ES2497502T3 - Procedimiento y sistema para el análisis de las reacciones usando un sistema de información - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para determinar si una muestra de ensayo contiene un ácido nucleico diana, comprendiendo el procedimiento: (a) poner en contacto la muestra de ensayo con al menos un agente de amplificación; (b) amplificar al menos una porción del ácido nucleico diana en la muestra; (c) medir señales obtenidas en varios puntos de la reacción de amplificación, siendo las señales proporcionales a la cantidad de ácido nucleico diana presente; (d) determinar una eficacia relacionados con transformada de la reacción de amplificación, en la que la eficacia relacionada con transformada de la reacción de amplificación es una serie de relaciones calculadas a partir de mediciones secuenciales de las señales obtenidas de la amplificación, indexándose cada una de la serie de proporciones a un valor de tiempo o ciclo número; (e) determinar un valor relacionado con la eficacia que es la magnitud máxima de la transformadas relacionadas con la eficacia; y (f) determinar que la muestra de prueba contiene un ácido nucleico diana si el valor de eficacia relacionado para la reacción de amplificación excede un valor seleccionado, realizándose la etapa de determinar si el valor de eficacia relacionado excede un valor seleccionado mediante la comparación de la eficacia valor relacionado con una curva de criterio, donde la curva de criterios se determina por: llevar a cabo una pluralidad de reacciones de amplificación en las muestras negativas, siendo dichas muestras negativas muestras que carecen del ácido nucleico diana; determinar el valor de eficacia relacionado para cada muestra negativa; determinar la media y la desviación estándar de los valores relacionados con la eficacia de las muestras negativas; y determinar que cualquier muestra que tenga cualquier valor relacionado eficacia superior a la media por un múltiplo seleccionado de la desviación estándar de los valores relacionados con la eficacia de las muestras negativas contiene el ácido nucleico diana.
Description
Procedimiento y sistema para el análisis de las reacciones usando un sistema de información
Antecedentes de la intención
1. Campo de la invención
La presente invención se refiere al análisis de los datos de las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos. Más específicamente, la invención se refiere a un sistema de información y un procedimiento para hacer determinaciones con respecto a productos químicos y/o reacciones biológicas. La invención también incluye un procedimiento alternativo para la cuantificación de ácidos nucleicos en una muestra que comprende la amplificación de un ácido nucleico diana y el análisis de los datos obtenidos durante la reacción de amplificación. La invención implica además un sistema de diagnóstico y/o un equipo usando la amplificación de ácido nucleico en tiempo real, incluyendo, pero no limitado a, análisis de PCR.
2. Descripción de la técnica
En muchos campos diferentes industriales, médicos, biológicos y/o de investigación, es deseable determinar la cantidad de un ácido nucleico de interés. Algunos procedimientos de cuantificación de ácidos nucleicos de interés implican la amplificación de los mismos y la observación de una señal proporcional a la cantidad de productos amplificados hecha; otros procedimientos implican la generación de una señal en respuesta a la presencia de un ácido nucleico diana, cuya señal se acumula con la duración de la reacción de amplificación. Como se usa aquí, la reacción de amplificación de ácido nucleico se refiere tanto a la amplificación de una porción de la secuencia de un ácido nucleico diana y la amplificación y la acumulación de una señal indicativa de la presencia de un ácido nucleico diana, con la primera a menudo se prefiere este último. La cuantificación de ácidos nucleicos se hace más difícil o menos precisa o ambos porque los datos capturados durante las reacciones de amplificación son a menudo significativamente oscurecidos por señales que no se generan en respuesta al ácido nucleico diana (es decir, ruido). Por otra parte, los datos capturados por muchos procedimientos de monitoreo pueden estar sujetos a variaciones y falta de reproducibilidad debido a las condiciones que pueden cambiar durante una reacción o cambiar entre las diferentes instancias de una reacción. En vista de lo anterior, existe una necesidad de desarrollar mejores medios de cuantificación de un ácido nucleico. Cuando la cuantificación de ácidos nucleicos está habilitada por reacciones de amplificación, también hay una necesidad de mejorar los procedimientos actuales de detección de reacciones de amplificación sospechosas o no válidas. Queda además una necesidad de mejorar las capacidades actuales de distinguir entre las reacciones de amplificación que no detectan un ácido nucleico diana (es decir, reacciones negativas) a partir de las señales débiles obtenidas a partir de las reacciones de amplificación que sufren de bajas cantidades de un ácido nucleico diana en una muestra, un grado de inhibición de la reacción de amplificación, u otras causas. La presente invención proporciona mejoras en estas áreas, como se describe a continuación.
Una lista no exhaustiva de referencias que proporcionan información de antecedentes en relación con la presente invención de la siguiente manera:
Livak, K. y Schmittgen, T. , Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and 22DDCT Method, METHOD 25: 402-408 (2001) doi: 10. 1006/meth. 2001-1262, Bustin SA, Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR assays, Journal of Molecular Endocrinology 25: 169-193 (2000). Bustin SA, Quantification of mRAN using real-time reverse transcription PCR: trends and problems, J Mol Endocrinol. 29: 23-29 (2002). Aunque los inventores no pueden garantizar que la siguiente página web seguirá estando disponible y no necesariamente aprueba las opiniones expresadas en el mismo, una persona interesada puede referirse a la página web www.wzw.turn.de/gene-quantification/index.shtml para información de referencia útil.
La descripción de cualquier obra, publicaciones, ventas o actividad en cualquier parte en la presente comunicación, incluidas en los documentos presentados con esta solicitud, no está destinada a ser una admisión de ninguna manera que cualquier tipo de trabajo constituye la técnica anterior, a menos que se indique expresamente lo contrario. Del mismo modo, la discusión de cualquier actividad, obra o publicación en este documento no es una admisión de que tal actividad, obra o publicación era conocida en cualquier jurisdicción en particular.
La PCR en tiempo real es una reacción de amplificación utilizada para la cuantificación de ácidos nucleicos diana en una muestra de ensayo. Expertos calificados convencionalmente suelen ver la reacción de amplificación comprendiendo tres fases distintas. En primer lugar, hay una fase de fondo o de línea de base, en la que se amplifica el ácido nucleico diana pero la señal proporcional a la cantidad de la diana de ácido nucleico no se puede detectar debido a que es demasiado pequeña para ser observada en relación con las señales independientes de la diana (a veces llamado "fondo" o "señal de fondo"). A continuación, hay una fase logarítmica en la que la señal crece sustancialmente de forma logarítmica porque la señal es sustancialmente proporcional a la cantidad de ácido nucleico diana en la reacción de amplificación y es mayor que la señal de fondo. Finalmente, el crecimiento de la
señal disminuye durante una fase de "meseta" que refleja menos que amplificación logarítmica del ácido nucleico diana. Como es conocido en la técnica, el tiempo en el que la fase logarítmica cruza un valor umbral, que es un valor algo mayor que el valor de la señal de fondo, está reproduciblemente relacionado con el logaritmo de la concentración del ácido nucleico diana. Este procedimiento de la técnica anterior se conoce genéricamente como el procedimiento Ct, tal vez llamado así por el Ciclo en que la señal cruza el umbral. El análisis Ct es razonablemente reproducible y preciso, pero sufre de algunos inconvenientes, que no necesitan ser discutidos aquí para entender la presente invención.
La patente US No. 6.303.305 o su miembro de la familia EP, a saber, EP 1 041 158 A2, describen un procedimiento de cuantificación de ácidos nucleicos que emplean reacciones de PCR. El procedimiento descrito utiliza la derivada enésima de la curva de crecimiento de una reacción de amplificación de ácido nucleico fluorescente. Este procedimiento evita de manera efectiva la necesidad de realizar una corrección de línea de base, pero no proporciona un procedimiento fiable para determinar muestras reactivas de no reactivas, y no sugiere razonablemente cómo utilizar un cálculo de la derivada enésima para evaluar la validez de los resultados obtenidos. Además, las señales de amplificación de ácidos nucleicos resultantes de cualquier artefacto en el sistema (por ejemplo, la diafonía o solapamiento positivo -definido infra) no se pueden distinguir de las verdaderas respuestas positivas utilizando los procedimientos descritos en el mismo y pueden dar lugar a resultados falsos positivos. Sin embargo, el cálculo de la derivada primera divulgada por la Patente US No. 6.303.305 proporciona un valor relacionado con la eficacia que es útil en el contexto de la presente invención. El experto en la materia puede referirse a la patente US No. 6.303.305 para detalles adicionales relacionados con el cálculo de una primera derivada de una curva de crecimiento de la señal de amplificación de ácido nucleico. La Patente US No. 6.303.305 también describe el cálculo de la primera derivada de una curva de crecimiento de amplificación de ácido nucleico. Sin embargo, la Patente US No. 6.303.305 no describe ni sugiere el uso de este valor de eficacia relacionado descrito en esta descripción (abajo).
La solicitud de patente provisional en copropiedad No. 60/527.389, presentada el 6 de diciembre de 2003, describe un procedimiento para analizar una reacción de amplificación de ácido nucleico en el cual se examina el registro de la señal a partir de una reacción de amplificación para el gradiente o pendiente máximos. Este valor, que para cualquier conjunto de datos corresponde a un punto de un cierto período de tiempo o número de ciclos después de la iniciación de la reacción de amplificación, se llama el MGL de la reacción. El MGL es útil en ciertas realizaciones de la presente invención, particularmente en las que distinguen cualitativamente aquellas muestras que comprenden el ácido nucleico diana poco de aquellas muestras que no contienen el ácido nucleico diana.
El documento EP1 138 784 A2 se refiere a un procedimiento para determinar la eficacia de la amplificación de un ácido nucleico diana que comprende los siguientes pasos: (i) la preparación de una serie de diluciones del ácido nucleico diana, (ii) amplificar el ácido nucleico diana en condiciones de reacción definidas, siendo la amplificación medida en tiempo real (iii) establecer un valor umbral de señal definido, (iv) determinar el número de ciclo en el que se supera el valor umbral de señal para diversas diluciones, (v) determinar la eficacia de amplificación como una función de la cantidad ácido nucleico diana original.
El documento EP 1 138 783 A2 se refiere a un procedimiento para la cuantificación de un ácido nucleico diana en una muestra que comprende las siguientes etapas: (i) determinar la eficacia de amplificación del ácido nucleico diana bajo condiciones de amplificación definidas, (ii) amplificar el ácido nucleico diana contenido en la muestra bajo las mismas condiciones de reacción definidas, (iii) medir la amplificación en tiempo real, (iv) cuantificar la cantidad original de ácido nucleico diana en la muestra mediante la corrección de la cantidad original derivada de la etapa (iii) con la ayuda de la eficacia de la amplificación determinada. La corrección de la eficacia de las reacciones de PCR según EP 1 138 783 A2 puede ser utilizada para la cuantificación absoluta con la ayuda de un estándar externo o interno, así como para la cuantificación relativa en comparación con la expresión de los genes de servicio.
El documento EP 0 686 699 A2 se refiere a un aparato y un procedimiento para determinar una concentración molar desconocida de partida de moléculas de ácidos nucleicos diana en el inicio de una reacción en cadena de polimerasa en una mezcla de reacción de muestra que contiene tampones adecuados, dos tipos complementarios de cebadores de oligonucleótidos, un exceso molar de cuatro tipos de trifosfatos de nucleósidos, una ADN polimerasa, y la concentración molar de partida desconocida de moléculas de ácido nucleico diana.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un procedimiento para determinar si una muestra contiene un ácido nucleico diana de interés como se define en las reivindicaciones 1 y 6.
El procedimiento de este procedimiento de invención comprende poner en contacto una muestra con los reactivos de amplificación o de detección o ambos con el fin de amplificar el ácido nucleico (tal como el término "amplificado" se utiliza en el presente documento). La reacción de amplificación genera señales indicativas de la cantidad de ácido nucleico diana presente en la muestra, que se registran señales en numerosos puntos durante la reacción de amplificación. La señal puede ser medida y registrada como una función del valor del tiempo, o en la alternativa, el número de ciclo.
Se determinan "transformadas relacionadas con la eficacia" adecuadas vistas o calculadas como una función de tiempo para la reacción de amplificación, y el punto en la reacción de amplificación del máximo de las transformadas relacionadas con la eficacia, la magnitud del máximo de las transformadas relacionadas con la eficacia o la anchura (o parámetro similar) de un pico en el gráfico de las transformadas relacionadas con la eficacia como una función de tiempo se pueden utilizar para obtener información acerca de la reacción. Este punto en la reacción representa el punto en el tiempo o el ciclo de amplificación en el que se produce el máximo de transformadas relacionadas con la eficacia. Ventajosamente, el máximo de transformadas relacionadas con la eficacia para una reacción particular, así como la duración y la magnitud de los cambios sustanciales en las transformadas relacionadas con la eficacia calculados, tienen relaciones consistentemente reproducibles con la concentración inicial de un ácido nucleico diana en una muestra, con la fiabilidad de los datos y la información generada por el ensayo, con la presencia o ausencia de un ácido nucleico diana de buena fe, y para otros parámetros de la reacción. Ventajosamente, estas relaciones se mantienen incluso en la presencia de ruido sustancial y variaciones impredecibles en la señal(es) generada por la reacción de amplificación. Tal como se utiliza aquí, el término "máximo", cuando se aplica a las transformadas relacionadas con la eficacia, se pretende incluir el mínimo de las transformadas relacionadas con la eficacia cuando se utiliza el recíproco de las transformadas relacionadas con la eficacia. Uno puede usar la relación inversa, en la que, en el caso de una curva, la curva empezará en un valor de aproximadamente 1 en la región de la línea de base, disminuyendo durante la región de crecimiento, y volviendo aproximadamente a uno en la región de la meseta. El uso de esta transformada permitiría usar la magnitud y la posición de la cubeta en lugar de la magnitud y la posición del pico para el análisis. Esta transformada es implementada de una manera esencialmente equivalente al procedimiento de la relación en la que se emplea el máximo de la transformada relacionada con la eficacia para una reacción particular.
En todas las realizaciones, las señales de la reacción de amplificación se miden a intervalos de tiempo apropiados para la reacción de amplificación durante la reacción de amplificación. Estas señales pueden ser referidas como mediciones basadas en el tiempo o periódicas, de manera que cada medición de la señal generada para una reacción particular se puede expresar como una función del tiempo. En algunas realizaciones, la reacción de amplificación es cíclica (por ejemplo, como en la PCR). Debido a que a menudo los ciclos tienen una duración sustancialmente uniforme, con frecuencia es conveniente sustituir un "número de ciclo" por una medición de tiempo. Por consiguiente, en algunas realizaciones de la presente invención, una región de datos identificada por uno o más procedimientos en un sistema de procesamiento de la información como se describe aquí puede corresponder a un número de ciclo. Sin embargo, algunas reacciones de amplificación cíclicas tienen ciclos de duración no uniforme. Para estas reacciones de amplificación, puede ser preferible para medir el tiempo en las medidas no uniformes. Por ejemplo, el grado teórico de amplificación en una reacción de PCR que tiene ciclos de duración variable estará vinculado más directamente con el número de ciclos realizados en lugar de la duración de la reacción. En consecuencia, el experto en la técnica apreciará fácilmente que las mediciones basadas en el tiempo se pueden escalar fácilmente para reflejar la reacción de amplificación subyacente. Como es conocido en la técnica, a menudo es útil interpolar los datos y resultados entre los números de ciclo, lo que da lugar al concepto de un número de ciclo fraccional "FCN". Del mismo modo, en las reacciones donde las mediciones están basadas en el tiempo, los eventos pueden ser medidos en unidades de tiempo fraccionales.
En otras realizaciones, la invención implica ventajosamente un sistema o procedimiento o ambos para el análisis de una muestra de reacción, tal como una muestra de reacción de PCR, que utiliza un conjunto sustancial de los datos disponibles de cinética de reacción para identificar una región de interés, en lugar de usar un conjunto de datos muy limitado, tal como donde una curva de reacción cruza un umbral.
En ciertas realizaciones, una región identificada puede ser usada para determinar uno o más resultados cualitativos, cuantitativos o resultados de análisis de datos, o ambos. El punto del máximo de la reacción de la transformada relacionada con la eficacia se puede utilizar para determinar la concentración de un ácido nucleico diana en una muestra o para determinar cualitativamente si cualquier analito diana está presente en una muestra de ensayo. Estos y otros valores pueden compararse con cantidades de referencia generalmente de la misma manera que un número de ciclo umbral (Ct) o el número de ciclo umbral fraccionado se puede utilizar en la técnica anterior.
