ES2549877T3 - Anticuerpo antiglucoesfingolípido de tipo I extendido, derivados del mismo y utilización - Google Patents

Abstract

Anticuerpo monoclonal humano o parte de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un epítopo que comprende un glucoesfingolípido de cadena de tipo I extendido que comprende Leb, en el que dicho epítopo es expresado en una célula cancerosa, en el que dicho anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo no se une a eritrocitos humanos, y en el que el anticuerpo presenta una región variable de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 15, y una región variable de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 17.

Description

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la presente invención son generalmente hospedantes procariotas o eucariotas, seleccionados como una elección de diseño.

La “transformación” de un organismo celular, célula o línea de células con un ácido nucleico significa introducir un ácido nucleico en la célula diana, de modo que el ácido nucleico sea replicable, ya sea como un elemento extracromosómico o por integración cromosómica y, opcionalmente, sea expresado. La “transfección” de una célula u organismo con un ácido nucleico se refiere a la absorción del ácido nucleico, por ejemplo, un vector de expresión, por la célula u organismo, ya sea que alguna secuencia codificante sea expresada de hecho o no. Las expresiones “célula hospedante transfectada” y “transformada” se refieren a una célula en la cual se introdujo un ácido nucleico. Células hospedantes procariotas típicas incluyen varias cepas de E. coli. Las células hospedantes eucariotas típicas son células de mamífero, tales como células de ovario de hámster chino, o células de origen humano. La secuencia de ácido nucleico introducida puede ser de la misma especie que la célula hospedante, o de una especie diferente de la célula hospedante, o puede ser una secuencia de ácido nucleico híbrida, que contiene algunos ácidos nucleicos extraños y algunos ácidos nucleicos homólogos. La transformación puede ocurrir también por transducción

o infección con elementos o vehículos derivados de virus.

El término “vector” hace referencia a un constructo de ácido nucleico, un vehículo que contiene un ácido nucleico, el transgen, el gen extraño o el gen de interés, que puede estar enlazado operablemente a secuencias de control adecuadas, para la expresión del transgen en un hospedante adecuado. Dichas secuencias de control incluyen, por ejemplo, un promotor que efectúa la transcripción, una secuencia de operador opcional para controlar dicha transcripción, una secuencia que codifica sitios de unión al ribosoma de ARNm adecuados, y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y traducción. El vector puede ser un plásmido, una partícula de fago, o solo un inserto genómico potencial. Una vez transformado en un hospedante adecuado, el vector puede replicarse y funcionar independientemente del genoma del hospedante, o puede en algunos casos integrarse en el genoma de una célula hospedante u otro ácido nucleico. En la presente memoria descriptiva, los términos “plásmido” y “vector” se usan de forma intercambiable, ya que un plásmido es una forma de vector comúnmente usada. Sin embargo, se pretende que la invención incluya dichas otras formas de vectores que cumplen una función equivalente como vehículo y las cuales se conocen o serán conocidas en la técnica, tales como virus, fagémidos, transposones, moléculas sintéticas que poseen ácidos nucleicos, liposomas, y similares.

“Mamífero”, en el contexto de tratamiento de tratamiento, se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo ser humano, animales domésticos y de granja, primates no humanos y animales de zoológico, de entretenimiento o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc.

Los anticuerpos de interés pueden seleccionarse o pueden usarse en un ensayo como se describe en la presente memoria o como es conocido en la técnica. Con frecuencia, dichos ensayos requieren que un reactivo sea detectable, es decir, por ejemplo, marcado. El término “marcador”, cuando se usa en la presente memoria, se refiere a un compuesto o composición detectable que puede ser conjugado directa o indirectamente a una molécula o proteína, por ejemplo un anticuerpo. El marcador puede ser por sí mismo detectable (por ejemplo, marcadores de radioisótopos, partículas o marcadores fluorescentes), o puede ser un instrumento para obtener una señal detectable, tal como, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar una alteración química de un compuesto o composición sustrato que es entonces detectable.

Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “fase sólida” significa una matriz a la cual puede adherirse o unirse una entidad o molécula, tal como el anticuerpo de la presente invención. Los ejemplos de fases sólidas comprendidas en la presente memoria incluyen aquellas formadas parcial o enteramente de vidrio (por ejemplo, vidrio de poros controlados), polisacáridos (por ejemplo, agarosa), plásticos, polipropilenos, poliacrilamidas, poliestireno, alcohol polivinílico y siliconas. En ciertas formas de realización, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pocillo de una placa de ensayo; en otras formas de realización puede usarse en una columna de purificación (por ejemplo, una columna de cromatografía de afinidad). De esta manera, la fase sólida puede ser un papel, una perla, un plástico, un chip, etc., puede estar realizado en una variedad de materiales, tales como nitrocelulosa, agarosa, poliestireno, polipropileno, silicio, etc., y puede estar en una variedad de configuraciones.

Las células que expresan el glucoesfingolípido de tipo I extendido o glucanos del mismo, tales como preparaciones de membrana celular, así como el glucoesfingolípido de tipo I extendido purificado, pueden usarse como inmunógenos para generar anticuerpos de interés. El inmunógeno puede obtenerse o puede aislarse de fuentes naturales, o puede sintetizarse enzimática o químicamente. Pueden usarse células enteras, tales como células que expresan el glucoesfingolípido de tipo I extendido, o células derivadas de una fuente natural o de cánceres, tales como líneas de células cancerosas. Las células que sobreexpresen el glucoesfingolípido de tipo I extendido pueden usarse como el inmunógeno para obtener los anticuerpos de interés. Asimismo, pueden usarse preparaciones de membrana que posean el glucoesfingolípido de tipo I extendido, como es sabido en la técnica. Dichas células y partes de las mismas pueden usarse como la fuente de antígenos en un ensayo de diagnóstico.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican mutantes de la secuencia de aminoácidos pueden prepararse por una variedad de métodos conocidos en la técnica. Los métodos incluyen, pero no están limitados a, mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio), mutagénesis por PCR y mutagénesis de cassette de un mutante

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previamente preparado o una versión no mutante de la molécula de interés (véase, por ejemplo, Kunkel, Proc Natl Acad Sci USA 82: 488 (1985)).

La expresión recombinante de un anticuerpo de la invención, o fragmento, derivado o análogo del mismo (por ejemplo, una cadena ligera o pesada de un anticuerpo de la invención, un anticuerpo monocatenario de la invención,

o una muteína de anticuerpo de la invención) incluye la construcción de un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica el anticuerpo o un fragmento del anticuerpo, como se describe en la presente. Una vez que se ha obtenido un polinucleótido que codifica una molécula de anticuerpo, el vector para la producción del anticuerpo puede producirse por tecnología de ADN recombinante, como es conocido en la técnica. Se construye un vector de expresión que contiene secuencias codificantes del anticuerpo y señales de control de la transcripción y traducción adecuadas. Los métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo.

El vector de expresión es transferido a una célula hospedante por técnicas convencionales, y las células transfectadas se cultivan entonces por técnicas convencionales para producir un anticuerpo, o fragmento, de la invención. En un aspecto de la invención, los vectores que codifican tanto las cadenas ligera como pesada pueden ser coexpresados en la célula hospedante para la expresión de la molécula de inmunoglobulina entera, como se detalla en la presente.

Una variedad de sistemas de vector de expresión/hospedante puede usarse para expresar las moléculas de anticuerpo de la invención. Dichos sistemas de expresión representan vehículos por los cuales las secuencias codificantes de interés pueden producirse y pueden purificarse subsiguientemente, pero representan también células las cuales pueden expresar, cuando son transformadas o transfectadas con las secuencias codificantes nucleotídicas adecuadas, una molécula de anticuerpo de la invención in situ. Las células bacterianas tales como E. coli, y células eucariotas se usan comúnmente para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante, especialmente para la expresión de toda la molécula de anticuerpo recombinante. Por ejemplo, células de mamífero tales como células CHO, junto con un vector tal como uno que posea el elemento promotor del gen temprano intermedio mayor del citomegalovirus humano, son un sistema de expresión eficaz para anticuerpos (Foecking et al., Gene 45: 101 (1986); y Cockett et al., Bio/Technology 8: 2 (1990)). Plantas y cultivos de células vegetales, células de insecto, etc., pueden usarse también para obtener las proteínas de interés, como es conocido en la técnica.

