ES2477232T5

ES2477232T5 - Análisis de copolímeros

Info

Publication number: ES2477232T5
Application number: ES11172109.8T
Authority: ES
Inventors: Josephine S. D'alessandro; Takashi Kei Kishimoto; Aileen Healy
Original assignee: Momenta Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Momenta Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2007-06-21
Filing date: 2008-06-19
Publication date: 2017-11-23
Anticipated expiration: 2028-06-19
Also published as: EP2381254A1; US20110053203A1; ES2477232T3; CN101743470A; WO2008157697A2; WO2008157697A3; IL202613A0; AU2008265692A1; EP2174130A2; CA2690402A1; EP2381254B1; EP2381254B2; JP2010530975A; US8753833B2

Description

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DESCRIPCION

Analisis de copoUmeros.

Campo

El contenido descrito en el momento presente se refiere en general a metodos para caracterizar mezclas complejas de peptidos o polipeptidos. Mas en particular, el contenido descrito en el momento presente se refiere a metodos basados en celulas para evaluar una o mas propiedades de un copolfmero de aminoacidos.

Antecedentes

El copolfmero-1 es una mezcla compleja de polipeptidos preparados a partir de la polimerizacion de los aminoacidos: acido glutamico, lisina, alanina y tirosina. El copolfmero-1 tambien es conocido como acetato de glatiramer y presenta la siguiente formula estructural:

(Glu, Ala, Lys, Tyr)x XCH3COOH

(C5H9NO4 •C3H7NO2 ^CgHi4N2O2 •CgHiiNO3)x *C2^O2

El acetato de glatiramer (GA, por sus siglas en ingles) es el ingrediente activo de COPAXONE® (Teva Pharmaceutical Industries Ltd., Israel), que comprende las sales de acetato de polipeptidos sinteticos que contienen cuatro aminoacidos que se encuentran en la naturaleza: acido L-glutamico, L-alanina, L-tirosina y L-lisina, con una fraccion molar promedio resenada de 0,141; 0,427; 0,095 y 0,338, respectivamente.

El acetato de glatiramer se usa en el tratamiento de la forma con recafdas y remisiones de la esclerosis multiple (RRMS, por sus siglas en ingles).

El artmulo por Li et al., European Journal of Pharmacology, 342, 1.998, 303-310, describe que el acetato de glatiramer bloquea la activacion de THP-1 por IFN-y.

La patente internacional WO 03/048735 A2 describe un procedimiento para medir la potencia relativa de un lote de ensayo de acetato de glatiramer.

El artmulo por Li et al., Journal of Neurochemistry, 2.001, 77, 1.208-1.217, se refiere a la inhibicion del acetato de glatiramer de la expresion de RANTES inducida por TNF-a y la liberacion de celulas astrodticas humanas U-251 MG.

El artmulo por Milo et al., Journal of Neuroimmunology, 61, 1.995, 185-193, se refiere a efectos aditivos de acetato de glatiramer e interferon p-1b sobre la respuesta inmunitaria a la protema basica de mielina.

El artmulo por Farina et al., Brain, 2.001, 124, 705-719, describe el tratamiento de esclerosis multiple con Copaxone.

El artmulo por Abdelaziz et al., Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2.004, 288, se refiere a la inhibicion de la produccion de TNF-a en macrofagos de THP-1 por acetato de glatiramer.

Sumario

La presente invencion proporciona metodos y composiciones para evaluar una o mas propiedades de un agente candidato, es decir el copolfmero de aminoacidos acetato de glatiramer, como se definio en las reivindicaciones 1, 2, 9 y 11. En un aspecto, la invencion proporciona una variedad de realizaciones para evaluar una preparacion de copolfmero de aminoacidos para propiedades fisiologicas, farmacodinamicas, farmacocineticas o farmaceuticas incluyendo, pero no limitado a, potencia, especificidad, estabilidad, actividad biologica, por ej., para conveniencia como una preparacion farmaceutica, por ej., para el tratamiento de enfermedad, trastornos o disfunciones autoinmunitarias y/o inflamatorias.

Una o mas propiedades de la preparacion de copolfmero de aminoacidos (por ej., de una preparacion de copolfmero de aminoacidos de ensayo), tal como potencia, especificidad, estabilidad y/o actividad biologica, se pueden evaluar comparando los resultados del analisis (por ej., un valor de ensayo cualitativo o cuantitativo que corresponde a la induccion, produccion, secrecion, presencia o nivel de una protema regulada) con un valor de referencia, por ej., un valor predeterminado para correlacionarse con un nivel particular de potencia, especificidad, estabilidad y/o actividad biologica de copolfmero, por ej., un valor predeterminado para correlacionarse con un nivel de potencia, especificidad, estabilidad y/o actividad biologica del copolfmero adecuado para una preparacion farmaceutica util para tratar una enfermedad, trastorno o disfuncion descrita en la presente memoria. En una realizacion, el valor de referencia es un perfil de induccion de citocinas, rango de equivalencia o especificacion farmaceutica para potencia, especificidad, estabilidad y/o actividad biologica para una preparacion farmaceutica comercializada de acetato de glatiramer. En otras realizaciones, el valor de referencia es un valor determinado por medicion directa de una propiedad de un compuesto de referencia, por ej., una preparacion de acetato de glatiramer de referencia. En una realizacion, el valor de ensayo se considera comparable al valor de referencia si esta dentro de 25%, 20%, 15%,

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10%, 5%, 2%, 1% o menos del valor de referencia.