El punto de reacción correspondiente al máximo de la transformadas relacionadas con la eficacia puede entenderse como indicación o siendo derivado de un número de ciclo que se encuentra en un punto relativamente consistente con respecto a la eficacia de la reacción, como en un máximo de eficacia de la reacción o de una región constante relacionada con un máximo de eficacia de la reacción o consistentemente relacionado con alguna otra progresión de reacción. Diferentes procedimientos pueden ser utilizados para determinar un punto de reacción relacionado con un máximo de eficacia de la reacción. Este valor puede comprender valores ajustados de FCN (por ejemplo, FCNMR Adj. y FCNInt. Adj.), como se describe a continuación. En ciertas realizaciones de esta invención, los procedimientos de la invención pueden determinar valores de FCN para múltiples señales de reacción, tales como un objetivo y/o un control y utilizar esos valores en la determinación de parámetros de reacción, incluyendo, pero no limitado a, la cantidad de ácido nucleico diana inicialmente presente en una muestra y la validez de los resultados generados por una reacción de amplificación.
La presente invención puede identificar un valor indicativo de la eficacia de la reacción (a veces, en este documento, hace referencia generalmente como un "valor de eficacia relacionado" (ERV)) en una o más regiones en una curva
de crecimiento de la señal. Un valor de eficacia relacionado específico se denomina como un valor MaxRatio o MR. MaxRatio se refiere a un posible procedimiento para calcular un valor de eficacia relacionado como se discute adicionalmente en el presente documento. Este es un ejemplo de un procedimiento para la determinación de un ERV y ejemplos ilustrativos de este documento que hacen referencia a la MR también debe ser entendida para incluir otros procedimientos adecuados para la determinación de un valor de eficacia relacionado, incluyendo, pero no limitado a, el gradiente máximo del registro de la curva de crecimiento, como se describe en la Solicitud de Patente U. S. en copropiedad No. 60/527.389, presentada en Diciembre 6, 2003, la primera derivada máxima de la señal obtenida de la reacción de amplificación (por ejemplo, como se describe en la Patente U. S. No. 6.303.305), y la diferencia máxima entre dos señales secuenciales obtenidas a partir de la reacción de amplificación. Por lo tanto, esta invención tiene que ver con un procedimiento analítico que identifica dos valores para una curva de reacción:
(1) un valor relacionado con un número de ciclo o el valor de tiempo y (2) un valor que indica un valor de eficacia relacionado. La invención puede utilizar esos dos valores en el análisis de los datos de la reacción realizada usando un sistema de manejo de información y procedimiento de utilización del sistema. Un ejemplo de dos de tales valores son realizaciones específicas de FCN y MR que se discuten a continuación.
Esta invención también está involucrada con un procedimiento y un sistema que utiliza dos valores como se discutió anteriormente que se determinan a partir de una reacción bajo examen para comparar esa reacción con uno o más conjuntos de datos de criterios. Una comparación de criterios se puede utilizar para determinar y/o corregir cualquier resultado y/o cuantificación como se describe aquí. Datos de criterios pueden derivarse mediante la generación de pares de valores relacionados con el número de ciclo valores de eficacia relacionados (por ejemplo, pares FCN-MR) de múltiples reacciones de calibración de cantidad conocida o de concentración conocida o ambos.
Esta invención también implica una o más técnicas para realizar el análisis de la eficacia de los datos de reacción. Este análisis se puede utilizar por separado o en conjunción con el valor de eficacia de análisis de valor relacionado con el número de ciclos relacionados descrito en el presente documento. Un análisis de la eficacia se puede utilizar para encontrar una región de interés para hacer una determinación acerca de los datos de reacción, tales como, por comparación con los conjuntos de datos de calibración, de una manera similar al análisis Ct tal como se entiende en la técnica.
La presente invención también proporciona un procedimiento para analizar una reacción de amplificación de ácido nucleico, en el que se pone en contacto una muestra que contiene un ácido nucleico con agentes de amplificación y se coloca bajo condiciones de amplificación adecuadas para amplificar una porción del ácido nucleico en la muestra. Durante la reacción de amplificación, las señales que son proporcionales a la cantidad del ácido nucleico diana presente se miden periódicamente en un intervalo adecuado. Convenientemente, el intervalo puede corresponder a la duración de un ciclo para aquellas reacciones de amplificación que son cíclicas. Las señales son entonces manipuladas para determinar una transformada relacionada con la eficacia para la reacción de amplificación. Cualquier transformada relacionada con la eficacia adecuada puede ser utilizada para la invención. Transformadas relacionadas con la eficacia preferidas en el contexto de la presente invención incluyen la pendiente de la línea, que puede ser determinada por muchas técnicas, incluyendo, pero no limitado a, cálculos de diferencias en los puntos de datos secuenciales, la determinación de la primera derivada de una línea ajustada a la curva de crecimiento de la señal de reacción, y la determinación del gradiente, pendiente, o derivada del log de la curva de crecimiento (es decir, Log (curva de crecimiento)). Más preferiblemente, la transformada relacionada con la eficacia es la relación de puntos de datos secuenciales, a veces denominado en este documento como la curva de relación. Cuando se conoce la transformada relacionada con la eficacia para la reacción, un gráfico de la transformadas relacionadas con la eficacia como una función del tiempo (expresado preferentemente en las unidades utilizadas para medir la señal) (o manipulación matemática que produce información similar a un gráfico) se puede utilizar para identificar un valor de pico. Sin embargo, no es necesario un gráfico. La anchura del pico en la gama seleccionada de anchos de pico aceptables se puede determinar por cualquier técnica o procedimiento adecuado. Sin embargo, un procedimiento preferido para determinar la anchura de pico aceptable implica analizar estadísticamente el grado de variación en la anchura de los picos obtenidos a partir de las reacciones de amplificación objetivamente normales que son muy similares o incluso idénticos al procedimiento de amplificación se analiza por el procedimiento de esta invención. En la reacción analizada, una muestra de ensayo desconocida se utiliza generalmente en lugar de las muestras utilizadas para caracterizar la reacción de amplificación o un ensayo de analito. Si la anchura del pico de la reacción de amplificación analizada cae dentro del intervalo prescrito de anchos de pico aceptables, la reacción se declara normal; si la anchura del pico de la reacción de amplificación analizada no cae dentro del intervalo prescrito de anchos de pico aceptables, la reacción se identifica como habiendo proporcionado las señales de sub-óptimos, aberrantes, o de otra manera cuestionables. Se evalúa la anchura de la mitad delantera del pico de la transformada relacionada con la eficacia. Esta evaluación es una medición más indulgente de la validez de la reacción de amplificación, y por lo tanto puede ser preferible en algunos casos, pero generalmente no en todos los casos.
La invención implica, además, un sistema de información y/o programa capaz de analizar los datos capturados. Los datos pueden ser capturados como datos de imagen de características observables de los datos, y el sistema de información se pueden integrar con otros componentes para capturar, preparar y/o mostrar datos de la muestra. Los ejemplos representativos de los sistemas en los que la invención se pueden emplear incluyen, pero no se limitan a, BioRad® i-Cycler®, Stratagene® MX4000®, y los sistemas de ABI Prism 7000®. Del mismo modo, la presente invención proporciona un producto de ordenador capaz de ejecutar el procedimiento de esta invención.
Diversas realizaciones de la presente invención proporcionan procedimientos y/o sistemas que pueden ser implementados en un sistema de manejo de información de propósito general o de propósito especial por medio de un lenguaje de programación adecuado, tal como Java, C++, G#, Cobol, C, Pascal, Fortran, PL1, LISP, assembly, etc., y todos los datos o las especificaciones de formato, como HTML, XML, DHTML, TIFF, JPEG, texto delimitado por tabuladores, binario, etc. adecuados para facilitar la discusión, varios comandos de software de ordenador útil en el contexto de la presente invención se ilustran en los comandos de MATLAB®. El software MATLAB es un paquete manipulador de álgebra lineal y visor disponible comercialmente de The Mathworks, Natick, Massachusetts (EE. UU. ). Por supuesto, en cualquier aplicación en particular (como en cualquier proyecto de desarrollo de software), se pueden hacer numerosas decisiones específicas de la implementación para lograr los objetivos específicos de los desarrolladores, tales como el cumplimiento de las limitaciones relacionadas con el sistema y/o las relacionadas con la empresa, que puede variar de una implementación a otra. Además, se apreciará que tal esfuerzo de desarrollo podría ser complejo y consumir mucho tiempo, pero no obstante, sería una empresa de rutina de la ingeniería de software para aquellos de experiencia ordinaria en la técnica que tengan el beneficio de esta descripción.
La invención se entenderá mejor con referencia a los siguientes dibujos y descripciones detalladas. Para mayor claridad, esta discusión se refiere a los dispositivos, procedimientos y conceptos en términos de ejemplos específicos. Sin embargo, la invención y aspectos de la misma pueden tener aplicaciones en una variedad de tipos de dispositivos y sistemas.
Además, es bien sabido que los sistemas y procedimientos de lógica tales como los descritos en el presente documento pueden incluir una variedad de diferentes componentes y funciones diferentes de una manera modular, diferentes realizaciones de la invención pueden incluir diferentes combinaciones de elementos y funciones y pueden agrupar diversas funciones como partes de diversos elementos. Para fines de claridad, la invención se describe en términos de sistemas que incluyen muchos componentes y combinaciones de componentes nuevos y componentes conocidos diferentes. No debe tomarse ninguna inferencia para limitar la invención a las combinaciones que requieren todos los nuevos componentes en cualquier forma de realización ilustrativa de esta invención.
Como se usa aquí, "la invención" debe entenderse que incluye una o más realizaciones específicas de la invención (a menos que se indique explícitamente lo contrario). Muchas variaciones de acuerdo con la invención se desprenderán de las enseñanzas en el presente documento para los expertos normales en la técnica.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un gráfico de los valores de datos discretos de reacción capturados de 43 lecturas (por ejemplo, ciclos) tomadas de una reacción de amplificación de ácido nucleico que se puede utilizar en un procedimiento de análisis de acuerdo con realizaciones de esta invención. La figura 2 es un gráfico que ilustra los datos de reacción capturados que muestran conjuntos de datos diana y de control que se han normalizado de acuerdo con realizaciones de esta invención. La figura 3 es un gráfico que ilustra los datos de reacción que muestran datos diana y de control que han sido escalados según las realizaciones de esta invención. La figura 4 es un gráfico que ilustra los datos capturados de la reacción que muestran los datos diana y de control después del filtrado digital de acuerdo con realizaciones de esta invención. La figura 5 es un gráfico que ilustra los datos capturados de la reacción que muestran los datos diana y de control con valores de pendiente eliminados de acuerdo con realizaciones de esta invención. La figura 6 es un diagrama que ilustra la relación transformada de destino de reacción y los datos de control de acuerdo con realizaciones de esta invención. La figura 7 es un diagrama que ilustra la transformada de relación cambiada de los datos de reacción diana y de control de acuerdo con realizaciones de esta invención. La figura 8 es un gráfico que ilustra los datos interpolados de reacción transformada que muestran datos diana y de control que han sido interpolados de acuerdo con realizaciones de esta invención. La figura 9 es un gráfico que ilustra los datos de reacción interpuestos que muestran la identificación de los puntos de FCN y MR de acuerdo con realizaciones de esta invención. La figura 10 es un diagrama de flujo para realizar una caracterización de los datos de reacción de acuerdo con las realizaciones de esta invención. La figura 11 es un gráfico que ilustra procedimientos para la determinación de datos de criterio de acuerdo con realizaciones de esta invención. La figura 12 es un gráfico que ilustra dos conjuntos de datos de reacción que ilustran cómo las curvas de reacción para la misma concentración de las muestras iniciales pueden variar debido a las diferentes anomalías de reacción. La figura 13 ilustra los cálculos de eficacia de pico para los conjuntos de datos en la figura 12. La figura ilustra la conveniencia de utilizar una transformada de eficacia desplazada de acuerdo con realizaciones específicas de la presente invención. La figura 14 ilustra datos para un ensayo de VIH ejecutado con ocho réplicas de muestras de concentración conocidas a 50, 500, 5.000, 50.000, 500.000 y 5.000.000 copias por mL.
La figura 15 es un gráfico que ilustra cuatro curvas de calibración lineales generadas a partir de los datos de calibración de tres puntos con cuatro valores relacionados al número de ciclos diferentes (por ejemplo, FCN, FCN2, FCNMR Adj., y FCNInt Adj.) de acuerdo con realizaciones de esta invención. La figura 16 compara las concentraciones calculadas con concentraciones conocidas para los datos ilustrados en la figura 14 utilizando las cuatro curvas ilustradas en la figura 15 de acuerdo con realizaciones de esta invención. La figura 17 ilustra los resultados usando una calibración de un punto de acuerdo con realizaciones de esta invención. La figura 18 ilustra los resultados de HBV experimentales usando análisis de MR con una calibración de un punto de acuerdo con realizaciones de esta invención. La figura 19 ilustra los resultados de HBV experimentales usando MR análisis y FCNMR adj. con una calibración de un punto de acuerdo con realizaciones de esta invención. La figura 20 muestra los resultados de HBV experimentales utilizando análisis Ct y una calibración de un punto de acuerdo con realizaciones de esta invención. La figura 21 ilustra los resultados experimentales contra el VIH mediante el análisis de la RM y la calibración de un punto, por ejemplo, utilizando respuestas 103 y 107 copias/mL como calibradores, según realizaciones de esta invención. La figura 22 es un gráfico que ilustra dos tipos de datos de criterios de acuerdo con realizaciones de esta invención en el que la línea horizontal inferior representa datos de criterios adecuados para la diferenciación de las reacciones negativas de las reacciones positivas. La figura 23 es un gráfico que ilustra FCN-MR para datos sobre el VIH de 50 copias/mL a 5.000.000 copias/mL analizados por un paquete de software de estadística para aplicar un ajuste de la curva a los datos y para determinar los intervalos de confianza de acuerdo con realizaciones de esta invención. La figura 24 es un gráfico que ilustra los datos de control interno analizados por un paquete de software de estadística para determinar los intervalos de confianza de acuerdo con realizaciones de esta invención. La figura 25 es un diagrama de flujo que ilustra un árbol de análisis lógico para la evaluación de la validez del ensayo mediante el análisis de pares de valor relacionado con el número de ciclo -valor relacionado con la eficacia tanto para el control interno como para las reacciones de amplificación diana de acuerdo con realizaciones de esta invención. La figura 26 es un diagrama de flujo que ilustra un análisis de árbol lógico para informar de los resultados de destino con la evaluación de los criterios de validez usando los pares de número de ciclo -valor relacionado con la eficacia de valor relacionado de acuerdo con realizaciones de esta invención. La figura 27 ilustra el cálculo de las mediciones de anchura de pico de acuerdo con realizaciones de esta invención. La figura 28 ilustra los resultados experimentales de VIH utilizando la medición completa de anchura de pico de acuerdo con realizaciones de esta invención. La figura 29 ilustra los resultados experimentales de VIH utilizando la medición completa de anchura de pico para identificar una respuesta anormal de acuerdo con realizaciones de esta invención. La figura 30 ilustra un ejemplo de una interfaz de usuario que muestra un gráfico de FCN-MR de acuerdo con realizaciones de esta invención. La figura 31 ilustra un ejemplo de una interfaz de usuario que muestra un gráfico de relación desplazado de acuerdo con realizaciones de esta invención. La figura 32 es un diagrama de bloques que muestra un ejemplo representativo de un dispositivo lógico en el cual pueden realizarse diversos aspectos de la presente invención.
Descripción detallada de la invención
En la presente memoria, la expresión "valor de eficacia relacionado", significa un valor que tiene una relación consistente con la eficacia de una reacción de amplificación. La expresión "transformada relacionada con la eficacia" significa una transformada matemática que implica la respuesta en una reacción de amplificación que se utiliza para determinar un valor relacionado con la eficacia. La expresión "punto de reacción" significa un punto durante una reacción en el que se produce un valor relacionado con la eficacia. El punto de reacción puede ser un punto en el tiempo medido desde el inicio de la reacción. Alternativamente, el punto de reacción puede ser un punto que denota un ciclo medido desde el inicio de la reacción. El término "derivada" significa la pendiente de una curva en un punto dado de la curva.