Además, se selecciona una célula hospedante que module la expresión de las secuencias insertadas, o que modifique y procese el producto génico de la manera específica deseada. Dichas modificaciones (por ejemplo, glucosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de los productos proteicos pueden ser importantes para la función de la proteína. Diferentes células hospedantes pueden tener los mecanismos característicos y específicos particulares para la modificación y el procesamiento postraduccional deseados de las proteínas y los productos génicos. Pueden seleccionarse sistemas hospedantes o líneas de células adecuados para garantizar la modificación y el procesamiento correctos del anticuerpo expresado de interés. Por lo tanto, pueden usarse células hospedantes eucariotas que posean la maquinaria celular para el procesamiento adecuado del transcrito primario, así como la glucosilación y fosforilación del producto génico. Dichas células hospedantes de mamífero incluyen, pero no se limitan a, células CHO, COS, 293, 3T3 o de mieloma.

Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, pueden diseñarse líneas de células que expresan establemente la molécula de anticuerpo. En vez de usar vectores de expresión que contengan orígenes de replicación virales, las células hospedantes pueden transformarse con ADN controlado por elementos de control de la expresión adecuados (por ejemplo, promotor, secuencias potenciadoras, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. Después de la introducción del ADN extraño, puede permitirse que las células diseñadas crezcan durante uno a dos días en un medio enriquecido, y entonces son movidas a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección, y permite que las células integren establemente el plásmido en un cromosoma y sea expandido en una línea de células. Alternativamente, puede mantenerse un elemento extracromosómico en las células bajo selección. Dichas líneas de células diseñadas no solo son útiles para la producción de anticuerpos, sino que son útiles para seleccionar y evaluar compuestos que interaccionan directa o indirectamente con la molécula de anticuerpo.

Pueden usarse muchos sistemas de selección, incluyendo, pero sin limitarse a, el uso de genes de timidina cinasa del virus del herpes simple (Wigler et al., Cell 11: 223 (1977)), de hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska et al., Proc Natl Acad Sci USA 48: 202 (1992)), de glutamato sintasa, en presencia de metionina sulfoximida (Adv Drug Del Rev 58, 671, 2006, y véase el sitio web o la bibliografía de Lonza Group Ltd.) y de adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al., Cell 22: 817 (1980)) en células tk, hgprt o aprt, respectivamente. También, la resistencia antimetabolitos puede usarse como la base de la selección para los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Wigler et al., Proc Natl Acad Sci USA 77: 357 (1980); O’Hare et al., Proc Natl Acad Sci USA 78: 1527 (1981)); gpt, que confiere resistencia a ácido micofenólico (Mulligan et al., Proc Natl Acad Sci USA 78: 2072 (1981)); neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G-418 (Wu et al., Biotherapy 3: 87 (1991)); e hygro, que confiere resistencia a higromicina (Santerre et al., Gene 30: 147 (1984)). Los métodos conocidos en la técnica de la tecnología de ADN recombinante pueden aplicarse habitualmente para seleccionar el

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moléculas de inmunoglobulina, usando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab’)2). Los fragmentos F(ab’)2 contienen la región variable, la región constante de cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada. Sin embargo, dichos fragmentos pueden ser producidos directamente por células hospedantes recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden aislarse de una biblioteca de fagos de anticuerpos. Alternativamente, fragmentos F(ab’)2-SH pueden recuperarse directamente de E. coli, y pueden ser acoplados químicamente para formar fragmentos F(ab’)2 (Carter et al., Bio/Technology 10: 163 (1992). De acuerdo con otro enfoque, los fragmentos F(ab’)2 pueden aislarse directamente del cultivo de células hospedantes recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán evidentes para los expertos en la materia. En otras formas de realización, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv monocatenario (Fv); véase, por ejemplo, el documento WO 93/16185.

Para algunos usos, incluyendo el uso in vivo de anticuerpos en seres humanos y ensayos de detección in vitro, puede ser preferible usar anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos. Métodos para producir anticuerpos quiméricos se conocen en la técnica; véase, por ejemplo, Morrison, Science 229: 1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4: 214 (1986); Gillies et al., J Immunol Methods 125: 191 (1989); y las patentes US nº 5.807.715; 4.816.567; y 4.816.397.