En una realizacion, la celula usada en el ensayo es un leucocito, es decir una celula mieloide, por ej., una estirpe celular mieloide o celula primaria, por ej., celula mononuclear de la sangre (por ej., celulas T, celulas destructoras naturales, monocitos, macrofagos, etc.), celula polimorfonuclear de la sangre (por ej., eosinofilos, basofilos, neutrofilos, megacariocitos, etc.), celula dendntica y celula timicas. La celula puede ser una estirpe celular mieloide tumorigenica tal como THP-1, U937, SiHa o HL-60. Adicionalmente, se pueden usar celulas mononucleares de sangre periferica de mairnferos as^ como monocitos procedentes de medula osea y monocitos.

En una realizacion, la protema regulada por la molecula proinflamatoria IFN-y (cuya induccion, produccion, secrecion, presencia o nivel se detecta en el ensayo) es una quimiocina, por ej., una quimiocina regulada por IFN-y. En una realizacion, la quimiocina se selecciona del grupo que consiste en: protema 10 inducible por interferon-y (IP- 10), quimioatrayente-a de celulas T inducible con interferon (I-TAC), monocina inducida por interferon-y (MIG). Otras protemas o citocinas solubles inducidas por IFN-y incluyen las mostradas en la Tabla 1. La induccion, produccion, secrecion, presencia o nivel de una protema regulada se puede detectar directamente, por ej., por un metodo basado en anticuerpo, tal como un ELISA o indirectamente, por ej., por tecnicas conocidas en la tecnica para detectar transcripciones para la protema o por uso de un analisis de gen informador.

En algunas realizaciones, la exposicion de la celula o las celulas al copolfmero de aminoacidos e IFN-y da como resultado una induccion sinergica de una o mas de las protemas reguladas por citocina. En un ejemplo, la exposicion de celulas mieloides al copolfmero de aminoacidos acetato de glatiramer e IFNy da como resultado una induccion sinergica de una o mas quimiocinas o citocinas reguladas por IFNy (por ej., de IP-10, I-TAC, MIG y/u otros ligandos de CXCR3). En una realizacion, la induccion de una citocina regulada puede ser al menos 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 75 veces, 100 veces, 150 veces, 200 veces, 300 veces o mas por encima de los valores de control (por ej., por encima de controles negativos sin molecula proinflamatoria y/o sin copolfmero).

La invencion proporciona ademas un metodo para preparar una composicion farmaceutica de acetato de glatiramer que comprende preparar un lote de acetato de glatiramer, evaluar la potencia, especificidad, actividad biologica y/o estabilidad de la composicion por un metodo descrito en la presente memoria y determinar que el acetato de glatiramer es aceptable para uso farmaceutico si se detecta al menos un nivel predeterminado de una o mas protemas reguladas por la citocina y/o si la protema regulada se induce a un nivel dentro del 80%-125% (por ej., al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 100%, 110%, 115%, 120%, 125%) de un valor de referencia.

Tambien se describe un metodo para preparar una composicion farmaceutica que comprende acetato de glatiramer, que comprende: polimerizar N-carboxiantndridos de L-alanina, acido L-glutamico bencil-protegido, L-lisina y L- tirosina protegidas con acido trifluoroacetico (TFA) para generar un copolfmero protegido; tratar el copolfmero protegido para despolimerizar parcialmente el copolfmero protegido y desproteger grupos bencil-protegidos y desproteger lisinas protegidas con TFA para generar acetato de glatiramer y aislar el acetato de glatiramer, en el que la mejora comprende: medir la expresion de una protema inducida por IFN-y en una celula mieloide o una estirpe celular mieloide primaria en presencia de IFN-y y una muestra del acetato de glatiramar aislado y comparar la expresion con el valor de referencia. En diversas realizaciones de este metodo de preparacion: la mejora comprende ademas seleccionar el acetato de glatiramer purificado para uso en la preparacion de una composicion farmaceutica si la diferencia entre la expresion medida y el valor de referencia esta dentro de un intervalo predeterminado y la mejora comprende ademas: preparar una composicion farmaceutica que comprende al menos una porcion del acetato de glatiramer purificado seleccionado.

Algunos aspectos del contenido descrito en el momento presente que se han indicado anteriormente, que se estudian en su totalidad o en parte por el contenido descrito en el momento presente, otros aspectos se haran evidentes a medida que transcurra la descripcion cuando se consideren en relacion a los Ejemplos y la Figura que se adjuntan como se describe mejor en la presente memoria a continuacion.

Breve descripcion de la figura

La Figura 1 ilustra la secrecion de IP-10, I-TAC y MIG durante aproximadamente 24 horas en diversos medios que contienen suero o exentos de suero a una concentracion constante de IFNy (10 ng/ml). La condicion de FBS al 10% se ensayo a 50, 10, 2 y 0 pg/ml de acetato de glatiramer (GA). Las condiciones de FBS al 2%, FBS al 0% y X- VIVO15 se analizaron a 50 y 0 pg/ml de GA. M representa el portador de control de manitol que se analizo a 100 pg/ml. Los numeros por encima de las barras representan las veces de incremento por encima del control (0 pg/ml).