La presente invención está dirigida al análisis de una muestra que contiene un analito. El analito puede ser un ácido nucleico. En el contexto de la presente invención, se hacen copias de una porción del analito (en adelante "amplificado") de una manera que genera una señal detectable durante la amplificación. La señal es indicativa del progreso de la reacción de amplificación, y preferiblemente se relaciona bien con la cantidad de analito y copias del analito presentes en una muestra de prueba, o se relaciona con la cantidad de copias del analito producidas por la reacción. La amplificación está configurada preferentemente para permitir la acumulación logarítmica del analito diana (por ejemplo, como en una reacción de PCR), y en una realización más preferida, la amplificación es una reacción de PCR en la que los datos se recogen a intervalos de tiempo regulares y/o en una punto particular en cada ciclo de PCR.
Se han desarrollado muchos sistemas que son capaces de amplificar y detectar ácidos nucleicos. Del mismo modo, muchos sistemas emplean amplificación de la señal para permitir la determinación de las cantidades de ácidos nucleicos que de otra manera estarían por debajo de los límites de detección. La presente invención puede utilizar cualquiera de estos sistemas, siempre que una señal indicativa de la presencia de un ácido nucleico o de la amplificación de copias del ácido nucleico se pueda medir de una manera dependiente del tiempo o dependiente del ciclo. Algunos sistemas de detección de ácidos nucleicos preferidos que son útiles en el contexto de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, PCR, LCR, 3SR, NASBA, TMA, y SDA. La reacción en cadena de polimerasa (PCR) es bien conocida en la técnica y se describe esencialmente en Saiki et al., Science 230; 13501354 (1985); Saiki et al., Science 239: 487-491 (1988); Livak et al., Patentes U. S. Nos. 5.538.848; 5.723.591; y 5.876.930, y otras referencias. La PCR también se puede utilizar en conjunción con transcriptasa inversa (RT) y/o ciertas polimerasas de ADN multifuncional para transformar una molécula de ARN en una copia de ADN, permitiendo así el uso de moléculas de ARN como sustratos para la amplificación por PCR por la ADN polimerasa. Myers et al. Biochem. 30: 7661 -7666 (1991)
Reacciones en cadena de ligadura (LCR) son similares a la PCR con la característica distintiva importante que, en la LCR, la ligadura en lugar de la polimerización se utiliza para amplificar secuencias diana. La LCR se describe, entre otros, en Backman et al., Patente Europea 320 308; Landegren et al., Science 241: 1077 (1988); Wu et al., Genomics 4: 560 (1989). En algunas formas avanzadas de LCR, la especificidad se puede aumentar al proporcionar una brecha entre los oligonucleótidos, debiendo dichas brechas ser llenadas por polimerización dependiente de la plantilla. Esto puede ser especialmente ventajoso si los cuatro dNTPS no son necesarios para llenar las brechas entre las sondas de oligonucleótidos y los cuatro dNTPS no se suministran en los reactivos de amplificación. Del mismo modo, la amplificación por círculo rodante (RCA) se describe por Lisby, Mol. Biotechnol. 12 (1): 75-99 (1999)), Hatch et al., Genet. Anal. 15 (2): 35-40 (1999) y otros, y es útil en el contexto de la presente invención.
Reacciones de amplificación isotérmica también son conocidas en la técnica y útiles en el contexto de la presente invención. Ejemplos de reacciones de amplificación isotérmicas incluyen 3SR como se describe por Kwoh et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (EE. UU.) 86: 1173-1177 (1989) y desarrollado adicionalmente en la técnica; como se describe por NASBA Kievits et al., J. Virol. Methods 35: 273-286 (1991) y desarrollado en la técnica; y el procedimiento de desplazamiento de hebra de amplificación (SDA) descrito como inicialmente por Walker et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (EE. UU.) 89: 392-396 (1992) y la Patente U. S. No. 5.270.184 y desarrollado en la técnica.
Por lo tanto, muchos sistemas de amplificación o de detección que sólo requieren que las ganancias de señal indicativa de la cantidad de un ácido nucleico diana se puedan medir de una manera dependiente del tiempo o dependiente del ciclo son útiles en el contexto de la presente invención. Otros sistemas que tienen estas características son conocidos por el experto en la técnica, y aunque no se discutió anteriormente, son útiles en el contexto de la presente invención.
El análisis de los datos recogidos de la reacción de amplificación puede proporcionar respuestas a una o más de las siguientes preguntas:
- (1)
- ¿Se encontró la secuencia diana?
- (2)
- En caso afirmativo, ¿cuál fue el nivel o la cantidad inicial de la secuencia diana?
- (3)
- ¿Es correcto el resultado?
- (4)
- ¿La serie de reacciones funciona correctamente?
- (5)
- ¿Hubo inhibición de la reacción deseada o esperada?
- (6)
- ¿Es aceptable la recuperación de la preparación de la muestra?
- (7)
- ¿La calibración de los datos de referencia, si se utiliza, sigue siendo válido?
De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, una o más de estas preguntas pueden ser contestadas mediante la identificación de una región de interés (por ejemplo, un FCN) y un valor relacionado con la eficacia (por ejemplo, una MR) de una reacción diana y/o de control interno. En otras realizaciones, una o más de estas preguntas pueden ser contestadas mediante la comparación de estos valores con los conjuntos de datos en lo sucesivo denominados datos de criterio, curvas de criterio, y/o conjuntos de datos de criterio. En realizaciones adicionales, una o más de estas preguntas pueden ser contestadas mediante la comparación de estos valores obtenidos para un control interno, por ejemplo, una 2ª reacción de amplificación de control, en la misma mezcla de reacción como sus datos de criterio. En otras realizaciones, una o más de estas preguntas pueden ser contestadas mediante la comparación de estos valores obtenidos para la reacción diana con tales valores obtenidos para una reacción de control interno de la misma mezcla de reacción como sus datos de criterios respectivos.
Por claridad, la invención se ilustrará con referencia a las reacciones de PCR en tiempo real, que son una clase de técnicas de medición y supervisión de alto interés en sistemas automatizados y manuales para la detección y cuantificación de ácidos nucleicos humanos, ácidos nucleicos animales, ácidos nucleicos de plantas, y ácidos nucleicos de patógenos humanos, de animales no humanos, y de plantas. La PCR en tiempo real está también bien adaptada para la detección de agentes de guerras biológicas y otros organismos vivientes o víricos en el entorno. La PCR en tiempo real combina la amplificación de los objetivos de secuencia de ácido nucleico (NA) con la detección sustancialmente simultánea del producto de la amplificación. Opcionalmente, la detección puede estar basada en
sondas fluorescentes o cebadores que son apagados o activados dependiendo de la presencia de un ácido nucleico. La intensidad de la fluorescencia es dependiente de la concentración o cantidad de la secuencia objetivo en una muestra (asumiendo, por supuesto, que la cantidad de objetivo está por encima de un límite mínimo detectable y es menor que cualquier límite de saturación). Esta capacidad de apagado/fluorescencia de la sonda permite que para condiciones del ensayo homogéneas, es decir, todos los reactivos tanto para la amplificación como la detección se añadan juntos en un contenedor de reacción, por ejemplo, un hueco único en una placa de reacción de huecos múltiples. Los sistemas de detección electrónicos, los sistemas basados en la captura de objetivo, y los sistemas y técnicas de análisis de parte alícuota son otras formas de sistemas de detección útiles en el contexto de la presente invención siempre que un sistema determinado acumule datos indicativos de la cantidad de objetivo presente en una muestra durante diversos puntos en el tiempo de una reacción de amplificación diana.
En las reacciones PCR, la cantidad de ácido nucleico objetivo se duplica en cada uno de los ciclos hasta que los reactivos se hacen limitantes o se agotan, o hay una competencia significativa, una fuente inadecuada de reactivos, u otros factores que se acumulan en el curso de una reacción. En los instantes durante los cuales una reacción PCR causa la duplicación (exacta) de la diana en un ciclo particular, se dice que la reacción tiene una eficacia (e) de 1 (por ejemplo e = 1). Después de numerosos ciclos, pueden crearse cantidades detectables de la diana a partir de una cantidad muy pequeña e inicialmente indetectable de diana. Típicamente, los protocolos de ciclos de PCR consisten alrededor de entre 30-50 ciclos de amplificación, pero las reacciones PCR que emplean más o menos ciclos son conocidas en la técnica y son útiles en el contexto de la presente invención.
En las reacciones PCR en tiempo real descritas más adelante para ilustrar la presente invención, la mezcla de reacción incluye un coctel reactivo apropiado de cebadores de oligonucleótidos, sondas de oligonucleótidos fluorescentes con tinte de marcado capaces de apagarse cuando no están ligadas a un ácido nucleico complementario diana, enzimas de amplificación, desoxinucleótidos trifosfatos (dNTP), y reactivos de soporte adicionales. También, puede añadirse a la mezcla una segunda sonda de oligonucleótido fluorescente con tinte de marcado para la detección de una "secuencia de control" que se puede amplificar o "control interno" y un "tinte de referencia", que opcionalmente puede adjuntarse a un oligonucleótido que permanece sin amplificar a través de una serie de reacciones, para una reacción PCR en tiempo real. De este modo, algunos sistemas de PCR en tiempo real usan un mínimo de tres tintes fluorescentes en cada una de las muestras o contenedor de reacción (por ejemplo, un hueco). Sistemas PCR que usan una sonda(s) adicional fluorescente para la detección de un segundo ácido nucleico diana son conocidos en la técnica y son útiles en el contexto de la presente invención.
Los sistemas que representan y visualizan los datos para cada una de las, una o más reacciones posibles (por ejemplo cada hueco en una placa de huecos múltiples) son también útiles en el contexto de la presente invención. Estos sistemas opcionalmente calculan valores que representan la intensidad de fluorescencia de la sonda como una función del tiempo o número de ciclo (CN) o ambos como una representación bidimensional (y respecto a x). De este modo la intensidad de fluorescencia graficada puede representar opcionalmente un cálculo a partir de múltiples tintes (por ejemplo, el tinte de la sonda y/o el tinte de control normalizado por el tinte de referencia) y puede incluir la resta de una señal de fondo calculada. En los sistemas PCR, dicho gráfico se denomina generalmente como una curva de amplificación de PCR y los datos representados pueden denominarse como datos de amplificación de PCR.
En la PCR, el análisis de datos puede hacerse difícil por varios factores. Por consiguiente, pueden realizarse diversas etapas para tener en cuenta estos factores. Por ejemplo, las señales de luz capturadas pueden analizarse para tener en cuenta la imprecisión en la propia detección de la luz. Tal imprecisión puede estar causada por errores
o dificultades en la resolución de la fluorescencia de un tinte individual de entre una pluralidad de tintes en una mezcla de tintes (descrita más adelante como "solapamiento"). De forma similar, alguna parte de la señal puede estar presente (por ejemplo la "señal de fondo") y puede aumentar incluso cuando no hay ninguna diana presente (por ejemplo, "deriva de línea de base"). De este modo, para eliminar la señal de fondo varios técnicas preferiblemente incluyen la deriva de línea de base, el análisis de tendencias y la normalización que se describen en este documento y/o son conocidos en la técnica. Estas técnicas son útiles pero no se requieren en el contexto de la presente invención. (La deriva de la línea de base o la tendencia pueden estar causadas por muchas fuentes, tales como, por ejemplo, la inestabilidad de los tintes, la inestabilidad de la lámpara, las fluctuaciones de temperatura, la alineación óptica, la estabilidad de los sensores, o combinaciones de los anteriores. Debido a estos factores y a otros factores de ruido, los procedimientos automatizados de identificación y corrección de la región de la línea de base son propensos a errores).
Típicamente en la PCR, las respuestas de interés generalmente se determinan a partir de la curva de crecimiento, que arranca de forma característica casi de meseta durante los primeros ciclos de reacción cuando se ha producido una duplicación insuficiente para causar una señal detectable, y a continuación crece exponencialmente hasta que se dan una o más condiciones limitantes de la reacción, tales como cuando la extinción de uno o más reactivos, comienza a influir en la reacción de amplificación o el proceso de detección.
Se han propuesto varios procedimientos y se han usado en investigación y otros escenarios para analizar los datos de una reacción tipo PCR. Típicamente, estos procedimientos intentan detectar cuándo la curva de reacción ha alcanzado un punto particular, generalmente durante un periodo de crecimiento exponencial o casi exponencial de la
señal (también conocido como la "fase logarítmico-lineal"). Aunque sin desear ligarlo a ninguna teoría, los inventores creen que los puntos más tempranos en los que puede observarse la fase logarítmico lineal por encima de la línea de base o señal de fondo proporciona la información más útil acerca de la reacción y que la pendiente de la fase logarítmico lineal es un reflejo de la eficacia de la amplificación. Algunas referencias de la técnica anterior sugieren erróneamente que para que la pendiente sea un indicador de la amplificación real (en lugar de la deriva de la señal), tiene que haber un punto de inflexión, que es el punto sobre la curva de crecimiento donde termina la fase logarítmica lineal. El punto de inflexión puede representar también la mayor tasa de cambio a lo largo de la curva de crecimiento. En algunas reacciones cuando se produce la inhibición, puede producirse el final de la fase de crecimiento exponencial antes de que la señal emerja desde el fondo.
Al ejecutar un análisis de PCR, generalmente es deseable determinar uno o más resultados del ensayo con respecto a la cantidad/concentración inicial de las moléculas diana. Para los propósitos de la discusión, los resultados pueden expresarse por respuestas a al menos una de las cuatro preguntas:
- (1)
- ¿Estaba presente la molécula diana de forma absoluta en la muestra inicial, (es decir un resultado de detección positivo/negativo)?
- (2)
- ¿Cuál fue la cantidad absoluta de la diana inicial presente?
- (3)
- ¿Cuál es la confianza (por ejemplo, expresada a veces como un valor de confianza de que las respuestas a las preguntas 1 ó 2 son correctas)?
- (4)
- ¿Cuál es la cantidad relativa de la diana presente en dos muestras diferentes?
Se han propuesto usar y pueden usarse varios procedimientos en la investigación y otros escenarios para contestar una o más de estas preguntas.
Los datos para las reacciones PCR a menudo se recogen una vez en cada ciclo para cada tinte que se mide (es decir, la fluorescencia determinada) en una reacción. Aunque tales datos son útiles en el contexto de la presente invención, puede realizarse una cuantificación más precisa por la interpolación entre los puntos de datos adquiridos en cada ciclo. De este modo, los datos pueden analizarse para generar "números de ciclo fraccionales", y pueden determinarse puntos de interés para que coincidan con un número de ciclo particular o un punto de reacción entre cualquier par de números de ciclos.
Un problema con los procedimientos que se basan en umbrales, particularmente en el establecimiento de diagnósticos donde es deseable fijar umbrales, es que estos procedimientos pueden ser susceptibles de errores debido a la presencia de factores de ruido, particularmente factores de ruido sistemáticos, tales como, por ejemplo, el "acoplamiento" y el "solapamiento". El acoplamiento puede entenderse en general que ocurre cuando una señal de un ensayo en una localización (tal como un hueco en una placa de huecos múltiples) causa una anomalía en una localización diferente, usualmente adyacente a la localización del ensayo. El solapamiento puede entenderse en general que se produce en situaciones donde se detecta más de una señal o conjunto de datos a partir de la reacción. Aunque los tintes de detección para una reacción se seleccionan para que sean en gran medida independientes entre sí y tengan un espectro de emisión de fluorescencia individual, los espectros de emisión frecuentemente se solapan de modo que el espectro de emisión de un tinte se extenderá dentro del espectro de emisión de un tinte diferente.
Tanto el acoplamiento como el solapamiento pueden tener efecto para aumentar o disminuir la medición calculada de interés. Además, en ambos casos, puede haber situaciones donde la propia curva puede tener una anomalía debido a cualquiera o ambos de estos fenómenos. Los factores de ruido sistemáticos tales como el acoplamiento o el solapamiento pueden ser especialmente difíciles de tratar cuando se realiza una corrección de la línea de base.
En algunos sistemas de la técnica anterior, para detectar señales de bajo nivel para resultados cualitativos o resultados cuantitativos, generalmente se requiere un umbral bajo. Sin embargo, el uso de un umbral bajo causa que la discriminación entre una falsa señal positiva debida al acoplamiento y una correcta señal positiva sea particularmente difícil, debido a que puede causar que la curva de PCR crezca por encima de un umbral de amplificación, sugiriendo por lo tanto que está presente un analito diana. El solapamiento positivo y negativo puede también presentar problemas. El solapamiento positivo puede producir un resultado falso positivo o puede causar estimaciones falsamente elevadas de la cantidad inicial de diana en una muestra, mientras que el solapamiento negativo puede causar estimaciones falsamente disminuidas de la cantidad inicial de diana en una muestra o indicar falsamente la ausencia de una diana en una muestra de prueba.
