ES2544237T3

ES2544237T3 - Producción de formatos de anticuerpos y aplicaciones inmunológicas de estos formatos

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Publication number: ES2544237T3
Application number: ES05826565.3T
Authority: ES
Inventors: Daniel Baty; Ghislaine Behar; Martine Chartier; André Pelegrin; Jean-Luc Teillaud; Isabelle Teulon
Original assignee: INST PAOLI CALMETTES; Aix Marseille Universite; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite de Montpellier I; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite de Montpellier; INSTITUT PAOLI CALMETTES; Institut Regional du Cancer de Montpellier
Current assignee: INST PAOLI CALMETTES; Aix Marseille Universite; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite de Montpellier I; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite de Montpellier; INSTITUT PAOLI CALMETTES; Institut Regional du Cancer de Montpellier
Priority date: 2004-12-16
Filing date: 2005-12-15
Publication date: 2015-08-28
Anticipated expiration: 2025-12-15
Also published as: EP3187505A1; US10385137B2; WO2006064136A1; EP1824884B1; EP2433965A2; FR2879605A1; EP1824884A1; EP3187505B1; JP2008523795A; US20160083476A1; ES2751006T3; ES2627607T3; FR2879605B1; EP2433965A3; US9169316B2; US20090202979A1; CA2590615C; CA2590615A1; EP2433965B1; JP5026279B2

Abstract

Formatos de anticuerpo, caracterizados por que comprenden todos o parte de los dominios de VHH o de VHH humanizados, fusionados a las regiones constantes de anticuerpos humanos, por que son de tipo Fab y comprenden, en asociación, dos dominios VHH diferentes, o dos dominios VH humanos sobre los cuales se insertan las CDRs de los VHH, estando uno de los dominios fusionado a la región constante Cκ o Cλ humana, el otro a la región CH1 de una inmunoglobulina, y por que son de tipo biespecífico / monovalente o biepitópico / monovalente.

Description

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al., 1991) REF en los sitios Ncol y Notl o Sfil y Notl.

Preparación del vector:

Se digieren veinte μg de fagémido pHen1 en un volumen de 300 μΙ con 50 U de Sfil en presencia de BSA, a 50 ºC, 16 h; o con 50 U de Ncol en presencia de BSA, a 37 ºC, 16 h. El fagémido linealizado se purifica en gel de agarosa al 0,7 % (kit « Qiaquick gel extraction », Qiagen). El ADN eluido se corta a continuación mediante 50 U de Notl a 37 ºC en un volumen de 200 μΙ, 16 h. La enzima es destruida con calor 15 min a 65 ºC y el ADN se extrae con fenol / cloroformo y se precipita en etanol. El pHen1 cortado se controla en gel de agarosa al 0,7 %, se cuantifica y se ajusta a 200 ng/μΙ.

Preparación de los fragmentos de ADN de los VHH:

Se cortan cinco μg de fragmentos VHH en un volumen de 300 μΙ con 50 U de Bgll y Notl en presencia de BSA, a 37 ºC, 16 h; o con 50 U de Ncol y Notl en presencia de BSA, a 37 ºC, 16 h. Las enzimas son desnaturalizadas a 65 ºC, 15 min; después se extraen los ADN con fenol / cloroformo y se precipitan en etanol en presencia de 10 μg de glucógeno (Roche). Los fragmentos VHH cortados mediante Ncol y Notl se purifican en gel de agarosa al 1 %, después se controlan en gel de agarosa al 2 %, se cuantifican y se ajustan a 100 ng/μΙ.

Ligación:

Se ligan ciento cincuenta ng de pHen1 digeridos con Sfil y Notl con 60 ng del fragmento VHH digerido con Bgll y Notl en un volumen de 20 μΙ con 2.000 U de ligasa T4 de ADN (BioIabs) a 16 ºC, 17 h.

La ligasa es inactivada a 65 ºC, 15 min, y el producto de la ligación se corta con 20 U de Xhol (BioIabs) para eliminar el vector residual no ligado, a 37 ºC, 4 h. Así se realizan seis ligaciones. Los productos de la ligación se reensamblan a continuación en 2 tubos y se extraen con fenol / cloroformo, se precipitan en presencia de 10 μg de glucógeno y se recogen en 2 x 18 μΙ de H2O ultrapura. Se utilizan dos μΙ por electroporación.