Descripcion detallada

El contenido descrito en el momento presente se describira ahora mas completamente de ahora en adelante con referencia a la figura que se adjunta, en que se muestran algunas, pero no todas las realizaciones del contenido descrito en el momento presente. Muchas modificaciones y otras realizaciones del contenido descrito en el momento presente explicadas en la presente memoria le vendran a la mente a un experto en la materia al que se refiere el contenido descrito en el momento presente con el beneficio de las explicaciones presentadas en las descripciones anteriores y la figura asociada. Por lo tanto, se tiene que entender que el contenido descrito en el momento presente

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no se tiene que limitar a las realizaciones espedficas descritas y que las modificaciones y otras realizaciones se destinan a estar incluidas dentro del alcance de las realizaciones adjuntas. Aunque se emplean terminos espedficos en la presente memoria, se usan en un sentido generico y descriptivo solo y no para fines de limitacion.

Siguiendo el convenio de derecho sobre patentes de larga data, los terminos "un," "uno" y "el" se refieren a "uno o mas" cuando se usan en esta solicitud, incluyendo las realizaciones. Asf, por ejemplo, la referencia a "una muestra" incluye una pluralidad de muestras, a menos que el contexto sea claramente para lo contrario (por ej., una pluralidad de muestras), etc.

Vision general

La presente invencion proporciona metodos y composiciones para evaluar una o mas propiedades de acetato de glatiramer que pueden ser utiles como una preparacion terapeutica, por ej., para el tratamiento de un trastorno autoinmunitario, neurodegenerativo, desmielinizante o inflamatorio. Los analisis descritos en la presente memoria pueden ser de cualquier formato conocido en la tecnica, incluyendo analisis de cultivo celular, analisis de cultivo de organos o analisis ex vivo.

Una "molecula proinflamatoria" es una molecula que estimula la activacion de leucocitos, celulas epiteliales o celulas estromales que da como resultado la amplificacion o propagacion de una respuesta inmunitaria inflamatoria. Una molecula proinflamatoria puede inducir la produccion de marcadores de activacion (por ej., ligando CD69, CD25, CD54, CD40, CD11b, CD62L, CD83, CD95) y/o secrecion de otras citocinas y/o quimiocinas pro-inflamatorias de celulas inmunitarias tales como celulas T CD4, celulas T CD8, celulas B, celulas NK, monocitos, macrofagos, celulas dendnticas, neutrofilos, basofilos, eosinofilos y mastocitos. La invencion utiliza la citocina pro-inflamatoria IFN-y que es una protema segregada pequena que presenta las propiedades de una molecula proinflamatoria como se describe en la presente memoria. Una "quimiocina" es una citocina con actividad quimiotactica. Ejemplos de quimiocinas incluyen IL-8, RANTES, MlP-1a, MCP-1, IP-10, Mig, I-TAC, TARC, I-309.

Los diversos metodos descritos en la presente memoria se pueden usar para evaluar una o mas propiedades de una preparacion de acetato de glatiramer, tal como potencia, especificidad, estabilidad, pureza y actividad biologica, por comparacion de la preparacion de copolfmero de ensayo con uno o mas valores de referencia predeterminados, tales como un valor de especificacion farmaceutica para potencia, especificidad, estabilidad y actividad biologica de acetato de glatiramer. En algunos casos, se puede determinar un valor de referencia por comparacion con un agente conocido. Este agente conocido se refiere en la presente memoria como un "agente de referencia" o un "compuesto de referencia." Un agente de referencia preferido de la invencion es un copolfmero de aminoacidos (por ej., una preparacion farmaceutica de acetato de glatiramer) que es adecuado para uso como preparacion farmaceutica, por ej., se ha mostrado que presenta eficacia terapeutica en uno o mas trastornos o afecciones autoinmunitarias, degenerativas, desmielinizantes y/o inflamatorias. Por "eficacia terapeutica" se desea que el agente sea capaz de prevenir, tratar o aliviar los smtomas asociados al trastorno o afeccion.

En una realizacion, el valor de referencia es un valor de especificacion farmaceutica predeterminado para acetato de glatiramer. En una realizacion, el compuesto de referencia es preparacion farmaceutica de acetato de glatiramer. En una realizacion, se ha observado la induccion sinergica de protemas reguladas por citocinas en diversos tipos de celulas cuando se administran conjuntamente con citocina suministrada de manera exogena y copolfmero-1. Como se usa en la presente memoria, el termino "sinergico" se refiere a dos o mas agentes (por ej., acetato de glatiramer y una citocina) que son mas eficaces en asociacion que la suma de los efectos individuales de cada agente unico solo. Esta induccion sinergica de protemas reguladas por citocinas se puede usar para investigar una preparacion de copolfmeros de ensayo para propiedades, incluyendo actividad biologica, que sean comparables con acetato de glatiramer.

El acetato de glatiramer esta homologado para la reduccion de la frecuencia de recafdas en pacientes con esclerosis multiple con recafdas y remisiones. La esclerosis multiple se ha clasificado como una enfermedad autoinmunitaria. El acetato de glatiramer tambien se ha descrito para uso en el tratamiento de otras enfermedades autoinmunitarias, enfermedades no autoinmunitarias inflamatorias y para fomentar la regeneracion nerviosa y/o para prevenir o inhibir la degeneracion secundaria que puede seguir a la lesion del sistema nervioso principal. Ademas, el acetato de glatiramer se ha descrito como un tratamiento para enfermedades mediadas por el sistema inmunitario asf como enfermedades asociadas a la desmielinizacion. Los metodos descritos en la presente memoria se pueden usar para evaluar la actividad de una preparacion de acetato de glatiramer para conveniencia como preparacion farmaceutica para cualquiera de estos trastornos.

