ES2541492T3 - Métodos para pretratar material celulósico con polipéptido GH61 - Google Patents

Métodos para pretratar material celulósico con polipéptido GH61 Download PDF

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Abstract

Método de degradación de un material celulósico, que comprende: (a) pretratamiento del material celulósico con una composición que comprende uno o más polipéptidos GH61; y (b) sacarificación del material celulósico pretratado con polipéptido GH61 con una composición enzimática.

Description

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reducir uno o más componentes de un proceso de fermentación. Por consiguiente, una sustancia aislada puede estar presente en tal producto de caldo de fermentación.
[0042] Condiciones de astringencia bajas: el término "condiciones de astringencia bajas" se refiere a sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado y 25% formamida, siguiendo procedimientos de transferencia de Southern de estándar durante 12 a 24 horas. El material portador se lava finalmente tres veces cada uno durante 15 minutos usando 2X SSC, 0,2% SDS a 50°C.
[0043] Polipéptido maduro: el término "polipéptido maduro" se refiere a un polipéptido en su forma final después de la traducción y cualquier modificación postraduccional, tal como tratamiento N-terminal, truncamiento C-terminal, glicosilación, fosforilación, etc. Se conoce en la técnica que una célula huésped puede producir una mezcla de dos o más polipéptidos maduros diferentes (es decir, con un aminoácido C-terminal y/o N-terminal diferente) expresado por el mismo polinucleótido. El polipéptido maduro se puede predecir utilizando el programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6). También se conoce en la técnica que células huésped diferentes procesan polipéptidos diferentemente, y así, una célula huésped que expresa un polinucleótido puede producir un polipéptido maduro diferente (por ejemplo, con un aminoácido C-terminal y/o N-terminal diferente) en comparación con otra célula huésped que exprese el mismo polinucleótido.
[0044] Secuencia codificante de polipéptido maduro: el término "secuencia codificante de polipéptido maduro" se define aquí como una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido maduro que tiene actividad biológica, por ejemplo, actividad enzimática. La secuencia codificante de polipéptido maduro se puede predecir utilizando el programa Signal (Nielsen et al., 1997, supra). Se conoce en la técnica que una célula huésped puede producir una mezcla de dos o más polipéptidos maduros diferentes (es decir, con un aminoácido C-terminal y/o N-terminal diferente) expresado por el mismo polinucleótido. Es también conocido en la técnica que células huésped diferentes procesan polipéptidos diferentemente, y así, una célula huésped que expresa un polinucleótido puede producir un polipéptido maduro diferente (por ejemplo, con un aminoácido C-terminal y/o N-terminal diferente) en comparación con otra célula huésped que exprese el mismo polinucleótido.
[0045] Condiciones de astringencia media: el término "condiciones de astringencia media" se refiere a sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado y 35% formamida, siguiendo procedimientos de transferencia de Southern estándar durante 12 a 24 horas. El material portador es finalmente lavado tres veces cada uno durante 15 minutos usando 2X SSC, 0,2% SDS a 55°C.
[0046] Condiciones de astringencia medias-altas: el término "condiciones de astringencia medias-altas" se refiere a sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 microgramos/ml ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado y 35% formamida, siguiendo procedimientos de transferencia de Southern estándar durante 12 a 24 horas. El material portador es finalmente lavado tres veces cada uno durante 15 minutos usando 2X SSC, 0,2% SDS a 60°C.
[0047] Constructo de ácidos nucleicos: el término "constructo de ácidos nucleicos" se refiere a una molécula de ácido nucleico, bien uni-o bicatenaria, que se aísla a partir de un gen de origen natural o se modifica para contener segmentos de ácidos nucleicos de modo que no existirían de lo contrario en la naturaleza o que es sintético, que comprende una o más secuencias de control.
[0048] Operativamente enlazado: el término "operativamente enlazado" se refiere a una configuración en la que una secuencia de control se coloca en una posición apropiada con respecto a la secuencia codificante de un polinucleótido de modo que la secuencia de control dirija la expresión de la secuencia codificante.
[0049] Polipéptido que tiene actividad de aumento celulolítico: el término "polipéptido que tiene actividad de aumento celulolítico" se refiere a un polipéptido GH61 que cataliza el aumento de la hidrólisis de un material celulósico por enzima que tiene actividad celulolítica.
[0050] La actividad de aumento celulolítico se determina por medición del aumento en azúcares reductores o el aumento del total de celobiosa y glucosa a partir de la hidrólisis de un material celulósico por enzima celulolítica bajo las siguientes condiciones: 1-50 mg de proteína total/g de celulosa en PCS, donde la proteína total está compuesta por 5099,5% p/p de proteína enzimática celulolítica y 0,5-50% p/p de proteína de un polipéptido GH61 que tiene actividad de aumento celulolítico durante 1-7 días a una temperatura adecuada, por ejemplo, 50°C, 55°C o 60°C, y pH, por ejemplo, 5,0 o 5,5, en comparación con una hidrólisis de control con igual carga de proteína total sin actividad de aumento celulolítico (1-50 mg de proteína celulolítica/g de celulosa en PCS). En un aspecto preferido, una mezcla de CELLUCLAST® 1,5L (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) en presencia de 2-3% de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae de peso de proteína total (producida de forma recombinante en el Aspergillus oryzae según la WO 02/095014) o 2-3% de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus del peso de proteína total (producido de forma recombinante en Aspergillus oryzae como se describe en la WO 2002/095014) de carga de proteína de celulasa se usa como la fuente de la actividad celulolítica.
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aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 7,0 y 60°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 7,0 y 65°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 7,0 y 70°C.
[0084] En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 7,5 y 5°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 7,5 y 10°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 7,5 y 15°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 7,5 y 20°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 7,5 y 25°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 7,5 y 30°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 7,5 y 35°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 7,5 y 40°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 7,5 y 45°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 7,5 y 50°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 7,5 y 55°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 7,5 y 60°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 7,5 y 65°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 7,5 y 70°C.
[0085] En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 8,0 y 5°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 8,0 y 10°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 8,0 y 15°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 8,0 y 20°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 8,0 y 25°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 8,0 y 30°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 8,0 y 35°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 8,0 y 40°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 8,0 y 45°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 8,0 y 50°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 8,0 y 55°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 8,0 y 60°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 8,0 y 65°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 8,0 y 70°C.
[0086] En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 8,5 y 5°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 8,5 y 10°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 8,5 y 15°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 8,5 y 20°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 8,5 y 25°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 8,5 y 30°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 8,5 y 35°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 8,5 y 40°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 8,5 y 45°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 8,5 y 50°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 8,5 y 55°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 8,0 y 60°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 8,5 y 65°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 8,5 y 70°C.
[0087] En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 9,0 y 5°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 9,0 y 10°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 9,0 y 15°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 9,0 y 20°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 9,0 y 25°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 9,0 y 30°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 9,0 y 35°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 9,0 y 40°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 9,0 y 45°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 9,0 y 50°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 9,0 y 55°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 9,0 y 60°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 9,0 y 65°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 9,0 y 70°C.
[0088] En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 9,5 y 5°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 9,5 y 10°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 9,5 y 15°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 9,5 y 20°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 9,5 y 25°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 9,5 y 30°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 9,5 y 35°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 9,5 y 40°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 9,5 y 45°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 9,5 y 50°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 9,5 y 55°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 9,5 y 60°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 9,5 y 65°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 9,5 y 70°C.
