ES2516690T5 - Inhibidores de la actividad de serina proteasa y su uso en métodos y composiciones para el tratamiento de rechazo de injertos y promoción de supervivencia de injertos - Google Patents

Description

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reinjerto de donante (derecha), que indica la inducción de la inmuntolerancia esoecífica.

Fig. 7A-7E ilustra la producción de AAT por células de islotes y reflejo de la supervivencia de injerto de islotes. 7A ilustra una expresión en el curso del tiempo de ARNm de AAT de ratón después de la producción de citoquinas (IL1β e IFNγ) (izquierda) y a las 8 horas (derecha). 7B ilustra un ejemplo de lesión de islotes durante la pancreatitis; la histología islotes normales (izquierda arriba), la histología de islotes de un páncreas inflamado (derecha arriba) y expresión de AAT de ratón en islotes obtenidos de los páncreas en un modelo de pancreatitis aguda (abajo). 7C ilustra un ejemplo de muestras de aloinjertos de islotes tomados después del injerto y se evaluó el cambio en porcentaje en niveles de ARNm de AAT. 7D ilustra un ejemplo de la protección de islotes de la lesión de citoquina con AAT endógeno por introducción de oncostatina M (un miembro de la familia de interleuquina 6 (IL-6)) que induce la expresión de AAT en islotes, niveles de oncostatina M y AAT (arriba izquierda); niveles de óxido nítrico y viabilidad evaluados (arriba derecha) y la producción de óxido nítrico que representa la viabilidad de los islotes después de una exposición de 4 días a oncostatina M y la producción de AAT que reduce los efectos de citoquina sobre los islotes (abajo).

Fig. 8A-8D ilustra el efecto de AAT en islotes humanos y la producción de óxido nítrico (8A), la producción de TNF-α (8B) IL-6 (8C) e IL-8 (8D).

Descripción de las realizaciones ilustrativas

Definiciones

Los términos que no se definen de otro modo en la presente se usan de acuerdo con su significado pleno y ordinario.

Como se usa en la presente, “un” o “una” pueden significar uno o más de uno de un artículo.

Como se usa en la presente, “análogo de alfa1-antitripsina” puede significar un compuesto que tiene actividad de tipo alfa1-antitripsina. En una realización, un análogo de alfa1-antitripsina es un derivado funcional de alfa1antitripsina. En una realización particular, un análogo de alfa1-antitripsina es un compuesto capaz de reducir de modo significativo la actividad de serina proteasa. Por ejemplo, un inhibidor de la actividad de serina proteasa tiene la capacidad de inhibir la capacidad proteolítica de tripsina, elastasa, calicreína, trombina, catepsina G, quimiotripsina, activadores de plasminógeno, plasmina y/u otras serina proteasas.

Como se usan en la presente, “fármacos o agentes inmunomoduladores”, se entienden, por ejemplo, agentes que actúan sobre el sistema inmune, directa o indirectamente, por ejemplo, por estimulación o supresión de una actividad celular de una célula en el sistema inmune, por ejemplo, células T, células B, macrófagos o células que presentan antígeno (APC, células dendríticas) o por actuación en componentes fuera del sistema inmune que, a su vez, estimulan, suprimen o modulan el sistema inmune, por ejemplo, citoquinas, por ejemplo, hormonas, agonistas o antagonistas de receptores y neurotransmisores; inmunomoduladores pueden ser, por ejemplo, inmunosupresores o inmunoestimulantes.

Se ha de entender que la terminología y la fraseología empleada en la presente son con fines descriptivos y no se deben considerar limitantes.

Descripción detallada de la invención

En las secciones siguientes, se describen diversas composiciones y métodos de ejemplo tal como se define por las reivindicaciones, a fin de detallar diversas realizaciones de la invención. Será obvio para un experto en la técnica que la práctica de las diversas realizaciones no requiere el empleo de todos o incluso algunos de los detalles específicos destacados en la presente, sino más bien las concentraciones, tiempos y otros detalles específicos se pueden modificar por medio de experimentación de rutina. En algunos casos, no se han incluido métodos o componentes bien conocidos en la descripción.

Las realizaciones de la presente invención incluyen métodos para tratar un sujeto que tiene o que necesita un trasplante. De acuerdo con estas realizaciones, un sujeto se puede tratar con una composición capaz de reducir de modo significativo la actividad de serina proteasa. Además, una realización de la presente invención proporciona métodos que incluyen el tratamiento de un sujeto con una composición que comprende un compuesto que tiene una actividad de α-1-antitripsina. En una realización, la composición puede incluir α-1-antitripsina, su análogo o un inhibidor de serina proteasa para promover, por ejemplo, la supervivencia del trasplante o reducir un efecto colateral del trasplante. Además, la administración de la composición puede ser antes del trasplante, durante el trasplante, después del trasplante o una combinación de ellos. Además, la composición también puede incluir una o varias terapias adicionales tales como terapias de inmunosupresión. Un trasplante de la presente invención puede incluir trasplante de un órgano tales como pulmón, riñón, corazón, hígado, piel, páncreas o intestino, o no orgánico tales como médula ósea, islote pancreático, córnea y/o tejido blando.

Los inhibidores de serina proteasa se han hallado en una variedad de organismos. Ahora se han identificado al menos nueve proteínas separadas bien caracterizadas, que comparten la capacidad de inhibir la actividad de

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diversas proteasas. Varios de los inhibidores se han agrupado juntos como el inhibidor de α1-antitripsina-proteinasa. Las serina proteasas incluyen, pero sin limitación, elastasa de leucocito, trombina, catepsina G, quimiotripsina, activadores de plasminógeno y plasmina.

Las realizaciones de la presente invención incluyen métodos para promover el trasplante, la supervivencia del injerto, la reducción del rechazo al injerto y/o la reducción o prevención de efectos colaterales asociados con el rechazo al injerto. De acuerdo con estas realizaciones, los efectos colaterales pueden incluir condiciones asociados con enfermedad de injerto versus huésped (GVHD) o rechazo al injerto. En un ejemplo, los métodos revelados en la presente se pueden usar para tratar a un sujeto que se somete a trasplante de médula ósea. En otra realización, los síntomas o signos pueden incluir, pero sin limitación, uno o varios de los siguientes: malestar, fiebre, tos seca, mialgias y dolores de pecho, compromiso ventilatorio, sudoración, náuseas, vómitos, fiebre, dolor abdominal, diarrea con sangre, ulceraciones de mucosa, función renal reducida (creatinina aumentada, producción de orina reducida), menor función pulmonar (mayor acortamiento de la respiración, fiebre, tos, esputo, hipoxemia), función cardíaca reducida (acortamiento de la respiración, dolor de pecho, fatiga, edema pulmonar o periférico, valvulopatía), función de islote reducida (glucosa incrementada, diabetes mellitus), enfermedad de injerto versus huésped (ulceración gastrointestinal (GI), insuficiencia pulmonar, ulceración de la piel).

Las realizaciones de la presente invención incluyen métodos para tratar a un sujeto que necesita de una terapia de inmunotolerancia. De acuerdo con estas realizaciones, un sujeto se puede tratar con una composición para inducir inmunotolerancia. Esto se logra mientras se reduce el riesgo de una respuesta inmune disfuncional o un efecto colateral de una respuesta inmune disfuncional en un sujeto tal como se encuentra típicamente durante la inmunosupresión estándar. Por ejemplo, una respuesta inmune disfuncional puede ser un efecto de rechazo al injerto, neumonía, sepsis, infección fúngica, cáncer. De acuerdo con este método, al sujeto se puede administrar una composición que incluye un compuesto que es capaz de reducir de modo significativo la actividad de serina proteasa u otra actividad asociada con α1-antitripsina o un análogo de α1-antitripsina. En determinadas realizaciones, una composición capaz de reducir de modo significativo la actividad de serina proteasa puede incluir α-1-antitripsina, uno de sus análogos o una combinación de ellos. De acuerdo con estas realizaciones, un ejemplo de la terapia de inmunotolerancia puede incluir la inhibición de la producción de citoquinas.