Los anticuerpos humanizados derivan de moléculas de anticuerpo generadas en una especie no humana que se unen al glucoesfingolípido de tipo I extendido, en el que una o más CDR de las mismas son insertadas en las regiones FR de una molécula de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos pueden ser humanizados usando una variedad de técnicas conocidas en la técnica incluyendo, por ejemplo, el injerto de CDR (documentos EPO 239.400; y WO 91/09967; y las patentes US nº 5.225.539; 5.530.101; y 5.585.089), revestimiento o modificación del patrón de la superficie (documentos EPO 592.106; y EPO 519.596; Padlan, (1991), Molecular Immunology; Studnicka et al., (1994), Protein Engineering 7:805; y Roguska et al., (1994), Proc Natl Acad Sci 91:969 y entremezclado de cadenas (véase la patente US nº 5.565.332).

Un anticuerpo humanizado presenta uno o más restos de aminoácidos de una fuente que es no humana. Los restos de aminoácidos no humanos son referidos con frecuencia como restos “introducidos”, los cuales se toman típicamente de un dominio variable “introducido”. La humanización puede llevarse a cabo esencialmente siguiendo los métodos de Winter et al. (Jones et al., Nature 321: 522 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988); y Verhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988)), sustituyendo CDR no humanas o partes de secuencias de CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos “humanizados” son anticuerpos quiméricos (patente US nº 4.816.567), en los que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los cuales algunos restos de CDR y algunos restos de FR posibles son sustituidos de sitios análogos en anticuerpos de roedor. La región bisagra y la región constante de cadena pesada pueden ser de cualquier clase o subclase para obtener un efecto deseado, tal como una función efectora particular.

Con frecuencia, los restos de armazón en las regiones de armazón humanas pueden ser sustituidos por el resto correspondiente del anticuerpo donante de CDR para alterar, y posiblemente para mejorar, la unión al antígeno. Las sustituciones del armazón se identifican mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, elaborando modelos de las interacciones de los restos de CDR y de armazón para identificar restos de armazón importantes para la unión al antígeno, y mediante comparación de secuencias para identificar restos de armazón inusuales en posiciones particulares; véase, por ejemplo, la patente U.S. nº 5.585.089; y Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988).

Se prefiere además que los anticuerpos humanizados retengan alta afinidad por el glucoesfingolípido de tipo I extendido, y retengan o adquieran otras propiedades biológicas favorables. De esta manera, pueden prepararse anticuerpos humanizados por un procedimiento analizando las secuencias precursoras y diversos derivados de anticuerpos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias humanizadas y precursoras. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales hipotéticos están disponibles comúnmente, y son bien conocidos por los expertos en la materia. Están disponibles programas de ordenador que ilustran y presentan estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de las presentaciones permite el análisis de la función probable de ciertos restos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los restos que influyen sobre la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse al glucoesfingolípido de tipo I extendido. De esta manera, pueden seleccionarse y combinarse restos de FR del receptor y secuencias introducidas, de modo que la característica deseada del anticuerpo, tal como afinidad incrementada por el antígeno diana, sea aumentada al máximo, aunque son los restos de CDR que directamente y más sustancialmente influyen sobre la unión al glucoesfingolípido de tipo I extendido. Las regiones CDR pueden ser modificadas también para que contengan uno o más aminoácidos que varían de aquellos obtenidos del anticuerpo precursor del cual se obtuvo la CDR, para proporcionar propiedades de interés mejoradas o diferentes, tales como unión de mayor afinidad o mayor avidez, por ejemplo.

Ciertas partes de las regiones constantes del anticuerpo pueden ser manipuladas y cambiadas para proporcionar

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homólogos, derivados, fragmentos y similares del anticuerpo con propiedades diferentes de o mejores que las observadas en el anticuerpo precursor. De esta manera, por ejemplo, muchos anticuerpos IgG4 forman enlaces disulfuro intracadena cerca de la región de bisagra. El enlace intracadena puede desestabilizar la molécula bivalente precursora, formando moléculas monovalentes que comprenden una cadena pesada con la cadena ligera asociada. Dichas moléculas pueden volver a asociarse, pero sobre una base aleatoria.