[0089] En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 10,0 y 5°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 10,0 y 10°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 10,0 y 15°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 10,0 y 20°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 10,0 y 25°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 10,0 y 30°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 10,0 y 35°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 10,0 y 40°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 10,0 y 45°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 10,0 y 50°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 10,0 y 55°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 8,0 y 60°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 10,0 y 65°C. En otro aspecto, el pretratamiento se realiza a pH 10,0 y 70°C.
[0090] Durante el pretratamiento de un material celulósico, una cantidad eficaz de un polipéptido GH61 que tiene actividad de aumento celulolítico para material celulósico es de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50,0 mg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 40 mg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 30 mg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 mg, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5 mg, de aproximadamente 0,025 a aproximadamente 1,5 mg, de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 1,25 mg, de aproximadamente 0,075 a aproximadamente 1,25 mg, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1,25 mg, incluso de aproximadamente 0,15 a aproximadamente 1,25 mg o de aproximadamente 0,25 a aproximadamente 1,0 mg por g de material celulósico.
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Alternativamente, el pretratamiento puede llevarse a cabo simultáneamente con la hidrólisis enzimática para liberar azúcares fermentables, tales como glucosa, xilosa y/o celobiosa. En la mayoría de los casos el paso de pretratamiento en sí produce alguna conversión de biomasa en azúcares fermentables (incluso en ausencia de enzimas).
[0125] Pretratamiento de vapor. En el pretratamiento de vapor, el material celulósico se calienta para interrumpir los componentes de la pared celular vegetal, incluyendo lignina, hemicelulosa y celulosa para hacer que la celulosa y otras fracciones, por ejemplo, hemicelulosa, sean accesibles para las enzimas. El material celulósico se pasa a o a través de un recipiente de reacción donde se inyecta vapor para aumentar la temperatura a la temperatura y presión requeridas y se retiene ahí durante el tiempo de reacción deseado. El pretratamiento de vapor se realiza preferiblemente a 140250°C, por ejemplo, 160-200°C o 170-190°C, donde la gama de temperatura óptima depende de la adición de un catalizador químico. El periodo de permanencia para el pretratamiento de vapor es preferiblemente 1-60 minutos, por ejemplo, 1-30 minutos, 1-20 minutos, 3-12 minutos, o 4-10 minutos, donde el periodo de permanencia óptimo depende de la gama de temperatura y adición de un catalizador químico. El pretratamiento de vapor permite cargas de sólidos relativamente altas, de modo que el material celulósico está generalmente solo húmedo durante el pretratamiento. l pretratamiento de vapor se combina frecuentemente con una descarga explosiva del material después del pretratamiento, que se conoce como explosión de vapor, es decir, es flash rápido a presión atmosférica y flujo turbulento del material para aumentar el área de superficie accesible por fragmentación (Duff y Murray, 1996, Bioresource Technology 855: 1-33; Galbe and Zacchi, 2002, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 618-628; U.S. Patent Application No. 20020164730). Durante el pretratamiento de vapor, grupos de acetil hemicelulosa se dividen y el ácido resultante autocataliza la hidrólisis parcial de la hemicelulosa en monosacáridos y oligosacáridos. La lignina se retira sólo de forma limitada.
[0126] Pretratamiento químico: el término "tratamiento químico" se refiere a cualquier pretratamiento químico que promueva la separación y/o liberación de celulosa, hemicelulosa y/o lignina. Tal pretratamiento puede convertir celulosa cristalina en celulosa amorfa. Ejemplos de procesos de pretratamiento químico adecuados incluyen, por ejemplo, pretratamiento de ácido diluido, pretratamiento de cal, oxidación en húmedo, explosión por congelación de la fibra con amoníaco (AFEX), filtración de amoníaco (apr), líquido iónico y pretratamientos organosolv.
[0127] Un catalizador tal como H2SO4 o SO2 (típicamente 0,3 a 5% p/p) se añade frecuentemente antes del pretratamiento con vapor, que reduce el tiempo y la temperatura, aumenta la recuperación y mejora la hidrólisis enzimática (Ballesteros et al., 2006, Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132: 496-508; Varga et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 113-116: 509-523; Sassner et al., 2006, Enzyme Microb. Technol. 39: 756-762). En el pretratamiento de ácido diluído, el material celulósico se mezcla con ácido diluído, típicamente H2SO4 y agua para formar un lodo, calentado por vapor a la temperatura deseada, y después de un periodo de permanencia paso rápido a presión atmosférica. El pretratamiento de ácido diluído se puede realizar con diferentes diseños de reactor, por ejemplo, reactores de flujo de pistón, reactores de contracorriente o reactores de lecho de encogimiento de contracorriente continua (Duff and Murray, 1996, supra;Schell et al., 2004, Bioresource Technol. 91: 179-188; Lee et al., 1999, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 65: 93-115).
[0128] Diferentes métodos de pretratamiento bajo condiciones alcalinas también pueden usarse. Estos pretratamientos alcalinos incluyen, pero de forma no limitativa, hidróxido sódico, cal, oxidación en húmedo, filtración de amoníaco (APR) y explosión por congelación de la fibra de amoníaco (AFEX).
[0129] El pretratamiento de cal se realiza con óxido de calcio o hidróxido cálcico a temperaturas de 85-150°C y tiempos de estancia de 1 hora a varios días (Wyman et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 1959-1966; Mosier et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 673-686). La WO 2006/110891, WO 2006/110899, WO 2006/110900 y WO 2006/110901 revelan métodos de pretratamiento que usan amoníaco.
[0130] La oxidación en húmedo es un pretratamiento térmico realizado típicamente a 180-200°C durante 5-15 minutos con adición de un agente oxidante tal como peróxido de hidrógeno o sobrepresión de oxígeno (Schmidt y Thomsen, 1998, Bioresource Technol. 64: 139-151; Palonen et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 117: 1-17; Varga et al., 2004, Biotechnol. Bioeng. 88: 567-574; Martin et al., 2006, J. Chem. Technol. Biotechnol. 81: 1669-1677). El pretratamiento se realiza preferiblemente a 1-40% de sustancia seca, por ejemplo, 2-30% de sustancia seca o 5-20% de sustancia seca, y frecuentemente el pH inicial se aumenta por la adición de álcali tal como carbonato de sodio.
[0131] Una modificación del método de pretratamiento de oxidación en húmedo, conocido como explosión en húmedo (combinación de oxidación en húmedo y explosión de vapor) puede manejar sustancia seca hasta 30%.En la explosión en húmedo, el agente oxidante se introduce durante el pretratamiento después de un determinado tiempo de estancia. El pretratamiento se cesa luego por paso rápido a presión atmosférica (WO 2006/032282).
[0132] La explosión de fibra de amoníaco (AFEX) implica tratamiento del material celulósico con amoníaco líquido o gaseoso a temperaturas moderadas tal como 90-150°C y alta presión tal como 17-20 bares durante 5-10 minutos, donde el contenido de sustancia en seco puede ser tan alto como 60% (Gollapalli et al., 2002, Appl. Biochem. Biotechnol. 98: 23-35; Chundawat et al., 2007, Biotechnol. Bioeng. 96: 219-231; Alizadeh et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121: 1133-1141; Teymouri et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 2014-2018). Durante el pretratamiento
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AFEX la celulosa y las hemicelulosas permanecen relativamente intactas. Los complejos de lignina-carbohidrato se dividen.
