ES2533002T3 - Receptores estrogénicos y métodos de uso - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo aislado que se une específicamente a una secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID Nº: 1, o a un fragmento inmunogénico de la SEC ID Nº: 1 que comprende al menos siete aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº: 1.
Description
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opcionalmente, purificado. Un polipéptido o polinucleótido “aislado” es uno que está separado y es distinto de su entorno natural. Un polipéptido o polinucleótido “purificado” es uno que está al menos un 60 % liberado, preferentemente un 75 % liberado, y más preferentemente un 90 % liberado de otros componentes con los que normalmente está asociado. Los polipéptidos y nucleótidos que se producen fuera del organismo en el que se producen de manera natural, por ejemplo, a través de medios químicos o recombinantes, se considera que están aislados y purificados por definición, ya que nunca se presentan en un entorno natural. Un “polipéptido exógeno” se refiere a un polipéptido extraño, es decir, un polipéptido que no está normalmente presente en una célula, o un polipéptido que está normalmente presente en una célula pero que se ha introducido en la célula mediante un procedimiento experimental, por ejemplo, por introducción de un polinucleótido que codifica el polipéptido.
Los polipéptidos que se desvelan en el presente documento pueden ser biológicamente activos. En el presente documento dicha actividad biológica se denomina “actividad RE-α36”. Un ejemplo de un bioensayo que puede usarse para determinar si un polinucleótido de la invención es biológicamente activo, implica poner en contacto una célula que exprese este polipéptido con un estrógeno o con un antiestrógeno y determinar si las actividades de la ruta MAPK aumentan o disminuyen en presencia del estrógeno o antiestrógeno, cuando se comparan con las actividades MAPK en una célula control que no expresa el polipéptido de la invención. Preferentemente, las actividades MAPK son, la fosforilación de ERK 1/2 y de Mek 1/2, y preferentemente la fosforilación de ERK 1/2 inducida por un polipéptido de la presente invención no está disminuida en presencia de un antiestrógeno. Preferentemente, la actividad del RE-α36 se inicia en la membrana. La actividad del RE-α36 puede medirse exponiendo una célula que exprese un polipéptido que pueda tener actividad RE-α36 con diferentes ligandos. Como ejemplos de ligandos que pueden usarse se incluyen, sin limitación, estrona (E1), 17α-estradiol (E2α), 17β -estradiol (E2β), estriol (E3), estetrol (E4) o un estrógeno unido a una molécula impermeable a membrana, por ejemplo, albúmina de suero bovino (BSA). Generalmente, cuando la actividad del RE-α36 a medir va a limitarse a la actividad del RE-α36 iniciada en membrana, se usa un estrógeno unido a una molécula impermeable a membrana. La cantidad de estrógeno que se usa puede variar, y está preferentemente en el intervalo de entre 1 nM y 10 nM. La célula expuesta al estrógeno es preferentemente una célula quiescente. Se permite que la exposición se produzca durante entre 5 y 90 minutos y después, la célula se somete a lisis, y los polipéptidos presentes en la célula se resuelven por electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. Después de transferir los polipéptidos resueltos a una membrana, se usan anticuerpos contra las formas no fosforiladas y fosforiladas de ERK 1/2 y Mek 1/2 para evaluar la activación de la ruta MAPK. Opcionalmente, puede incluirse un antiestrógeno, tal como Tamoxifeno, 4OH-Tamoxifeno o ICI-182.780, para determinar si la fosforilación de ERK 1/2 es insensible a antiestrógenos.
En el presente documento se desvela un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID Nº: 20. Este polipéptido, y polipéptidos relacionados, como se describe en el presente documento, también se denominan en el presente documento RE-α36, isoforma RE-α36, y subunidad α36 del receptor RE. Como se muestra en la Figura 1, la isoforma RE-α36 carece de restos de aminoácidos amino terminales 1-183, restos de aminoácidos carboxilo terminales 430-595 y tiene una adición de 27 restos de aminoácidos en su extremo C cuando se compara con la isoforma RE-α66 (véase la Tabla 1). Los isómeros del receptor estrogénico alfa incluyen RE-α36, RE-α46, RE-α66. Los isómeros del receptor estrogénico beta incluyen RE-β. También se desvelan receptores estrogénicos que incluyen una isoforma RE-α36. Sin pretender ser limitante, la isoforma RE-α36 se piensa que modula la respuesta de una célula a estrógenos a través de la regulación de la función de los receptores estrogénicos formando un dímero con el RE-α66, con el RE-α46 o con el RE-β. Además, se piensa que el RE-α36 carece de actividad del factor de activación 1 (AF-1) y del factor de activación 2 (AF-2), y por tanto carece de la actividad de transcripción intrínseca. Sin embargo, se piensa que el RE-α36 conserva un dominio de dimerización intacto que permite que el RE-α36 forme dímeros con el RE-α46, con el RE-α66 o con el RE-β. Se piensa que esta interacción permite que el RE-α36 module la actividad del RE-α46, del RE-α66 y del RE-β que contienen receptores estrogénicos.