Cualquiera de las realizaciones detalladas en la presente también puede incluir uno o varios de una cantidad terapéuticamente efectiva de fármacos antimicrobianos, agentes antiinflamatorios, agentes inmunomoduladores o agentes inmunosupresores o una combinación de ellos.

Los ejemplos no limitativos de agentes / fármacos antirrechazo pueden incluir, por ejemplo, ciclosporina, azatioprina, corticosteroides, FK506 (tacrolimus), RS61443, micofenolato mofetilo, rapamicina (sirolimus), mizoribina, 15desoxispergualina y/o leflunomida o cualquier combinación de ellos.

Además, otras composiciones combinadas o métodos de la presente invención incluyen determinadas terapias a base de anticuerpos. Los ejemplos no limitativos incluyen anticuerpos policlonales antilinfocíticos, anticuerpos monoclonales dirigidos al complejo de receptor de antígeno de células T (OKT3, TIOB9), anticuerpos monoclonales dirigidos a antígenos de la superficie celular adicionales, incluyendo receptor alfa de interleuquina-2. Las terapias a base de anticuerpos se pueden usar como terapia de inducción y/o fármacos antirrechazo en combinación con las composiciones y métodos de la presente invención.

Las realizaciones de la presente invención incluyen métodos de tratamiento de un sujeto que necesita de una terapia de inmunotolerancia. De acuerdo con estas realizaciones, un sujeto se puede tratar con una composición capaz de reducir de modo significativo la actividad de serina proteasa. En una realización, la composición puede incluir una α1-antitripsina, su análogo o un inhibidor de serina proteasa, por ejemplo, para reducir o inhibir la producción de citoquinas. De acuerdo con estas realizaciones, se contemplan terapias combinadas, tales como combinación de una composición de α-1-antitripsina con un agente antiinflamatorio.

Una realización particular de la presente invención incluye métodos para reducir los niveles y actividades de citoquinas tales como TNFα (factor de necrosis tumoral alfa). Por ejemplo, la composición puede incluir alfa1antitripsina o su análogo o una combinación de ellos solos o combinados con otras terapias.

En una realización, la reducción, prevención o inhibición del rechazo de trasplante o sus efectos colaterales asociados con una o varias de las condiciones antes mencionadas pueden ser de aproximadamente el 10-20%, 3040%, 50-60% o más de reducción o inhibición debido a la administración de las composiciones reveladas.

En una realización de la presente invención, una composición puede incluir compuestos que enganchan moléculas para el receptor SEC para tratar a un sujeto que se somete a trasplante y/o que necesita de terapia de inmunotolerancia. En cada uno de los métodos mencionados, una α1-antitripsina (por ejemplo, derivada de mamífero) o inhibidor de sustancia con actividad de serina proteasa contemplados para usar dentro de los métodos de la presente invención pueden incluir una serie de péptidos que incluyen péptidos de aminoácidos carboxiterminales correspondientes a AAT. Estos pentapéptidos pueden estar representados por una fórmula general (I): I-A-B-C-D-E-F-G-H-II (nota: en el listado de secuencias F=X), en donde I es Cys o está ausente; A es Ala, Gly; Val o está ausente; B es Ala, Gly, Val, Ser o está ausente; C es Ser, Thr o está ausente; D es Ser, Thr,

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Ans, Glu, Arg, Ile, Leu o está ausente; E es Ser, Thr, Asp o está ausente; F es Thr, Ser, Asn, Gln, Lys, Trp o está ausente; G es Tyr o está ausente; H es Thr, Gly, Met, Met(O), Cys, Thr o Gly; y II es Cys, un grupo amida, un grupo amida sustituida, un grupo éster o está ausente, en donde los péptidos incluyen 4 o más aminoácidos consecutivos y sus sales fisiológicamente aceptables. Entre estas series de péptidos, varios son igualmente aceptables que incluyen FVFLM (SEQ ID NO. 1), FVFAM (SEQ. ID NO. 2), FVALM (SEQ. ID NO. 3), FVFLA (SEQ. ID NO. 4), FLVFI (SEQ. ID NO. 5), FLMII (SEQ. ID NO. 6), FLFVL (SEQ. ID NO. 7), FLFVV (SEQ. ID NO. 8), FLFLI (SEQ. ID NO. 9), FLFFI (SEQ. ID NO. 10), FLMFI (SEQ. ID NO. 11), FMLLI (SEQ. ID NO. 12), FIIMI (SEQ. ID NO. 13), FLFCI (SEQ. ID NO. 14), FLFAV (SEQ. ID) NO. 15), FVYLI (SEQ. ID NO. 16), FAFLM (SEQ. ID NO. 17), AVFLM (SEQ. ID NO. 18) y cualquier combinación de ellos.

En varias realizaciones de la presente, los péptidos de AAT contemplados para usar en las composiciones y métodos de la presente invención también pretenden incluir cualquiera y todos aquellos péptidos de AAT específicos de la SEQ ID NO. 1 representada supra. Se puede usar cualquier combinación de aminoácidos consecutivos que simulan la actividad de AAT o actividad de tipo AAT, tales como aminoácidos 2-12, aminoácidos 3-14, 4-16, etc.

En cada uno de los métodos antes mencionados, se contemplan α1-antitripsina o sus análogos para usar en una composición en la presente. Estos análogos pueden incluir péptidos. Los péptidos pueden incluir, pero sin limitación, péptidos de aminoácidos que contienen MPSSVSWGIL (SEQ. ID NO. 19); LAGLCCLVPV (SEQ. ID NO. 20) SLAEDPQGDA (SEQ. ID NO. 21); AQKTDTSHHD (SEQ. ID NO. 22) QDHPTFNKIT (SEQ. ID NO. 23); PNLAEFAFSL (SEQ. ID NO. 24); YRQLAHQSNS (SEQ. ID NO. 25); TNIFFSPVSI (SEQ. ID NO. 26); ATAFAMLSLG (SEQ. ID NO. 27); TKADTHDEIL (SEQ. ID NO. 28); EGLNFNLTEI (SEQ. ID NO. 29); PEAQIHEGFQ (SEQ. ID) NO. 30); ELLRTLNQPD (SEQ. ID NO. 31); SQLQLTTGNG (SEQ. ID NO. 32); LFLSEGLKLV (SEQ. ID NO. 33); DKFLEDVKKL (SEQ. ID NO. 34); YHSEAFTVNF (SEQ. ID NO. 35); GDHEEAKKQI (SEQ. ID NO. 36); NDYVEKGTQG (SEQ. ID NO. 37); KIVDLVKELD (SEQ. ID NO. 38); RDTVFALVNY (SEQ. ID NO. 39); IFFKGKWERP (SEQ. ID NO. 40); FEVKDTEDED (SEQ. ID NO. 41); FHVDQVTTVK (SEQ. ID NO. 42); VPMMKRLGMF (SEQ. ID NO. 43); NIQHCKKLSS (SEQ. ID NO. 44); WVLLMKYLGN (SEQ. ID NO. 45); ATAIFFLPDE (SEQ. ID NO. 46); GKLQHLENEL (SEQ. ID NO. 47); THDIITKFLE (SEQ. ED NO. 48); NEDRRSASLH (SEQ. ID NO. 49); LPKLSITGTY (SEQ. ID NO. 50); DLKSVLGQLG (SEQ. ID NO. 51); ITKVFSNGAD (SEQ. ID NO. 52); LSGVTEEAPL (SEQ. ID NO. 53); KLSKAVHKAV (SEQ. ID NO. 54); LTIDEKGTEA (SEQ. ID NO. 55); AGAMFLEAIP (SEQ. ID NO. 56); MSIPPEVKFN (SEQ. ID NO. 57); KPFVFLMIEQ (SEQ. ID NO. 58); NTKSPLFMGK (SEQ. ID NO. 59); VVNPTQK (SEQ. ID NO. 60) o cualquier combinación de ellos.