Analisis in vitro

Los metodos y las composiciones de la presente invencion comprenden analisis utiles para evaluar una o mas propiedades del acetato de glatiramer. En una realizacion, se investiga una preparacion de copolfmero de ensayo usando un ensayo in vitro para evaluar el efecto de la preparacion de copolfmero en la produccion y/o secrecion de una o mas protemas reguladas por lFN- y. El nivel de induccion regulada por IFN-y de la protema o las protemas en presencia de una preparacion de copolfmero de ensayo se compara con el nivel de la induccion regulada por citocina proinflamatoria de esa o esas protemas en el mismo tipo de celula en presencia de un agente de referencia.

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El nivel (es dedr, nivel cualitativo o cuantitativo) y la naturaleza (es dedr, especies de protema) de induccion se refiere en la presente memoria como el "perfil de induccion de citocinas." El perfil de induccion de citocinas se puede usar para valorar una o mas propiedades del acetato de glatiramer, tales como potencia, estabilidad, especificidad y actividad biologica. En una realizacion, se dice que una preparacion de ensayo es adecuada como una composicion farmaceutica cuando el perfil de induccion de citocinas de la preparacion de ensayo (por ej., el nivel de induccion o el numero de protemas similares que son inducidas o ambos) esta entre aproximadamente 80% y aproximadamente 125%, incluyendo aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99%, aproximadamente 100%, aproximadamente 105%, aproximadamente 110%, aproximadamente 115%, aproximadamente 120%, hasta aproximadamente 125% de un valor de referencia o perfil para una composicion farmaceutica de copolfmero (por ej., un lote de COPAXONE®). En otra realizacion, se dice que una preparacion de ensayo presenta sustancialmente las mismas propiedades que una preparacion de copolfmero de referencia (por ej., cOpAxONE®) cuando el perfil de induccion de citocinas de la preparacion de ensayo (por ej., el nivel de induccion o el numero de protemas similares que son inducidas o ambos) esta entre aproximadamente 80% y aproximadamente 125%, incluyendo aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99%, aproximadamente 100%, aproximadamente 105%, aproximadamente 110%, aproximadamente 115%, 120%, hasta aproximadamente 125% de la preparacion de copolfmero de referencia.

En una realizacion, la referencia es acetato de glatiramer con eficacia terapeutica conocida en uno o mas trastornos autoinmunitarios o inflamatorios. En una realizacion espedfica, el agente de referencia es acetato de glatiramer. El valor de referencia puede ser un valor predeterminado para corresponderse con un cierto nivel de potencia, pureza, estabilidad u otra actividad de acetato de glatiramer.

Una o mas celulas capaces de producir o segregar una protema regulada por citocinas se pone en contacto con acetato de glatiramer o un agente de referencia a una concentracion y tiempo suficiente para la induccion de la protema regulada por citocinas. El analisis puede comprender dos o mas tipos de celulas, que pueden ser celulas primarias, estirpes celulares o combinaciones de las mismas. La concentracion y el tiempo suficiente para la induccion de la protema regulada por citocinas son los que dan como resultado la produccion o secrecion detectable de la protema regulada por citocinas por encima del nivel de esa protema en ausencia de acetato de glatiramer o agente de referencia (por ej., por encima de los niveles de los valores de referencia de la protema que se regula por la citocina). La concentracion del acetato de glatiramer puede estar presente en el medio de analisis a una concentracion de al menos aproximadamente 0,05 pg/ml, al menos aproximadamente 1 pg/ml, al menos aproximadamente 2 pg/ml, al menos aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5,

aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10,

aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 40,

aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90,

aproximadamente 100, aproximadamente 110, aproximadamente 125, aproximadamente 150, aproximadamente 175, aproximadamente 200, aproximadamente 225, aproximadamente 250, aproximadamente 275, aproximadamente 300, aproximadamente 375, aproximadamente 400, aproximadamente 425, aproximadamente 450, aproximadamente 475, al menos aproximadamente 500 pg/ml o mayor, siempre que la concentracion no alcance la que es citotoxica.

El acetato de glatiramer o agente de referencia se puede incubar (es decir, "poner en contacto") con la celula capaz de segregar o producir la protema regulada por citocinas durante al menos aproximadamente 1 hora, al menos aproximadamente 1,5 horas, al menos aproximadamente 2 horas, al menos aproximadamente 3 horas, al menos aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17,

aproximadamente 18, aproximadamente 19, aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22,

aproximadamente 23, aproximadamente 24, aproximadamente 25, aproximadamente 26, aproximadamente 27,

aproximadamente 28, aproximadamente 29, aproximadamente 30, aproximadamente 31, aproximadamente 32,

aproximadamente 33, aproximadamente 34, aproximadamente 35, aproximadamente 36, aproximadamente 40,

aproximadamente 45, aproximadamente 48 o mas horas.