[0133] Pretratamiento organosolv delignifica el material celulósico por extracción utilizando etanol acuoso (40-60% etanol) a 160-200°C durante 30-60 minutos (Pan et al., 2005, Biotechnol. Bioeng. 90: 473-481; Pan et al., 2006, Biotechnol. Bioeng. 94: 851-861; Kurabi et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121: 219-230). Se añade normalmente ácido sulfúrico como un catalizador. En el pretratamiento organosolv, la mayoría de la hemicelulosa y la lignina se retira.
[0134] Otros ejemplos de métodos de pretratamiento adecuados son descritos por Schell et al., 2003, Appl. Biochem. and Biotechnol. Vol. 105-108, p. 69-85, y Mosier et al., 2005, Bioresource Technology 96: 673-686 y la solicitud publicada de EE.UU. 2002/0164730.
[0135] En un aspecto, el pretratamiento químico se realiza preferiblemente como un tratamiento de ácido diluido, y de forma más preferible como un tratamiento de ácido diluido continuo. El ácido es típicamente ácido sulfúrico, pero otros ácidos también pueden usarse, tal como ácido acético, ácido cítrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido tartárico, ácido succínico, cloruro de hidrógeno o mezclas derivadas. El tratamiento de ácido moderado se realiza en el rango de pH de preferiblemente 1-5, por ejemplo, 1-4 o 1-2,5. En un aspecto, la concentración ácida está en la gama de preferiblemente 0,01 a 10% en peso de ácido, por ejemplo, 0,05 a 5% en peso de ácido o 0,1 a 2% en peso de ácido. El ácido es contactado con el material celulósico y mantenido a una temperatura en la gama de preferiblemente 140-200°C, por ejemplo, 165-190°C, durante periodos que varían de 1 a 60 minutos.
[0136] En otro aspecto, el pretratamiento tiene lugar en un lodo acuoso. En aspectos preferidos, el material celulósico está presente durante el pretratamiento en cantidades preferiblemente entre 10-80 % en peso, e.g..20-70 % en peso o 30-60 % en peso, tal como alrededor de 40 % en peso. El material celulósico pretratado puede ser sin lavar o lavado utilizando cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, lavado con agua.
[0137] Pretratamiento mecánico o pretratamiento físico: el término "pretratamiento mecánico" o "pretratamiento físico" se refiere a cualquier pretratamiento que promueva la reducción del tamaño de partículas. Por ejemplo, tal pretratamiento puede implicar varios tipos de trituración o molienda (por ejemplo, molienda en seco, molienda en húmedo o molienda con bola vibratoria) para disgregar y/o reducir el tamaño de partícula de componentes de la pared celular vegetal del material celulósico.
[0138] El material celulósico se puede pretratar tanto física (mecánica) como químicamente. El pretratamiento mecánico
o físico se puede acoplar con explosión de vaporización/vapor, hidrotermólisis, tratamiento de ácido diluido o moderado, alta temperatura, tratamiento de alta presión, irradiación (por ejemplo, irradiación de microondas) o combinaciones de los mismos. En un aspecto, alta presión se refiere a presión en la gama de preferiblemente aproximadamente 100 a aproximadamente 400 psi, por ejemplo, de aproximadamente 150 a aproximadamente 250 psi. En otro aspecto, alta temperatura se refiere a temperatura en la gama de aproximadamente 100 a aproximadamente 300°C, por ejemplo, de aproximadamente 140 a aproximadamente 200°C. En un aspecto preferido, el pretratamiento mecánico o físico se realiza en un proceso de lote utilizando un sistema hidrolizador de pistola de vapor que usa alta presión y alta temperatura tal como se ha definido anteriormente, por ejemplo, un hidrolizador Sunds disponible de Sunds Defibrator AB, Suecia. Los pretratamientos físicos y químicos pueden llevarse a cabo consecutiva o simultáneamente, como se desee.
[0139] Por consiguiente, en un aspecto preferido, el material celulósico está sujeto a pretratamiento físico (mecánico) o químico, o cualquier combinación de los mismos, para promover la separación y/o liberar celulosa, hemicelulosa y/o lignina.
[0140] Pretratamiento biológico: el término "pretratamiento biológico" se refiere a cualquier pretratamiento biológico que promueva la separación y/o la liberación de celulosa, hemicelulosa y/o lignina del material celulósico. Técnicas de pretratamiento biológico pueden implicar aplicación de enzimas y/o microorganismos de solubilización de lignina (véase, por ejemplo, Hsu, T.-A., 1996, Pretreatment of biomass, in Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman,
C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212; Ghosh y Singh, 1993, Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of cellulosic biomass, Adv. Appl. Microbiol. 39: 295-333; McMillan, J. D., 1994, Pretreating lignocellulosic biomass: a review, in Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, M. E., Baker, J. O., y Overend, R. P., eds., ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington, DC, chapter 15; Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J., y Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, en Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65: 207-241; Olsson y Hahn-Hagerdal, 1996, Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production, Enz. Microb. Tech.
18: 312-331; y Vallander y Eriksson, 1990, Production of ethanol from lignocellulosic materials: State of the art, Adv. Biochem. Eng./Biotechnol. 42: 63-95).
[0141] Sacarificación. En el paso de hidrólisis, también conocido como sacarificación, el material celulósico pretratado se hidroliza para descomponer celulosa y/o hemicelulosa en azúcares fermentables, tal como glucosa, celobiosa, xilosa, xilulosa, arabinosa, manosa, galactosa y/o oligosacáridos solubles. La hidrólisis se realiza enzimáticamente por una
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isobutanol, etanol, glicerol, metanol, etilenglicol, 1,3-propanodiol [propilenglicol], butanodiol, glicerina, sorbitol y xilitol); un alcano (por ejemplo, pentano, hexano, heptano, octano, nonano, decano, undecano y dodecano), un cicloalcano (por ejemplo, ciclopentano, ciclohexano, cicloheptano y ciclooctano), un alqueno (por ejemplo penteno, hexeno, hepteno y octeno); un aminoácido (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico, glicina, lisina, serina y treonina); un gas (por ejemplo, metano, hidrógeno (H2), dióxido de carbono (CO2) y monóxido de carbono (CO); isopreno; una cetona (por ejemplo, acetona); un ácido orgánico (por ejemplo, ácido acético, ácido acetónico, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido 2,5-diqueto-D-glucónico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glucárico, ácido glucónico, ácido glucurónico, ácido glutárico, ácido 3-hidroxipropiónico, ácido itacónico, ácido láctico, ácido málico, ácido malónico, ácido oxálico, ácido oxaloacético, ácido propiónico, ácido succínico y ácido xilónico); y policétido. El producto de fermentación puede también ser proteína como un producto de valor alto.
[0168] En un aspecto preferido, el producto de fermentación es un alcohol. Se entiende que el término "alcohol" abarca una sustancia que contiene una o más fracciones de hidróxilo. En un aspecto más preferido, el alcohol es n-butanol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es isobutanol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es etanol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es metanol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es arabinitol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es butanodiol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es etilenglicol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es glicerina. En otro aspecto más preferido, el alcohol es glicerol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es 1,3-propanodiol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es sorbitol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es xilitol. Véase, por ejemplo, Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J., y Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, en Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65: 207-241; Silveira, M. M., y Jonas, R., 2002, The biotechnological production of sorbitol, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 400-408; Nigam, P., y Singh, D., 1995, Processes for fermentative production of xylitol -a sugar substitute, Process Biochemistry 30 (2): 117-124; Ezeji, T. C., Qureshi, N. y Blaschek, H. P., 2003, Production of acetone, butanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BA101 and in situ recovery by gas stripping, World Journal of Microbiology and Biotechnology 19 (6): 595-603.