De acuerdo con realizaciones de la presente invención, el péptido se puede proteger o derivar por cualquier medio conocido en la técnica, por ejemplo, acilación N-terminal, amidación C-terminal, ciclación, etc. En una realización específica, el término N del péptido es acetilado.

Composiciones farmacéuticas

Las realizaciones en la presente proporcionan la administración de composiciones que comprenden el compuesto de la invención a sujetos en una forma biológicamente compatible apropiada para administración farmacéutica in vivo. Por “forma biológicamente compatible apropiada para administración in vivo” se entiende una forma del agente activo (es decir, producto químico farmacéutico, proteína, gen, anticuerpo, etc., de las realizaciones) para ser administrada, en la que cualquier efecto tóxico se ven compensado por los efectos terapéuticos del agente activo. La administración de una cantidad terapéuticamente activa de las composiciones terapéuticas se define como una cantidad efectiva, en dosis y durante períodos de tiempo necesarios para lograr el resultado deseado. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente activa de un compuesto puede variar de acuerdo con factores tales como el estado patológico, edad, sexo y peso del individuo y la capacidad del anticuerpo de producir una respuesta deseada en el individuo. Los regímenes posológicos se pueden ajustar para proporcionar la respuesta terapéutica óptima.

En una realización, el compuesto (es decir, producto químico farmacéutico, proteína, péptido etc. de las realizaciones) se puede administrar de una manera conveniente como administración subcutánea, intravenosa, oral, inhalación, aplicación transdérmica, aplicación intravaginal, aplicación tópica, administración intranasal o rectal. Según la vía de administración, el compuesto activo se puede recubrir de un material para proteger el compuesto de la degradación por enzimas, ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto. En una realización preferida, el compuesto se puede administrar por vía oral. En otra realización preferida, el compuesto se puede administrar por vía intravenosa. En una realización particular, el compuesto se puede administrar por vía intranasal, como inhalación.

Un compuesto se puede administrar a un sujeto en un portador o diluyente apropiado, coadministrado con inhibidores de enzimas o en un portador apropiado como liposomas. La expresión “portador farmacéuticamente aceptable” como se usa en la presente pretende incluir diluyentes tales como solución fisiológica y soluciones tamponadas acuosas. Puede ser necesario recubrir el compuesto o coadministrar el compuesto con un material para evitar su inactivación. El agente activo también se puede administrar por vía parenteral o intraperitoneal. Las dispersiones también se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de ellos y en aceites. En condiciones de almacenamiento y uso ordinarias, estas preparaciones pueden contener un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.

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Las composiciones farmacéuticas apropiadas para uso inyectable se pueden administrar por medios conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden usar soluciones acuosas estériles (llegado el caso, hidrosolubles) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la composición puede ser estéril y puede ser fluida en la medida en que exista una simple inyectabilidad. Puede ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y se puede preservar contra la acción contaminante de los microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador farmacéuticamente aceptable puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares) y sus mezclas apropiadas. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, por uso de un recubrimiento como lecitina, por mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y por uso de tensioactivos. La prevención de microorganismos se puede lograr por calentamiento, exposición del agente al detergente, irradiación o adición de diversos agentes antibacterianos o antifúngicos.

Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el compuesto activo (por ejemplo un compuesto que reduce la actividad de serina proteasa) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno

o una combinación de ingredientes enumerados con anterioridad, de ser requerid, seguido de esterilización por filtración.

Las composiciones acuosas pueden incluir una cantidad efectiva de un compuesto terapéutico, péptido, región central epitópica, estimulante, inhibidor y similares, disuelto o disperso en un portador farmacéuticamente aceptable

o medio acuoso. Los compuestos y materiales biológicos revelados en la presente se pueden purificar por medios conocidos en la técnica.

Las soluciones de los compuestos activos como sales de base libre o farmacológicamente aceptables se pueden preparar en agua apropiadamente mezclada con un tensioactivo, como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones también se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de ellos y en aceites. En condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede producir con el uso en las composiciones de agentes que demoran la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Después de la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosis y en tal cantidad que sea terapéuticamente efectiva. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas posológicas, tales como el tipo de soluciones inyectables descritas con anterioridad. Se contempla que también se pueden emplear cápsulas de liberación lenta, micropartículas de liberación prolongada y similares. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente apropiadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal.

Los agentes terapéuticos activos se pueden formular dentro de una mezcla para comprender aproximadamente 0,0001 a 1,0 miligramos o aproximadamente 0,001 a 0,1 miligramos o aproximadamente 0,1 a 1,0 o incluso aproximadamente 1 a 10 gramos por dosis. Las dosis únicas o múltiples también se pueden administrar en un cronograma apropiado para una condición predeterminada.

En otra realización, se pueden usar soluciones nasales o sprays, aerosoles o inhalantes para suministrar el compuesto de interés. Las formulaciones adicionales que son apropiadas para otros modos de administración incluyen supositorios y pesarios. También se puede usar un pesario o supositorio rectal. En general, para supositorios, los aglutinantes y portadores tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialquilenglicoles o triglicéridos; tales supositorios se pueden formar a partir de mezclas que contienen el ingrediente activo en el intervalo del 0,5% al 10%, con preferencia, del 1%-2%.

Las formulaciones orales incluyen tales excipientes normalmente empleados como, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, y similares. En determinadas realizaciones definidas, las composiciones farmacéuticas orales comprenderán un diluyente inerte o portador comestible asimilable o se pueden incluir en cápsula de gelatina dura o blanda o se pueden prensar en comprimidos o se pueden incorporar directamente con el alimento de la dieta. Para la administración terapéutica oral, los compuestos activos se pueden incorporar con excipientes y usar en la forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, tabletas, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares. Estas composiciones y preparaciones deberán contener al menos el 0,1% de compuesto activo. El porcentaje de las composiciones y las preparaciones pueden variarse, de hecho, y pueden ser de modo conveniente de entre aproximadamente el 2 a aproximadamente el 75% del peso de la unidad o, con preferencia, de entre el 2560%. La cantidad de compuestos activos en tales composiciones de utilidad terapéutica es tal que se obtendrá una dosis apropiada.

Una composición farmacéutica se puede preparar con portadores que protegen los ingredientes activos de una rápida eliminación del organismo, tales como formulaciones de liberación prolongada o recubrimientos. Se conocen estos portadores incluyen formulaciones de liberación controlada, tales como, pero sin limitación, sistemas de suministro microencapsulado y biodegradable, polímeros biocompatibles, tales como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, poliortoésteres, ácido poliláctico y otros.

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Una importante secuencia de aminoácido cerca del extremo carboxiterminal de la α1-antitripsina se muestra en negrita y subrayada y es pertinente a esta invención (los detalles de la secuencia se pueden hallar, por ejemplo, en la patente U. S. N.º 5.470.970).

Los sitios extrahepáticos de la producción de AAT incluyen neutrófilos, monocitos y macrófagos y la expresión de AAT es inducible en respuesta a LPS, TNFα, IL-1 e IL-6 en diversos tipos celulares. La deficiencia en AAT está asociada con condiciones disfuncionales inmunes tales como artritis reumatoidea y lupus eritematoso sistémico.