El procedimiento o sistema de esta invención puede identificar de forma reproducible una región en una curva o datos de reacción, preferiblemente usando un sistema de procesamiento de información, que puede usarse a continuación para proporcionar resultados basados en los datos de la reacción de amplificación. La invención puede identificar esta región independientemente del nivel base de la señal, incluso en presencia de ruido sustancial. La invención puede identificar además un valor que es representativo de la eficacia en esa región. Este valor puede usarse en la determinación de resultados primarios o en el ajuste de resultados o en la determinación de valores de confianza como se describe en este documento o en todo lo anterior.
La invención puede ilustrarse por un examen específico, mostrado más adelante. En este ejemplo se usa un sistema de procesamiento de información para analizar datos que representan la curva de crecimiento de una reacción de amplificación. En la amplificación, se genera un "pico" por una etapa en el análisis de datos. La localización de este pico (medido en unidades de tiempo o en ciclos desde el inicio de la reacción de amplificación) se denomina como el número de ciclo fraccional (FCN) y el valor máximo del pico se denomina como el ERV (valor relacionado con la eficacia). Estos valores pueden usarse en un procedimiento para identificar una región del valor relacionado con la eficacia y para determinar un valor relacionado con la eficacia en este pico. Ambos valores pueden entenderse que están derivados de un procedimiento que analiza la forma de la curva de la reacción independientemente de la intensidad de la señal de amplificación, cuya intensidad de la señal de amplificación puede variar de reacción en reacción y de instrumento en instrumento, a pesar de comenzar con muestras idénticas. La curva de reacción es una representación de una reacción en la que una señal sustancialmente indicativa de la cantidad de diana en una reacción se representa como una función del tiempo o, cuando sea apropiado, en función del número de ciclo. El FCN puede entenderse como que está consistentemente relacionado con un punto de la eficacia de crecimiento máximo de una curva de reacción, y el ERV puede entenderse que está consistentemente relacionado con la eficacia en ese punto.
En algunas realizaciones de esta invención, los procedimientos analíticos pueden emplearse opcionalmente, y ventajosamente, sin usar la corrección de la línea de base. En algunos sistemas y procedimientos de esta invención no se necesita un tinte de referencia.
La presente invención permite la cuantificación objetiva de la cantidad de una diana presente en una muestra de prueba sin necesidad de calcular un umbral subjetivo y variable o un valor de Ct, como se emplea en algunas técnicas de la técnica anterior. Además la invención puede usar información que está disponible para la determinación del grado de inhibición en una reacción analizando la forma de la curva de amplificación de PCR, incluyendo los datos que generalmente se han ignorado generalmente, tal como los datos en ciclos después de un Ct.
Los procedimientos generales para la generación y uso de pares de datos determinados a partir de los datos de la curva de reacción se entenderán de los ejemplos a continuación. Por claridad, estos ejemplos se refieren a un conjunto de datos específicos y funciones específicas para analizar esos datos, aunque la invención no está limitada a los ejemplos tratados.
Ejemplo 1 – Datos Capturados
A modo de ejemplo, un sistema típico de detección de una reacción PCR en tiempo real genera un fichero de datos que almacena la señal generada a partir de uno o más tintes de detección. La figura 1 ilustra una representación de datos de la reacción capturados que pueden usarse en un procedimiento analítico de acuerdo con la presente invención. En este ejemplo, una señal de tinte (DYE1) proporciona los datos de la diana capturados, otra señal de tinte (DYE2) proporciona los datos capturados del control interno, y una señal de tinte adicional (DYE3) proporciona datos de referencia capturados opcionales. Estos datos representan datos de una reacción única, tomados de un fichero de salida normalizada. Este gráfico particular puede entenderse que representa los datos iniciales para los cuales se ha aplicado algún tipo de algoritmo de múltiples componentes. En esta representación, el eje x proporciona una indicación del número de ciclos (por ejemplo, 1 a 45) y el eje y indica la intensidad detectada del tinte, en unidades de fluorescencia relativa. En esta figura, los tres conjuntos diferentes de datos de captura se ilustran como curvas continuas. Sin embargo, los valores de datos capturados reales son generalmente valores de señal discreta capturados en cada número de ciclo. De este modo, un conjunto inicial de datos como se ilustra en la figura 1 puede consistir de tres conjuntos (diana, control y referencia) de los valores discretos adecuados (por ejemplo aproximadamente 50 valores en este caso).
Ejemplo 2 – Normalización
Aunque opcionalmente, la normalización sobre los datos capturados puede realizarse en varios modos diferentes. Un procedimiento involucra dividir los valores de diana y control en cada uno de los ciclos leyendo la correspondiente señal del tinte de referencia. Como alternativa, el divisor puede ser el valor promedio de referencia sobre todos los ciclos o un promedio sobre ciertos ciclos. En otra realización alternativa, el divisor puede ser el promedio del tinte diana o del tinte de control o del tinte diana y del tinte de control sobre una o más de los ciclos más tempranos (línea de base), cuando no se detecta ninguna señal de amplificación. Cualquier procedimiento de normalización conocido puede emplearse en el análisis de los datos. La invención puede usarse con datos que ya se han normalizados por un sistema PCR. La figura 2 es una representación de datos capturados de la reacción mostrando los conjuntos de datos de diana y de control que se han normalizado de acuerdo con la presente invención. En este ejemplo, como resultado de la normalización, la escala del eje y representa un número puro. En este caso, el número está entre aproximadamente 0 y 9. Son conocidos otros procedimientos de normalización en la técnica y pueden convertir este número para que esté entre aproximadamente 0 y 100 o para cualquier otro intervalo deseado.
Debido a que la normalización es opcional, la presente invención puede usarse para analizar datos de reacción sin el uso de la normalización o tinte de referencia. Como alternativa, la señal de la diana o señal de control o ambas pueden usarse para normalización.
Ejemplo 3 – Puesta a escala
La puesta a escala es opcional pero puede realizarse para hacer más fácil la visualización de los datos para un operador humano. La puesta a escala no afecta a los resultados analíticos. La puesta a escala puede realizarse además de la normalización, en ausencia de normalización, o antes o después de la normalización.
Otro procedimiento de puesta a escala involucra dividir cada valor de conjunto de datos por el promedio de los valores durante algunos ciclos más tempranos, generalmente en la región de la línea de base antes de que se detecte cualquier señal de datos positiva. En este ejemplo, las lecturas de 4 hasta 8 se promediaron y se realizó primero la normalización. La figura 3 es una representación de datos de reacción que muestran datos de la diana y de control que se han puesto a escala. En este ejemplo, la puesta a escala fuerza los valores tempranos de la diana y de control a uno, y ya que los valores tempranos son menores que uno, la división fuerza los valores posteriores a números puros ligeramente mayores.
Ejemplo 4 – Filtrado Digital
Pueden aplicarse uno o más procedimientos de filtrado digital a los datos capturados para "limpiar" los conjuntos de datos de señal y mejorar la proporción de señal a ruido. Son conocidos muchos algoritmos de filtrado diferentes. La presente invención puede emplear un filtro de cuatro polos sin ningún cero. Esto elimina el potencial rebasamiento de la señal filtrada. Como ejemplo, esto puede implementarse con la función MATLAB "filtfilt" proporcionada por el Conjunto de Herramientas de Procesamiento de Señal MATLAB, que filtra tanto hacia adelante como hacia atrás para eliminar cualquier hueco de fase (retardos de tiempo). Un ejemplo de parámetros y una llamada de la función MATLAB son como sigue:
b=0,316;
a=[1,0000 -1,0000 0,3750 – 0,625 0,0039];
data (:,:,assay)=filtfilt(b,a,data(:, :, assay));
data (:,:,ic)=filtfilt(b,a,data(:,:,ic));
En este ejemplo, "b" y "a" contienen los coeficientes del filtro "data(:,:,assay)" y "data(:,:,ic)" contienen los datos capturados que pueden haberse o no normalizado, puesto a escala, o ambas cosas. En este caso, los datos filtrados están ambos normalizados y puestos a escala. La figura 4 es una representación de datos de reacción capturados que muestran los datos de la diana y de control después del filtrado digital. Los valores no se cambian por el filtrado digital, pero el conjunto de datos se "suavizan" un poco.
Ejemplo 5 – Eliminación de Pendiente/Alineamiento Base
Puede usarse un procedimiento de eliminación de pendiente opcional para eliminar cualquier pendiente residual que esté presente en la señal de la línea de base temprana antes de que se produzca cualquier señal real detectable. Este procedimiento puede denominarse también como alineamiento base, pero en algunas realizaciones, el desplazamiento no se elimina, sólo la pendiente. De acuerdo con esta invención, para la eliminación de la pendiente, se examinan tanto la señal de la diana (DYE1) como la señal de control (DYE2) simultáneamente. Cualquier señal que aparezca primero contamina el punto de regresión directa, y el procedimiento generalmente vuelve atrás 10 ciclos. Si 10 ciclos hacia atrás es antes el ciclo 5, entonces se usa el ciclo 5 como el punto de regresión inicial para evitar los transitorios de la señal más temprana. Se calcula una línea de regresión lineal usando los datos de señal entre estos puntos y la pendiente de la regresión para cada tinte se resta de la de esa señal de tinte. En este caso, se aplica la eliminación de la pendiente a los datos normalizados, puestos a escala, y filtrados como se ha tratado anteriormente. La figura 5 es una representación de datos de reacción capturados mostrando datos de la diana y de control con los valores de pendiente eliminados. En cada una de estas figuras, estaba presente una pendiente muy pequeña en los ciclos tempranos; por lo tanto, la eliminación de la pendiente no afecta sustancialmente a los valores de los datos capturados.
Ejemplo 6 – Cálculo de la Transformada
Un ejemplo que no es parte de esta invención, pero que es útil para su entendimiento es el procedimiento MaxRatio. En este procedimiento, se calcula la proporción entre mediciones secuenciales, obteniendo por lo tanto una serie de proporciones, cada una de las cuales puede indexarse a un valor del tiempo o un número de ciclo. Existen muchos medios adecuados de calcular estas proporciones, y puede usarse cualquier medio adecuado. El modo más simple de realizar este cálculo de proporciones utiliza la siguiente función:
Proporción(n)
donde n representa el número de ciclo y s(n) representa la señal en el ciclo n. Este cálculo proporciona una curva que comienza aproximadamente en 1 en la región de la línea de base de la respuesta, aumenta a un máximo durante la región de crecimiento, y vuelve aproximadamente a 1 en la región de meseta. La expresión MATLAB que realiza este cálculo de forma eficaz es el siguiente:
Ratio= s(2:end,:)./s(1:end-1:),
donde "s" representa la matriz de respuestas de señal en que cada columna representa una respuesta separada.
La figura 6 muestra un ejemplo de esta transformada de proporciones. Debido a la fluorescencia de fondo intrínseca, la proporción no alcanza 2 como sería de esperar de una reacción PCR si la señal se duplicase. A pesar de todo, la magnitud del pico es independiente de las variaciones de intensidad multiplicativas y es proporcional a la tasa de crecimiento o la eficacia en ese punto. El procedimiento de cálculo de proporciones es simple y se calcula de forma eficaz. Podrían realizarse otros cálculos equivalentes. Un ejemplo involucraría el cálculo de las proporciones directa e inversa y promediándolos a continuación. Puede utilizarse la inversa de la proporción, en cuyo caso la curva empezará en un valor de aproximadamente 1 en la región de la línea de base, disminuirá en la región de crecimiento, y volverá al valor de aproximadamente 1 en la región de meseta. A continuación se usaría la magnitud y la localización de la depresión en lugar de un pico para el análisis. Esta transformada puede implementarse de un modo esencialmente equivalente al procedimiento de la proporción.
Aunque el algoritmo de MaxRatio es utilizable como se ha descrito, es conveniente desplazar la curva restando una constante, por ejemplo, aproximadamente uno (1), de cada punto. Esta proporción proporciona una transformación de la respuesta original, que comienza cerca de cero en la región de la línea de base, crece hasta un pico en la región de crecimiento de la curva, y vuelve a cerca de cero en la región de meseta. Este cálculo de proporción desplazada se describe por la siguiente función:
Proporción(n)= 1 s(n)
La figura 7 muestra la salida de este cálculo de la proporción desplazada. El punto de reacción y la magnitud del pico de la curva de proporciones desplazada se determinan a continuación. El punto de reacción (es decir, la distancia a lo largo del eje x) especifica el valor FCN de la MR y la magnitud especifica el valor de MR relacionado con la eficacia (Máximo de la Proporción).
Ejemplo 7 – Interpolación
Para mejorar la resolución del número de ciclo, puede realizarse una interpolación. Se conocen en la técnica muchos modos de realizar esta operación. Un procedimiento de interpolación en el contexto de la invención es una interpolación segmentaria cúbica, que proporciona una interpolación suave, de modo que incluso la segunda derivada de los conjuntos de datos capturados será continua. La invención puede usarse para interpolar la serie entera de datos. La invención puede usarse para determinar una región de interés y a continuación interpolar sólo en esa región para conseguir una resolución sub-periódica, o sub-ciclo. Un ejemplo de un comando MATLAB para la realización de una interpolación segmentaria cúbica es como sigue:
out = interp1 (x,in,x2,'spline')
donde "x" representa número del periodo (o ciclo) (1, 2, 3…), "in" representa la señal no interpolada en esos ciclos, "x2" representa el vector del periodo de más alta resolución (o ciclo) (1,00, 1,01, 1,02,…) y "out" representa la señal interpolada que corresponde a los ciclos fraccionales en "x2".
La figura 8 es una representación de los datos de reacción capturados que muestran los datos de la diana y de control que se han interpolado para proporcionar continuidad de la función. Como resultado de la interpolación, el número de valores en el conjunto de datos generalmente aumentará sustancialmente, por ejemplo de 43 valores a 4201 valores.
Debería entenderse que las etapas descritas anteriormente pueden realizarse en diferentes órdenes, tal como, por ejemplo, filtrar primero, seguido por el alineamiento de la base antes de la puesta en escala. Sin embargo, si la interpolación se realiza antes del cálculo de la proporción, deberá tenerse cuidado para seleccionar los valores de respuesta interpolada apropiados para el cálculo de la proporción. Es importante que el intervalo entre valores de proporción permanezca igual. De este modo, si se usan ciclos como el periodo de medición, y la interpolación
aumenta la resolución del tiempo a 0,01 ciclos, entonces la proporción desplazada en x=2,35 sería de R=s(3,35)/s(2,35) -1.
Ejemplo 8 – Encontrar Picos para Determinar FCN y ERV (por ejemplo, MR) de Diana y Control
Otra etapa es seleccionar los picos en la serie de datos. Esta operación involucra las etapas de (1) encontrar picos
locales y (2) seleccionar de los picos locales uno o más para un análisis adicional, usando opcionalmente datos de
criterios (definidos infra).
Un algoritmo de encuentro de picos identifica cuando la pendiente de la curva cambia de positiva a negativa, lo que
representa un máximo local. El algoritmo identifica la localización y la magnitud de los picos. Un ejemplo de una
función MATLAB para hacer este cálculo es como sigue:
function (ind, peaks) = findpeaks (y)
% FINPEAKS find peaks in real vector.
% ind = findpeaks (y) finds the indices (ind) which are
% local máxima in the sequence y.
% (ind, peaks) = findpeaks (y) returns the value of the
% peaks at these locations, i.e. peaks=y(ind);
y = y (:)' ;
switch length (y)
case 0
ind = □ ;
case 1
ind = 1;
otherwise
dy = diff (y)
not_plateau_ind = find (dy~=0);
ind = find (([dy (not_plateau_ind) 0] < 0) &
( [0 dy (not_plateau_ind)] >0));
ind = not_plateau_ind (ind);
end
if nargout >1
peaks = y (ind);
end
La figura 9 es un cálculo de la eficacia que muestra los valores de FCN y MR identificados de los tintes de la diana y
de control interno y una curva de criterio de acuerdo con los ejemplos que pueden usarse para entender la presente
invención. Para los datos de la diana, FINDPEAKS localizó un pico en el eje del ciclo x = 19,42 con una amplitud de
0,364. Para los datos de control interno, FINDPEAKS encontró picos en 2,03; 5,29; 7,67; 12,83; 22,70, 37,86, con
magnitudes respectivas de 0,0027; 0,0027; 0,0022; 0,0058; 0,1738; y 0,0222.