[0169] En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es un alcano. El alcano puede ser un alcano de no ramificado o ramificado. En otro aspecto más preferido, el alcano es pentano. En otro aspecto más preferido, el alcano es hexano. En otro aspecto más preferido, el alcano es heptano. En otro aspecto más preferido, el alcano es octano. En otro aspecto más preferido, el alcano es nonano. En otro aspecto más preferido, el alcano es decano. En otro aspecto más preferido, el alcano es undecano. En otro aspecto más preferido, el alcano es dodecane.
[0170] En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es un cicloalcano. En otro aspecto más preferido, el cicloalcano es ciclopentano. En otro aspecto más preferido, el cicloalcano es ciclohexano. En otro aspecto más preferido, el cicloalcano es cicloheptano. En otro aspecto más preferido, el cicloalcano es ciclooctano.
[0171] En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es un alqueno. El alqueno puede ser un alqueno no ramificado o ramificado. En otro aspecto más preferido, el alqueno es penteno. En otro aspecto más preferido, el alqueno es hexeno. En otro aspecto más preferido, el alqueno es hepteno. En otro aspecto más preferido, el alqueno es octeno.
[0172] En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es un aminoácido. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido aspártico. En otro aspecto más preferido, el aminoácido es ácido glutámico. En otro aspecto más preferido, el aminoácido es glicina. En otro aspecto más preferido, el aminoácido es lisina. En otro aspecto más preferido, el aminoácido es serina. En otro aspecto más preferido, el aminoácido es treonina. Véase, por ejemplo, Richard, A., y Margaritis, A., 2004, Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poly(glutamic acid) production and other microbial biopolymers, Biotechnology and Bioengineering 87 (4): 501-515.
[0173] En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es un gas. En otro aspecto más preferido, el gas es metano. En otro aspecto más preferido, el gas es H2. En otro aspecto más preferido, el gas es CO2. En otro aspecto más preferido, el gas es CO. Véase, por ejemplo, Kataoka, N., A. Miya, y K. Kiriyama, 1997, Studies on hydrogen production by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria, Water Science and Technology 36 (6-7): 41-47; y Gunaseelan V.N. in Biomass and Bioenergy, Vol. 13 (1-2), pp. 83-114, 1997, Anaerobic digestion of biomass for methane production: A review.
[0174] En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es isopreno.
[0175] En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es una cetona. Se entiende que el término "cetona" abarca una sustancia que contiene una o más fracciones de cetona. En otro aspecto más preferido, la cetona es acetona. Véase, por ejemplo, Qureshi y Blaschek, 2003, supra.
[0176] En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es un ácido orgánico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido acético. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido acetónico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido adípico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido ascórbico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido cítrico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido 2,5-diqueto-D-glucónico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido fórmico. En otro aspecto más
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preferido, el ácido orgánico es ácido fumárico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido glucárico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido glucónico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido glucurónico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido glutárico. En otro aspecto preferido, el ácido orgánico es ácido 3-hidroxipropiónico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido itacónico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido láctico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido málico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido malónico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido oxálico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido propiónico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido succínico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido xilónico. Véase, por ejemplo, Chen, R., y Lee, Y. Y., 1997, Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid production from cellulosic biomass, Appl. Biochem. Biotechnol. 63-65: 435-448.
[0177] En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es policétido.
[0178] Recuperación. El producto(s) de fermentación se puede recuperar opcionalmente del medio de fermentación utilizando cualquier método conocido en la técnica incluyendo, pero no limitado a, cromatografía, procedimientos electroforéticos, solubilidad diferencial, destilación o extracción. Por ejemplo, el alcohol se separa del material celulósico fermentado y purificado por métodos convencionales de destilación. Etanol con una pureza de hasta aproximadamente 96% de vol. se puede obtener, que se puede usar como, por ejemplo, etanol de combustible, etanol potable, es decir, licores neutros potables, o etanol industrial.
Composiciones enzimáticas
[0179] Las composiciones enzimáticas usadas en un método de la invención pueden comprender cualquier proteína que sea útil para degradar o convertir material celulósico. Las composiciones pueden comprender una enzima como componente enzimático principal, por ejemplo, una composición monocomponente, o enzimas múltiples. Las composiciones se pueden preparar conforme a métodos conocidos en la técnica y pueden ser en forma de líquido o una composición seca. Las composiciones se pueden estabilizar conforme a métodos conocidos en la técnica.
[0180] Las composiciones pueden ser una formulación de caldo de fermentación o una composición celular, como se describe en este caso. La composición puede ser un caldo entero de células matadas que contiene ácido(s) orgánico(s), detrito celular y/o células matadas y medio de cultivo.
[0181] El término "caldo de fermentación" como se utiliza en este caso se refiere a una preparación producida por fermentación celular que sufre ninguna o mínima recuperación y/o purificación. Por ejemplo, los caldos de fermentación se producen cuando cultivos microbianos se cultivan por saturación, incubados bajo condiciones de limitación de carbono para permitir la síntesis de proteína (por ejemplo, expresión de enzimas por células huésped) y secreción en el medio de cultivo celular. El caldo de fermentación puede contener contenidos no-fraccionados o fraccionados de los materiales de fermentación derivados al final de la fermentación. Típicamente, el caldo de fermentación no está fraccionado y comprende el medio de cultivo consumido y el detrito celular presente después de que las células microbianas (por ejemplo, células fúngicas filamentosas) se hayan retirado, por ejemplo, por centrifugado. El caldo de fermentación puede contener medio de cultivo celular consumido, enzimas extracelulares y células microbianas viables y/o no viables.
[0182] La formulación del caldo de fermentación y composiciones celulares pueden comprender un primer componente de ácido orgánico que comprenda al menos un ácido orgánico de 1-5 carbonos y/o un derivado de sal y un segundo componente de ácido orgánico que comprenda al menos un ácido orgánico de 6 o más carbonos y/o un derivado de sal. El primer componente de ácido orgánico puede ser ácido acético, ácido fórmico, ácido propiónico, un derivado de sal, o una mezcla de dos o más de los anteriormente mencionados y el segundo componente de ácido orgánico es ácido benzoico, ácido ciclohexanocarboxílico, ácido 4-metilvalérico, ácido fenilacético, un derivado de sal, o una mezcla de dos o más de los anteriormente mencionados.
[0183] En un aspecto, la composición contiene un ácido(s) orgánico(s), y opcionalmente además contiene células matadas y/o detrito celular. Las células matadas y/o detrito celular se retiran de un caldo completo de células matadas para proporcionar una composición que esté libre de estos componentes.
[0184] Las formulaciones de caldo de fermentación o las composiciones de células pueden comprender además un agente conservante y/o anti-microbiano (por ejemplo, bacteriostático), incluyendo, pero no limitado a, sorbitol, cloruro sódico, sorbato de potasio y otros conocidos en la técnica.