En una realizacion, una cantidad de la citocina proinflamatoria que regula la expresion de la protema descrita anteriormente se puede anadir de manera exogena al medio de analisis. La citocina se puede anadir antes, al mismo tiempo que o despues de la adicion de la preparacion de copolfmero de ensayo o de referencia. En una realizacion, la citocina se anade al mismo tiempo que la preparacion de copolfmero de ensayo o de referencia. La citocina puede estar presente en el medio de analisis a una concentracion de al menos aproximadamente 1 ng/ml, al menos aproximadamente 2 ng/ml, al menos aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 40, al menos aproximadamente 50 ng/ml o mayor, siempre que la concentracion no alcance la que es citotoxica. En algunas realizaciones, la citocina se puede expresar de manera heterologa en la celula huesped del analisis. El gen heterologo puede estar bajo el control de un activador constitutivo o uno inducible.

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En diversos aspectos de la presente invencion, la citocina que regula la produccion y secrecion de una o mas protemas descritas en la presente memoria es una citocina proinflamatoria. Las citocinas proinflamatorias se asocian tipicamente a una respuesta de celulas T Th1. En una realizacion, la citocina pro-inflamatoria se selecciona del grupo que incluye, pero no esta limitado a, TNFa, interferon gamma (IFNy), interleucina-1 (IL-1), interleucina-1 beta (IL-1p), interleucina-1 (IL-2) interleucina-6 (IL-6), interleucina-4 (IL-4), interleucina-8 (IL-8), interleucina-10 (IL-10), interleucina-13 (IL-13), interleucina-17 (IL-17), interleucina-18 (IL-18), interleucina-23 (IL-23) y linfotoxina-a. En los analisis descritos en la presente memoria, la citocina esta presente en una concentracion suficiente para inducir la produccion o secrecion de una o mas protemas reguladas por esa citocina. En una realizacion, la protema regulada por citocinas comprende protemas (por ej., quimiocinas) que estan reguladas por interferon gamma, incluyendo protema 10 inducible por interferon y (IP-10), quimioatrayente-a de celulas T inducible con interferon (I-TAC) y monocina inducida por interferon-y (MIG). IP-10, MIG e I-TAC se expresan dentro de las lesiones del SNC en tanto Encefalitis Autoinmune Experimental (EAE) como esclerosis multiple (MS) y el receptor que une estos ligandos, CXCR3, se expresa en celulas T que infiltran lesiones de EAE y MS asf como en celulas T en el lfquido cefalorraqmdeo y la periferia de pacientes de MS durante exacerbaciones (revisado en Klein et al. (2.004) J Inmunol 172: 550-559).

Celulas

Muchos tipos de celulas mieloides encuentran uso en los metodos de la presente invencion siempre que puedan producir una o mas protemas reguladas por las citocinas descritas en la presente memoria. Se incluyen, sin limitacion, celulas implicadas en respuestas inflamatorias, por ej., celulas mononucleares de la sangre (por ej., celulas T, celulas destructoras naturales, monocitos, macrofagos, etc.), celulas polimorfonucleares de la sangre (por ej., eosinofilos, basofilos, neutrofilos, megacariocitos, etc.) y celulas dendnticas. Tambien se incluyen estirpes celulares tumorigenicas tales como THP-1, U937, SiHa y HL-60. Adicionalmente, tambien se pueden usar celulas mononucleares de sangre periferica de mairnferos asf como monocitos procedentes de medula osea y monocitos aislados por elutriacion o aislamiento de perlas magneticas negativo.

Condiciones del cultivo celular.

Las formulaciones de medios de cultivo celular son conocidas en la bibliograffa y muchas estan comercialmente disponibles. En una realizacion, las celulas en el analisis se cultivan en medio sin suero. Los metodos para preparar medios sin suero son conocidos en la tecnica. Los ingredientes pueden incluir aminoacidos (ambos D y/o L- aminoacidos) tales como glutamina, alanina, arginina, asparagina, cistina, acido glutamico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina y valina y sus derivados; subgrupos solubles en acido tales como tiamina, acido ascorbico, compuestos ferricos, compuestos ferrosos, purinas, glutation y fosfatos de sodio monobasicos.

Ingredientes adicionales pueden incluir azucares, desoxirribosa, ribosa, nucleosidos, vitaminas solubles en agua, riboflavina, sales, metales traza, lfpidos, sales de acetato, sales de fosfato, HEPES, rojo fenol, sales de piruvato y tampones.

Otros ingredientes usados con frecuencia en formulaciones del medio incluyen vitaminas solubles en grasa (incluyendo vitaminas A, D, E y K), esteroides y sus derivados, colesterol, acidos grasos y lfpidos, Tween 80, 2- mercaptoetanol piramidinas, asf como una variedad de suplementos incluyendo suero (fetal, caballo, ternera, etc.), protemas (insulina, transferrina, factores de crecimiento, hormonas, etc.), antibioticos (gentamicina, penicilina, estreptomicina, anfotericina B, etc.), ultrafiltrado de huevo completo y factores de union (fibronectinas, vitronectinas, colagenos, lamininas, tenascinas, etc.). El experto sabe determinar las condiciones apropiadas bajo las que se propaga una celula util en los metodos de la presente invencion.

Las celulas se pueden cultivar de cualquier manera conocida en la tecnica incluyendo en suspension, en monocapa, en perlas o en tres dimensiones. Los metodos de cultivo de celulas y tejidos son conocidos en la tecnica y se describen, por ejemplo, en Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures; Freshney (1.987), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques.