Ejemplo 9 – Selección de Picos para Determinar FCN y ERV (por ejemplo, MR) de Diana y Control
En el procedimiento tratado anteriormente, se identifican a menudo varios picos de máximos locales tanto para los datos de diana como los datos de control. Pueden usarse diversos procedimientos para seleccionar cuales de estos picos de máximos locales se usarán para la determinación de FCN y ERV.
Típicamente, y en particular durante las reacciones con buen comportamiento, se selecciona el pico más alto o pico máximo. En muchas situaciones, esta selección proporciona el punto de la reacción más reproducible a partir del cual realizar cálculos adicionales como se trata en este documento. Sin embargo, en algunas situaciones, es preferible un primer pico, o un primer pico por encima de un corte particular o después de un número de ciclos particular. De este modo, en ejemplos particulares, puede emplearse una selección de Pico Máximo o Primer Pico donde el Pico Máximo encuentra el mayor pico en la curva de proporciones desplazada mientras que Primer Pico encuentra el primer pico que es más alto que un algún valor seleccionado.
Una vez que se han determinado los datos de criterios, estos datos pueden usarse también para determinar el pico a seleccionar para la determinación de ERV durante la operación real, particularmente para señales débiles o ruidosas.
En la figura 9, por ejemplo, para los datos DYE2, el algoritmo para encontrar picos encontró seis picos locales, pero el quinto pico fue el pico máximo y fue también el único que estaba por encima de la curva de criterios. De este modo, en este ejemplo, el FCN determinado para DYE2 es 22,70 y la MR determinada para DYE2 es 0,1738.
También puede usarse un dispositivo de información o aparato de sistema para realizar los procedimientos de esta invención. La figura 10 es un diagrama de flujo para realizar una caracterización de los datos de una reacción de
acuerdo con las realizaciones de la presente invención. Detalles adicionales de este procedimiento general se entenderán a partir de la discusión a continuación.
Los procedimientos analíticos descritos en este documento pueden aplicarse a reacciones que contienen concentraciones de diana conocidas o desconocidas. En una realización, se incluirán concentraciones conocidas de ácido nucleico diana en huecos de calibración en una reacción realizada en una placa de reacción de huecos múltiples, y el ERV y el valor del punto de la reacción se usarán a partir de estas muestras de concentración conocidas para realizar la cuantificación. Pueden usarse concentraciones conocidas también para desarrollar los datos de criterios como se describe adicionalmente en este documento.
Ejemplo 10 – Determinación de Curva de Criterios/Conjuntos de Datos de Criterios
En otras realizaciones, los valores relacionados con la eficacia (por ejemplo los valores de MR) pueden representarse como una función de los valores de sus valores de puntos de la reacción (valores FCN) para varios conjuntos de datos de concentración conocida para generar una curva de criterios característica para un ensayo particular. La curva de criterios es característica de una formulación de un ensayo y protocolo de detección particulares y puede usarse para determinar de forma fiable los resultados positivos/negativos, para determinar si un resultado particular debería descartarse como no fiable, para determinar una medida de confianza de un resultado, o cualquier combinación de los anteriores. En general, un par de datos de reacción que quedan bajo una curva de criterios indican muestras no reactivas, o reacciones no funcionales, tales como las reacciones que encuentran una inhibición significativa.
Los datos de criterios pueden usarse para seleccionar qué picos informar o usar en un análisis de reacción, o ambos. Los datos de criterios proporcionan un procedimiento automático y fiable para la discriminación entre resultados negativos (por ejemplo, diana no presente en absoluto) y resultados que muestran baja cantidad de diana.
La figura 11 es un gráfico en el cual se grafica la MR de seis conjuntos de reacciones de concentración conocida (es decir, normalizadores o calibradores) y un conjunto de reacciones negativas, como una función del valor de FCN calculado del valor de MR. Esta representación permite seleccionar una curva de criterios. Una curva de criterios, como se describió anteriormente, es cualquier curva o línea que separa los resultados positivos de los resultados negativos. La curva de criterios se selecciona preferiblemente de modo que está relativamente próxima y por encima de los datos de reacción negativa (en el espacio x-y de la representación). En la figura 11, los pares de datos MR-FCN procedentes de varias muestras de concentraciones conocidas determinadas bajo las mismas o similares condiciones de ensayo se grafican junto con pares de datos MR-FCN de muestras que no contienen la diana del ensayo, cuyas muestras se han denominado también como negativas. Aunque las negativas no deberían exhibir ninguna respuesta de amplificación, el procedimiento analítico si determina un par de datos MR-FCN para estas muestras. Estos datos para las muestras negativas usualmente corresponden a máximos del ruido dirigido sobre la salida de respuesta, que es generalmente una respuesta aleatoria. El valor de MR determinado a partir del ruido es muy bajo y lejos de las respuestas de muestras de concentraciones conocidas. Los pares de MR-FCN para las reacciones negativas pueden agruparse si hay una fuente de ruido sistemático, tal como el solapamiento, en cuyo caso los pares MR-FCN pueden aparecer falsamente como señales de reacción positivas. En la caracterización de la respuesta MR-FCN, de verdaderos positivos frente a verdaderos negativos, puede identificarse una clara región de separación entre estos dos conjuntos de datos, que se representan por la línea o curva discontinua en la figura 11, la curva de criterios. En esta figura, cada círculo representa un par de datos FCN-MR. En este caso, cada uno de los grupos de círculos representa múltiples respuestas en concentraciones conocidas de la diana. Hay ocho réplicas diferentes en seis concentraciones conocidas dentro de este ejemplo. Desde la derecha de la representación, por ejemplo, estas concentraciones conocidas pueden representar concentraciones de 50 copias/mL, 5x102 copias/mL, 5x103 copias/mL, 4x104 copias/mL, 5x105 copias/mL, y 5x106 copias/mL. Estos grupos de datos de criterios pueden usarse para generar una curva de criterios.
Pueden usarse múltiples conjuntos de datos de criterios relativamente simples para proporcionar curvas de criterios características para varios ensayos. Un enfoque útil involucra tomar la media de los valores de MR para el conjunto de respuestas negativas y añadir a este valor un múltiplo de la desviación estándar de los valores de MR para las respuestas negativas. Para el ejemplo mostrado en la figura 11, la curva de criterios se fija como una línea horizontal igual a la media más 10 desviaciones estándar de los valores de MR para las respuestas negativas. El valor de criterio en este ejemplo se calculó que era aproximadamente 0,026. En algunos sistemas, otras consideraciones pueden producir una modificación del valor de criterio (por ejemplo, un valor de FCN-MR) deseable para tener en cuenta potenciales anomalías de señal, tal como, por ejemplo, el acoplamiento o solapamiento positivo. El acoplamiento puede resultar de una señal en un hueco positivo de un instrumento de huecos múltiples que influye en la señal de un hueco diferente. Como mucho se ha observado un acoplamiento de un 2% en ciertos instrumentos. Por esta razón, pueden aumentarse los criterios de modo que eviten la clasificación de muestras negativas verdaderas como muestras positivas. Para los datos de ensayo representados en la figura 11, los valores más altos de MR para los ensayos positivos son aproximadamente 0,5. El dos por ciento de este valor es 0,010. Aumentando el criterio en 0,010 deberían eliminarse los falsos positivos debidos al acoplamiento. Ya que los valores más altos de MR en este ensayo sólo ocurren con muestras de mayor concentración que tienen valores de FCN más
pequeños, los criterios puede aumentarse sólo en los valores de FCN más pequeños, donde es probable que se produzca el acoplamiento. Este conjunto de criterios modificados puede describirse por una serie de pares de datos (Xn, Yn) que describen una curva multielemento. Por ejemplo, la curva de criterios modificada en la figura 11 puede especificarse por el conjunto de datos de criterios:
(X1; Y1) = (1; 0,036)
(X2; Y2) = (20; 0,036)
(X3; Y3) = (25; 0,026)
(X4; Y4) = (45; 0,026)
Como ejemplo adicional, la curva de criterios mostrada en la figura 10 puede especificarse por el conjunto de datos de criterios:
(X1; Y1) = (1; 0,10)
(X2; Y2) = (10; 0,10)
(X3; Y3) = (20; 0,05)
(X4; Y4) = (40; 0,05)
Las curvas de criterios y/o los conjuntos de datos de criterios, incluyendo los conjuntos que tienen formas diferentes
o formas más complejas o ambas, pueden determinarse sin experimentación excesiva. El uso pretendido de la aplicación de PCR llamará a enfoques diferentes para el establecimiento de líneas de criterios. Los especialistas en la técnica apreciarán fácilmente que cuando se desea alta sensibilidad en un ensayo, se usa una línea de criterios baja. Por ejemplo, si un ensayo está diseñado para la diferenciación de variantes de secuencias, tales como una secuencia de consenso de población (es decir, una secuencia de "tipo salvaje") frente a secuencias polimorfas o variantes, (por ejemplo "un polimorfismo nucleótido único"), entonces puede usarse una línea de criterios de un valor más alto, porque usualmente no se requiere la detección de cantidades limitantes de un ácido nucleico diana en la determinación de variantes de secuencias.
El ejemplo particular mostrado en la figura 11 no exhibe solapamiento positivo a partir de la respuesta de la señal de control interna (IC) a la respuesta de la señal de ensayo. Si estuviese presente la respuesta de la señal IC positiva para el solapamiento del ensayo, podría efectuarse una modificación similar para el criterio. Dado que la respuesta de la señal IC debería producirse sólo sobre un estrecho intervalo de valores de FCN, el criterio podría aumentarse sólo en ese intervalo limitado.
Generalmente, como se trata adicionalmente en este documento, una respuesta FCN-MR se determina para muestras de concentración conocidas a través del intervalo de concentración de la diana de interés para definir la respuesta normal. Estudios adicionales en una población de muestras que desafían la reacción de ensayo pueden realizarse para ver cuánto deterioro en MR es aceptable antes de que se comprometa el funcionamiento del ensayo. Estos tipos de análisis de caracterización pueden usarse para establecer datos de criterios o conjuntos de datos de criterios independientemente de la desviación estándar u otras características del ruido o línea de base observada cuando las muestras que no contienen ácido nucleico se tratan bajo condiciones de amplificación.
De acuerdo con otras realizaciones de la invención, los datos de criterios pueden determinarse de formas similares para la determinación de Ct, para el análisis de Ct como se ha hecho en la técnica anterior. Un ensayo particular bajo diseño puede efectuarse varias veces para caracterizar su respuesta típica de MR-FCN. A partir de esta respuesta típica, puede definirse el conjunto de datos de criterios. Sin embargo, a diferencia del análisis de Ct, en FCN-MR, la respuesta es independiente de la intensidad de señal y es fácilmente reproducible, incluso a través de instrumentos de un tipo particular que produce resultados altamente variables con idénticas muestras.
Ejemplo 11 – Región Alternativa de Interés
Se ha visto empíricamente que el valor de FCN de un valor relacionado con la eficacia como se determinó anteriormente puede ajustarse ventajosamente para proporcionar un valor de cuantificación incluso más reproducible. Por ejemplo, la figura 12 es una representación de dos conjuntos de datos de reacción que ilustran cómo pueden variar las curvas de reacción para muestras que tienen la misma concentración inicial debido a diferentes anomalías de la reacción. Esta figura ilustra dos respuestas para muestras que contienen cantidades iguales de un ácido nucleico diana HIV. Sin embargo, en una respuesta, la señal obtenida de la reacción cae de forma temprana debido a una anomalía en la reacción. Esta caída puede causar que el valor de FCN determinado a partir del máximo de la curva de proporciones desplazada varíe sustancialmente entre las dos muestras, como se
ilustra en la figura 13. Sin embargo, la figura también muestra que las dos curvas de gradiente son sustancialmente más similares en los primeros momentos o número de ciclo, que se representan sobre el eje x del gráfico.
De este modo, la invención involucra la determinación de una desviación desde el número de ciclo del valor de eficacia máxima (en este documento denominado como el valor FCN2), que es la localización de otro punto sobre la curva de reacción que puede usarse para análisis como se describe en este documento. En realizaciones adicionales, puede seleccionarse un valor del Umbral del Valor Relacionado con la Eficacia (ERVT) o del Umbral de Proporción (RT) y usarse para determinar una región de números de ciclo de interés. Un valor de ERVT o de RT pueden ser valores determinados automáticamente o empíricamente para un ensayo particular. El valor de RT puede fijarse en un nivel de datos de criterio o próximo que se determina en los ciclos posteriores durante la calibración del ensayo.
Una realización de un procedimiento de esta invención comienza en el valor de FCN sobre la curva de proporciones desplazada y determina un punto de reacción temprano donde la curva cruza el valor de RT. Este punto de reacción se reporta como un valor de FCN2. Se cree que el valor FCN2 proporciona una linealidad mejorada en las muestras que tienen bajo número de copias, en contraste con los valores de FCN para ciertos ensayos, tales como las reacciones donde la formación de productos no específicos reduce la eficacia de la formación de producto en las muestras que tienen bajos números de copias.
La figura 13 ilustra lo deseable de usar un valor de eficacia desplazado. Esta figura muestra las curvas de proporción desplazadas para las respuestas mostradas en la figura 12 y una línea RT en 0,03. Para este ejemplo, los valores de FCN y FCNW se muestran en la Tabla 1
TABLA 1
- Respuesta
- FCN FCN2 MR
- Hueco 41
- 28,81 22,85 0,129
- Hueco 42
- 28,06 22,92 0,097
- Diferencia
- 0,75 0,07 0,032
En este ejemplo, la curva de una respuesta se aplana de forma temprana y difiere en la forma de la curva de la otra respuesta, y la curva de proporciones desplazada muestra una diferencia. El aplanamiento temprano puede causar un pico temprano. En este ejemplo, los valores de FCN2 tienen una coincidencia más estrecha que los valores de FCN. En general se ha encontrado que los valores de FCN y FCN2 son más precisos (menores desviaciones estándar) que los valores de Ct. Aunque estos ejemplos se enfocan en el uso de MR en las realizaciones de FCN y FCN2 de la presente invención, incluyen, pero no están limitadas a, (a) uso de la primera derivada, (b) uso de las diferencias entre puntos de datos periódicos secuenciales, y (c) uso de la pendiente o gradiente del registro de la curva de crecimiento.
Ejemplo 12 – Cuantificación usando el Análisis de MR-FCN
La cuantificación se desea a menudo en diversos tipos de análisis de reacción. En reacciones de PCR, por ejemplo, la cuantificación se refiere generalmente a un análisis de una reacción para estimar una cantidad o concentración de inicio de una diana que tiene una concentración desconocida. La invención involucra procedimientos o sistemas o ambos para el uso de un valor relacionado con la eficacia y un valor del número de ciclo (por ejemplo, el FCN) para realizar una cuantificación. Específicamente, el ERV de una muestra de prueba se compara con uno o más de los ERV de al menos un calibrador, preferiblemente al menos dos calibradores, y opcionalmente 3, 4, 5 ó 6 calibradores, cada uno de los cuales contiene una cantidad conocida de un ácido nucleico diana.
En realizaciones adicionales, la cuantificación puede entenderse generalmente que involucra una o más capturas de datos de calibración y una o más capturas de datos de cuantificación. Los datos de calibración y cuantificación se relacionan usando una asociación de cuantificación o una ecuación.
En la calibración, una asociación entre los datos capturados, o un valor derivado de los datos capturados (tal como un FCN, FCN2, o MR, o combinación de los anteriores), y una o más reacciones de concentración de inicio conocida se usan para establecer uno o más parámetros para una ecuación de cuantificación. Estos parámetros pueden usarse a continuación para determinar las concentraciones de inicio de una o más reacciones desconocidas.
Se conocen diversos procedimientos y técnicas para la realización de la cuantificación y/o calibración en el análisis de una reacción. Por ejemplo, en el establecimiento de diagnósticos de PCR, no es infrecuente analizar muestras de prueba en una placa de reacción de 96 huecos. En cada uno de los 96 huecos de la placa de reacción, algunos huecos se dedican a reacciones de calibración con muestras que tienen una concentración de diana inicial conocida. Los valores de calibración determinados para estas muestras pueden usarse a continuación para cuantificar las muestras de concentración desconocida en el hueco.