Otras moléculas de inhibidor de serina proteasa, que se pueden usar en cualquiera de las composiciones reveladas pueden incluir compuestos descritos a continuación: el documento WO 98/20034 que revela inhibidores de serina proteasa de pulgas; el documento WO98/23565 que revela compuestos de aminoguanidina y alcoxiguanidina útiles para inhibir las serina proteasas; el documento WO98/5034 que revela compuestos de bis-aminometilcarbonilo útiles para tratar trastornos de cisteína y serina proteasa; el documento WO98/50420 que revela derivados cíclicos y otros aminoácidos útiles para enfermedades relacionadas con trombina; el documento WO 97/21690 que revela derivados que contienen D-aminoácidos; el documento WO 97/10231 que revela inhibidores de serina y cisteína proteasas que contienen cetometileno; el documento WO 97/03679 que revela inhibidores de serina y cisteína proteasas con contenido de fósforo; el documento WO 98/21186 que revela benzotiazo e inhibidores de serina proteasas heterocíclicos relacionados; el documento WO 98/22619 que revela una combinación de inhibidores que se ligan al sitio P de serina proteasas con sitio quelante de cationes divalentes; el documento WO 98/22098 que revela una composición que inhibe la conversión de la subfamilia CPP32 proenzimática que incluye caspasa 3 (CPP32/Yama/Apopaína); el documento WO 97/48706 que revela pirrolo-pirazina-dionas; y el documento WO 97/33996 que revela bicunina placentaria humana (recombinante) como inhibidor de serina proteasa.

Otros compuestos que tienen actividad inhibidora de serina proteasa son igualmente apropiados y efectivos para usar en los métodos de la presente invención, incluyendo, pero sin limitación: derivados de tetrazol tal como se revela en el documento WO 97/24339; derivados de ácido guanidinobenzoico tal como se revela en el documento WO 97/37969 y en una cantidad de patentes U. S. Nros. 4.283.418, 4.843.094, 4.310.533, 4.283.418, 4.224.342, 4.021.472, 5.376.655, 5.247.084 y 5.077.428; derivados de fenilsulfonilamida representados por la fórmula general en el documento WO 97/45402; nuevos derivados de sulfuro, sulfóxido y sulfona representados por la fórmula general en el documento WO 97/49679; nuevos derivados de amidino representados por la fórmula general en el documento WO 99/41231; otros derivados de amidinofenol se revelan en las patentes U. S. Nros. 5.432.178, 5.622.984, 5.614.555, 5.514.713, 5.110.602, 5.004.612 y 4.889.723 ente muchas otras.

Rechazo al injerto y supervivencia del injerto -efectos colaterales y condiciones 1)

Uno de los efectos beneficiosos de uso de las composiciones que comprenden un compuesto de la presente invención incluye, por ejemplo, y no a modo de limitación, infiltración reducida de injerto con células o factores séricos (incluyendo, pero sin limitación, complemento, anticuerpo antiinjerto que generan inflamación y rechazo al injerto), citoquinas reducidas, óxido nítrico reducido, apoptosis reducida y respuesta inmune específica reducida contra el injerto o cualquier combinación de ellos.

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Control del rechazo del injerto

Al prevenir o reducir los efectos colaterales o condiciones asociadas con la supervivencia del injerto o el rechazo al injerto usando este novedoso enfoque, se obtienen varias ventajas en comparación con enfoques alternativos, por ejemplo, y no a modo de limitación:

1.

Reducida infiltración del injerto con células o factores séricos (por ejemplo, y no a modo de limitación, complemento, anticuerpo antiinjerto que genera inflamación y rechazo al injerto); producción reducida de citoquinas u óxido nítrico (NO) que puede inducir inflamación o apoptosis; inhibe apoptosis; inhibe la activación inmune, inhibe CMV o cualquier combinación de ellos.

2.

Inhibidores sintéticos de serina proteasas (similares a AAT o análogos) pueden desarrollarse y se han desarrollado por medios conocidos en la técnica. Tal agente farmacéutico se puede formular como, por ejemplo, una crema para tratar el rechazo al injerto y/o promover la supervivencia de injerto.

3.

Agentes asequibles en comercios ya aprobados para un uso diferente en humanos actuarán como un tratamiento para el rechazo al injerto y/o promoverán la supervivencia del injerto. Estos agentes se usan actualmente para indicaciones distintas al rechazo al injerto y/o para promover la supervivencia del injerto e incluyen AAT inyectables, preparaciones plasmáticas, aprotinina y otros (American J. de Resp Critical Care Med 1998, VII 158:49-59). En una realización, los inhibidores de serina proteasa se pueden suministrar por inhalación. Un agente inhalado (AAT natural o un producto sintético similar a AAT y/u otro inhibidor de serina proteasa) puede ser especialmente útil debido a las elevadas concentraciones locales, facilidad de suministro de fármaco y falta de efectos colaterales (dado que la administración no es sistémica). Este modo de suministro de fármaco enfocado puede aumentar la actividad inhibidora de serina proteasa dentro de tejidos pulmonares y linfáticos asociados, que son dos de los sitios principales donde se desarrollan las enfermedades y/o condiciones clínicas asociadas con el rechazo al injerto y/o promoción de la supervivencia del injerto.

4.

Al promover la supervivencia del injerto y/o tratar el rechazo al injerto, la causa directa del efecto colateral se disrumpe en individuos afectados. Esta invención contempla específicamente la inhibición de las serina proteasas de células huésped o induce el receptor SEC o una combinación de ellos como un método de tratamiento del rechazo al injerto y/o promoción de la supervivencia del injerto en un mamífero que lo necesita junto con la administración de uno o varios agentes antirrechazo y/o antimicrobianos.

5.

Hay una vasta experiencia clínica usando AAT inyectables para tratar pacientes con deficiencia de AAT genética. No se han detectado efectos negativos a largo plazo hasta la fecha (American J. of Resp Critical Care Med 1998, VII

158: 49-59; Wencker et al. Chest 2001 119:737-744). Más aún, se ha administrado un inhibidor de molécula pequeña de serina proteasa de huésped a pacientes con enfermedad de Kawasaki (Ulinistatin, Ono Pharmaceuticals).

Proteínas aisladas para usar en las composiciones y métodos de la invención

También se revelan proteínas y sus porciones, así como fragmentos de polipéptidos apropiados para usar como inmunógenos para producir anticuerpos dirigidos contra un polipéptido de la invención. El polipéptido nativo se puede aislar de células o fuentes tisulares por un esquema de purificación apropiado usando técnicas estándar de purificación de proteínas. En otra realización, se producen polipéptidos de la invención por técnicas de ADN recombinantes. Alternativamente a la expresión recombinante, se puede sintetizar un polipéptido de la invención químicamente usando técnicas estándar de síntesis de péptidos.

También se conocen variantes recombinantes no modificadas y mutantes de alfa1-antitripsina producidas por métodos de ingeniería genética (ver la patente U. S. N.º 4.711.848). La secuencia de nucleótidos de alfa1antitripsina humana y otras variantes de alfa1-antitripsina humana se reveló en la solicitud publicada internacional N.º WO 86/00.337. Esta secuencia de nucleótidos se puede usar como material de partida para generar todas estas variantes de aminoácidos de AAT y fragmentos de aminoácidos representados en la presente, usando técnicas de ADN recombinantes y métodos conocidos por los expertos en la técnica.

Una proteína aislada y/o purificada o parcialmente purificada o su porción biológicamente activa se puede usar en cualquier realización de la invención. Una proteína que es sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína que tienen menos de aproximadamente el 30%, 20%, 10% o 5% (en peso seco) de proteína heterológa. Cuando la proteína o superficie porción biológicamente activa se produce de forma recombinante, también puede ser sustancialmente libre de medio de cultivo. Cuando la proteína se produce por síntesis química, es sustancialmente libre con preferencia de precursores químicos u otros productos químicos. Conforme a ello, tales preparaciones de la proteína tienen menos de aproximadamente el 30%, 20%, 10% y 5% (en peso seco) de precursores químicos o compuestos distintos del polipéptido de interés.