La practica de la presente invencion empleara, a menos que se indique de otro modo, tecnicas convencionales de biologfa celular, cultivo celular, biologfa molecular, biologfa transgenica, microbiologfa, ADN recombinante e inmunologfa, que estan dentro de la destreza de la tecnica. Dichas tecnicas se explican completamente en la bibliograffa. Vease, por ejemplo, Sambrook et al., ed. (2.001) Molecular Cloning A Laboratory Manual (Edicion de Lab 3d; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 y 155; Mayer and Walker, eds. (1.988) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, Londres); Herzenberg, Weir and Blackwell, eds., (1.996) Weir's Handbook Of Experimental Immunology, Volumenes I-IV.

Medicion de induccion de protemas.

La induccion de una protema regulada por citocinas como se describe en la presente memoria se puede evaluar en una variedad de diferentes formas, cada una de las cuales es conocida para los expertos en la materia. La medicion puede ser cuantitativa o cualitativa, siempre que la medicion pueda indicar si el nivel de la protema regulada por

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citocinas de interes en la muestra este en, por encima de o por debajo de un valor de referencia. El nivel de induccion, asf como las protemas espedficas que se inducen, de una o mas de las protemas reguladas por citocina (en la presente memoria referidas como el "perfil de induccion de citocinas") puede ser comparado con un perfil de referencia de induccion de citocinas (por ej., un perfil que se ha predeterminado para corresponderse con una actividad particular o nivel de actividad) o al perfil de induccion de citocinas de uno o mas de un agente de referencia y un agente de control negativo. Un agente de control negativo puede ser, por ej., uno que no presenta potencia o actividad o uno que no induce produccion de protemas reguladas por citocinas en el tipo de celula utilizado en el analisis o ambos.

El perfil de induccion de citocinas se puede usar como una medida de una propiedad o actividad biologica. Las propiedades tales como potencia, especificidad y estabilidad se pueden evaluar usando el perfil de induccion de citocinas. Para los fines de la presente invencion, se evaluan potencia y actividad biologica evaluando el nivel de induccion de una o mas protemas reguladas por citocina. La "especificidad" se evalua, por ej., identificando o distinguiendo la preparacion de ensayo como que es acetato de glatiramer frente a no acetato de glatiramer basado en los resultados. La estabilidad se puede evaluar comparando el perfil de induccion de citocinas del agente candidato con el agente de referencia en el tiempo. En algunas realizaciones, el perfil de induccion de citocinas se puede usar como una medida de equivalencia para un agente de referencia.

En una realizacion, la induccion de la protema regulada por citocinas se detecta usando un metodo inmunologico. Los metodos inmunologicos que se pueden usar para detectar induccion de protemas reguladas por citocinas incluyen, pero no se limitan a, sistemas de analisis competitivo y no competitivo usando tecnicas con base inmunitaria tales como metodos Western, radioinmunoanalisis, ELISA (analisis inmunoabsorbente ligado a enzimas), ELISA multiple, inmunoanalisis de "sandwich", analisis de inmunoprecipitacion, reacciones de la precipitina, reacciones de la precipitina de difusion en gel, analisis de inmunodifusion, analisis de aglutinacion, analisis de fijacion del complemento, analisis inmunoradiometricos, inmunoanalisis fluorescentes, inmunoanalisis de protema A y similares. Dichos analisis son rutinarios y conocidos en la tecnica (vease, por ej., Ausubel et al, eds, 1.994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, que se incorpora por referencia en la presente memoria en su totalidad). Se describen inmunoanalisis ejemplares brevemente a continuacion (pero no se destinan a limitacion).

Los protocolos de inmunoprecipitacion comprenden en general obtener sobrenadante del medio de analisis (opcionalmente enriquecido con protema fosfatasa y/o inhibidores de la proteasa, por ej., acido etilendiaminotetraacetico (AEDT), fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF, por sus siglas en ingles), aprotinina, vanadato de sodio), anadiendo una molecula de union de interes (es decir, una molecula, tal como un anticuerpo, que se une espedficamente a la protema regulada por citocinas de interes) al sobrenadante, incubando durante un periodo de tiempo (por ej., 1 a 4 horas) a aproximadamente 4°C, anadiendo perlas de protema A y/o protema G sefarosa al lisado de celulas, incubando durante aproximadamente una hora o mas a aproximadamente 4°C, lavando las perlas en tampon y volviendo a suspender las perlas en dodecilsulfato de sodio (SDS, por sus siglas en ingles)/tampon de muestra. La capacidad de la molecula de union de interes para inmunoprecipitar un antfgeno particular se puede evaluar por, por ej., analisis por el metodo Western. Un experto en la materia sena conocedor en cuanto a los parametros de que se pueden modificar para aumentar la union de la molecula de union a una protema regulada por citocinas y disminuir el fondo (por ej., pre-aclarando el sobrenadante con perlas de sefarosa). Para mas discusion considerando los protocolos de inmunoprecipitacion, vease, por ej., Ausubel et al., eds, 1.994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York en 10.16.1, que se incorpora por la presente por referencia en la presente memoria en su totalidad.