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Tabla 1
- Secuencias de aminoácidos y de nucleótidos
- SEC ID Nº y Descripción
- Secuencias de aminoácidos y de nucleótidos
- SEC ID Nº: 18, RE-α66, Números de Acceso M12674, AAA52399
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- SEC ID Nº: 19, RE-α66,
- Números de Acceso
- M12674,
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Los polipéptidos desvelados incluyen polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 % idéntica a la SEC ID Nº: 20. Dichos polipéptidos incluyen los que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos una sola unidad de porcentaje mayor del 70 % idéntica a la SEC ID Nº: 20, por ejemplo, una identidad del 71 %, 72 %, 73 %, y así sucesivamente hasta una identidad del 100 % con la SEC ID Nº: 20. Preferentemente, los polipéptidos incluyen los que tienen una secuencia de aminoácidos que es, en orden creciente de preferencia, al menos aproximadamente 80 % idéntica, al menos aproximadamente 90 % idéntica, o al menos aproximadamente 95 % idéntica a la SEC ID Nº: 20. Preferentemente el polipéptido es biológicamente activo. Preferentemente el polipéptido tiene un peso molecular de 36 kDa, medido después de electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecil sulfato sódico (SDS). Normalmente, los restos implicados en la fosforilación del RE-α66, por ejemplo, S236, K302 y K303 se conservan, y son aquellos restos que están implicados en la función del dominio de unión a ADN, dominio de unión a ligando y dominios de dimerización del RE-α66. En la técnica se conocen restos que funcionan en la unión a ADN, unión a ligando y/o dimerización.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias polipeptídicas se determina generalmente alineando los restos de las dos secuencias de aminoácidos para optimizar el número de aminoácidos idénticos a lo largo de sus secuencias; se permiten huecos en cualquiera o en ambas secuencias al realizar el alineamiento para optimizar el número de aminoácidos idénticos, aunque en cada secuencia los aminoácidos deben, no obstante, permanecer en su debido orden. Preferentemente, se comparan dos secuencias de aminoácidos usando el programa Blastp, versión 2.0.9 del algoritmo de búsqueda BLAST 2, como describen Tatusova et al. (FEMS Microbiol. Lett., 174,247-250 (1999)) y se encuentra disponible en la página web http://www.nc-bi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html. Preferentemente, para todos los parámetros de búsqueda de BLAST 2, se usan los valores por defecto, que incluyen, matriz = BLOSUM62; penalización por apertura de hueco = 11, penalización por extensión de hueco = 1, caída de alineación de hueco = 50, esperanza = 10, tamaño de palabra = 3 y opcionalmente, filtrar. En la comparación de dos secuencias de aminoácidos usando el algoritmo de búsqueda BLAST, una similitud estructural se denomina “identidad”.
La invención también proporciona polipéptidos que son fragmentos de la isoforma del receptor estrogénico RE-α36 como se reivindica en las Reivindicaciones 37 a 38. Dichos fragmentos son útiles para preparar anticuerpos que se unen específicamente a la isoforma del receptor estrogénico RE-α36. Los ejemplos de fragmentos que son útiles para suscitar anticuerpos incluyen una isoforma del receptor estrogénico que se ha truncado, bien en el extremo N, o en el extremo C, o en ambos, mediante uno o más aminoácidos, siempre que el fragmento contenga al menos 7 aminoácidos contiguos, incluso más preferentemente al menos 10 aminoácidos contiguos, y más preferentemente al menos 12 aminoácidos contiguos.
La divulgación proporciona polipéptidos de fusión que tienen un polipéptido transportador acoplado un polipéptido como se desvela en el presente documento. Un polipéptido transportador puede usarse para aumentar o disminuir la solubilidad de un polipéptido de fusión. El polipéptido transportador también puede usarse para aumentar la inmunogenicidad del polipéptido de fusión para aumentar la producción de anticuerpos que se unen a un polipéptido de la invención. Por ejemplo, un polipéptido transportador puede fusionarse con un fragmento de un polipéptido como se desvela en el presente documento para facilitar la producción de anticuerpos que se unen específicamente al RE-α36. Un ejemplo de dicho fragmento es un polipéptido que tiene los aminoácidos 13-27 de la SEC ID Nº: 1. La divulgación no está limitada por los tipos de polipéptidos transportadores usados para crear polipéptidos de fusión.
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especificidad alterada y propiedades farmacológicas mejoradas, tales como semivida, absorción, fuerza y eficacia.
La sustitución de uno o más aminoácidos dentro de un polipéptido o un peptidomimético con un D aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) puede usarse para generar polipéptidos y peptidomiméticos que sean, por ejemplo, más estables y más resistentes a proteasas endógenas.