Dos tipos generales de procedimientos de calibración se denominan como la calibración de un punto y calibración de curva normalizada (por ejemplo, múltiples puntos). Ejemplos de estos tipos se muestran a continuación. Sin embargo puede usarse cualquier procedimiento de calibración adecuado en el contexto de la presente invención.
Cuando no hay ninguna inhibición o interferencia, la reacción de PCR procede con la secuencia diana mostrando un crecimiento exponencial, de modo que después de N ciclos de replicación, la concentración inicial de la diana se ha amplificado de acuerdo con la siguiente relación:
que también puede expresarse como:
0 NN
donde ConcN representa la concentración de la diana amplificado después de N ciclos de reacción, Conc0 representa la concentración diana inicial antes de la amplificación, N representa el número de ciclo y e representa la eficacia de la amplificación diana.
Se usa el análisis cuantitativo de datos para analizar en tiempo real las curvas de reacción PCR de modo que se determina Conc0 con un grado de precisión aceptable. Los procedimientos de análisis de Ct anteriores intentan determinar un número de ciclo en un punto de la reacción donde ConcN es la misma para todas las reacciones bajo análisis. El valor de FCN determinado por los procedimientos de la invención proporciona una buena estimación para el número de ciclo N para un ensayo en el cual no se ha demostrado ninguna inhibición significativa o degradación de señal sobre el rango dinámico de la concentración de diana de entrada. Puede usarse la siguiente relación de proporcionalidad entre una concentración de partida y el FCN:
(1 e)FCN
donde Conc0(FCN) representa la estimación de la concentración diana inicial determinada usando el valor de FCN como se determina por los procedimientos de esta invención.
En otras palabras, cuanto menor es la concentración de diana de inicio, mayor es el valor de FCN determinado por la reacción PCR. Esta relación puede usarse tanto para datos de calibración como para datos de cuantificación.
Esta relación de proporcionalidad puede expresarse como una equivalencia, tal como
(1 e)FCN
donde K representa una constante de proporcionalidad de calibración.
Para los datos de calibración, Conc0(FCN) representa una concentración conocida, tal como 500.000 copias de ácido nucleico diana/mL; el exponente FCN es el número de ciclo FCN determinado como se ha descrito anteriormente; y e representa el valor de la eficacia para una reacción, con e=1 indicando una duplicación en cada ciclo. Estos factores se combinan para formar una relación para permitir la determinación de la constante de proporcionalidad. La determinación de la constante de proporcionalidad puede realizarse sólo si hay un conocimiento a priori de la eficacia, e, de la reacción de amplificación. Este conocimiento a priori posibilita la calibración de un punto. Para datos de cuantificación, los valores de FCN se determinan para reacciones que involucran muestras que tienen concentraciones desconocidas de diana. Loa valores de FCN se convierten a continuación en valores de concentración por el uso de la ecuación anterior. Si la eficacia, e, no es conocida a priori, entones puede usarse el procedimiento de cuantificación de curva normalizada. En este caso, para los datos de calibración, se amplifican diferentes muestras que tienen diferentes niveles de concentración conocidos, y se determinan los valores de FCN de las muestras. Estos valores de FCN pueden graficarse frente al log (en base 10) de las concentraciones conocidas para describir un log (concentración) frente a una respuesta de FCN. Para un ensayo que no demuestra ninguna inhibición o degradación de la señal significativas sobre el intervalo dinámico de las concentraciones de diana de entrada, esta respuesta está típicamente bien ajustada por una curva lineal. La siguiente ecuación describe la forma de esta curva normalizada:
donde Log10(Conc0(FCN)) representa el log (en base 10) de la concentración inicial, m representa la pendiente de la curva normalizada lineal, y b representa la intercepción de la curva normalizada lineal.
Usando dos o más muestras de calibración de concentración conocida, puede aplicarse una regresión lineal para determinar la pendiente m, y una intercepción b, de la curva normalizada. Para los datos de cuantificación, se determinan los valores de FCN para las reacciones que involucran muestras de prueba de concentración desconocida, cuyos valores se convierten a continuación a valores log (concentración) para uso de la ecuación lineal
5 anterior. Los resultados pueden reportarse ya sea en log (concentración) o en unidades de concentración por la conversión apropiada.
Debería observarse que la ecuación de calibración de un punto se convierte fácilmente a esta forma de curva normalizada lineal:
(1 e)FCN
Log10 (Conc0(FCN) = -log10 (1+e) x FCN + log10 (K). El coeficiente lineal m puede usarse para calcular la eficacia de 15 la reacción PCR particular.
Ejemplo 13 – Ajustes de Cuantificación
Cuando las reacciones PCR están sujetas a inhibición, la intensidad de la señal de PCR en tiempo real resultante
20 puede deprimirse o retrasarse. El efecto de esta degradación de la señal sobre el valor relacionado con la eficacia tal como MR es una reducción en ese valor. Además, el efecto de la degradación de la señal sobre el número de ciclo fraccional es generalmente para identificar el FCN en un número de ciclo más temprano que se esperaría para la reacción inhibida. Estos factores causan que el gráfico de log (concentración) como una función de FCN esté peor descrito por una función de ajuste de curva lineal. Aunque pueden aplicarse funciones de ajuste de curva de orden
25 más alto para una curva normalizada, un ajuste lineal requiere menos niveles de calibración y es más sencillo de calcular.
Algunos de estos problemas pueden resolverse en un análisis de curva normalizado incorporando un ERV o valor de intensidad en las relaciones de cuantificación como se ha tratado anteriormente. De este modo, las ecuaciones
30 anteriores pueden reescribirse:
Conc0(FCNIntensidadAjus )
(1 e)FCN
(1 e)FCN
donde Intensidad representa la intensidad de respuesta (anteriormente fondo) en el valor de FCN determinado, MR representa el valor de MR como se ha descrito anteriormente. Conc0(FCNIntensidad Ajus) representa la estimación de la concentración inicial de diana determinada usando el valor de FCN ajustado, usando el valor de Intensidad y
40 Conc0(FCNMR Ajus) representa la estimación de la concentración inicial de diana determinada usando el valor de FCN ajustado usando el valor de MR.
Estas expresiones aprovechan la relación observada entre la intensidad en el ciclo de FCN seleccionado o la MR determinada en el ciclo de FCN seleccionado, o ambas, y el cambio para el valor de FCN en presencia de inhibición
45 como se ha tratado anteriormente. El efecto neto es que el lado derecho de las expresiones de proporcionalidad anteriores es relativamente insensible a la inhibición y otros factores que afectan a la curva de amplificación de PCR, y por lo tanto, proporcionan una robustez significativa como expresiones para determinación de los valores de concentración de la diana.
50 La siguiente discusión explica además las propiedades y relaciones de FCN, FCNIntensidad Ajus, y FCNMR Ajus. Asumiendo que la eficacia es 1, lo anterior puede simplificarse a:
Conc0(FCN )
12FCN
2FCN
2FCN
Tomando logaritmos en base 2 de las expresiones se obtiene:
Log2(Conc0(FCNIntensidadAjus )) FCN Log2(Intensidad)
10 De los lados de la derecha de las expresiones vienen los valores para la compensación de la intensidad o de MR para ajustar el valor de FCN por medio de las siguientes fórmulas:
Este cálculo proporciona entonces la cuantificación usando valores de FCN ajustados análogos al uso de valores de FCN o valores de Ct. Debería observarse que el uso de estos valores ajustados de FCN proporcionan una robustez
20 significativa para la inhibición y otros factores que afectan a la amplificación de PCR, tales como los valores de Ct utilizados en la determinación de las concentraciones de diana en las muestras desconocidas. El gráfico del Log (concentración) frente a estos valores ajustados de FCN generalmente está bien ajustado por una curva normalizada lineal. De este modo, la presente invención proporciona un procedimiento para la determinación de la cantidad de ácido nucleico diana en una muestra que comprende involucrar las etapas de (a) encontrar el periodo de tiempo o
25 número de ciclo de una reacción de amplificación correspondiente a un máximo de un valor relacionado con la eficacia, preferiblemente de MR, y (b) ajustar ese valor restando el logaritmo de la intensidad o el logaritmo de MR, y
(c) comparar el valor obtenido con los datos de calibración obtenidos usando la misma metodología.
Ejemplo 14 – Calibración de una Curva Normalizada
30 El desarrollo de una curva normalizada de concentraciones conocidas y el uso de la misma para la cuantificación son bien conocidos en la técnica y puede además entenderse del siguiente ejemplo. En un caso típico, varias reacciones de calibración (tales como las de huecos en los cuales las concentraciones iniciales son conocidas) se usan durante cada amplificación o una serie de amplificaciones para realizar la operación de calibración. Un
35 problema que se presenta con el intento de cuantificación de un ácido nucleico diana en una muestra a través de un gran intervalo de concentraciones iniciales posibles es que la cuantificación de bajas cantidades de ácido nucleico diana en cualquier reacción particular se hace más difícil. Por ejemplo, la figura 14 ilustra datos para un ensayo diseñado para cuantificar la cantidad de HIV en las muestras de prueba. Las reacciones se realizaron con ocho réplicas de seis concentraciones conocidas de ácido nucleico diana, que eran 50; 500; 5.000; 50.000; 500.000; y
40 5.000.000 copias por mL. Los datos del ensayo muestran una supresión de señal significativa en las reacciones donde el número de copias es bajo (las curvas más alejadas hacia la derecha). Mientras que la cantidad de las cuatro concentraciones más altas de ácido nucleico diana (conjuntos de curvas a la izquierda) obtuvo resultados precisos con bajos coeficientes de variabilidad, las dos concentraciones más bajas obtuvieron curvas menos precisas. La imprecisión causada por las dificultadas en la cuantificación de bajas concentraciones de ácidos
45 nucleicos diana en ensayos que tienen un intervalo dinámico de 100.000 a 1 o más puede resolverse por los siguientes procedimientos de esta invención.
Debido a que las calibraciones ejecutadas en una placa de reacción son relativamente caras, es convencional recoger un número mínimo aceptable de conjuntos de datos de calibración. Por ejemplo en una implementación, la
50 media de dos replicaciones de cada una de las muestras de 500; 50.000; y 5.000.000 copias/mL se ejecutan junto con los ensayos de diagnóstico, requiriendo por lo tanto quizás seis huecos en una placa de 96 huecos a utilizar para las reacciones de calibración.
Debido a que la relación entre el número de ciclos y el log de la concentración del calibrador es sustancialmente
55 lineal, puede realizarse una regresión lineal entre un logaritmo (por ejemplo, log10) de las concentraciones del calibrador y el número de ciclo. Esta regresión puede realizarse fácilmente mediante el programa Excel y otro software de análisis matemático. La figura 15 ilustra cuatro curvas lineales normalizadas generadas a partir de datos de calibración de tres puntos usando cuatro valores relacionados con el diferente número de ciclos (por ejemplo, FCN, FCN2, FCNMR Ajus., y FCNInt. Ajus.).
En cada una de las ecuaciones de ajuste de curva, el eje x representa los valores del Log10 (Diana) real o de una concentración conocida. De este modo, la resolución para x proporciona una expresión para convertir los valores relacionados con el número de ciclo con el Log10 (Diana) de la concentración de ensayo calculada. Si la respuesta de ensayo no es lineal con el Log (Diana), puede usarse una regresión de orden superior o más compleja, o mayor
5 número de reacciones de calibración, o ambos. En este ejemplo, se determinaron las siguientes ecuaciones:
FCN3,0713*Log10(Conc0) 31,285
FCN MRajus3,2344*Log10(Conc0) 33,271
FCNInt.Ajus. 3,2870*Log10(Conc0) 32,775
15 Ejemplo 15 – Comparación de Cuantificación Usando Diferentes Valores Relacionados con el Número de Ciclo
Para examinar las diferentes características de las calibraciones usando los diferentes valores relacionados con el número de ciclo descritos anteriormente, puede realizarse la cuantificación sobre diversas muestras que tienen 20 concentraciones conocidas, y compararse las concentraciones calculadas con las concentraciones conocidas. En un ejemplo de tal comparación, se usaron las curvas normalizadas que tienen los parámetros generados por encima de los que se usaron para realizar la cuantificación de las respuestas del ensayo mostradas en la figura 14. La media de las concentraciones calculadas de las ocho réplicas en cada concentración conocida se compararon con el valor de la concentración conocida. La figura 16 compara el log10 de los valores de concentración conocidos (eje x) con la
25 media del log10 de cada una de las concentraciones calculadas para las ocho muestras en cada concentración.
Como se indica por la figura 16, las muestras de 50 copias/mL (log (concentración) = 1,7) están ligeramente sobrecuantificadas (es decir, más altas que la concentración real) usando FCN, mientras que la precisión para el procedimiento de FCN (de la MR) a concentraciones más altas es muy buena. FCN2 es más preciso en la 30 concentración más baja, pero algo infra-cuantificada (es decir, más baja que la concentración real), y exhibe menos linealidad y precisión en algunas concentraciones más altas. FCNMR Ajus. se mostró muy precisa y cuantificación lineal a través de todo el intervalo de concentración. FCNInt. Ajus. también mostró una mejora sustancial en la precisión y linealidad en comparación con FCN, excepto por una ligera infra-cuantificación en la concentración más baja. Por consiguiente, los cuatro procedimientos funcionan bien, pero algunos son mejores que otros para
35 situaciones particulares. Por lo tanto el técnico especialista puede seleccionar fácilmente un procedimiento apropiado para cualquier aplicación particular para obtener resultados excelentes.
Ejemplo 16 – Cuantificación Usando la Calibración de Un Punto
40 La calibración de un punto puede usarse para la cuantificación. En este caso, se usaron dos huecos con una concentración de 50.000 copias/mL (Log(4,7)) para calibración. Para calcular la constante de calibración, se usa la
2FCN
siguiente ecuación: K = Conc0 * , donde K representa la constante de calibración, Conc0 representa la concentración conocida del calibrador, FCN representa el número de ciclo fraccional del calibrador, y la eficacia de la reacción, e, como se describió anteriormente, se asume que es 1. Constantes de calibración similares pueden
45 generarse usando las relaciones de proporcionalidad tales como FCN, FCN2, FCNMR Ajus., y FCNInt. Ajus..
En este caso, la constante se generó para dos huecos y se usó el promedio. Una vez generada la constante de calibración, la concentración para cada ensayo se calcula con la siguiente ecuación:
KFCN
50 Conc
FCN
La figura 17 ilustra el resultado de una calibración de un punto.
Como puede verse, los resultados de FCN son elevados en las dos concentraciones más bajas y precisas desde el
55 log (Conc) igual a 3,7 y por encima. FCN2 muestra una precisión mejorada a bajas concentraciones en comparación con FCN, pero infra-cuantifica en el log(Diana) igual a 5,7 y 6,7. FCN-MR ajustado muestra una buena linealidad sobre todo el intervalo con una ligera sobre-cuantificación en las dos concentraciones más bajas. FCN-Intensidad ajustada también muestra buena linealidad con una muy ligera infra-cuantificación en las dos concentraciones más bajas. Por consiguiente, cada una de estas realizaciones funciona bien y los técnicos especialistas pueden
60 seleccionar fácilmente de entre estas opciones.
Como se ha tratado anteriormente, puede usarse un análisis FCN-MR para caracterizar una reacción particular como positiva o negativa o para comparar la reacción con los datos de criterios, o ambas cosas. Estos valores pueden usarse para cuantificar una reacción. Una diversidad de procedimientos de cuantificación puede beneficiarse del análisis de FCN-MR antes que del análisis de Ct.
En una realización, pueden usarse un valor de FCN, un valor de FCN2, o un valor de FCN ajustado del modo que se ha usado un valor de Ct en la técnica anterior. Típicamente, pero no necesariamente, el análisis FCN-ajustado, FCN2-ajustado, o FCN-ajustado pueden aplicarse a diversos conjuntos de datos de calibración para desarrollar por lo tanto curvas de datos de referencia o una ecuación para comparar el resultado de una reacción en la cual la concentración de la diana es desconocida con los resultados de las reacciones en las cuales la concentración de diana es conocida. De este modo, la presente invención puede usarse para desarrollar los datos de referencia y para realizar una comparación en la que se usan dos valores (por ejemplo FCN-MR) para desarrollar datos de referencia y también para realizar una comparación con esos datos.