El analisis por el metodo Western comprende en general preparar muestras de protema del sobrenadante de analisis, electroforesis de las muestras de protemas en un gel de poliacrilamida (por ej., SDS-PAGE al 8%-20% dependiendo del peso molecular del antfgeno), transferir la muestra de protemas del gel de poliacrilamida a una membrana tal como nitrocelulosa, PVDF o nailon, bloquear la membrana en disolucion de bloqueo (por ej., PBS con BSA al 3% o leche desnatada), lavar la membrana en tampon de lavado (por ej., PBS-Tween 20), bloquear la membrana con la molecula de union de interes (por ej., un anticuerpo espedfico para la protema regulada por citocinas de interes) diluida en tampon de bloqueo, lavar la membrana en tampon de lavado, bloquear la membrana con un anticuerpo (que reconoce la molecula de union, por ej., un anticuerpo secundario) conjugado a un sustrato enzimatico (por ej., peroxidasa de rabano o fosfatasa alcalina) o molecula radiactiva (por ej., 32P o 125I) diluida en tampon de bloqueo, lavar la membrana en tampon de lavado y detectar la presencia de la protema regulada por citocinas. Un experto en la materia sena conocedor en cuanto a los parametros de que se pueden modificar para aumentar la senal detectada y para reducir el ruido de fondo. Para mas discusion considerando los protocolos del metodo Western vease, por ej., Ausubel et al., eds, 1.994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York en 10.8.1, que se incorpora por la presente por referencia en la presente memoria en su totalidad.

Los ELISA comprenden preparar protema regulada por citocinas, recubrir el pozo de una placa de microtftulo de 96 pozos con la protema regulada por citocinas de interes o un sobrenadante de analisis que comprende la protema regulada por citocinas de interes, anadir la molecula de union de interes conjugada a un compuesto detectable tal como un sustrato enzimatico (por ej., peroxidasa de rabano o fosfatasa alcalina) al pozo e incubar durante un periodo de tiempo y detectar la presencia de la protema regulada por citocinas. En los ELISA, la molecula de union

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de interes no tiene que estar conjugada a un compuesto detectable; en su lugar, se puede anadir al pozo un anticuerpo (que reconoce la molecula de union de interes) conjugado a un compuesto detectable. Ademas, en vez de recubrir el pozo con la protema regulada por citocinas de interes o un sobrenadante de ensayo que comprende la protema regulada por citocinas de interes, la molecula de union se puede recubrir al pozo. En este caso, un anticuerpo conjugado a un compuesto detectable se puede anadir despues de la adicion de la protema regulada por citocinas de interes o un sobrenadante de analisis que comprende la protema regulada por citocinas de interes al pozo recubierto. Un experto en la materia sena conocedor en cuanto a los parametros de que se pueden modificar para aumentar la senal detectada asf como otras variaciones de los ELISA conocidos en la tecnica. Para mas discusion considerando los ELISA vease, por ej., Ausubel et al, eds., 1.994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York en 11.2.1, que se incorpora por la presente por referencia en la presente memoria en su totalidad. Se pueden obtener diversos estuches de ELISA de fuentes comerciales tales como BioSource International (Montreal, Canada), BD Biosciences (San Jose, CA), R&D Systems (Minneapolis, MN), Millipore Corp. (Bedford, MA) y Pierce (Rockville, IL).

Tambien se pueden usar mediciones basadas en la afinidad que utilizan una molecula que se une espedficamente a la protema regulada por citocinas que se esta midiendo (un "reactivo de afinidad," tal como un anticuerpo o aptamero), asf como otras tecnologfas, tales como tecnologfas basadas en la espectroscopfa (por ej., desorcion mediante laser asistida por matriz-tiempo de vuelo o MALDI-TOF, espectroscopfa).

Las tecnologfas basadas en la afinidad incluyen analisis basados en anticuerpos (inmunoanalisis como se describio anteriormente) y analisis que utilizan aptameros (moleculas de acido nucleico que se unen de manera espedfica a otras moleculas), tal como ELONA. Adicionalmente, tambien se consideran analisis que utilizan tanto anticuerpos como aptameros (por ej., un ensayo de formato sandwich que utiliza un anticuerpo para captura y un aptamero para deteccion). En general, los anticuerpos se pueden sustituir por aptameros en casi todos los formatos de inmunoanalisis, aunque los aptameros permiten formatos de analisis adicionales (tales como amplificacion de aptameros ligados usando tecnologfa de amplificacion de acidos nucleicos tal como PCR (Patente de EE.UU. N° 4.683.202) o amplificacion isotermica con matrices de material compuesto (Patentes de EE.UU. Nos. 6.251.639 y 6.692.918).

Los analisis basados en la afinidad pueden estar en competicion o formatos de reaccion directa, utilizan formatos de tipo sandwich y pueden ser ademas heterogeneos (por ej., utilizan soportes solidos) u homogeneos (por ej., tienen lugar en una sola fase) y/o utilizan inmunoprecipitacion. La mayona de los analisis implica el uso de reactivo de afinidad marcado (por ej., anticuerpo, polipeptido o aptamero); las etiquetas pueden ser, por ejemplo, moleculas enzimaticas, fluorescentes, quimioluminiscentes, radioactivas o colorantes. Tambien se conocen analisis que amplifican las senales de la sonda; ejemplos de los cuales son analisis que utilizan biotina y avidina e inmunoanalisis marcados y mediados por enzimas, tales como los analisis ELISA y ELONA.