Los polipéptidos y peptidomiméticos de la invención y como se describe en el presente documento pueden modificarse para su uso in vivo por la adición, en el extremo amino y/o extremo carboxilo, de un agente bloqueante para disminuir la degradación in vivo. Esto puede ser útil en aquellas situaciones en las que el extremo del polipéptido tiende a degradarse por proteasas in vivo. Dichos agentes bloqueantes pueden incluir, sin limitación, secuencias peptídicas adicionales relacionadas o no relacionadas que pueden unirse a los restos terminales amino y/o carboxilo del polipéptido o peptidimimético de la invención y como se describe en el presente documento. Esto puede realizarse durante la síntesis química, o mediante tecnología de ADN recombinante por métodos conocidos para los expertos habituales en la técnica. Como alternativa, los agentes bloqueantes, tales como ácido piroglutámico, u otras moléculas conocidas en la técnica, pueden unirse a los restos terminales amino y/o carboxilo,
o el grupo amino en el extremo amino o grupo carboxilo en el extremo carboxilo puede reemplazarse por un grupo funcional diferente. Por consiguiente, la invención proporciona polipéptidos y peptidomiméticos que están bloqueados en el extremo amino, el extremo carboxilo o la combinación de los mismos.
Los polipéptidos de la invención y como se desvela en el presente documento pueden producirse a una gran o pequeña escala a través del uso de numerosos sistemas de expresión que incluyen, pero sin limitación, células o microorganismos que se transforman con un vector recombinante en el que se ha insertado un polipéptido como se desvela en el presente documento. El uso de dichos vectores y métodos recombinantes se describen más adelante. Estos vectores pueden usarse para transformar diversos organismos. Como ejemplos de dichos organismos se incluyen bacterias (por ejemplo, E. coli o B. subtilis); levaduras (por ejemplo Saccharomyces y Pichia); células de insectos (por ejemplo, baculovirus); de plantas; o de mamífero (por ejemplo, células COS, CHO, BHK, 293, VERO, HeLa, MDCK, W138 y NIH 3T3). También son útiles, como células hospedadoras, las células primarias o secundarias obtenidas directamente de un mamífero que se ha transfectado con un vector.
También pueden usarse métodos sintéticos para producir polipéptidos y peptidomiméticos de la invención y como se desvela en el presente documento. Dichos métodos son conocidos y rutinarios en la técnica. Por ejemplo, el método de síntesis peptídica en fase sólida es un método establecido y muy usado. Los polipéptidos pueden purificarse fácilmente por fraccionamiento sobre columnas de inmunoafinidad o de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía en sílice o en resina de intercambio aniónico tal como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75; cromatografía de afinidad por ligando y similares. Los polipéptidos también pueden purificarse fácilmente a través de la unión de un polipéptido de fusión con medios de separación, seguido de escisión el polipéptido de fusión para liberar un polipéptido purificado. Por ejemplo, puede crearse un polipéptido de fusión que incluya un sito de escisión del factor Xa entre el polipéptido y el polipéptido transportador. El polipéptido de fusión puede estar unido a una columna de afinidad a la cual se une la parte del polipéptido transportador del polipéptido de fusión. El polipéptido de fusión puede después escindirse con factor Xa para liberar el polipéptido. Dicho sistema se ha usado junto con un kit de eliminación del factor Xa para la purificación de los polipéptidos como se desvela en el presente documento.
Polinucleótidos
También se desvelan polinucleótidos que codifican los polipéptidos como los desvelados en el presente documento. El término “polinucleótido” se refiere en general a un polímero de dos o más nucleótidos unidos covalentemente en una orientación de 5’ a 3’. Un polinucleótido puede incluir secuencias de nucleótidos que tienen diferentes funciones, incluyendo, por ejemplo, secuencias codificantes, y secuencias no codificantes tales como secuencias reguladoras. Más adelante se define lo que es una secuencia codificante, una secuencia no codificantes y una secuencia reguladora. Las expresiones ácido nucleico, molécula de ácido nucleico y oligonucleótido y proteína, incluidas en la definición de polinucleótido y estos términos, se usan indistintamente. Debe entenderse que estas expresiones no significan una longitud específica de un polímero de nucleótidos, ni tampoco pretenden implicar o diferenciar si el polinucleótido se produce usando técnicas recombinantes, síntesis química o enzimática, o si es de origen natural.
Los polinucleótidos pueden ser bicatenarios o monocatenarios, y la secuencia de la segunda cadena, complementaria, la dictamina la secuencia de la primera cadena. El término “polinucleótido” se interpreta por lo tanto en general como que abarca un polímero de ácido nucleico monocatenario, su complemento, y el dúplex formado por el mismo. La “complementariedad” de polinucleótidos se refiere a la capacidad de dos polinucleótidos monocatenarios para emparejar sus bases entre sí, emparejándose una adenina de un polinucleótido con una timidina (o uracilo, en el caso de ARN) del otro, y emparejándose una citidina de un polinucleótido con una guanina del otro. Dos polinucleótidos son complementarios entre sí cuando una secuencia de nucleótidos en un polinucleótido puede emparejarse con una secuencia de nucleótidos en un segundo nucleótido. Por ejemplo, 5’-ATGC y 5’-GCAT son completamente complementarias, como los son 5’-GCTA y 5’-TAGC.