El banco de VHH de lama macho (ref.: 080101) representa 5,4 x 106 clones y el banco de VHH de lama hembra (ref.: 010301), 106 clones.

Aislamiento de los VHH a partir de los bancos mediante la técnica de phage-display.

Selección de los VHH anti-CEA y anti-CD 16:

Los diferentes VHH se han aislado mediante la técnica de phage-display.

Producción de los bancos de fagos:

Se inoculan diez μΙ de la reserva de un banco 080101 o 010301 (células TG1 transformadas con los fagémidos) en 50 ml de (2TY, 100 μg/μΙ de ampicilina, 2 % de glucosa) y se incuban a 37 ºC hasta una DO600 igual a 0,5. A continuación se infectan cinco ml del cultivo con 5 ml del M13KO7 a 1013 ufp/ml, 30 min, a 37 ºC, sin agitación. Después de la centrifugación, el sedimento de fagos se recoge en 25 ml de (2TY, 100 μg/μΙ de ampicilina, 25 μg/μΙ de kanamicina). El cultivo se incuba 16 h a 30 ºC con agitación. Los fagos se precipitan a continuación con 1/5 vol de NaCI 2,5 M / 20 % de PEG 6000 y se concentran 25 veces en PBS. Selección de los VHH:

Se equilibran doscientos μΙ de esferas recubiertas de estreptavidina (Dynabeads M-280, Dynal) con 1 ml de leche al 2 % / PBS durante 45 min a la temperatura ambiente con agitación en una ruleta. También se equilibran 1012 fagos de la producción descrita previamente con leche al 2 % - PBS en un volumen final de 500 μΙ durante 60 min a la temperatura ambiente con agitación en una ruleta.

Las esferas se compactan con un imán, se resuspenden en 250 μΙ de leche al 2 % / PBS y se incuban con 200 μΙ de antígeno biotinilado durante 30 min a la temperatura ambiente en una ruleta. Se utilizan 150, 75 y 25 nM final de antígeno biotinilado en la 1ª, 2ª y 3ª ronda, respectivamente.

A los 450 μΙ de esferas / antígeno-biotina se añaden los 500 μΙ de fagos durante 3 h a la temperatura ambiente con agitación en una ruleta. La mezcla de esferas / antígeno-biotina / fagos se lava 5 veces con 800 μΙ leche 4 % - PBS, despues se transfiere a un tubo nuevo de eppendorf. Se realizan otros cinco lavados con 800 μΙ de PBS - Tween al 0,1 % y después la mezcla se transfiere a un tubo nuevo de eppendorf. Finalmente, se realizan 5 lavados con 800 μΙ de PBS.

Los fagos anticuerpo fijados sobre las esferas / antígeno-biotina se resuspenden en 200 μΙ de PBS y se incuban 30 min a 37 ºC, sin agitación, con 1 ml de TG1 hechas competentes por la fijación de los fagos a pili (células competentes: a partir de una cultivo de TG1 en 2YT durante una noche, se realiza a una dilución a 1/100 y se inoculan 50 ml de 2YT a 37 ºC con agitación hasta una DO600 cercana a 0,5). En cada selección, se cuentan y se

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DH5α, con 3 ml de 2YT / 100 μg/ml de ampicilina / 2 % de glucosa y se incuba a 30 ºC con agitación. A continuación se siembran cincuenta ml de LB / 100 μg/ml de ampicilina / 2 % de glucosa con una dilución del cultivo precedente y se incuban 16 h a 30 ºC con agitación. Se inoculan cuatrocientos ml de LB / 100 μg/ml de ampicilina con el equivalente de 0,1 unidad DO600, y se incuban a 30 ºC con agitación durante 2 h 30, después el cultivo se incuba a 20 ºC con agitación, hasta una DO600 de 0,5 a 0,7. El cultivo es inducido a continuación con 400 μΙ de IPTG (isopropil--D-tiogalactopiranósido) 0,1 mM final cultivado a 20 ºC durante 72 h.

Extracción de la fracción soluble del periplasma:

Los cultivos a partir de los cuales se han producido los VHH o los anticuerpos biespecíficos se centrifugan a 4.200 g, 4 ºC, 40 min. El sedimento se recoge en 4 ml de TES helado (Tris-HCI 0,2 M a pH 8,0; EDTA 0,5 mM; sacarosa 0,5 M). A continuación se añaden 160 μΙ de lisozima (10 mg/ml en TES, recién preparado), después 24 ml de TES frío diluido a 1/2 en H2O. La mezcla se incuba 30 min en hielo.