[0185] El caldo completo inactivado por célula o composición puede contener los contenidos no fraccionados de los materiales de fermentación derivados en final de la fermentación. Típicamente, el caldo completo inactivado por célula o composición contiene el medio de cultivo consumido y el detrito celular presente después de que las células microbianas (por ejemplo, células fúngicas filamentosas) hayan crecido por saturación, incubadas bajo condiciones de limitación de carbono para permitir la síntesis de proteína (por ejemplo, expresión de enzima(s) de celulasa y/o glucosidasa). El caldo completo inactivado por célula o composición puede contener el medio de cultivo celular consumido, enzimas extracelulares y células fúngicas filamentosas inactivadas. Las células microbianas presentes en el
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Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimefi, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia spededonium, Thielavia setosa, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma viride o Trichophaea saccata que tiene actividad enzimática.
[0203] Mutantes químicamente modificados o creados genéticamente de proteína de polipéptidos que tienen actividad enzimática también se pueden usar.
[0204] Uno o más (por ejemplo, varios) componentes de la composición enzimática pueden ser un componente recombinante, es decir, producido por clonación de una secuencia de ADN que codifica el componente único y la posterior célula transformada con la secuencia de ADN y expresada en un huésped (véase, por ejemplo, WO 91/17243 y WO 91/17244). El huésped es preferiblemente un huésped heterólogo (la enzima es foránea del huésped), pero el huésped puede, bajo ciertas condiciones, ser también un huésped homólogo (la enzima es nativa del huésped). Proteínas celulolíticas monocomponente también se pueden preparar por purificación de tal proteína a partir de un caldo de fermentación.
[0205] En un aspecto, una o más (por ejemplo, varias) enzimas celulolíticas comprenden una preparación enzimática celulolítica comercial. Ejemplos de preparaciones enzimáticas celulolíticas comerciales adecuadas para su uso en la presente invención incluyen, por ejemplo, CELLIC® CTec (Novozymes A/S), CELLIC® CTec2 (Novozymes A/S), CELLUCLAST™ (Novozymes A/S), NOVOZYM™ 188 (Novozymes A/S), CELLUZYME™ (Novozymes A/S), CEREFLO™ (Novozymes A/S), and ULTRAFLO™ (Novozymes A/S), ACCELERASE™ (Genencor Int.), LAMINEX™ (Genencor Int.), SPEZYME™ CP (Genencor Int.), FILTRASE® NL (DSM); METHAPLUS® S/L 100 (DSM), ROHAMENT™ 7069 W (Röhm GmbH), FIBREZYME® LDI (Dyadic International, Inc.), FIBREZYME® LBR (Dyadic International, Inc.) o VISCOSTAR® 150L (Dyadic International, Inc.). Las enzimas de celulasa se agregan en cantidades efectivas de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 5,0 % en peso de sólidos, por ejemplo, de aproximadamente 0,025 a aproximadamente 4,0 % en peso de sólidos o de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 2,0 % en peso de sólidos.
[0206] Ejemplos de endoglucanasas bacterianas que se pueden usar en los métodos de la presente invención, incluyen, pero de forma no limitativa, una endoglucanasa de Acidothermus cellulolyticus (WO 91/05039; WO 93/15186; patente de EE.UU. nº 5,275,944; WO 96/02551; patente de EE.UU. nº 5.536.655, WO 00/70031, WO 05/093050); endoglucanasa III de Thermobifida fusca (WO 05/093050); y endoglucanasa V de Thermobifida fusca (WO 05/093050).
[0207] Ejemplos de endoglucanasas fúngicas que se pueden usar en la presente invención incluyen, pero de forma no limitativa, una endoglucanasa I de Trichoderma reesei (Penttila et al., 1986, Gene 45: 253-263; endoglucanasa I de Trichoderma reesei Cel7B; número de registro del GENBANK™ M15665; SEC ID nº: 66); endoglucanasa II de Trichoderma reesei (Saloheimo, et al., 1988, Gene 63:11-22; endoglucanasa II de Trichoderma reesei Cel5A; número de registro del GENBANK™ M19373; SEC ID nº: 68); endoglucanasa III de Trichoderma reesei (Okada et al., 1988, Appl. Circundar. Microbiol. 64: 555-563; número de registro del GENBANK™ AB003694; SEC ID nº: 70); endoglucanasa V de Trichoderma reesei (Saloheimo et al., 1994, Molecular Microbiology 13: 219-228; número de registro del GENBANK™ Z33381; SEC ID nº: 72); endoglucanasa de Aspergillus aculeatus (Ooi et al., 1990, Nucleic Acids Research 18: 5884); endoglucanasa de Aspergillus kawachii (Sakamoto et al., 1995, Current Genetics 27: 435-439); endoglucanasa de Erwinia carotovara (Saarilahti et al., 1990, Gene 90: 9-14); endoglucanasa de Fusarium oxysporum (número de registro del GENBANK™ L29381); endoglucanasa de Humicola grisea var. thermoidea (número de registro del GENBANK™ AB003107); endoglucanasa de Melanocarpus albomyces (número de registro del GENBANK™ MAL515703); endoglucanasa de Neurospora crassa (número de registro del GENBANK™ XM 324477); endoglucanasa V de Humicola insolens (SEC ID nº: 74); endoglucanasa de Myceliophthora thermophila CBS 117.65 (SEC ID nº: 76); endoglucanasa de basidiomiceto CBS 495.95 (SEC ID nº: 78); endoglucanasa de basidiomiceto CBS 494.95 (SEC ID nº: 80); endoglucanasa de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL6B (SEC ID nº: 82); endoglucanasa de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL6C (SEC ID nº: endoglucanasa de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7C (SEC ID nº: 86); endoglucanasa de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7E (SEC ID nº: 88); endoglucanasa de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7F (SEC ID nº: 90); endoglucanasa de Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373 CEL7A (SEC ID nº: 92); y endoglucanasa de Trichoderma reesei cepa nº VTT-D-80133 (SEC ID nº: 94; número de registro del GENBANK™ M15665). Las endoglucanasas de SEC ID nº: 66, SEC ID nº: 68, SEC ID nº: 70, SEC ID nº: 72, SEC ID nº: 74, SEC ID nº: 76, SEC ID nº: 78, SEC ID nº: 80, SEC ID nº: 82, SEC ID nº: 84, SEC ID nº: 86, SEC ID nº: 88, SEC ID nº: 90, SEC ID nº: 92 y SEC ID nº: 94 anteriormente descritas se codifican por la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID nº: 65, SEC ID nº: 67, SEC ID nº: 69, SEC ID nº: 71, SEC ID nº: 73, SEC ID nº: 75, SEC ID nº: 77, SEC ID nº: 79, SEC ID nº: 81, SEC ID nº: 83, SEC ID nº: 85, SEC ID nº: 87, SEC ID nº: 89, SEC ID nº: 91 y SEC ID nº: 93, respectivamente.
[0208] Ejemplos de celobiohidrolasas útiles en la presente invención incluyen, pero de forma no limitativa, celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei (SEC ID nº: 96); celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei (SEC ID nº: 98);
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celobiohidrolasa I de Humicola insolens (SEC ID nº: 100); celobiohidrolasa II de Myceliophthora thermophila (SEC ID nº: 102 y SEC ID nº: 104); celobiohidrolasa II de Thielavia terrestris (CEL6A) (SEC ID nº: 106); celobiohidrolasa I de Chaetomium thermophilum (SEC ID nº: 108); celobiohidrolasa II de Chaetomium thermophilum (SEC ID nº: 110); celobiohidrolasa I de Aspergillus fumigatus (SEC ID nº: 112) y celobiohidrolasa II de Aspergillus fumigatus (SEC ID nº: 114).