Aunque los experimentos que usan el procedimiento de MR utilizaron regularmente diferentes etapas de preprocesamiento sobre el conjunto de datos capturados antes del procesamiento del conjunto de datos con una función de proporciones, la mayor parte de estas etapas no se requieren. En particular, los resultados experimentales han indicado que no se requieren la puesta en escala, la normalización por un tinte de referencia, el alineamiento base (tanto la corrección del desplazamiento como de la pendiente), y el filtrado. Sin embargo, se ha encontrado que el filtrado generalmente es deseable ya que mejora el funcionamiento en presencia de ruido. La corrección de pendiente (para la región de la línea de base) se ha encontrado que es deseable ya que mejora ligeramente la discriminación entre muestras que no contienen ácido nucleico diana y las que contienen muy poco ácido nucleico diana o sufren de una inhibición significante de la reacción de amplificación. Generalmente, sin embargo, cuando se usa FCNIntensidad Ajus., es preferible usar una técnica de normalización, tal como, pero sin limitarse a estas, la puesta a escala, o la normalización para un tinte de referencia.
Ejemplo 17 – Algoritmo de MR Aplicado a Datos de HBV Usando una Calibración de Un punto.
Ensayos de HBV de soluciones de control que varían desde 10 copias/reacción hasta 109 copias/reacción y negativas se procesaron sobre un ABI Prism 7000 con seis réplicas en cada concentración. Los datos capturados se procesaron usando sólo un filtro digital. A continuación se calcularon los valores de FCN usando un algoritmo de MR como se ha descrito anteriormente. Se calcularon las concentraciones por medio de una calibración de un punto usando las tres respuestas de 109 copias/reacción como calibrador de referencia.
Incluso sin normalización, puesta a escala, o alineación de base, el resultado de la cuantificación fue muy bueno, con la excepción de una aceptable cantidad de sobre-cuantificación de las muestras de 10 copias/reacción y 100 copias/reacción (es decir, Log (Diana) = muestras 1 y 2). Había una clara distinción entre los ensayos negativos y los ensayos de 10 copias/reacción, sin falsos positivos o falsos negativos. Resultados adicionales indicaron cuando los mismos datos se cuantificaron con análisis de Ct, los ensayos de 10 copias/reacción y 100 copias/reacción también se sobre-cuantificaron ligeramente, y la precisión en todas las concentraciones por encima de 10 copias/reacción es mejor con los análisis de MR. En este caso, los resultados de Ct se normalizaron, se alinearon con la base y se calibraron por medio de una calibración de dos puntos con tres réplicas para cada una de las concentraciones de 103 y 107 copias/reacción.
La figura 19 ilustra un ejemplo de los mismos datos de HBV usando un análisis de MR y con corrección FCNMR Ajus. De nuevo, la cuantificación se realizó por medio de una calibración de un punto con tres respuestas en 109 copias/reacción sin normalización, puesta a escala o alineamiento de base. Como puede verse, la sobrecuantificación de las concentraciones bajas se reduce significativamente, es decir, los resultados cuantitativos se mejoran significativamente.
Ejemplo 18 -Algoritmo de MR Aplicado a Datos de HIV
En este ejemplo, se realizaron ensayos de HIV de una solución de control a concentraciones negativas, de 50 copias/mL, y 100 copias/mL, hasta 106 copias/mL en réplicas de seis. Las respuestas se procesaron por medio del algoritmo de MR usando FCNMR Ajus. con normalización y alineamiento de base. La figura 21 ilustra resultados del ejemplo usando análisis de MR y calibración de dos puntos, por ejemplo usando dos réplicas de respuesta de 102 y 105 copias/mL como calibradores. Hubo una clara diferenciación entre los negativos y ensayos de 50 copias/mL sin falsos positivos ni falsos negativos. Como puede verse, hubo una buena linealidad y precisión.
Ejemplo 19 – Determinación de Validez Usando de Diana y Pares de IC (FCN, MR)
Se ha encontrado que los pares de valores de tiempo de reacción o números de ciclos y los valores relacionados con la eficacia (por ejemplo pares de valores de FCN-MR) pueden proporcionar información valiosa acerca de una reacción de amplificación de ácido nucleico, por ejemplo, una reacción PCR, que puede mejorarse adicionalmente considerando pares de datos tanto para las reacciones de amplificación de control interno como de diana. Aunque los pares para la reacción diana solos aportan información importante acerca de la eficacia de la reacción y pueden
usarse para su comparación con datos de criterios, factores adicionales que surgen en el procesamiento de muestras o en las propias muestras pueden analizarse mejor considerando también los datos de control.
Por ejemplo, en el procesamiento de muestras para su uso en PCR o en otras reacciones de amplificación adecuadas, la muestra puede transportar diversos inhibidores dentro de la reacción, lo cual podría detectarse mediante la evaluación de sólo datos de control. Sin embargo, la recuperación anormal del ácido nucleico diana durante la preparación de la muestra típicamente no se detectaría por el análisis de una simple reacción de amplificación. Además, un ácido nucleico diana puede poseer secuencias polimórficas que podrían mejorar la detección del ácido nucleico diana, por ejemplo, si se usa una sonda que se vincula con una región polimórfica de la secuencia. Las discordancias causadas por la secuencia polimórfica en esa región afectarían a la señal detectada, y, por consiguiente la amplificación puede que no aparezca como anormal o inhibida usando la evaluación de los pares de datos para una simple amplificación. El co-análisis de un control interno junto con el análisis de respuestas de amplificación de diana puede proporcionar una cuantificación precisa de ácido nucleico diana en tales muestras cuando otros procedimientos indicarían típicamente una reacción inválida.
De este modo, pueden usarse juntos pares de valores de tiempo de reacción o número de ciclos y valores relacionados con la eficacia para evaluar la validez de una reacción determinada, tal como en un contendor o hueco determinado. Podría diseñarse la reacción de amplificación de control interno (IC) para que fuese comparable en robustez con la reacción de amplificación de diana, o ligeramente menos robusta. La robustez en este contexto significa la sensibilidad del funcionamiento de la reacción a factores que pueden afectar al recorrido del procesamiento de PCR, tal como la inhibición que resulta de la preparación de la muestra o de las propias muestras,
o para la variabilidad en la transferencia de la mezcla de reacción por la pipeta, tal como transfiriendo cantidades imprecisas de reactivos de amplificación por pipeta.
Ejemplo 20 – Curvas de Datos de Criterios Múltiples
Las curvas de criterios múltiples para los pares de valores del número de ciclo – valor relacionado con la eficacia (por ejemplo, los pares FCN-MR) pueden desarrollarse y pueden tener usos diferentes o niveles de importancia, en particular para el uso con la determinación de la validez. Por ejemplo, puede seleccionarse una primera curva de criterios de modo que sea capaz de discriminar las señales de amplificación reactivas de las respuestas no reactivas. Puede seleccionarse una segunda curva de criterios de modo que sea más restrictiva que la primera, de modo que sería útil en la identificación de respuestas de muestras que conducen a la cuantificación precisa en contraste con las que tienen una inhibición parcial que podrían tener una confianza más baja en la cuantificación. La figura 22 es un gráfico que ilustra dos tipos de datos de criterios, en la que la línea horizontal más inferior representa datos de criterios adecuados para la diferenciación negativa de las reacciones reactivas. El segundo conjunto de líneas representa datos de criterios que indican el intervalo normal para las respuestas de los pares FCN-MR. Estos criterios pueden usarse para distinguir una alta confianza en la cuantificación en contraste con una confianza más baja que podría estar asociada con un valor fuera de este rango debido a una inhibición parcial de la reacción.
Por ejemplo, el primer tipo de datos de criterios que diferencia la reacción de amplificación reactiva de la no reactiva puede denominarse como "datos de criterios de MR". Estos datos actúan como un umbral de corte – las respuestas reactivas tendrán valores de MR que excederán los datos de criterios de MR, mientras que las muestras negativas tendrán valores de MR que no excederán el valor de criterio o la línea de criterio. Los datos de criterios se fijan preferiblemente de modo que el ruido en la señal de respuesta no excede el criterio, ni tendencias tales como el acoplamiento o el solapamiento.
El segundo tipo de datos de criterios se denomina como el intervalo normal de MR. Este intervalo sería el intervalo de valores de MR para un FCN determinado sobre el cual la cuantificación de la muestra es precisa. Si se suprime una respuesta de señal, el valor de MR observado caerá. Como el valor de MR disminuye debido a la inhibición, el valor de FCN puede desplazarse hacia ciclos más tempranos, mientras que el umbral basado en Ct podría desplazarse a ciclos posteriores. El intervalo normal de MR sería el intervalo para valores de MR en un conjunto de datos de criterios para el cual el valor elegido relacionado con el número de ciclo proporcionaría un resultado cuantitativo preciso para la muestra cuando se usa para determinar la concentración de diana en la muestra a partir de la curva normalizada de ensayo.
El "intervalo normal de MR" puede desarrollarse usando un ajuste bivariable de MR por FCN como se entenderá en la técnica. La figura 23, por ejemplo, muestra un gráfico de FCN-MR para datos HIV desde 50 copias/mL hasta
5.000.000 copias/mL. Los datos se analizaron por medio de un paquete de software de estadística (tal como JMP (SAS Institute, Inc.)) para aplicar un ajuste de curva cúbica a los datos. Este ajuste de curva cúbica se representa por la línea continua en medio de la figura. Las curvas superior e inferior discontinuas representan el intervalo de confianza generado usando la opción de análisis individual de intervalos de confianza con un nivel de alfa de 0,001. Las tablas 2A, 2B, y 2C ilustran la entrada de datos de muestras y la salida relacionada con la figura 23.
TABLA 2A
- Resumen de Ajuste
- RCuadrada
- 0,971668
- RCuadrada Ajust.
- 0,969737
- Raíz del Error Cuadrático Medio
- 0,023918
- Media de la Respuesta
- 0,401317
- Observaciones (o Suma Pond.) 48
- Grado de Ajuste de Polinomio = 3 MR = 0,6710196 – 0,0101107 FCN – 0,003987 (FCN – 18.3056)^2 – 0,0004202 (FCN – 18,3056)^3
TABLA 2B Análisis de la Varianza
- Fuente
- DF Suma de Cuadrados Media Cuadrática Proporción F
- Modelo
- 3 0,86331003 0,287770 503,0120
- Error
- 44 0,02517212 0,000572 Prob > F
- C.Total
- 47 0,88848215 < 0,0001
TABLA 2C
- Término
- Estimaciones Error Estándar Proporción t Prob > |t|
- Interceptación
- 0,6710196 0,036617 18,33 < 0,0001
- FCN
- -0,010111 0,002006 -5,04 < 0,0001
- (FCN – 18,3056)^2
- -0,003939 0,000198 -19,92 < 0,0001
- (FCN – 18,3056)^3
- -0,00042 0,000047 -8,93 < 0,0001
10 Un intervalo de confianza derivado estadísticamente, como se muestra, es un enfoque sistemático para determinar qué puntos de datos representan respuestas normales y deberían por lo tanto cuantificarse. Los puntos de datos que caen fuera de este intervalo son excepcionales y preferiblemente se identifican con un operario por un programa de software de modo que puede realizarse una investigación adicional.
15 En realizaciones alternativas, tal curva puede simplificarse, en la forma de uno o más segmentos de línea recta. Esta simplificación puede realizarse en algunos casos por un técnico que está viendo los datos sin procesar o puede deducirse a partir de un intervalo alfa como se ha tratado anteriormente.
20 Un ajuste estadístico similar puede realizarse sobre los datos de control interno (IC). La figura 24, por ejemplo, muestra una representación de MR como una función de FCN para los datos IC, específicamente los datos IC asociados con los datos mostrados en la figura 23. Estos datos pueden usarse para determinar un criterio de IC, que por ejemplo, pueden ser un valor único que está cinco desviaciones estándar por debajo de la media de los valores de MR del IC o puede ser un intervalo o caja de valores, por ejemplo, basado en la media ± 5 desviaciones estándar
25 de los valores de MR y de FCN.
De este modo, la presente invención también proporciona un procedimiento para analizar una reacción de amplificación, comprendiendo el procedimiento el establecimiento de un "corredor de confianza", que es un intervalo de valores seleccionados proporcionado en pares en los cuales el primer valor es un valor relacionado con la 30 eficacia máxima (que es preferiblemente la MR), y el segundo valor es un valor de tiempo o valor del número de ciclo en un punto de la reacción (que opcionalmente puede ser fraccional). El procedimiento comprende además determinar si un valor de eficacia máximo que se produce en cualquier valor del tiempo periódico particular o valor del número de ciclo en un punto de la reacción (que opcionalmente puede ser fraccional) cae dentro del intervalo seleccionado. Si no es así, entonces se indica la investigación adicional, o el descarte de resultados. Puede usarse 35 cualquier procedimiento adecuado para establecer el corredor de confianza seleccionado. Los procedimientos preferidos incluyen el establecimiento del corredor de confianza de aproximadamente 1, 2, 3, 5, 10, o cualquier otro número adecuado de desviaciones estándar desde la media de los datos obtenidos a partir de un conjunto de reacciones utilizadas para caracterizar el ensayo. Otro procedimiento adecuado involucra la modificación del corredor de confianza observando resultados conocidos como aberrantes o discrepantes y la modificación del
40 corredor de confianza para excluir una porción de esos resultados aberrantes o discrepantes en futuros ensayos. El uso del corredor de confianza de la presente invención puede aplicarse a la cuantificación del ácido nucleico diana, el análisis de cualquier estándar, calibradores, controles o combinaciones de los anteriores.
Ejemplo 21 – Análisis de Validez
45 La figura 25 es un diagrama de flujo que ilustra un árbol de análisis lógico para la evaluación de la validez de ensayos mediante el análisis de parejas de números de ciclos (por ejemplo, FCN) frente a ERV (por ejemplo, MR) para ambas reacciones amplificación de control interno y de diana. La figura 26 es un diagrama de flujo que ilustra
un árbol de análisis lógico para reportar los resultados diana con una evaluación de los criterios de validez usando pares de número de ciclo (por ejemplo FCN) frente a ERV (por ejemplo, MR). En los diagramas de flujo FCN se usa para claridad de la ilustración, pero como se observa en otras partes en este documento, pueden usarse otros procedimientos para generar el valor del punto de la reacción, por ejemplo, el procedimiento de Ct, FCN2, FCNMR Ajus., o FCNInt. Ajus., u otro procedimiento adecuado.
De este modo, una comprobación de validez puede proceder opcionalmente como una serie de preguntas relativas al control interno (IC) y/o datos de diana.
En la figura 25, los bloques con forma de flecha de más a la izquierda proporcionan descripciones generales de las etapas del procedimiento. Pueden entenderse detalles del procedimiento adicionales considerando lo siguiente. El procedimiento analiza un par de número de ciclo/ERV tanto de una reacción de diana como de control (IC). Inicialmente, si (1) IC MR está por encima de los datos de criterios de IC MR, y a continuación si (2) IC FCN está dentro del rango normal, y además si (3) IC MR está dentro del rango normal, entonces se confirma la validez de la reacción.
Como se muestra en la figura, un resultado inválido puede caracterizarse o explicarse además considerando una o más características de la MR diana.
La figura 26 ilustra un procedimiento para el análisis de los datos diana para reacciones válidas para caracterizar adicionalmente un resultado válido como indicativo de (1) una muestra de diana no reactiva, (2) una diana con una concentración menor que el límite de detección del ensayo, (3) una diana presente pero con una cuantificación inhibida, posiblemente debido a una discordancia del sub-tipo, o (4) una reacción de diana válida, cuantificable.
De este modo, combinando el análisis basado en dianas múltiples y usando ambos valores del número de ciclos y el relacionado con la eficacia, puede distinguirse una muestra inhibida de una muestra que sufre de una recuperación pobre del ácido nucleico durante la preparación de la muestra. El análisis hace uso del conocimiento preestablecido del ensayo que está contenido en los datos de criterios de control interno y diana.