Después de la centrifugación a 4.200 g, 4 ºC, 40 min, se recupera el sobrenadante (correspondiente a la fracción periplásmica) y se añaden 150 μΙ de DNAse (10 mg/ml) y 5 mM final de MgCI2, 30 min a la temperatura ambiente. La solución se dializa 16 h contra el tampón de equilibrado (acetato de sodio 50 mM, NaCI 0,1 M a pH 7,0). Purificación de los VHH:

La columna (BD TALON™ Metal affinity, BD Biosciences Clontech) es equilibrada con el tampón de equilibrado (acetato de sodio 50 mM, NaCI 0,1 M, pH 7,0). Se deposita la fracción periplásmica en la columna. Después del lavado de la columna con 5 volúmenes de tampón de equilibrado, el VHH es eluído con un gradiente de pH o de imidazol (gradiente entre el tampón de equilibrado a pH 7,0 y una solución de acetato de sodio 50 mM a pH 5,0 o una solución de imidazol 200 mM). Cada fracción es controlada en un gel de SDS / PAGE (acrilamida al 15 %) después de una tinción con azul de coomassie. Las fracciones de interés se reagrupan y se dializan contra PBS. El VHH se concentra sobre una membrana (Amicon Ultra 5000MWCO, Millipore) y el mide mediante el método colorimétrico de Lowry con la ayuda del kit Biorad Protein Assay.

Purificación de los anticuerpos biespecíficos:

Los anticuerpos biespecíficos se purifican a partir de la fracción soluble del periplasma (cotéjese la extracción de la fracción soluble del periplasma) en dos tiempos; inicialmente, sobre una columna BD TALON (cotéjese la purificación de los VHH), después sobre una proteína G (HiTrap protein G 5 ml, Amersham biosciences).

La columna « Hi Trap protein G » es equilibrada con PBS (NaCI 137 mM, KCI 2,67 mM, Na2HPO4 1,2 mM, KH2PO4 1,76 mM, pH 7,4). Las proteínas eluídas en la columna BD TALON y dializadas en PBS se depositan sobre la proteína G. Después de lavar la columna con 5 volúmenes de PBS, el anticuerpo biespecífico es eluído con glicina 0,1 M a pH 2,7, después tamponado con HEPES 1 M a pH 8. Después de un control sobre un gel de SDS / PAGE (acrilamida al 10 %), el anticuerpo biespecífico es dializado en PBS 0,1 x, congelado a -80 ºC y liofilizado, para ser concentrado diez veces. Finalmente el F(ab’)2 es separado del Fab’ en una columna Tricorn Superdex 200 10/300 GL (Amersham Biosciences) equilibrada con PBS.

Caracterización funcional de los VHH y de los anticuerpos biespecíficos mediante ELISA, Biacore, inmunofluorescencia (citometría de flujo, FACS) y mediante ensayos de activación de CD16.

Caracterización de los anticuerpos anti-CEA y anti-CD16 mediante ELISA:

ELISA de los fagos-VHH:

Se fijan cinco μg/ml de antígeno biotinilado (CEA o CD16) en una placa de estreptavidina (BioBind Assembly Streptavidin Coated, ThermoLabsystems) previamente saturada con leche al 2 % - PBS. Se ponen en contacto cinco 1010 fagos-anticuerpo con el antígeno. La unión antígeno / anticuerpo es detectada gracias a un ELISA compuesto por un anticuerpo monoclonal dirigido contra la proteína P8 del fago (conjugado HRP / anti-M13 monoclonal, Pharmacia). La adición de sustrato, 10 mg de ABTS (ácido 2,2’-azino bis (3-etilbenzo-tiazolin-6-sulfónico, sal de diamonio) a 20 ml tampón de revelado (18 ml de PBS, 1 ml de ácido cítrico 1 M, 1 ml de citrato de sodio 1 M, 10 ml de H2O2 al 30 %), permite leer la reacción a 405 nm (Tecan).

