede formular fácilmente formulaciones farmacéuticamente adecuadas basándose en el conocimiento general común. Además, se hace referencia explícita a las referencias que tratan específicamente los anticuerpos de dominio que se citan en la presente memoria. Sin limitación, pueden prepararse formulaciones para vías estándares de aplicación, incluyendo formulaciones para aplicación nasal, oral, intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intravaginal, rectal, aplicación tópica o aplicación por inhalación.

Basándose en la presente invención, el especialista puede idear también fácilmente procedimientos adecuados de

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tratamiento caracterizados por el uso de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de dominio de la presente invención.

EJEMPLOS

5 La sección experimental describe la sorprendente identificación de una variante relacionada con producto que aparece tras la expresión de anticuerpos de dominio único, como nanocuerpos, en hospedadores no E. coli tales como Pichia pastoris. Se describe también el análisis y eliminación de la variante relacionada con producto.

10 La variante no aparece en E. coli.

Varios procedimientos cromatográficos estándares no pueden separar el material “intacto” de la variante: ni una etapa cromatográfica de intercambio iónico catiónico (IEX), ni una cromatografía de interacción hidrófoba mostraron capacidad de resolución para la variante. Además, la mayoría de las variantes son totalmente funcionales como se

15 determina por la unión (p.ej. Biacore, ELISA) a sus ligandos respectivos. En otras palabras, mediante técnicas analíticas estándares, el material producido no en E. coli (que comprende la variante) era indistinguible del material producido en E. coli (sin la variante).

Por estas razones, encontrar la variante relacionada con producto fue sorprendente, para empezar.

20 El análisis de la variante relacionada con producto demuestra que la variante, que se identificó inicialmente como “postpico” en el análisis de HPLC-FI, constituye una población de moléculas de nanocuerpos en que uno de los enlaces disulfuro canónicos no se ha formado. En un caso, el enlace disulfuro no se ha formado en uno de los bloques de construcción del nanocuerpo de un nanocuerpo compuesto que comprende tres subunidades de

25 nanocuerpo con dos especificidades diferentes. La evidencia de que la variante relacionada con producto carece de un enlace disulfuro provino de las medidas de masa total por espectrometría de masas, la medida del tiol libre en la muestra, la unión de la variante a una resina de afinidad de tiol y la formación espontánea del enlace disulfuro en la variante tras almacenamiento.

30 Se ejemplifican múltiples modos para evitar la aparición de la variante para empezar y/o para retirar la variante después de que se haya formado.

Por ejemplo, la formación de la variante durante la etapa de cultivo puede reducirse o evitarse mediante una o más medidas seleccionadas de baja alimentación de metanol, medio de baja conductividad, baja temperatura de cultivo,

35 adición de extracto de levadura y/o peptona y sobreexpresión de proteína disulfuro isomerasa (PDI).

Además, la variante puede retirarse del producto obtenido mediante uno o más seleccionados de unión a tiol-Sepharose en condiciones desnaturalizantes, HPLC-FI, almacenamiento a temperaturas elevadas, oxigenación, aumento del pH, replegamiento en presencia de desnaturalizantes y un tampón rédox y adición de agentes

40 oxidantes tales como iones metálicos oxidantes, específicamente Cu2-, Fe2+, Fe3+ y/o Zn2+.

La adición de agentes oxidantes, en particular iones metálicos oxidantes, p.ej. iones de cobre, hierro o cinc, puede efectuarse en cualquier etapa de producción, concretamente durante la etapa de cultivo, durante las diversas etapas de clarificación y purificación y en el producto purificado final.

45 Estas medidas, solas o en combinación, evitan tener una gran proporción de variante de producto activa, pero potencialmente inestable, en la sustancia farmacológica final después de la purificación.

RANKL008a se ha descrito anteriormente en el documento WO 2008/142164 y es un nanocuerpo biespecífico

50 trivalente consistente en tres dominios variable humanizados de un anticuerpo de llama de cadena pesada, del que dos subunidades idénticas son específicas para unión a RANKL, mientras que la subunidad restante se une a seroalbúmina humana (HSA). Las subunidades se condensan de cabeza a cola con un ligador G/S en el siguiente

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55 En algunos casos, RANKL008a es seguido por el acrónimo Pic, que representa la proteína que se expresa en Pichia pastoris, o por el acrónimo Omp, que representa el material expresado en E. coli mediante expresión periplásmica.

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Tabla 14: Esquema de tratamiento de muestra ensayado para la reducción de PRV-RANKL008a en condiciones de pH y temperatura aumentados y adición de Cu2+.

Se sometieron las muestras a análisis de HPLC-FI y se determinaron las áreas de la superficie de pico. Se expresan los resultados en UMA/pico para el pico principal, eluyendo el pico a 0,2 minutos (correspondiente a la variante de piroglutamato) y el postpico a +2 minutos correspondiente a la variante que carece del enlace disulfuro.

pH 8: No tratado TA 37 ºC 55 ºC

Principal: 1268 1280 1299 1301

Principal + 0,2 min: 41 43 45 42

Principal + 2 min: 220 220 224 11

Suma de todos los picos: 1529 1543 1568 1354

pH 9: No tratado TA 37 ºC 55 ºC

Principal: 1268 1260 1280 1249

Principal + 0,2 min: 41 40 42 47

Principal + 2 min: 220 156 160 0

Suma de todos los picos: 1529 1456 1482 1296

Cu2+: No tratado CuSO4 1 mM CuSO4 1 mM + inactivación

Principal: 1268 1530 1255

Principal + 0,2 min: 41 55 40

Principal + 2 min: 220 0 204

Suma de todos los picos: 1529 1585 1499

Tabla 15: Área superficial de pico para los picos individuales: área superficial de pico (UMA) de los diferentes picos observados en el cromatograma de HPLC-FI de muestras de RANKL008a incubadas a diferentes temperaturas a pH

10 8,0, a pH 9 o en condiciones en presencia de CuSO4 con o sin inactivador en comparación con muestra no tratada en condiciones como se especifican en la tabla anterior.