Las porciones biológicamente activas de un polipéptido de la invención incluyen polipéptidos que incluyen secuencias de aminoácidos suficientemente idénticas o derivadas de la secuencia de aminoácido de la proteína (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID Nos: 1 a 60, que exhiben al menos una

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pero sin limitación, derivados de interferón (por ejemplo, betaserona); derivados de prostano (por ejemplo, compuestos revelados en el documento PCT/DE93/0013, iloprost, cortisol, dexametasona; inmunsupresores (por ejemplo, ciclosporina A, FK-506 (micofenilato mofetilo); inhibidores de lipoxigenasa (por ejemplo, zileutona, MK-886, WY-50295); antagonistas de leucotrieno (por ejemplo, compuestos revelados en el documento DE 40091171, solicitud de patente alemana P 42 42 390.2); y análogos; derivados peptídicos (por ejemplo, ACTH y análogos); receptores solubles de TNF; anticuerpos de TNF; receptores solubles de interleuquinas, otras citoquinas, proteínas de células T; anticuerpos contra receptores de interleuquinas, otras citoquinas y proteínas de células T.

Kits

También se revelan kits para usar con los métodos descritos con anterioridad. Se pueden emplear pequeñas moléculas, proteínas o péptidos para usar en cualquiera de los métodos revelados. Además, otros agentes tales como agentes antibacterianos, agentes inmunosupresores, agentes antiinflamatorios pueden estar provistos en el kit. Los kits podrán incluir así, en un medio contenedor apropiado, una proteína o un péptido o agente análogo y opcionalmente uno o varios agentes adicionales.

Los kits también pueden incluir una composición alicuotada apropiadamente de la proteína codificada o antígeno de polipéptido, ya sea rotulada o no rotulada, como se puede usar para preparar una curva estándar para un ensayo de detección.

El medio contenedor de los kits incluirá en general un vial, tubo de ensayo, frasco, botella, jeringa u otro medio contenedor, en el que se puede colocar el anticuerpo o el antígeno y, con preferencia, alicuotar de forma apropiada. Cuando se proporciona un segundo o tercer ligando de unión o componente adicional, el kit también contendrá en general un segundo, tercer u otro recipiente adicional en el que este ligando o componente se puede colocar. Los kits de la presente invención también pueden incluir típicamente un medio para contener el anticuerpo, antígeno y cualquier otro contenedor reactivo en confinamiento cerrado para venta comercial. Estos contenedores pueden incluir inyección o contenedores plásticos moldeados por soplado en los que se retienen los viales deseados.

Ejemplos

Ejemplo 1

La alfa1-antitripsina prolonga la supervivencia de islotes injertados en ratones

Fig. 1A-1D. Islotes de ratones DBA/2 (H-2d) se trasplantaron debajo de la cápsula renal de ratones hiperglucémicos C57BL/6 inducidos con estreptozotocina (H-2b). (A) Niveles de glucosa de los días 6-18. El control consiste en ratones que no estaban tratados (n = 3) o tratados del día -1 cada 3 días con albúmina humana (ALB, 6 mg, n = 3). La supervivencia del injerto de islotes se observa en ratones tratados desde el día -1 cada 3 días con AAT humana (2 mg, n =10). * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 entre niveles de glucosa el mismo día. (B) Protocolos de tratamiento. Se describen tratamiento de AAT de control y completo en el panel A. El tratamiento temprano de AAT consiste en el tratamiento en los días -1, 1 y 3 (2 mg, n = 3). El tratamiento tardío de AAT consiste en el tratamiento desde el día 2 y cada 2 días (2 mg, n = 3). El rechazo indica el día en que los niveles de glucosa exceden 300 mg/dl.

(C)

Efecto de anticuerpos anti-humano-AAT de ratón. La línea de puntos indica niveles de glucosa postrasplante de un ratón bajo protocolo de tratamiento de AAT completo (ver A, B) que se inmunizó por administraciones múltiples de AAT humana antes del trasplante (1 representante, n = 3). La línea sólida indica niveles de glucosa de un ratón no inmunizado tratado bajo el protocolo de tratamiento de AAT completo (1 representante, n = 10). La flecha indica la detección de anticuerpos anti-humano-AAT inducidos por tratamiento en el ratón representativo no inmunizado.

(D)

Comparación de los niveles de glucosa postrasplante en el día 15 en ratones que estaban bajo protocolo de tratamiento completo con ALB (n = 3) o AAT (no inmunizados n =10, inmunizados n = 3). Del grupo tratado con AAT, se detectaron anticuerpos el día 15 en 3/3 ratones inmunizados y en 6/10 ratones no inmunizados. ** P = 0,005 entre ratones que produjeron anticuerpos (n = 6) y ratones que no produjeron produce anticuerpos (n = 4).

El tratamiento con albúmina humana (6 mg) dio como resultado el rechazo al injerto comparable con aquel de ratones receptores no tratados. Por el contrario, los ratones receptores que recibieron AAT (2 mg) exhibieron una función de injerto prolongada. Como se representa en la Fig. 1b, ninguno de los protocolos de tratamiento parciales, es decir, días -1, 1 y 3 (’tratamiento temprano’) o días 2 y más (’tratamiento tardío’) prolongaron la supervivencia del aloinjerto.

Los ratones tratados con AAT desarrollaron anticuerpos anti-humanos-AAT (Fig. 1C y D). Los ratones individuales exhibieron anticuerpos anti-humanos-AAT en diversos puntos temporales (datos no mostrados). Para afirmar que los anticuerpos reducen el efecto de protección de AAT, se preexpuso un grupo de ratones (“inmunizados”) a AAT humana dos meses antes de dejarlos hiperglucémicos y trasplantados con islotes alogénicos. Estos receptores de injertos se trataron con el protocolo de AAT completo, a pesar de exhibir altos títulos de anticuerpos específicos antes del injerto y mostrar un rápido rechazo al injerto (Fig. 1C). El día 15 se seleccionó para representar una asociación entre formación de anticuerpos y pérdida de actividad de protección de AAT; en este punto de tiempo, los ratones tratados con AAT se dividieron en productores positivos y negativos de anticuerpos anti-humanos-AAT. Como se muestra en la Fig. 1D, el día 15 todos los ratones con anticuerpos positivos eran hiperglucémicos y todos

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loms ratones con anticuerpos negativos eran normoglucémicos.

Ejemplo 2

Fig. 2A-2D ilustra un método de ejemplo del efecto de AAT sobre infiltrados celulares peritoneales producidos por tioglicolato. A los ratones se administraron por vía intraperitoneal 0,1 ml de solución fisiológica, ALB, AAT o AAT oxidado seguido de 1 ml de solución fisiológica o tioglicolato (ThG, 3% p/v, n = 3 por grupo). El lavado peritoneal se llevó a cabo en grupos separados después de 24 y 48 horas. (A) Población celular total de células lavadas de ratones inyectados con tioglicolato tratados con solución fisiológica (barras abiertas) o tratados con ATT (barras cerradas) (5 mg). ** P < 0,05. (B) Porcentaje de población celular de ratones tratados con solución fisiológica a las 48 horas. ** P < 0,05. (C) Oxidación de AAT. AAT se sometió a radicales oxidativos (ver los métodos). La pérdida de la actividad de serina proteasa de AAT oxidada se evaluó en un ensayo de elastasa. La actividad de elastasa en ausencia de AAT nativa se fijó en el 100% y se calculó el porcentaje de actividad en presencia de AAT nativa y oxidada (n = 3). *** P < 0,002. En la Fig. 2D, se identifican los macrófagos y neutrófilos producidos. Los infiltrados peritoneales de lavados de 48 horas de ALB (6 mg) y tratados con AAT (6 mg), los ratones inyectados con tioglicolato se tiñeron para análisis FACS por anticuerpos específicos. Los macrófagos y neutrófilos se identificaron sobre la base de F4/80 y GR1 versus perfiles de citometría de flujo de dispersión lateral. Arriba, gráficos representativos de análisis FACS (n = 3). Los resultados de FACS cuantificados (n = 3) se representan en la parte de abajo.