ELISA de los VHH:

Se fijan cinco μg/ml de antígeno biotinilado en una placa de estreptavidina (BioBindAssembIyStreptavidin Coated, ThermoLabsystems) previamente saturada con leche al 2 % - PBS. Cada VHH (intervalo desde 0,001 μg/ml hasta 1 μg/ml) es unido al antígeno adsorbido en los micropocillos. La unión es revelada con un anticuerpo monoclonal dirigido contra la etiqueta c-myc (Santa Cruz Biotechnology, Inc) diluido a 1/1.000 y un anticuerpo policlonal de cabra dirigido contra las IgG de ratón acoplado a la peroxidasa diluido a 1/5.000 (ref. 55556, ICN) en presencia de ABTS (sulfonato de 2,2’-azino-di-(3-etilbenztiazolina) sal de diamonio, Roche).

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ELISA de los anticuerpos biespecíficos:

Se recubren pasivamente diez μg /ml de antígeno (rhCD16 o rhCEA) en una placa MaxiSorp (Nunc). Después de la saturación de la placa con PBS / leche al 4 %, el anticuerpo biespecífico (F(ab’)2, Fab’, Fab) (intervalo desde 800 5 hasta 0,4 nM) es unido al antígeno adsorbido en los micropocillos. La unión se revela bien:

con un anticuerpo monoclonal dirigido contra la etiqueta Flag (anti-Flag M2 mAB, Sigma) diluido a 1/5.000 y un anticuerpo policlonal de cabra dirigido contra las IgG de ratón acoplado a la fosfatasa alcalina diluido a 1/5.000 (ref. 115-055-003, Jackson Immunoresearch) en presencia de DNPP (4-nitrofenil fosfato disódico hexahidratado).

10 - con un anticuerpo monoclonal dirigido contra la etiqueta c-myc (Santa Cruz Biotechnology) diluido a 1/500 y un anticuerpo policlonal de cabra dirigido contra las IgG de ratón acoplado a la fosfatasa alcalina diluido a 1/5.000 (ref. 115-055-003, Jackson Immunoresearch) en presencia de DNPP

- con un anticuerpo policlonal de cabra dirigido contra la cadena ligera kappa humana acoplado a la fosfatasa alcalina diluido a 1/500 (ref. 2060-04, SouthernBiotech) en presencia de DNPP.

15 Se comprueba la accesibilidad de VHH CEA 17 cuando el VHH CD16 c21 se une al rhCD16 adsorbido en los micropocillos con rhCEA biotinilado y estreptavidina acoplada a fosfatasa alcalina diluida a 1/500 (DAKO, cat D0396).

20 Constantes de afinidad de los anticuerpos anti-CEA y anti-CD 16 mediante Biacore:

El BIACORE utiliza el principio de la resonancia plasmónica de superficie (SPR) para seguir en tiempo real las interacciones entre moléculas sin un marcaje de las mismas. Uno de los participantes en la interacción es inmovilizado de forma covalente sobre un biocaptador, mientras que el otro es inyectado en un flujo continuo. El 25 principio de detección mediante SPR permite el seguimiento de los cambios de masa en la superficie del biocaptador debidos a la formación, y después a la disociación, de complejos moleculares. La respuesta, cuantificada en unidades de resonancia (RU), es una indicación directa de la tasa de fijación del analito mediante la medición de la variación del índice de refracción. El registro de la señal (un sensograma) se trata matemáticamente para obtener las constantes de velocidad de asociación, ka, de disociación kd y las constantes

30 de asociación KA (KA = ka / kd) y de disociación en el equilibrio KD (KD = kd / ka).

Las interacciones entre el CEA o el CD16 y los VHH (que poseen una etiqueta c-myc reconocida por el anticuerpo monoclonal 9E10, Santa Cruz Biotechnology, Inc) se han estudiado con un BIACORE 3000 provisto de un biocaptador de tipo CM5 sobre el cual se ha inmovilizado el anticuerpo monoclonal 9E10 de forma covalente 35 siguiendo el procedimiento habitual de acoplamiento por aminas propuesto por BIACORE (activación por NHS / EDC). Entonces se inyecta el VHH (en tampón: HEPES 10 mM; NaCI 150 mM; EDTA 3 mM; 0,005 % de tensioactivo P20), después se inyecta una gama de CEA o de CD16 sobre el VHH inmovilizado sobre el 9E10. En paralelo, se realizan las inyecciones sobre un canal de control que ha experimentado la misma química de acoplamiento pero sin una inyección de proteína. Las afinidades de los VHH están indicadas en la Tabla 1, a continuación. Se obtienen

40 unas afinidades equivalentes a partir de los diferentes formatos de anticuerpos biespecíficos.