Otra serie de aminoácidos adecuados para modificación incluyen aminoácidos en el área de la bisagra que afectan a las funciones del anticuerpo tales como la unión de una molécula que contiene una cadena pesada con unión al receptor Fc e internalización del anticuerpo unido. Dichos aminoácidos incluyen, en las moléculas de IgG1, los restos de aproximadamente 233 a aproximadamente 237 (Glu-Leu-Leu-Gly-Gly, SEC ID NO: 1); de aproximadamente 252 a aproximadamente 256 (Met-Ile-Ser-Arg-Thr, SEC ID NO: 2) y de aproximadamente 318 (Glu) a aproximadamente 331 (Pro) incluyendo, por ejemplo, Lys320, Lys322 y Pro329.

Los anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables para el tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Pueden obtenerse anticuerpos humanos por una variedad de métodos conocidos en la técnica, incluyendo los métodos de presentación de fagos descritos anteriormente usando bibliotecas de anticuerpos derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana; véanse las patentes US nº 4.444.887 y 4.716.111; y los documentos WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 y WO 91/10741. Las técnicas de Cole et al. y Boerder et al. están también disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss (1985); y Boerner et al., J Immunol 147:86 (1991)).

Los anticuerpos humanos también pueden producirse usando ratones transgénicos que sean incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que expresen también ciertos genes de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, los complejos de genes de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada humana pueden ser introducidos aleatoriamente o por recombinación homóloga en células madre embriónicas de ratón. Como alternativa, la región variable humana, la región constante y la región de diversidad pueden ser introducidas en las células madre embriónicas de ratón, además de los genes de la cadena ligera y pesada humanas. Los genes de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada de ratón pueden tratarse de modo que sean no funcionales por separado o simultáneamente con la introducción de los loci de inmunoglobulina humana por recombinación homóloga. En particular, la supresión homocigótica de la región JH previene la producción endógena de anticuerpos. Las células madre embriónicas modificadas son expandidas y microinyectadas en blastocistos para producir ratones quiméricos. Los ratones quiméricos son entonces procreados para producir progenie homocigótica que exprese anticuerpos humanos; véanse, por ejemplo, Jakobovitis et al., Proc Natl Acad Sci USA 90:2551 (1993); Jakobovitis et al., Nature 362:255 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol 7:33 (1993); y Duchosal et al., Nature 355:258 (1992)).

Los ratones transgénicos son inmunizados en la forma normal con un glucoesfingolípido de tipo I extendido, por ejemplo la totalidad o una parte del glucoesfingolípido de tipo I extendido, o una preparación de membrana que contenga al mismo. Anticuerpos monoclonales dirigidos contra el glucoesfingolípido de tipo I extendido pueden obtenerse de los ratones transgénicos inmunizados usando la tecnología de hibridomas convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humana albergados por los ratones transgénicos se reordenan durante la diferenciación de las células B, y subsiguientemente sufren conmutación de clase y mutación somática. De esta manera, usando dicha técnica, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE terapéuticamente útiles. Para una revisión, véase Lonberg et al., Int Rev Immunol 13: 65-93 (1995). Para una discusión de la producción de anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir dichos anticuerpos, véanse, por ejemplo, los documentos WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; y EPO nº 0.598.877; y las patentes US nº 5.413.923; 5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806; 5.814.318; 5.885.793; 5.916.771; y 5.939.598. Además, compañías tales como Amgen (Fremont, CA), Genpharm (San Jose, CA) y Medarex, Inc. (Princeton, NJ) pueden ser contratadas para proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra el glucoesfingolípido de tipo I extendido usando una tecnología similar a la descrita anteriormente.

Asimismo, pueden obtenerse mAbs humanos inmunizando ratones trasplantados con leucocitos de sangre periférica, esplenocitos o médula ósea humanos (usando, por ejemplo, la técnica de triomas de XTL Biopharmaceuticals, Israel).

Anticuerpos completamente humanos que reconocen a un epítopo seleccionado pueden generarse usando una técnica referida como “selección guiada”. En dicho enfoque, un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, se usa para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconoce al mismo epítopo (Jespers et al., Bio/Technology 12: 899 (1988)).