AAT inhibe la infiltración celular

Para lograr la posibilidad de que AAT afecte la infiltración celular efectora, se examinaron dos modelos de emigración celular: infiltración peritoneal provocada por tioglicolato (ThG) e infiltración celular debido a inyección intraperitoneal de fibroblastos incompatibles con MHC.

Tal como se muestra en la Fig. 2A, había un incremento progresivo en el recuento de células total a las 24 y 48 horas en ratones inyectados con ThG, mientras que no se observaba un aumento significativo en ratones inyectados con AAT y ThG. A las 48 horas, el recuento celular total en el lavado peritoneal de ratones tratados con AAT era del 50% de aquel de control (Fig. 2B). El recuento de células total en ratones que recibieron control de albúmina era similar al de los ratones tratados con solución salina. Había un efecto dependiente de la dosis en la que se halló que un sexto de la dosis reducía el recuento celular en menor medida de una manera significativa. AAT oxidada, que había perdido su actividad anti-elastasa in vitro (Fig. 2C), no afectó el infiltrado celular a 1 mg (Fig. 2B).

La reducción del recuento celular total se atribuye primariamente a una reducción de la cantidad de neutrófilos (Fig. 2D), identificada por su perfil de dispersión lateral de GR-1 alto/intermedio (SSC). No se observó una mayor diferencia con la infiltración de macrófagos, identificada por su perfil F4/80int, GR-1int, SSC12 int, que es distinto del perfil F4/80 muy alto, GR-1 bajo, SSC alto de macrófagos residentes12 (datos no mostrados).

Ejemplo 3

Fig. 3A-3C ilustra un método de ejemplo del efecto de AAT en infiltrados celulares peritoneales incompatibles con MHC, producidos por fibroblastos NIH-3T3. Los ratones (C57BL/6; H-2b) fueron inyectados i.p. con 0,1 ml de solución salina o AAT (1 mg) seguido por 1 ml de células NIH-3T3 (1107 células en solución salina; H-2d). El lavado peritoneal se realizó diariamente los días 1-5 y las subpoblaciones celulares se identificaron por análisis FACS (n = 3 por tratamiento). (A) Cantidades de células. La cantidad de células en cada subpoblación se calculó a partir de los porcentajes obtenidos por análisis FACS y la cantidad total de células en el infiltrado. * P < 0,05, ** P < 0,01 entre las cantidades de células el mismo día. (B) Análisis representativo FACS. (C) Efecto de AAT sobre la intensidad y la función del infiltrado producida por aloinjerto de islote. Izquierda, tinción de hematoxilina y eosina (H&E) de aloinjertos de islotes del día 7. Una sección de injerto de islote tratado con AAT (marco blanco) se compara con una sección similar de ratón receptor diabético tratado con ALB (protocolo de tratamiento completo, ver la Fig. 1A). La flecha apunta a un borde entre islote e infiltrado circundante. Derecha, inmunohistoquímica (IHC) con anticuerpos antiinsulínicos de injertos de islotes del día 15. Un asección de injerto de islote autólogo (marco blanco) se compara con secciones similares de aloinjertos de ratones receptores tratados con AAT y ALB. R, parénquima renal, G, injerto, C, cápsula renal.

Como se ilustra en la Fig. 3A, la introducción de células alogénicas evocaron un infiltrado celular que consistía en neutrófilos que aparecen tempranamente y macrófagos activados y células CD3+ y NK de tardía aparición (Fig. 3B). Los ratones tratados con AAT exhibieron una reducción de neutrófilos, células CD3+ y NK, el color oscuro es tinción insulínica.

Para evaluar el nivel de infiltración celular en islotes injertados, se removieron los injertos de ratones receptores tratados con AAT y ALB el día 7, se fijaron en paraformaldehído y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Como se representa en la Fig. 3C (izquierda), es demostrable un infiltrado celular sin tener en cuenta el tratamiento con AAT e incluye neutrófilos y linfocitos. Sin embargo, los infiltrados evocados por injertos de ratones receptores tratados con ALB eran más masivos y causan la disrupción de bordes de islotes, en comparación con islotes intactos de ratones receptores de AAT. Para evaluar la función de islote, se removieron los injertos de ratones receptores tratados con

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AAT y ALB el día 15 y la inmunohistoquímica se llevó a cabo con anticuerpos antiinsulínicos, el color oscuro es tinción de insulina. Como se representa en la Fig. 3C (derecha), la producción de insulina se preserva el día 15 en islotes de receptores tratdos con AAT.

Ejemplo 4

Fig. 4A-4H ilustra un método de ejemplo del efecto de AAT en respuestas a islotes. (A-D) Islotes de ratones C57BL/6 se cultivaron en 100 islotes/cavidad, por duplicado. AAT se incubó en las concentraciones indicadas durante 1 hora antes de la adición de IFNγ (5 ng/ml) más IL-1β (10 ng/ml). 72 horas más tarde, los sobrenadantes se recolectaron y se evaluó la viabilidad de islotes. Las respuestas celulares de islotes en ausencia de AAT se fijaron en el 100%. Los datos se combinaron a partir de 3 experimentos individuales, por duplicado. ** P < 0,01, *** P < 0,001 entre islotes tratados con AAT y no tratados. Media ± SEM de a. niveles de nitrito, b. viabilidad celular y c. niveles de MIP-1α.. La línea de puntos representa islotes incubados a 1/30 de la concentración de IFNγ/IL-1β. d. niveles de TNFα. (E) Ensayo de inducción insulínica. Los islotes se incubaron por triplicado (20 islotes/cavidad) en presencia de AAT (0,5 mg/ml) o ALB (0,5 mg/ml) 1 hora antes de la adición de IFNγ (5 ng/ml) más IL-1β (10 ng/ml). 24 horas más tarde, los islotes se transfirieron a una solución de glucosa de 3 mM o 20 mM durante 30 minutos y se midieron los niveles de insulina. El eje vertical representa la relación entre niveles de insulina en ambas concentraciones de glucosa. * P < 0,05 entre islotes tratados con AAT y ALB. (F) Toxicidad de estreptozotocina. Los ratones C57BL/6 se inyectados i.p. con AAT (5 mg) o solución fisiológica, un día antes, el mismo día y un día después de la inyección de estreptozotocina (225 mg/kg) o solución fisiológica (n = 3 por grupo). 48 horas más tarde, se retiraron los páncreas y se identificaron células con contenido de insulina por inmunohistoquímica. Cada imagen representa un islote representativo de un páncreas. Gráfico, media ± SEM de cambio en porcentaje de células que contienen insulina como se determinó manualmente de imágenes de 2 islotes por páncreas (n = 6 por grupo de tratamiento). * P < 0,05. (G) Contenido celular de islotes. Islotes aislados frescos (100 islotes por triplicado) y restos pancreáticos residuales de no islotes se disociaron en suspensiones celulares simples y se tiñeron para análisis FACS con antiCD45-APC o anticuerpo de control de isotipo. Área sombreada, islotes. Área abierta, desechos. (H) Expresión de MHC clase II. Se cultivaron islotes de ratones C57BL/6 (100 islotes/cavidad por duplicado) en presencia de AAT (0,5 mg/ml) 1 hora antes de la adición de IFNγ (5 ng/ml) más IL-1β (10 ng/ml). 24 horas más tarde, los islotes se disociaron en suspensiones celulares simples y doblemente teñidas para análisis FACS con anticuerpos anti-CD45-APC y anti-MHCII-PE o anticuerpos de control de isotipo. Izquierda, Media ± SEM de cambio en porcentaje del islotes no estimulados de control (CT). * P < 0,05 entre islotes tratados con AAT y no tratados. Derecha, análisis representativo FACS; área sombreada, islotes tratados con AAT. Área abierta, islotes estimulados. Los eventos se regulan para CD45+.