Tabla 1

VHH: ka x 105 (1/Ms) kd x 10-3 (1/s) KA x 107 (1/M) KD x 10-9 (M)

Anti-CEA 3: 1,24 ± 0,014 1,68 ± 0,002 7,38 13,6

Anti-CEA 17: 1,56 ± 0,014 1,3 ± 0,002 12 8,3

Anti-CEA 25: 1,13 ± 0,014 3,6 ± 0,004 3,15 31,7

Anti-CEA 43: 1,78 ± 0,019 1,83 ± 0,002 9,72 10,3

Anti-CD 16 c13: 0,53 ± 0,07 5,67 ± 0,02 0,94 100,6

Anti-CD 16 c21: 2,86 ± 0,02 2,79 ± 0,006 10,3 9,7

Anti-CD 16 c28: 0,42 ± 0,03 3,45 ± 0,006 1,22 81,9

Anti-CD 16 c72: 0,39 ± 0,02 3,7 ± 0,006 1,06 94,6

Análisis mediante FACS de la especificidad de los VHH anti-CEA y anti-CD16 y de los anticuerpos biespecíficos 45 correspondientes:

Especificidad por el CEA:

(Para que la inmunoidentificación sea eficaz, es primordial que los anticuerpos anti-CEA no reconozcan el NCA, una 50 molécula muy homóloga al CEA que es expresada en la superficie de los granulocitos.)

La comprobación de la unión antígeno-anticuerpo se lleva a cabo en la línea no transfectada MC38 (línea celular de cáncer de colon murino), las líneas transfectadas con el CEA (MC38/CEA+) o el NCA (MC38/NCA+), la línea tumoral

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-: VHH anti-CD16 (c13, c21, c28, c72).

-: VHH anti-CEA (3, 17, 25, 43).

- 35A7, anticuerpo monoclonal anti-CEA

- 192, anticuerpo monoclonal anti-NCA (que crece con el CEA)

- Anticuerpos biespecíficos anti-CEA / anti-CD 16 construidos a partir de los 8 VHH aislados. Anticuerpos utilizados para el revelado:

- 9E10, anticuerpo monoclonal de ratón anti-cmyc (200 μg/ml, utilizado a 1/10) que se fija a la etiqueta c-myc de los VHH purificados.

- Fab’2 de un anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón acoplado al FITC (F(ab’)2 / FITC) utilizado a 20 μg/ml (Jackson Immunoresearch Lab. Inc., 115-096-003). Se utilizan 0,5 x 106 células por ensayo. Los VHH y los anticuerpos monoclonales se diluyen en 100 μΙ de PBS 1 % de BSA. 0,5 x 106 células (medida de la autofluorescencia de las células) 0,5 x 106 células + (F(ab’)2 / FITC) 20 μg/ml 0,5 x 106 células + anti-9E10 20 μg/ml, después (F(ab’)2 / FITC) 20 μg/ml 0,5 x 106 células + VHH entre 1 y 5 μg/ml, después 9E10 20 μg/ml, después (F(ab’)2 / FITC) 20 μg/ml 0,5 x 106 células + anticuerpos monoclonales (35A7, 192, 3G8.7.5.4, AT10, IV.3) 20 μg/ml, después (F(ab’)2 / FITC) 20 μg/ml.

En cada etapa, las muestras se incuban 45 min, a 4 ºC, en la oscuridad.

Entre cada reacción, se realiza un lavado con 2 ml de PBS / 1 % de BSA. En la última etapa, las células se recogen en 0,5 ml de PBS

Los resultados del FACS demuestran la especificidad de los 4 VHH anti-CD 16 analizados y de los anticuerpos biespecíficos anti-CEA/anti-CD16 en forma de Fab, Fab’ y F(ab’)2. Son específicos de CD16 y no crecen con el CD32. En la figura 4 se ilustra un ejemplo. En este ejemplo, el anticuerpo monoclonal de referencia mAb 3G8 no se une a las células Jurkat, K562 CD32A+ y IIA. 1.6hulIB1 CD32B+ que no expresa el CD16 sino a las células Jurkat CD16A+ y a los granulocitos que expresan el CD16 en su superficie. El VHH CD16 c21 sólo se une a las células que expresan el CD16 en su superficie. Se obtienen unos resultados equivalentes con los demás anticuerpos VHH anti-CD16 (clones: c13, c28 y c72). El anticuerpo biespecífico VHH CEA 17 / VHH CD16 c21 es específico de las células Jurkat CD16A+ y NKL a la vez en forma de Fab’ y de F(ab’)2. Se obtienen unos resultados equivalentes con los demás anticuerpos biespecíficos anti-CEA/anti-CD16 en forma de Fab, Fab’ y F(ab’)2 (que derivan de los 8 VHH anti-CEA y anti-CD16).