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Para la administración por inhalación, una composición puede administrarse convenientemente desde un envase insuflador, nebulizador o presurizado u desde otro medio de administración conveniente de un pulverizador en aerosol. Los envases presurizados pueden incluir un propulsor adecuado, tal como diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluorometano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida.
Como alternativa, para la administración por inhalación o insuflación, una composición puede tener forma de una composición en polvo seco, por ejemplo, una mezcla de polvo de un modulador y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón. La composición en polvo puede presentarse en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en cápsulas o cartuchos o, por ejemplo, en envases de gelatina o blíster, dese los que puede administrarse el polvo usando un inhalador o insuflador. Para la administración intranasal, una composición puede administrarse mediante un pulverizador líquido, tal como mediante un atomizador en un frasco de plástico.
Una composición puede formularse para administración transdérmica. Una composición también puede formularse como una solución, suspensión o dispersión acuosa, un gel acuoso, una emulsión de agua en aceite, o una emulsión de aceite en agua. Una formulación transdérmica también puede prepararse por encapsulación de una composición dentro de un polímero. La forma de dosificación puede aplicarse directamente a la piel como una loción, crema, bálsamo, o a través del uso de un parche.
Las composiciones de la invención también pueden contener otros ingredientes, tales como aromatizantes, colorantes, agentes antimicrobianos y conservantes. Además, una composición de la invención puede incluir ingredientes farmacéuticamente activos tales como hormonas, agentes antinecróticos, vasodilatadores, agentes farmacéuticos y similares.
La eficacia de toxicidad y terapéutica de dichas composiciones puede determinarse por procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o en animales experimentales, por ejemplo, determinando la DL50 (la dosis letal al 50 % de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población). La proporción de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y este puede expresarse como la proporción de DL50/DE50. Se prefieren los compuestos que presenten índices terapéuticos elevados.
Los datos obtenidos de ensayos de cultivo celulares y de estudios con animales pueden usarse en la formulación de una serie de dosificaciones para su uso en seres humanos. La dosificación de dichos compuestos se sitúa preferentemente en un intervalo de concentraciones en circulación que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la vía de administración utilizada. Para un compuesto usado en los métodos de la invención, la dosis terapéuticamente eficaz puede calcularse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celulares. Una dosis puede formularse en modelos animales para conseguir un intervalo de concentración plasmática en circulación que incluye la CI50 (es decir, la concentración del compuesto de ensayo que consigue una inhibición máxima media de los síntomas) según se determine en el cultivo celular. Dicha información puede usarse para determinar de una manera más precisa las dosis útiles en seres humanos. Pueden medirse niveles en plasma, por ejemplo, por cromatografía líquida de alto rendimiento. En un aspecto, el intervalo de dosificación para su uso en seres humanos es una cantidad suficiente para dar como resultado concentraciones en suero que son al menos de 10 micromolar (µM), preferentemente, al menos de 25 µM, más preferentemente, de 50 µM.
Las composiciones pueden administrarse de una o más veces al día a una a más veces a la semana, incluyendo una vez cada dos días. El experto en la materia apreciará que determinados factores pueden influir en la dosificación y el tiempo necesario para tratar eficazmente a un sujeto, incluyendo, pero sin limitación, la gravedad de la enfermedad o trastorno, tratamientos previos, la salud general y/o la edad del sujeto y otras enfermedades presentes. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad eficaz de una composición puede incluir un solo tratamiento o, preferentemente, puede incluir una serie de tratamientos.
Métodos de detección
La presente invención proporciona métodos para detectar un polipéptido como se reivindica en la reivindicación 25 o
26. Como se usa en el presente documento, la expresión “ex vivo” se refiere a una célula que no se ha retirado, por ejemplo, aislado, del organismo de un sujeto. Las células ex vivo incluyen, por ejemplo, células primarias (por ejemplo, células que se han retirado recientemente de un sujeto y que son capaces de limitar su crecimiento o mantenimiento en el medio de cultivo tisular) y células cultivadas (por ejemplo, células que son capaces de extender el crecimiento o mantenerse en medio de cultivo tisular). La célula es, preferentemente, una célula de mamífero tal como, por ejemplo, de ratón, de rata, de primate (por ejemplo de mono, de ser humano), preferentemente de ser humano. Los ejemplos preferidos de células incluyen células mamarias, tal como una célula tumoral mamaria, y células de próstata, tal como una célula tumoral de próstata. Una célula puede obtenerse de un sujeto, por ejemplo, mediante biopsia de un tejido humano de mama o próstata. Pueden usarse muestras obtenidas de casi cualquier tipo de tejido. Pueden cultivarse células de control in vitro de acuerdo con métodos conocidos en la materia. Las células que no expresan un receptor estrogénico RE-α de 36 kDa y que por tanto pueden usarse como control
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Cell, 55: 619-625 (1988)) son comúnmente aceptados como modelos de enfermedades humanas.