[0209] Las celobiohidrolasas de SEC ID nº: 96, SEC ID nº: 98, SEC ID nº: 100, SEC ID nº: 102, SEC ID nº: 104, SEC ID nº: 106, SEC ID nº: 108, SEC ID nº: 110, SEC ID nº: 112, y SEC ID nº: 114 anteriormente descritas son codificadas por la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEC ID nº: 97, SEC ID nº: 99, SEC ID nº: 101, SEC ID nº: 103, SEC ID nº: 105, SEC ID nº: 107, SEC ID nº: 109, SEC ID nº: 111, y SEC ID nº: 113, respectivamente.
[0210] Ejemplos de beta-glucosidasas útiles en la presente invención incluyen, pero de forma no limitativa, betaglucosidasa de Aspergillus oryzae (SEC ID nº: 116); beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (SEC ID nº: 118); betaglucosidasa de Penicillium brasilianum IBT 20888 (SEC ID nº: 120); beta-glucosidasa de Aspergillus niger (SEC ID nº: 122); y beta-glucosidasa de Aspergillus aculeatus (SEC ID nº: 124). Las beta-glucosidasas de SEC ID nº: 116, SEC ID nº: 118, SEC ID nº: 120, SEC ID nº: 122 y SEC ID nº: 124 anteriormente descritas son codificadas por la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEC ID nº: 115, SEC ID nº: 117 y SEC ID nº: 119, SEC ID nº: 121 y SEC ID nº: 123, respectivamente.
[0211] Ejemplos de otras beta-glucosidasas útiles en la presente invención incluyen una proteína de fusión de variante de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae de SEC ID nº: 126 o la proteína de fusión de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae de SEC ID nº: 128. Las proteínas de fusión de beta-glucosidasa de SEC ID nº: 126 y SEC ID nº: 128 son codificadas por SEC ID nº: 125 y SEC ID nº: 127, respectivamente.
[0212] La beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae se puede obtener según la WO 2002/095014. La beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus se puede obtener según la WO 2005/047499. La beta-glucosidasa de Penicillium brasilianum se puede obtener según la WO 2007/019442. La beta-glucosidasa de Aspergillus niger se puede obtener según Dan et al., 2000, J. Biol. Chem. 275: 4973-4980. La beta-glucosidasa de Aspergillus aculeatus se puede obtener según Kawaguchi et al., 1996, Gene 173: 287-288.
[0213] Otras endoglucanasas útiles, celobiohidrolasas y beta-glucosidasas se describen en numerosas familias de glicosil hidrolasa utilizando la clasificación según Henrissat B., 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309-316, y Henrissat B., and Bairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696.
[0214] Otras enzimas celulolíticas que se pueden usar en la presente invención se describen en la WO 98/13465, WO 98/015619, WO 98/015633, WO 99/06574, WO 99/10481, WO 99/025847, WO 99/031255, WO 2002/101078, WO 2003/027306, WO 2003/052054, WO 2003/052055, WO 2003/052056, WO 2003/052057, WO 2003/052118, WO 2004/016760, WO 2004/043980, WO 2004/048592, WO 2005/001065, WO 2005/028636, WO 2005/093050, WO 2005/093073, WO 2006/074005, WO 2006/117432, WO 2007/071818, WO 2007/071820, WO 2008/008070, WO 2008/008793, patente de EE.UU. nº 5.457.046, patente de EE.UU. nº 5.648.263 y patente de EE.UU. nº 5.686.593.
[0215] En un aspecto, una o más (por ejemplo, varias) enzimas hemicelulolíticas comprenden una preparación enzimática hemicelulolítica comercial. Ejemplos de preparaciones enzimáticas hemicelulolíticas comerciales adecuadas para su uso en la presente invención incluyen, por ejemplo, SHEARZYME™ (Novozymes A/S), CELLIC® HTec (Novozymes A/S), CELLIC® HTec2 (Novozymes A/S), VISCOZYME® (Novozymes A/S), ULTRAFLO® (Novozymes A/S), PULPZYME® HC (Novozymes A/S), MULTIFECT® Xylanase (Genencor), ACCELLERASE®XY (Genencor), ACCELLERASE® XC (Genencor), ECOPULP® TX-200A (AB Enzymes), HSP 6000 Xylanase (DSM), DEPOL™ 333P (Biocatalysts Limit, Wales, UK), DEPOL™ 740L. (Biocatalysts Limit, Wales, UK) y DEPOL™ 762P (Biocatalysts Limit, Wales, UK).
[0216] Ejemplos de xilanasas útiles en los métodos de la presente invención incluyen, pero de forma no limitativa, xilanasa de Aspergillus aculeatus (GeneSeqP:AAR63790; WO 94/21785); xilanasas de Aspergillus fumigatus (WO 2006/078256; xyl 3 SEC ID nº: 129 [secuencia de ADN] y SEC ID nº: 130 [secuencia de aminoácido deducido]); Penicillium pinophilum (WO 2011/041405); Penicillium sp. (WO 2010/126772); Thielavia terrestris NRRL 8126 (WO 2009/079210); y Trichophaea saccata GH10 (WO 2011/057083).
[0217] Ejemplos de beta-xilosidasas útiles en los métodos de la presente invención incluyen, pero de forma no limitativa, beta-xilosidasa de Trichoderma reesei (UniProtKB/TrEMBL número de registro Q92458; SEC ID nº: 131 [secuencia de ADN] y SEC ID nº: 132 [ secuencia deamino ácido deducido]) Talaromyces emersonii (número de registro de SwissProt Q8X212); y Neurospora crassa (número de registro de SwissProt Q7SOW4).
[0218] Ejemplos de acetilxilano esterasas útiles en los métodos de la presente invención incluyen, pero de forma no limitativa, acetilxilano esterasas de Aspergillus aculeatus (WO 2010/108918); Chaetomium globosum (número de registro de Uniprot Q2GWX4); Chaetomium gracile (número de registro de GeneSeqP AAB82124); Humicola insolens DSM 1800 (WO 2009/073709); Hypocrea jecorina (WO 2005/001036); Myceliophthora thermophila (WO 2010/014880);
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Neurospora crassa (número de registro de UniProt q7s259); Phaeosphaeria nodorum (número de registro de Uniprot QOUHJ1); y Thielavia terrestris NRRL 8126 (WO 2009/042846).
[0219] Ejemplos de feruloilo esterasas (esterasas de ácido ferúlico) útiles en los métodos de la presente invención incluyen, pero de forma no limitativa, feruloilo esterasas de Humicola insolens DSM 1800 (WO 2009/076122); Neosartorya fischeri (número de registro de UniProt A1D9T4); Neurospora crassa (número de registro de UniProt Q9HGR3); Penicillium aurantiogriseum (WO 2009/127729); y Tielavia terrestris (WO 2010/053838 y WO 2010/065448).