Análisis mediante FACS de la accesibilidad de los anticuerpos biespecíficos en las células:

La accesibilidad del dominio VHH anti-CD16:

Se incuban cinco 105 células LS174T durante 30 min, en PBS-BSA al 1 % en hielo, en presencia de Fab, de Fab’ o de F(ab’)2, (intervalo desde 10 μg/ml hasta 0,1 μg/ml). Las células se lavan con PBS-BSA al 1 %. A continuación se detecta la fijación de rhCD16 (10 μg/ml) en el dominio VHH anti-CD16 de los diferentes fragmentos de anticuerpo, en dos tiempos, incubando el anticuerpo monoclonal 7.5.4 o 3G8 (3 μg/ml) con las células durante 30 min, en hielo, incubando después las células con F(ab’)2 de cabra anti-IgG de ratón (H + L) marcado con FITC (Jackson Immunoresearch Laboratory, cat: 115-096-003), durante 30 min en hielo. Después de varios lavados se analiza la inmunofluorescencia mediante citometría de flujo con un FACScaIibur 4C4 (Becton dickinson) mediante la utilización del programa Cell Quest Pro.

La accesibilidad del dominio VHH anti-CEA:

Se incuban cinco 105 células Jurkat CD16A+ durante 30 min, en PBS-BSA al 1 % en hielo, en presencia de Fab, de Fab’ o de F(ab’)2, (intervalo desde 10 μg/ml hasta 0,1 μg/ml). Las células se lavan con PBS-BSA al 1 %. A continuación se detecta la fijación de rhCEA (10 μg/ml) en el dominio VHH anti-CEA de los Fab, Fab’o F(ab’)2, en dos tiempos, incubando el anticuerpo monoclonal 192 (3 μg/ml) con las células durante 30 min, en hielo, incubando después las células con F(ab’)2 de cabra anti-IgG de ratón (H+L) marcado con FITC (Jackson Immunoresearch Laboratory, cat: 115-096-003), durante 30 min en hielo. Después de varios lavados se analiza la inmunofluorescencia mediante citometría de flujo con un FACScaIibur 4C4 (Becton dickinson) mediante la utilización del programa Cell Quest Pro.

En la figura 5 se ilustra un ejemplo. El anticuerpo biespecífico VHH CEA 17/VHH CD16 c21 se une a la vez a las células LS174T y Jurkat CD16A+. Se obtienen unos resultados equivalentes con los demás anticuerpos biespecíficos anti-CEA/anti-CD16 en forma de Fab, Fab’ y F(ab’)2 (que derivan de los 8 VHH anti-CEA y anti-CD16).

Ensayo de competición entre los VHH anti-CD16 y los anticuerpos monoclonales 3G8 y 7.5.4:

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a 37 ºC, se cuenta la radioactividad de Cr liberada en el medio con la ayuda de un contador . Algunos ejemplos que muestran la lisis celular obtenida con los anticuerpos biespecíficos anti-CEA 17/anti-CD16 c21 y anti-CEA 17/anti-CD16 c28 en forma de Fab’ y de F(ab’)2 están representados en la figura 9.

Construcción de los diferentes plásmidos (véanse las Figuras 10A, 10B, 11,12A y 12B).

- Todos los protocolos no detallados están descritos en Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular cloning a laboratory manual, 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

- Las digestiones con las enzimas de restricción se llevan a cabo según las recomendaciones de los proveedores.

- Genes de origen humano insertados: los genes que codifican para las regiones C, CH1, H, CH2 y CH3 corresponden respectivamente a los dominios de los genes que codifican para la región constante de una cadena ligera kappa de una inmunoglobulina humana, para la primera región constante, para la región bisagra, para la segunda región constante y para la tercera región constante de una cadena pesada de una inmunoglobulina IgG1 humana. Estos genes se han obtenido mediante una RT-PCR a partir de un bolsillo de LFB (Laboratoire français de Fractionnement et des Biotechnologies). Este material posee las autorizaciones legales para ser utilizado en los experimentos descritos.