En otro aspecto, una célula se pone en contacto con una composición que incluye un polinucleótido, donde el polinucleótido ocasiona el silenciamiento post-transcripcional de una región codificante que codifica un polipéptido como se desvela en el presente documento. Dicho polinucleótido se denomina en el presente documento polinucleótido silenciador. El polinucleótido silenciador puede introducirse en una célula como un polinucleótido de ARN, o como un vector que incluye un polinucleótido de ADN que codifica y expresará el polinucleótido de ARN. Puede administrarse más de un tipo de polinucleótido. Por ejemplo, dos o más polinucleótidos que están diseñados para silenciar el mismo ARNm pueden combinarse y usarse los métodos del presente documento. Como alternativa, pueden usarse dos o más polinucleótidos conjuntamente donde cada uno de los polinucleótidos se diseña para silenciar diferentes ARNm.
Como se usa en el presente documento, el término “polinucleótido” se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, bien ribonucleótidos, desoxinucleótidos, o una combinación de los mismos, e incluye moléculas tanto monocatenarias como bicatenarias. Un polinucleótido puede obtenerse directamente a partir de una fuente natural, o puede prepararse con la ayuda de técnicas recombinantes, enzimáticas o químicas. Preferentemente, un polinucleótido de la presente invención está aislado. Como se usa en el presente documento, una “región codificante diana” y “secuencia codificante diana” se refiere a la región codificante cuya expresión inhibe un polinucleótido silenciador. Como se usa en el presente documento, un “ARNm diana” es un ARNm codificado por una región codificante diana. Un ejemplo de una región codificante diana es la secuencia de nucleótidos que codifica un RE-α36 (SEC ID Nº: 21), la secuencia de nucleótidos flanqueante 5’ (SEC ID Nº: 20), o la secuencia de nucleótidos flanqueante 3’, incluyendo la secuencia de nucleótidos codificada por el exón 9 (SEC ID Nº: 25).
Los polinucleótidos silenciadores incluyen polinucleótidos de ARN bicatenarios (ARNbc). La secuencia de un polinucleótido silenciador incluye una cadena, denominada en el presente documento cadena en sentido, de entre 16 a 30 nucleótidos, por ejemplo, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27,28,29 o 30 nucleótidos. La cadena en sentido es sustancialmente idéntica, preferentemente idéntica, a un ARNm diana. Como se usa en el presente documento, el término “idéntico” significa que la secuencia de nucleótidos de la cadena en sentido tiene la misma secuencia de nucleótidos que una parte del ARNm diana. Como se usa en el presente documento, la expresión “sustancialmente idéntica” significa que la secuencia de la cadena en sentido es diferente de la secuencia de un ARNm diana en 1, 2 o 3 nucleótidos, preferentemente 1 nucleótido, y los restantes nucleótidos son idénticos a la secuencia del ARNm. Estos 1, 2 o 3 nucleótidos de la cadena en sentido se denominan nucleótidos no complementarios. Cuando un polinucleótido silenciador incluye una cadena en sentido que es sustancialmente idéntica a un ARNm diana, los nucleótidos no complementarios 1, 2 o 3 se localizan preferentemente en el centro de la cadena en sentido. Por ejemplo, si la cadena en sentido tiene una longitud de 21 nucleótidos, los nucleótidos no complementarios son normalmente los nucleótidos 9, 10, 11 o 12, preferentemente los nucleótidos 10 u 11. La otra cadena de un polinucleótido de ARNbc, denominada en el presente documento cadena antisentido, es complementaria a la cadena en sentido. El término “complementario” se refiere a la capacidad de dos polinucleótidos monocatenarios para formar pares de bases entre sí, emparejándose una adenina de un polinucleótido con una timina o un uracilo de un segundo polinucleótido y emparejándose una citosina de un polinucleótido con una guanina de un segundo polinucleótido. Los polinucleótidos silenciadores también incluyen los polinucleótidos de ADN bicatenarios que corresponden a los polinucleótidos de ARNbc. También se incluyen los polinucleótidos de ARN monocatenario y polinucleótidos de ADN monocatenario correspondientes a las cadenas en sentido y cadenas antisentido desveladas en el presente documento. Debe entenderse que las secuencias desveladas en el presente documento como secuencias de ADN pueden convertirse de una secuencia de ADN a una secuencia de ARN reemplazando cada nucleótido de timidina con un nucleótido de uracilo. Sin pretender ser limitante, los polinucleótidos como se desvela en el presente documento ocasionan el silenciamiento post-transcripcional de una región codificante diana. En la técnica se conocen modificaciones en los polinucleótidos para su uso en el silenciamiento y de este modo los polinucleótidos silenciadores pueden modificarse.