Cuando se usan técnicas recombinantes, la variante de anticuerpo puede producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico, o puede ser segregada directamente en el medio. Si la variante de anticuerpo se produce intracelularmente, como una primera etapa, los restos de materia en partículas, ya sea células hospedantes o fragmentos lisados, pueden ser eliminados, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Carter et al., Bio/Technology 10: 163 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que son segregados hacia el

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El segundo componente puede ser también un agente citotóxico. La expresión “agente citotóxico”, como se usa en la presente memoria, se refiere a una sustancia que reduce o bloquea la función o el crecimiento de células, y/o que causa la destrucción de las células. De esta manera, el agente citotóxico puede ser un taxol, un maitansinoide tal como DM1 o DM4, CC-1065 o un análogo de CC-1065, una ricina, un fármaco, mitomicina C, etc. En algunas formas de realización, el agente citotóxico, como con cualquier agente de unión de un conjugado de la presente invención, se une covalentemente, directamente o por medio de un enlazador escindible o no escindible, a un anticuerpo de interés.

Los ejemplos de maitansinoides adecuados incluyen maitansinol y análogos de maitansinol. Los maitansinoides inhiben la formación de los microtúbulos y son altamente tóxicos para las células de mamífero.

Los ejemplos de análogos de maitansinol adecuados incluyen aquellos que tienen un anillo aromático modificado, y aquellos que tienen modificaciones en otras posiciones. Dichos maitansinoides adecuados se describen en las patentes US nº 4.424.219; 4.256.746; 4.294.757; 4.307.016; 4.313.946; 4.315.929; 4.331.598; 4.361.650; 4.362.663; 4.364.866; 4.450.254; 4.322.348; 4.371.533; 6.333.410; 5.475.092; 5.585.499; y 5.846.545.

Los ejemplos de análogos de maitansinol adecuados que tienen un anillo aromático modificado incluyen: (1) C-19descloro (patente US nº 4.256.746) (preparado, por ejemplo, por reducción con LAH de ansamitocina P2); (2) C-20hidroxi (o C-20-desmetilo)+/-C-19-descloro (patentes U.S. nº 4.361.650 y 4.307.016) (preparado, por ejemplo, por desmetilación usando Streptomyces o Actinomyces o decloración usando hidruro de litio y aluminio (LAH)); y (3) C20-desmetoxi, C-20-aciloxi (-OCOR), +/-descloro (patente U.S. nº 4.294.757) (preparado mediante acilación usando cloruros de acilo).

Los ejemplos de análogos de maitansinol adecuados que tienen modificaciones de otras posiciones incluyen: (1) C-9-SH (patente US nº 4.424.219) (preparado por la reacción de maitansinol con H2S o P2S5); (2) C-14-alcoximetilo (desmetoxí/CH2OR) (patente US nº 4.331.598); (3) C-14-hidroximetilo o aciloximetilo (CH2OH o CH2OAc) (patente US nº 4.450.254) (preparado de Nocardia); (4) C-15-hidroxi/aciloxi (patente U.S. nº 4,364,866) (preparado por la conversión de maitansinol por Streptomyces); (5) C-15-metoxi (patentes US nº 4.313.946 y 4.315.929) (aislado de Trewia nudiflora); (6) C-18-N-desmetilo (patentes US nº 4.362.663 y 4.322.348) (preparado por la desmetilación de maitansinol por Streptomyces); y (7) 4,5-desoxi (patente de US nº 4.371.533) (preparado por la reducción de maitansinol con LAH/tricloruro de titanio).

Los conjugados citotóxicos pueden prepararse por métodos in vitro. Para enlazar un agente citotóxico, fármaco o profármaco al anticuerpo, se usa comúnmente un grupo enlazante. Los grupos enlazantes adecuados se conocen en la técnica, e incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos lábiles a ácidos, grupos fotolábiles, grupos lábiles a peptidasas y grupos lábiles a esterasas. Por ejemplo, pueden construirse conjugados usando una reacción de intercambio de disulfuro, o formando un enlace de tioéter entre un anticuerpo de interés y el fármaco o profármaco.