- La secuencia de cada plásmido se realiza con un secuenciador ABI 310 mediante la utilización de los oligonucleótidos:

EcoRI-90 de la secuencia SEC ID Nº 12: GCGCCGACATCATAACGGTTCTGGC Hindlll+88 de la secuencia SEC ID Nº 13: CGCTACTGCCGCCAGGC

- Todos los vectores están concebidos para permitir la introducción entre 2 sitios únicos de enzimas de restricción de: diferentes promotores, diferentes secuencias de señalización de tipo PeIB (u otras), diferentes secuencias RBS, cualquier dominio VHH o VHH humanizado, cualquier dominio C o los dominios CH1, H, CH2 y CH3 de cualquier tipo de inmunoglobulina.

pMCSPhoA’

(Figura 10A)

La construcción de este plásmido se describe en Le Calvez y al. (1995). REF

Esta plásmido codifica para la forma madura de la fosfatasa alcalina (PhoA) que empieza en el sexto residuo (Prolina).

p35PhoA’

(Figura 10A)

La construcción de este plásmido se describe en Le Calvez (1996).

Un fragmento de gen (formado por oligonucleótidos degenerados en la tercera base de los codones 2 a 14 que codifican para la secuencia de señalización de PeIB) es insertado entre los sitios Ndel y Eagl del plásmido pMCSPhoA’. A continuación se han seleccionado los clones (1 a 60) que representan la mejor actividad de fosfatasa alcalina.

p35PhoA’/N

(Figuras 10A y 11)

Supresión del sitio Ncol en el gen phoA.

Se realiza una PCR de superposición a partir de pMCSPhoA’ con los oligonucleótidos: secuencia arriba-Rsrll, Ncolsup, Ncol-inf y secuencia abajo-EcoNI.

Secuencias SEC ID Nº 14 a 17 de los oligonucleótidos utilizados:

secuencia arriba-Rsrll SEC ID Nº 14: GGCACATGTGACCTCGCGC Ncol-sup SEC ID Nº 15: GCAACGTACCACGGCAATATCG Ncol-inf SEC ID Nº 16: CGATATTGCCGTGGTACGTTGC secuencia abajo-EcoNI SEC ID Nº 17: GCCATCTTTGGTATTTAGCGCC

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Supresión de los sitios Apal y BstEII de p55PhoA6HisGS/N-:

Se realiza una PCR de superposición a partir de p55PhoA6HisGS/N- con los oligonucleótidos: secuencia arriba-EcoRV, Apal-BstEII-sup, BstEII-Apal-inf y secuencia abajo-MIul. Secuencias SEC ID Nº 20 a 23 de los oligonucleótidos utilizados:

secuencia arriba-EcoRV

SEC ID Nº 20: CATGAGCTGTCTTCGGTATC

Apal-BstEII-sup

SEC ID Nº 21: TAATGGTCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGATGACCCA

BstEII-Apal-inf

SEC ID Nº 22: TGGGTCATCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGACCATTA

secuencia abajo-MIul

SEC ID Nº 23: GAACGAAGCGGCGTCGAAG

Condiciones de las PCR 1 y PCR 2:

Un μΙ (5 ng) de plásmido p55PhoA6HisGS/N-, 10 pmol de cada oligonucleótido (secuencia arriba-EcoRV y BstEII- Apal-inf para la PCR 1 y Apal-BstEII-sup y secuencia abajo-MIul para la PCR 2), 0,5 U de Dynazyme (a 94 ºC, 3 min; 94 ºC, 45 s; a 60 ºC, 45 s; a 72 ºC, 45 s; 25 ciclos, después a 72 ºC, 10 min. Los productos de la PCR son purificados a partir de un gel de agarosa al 2 % (gel extraction Kit Quiagen, volumen final de 50 μΙ).

Condiciones de la PCR 3 de superposición:

Un μΙ de cada una de las PCR 1 y 2 y 0,5 U de Deep Vent, en un volumen final de 50 μΙ. Después de 5 ciclos (a 94 ºC, 3 min; 94 ºC, 1 min; 60 ºC, 1 min; 72 ºC, 1,5 min) se añaden 10 pmol de cada oligonucleótido (secuencia arriba-EcoRV y secuencia abajo-Mlul) y la PCR se continúa durante 35 ciclos, después a 72 ºC, 10 min. El producto de la PCR 3 es purificado a partir de un gel de agarosa al 2 % (gel extraction Kit Quiagen, volumen final de 50 μΙ).