Las cadenas en sentido y antisentido de un polinucleótido silenciador de ARNbc como se desvela en el presente documento también pueden unirse covalentemente, normalmente mediante un espaciador constituido por nucleótidos. Dicho polinucleótido a menudo se denomina en la técnica ARN de horquilla corto (ARNhc). Después del emparejamiento de bases de las cadenas en sentido y antisentido, la región espaciadora forma un bucle. El número de nucleótidos que constituye el bucle puede variar, y se han descrito bucles entre 3 y 23 nucleótidos (Sui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 5515-5520 (2002), y Jacque et al., Nature, 418, 435-438 (2002)).
Un polinucleótido silenciador ocasiona la inhibición post-transcripcional de la expresión, denominada también silenciamiento de una región codificante diana. Sin pretender limitarse a la teoría, después de la introducción en una célula un polinucleótido silenciador se hibridará con un ARNm diana y endonucleasas celulares de señal escindirán el ARNm diana. El resultado es la inhibición de la expresión del polipéptido codificado por el ARNm. Si la expresión de una región codificante diana se inhibe puede determinarse, por ejemplo, midiendo la disminución en la cantidad de ARNm diana en la célula, midiendo una disminución en la cantidad del polipéptido codificado por el ARNm, o midiendo una disminución en la actividad del polipéptido codificado por el ARNm. Un polinucleótido silenciador puede estar presente en un vector. Un polinucleótido silenciador puede estar presente en un vector como dos polinucleótidos complementarios distintos, cada uno de los cuales puede expresarse para producir una cadena en
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Estimulación celular con estrógenos y antiestrógenos y ensayo MTT. Antes del tratamiento, las células se cultivaron en medio sin rojo fenol con suero de ternero fetal tratado con carbón vegetal recubierto con dextrina al 2,5 % durante 48-72 horas y después se lavaron con PBS y se colocaron en medio asérico, sin rojo fenol, reciente, que contenía 0,1 µg/ml de BSA y 5 µg/ml de insulina, durante 12 horas. La estimulación de células quiescentes se realizó a 37 ºC en medio asérico durante un periodo de tiempo diferente. Los diferentes estrógenos y antiestrógenos se adquirieron en Steraloids Inc. El BSA-E2β se obtuvo en Sigma.
Para los ensayos con bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT), se añadieron células en suspensión a cada pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos para dar una concentración final de 1 X 103 células/pocillo, y se incubaron durante 24 horas a 37 ºC en una incubadora con CO2. Los medios que contenían E2β 10 nM, 10 nM de Tamoxifeno o 4OH-Tamoxifeno o UO126 7,2 nM (Calbiochem) se añadieron a cada pocillo durante 48 horas. El ensayo con MTT se realizó con el Kit de Ensayo de Proliferación Celular de una Solución Acuosa de CellTiter96 (Bio Rad) según recomendación del fabricante. Se usó un lector de microplaca (Promega) para medir la absorbancia a 490 nm.
Ensayo de fraccionamiento celular. El fraccionamiento celular se realizó como describen Márquez et al. (Oncogene, 20, 5420-5430 (2001)).
Análisis de transferencia de Western, inmunofluorescencia indirecta y anticuerpos. Para el análisis de transferencia de Western, las células se alteraron con tampón RIPA, se hirvieron en tampón de carga con gel y se separaron en un gel de SDS-PAGE al 10 %. Después de la electroforesis, las proteínas se transfectaron a una membrana de PVDF (Millipore). El filtro se exploró con diversos anticuerpos y se visualizó con anticuerpos secundarios apropiados conjugados con HRP (Santa Cruz Biotechnology) y reactivos ECL (Perkin Elmer Life Sciences).
El anticuerpo contra ERK1/2 (K-23) se adquirió en Santa Cruz Biotechnology. Los anticuerpos usados para analizar la activación de la ruta MAP quinasa incluyeron las formas fosforiladas de Mek1 y ERK1/2, y se adquirieron en Cell Signaling Technology. El anticuerpo anti-R-α de rata (H222) se adquirió en Research Diagnostic Inc. Los anticuerpos de COPB (Y-20), mSin3A (AK-11) y la 5’ nucleotidasa (H-300) se adquirieron en Santa Cruz biotechnology Inc. El D4-GDI (clon 97A1015) se obtuvo en Upstate Biotechnology.