AAT modifica la respuesta de los islotes a los mediadores proinflamatorios

Se examinaron diversas respuestas de islotes a IL-1β/IFNγ in vitro. Los islotes expuestos a IL-IL-1β/IFNγ durante 72 horas produce óxido nítrico (NO) de una manera dependiente de la concentración y exhiben pérdida de viabilidad dependiente de NO. Como se muestra en las Figs. 4A y B, en presencia de AAT, se produjo menos NO y se obtuvo mayor viabilidad de islotes. La producción de MIP-1α se redujo en presencia de AAT, en particular cuando se estimula por bajas concentraciones de IL-1β/IFNγ (Fig. 4C). Notablemente, el nivel de TNFα en sobrenadantes se redujo marcadamente por AAT (Fig. 4D). La inducción de insulina se inhibió por IL-1β/IFNγ, pero era intacta en presencia de IL-1β/IFNγ más AAT (Fig. 4E). Para ensayar el efecto de AAT en islotes in vivo, se evaluó la toxicidad de STZ. Se administró AAT (2 mg) un día antes, el mismo día y un día después de la inyección de STZ. La inmunohistoquímica de los páncreas con anticuerpos antiinsulínicos 48 horas después de la inyección de STZ revela más células productoras de insulina en islotes de ratones tratados con AAT más que ALB (26,3% ± 2,6 y 12,8% ± 2,3 células productoras de insulina por islote, respectivamente, Fig. 4f). El contenido de células blancas de islotes recién aislados se evaluó por análisis FACS. Los islotes contienen células CD45+ (Fig. 4G) que también son positivas para los marcadores monocíticos / granulocíticos GR1 y F4/80 (datos no mostrados). Esta población celular respondía a AAT con MHC de clase II de menor superficie (Fig. 4H).

Ejemplo 5

Fig. 5A-5D ilustra el efecto de AAT sobre TNF-α. (A) Los islotes de ratones C57BL/6 se cultivaron (100 islotes/cavidad por triplicado) en presencia de AAT (0,5 mg/ml) o inhibidor de TACE (10 mM) 1 hora antes de la estimulación por IFNγ (5 ng/ml) más IL-1β (10 ng/ml). Izquierda, media ± SEM de cambio en TNFα en sobrenadantes después de 72 horas de incubación. Derecha, media ± SEM de cambio en veces en TNFα de membrana en células de islotes después de 5 horas de incubación, de acuerdo con el análisis FACS. *** P < 0,001 niveles de control (CT) comparados en ausencia de AAT. (B) Análisis representativos FACS de TNFα de membrana en células de islotes estimulados en ausencia (área abierta) o presencia (área sombreada) de AAT. Los eventos se regulan para CD45+. (C) Hiperglicemia inducida por estreptozotocina. Los ratones C57BL/6 se inyectaron i.p. con solución fisiológica (n = 3), AAT (5 mg, n = 3) o TNFα (1 mg/kg, n = 3) o fueron administrados p.o. con inhibidor de TACE (TACEi, 60 mg/kg, n = 6) un día antes de la inyección de STZ (225 mg/kg, i.p.). Posteriormente, AAT y TNFα se inyectaron a diario; inhibidor de TACE se administró dos veces por día. A las 48 horas, se comparan niveles de glucosa medios ± SEM con los de las camadas normales (n = 3). * P < 0,05, ** P < 0,01 en comparación con ratones tratados con solución fisiológica, inyectados con STZ.

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AAT inhibe la liberación de TNFα de membrana

Escisión proteolítica de TNFα de membrana libera TNFα soluble de células activadas por acción de la enzimas convertidora de TNFα (TACE). Los inventores examinaron los niveles de TNFα de membrana en islotes estimulados en presencia de AAT. El efecto de AAT se comparó con el de un inhibidor de TACE. Tanto Bot como inhibidor de TACE redujo los niveles de TNFα en sobrenadantes de islotes expuestos a IL-1β/IFNγ (Fig. 5A, izquierda). En estas condiciones, TNFα de membrana acumulado sobre la superficie celular de células de islotes CD45+ (Fig. 5A, derecha).

Para evaluar la posibilidad de que la protección de islotes se produzca por medio de inhibición de la liberación de TNFα de membrana in vivo, se introdujeron inhibidor de TACE, receptor de p75 TNF (TNF BP) o AAT a ratones antes de la inyección de STZ. A pesar de que todos los ratones desarrollaron hiperglucemia después del día 4, la progresión de la toxicidad de células β se veía significativamente afectada por tratamientos. Como se muestra en la Fig. 5C, el efecto de STZ a las 48 horas se redujo en la presencia de AAT (una reducción del 23,2% ± 2,3 en niveles de glucosa en ayunas en comparación con ratones inyectados con STZ/solución fisiológica). El efecto del inhibidor de TACE y receptor de p75 TNF no rea profundo. De modo similar, el inhibidor de TACE prolongaba la supervivencia del injerto de islotes en una menor extensión que AAT (datos preliminares no mostrados).

Los esplenocitos que se cosecharon 48 horas después de la inyección de ThG produjeron TNFα en cultivo (Fig. 5D). AAT administrado antes de tioglicolato redujo la liberación de TNFα de esplenocitos cultivados. Una tendencia similar se halló con IFNγ (datos no mostrados), lo que significa que la respuesta a ThG tenía efectos que se extienden más allá del compartimiento peritoneal y que el pretratamiento con AAT reducía estos efectos.

Ejemplo 6

Fig. 6A-6D ilustra el efecto de AAT sobre trasplante de aloinjerto de islotes. 6A ilustra el estudio en el transcurso del tiempo después del trasplante de células de islotes. Este ejemplo indica que los ratones tratados mantienen normoglucemia durante un período de 60 días (n = 4), después de retirar la terapia de AAT. Después de retirar la terapia, la normoglucemia duró otros 20 días. 6A ilustra el seguimiento de glucosa. La tinción de insulina positiva en el injerto de islote tratado en el día 85 también se demostró (datos no mostrados). 6B ilustra un infiltrado inmune hallado fuera del área del injerto. 6C ilustra un incremento en la presencia de CD4+ y una reducción comparativa de monocitos y neutrófilos. También se mostró que la vascularización masiva era evidente dentro del injerto (datos no mostrados). Se observó que los injertos de islotes aceptados de larga duración se pueden se pueden liberar de una alorrespuesta inmune, incluso se evaluó después de retiro de la terapia si la terapia había evocado una inmunotolerancia específica de la cepa de islotes del donante. Para ello, los injertos se explantaron por nefrectomía y los receptores originales ahora hiperglucémicos fueron retrasplantados con la misma cepa de islotes de antes (n = 2) o una tercera cepa que no habían considerado antes (n = 2). De acuerdo con una inmunotolerancia específica de cepa establecida, los ratones aceptaron injertos de donantes originales, pero tenían injertos de tercera cepa rechazados agudamente (6D); el mismo donante (izquierda) y un reinjerto de tercer donante (derecha).

Ejemplo 7

Fig. 7A-7E ilustra la producción de AAT por células de islotes y la reflexión de la supervivencia del injerto de islotes. 7A ilustra una expresión en el transcurso del tiempo de mARN de AAT de ratón después de la producción de citoquinas (IL-1β e IFNγ) (izquierda) y a las 8 horas (derecha). Para demostrar la relevancia de alfa1-antitripsina endógena en condiciones fisiológicas, se enfocó el tema de lesión de los islotes durante la pancreatitis. En el modelo de ratón de pancreatitis aguda, los islotes aislados de páncreas que están inflamados expresan alfa1-antitripsina inducible. 7B ilustra un ejemplo de lesión de islote durante la pancreatitis; la histología de islotes normales (arriba izquierda), la histología de los islotes de un páncreas inflamado (arriba derecho) y expresión de AAT de ratón en islotes obtenidos de los páncreas en un modelo de pancreatitis aguda (abajo). Niveles de alfa1-antitripsina durante la pancreatitis (modelo de caeruleína para pancreatitis aguda). Arriba, histología de un islote en un páncreas normal (izquierda) y un islote en un páncreas inflamado (derecha), representativos de n = 3. Abajo, expresión de alfa1antitripsina de ratón en islotes obtenidos de páncreas en un modelo de pancreatitis aguda. El tratamiento de ratones con alfa1-antitripsina exógena dio como resultado la regulación hacia debajo de la expresión de alfa1-antitripsina endógena, así como reducción de los niveles séricos de TNFα (no mostrados).