La molécula conjugada a un anticuerpo de interés puede ser una molécula con una actividad farmacológica, tal como un fármaco, tal como una pequeña molécula o una biomolécula. De esta manera, la biomolécula puede ser una citocina, por ejemplo. La molécula puede ser un profármaco, tal como un éster de fármaco. La molécula puede ser un radionúclido.

Como se expone anteriormente, la presente invención proporciona secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican un anticuerpo o variante funcional del mismo como se describe en la presente memoria, constructos de vector que comprenden una secuencia nucleotídica que codifica los polipéptidos de unión al glucoesfingolípido de tipo I extendido de la presente invención, células hospedantes que comprenden dicho vector, y técnicas recombinantes para la producción del polipéptido que se une a glucoesfingolípidos de tipo I extendidos.

El vector contiene normalmente componentes conocidos en la técnica, e incluyen generalmente, pero no están limitados a, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal, un origen de replicación, un promotor, una secuencia de poliA, uno o más genes marcadores o de selección, secuencias que facilitan y/o aumentan la traducción, un elemento potenciador, etc. De esta manera, los vectores de expresión incluyen una secuencia nucleotídica enlazada operablemente a dichas secuencias nucleotídicas reguladoras de la traducción o transcripción adecuadas, tales como las derivadas de genes de mamíferos, microbianos, de virus o de insectos. Ejemplos de secuencias reguladoras adicionales incluyen operadores, sitios de unión ribosomales del ARNm, y/u otras secuencias adecuadas que controlan la transcripción y traducción, tales como el inicio y la terminación de las mismas. Las secuencias nucleotídicas están “enlazadas operablemente” cuando la secuencia reguladora se relaciona funcionalmente con la secuencia nucleotídica para el polipéptido adecuado. De esta manera, una secuencia nucleotídica del promotor está enlazada operablemente a, por ejemplo, la secuencia de la cadena pesada del anticuerpo si la secuencia nucleotídica del promotor controla la transcripción de esa secuencia nucleotídica.

Además, secuencias que codifican péptidos señal adecuados, que no están asociadas naturalmente con las secuencias de la cadena ligera y/o pesada del anticuerpo, pueden ser incorporadas en los vectores de expresión.

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09-10-2015

SEC ID NO: 14

Longitud: 318 Tipo: ADN (cadena pesada, región variable)

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SEC ID NO: 15

Longitud: 106 Tipo: aminoácido (cadena pesada, región variable)

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SEC ID NO: 16

Longitud: 300 20 Tipo: ADN (cadena ligera, región variable)

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25 SEC ID NO: 17

Longitud: 100

Tipo: aminoácido

(cadena ligera, región variable) 30

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Un vez que las cadenas ligera y pesada se secuencian, los ácidos nucleicos pueden ser recodificados para optimizar la expresión, por ejemplo, en células hospedantes humanas específicas.

35 Ejemplo 10: transfectomas

Se cultivan células NS0 a una densidad de 1 x 106 células/ml. Las células se mantienen en fase de crecimiento exponencial, y el medio se cambia el día antes de la transfección. El día de la transfección, se lavan 40 x 106 células. 40 Entonces, 10 µg de ácido nucleico linealizado que contiene, por ejemplo, ADN de la cadena ligera y ADN de la cadena pesada linealizado, se añaden a la suspensión celular (el volumen de ADN total debe ser menor de 50 µl), y el cultivo se incuba en hielo durante 15 minutos. La mezcla de ADN y células se transfiere a una cubeta enfriada (0,4 cm), y se aplica un pulso eléctrico (750 V y 25 µF). La cubeta se pone en hielo inmediatamente después del pulso eléctrico, y se mantiene en hielo durante 10 a 15 minutos. Las células se recogen y se siembran en placas. Las

45 células se incuban en una incubadora de CO2 al 5% durante 12 a 16 días o hasta que aparezcan las colonias. El sobrenadante de las colonias celulares o células mantenidas en cultivo en suspensión se ensayan por ELISA, y los transfectomas positivos son clonados en medio reciente. Para seleccionar adicionalmente los transfectomas positivos, se lleva a cabo ELISA de titulación o el ensayo de Biacore. Los transfectomas expandidos se mantienen en matraces de agitación, y el anticuerpo o derivado del mismo se recoge del sobrenadante.

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