Ejemplo 22 – Determinación de la Validez Usando el Ancho de Pico
En contraste con el análisis convencional de Ct en la técnica anterior, que sólo presenta un valor único describiendo una respuesta de amplificación, un análisis de un valor relacionado con la eficacia (y preferiblemente un análisis de MR) puede proporcionar una curva de transformada relacionada con la eficacia con datos correspondientes al valor del tiempo o el valor del número de ciclos de toda la reacción de amplificación o cualquier porción de la misma. Se ha descubierto que dentro de una formulación del ensayo específico, las respuestas normales del ensayo generan curvas de transformadas relacionadas con la eficacia altamente reproducibles. Una característica en particular es el ancho del pico de la curva de transformada relacionada con la eficacia. Se ha encontrado que el ancho del pico de la transformada relacionada con la eficacia, por ejemplo, como se define por su ancho en la mitad de la altura máxima, varía muy poco incluso cuando la magnitud de la intensidad de la fluorescencia varía enormemente.
Cualquier procedimiento adecuado puede usarse para determinar el ancho del pico del valor relacionado con la eficacia. La figura 27 representa un procedimiento adecuado para la determinación del ancho de un pico del valor relacionado con la eficacia. En la figura 27, el ancho del pico total es el ancho en ciclos del pico en su nivel mitad del máximo. Las respuestas de HIV en la figura 14, muestran la fluorescencia normalizada para muestras de concentración más alta en aproximadamente 8, mientras que la fluorescencia normalizada para las muestras de baja concentración es tan baja como aproximadamente 1. Usando el procedimiento de proporciones desplazadas para calcular una transformada relacionada con la eficacia para cada reacción de amplificación y calculando el ancho del pico total proporciona los resultados mostrados en la figura 28. Incluso con un cambio de ocho duplicaciones en la intensidad de la fluorescencia final, los anchos de pico se conservan sorprendentemente dentro de un intervalo estrecho. Por consiguiente la presente invención proporciona criterios de validez de la reacción de amplificación, en los que una reacción de amplificación se considera válida cuando el ancho del pico de un valor relacionado con la eficacia está contenido dentro de un intervalo seleccionado característico de la reacción de amplificación. En la figura 28, las líneas horizontales discontinuas en tipo grueso representan la media de las mediciones del ancho más y menos 10 desviaciones estándar. Las mediciones de ancho que no están dentro del intervalo de aproximadamente 5,5 y 8,0 (como se muestra en la figura 28) se consideran inválidas o al menos sospechosas. Los técnicos especialistas pueden variar fácilmente los parámetros describiendo el intervalo de aceptación, dependiendo de los requisitos de un ensayo particular y sin experimentación excesiva.
Los anchos de los picos pueden usarse para detectar una respuesta de ensayo anormal. El cálculo del ancho de pico total se aplicó a los datos del ensayo que contenía una respuesta anormal mostrada en la figura 12. Los resultados se presentan en la figura 29. Como puede verse, las respuestas normales para este conjunto de datos producen anchos de todo el pico entre aproximadamente 6 y 9 ciclos mientras que el ancho de pico total del hueco 42 es de 17,42. Por consiguiente, la reacción de amplificación del hueco 42 es anormal y se ignora.
El cálculo del ancho de pico total estará afectado por las variaciones anormales en la respuesta de amplificación que se producen tanto antes como después del valor del punto de reacción (por ejemplo, el FCN) del valor relacionado con la eficacia. Las variaciones anormales que se producen después del valor del punto de reacción del valor relacionado con la eficacia no se consideran para una prueba de validez del ensayo, porque no pueden afectar la cuantificación del ensayo por el procedimiento MR. Esta opción puede conseguirse fácilmente usando el cálculo del ancho de medio pico ilustrado en la figura 27 o su equivalente. En el ejemplo ilustrado, sólo se usa el ancho en unidades periódicas de tiempo desde aproximadamente la mitad del máximo de la transformada relacionada con la eficacia hasta aproximadamente el valor del punto de reacción del valor relacionado con la eficacia máxima. Por supuesto, otros procedimientos adecuados para la medición de los anchos de pico y anchos de mitad de pico se conocen en la técnica.
Ejemplo 23 – Realizaciones de Software
Los sistemas de esta invención pueden incorporarse en una multiplicidad de productos de ordenador adecuados o instrumentos de información. Algunos detalles de una implementación de software de MR se proporcionan a continuación. Las descripciones de la interfaz específica de usuario y las ilustraciones se toman sólo para ilustrar realizaciones específicas y puede usarse cualquiera de varios procedimientos de interfaz de usuario diferentes conocidos en la técnica de procesamiento de información en los sistemas de realización de esta invención. La invención puede usarse también en sistemas donde se programan virtualmente todas las opciones descritas más adelante, calculadas, o proporcionadas por un sistema de información, y consecuentemente, proporcionan pocas o ninguna opción de la interfaz de usuario. En algunos casos, se describen detalles y/u opciones de un sistema prototipo para propósitos de ejemplificación; muchas de estas opciones y/o detalles puede que no sean relevantes o estén disponibles para un sistema de producción.
Además, las realizaciones software pueden incluir diversas funcionalidades, tales como, por ejemplo, el procesamiento de reacciones con una o dos reacciones diana, o una o más reacciones de control interno, o datos de referencia, o combinaciones de las anteriores. Un sistema de software adecuado para su uso en esta invención puede proporcionar cualquier número de ficheros normalizados de manejo de funciones tales como abrir, cerrar, imprimir, almacenar, etc.
La figura 30 ilustra una interfaz de usuario para el procesamiento de datos de PCR de acuerdo con esta invención. En esta interfaz, la selección de los tintes apropiados correspondientes al ensayo diana, el control interno, y las respuestas de referencia se seleccionan de listas de ventanas emergentes en la porción superior izquierda de la ventana. Las etiquetas para la selección de diferentes opciones de vistas se posicionan en el medio de la ventana y están dispuestas horizontalmente. La figura 30 muestra que se ha seleccionado la etiqueta que presenta la representación de MR-FCN. La figura 31 ilustra una interfaz de usuario que muestra los mismos datos para el hueco 1, pero que representa la curva de proporciones desplazada. Otras etiquetas permiten ver los datos de la fluorescencia sin elaborar, la fluorescencia normalizada, y los datos de la línea de base para todas las respuestas. Además, una etiqueta permite la inspección de cada respuesta individualmente. Los campos de la derecha de la representación muestran los valores de respuesta calculados tales como MR, FCN, Ct, y la desviación estándar de la región de la línea de base. Por debajo de estos valores calculados están los botones de selección que permiten al usuario representar bien los datos del ensayo o los datos de control interno.
Realización en una Aplicación de Información Programada
La figura 32 es un diagrama de bloques que muestra un ejemplo de un dispositivo lógico en el cual pueden realizarse diversos aspectos de la presente invención. Como se entenderá de las enseñanzas proporcionadas en este documento, la invención puede implementarse en hardware o software o ambos. En algunas realizaciones, pueden implementarse diferentes aspectos de la invención bien en la lógica del lado de cliente o la lógica del lado del servidor. Además la invención o componentes de la misma pueden implementarse en un componente de programa de medios fijos que contiene instrucciones lógicas o datos, o ambos, que cuando se cargan en un dispositivo de computación configurado apropiadamente puede causar que el dispositivo funcione de acuerdo con la invención. El componente de medios fijos que contiene instrucciones lógicas puede suministrarse al espectador sobre un medio fijo para la carga física dentro del ordenador del observador o el medio fijo que contiene las instrucciones lógicas puede residir sobre un servidor remoto al que puede tener acceso el observador a través de un medio de comunicaciones para descargar el componente de programa.
La figura 32 muestra un instrumento de información o dispositivo digital 700 que puede usarse como un aparato lógico para realizar operaciones lógicas con respecto a la representación o análisis de imágenes, o ambos, como se describe en este documento. Tal dispositivo puede realizarse como un sistema de ordenador de propósito general o una estación de trabajo que ejecuta instrucciones lógicas a realizar de acuerdo con las diversas realizaciones de la presente invención. Tal dispositivo puede también adaptarse y/o especializarse para laboratorios o hardware científico que integran el procesamiento lógico dentro de una máquina para la realización de diversas operaciones de manejo de muestras. En general, los componentes de procesamiento lógico de un dispositivo de acuerdo con la presente invención pueden leer instrucciones del medio 717, o el puerto de red 719 o ambos. La unidad de procesamiento central puede conectarse opcionalmente al servidor 720 que tiene un medio fijo 722. El aparato 720
puede después de esto usar esas instrucciones para dirigir acciones o realizar análisis como se describe en este documento. Un tipo de aparato lógico que puede realizar la invención es un sistema de ordenador como el ilustrado en 700, que contiene una CPU 707, dispositivos de entrada opcionales 709 y 711, un medio de almacenamiento 715, por ejemplo, unidades de disco, y un monitor opcional 705. Los medios fijos 717, o los medios fijos 722 sobre el puerto 719, pueden usarse para programar tal sistema y pueden representar un medio óptico de tipo disco o magnético, una cinta magnética, memoria dinámica o estática de estado sólido, etc. La invención puede también realizarse en todo o en parte como software grabado sobre este medio fijo. El puerto de comunicaciones 719 también puede usarse para recibir inicialmente instrucciones que se usan para programar tal sistema y representa cualquier tipo de conexión de comunicaciones.
La figura 32 muestra componentes adicionales que pueden ser parte de un sistema de diagnóstico. Estos componentes incluyen un espectador o detector 750 o microscopio, manejador de muestras 755, u otra fuente de luz UV 760 y filtros 765, y una cámara de CCD o dispositivo de captura 780 para capturar datos de señal. Estos componentes adicionales pueden ser componentes de un sistema único que incluye análisis lógico y/o de control. Estos dispositivos pueden también ser esencialmente dispositivos independientes que están en comunicación digital con un instrumento de información tal como 700 a través de una red, bus, comunicación inalámbrica, etc. como se entenderá en la técnica. Los componentes de tal sistema pueden tener cualquier configuración física y/o apariencia convenientes y pueden combinarse en un sistema integrado único. De este modo, los componentes individuales mostrados en la figura 42 representan sólo un sistema de ejemplo.
La invención puede también realizarse en su totalidad o en parte dentro de la circuitería de un circuito integrado de aplicación específica (ASIC) o dispositivo de lógica programable (PLD). En tal caso, la invención puede realizarse en un lenguaje descriptor entendible por un ordenador, que puede usarse para crear un ASIC, o PLD, que opera como se describe en este documento.
Otras Realizaciones
La invención se ha descrito con referencia a realizaciones específicas. Otras realizaciones serán evidentes para los especialistas en la técnica. En particular, una aplicación de un visor de información digital se ha ilustrado de forma general como una estación de trabajo de ordenador tal como un ordenador personal. Sin embargo, el dispositivo de computación digital significa que es cualquier aplicación de información adecuada para realizar los procedimientos lógicos de la invención, y podría incluir dispositivos tales como sistemas de laboratorios o equipos activados digitalmente, televisión activada digitalmente, teléfono celular, asistente digital personal, etc. Modificaciones dentro del espíritu de la invención serán evidentes para los especialistas en la técnica. Además, pueden usarse diversas acciones diferentes para efectuar interacciones con un sistema de acuerdo con las realizaciones específicas de la presente invención. Por ejemplo, puede pronunciarse un comando de voz por un operario, puede teclearse una clave por un operario, puede pulsarse un botón sobre un dispositivo científico del lado del cliente por un operario, o puede efectuarse una selección usando cualquier dispositivo de apuntamiento por el usuario.
Se entiende que los ejemplos y las realizaciones descritos aquí tienen propósitos ilustrativos y que varias modificaciones y cambios a la luz de los mismos serán sugeridos por las enseñanzas del documento a personas expertas en la técnica y que deben incluirse en el alcance de las reivindicaciones.
Claims (9)
- REIVINDICACIONES1. Un procedimiento para determinar si una muestra de ensayo contiene un ácido nucleico diana, comprendiendo el procedimiento:
- (a)
- poner en contacto la muestra de ensayo con al menos un agente de amplificación;
- (b)
- amplificar al menos una porción del ácido nucleico diana en la muestra;
- (c)
- medir señales obtenidas en varios puntos de la reacción de amplificación, siendo las señales proporcionales a la cantidad de ácido nucleico diana presente;
- (d)
- determinar una eficacia relacionados con transformada de la reacción de amplificación, en la que la eficacia relacionada con transformada de la reacción de amplificación es una serie de relaciones calculadas a partir de mediciones secuenciales de las señales obtenidas de la amplificación, indexándose cada una de la serie de proporciones a un valor de tiempo o ciclo número;
- (e)
- determinar un valor relacionado con la eficacia que es la magnitud máxima de la transformadas relacionadas con la eficacia; y
- (f)
- determinar que la muestra de prueba contiene un ácido nucleico diana si el valor de eficacia relacionado para la reacción de amplificación excede un valor seleccionado, realizándose la etapa de determinar si el valor de eficacia relacionado excede un valor seleccionado mediante la comparación de la eficacia valor relacionado con una curva de criterio, donde la curva de criterios se determina por:
llevar a cabo una pluralidad de reacciones de amplificación en las muestras negativas, siendo dichas muestras negativas muestras que carecen del ácido nucleico diana; determinar el valor de eficacia relacionado para cada muestra negativa; determinar la media y la desviación estándar de los valores relacionados con la eficacia de las muestras negativas; y determinar que cualquier muestra que tenga cualquier valor relacionado eficacia superior a la media por un múltiplo seleccionado de la desviación estándar de los valores relacionados con la eficacia de las muestras negativas contiene el ácido nucleico diana. -
- 2.
- El procedimiento de la reivindicación 1, donde se considera cualquier muestra que tiene cualquier valor relacionado eficacia superior a la media de una a aproximadamente 20 veces la desviación estándar de la eficacia relacionadas con transformada de las muestras negativas para contener un ácido nucleico diana.
-
- 3.
- El procedimiento de la reivindicación 1, donde el valor seleccionado de la etapa (e) varía de acuerdo con el punto de reacción particular en la que se produce el valor de eficacia relacionado.
-
- 4.
- El procedimiento de la reivindicación 1, donde el valor seleccionado de la etapa (e) se determina por (1) amplificación de una pluralidad de muestras para determinar los valores relacionados con la eficacia y (2) selección de un valor que es mayor que todos los valores relacionados con la eficacia de las muestras negativas.
-
- 5.
- El procedimiento de la reivindicación 1, donde el valor de eficacia relacionado es la proporción máxima de la respuesta de amplificación.
-
- 6.
- Un procedimiento para determinar si una muestra de ensayo contiene un ácido nucleico diana, comprendiendo el procedimiento:
- (a)
- poner en contacto la muestra de ensayo con al menos un agente de amplificación;
- (b)
- amplificar al menos una porción del ácido nucleico diana en la muestra;
- (c)
- medir señales obtenidas en varios puntos de la reacción de amplificación, siendo las señales proporcionales a la cantidad de la presente ácido nucleico diana;
- (d)
- determinar una transformada relacionada con la eficacia de la reacción de amplificación, en la que la eficacia relacionados con transformada de la reacción de amplificación es una serie de relaciones calculadas a partir de mediciones secuenciales de las señales obtenidas de la amplificación, siendo cada una de la serie de ratios indexada a un valor de tiempo o número de ciclo;
- (e)
- determinar un valor relacionado con la eficacia que es la magnitud máxima de la transformadas relacionadas con la eficacia; y
- (f)
- determinar que la muestra de ensayo contiene un ácido nucleico diana si el valor relacionado con la eficacia para la reacción de amplificación excede un valor seleccionado, donde el valor seleccionado se determina por (1) amplificar una pluralidad de muestras para determinar los valores relacionados con la eficacia y (2) seleccionar un valor que separa los valores relacionados con la eficacia de las muestras negativas de los valores relacionados con la eficacia de las muestras positivas.
-
- 7.
- El procedimiento de la reivindicación 6, donde se considera que cualquier muestra que tenga cualquier valor relacionado con la eficacia superior a la media en uno a aproximadamente 20 veces la desviación estándar de la transformada relacionada con la eficacia de las muestras negativas contiene un ácido nucleico diana.
- 8. El procedimiento de la reivindicación 6, donde el valor seleccionado de la etapa (e) varía de acuerdo con el punto de reacción particular en la que se produce el valor de eficacia relacionado.5 9. El procedimiento de la reivindicación 6, donde el valor seleccionado de la etapa (e) se determina (1) amplificando una pluralidad de muestras para determinar los valores relacionados con la eficacia y (2) seleccionando de un valor que es mayor que todos los valores relacionados con la eficacia de las muestras negativas.
- 10. El procedimiento de la reivindicación 6, donde el valor de eficacia relacionado es la proporción máxima de la 10 respuesta de amplificación.
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