Para demostrar la relevancia de alfa1-antitripsina endógena en trasplante de islote, se seccionaron aloinjertos de islotes de ratones trasplantados no tratados en los días 1 a 7 después del trasplante (n = 3). Se examinaron respecto de la expresión de alfa1-antitripsina y revelaron un patrón que puede coincidir con la fase de inflamación (días 1-3) seguido de pérdida de masa de islote (días 4-7). 7C ilustra un ejemplo de muestras de aloinjertos de islotes tomadas después del injerto y también se evaluaron los cambios en porcentaje en niveles de mARN de AAT. Se extrajo el ARN total y el mARN para alfa1-antitripsina se evaluó por RT-PCR.

La protección de islotes de la lesión de citoquina se examinó usando alfa1-antitripsina endógena introduciendo oncostatina M, un miembro de la familia de IL-6 que induce la expresión de alfa1-antitripsina en islotes sin causar la muerte de los islotes. Después de 4 días, esos islotes humanos se incubaron con oncostatina M, a los fines de la acumulación de suficiente alfa1-antitripsina, a los islotes se añadió la combinación tóxica de células β de IL-1β/IFNγ.

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Los islotes pretratados que tenían exceso de alfa1-antitripsina se protegieron de la lesión, soportando el concepto de que la alfa1-antitripsina derivada del islote puede participar en la protección del islote durante la inflamación. 7D ilustra un ejemplo de protección de islotes de la lesión de citoquinas con AAT endógena al introducir oncostatina M (un miembro de la familia de interleuquina 6 (IL-6) que induce la expresión de AAT en islotes, oncostatina M y niveles de AAT (arriba izquierda); se evaluaron los niveles de óxido nítrico y viabilidad (arriba derecha). Abajo, islotes humanos expuestos a oncostatina M durante 4 días producen suficiente alfa1-antitripsina para reducir los efectos de IL-1β/IFNγ añadida durante 48 horas más.

Ejemplo 8

En un estudio de ejemplo, se examinó la alfa1-antitripsina en islotes humanos. Fig. 8A-8D ilustra el efecto de AAT sobre islotes humanos. Se examinó la producción de óxido nítrico (8A), la producción de TNF-α (8B), de IL-6 (8C) e IL-8 (8D). 100 islotes humanos por cavidad se sembraron por triplicado y se añadió alfa1-antitripsina (AAT) 2 horas antes de los estímulos. Los sobrenadantes se ensayaron 72 horas más tarde. 3A, óxido nítrico; 3B, TNFα; 3C, IL-6; 3D, IL-8. Los resultados son media ± SEM y son representativos de aislamientos de islotes separados de tres donantes humanos.

MÉTODOS

De acuerdo con la presente invención, se puede emplear biología molecular convencional, microbiología, y técnicas de ADN recombinantes dentro del alcance de la técnica. Estas técnicas se explican por completo en la literatura. Ver, por ejemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.; Animal Cell Culture, R. I. Freshney, ed., 1986).

Ratones hembras C57BL/6 y DBA/2 se adquirieron de Jackson Laboratories.

Inducción de hiperglucemia por estreptozotocina, aislamiento de islotes y trasplante de islotes. En un método de ejemplo, se trataron ratones C57BL/6 de 5-6 semanas de edad por vía intraperitoneal (i. p.) con 225 mg/kg de estreptozotocina (STZ) (Sigma). Se usaron ratones con hiperglucemia establecida al menos 5 días después de la administración de STZ. Los islotes se aislaron de ratones DBA/2 el día del trasplante o 24 horas antes de los ensayos in vitro, por digestión enzimática de páncreas, por medios conocidos en la técnica, con modificaciones menores. Brevemente, los ratones se anestesiaron con cetamina i.p. (50 mg/kg, Vedco Inc.) y xilazina (10 mg/kg, Vedco Inc.). Cada páncreas se infló con 3,5 ml de colagenasa fría (1 mg/ml, tipo XI, Sigma), se seccionaron y se sumergieron durante 40 minutos a 37 °C en baño de agua. Los páncreas se sometieron generosamente a vórtex y se filtraron a través de un tamiz de metal de 500 micrones. El pellet se lavó dos veces en HBSS frío con contenido de 0,5% de BSA (Sigma) y se reconstituyó en RPMI-1640 (Cellgro, Mediatech) suplementado con 10% de FCS (Cellgro), 50 UI/ml de penicilina (Cellgro) y 50 mg/ml de estreptomicina (Cellgro). Los islotes se recolectaron en un filtro celular de nylon de 100 micrones (BD Falcon), se liberaron en una placa de Petri por enjuague con HBSS (Cellgro, Mediatech) y 0,5% de BSA (Sigma) y se colocaron a mano bajo un estereomicroscopio. Para el trasplante, se lavaron bien 450 islotes de FCS residual en HBSS y 0,5% de BSA y se montaron en una punta de 0,2 ml para trasplante inmediato. Para los ensayos in vitro, se dejaron incubar los islotes durante 24 horas a 37 °C. El trasplante de islotes se llevó a cabo en el espacio subcapsular renal izquierdo. Los ratones receptores se anestesiaron, tal como se describió con anterioridad. Se realizó una incisión en la pared abdominal sobre el riñón izquierdo. Los islotes se liberaron en el espacio subcapsular a través de una punción y la abertura se selló por medios conocidos en la técnica. El seguimiento de glucosa en sangre se llevó a cabo 3 veces por semana a partir de gotas de sangre del extremo de la cola usando glucosticks (Roche) (Nanji, S.A. & Shapiro, A.M. Islet transplant in patients with diabetes mellitus: choice of immunosuppression. BioDrugs 18, 315-28 (2004).)

Desarrollo de anticuerpos anti-humanos-AAT en ratones. En otro método de ejemplo, a fin de evocar la producción específica de anticuerpos contra AAT humano, a los ratones se inyectaron i. p. 10 mg de AAT humana por ratón de 20 gramos cuatro veces a intervalos de 1 semana. Se usaron ratones en experimentos 2 meses después de la última administración. La producción de anticuerpos se evaluó antes de llevar a cabo los experimentos de trasplante.

En un ejemplo, el ensayo de los niveles de anticuerpos anti-humanos-AAT se llevó a cabo tal como se describió en la técnica. Brevemente, los sueros de ratón se mantuvieron a -70 °C hasta ensayar los niveles de AAT anti-humano. Las placas se recubrieron con AAT humana o albúmina (2 mg/ml) en PBS a 4 °C durante la noche, luego se lavó y se bloqueó durante 1 hora a 25 °C tal como se describió. El suero de control negativo se usó además del suero de ensayo. El anticuerpo anti-AAT ligado usando solución estándar de sustrato TMB se midió (Sigma).

Células. La línea celular NIH-3T3 (por ejemplo, ATCC) se cultivó. El día de la inoculación peritoneal, se recolectaron frescas 1 x 107 por tripsinización y se lavaron con PBS frío. El pellet se resuspendió en 1 ml de PBS frío para la inyección inmediata.

Experimentos de infiltración. La infiltración peritoneal se produjo por inyección i. p. de 1 ml de tioglicolato autoclavado (3% p/v, Sigma) o células alogénicas (NIH-3T3), junto con 0,1 ml de solución fisiológica, albúmina humana, AAT humana o AAT oxidada. El lavado peritoneal se llevó a cabo a las 24 y 48 horas (tioglicolato) o en los días 1-5 (células alogénicas). Para el lavado, los ratones se anestesiaron por inhalación de isoflurano y se

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