El anticuerpo anti-RE-α36 policlonal se suscitó en conejo contra el antígeno peptídico sintetizado de acuerdo con los últimos 15 aminoácidos en la región C terminal del RE-α33 que son exclusivos para el RE-α36 (Alpha Diagnostic Inc.). Para purificar el anticuerpo, se usó una columna de afinidad del péptido sintetizado usado para suscitar el anticuerpo. La especificidad del anticuerpo también se había ensayado en células HEK293 transfectadas con el vector de expresión que expresaba el RE-α36, que no expresa el RE-α36 endógeno. El ensayo de inmunofluorescencia mostró que se detectaban señales inmunorreactivas del anticuerpo anti-RE-α36 solo en transfectantes transitorios con vectores que expresaban el RE-α36 pero no en transfectantes que expresaban un RE-α36 mutante que carecía del extremo C, lo que sugiere que el anticuerpo RE-α36 es altamente específico.
Ensayo de transfección de ADN y luciferasa. Para las ensayos de transfección transitoria, células HEK293 subsembradas en discos de 6 pocillos crecieron hasta una confluencia del 60-70 % en medio sin rojo fenol más suero de ternero fetal sin esteroides al 2,5 %. Las células se lavaron y se transfectaron transitoriamente con 5 µg totales de plásmidos (2 µg del plásmido indicador 2 X ERE-tk-Luc junto con 1,5 µg del vector de expresión pSG5, 1,5 µg de pSG hREα66 o 1,5 µg de pSG hREβ en solitario o con 1,5 µg del vector de expresión RE-α36) con reactivo FuGene6 (Roche Molecular Biochemicals). Se usó un plásmido indicador que contenía dos ERE (secuencia de -331 a -289 del gen A2 de Vitellogenina de pollo) colocado aguas arriba del promotor de la timidina quinasa (2 X ERE-tk-Luc, obtenido a través del Dr. Katarine Pettersson, Karolinska Institute, Suecia). Los vectores de expresión que contenían RE-α66 y β también se obtuvieron a través del Dr. Katarine Pettersson. El vector de expresión del RE-α46 se obtuvo a través del Dr. Zafar Nawaz (Creighton University Medical Center, Omaha, Nebraska). Las células se trataron con o sin E2 (10 nM) durante 12 horas antes de ensayar la actividad luciferasa. Los ensayos de luciferasa se realizaron usando el kit de Ensayo de Luciferasa de Promega. Los valores corresponden al promedio ± desviación típica de más de tres experimentos de transfección distintos.
Análisis de extracción de ARN y transferencia de Northern. El ARN celular total se aisló usando Trizol (Invitrogen), según las instrucciones del fabricante. Diez µg de ARN total se separaron por electroforesis en gel de formamida/formaldehído al 1,2 % y se transfirieron a una membrana de nylon (Hybond-N, Amersham Pharmacia Biotech). Las transferencias se prehibridaron durante 1 hora y se hibridaron durante 2 horas en solución Quick-Hybridization (Amersham Pharmacia Biotech) a 65 ºC. Las sondas incluyeron un fragmento de ADNc de 410 pb desde la región 3’ no traducida del RE-α36 que es exclusiva para el RE-α36, y una sonda de ADN de β actina de BD Clonetech. Las sondas de ADN se marcaron con 32P dCTP y un kit de marcaje de ADN Rediprime II (Amersham Biotech). Las transferencias se autoradiografiaron usando exploraciones de intensificación a -70 ºC durante una noche. Las mismas membranas se separaron y volvieron a explorarse con una sonda de ADN de β actina marcada para confirmar la misma carga.
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transcripcional intrínseca. Sin embargo, el RE-α36 suprime eficazmente los sitios de transactivación mediados por los dominios AF-1 y -2 del RE-α66 y β con ligando y sin ligando, lo que indica que el RE-α36 es un fuerte inhibidor de la señalización estrogénica genómica. Este hallazgo compara el informe previo de que el RE-α46, que carece del dominio AF-1, funciona como un poderoso competidor para suprimir la actividad de AF-1 del RE-α66.