[0220] Ejemplos de arabinofuranosidasas útiles en los métodos de la presente invención incluyen, pero de forma no limitativa, arabinofuranosidasas de Aspergillus niger (número de registro de GeneSeqP AAR94170); Humicola insolens DSM 1800 (WO 2006/114094 y WO 2009/073383); y M. giganteus (WO 2006/114094).
[0221] Ejemplos de alfa-glucuronidasas útiles en los métodos de la presente invención incluyen, pero de forma no limitativa, alfa-glucuronidasas de Aspergillus clavatus (número de registro de UniProt alcc12); Aspergillus fumigatus (número de registro de SwissProt Q4WW45); Aspergillus niger (número de registro de Uniprot Q96WX9); Aspergillus terreus (número de registro de SwissProt QOCJP9); Humicola insolens (WO 2010/014706); Penicillium aurantiogriseum (WO 2009/068565); Talaromyces emersonii (número de registro de UniProt Q8X211); y Trichoderma reesei (número de registro de UniProt Q99024).
[0222] Los polipéptidos que tienen actividad enzimática usados en los métodos de la presente invención se pueden producir por fermentación de las cepas microbianas mencionadas anteriormente en un medio nutritivo que contiene fuentes de nitrógeno y carbono adecuadas y sales inorgánicas, utilizando procedimientos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Bennett, J.W. y LaSure, L. (eds.), More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991). Medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o se pueden preparar según composiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de la American Type Culture Collection). Rangos de temperatura y otras condiciones adecuadas para el crecimiento y la producción enzimática se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Bailey, J.E., y Ollis, D.F., Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill Book Company, NY, 1986).
[0223] La fermentación puede ser cualquier método de cultivo de una célula que de como resultado la expresión o el aislamiento de una enzima o proteína. La fermentación se puede entender, por lo tanto, como que comprende el cultivo en matraz de agitación, o fermentación a pequeña o gran escala (incluyendo, fermentaciones de lote continuo, lote alimentado o estado sólido) fermentadores en laboratorio o industriales realizadas en un medio adecuado y bajo condiciones que permitan a la enzima ser expresada o aislada. Las enzimas resultantes producidas por los métodos anteriormente descritos se pueden recuperar del medio de fermentación y purificar por procedimientos convencionales.
Constructos de ácidos nucleicos
[0224] Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido, por ejemplo, un polipéptido GH61 que tiene actividad de aumento celulolítico, una enzima celulolítica, una enzima hemicelulolítica, etc., se pueden manipular en una variedad de formas para proporcionar expresión del polipéptido por construcción de un constructo de ácidos nucleicos que incluyen un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido operativamente enlazado a una o más (por ejemplo, varias) secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula huésped adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. La manipulación de la secuencia del polinucleótido antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar secuencias polinucleótidas utilizando métodos de ADN recombinante se conocen bien en la técnica.
[0225] La secuencia de control puede ser un promotor, un polinucleótido que es reconocido por una célula huésped para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido. El promotor contiene secuencias de control transcripcionales que median la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier polinucleótido que muestre actividad transcripcional en la célula huésped incluyendo promotores mutantes, truncados e híbridos, y se pueden obtener a partir de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares bien homólogos o heterólogos de la célula huésped.
[0226] Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos en una célula huésped bacteriana son los promotores obtenidos a partir del gen de alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), gen de alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL), gen de penicilinasa de Bacillus licheniformis (penP), gen de amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus (amyM), gen de levansucrasa de Bacillus subtilis (sacB), genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, gen criIIIA de Bacillus thuringiensis (Agaisse y Lereclus, 1994, Molecular Microbiology
13: 97-107), operón lac de E. coli, promotor trc de E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), gen de agarasa de Streptomyces coelicolor (dagA) y el gen de beta-lactamasa procariótica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), al igual que el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Otros promotores se describen en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; y en Sambrooket al., 1989, supra. Ejemplos de promotores en serie se describen en la WO 99/43835.
[0227] Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos en una célula huésped fúngica filamentosa son promotores obtenidos a partir de los genes para acetamidasa de Aspergillus
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permitir la inserción o sustitución de un polinucleótido que codifica un polipéptido, por ejemplo, un polipéptido GH61 que tiene actividad de aumento celulolítico, una enzima celulolítica, una enzima hemicelulolítica, etc., en tales sitios. Alternativamente, el polinucleótido se puede expresar por inserción del polinucleótido o un constructo de ácidos nucleicos que comprenda la secuencia en un vector apropiado para la expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia codificante se localiza en el vector de modo que la secuencia codificante esté operativamente enlazada con las secuencias de control apropiadas para la expresión.
[0249] El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que puede ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinante y puede provocar la expresión del polinucleótido. La elección del vector típicamente dependerá de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la que el vector debe ser introducido. El vector puede ser un plásmido lineal o cerrado circular.
[0250] El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que exista como una entidad extracromosómica, cuya replicación sea independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma, o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduzca en la célula huésped, se integre en el genoma y replique con el cromosoma(s) en el que se ha integrado. Además, un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contengan el ADN total que se va a introducir en el genoma de la célula huésped, o un transposón, puede ser utilizado.
[0251] El vector contiene preferiblemente uno o más (por ejemplo, varios) marcadores seleccionables que permiten la selección fácil de células transformadas, modificadas, transducidas o similares. Una etiqueta seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia biocida o vírica, resistencia a los metales pesados, prototrofia para los auxótrofos y similares.
[0252] Ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos son los genes dal de Bacillus licheniformis o Bacillus subtilis, o marcadores que confieren resistencia antibiótica tales como resistencia a la ampicilina, cloranfenicol, canamicina, neomicina, espectinomicina o a la tetraciclina. Marcadores adecuados para células huésped de levadura incluyen, pero de forma no limitativa, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 y URA3. Marcadores seleccionables para su uso en una célula huésped fúngica filamentosa incluyen, pero de forma no limitativa, adeA (fosforibosilaminoimidazola-succinocarboxamida sintasa), adeB (fosforibosil-aminoimidazola sintasa), amdS (acetamidasa), argB (ornitina-carbamoiltransferasa), bar (fosfonitricina acetiltransferasa), hph (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato-reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa) y trpC (antranilato sintasa), al igual que equivalentes de los mismos. Se prefieren para su uso en una célula de Aspergillus los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y un gen bar de Streptomyces hygroscopicus. Se prefiere para su uso en una célula de Trichoderma los genes adeA, adeB, amdS, hph y pirG.
[0253] El marcador seleccionable puede ser un sistema de marcador seleccionable doble como se describe en la WO 2010/039889. En un aspecto, el marcador seleccionable doble es un sistema de marcador seleccionable dual hph-tk.
[0254] El vector contiene preferiblemente un(os) elemento(s) que permite(n) la integración del vector en el genoma de la célula huésped o replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma.
[0255] Para la integración en el genoma de la célula huésped, el vector puede depender de la secuencia del polinucleótido que codifica el polipéptido o cualquier otro elemento del vector para integración en el genoma por recombinación homóloga o no homóloga. Alternativamente, el vector puede contener polinucleótidos adicionales para dirigir la integración por recombinación homóloga en el genoma de la célula huésped en una ubicación(es) precisa del cromosoma(a). Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos integracionales deberían contener un número suficiente de ácidos nucleicos, tal como de 100 a 10.000 pares de bases, de 400 a 10.000 pares de bases y de 800 a 10.000 pares de bases, que tienen un alto grado de identidad de secuencia con la secuencia objetivo correspondiente para mejorar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga de la secuencia objetivo en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos integracionales pueden ser polinucleótidos no codificantes o codificantes. Por otro lado, el vector se puede integrar en el genoma de la célula huésped por recombinación no homóloga.