A partir de los datos resumidos en la Tabla 15, resulta evidente que:

15 Mantener la muestra a una temperatura de 55 ºC promueve la formación del enlace disulfuro en la variante.

Mantener la muestra a una temperatura de 55 ºC y pH 9 conduce a cierta pérdida de material como se evidencia por la formación de un precipitado, la menor área superficial total recuperada en la HPLC-FI ilustra que se pierde algo de muestra durante el calentamiento (se observó un precipitado visible).

20 La formación del enlace disulfuro e la variante es más rápida a pH 9 que a pH 8 en condiciones comparables.

La incubación a pH 9 parece aumentar ligeramente la formación de la variante de piroglutamato.

25 Después de la exposición a CuSO4 1 mM, la variante no puede detectarse después de 2 horas de incubación. Una vez se retira el CuSO4 por diálisis posterior, el enlace disulfuro permanece intacto. El área superficial total de la muestra antes y después del tratamiento con Cu2+ es comparable. Esto significa que toda la variante relacionada con producto se convierte cuantitativamente en el pico principal, concretamente el material intacto. Obsérvese que en estas condiciones la muestra está a pH 7.

30 El efecto oxidativo del Cu2+ se inactiva completamente por EDTA.

Se verificaron las muestras por CL-EM y se confirmó que en la muestra antes del tratamiento la variante a +2 minutos corresponde a una masa de +2 Da, mientras que esta masa de +2 Da no se observa en la muestra después

35 de incubación durante una noche a pH 9 y después del tratamiento con CuSO4.

Al final del experimento, se almacenaron las muestras durante 1 semana a 37 ºC y se reanalizaron por HPLC-FI. Los datos, expresados como % del área superficial total, se resumen en la siguiente tabla.

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Muestra, ID: Pico % de área % de área después de 1 semana a 37 ºC

pH 8, TA: Pico principal 81,8 85,9

+ 0,2 min: 2,7 4,6

+ 2 min: 14,1 9,5

pH 8, 37 ºC: Pico principal 81,5 85,9

+ 0,2 min: 2,8 4,7

+ 2 min: 14,1 9,4

pH 8, 55 ºC: Pico principal 94 95,4

+ 0,2 min: 3 4,6

+ 2 min: / /

pH 9, TA: Pico principal 84,5 90,2

+ 0,2 min: 2,7 4,9

+ 2 min: 10,5 4,9

pH 9, 37 ºC: Pico principal 84,1 89,2

+ 0,2 min: 2,8 5,2

+ 2 min: 10,5 5,5

pH 9, 55 ºC: Pico principal 96,5 94,2

+ 0,2 min: 3,5 5,8

+ 2 min: / /

Diálisis con CuSO4 1 mM: Pico principal 96,5 95,0

+ 0,2 min: 3,5 5,0

+ 2 min: / /

CuSO4 1 mM, EDTA 1 mM, ácido cítrico 20 mM pH 7,0: Pico principal 83,7 86,5

+ 0,2 min: 2,6 3,3

+ 2 min: 13,6 10,3

Tabla 16: Análisis de HPLC-FI, % del área superficial de pico total, de muestras de RANKL008a incubadas a un mayor pH y temperatura o en presencia de CuSO4 y sometidas a un almacenamiento adicional durante 1 semana a 37 ºC.

5 Las conclusiones de esta tabla son:

El % de área de pico atribuido a la variante de disulfuro presente en la muestra después del tratamiento de una noche inicial (p.ej., pH 8,0 37 ºC) se reduce adicionalmente tras un almacenamiento adicional de una semana a

10 37º C.

Tras almacenamiento a mayor pH (pH 8 y 9), en comparación con D-PBS para las muestras tratadas con CuSO4, aumenta el % de variante de piroglutamato a +0,2 min.

15 El material sometido a tratamiento con Cu2+ y posterior diálisis permanece intacto después de 1 semana a 37 ºC, sugiriendo que el enlace disulfuro reoxidado es estable tras el almacenamiento.

En la muestra que contiene Cu2+ y el inactivador EDTA, la variante de disulfuro se reduce ligeramente, ilustrando que la inactivación es incompleta tras el almacenamiento.

20 En conclusión, en esta comparación se obtuvo la retirada más eficaz de la variante de disulfuro tratando la muestra con Cu2+; la reacción es rápida y la variante se convierte cuantitativamente en material intacto por el tratamiento; además, se prefiere que pueda efectuarse a pH neutro. No se requiere la presencia de desnaturalizante.

25 Las condiciones observadas durante el experimento anterior sugieren que la oxidación y formación del enlace disulfuro aparecen fácilmente mediante incubación de la muestra en presencia de Cu2+. En estos experimentos de seguimiento, se incluyeron diferentes lotes de material como se enumeran en la Tabla 17. Se incluyó un lote de 13H5-9GS-13H5 en estos experimentos. Se dializaron las muestras con tampón Tris-HCl 20 mM (pH 8) y se añadieron a partir de una solución madre de CuSO4 concentraciones finales de 10 μM, 100 μM, 1 mM y 100 mM, se

30 incubaron las muestras durante 2 h a temperatura ambiente y se dializaron entonces frente a D-PBS (durante una noche). Se añadió CuSO4 en exceso 100 mM para detectar cualquier efecto de oxidación indeseable sobre el material.

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Claims

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