La presencia de un RE basado en la membrana plasmática que desencadena una rápida señalización estrogénica, se discutió durante mucho tiempo, dado que la identidad molecular de este receptor no se había establecido. Previamente, Razandi, usando un ensayo de transfección, indicó que, tanto el RE-α66 como el β, podían iniciar la señalización estrogénica en membrana, aunque solamente un porcentaje muy pequeño del mismo se expresaba en la superficie celular (Razandi et al., Mol. Endocrinol., 13, 307-319 (1999)), lo que sugería que estos RE pueden estar implicados en la señalización estrogénica iniciada en la membrana, además de sus funciones adicionales en la señalización estrogénica genómica. Recientemente, se localizó la isoforma de 46 kDa del RE-α en la superficie celular y se descubrió que mediaba la fosforilación eNOS estimulada por estrógeno (Li et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 4807-4812 (2003)). Aquí, se demostró que otra variante del RE-α, el RE-α36, se localizaba predominantemente en la membrana plasmática y mediaba la activación de la ruta MAPK/ERK inducida por la señalización estrogénica iniciada en la membrana. Además, dado que el RE-α36 carece totalmente de actividad de transactivación intrínseca y solo actúa como un regulador de la señalización estrogénica genómica, el RE-α36 puede actuar principalmente como un receptor estrogénico basado en membrana para mediar la señalización estrogénica iniciada en la membrana. Previamente, se ha indicado que algunas de las acciones rápidas mediadas por E2β se producen en neuronas de ratones RE-α genosuprimidos (αERKO) y estas acciones no están bloqueadas por ICI 182,780 (Gu et al., Endocrinology, 140, 660-666 (1999)), lo que sugiere la existencia de más de una ruta de señalización estrogénica iniciada en la membrana. En este documento, se demuestra que, los antiestrógenos no bloqueaban la activación de MAPK/ERK mediada por el RE-α36, lo que sugiere que el RE-α36 está implicado en la ruta de señalización insensible a antiestrógenos previamente descrita. Dado que se crearon ratones αERKO mediante una alteración insercional del primer exón codificante del gen del RE-α36 de ratón (el exón que se salta en la generación de transcritos del RE-α36), es probable que la producción del homólogo de ratón del RE-α36 permanezca normal en estos ratones genosuprimidos. Por tanto, el RE-α36 puede contribuir a los efectos estrogénicos restantes observados en estos ratones. Recientemente, Toran-Allerand et al. (J. Neuroscience 22, 8391-8401 (2002)) indicaron la existencia de un nuevo receptor estrogénico asociado a la membrana plasmática (RE-X) con un peso molecular estimado de 63-65 kDa. El RE-X muestra algunas similitudes con el RE-α36, tales como reaccionar con anticuerpos contra el dominio de unión a ligando del RE-α66 y responder igualmente bien contra E2α y β. Sin embargo, la identidad molecular de estos dos receptores está a la espera de la clonación y secuenciación del RE-X.
También se ha demostrado que el RE-α36 promueve la activación iniciada en membrana de la ruta MAPK/ERK que conduce a la proliferación celular estimulada por estrógenos. Por tanto, el RE-α36, que está desprovisto de actividad de transcripción intrínseca, es suficiente para promover el crecimiento celular estimulado por estrógenos, lo que apoya el informe previo de que un mutante transcripcionalmente inactivo del RE-α66 induce la síntesis de ADN. Estos datos en conjunto sugieren que las actividades transcripcionales del RE pueden no ser necesarias para promover el crecimiento celular estimulado por estrógenos. Sorprendentemente, también se observó que antiestrógenos, tales como Tamoxifeno, activan fuertemente la señalización MAPK/ERK y estimulan el crecimiento celular durante el periodo del experimento (48 horas). Este hallazgo concuerda bien con la idea de que el Tamoxifeno actúa como agonista y antagonista de la señalización estrogénica y sugiere que el RE-α36 también puede estar implicado en la señalización antiestrogénica iniciada en la membrana.
Se sabe bien que las células de cáncer de mama con un fenotipo RE-α66 positivo (cáncer de mama positivo al RE) están más diferenciadas y tienen un potencial metastásico inferior en comparación con los tumores negativos al REα (McGuire, W. L. Prognostic factors in primary breast cancer. Cancer Surv. 5, 527-536 (1986)). Esto resulta interesante, ya que el RE-α36 se expresa no solo en el subconjunto de cánceres de mama positivos al RE-α66 sino también en la mayoría de los cánceres de mama negativos al RE-α66 examinados. Corroborando estos resultados, se ha indicado que la señalización estrogénica induce una rápida activación de la ruta PI3K/Akt en células MDA-MB231 que podría no bloquearse por antagonistas estrogénicos (Tsai et al., Cancer Res. 61, 8390-8392 (2001)), lo que se explicó como señalización estrogénica a través de una ruta independiente al RE. También se ha demostrado que la alta concentración de Tamoxifeno induce a la apoptosis en células MDA-MB-231 (Mandleker et al., Apoptosis 6, 469-477 (2001)). Estos datos sugieren contundentemente que el cáncer de mama negativo al RE-α66 puede conservar aún los efectos estrogénicos o antiestrogénicos mediados por la señalización iniciada en la membrana.
El RE-α36 también posee un dominio de unión a ligando exclusivo, reemplazando las 5 últimas hélices (hélices 8-12) de las 12 hélices en el RE-α66 con un dominio exclusivo de 27 aminoácidos, que puede cambiar la especificidad de unión a ligando y la afinidad del RE-α36. De hecho, se descubrió que el RE-α36 suscitaba una señalización iniciada en membrana igualmente en respuesta a E2α y β, E3 y E4. Por tanto, el RE-α36 parece poseer un espectro de unión a ligando mucho más amplio que el RE-α66, lo que hace que el RE-α36 sea posiblemente un mediador más fuerte de señalización mitogénica. Análisis posteriores de la especificidad de unión a ligando y afinidad del RE-α36
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