La secuencia del fragmento de la PCR se realiza en un secuenciador ABI 310 mediante la utilización del oligo 5’ EcoRI-90.

Clonación del fragmento de la PCR 3 en el plásmido p55PhoA6HisGS/N-.

Se digieren treinta y cinco μΙ del fragmento de la PCR 3 y 5 μΙ (2,5 μg) de p55PhoA6HisGS/N- con 10 U de EcoRV y Mlul. Después de 16 h de incubación, las enzimas son destruidas 10 min a 65 ºC. Cada ADN se precipita a continuación y se resuspende en 20 μΙ de H2O. La ligación se realiza 16 h a 16 ºC con 5 μΙ del fragmento de la PCR, 0,5 μΙ de vector y 3 U Weiss de ligasa T4 de ADN Biolabs en un volumen final de 10 μΙ. Se transforman bacterias TG1 competentes (técnica del CaCI2) con 5 μΙ de ligación.

p55PhoA6HisGS-/NAB

(Figuras 10A y 11)

Desfase del gen PhoA a nivel del sitio Eagl.

Este desfase crea un sitio único Fsel.

Se digieren cinco μΙ (2,5 μg) de p55PhoA6HisGS/NAB- con 10 U de Eagl. Después de 16 h de incubación, la enzima es destruida 10 min a 65 ºC. La mezcla de reacción se precipita a continuación y se resuspende en 20 μΙ de H2O. Se añaden una mezcla equimolar de dGTP y dCTP (33 μΜ final) y 2,5 U de fragmento Klenow exo- (BioIabs) en un volumen final de 50 μΙ, 15 min a 25 ºC. Se detiene la reacción con 2 μΙ de EDTA a 500 mM, 20 min a 75 ºC. La mezcla de reacción se precipita en etanol, se recoge con 5 μΙ de H2O y se liga con 3 U Weiss de ligasa T4 de ADN Biolabs en un volumen final de 10 μΙ. Se transforman bacterias TG1 competentes (técnica del CaCI2) con 5 μΙ de ligación.

Este plásmido permite la clonación y la selección de los fragmentos de anticuerpos VH humanos mejor secretados.

p55/MCS1

(Figuras 10A y 11)

Inserción de MCSI en p55PhoA6HisGS/NAB- entre los sitios Ncol y Hindlll mediante la utilización de los oligonucleótidos apareados 5’ MCSI y 3’ MCSI. Secuencias SEC ID Nº 24 y 25 de los oligonucleótidos utilizados:

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5’ MCSI SEC ID Nº 24:

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3’ MCSI SEC ID Nº 25:

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Se digieren cinco μΙ (2,5 μg) del vector p55PhoA6HisGS/NAB- 6 h con 10 U de cada enzima Ncol y Hindlll. Se incuban diez pmol de cada uno de los oligonucleótidos 5’ MCSI y 3’ MCSI 5 min a 80 ºC, después la solución se deja enfriar lentamente hasta la temperatura ambiente. Ligación de 5 μΙ de vector con 1,2 μΙ del casete hibridado (5’ MCSI + 3’ MCSI) en presencia de 3 U Weiss de ligasa T4 de ADN Biolabs 1 h a la temperatura ambiente. La ligasa es destruida mediante su incubación 10 min a 65 ºC. Se añade de nuevo mezcla de reacción (2 h) de 90 μΙ, que contiene 10 U de Eagl para destruir el vector de origen. Esta mezcla se precipita con etanol y se recoge en 10 μΙ de H2O. Se transforman bacterias TG1 competentes (técnica del CaCI2) con la mezcla.

p55Flag/RBS/35

(Figuras 10A y 11)

Inserción del motivo Flag/RBS/PelB35 en p55/MCSI entre los sitios Sfil y Sac2 mediante la utilización de los oligonucleótidos apareados 5’ Flag/RBS/35-sup y 3’ Flag/RBS/35-inf. Secuencias SEC ID Nº 26 y 27 de los oligonucleótidos utilizados:

5’ Flag/RBS/35-sup

SEC ID Nº 26:

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SEC ID Nº 117:

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3’ Flag/RBS/35-inf SEC ID Nº 27:

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SEC ID Nº 118

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La clonación se efectúa exactamente según las condiciones descritas previamente para la inserción de MCSI. Después de la ligación, la mezcla de reacción es digerida con 10 U de enzima Xhol.

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Claims

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