[0256] Para replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permita al vector replicar de manera autónoma en la célula huésped en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador plásmido que medie la replicación autónoma que funcione en una célula. El término "origen de replicación" o "replicador plásmido" se refiere a un polinucleótido que permite que un plásmido o vector replique in vivo.
[0257] Ejemplos de orígenes bacterianos de replicación son los orígenes de replicación de los plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177 y pACYC184 que permiten la replicación en E. coli, y pUB110, pE194, pTA1060 y pAMß1 que permiten la replicación en Bacillus.
[0258] Ejemplos de orígenes de replicación para su uso en una célula huésped de levadura son el origen de replicación de 2 micras, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3, y la combinación de ARS4 y CEN6.
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[0259] Ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula fúngica filamentosa son AMA1 y ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175 WO 00/24883). El aislamiento del gen AMA1 y la construcción de plásmidos o vectores que comprenden el gen se puede realizar según los métodos descritos en la WO 00/24883.
[0260] Más de una copia de un polinucleótido se puede insertar en una célula huésped para aumentar la producción de un polipéptido. Un aumento en el número de copias del polinucleótido se puede obtener integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o incluyendo un gen marcador seleccionable amplificable con el polinucleótido donde las células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable y por lo tanto copias adicionales del polinucleótido, se pueden seleccionar por cultivo de las células en presencia del agente seleccionable apropiado.
[0261] Los procedimientos usados para enlazar los elementos anteriormente descritos para construir los vectores de expresión recombinantes son conocidos por un experto en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook et al..1989, supra).
Células huésped
[0262] Células huésped recombinantes que comprenden un polinucleótido que codifica un polipéptido, por ejemplo, un polipéptido GH61 que tiene actividad de aumento celulolítico, una enzima celulolítica, una enzima hemicelulolítica, etc., se pueden usar ventajosamente en la producción recombinante del polipéptido. Un constructo o vector que comprende tal polinucleótido se introduce en una célula huésped de modo que el se mantenga como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico autorreplicante como se ha descrito anteriormente. El término "célula huésped" abarca cualquier descendiente de una célula madre que no se idéntico a la célula madre debido a mutaciones que se produzcan durante la replicación. La elección de una célula huésped dependerá en gran parte dependen del gen que codifica el polipéptido y su fuente.
[0263] La célula huésped puede ser cualquier célula útil en la producción recombinante de un polipéptido, por ejemplo, una procariota o una eucariota.
[0264] La célula huésped procariótica puede ser cualquier bacteria gram-positiva o gram-negativa. Bacterias grampositivas incluyen, pero de forma no limitativa, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, GeoBacillus, LactoBacillus, Lactococcus, OceanoBacillus, Staphylococcus, Streptococcus y Streptomyces. Bacterias gram-negativas incluyen, pero de forma no limitativa, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella y Ureaplasma.
[0265] La célula huésped bacteriana puede ser cualquier célula de Bacillus incluyendo, pero no limitado a, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis y Bacillus thuringiensis.
[0266] La célula huésped bacteriana también puede ser cualquier célula de Streptococcus incluyendo, pero no limitado a, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis y Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.
[0267] La célula huésped bacteriana también puede ser cualquier célula de Streptomyces incluyendo, pero no limitado a, células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus y Streptomyces lividans.
[0268] La introducción de ADN en una célula de Bacillus se puede efectuar por transformación de protoplasto (véase, por ejemplo, Chang y Cohen, 1979, Mol. Gen. Ganet. 168: 111-115), transformación de la célula competente (véase, por ejemplo, Young y Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829 o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209221), electroporación (véase, por ejemplo,Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751) o conjugación (véase, por ejemplo, Koehler y Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). La introducción de ADN en una célula de E. coli se puede efectuar por transformación de protoplasto (véase, por ejemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) o electroporación (véase, por ejemplo, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). La introducción de ADN en una célula de Streptomyces se puede efectuar por transformación de protoplasto, electroporación (véase, por ejemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), conjugación (véase, por ejemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585) o transducción (véase, por ejemplo, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 62896294). La introducción de ADN en una célula de Pseudomonas se puede efectuar por electroporación (véase, por ejemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) o conjugación (véase, por ejemplo, Pinedo y Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). La introducción de ADN en una célula de Streptococcus se puede efectuar por competencia natural (véase, por ejemplo, Perry y Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), transformación de protoplasto (véase, por ejemplo, Catt y Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), electroporación (véase, por ejemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) o conjugación (véase, por ejemplo, Clewell, 1981,
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Microbiol. Rev. 45: 409-436). No obstante, cualquier método conocido en la técnica para introducción de ADN en una célula huésped se puede utilizar.
[0269] La célula huésped también puede ser una célula eucariota, tal como una célula de mamífero, insecto, planta u fúngica.
[0270] La célula huésped puede ser una célula fúngica. "Hongo", como se utiliza en este caso, incluye el filo Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota y Zygomycota al igual que el Oomycota y todos los hongos mitospóricos (como se define por Hawkswort et al., en Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK).
[0271] La célula huésped fúngica puede ser una célula de levadura. "Levadura", como se utiliza en este caso incluye levadura ascoesporógena (Endomycetales), levadura basidioesporogénea y levadura de los Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Dado que la clasificación de levadura puede cambiar en el futuro, para los fines de esta invención, la levadura se debe definir como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore, and Davenport, editors, Soc. App. Bacterial Symposium Series No. 9, 1980.
[0272] La célula huésped de levadura puede ser una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, SchizoSaccharomyces o Yarrowia, tal como una célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis o Yarrowia lipolytica.
[0273] La célula huésped fúngica puede ser una célula fúngica filamentosa. "Hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (como se define por Hawkswort et al., 1995, supra). Los hongos filamentosos se caracterizan generalmente por una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por alargamiento hifal y el catabolismo de carbono es estrictamente aeróbico. En cambio, el crecimiento vegetativo por levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae es por injerto de un talo unicelular y el catabolismo de carbono puede ser fermentativo.
[0274] La célula huésped fúngica filamentosa puede ser una célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes o Trichoderma.
[0275] Por ejemplo, la célula huésped fúngica filamentosa puede ser una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride.
[0276] Las células fúngicas se pueden transformar por un proceso que implica la formación de protoplasto, la transformación de los protoplastos y la regeneración de la pared celular de modo conocido de por sí. Procedimientos adecuados para la transformación de células huésped de Aspergillus y Trichoderma son descritas en la EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474, y Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Métodos adecuados para transformar especies de Fusarium son descritas por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 y la WO 96/00787. La levadura se puede transformar utilizando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abelson, J.N. y Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; y Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920.
Métodos de producción
[0277] Métodos para producir un polipéptido, por ejemplo, un polipéptido GH61 que tiene actividad de aumento celulolítico, una enzima celulolítica, una enzima hemicelulolítica, etc., comprenden (a) cultivo de una célula, que en su forma de tipo salvaje es capaz de producir el polipéptido, bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y
(b) recuperación del polipéptido. En un aspecto preferido, la célula es del género Aspergillus. En un aspecto más preferido, la célula es Aspergillus fumigatus.
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