En un formato heterogeneo, el analisis utiliza dos fases (tfpicamente ftquido acuoso y solido). Tfpicamente un reactivo de afinidad espedfico de protema regulada por citocinas esta ligado a un soporte solido para facilitar la separacion de la protema regulada por citocinas del volumen de la muestra. Despues de reaccion durante un tiempo suficiente para permitir la formacion de complejos de reactivo de afinidad/protema regulada por citocinas, el soporte solido o la superficie que contiene el anticuerpo se lava tfpicamente previamente a la deteccion de polipeptidos ligados. El reactivo de afinidad en el analisis para medicion de protemas reguladas por citocinas se puede proporcionar sobre un soporte (por ej., solido o semi-solido); alternativamente, los polipeptidos en la muestra se pueden inmovilizar sobre un soporte o superficie. Ejemplos de soportes que se pueden usar son nitrocelulosa (por ej., en forma de membrana o pozo de microtftulo), poli(cloruro de vinilo) (por ej., en laminas o pozos de microtftulo), latex de poliestireno (por ej., en perlas o placas de microtftulo), poli(fluoruro de vinilideno), papel diazotizado, membranas de nailon, perlas activadas, perlas de vidrio y Protema A. Los dos formatos, estandar y competitivo, para estos analisis son conocidos en la tecnica.

Los analisis heterogeneos de tipo matriz son adecuados para medir niveles de protemas reguladas por citocina cuando los metodos de la invencion se practican utilizando multiples protemas reguladas por citocina. Los analisis de tipo matriz usados en la practica de los metodos de la invencion utilizaran comunmente un sustrato solido con dos o mas reactivos de captura espedficos para diferentes protemas reguladas por citocina ligadas al sustrato en un patron predeterminado (por ej., una rejilla). La muestra (por ej., sobrenadante de analisis) se aplica al sustrato y las protemas reguladas por citocina en la muestra se ligan por los reactivos de captura. Despues de eliminacion de la muestra (y lavado apropiado), las protemas reguladas por citocina ligadas se detectan usando una mezcla de reactivos de deteccion apropiados que unen de manera espedfica las diversas protemas reguladas por citocina. La union del reactivo de deteccion se realiza comunmente usando un sistema visual, tal como un sistema a base de colorante fluorescente. Debido a que los reactivos de captura se disponen sobre el sustrato en un patron predeterminado, los analisis de tipo matriz proporcionan la ventaja de deteccion de multiples protemas reguladas por citocinas sin la necesidad de un sistema de deteccion multiple.

En un formato homogeneo el ensayo tiene lugar en fase unica (por ej., fase ftquida acuosa). Tfpicamente, la muestra se incuba con un reactivo de afinidad espedfico para la protema regulada por citocinas en disolucion. Por ejemplo, puede estar en condiciones que precipiten cualquier complejo de reactivo de afinidad/anticuerpo que se forme. Los dos formatos, estandar y competitivo, para estos analisis son conocidos en la tecnica.

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En un formato estandar (reaccion directa), el nivel de complejo de protema regulada por citocinas/reactivo de afinidad se controla directamente. Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, determinando la cantidad de un reactivo de deteccion marcado que se forma ligado a complejos de protema regulada por citocinas/reactivo de afinidad. En un formato competitivo, la cantidad de protema regulada por citocinas en la muestra se deduce controlando el efecto competitivo sobre la union de una cantidad conocida de protema marcada regulada por citocinas (u otro ligando de competicion) en el complejo. Las cantidades de formacion de union o de complejo se pueden determinar cualitativamente o cuantitativamente.

Ademas de inmunoanalisis, se puede medir la induccion evaluando patrones de expresion de los genes que codifican las protemas reguladas por citocina o de genes informadores. Por ejemplo, los patrones de expresion se pueden evaluar por analisis Northern, PCR, RT-PCR, analisis Taq Man, analisis de proteccion de ribonucleasas, deteccion con FRET, controlando una o mas balizas moleculares, hibridacion a una matriz de oligonucleotidos, hibridacion a una matriz de ADNc, hibridacion a una matriz de polinucleotidos, hibridacion a una micromatriz lfquida, hibridacion a una matriz microelectronica, secuenciacion de ADNc, hibridacion de clones, impresion digital de fragmentos de ADN y similares. El metodo particular elegido dependera de factores tales como la cantidad de ARN recuperado, la preferencia del profesional cualificado, los reactivos y el equipo disponibles, detectores y similares.

Como entenderan los expertos en la materia, el modo de deteccion de la senal dependera del sistema de deteccion exacto utilizado en el analisis. Por ejemplo, si se utiliza un reactivo de deteccion radiomarcado, la senal se medira usando una tecnologfa capaz de cuantificar la senal de la muestra o comparando la senal de la muestra con la senal de una muestra de referencia, tal como contador de centelleo, autoradiograffa (tfpicamente combinado con densitometna de barrido) y similares. Si se usa un sistema de deteccion quimioluminiscente, entonces la senal se detectara tfpicamente usando un luminometro. Los metodos para detectar senal de sistemas de deteccion son conocidos en latecnica y no es necesario describirlos mas en la presente memoria.

Cuando se mide mas de una protema regulada por citocinas, la muestra se puede dividir en una serie de almuotas, usandose almuotas separadas para medir diferente protema regulada por citocinas (aunque tambien se considera la division de la muestra en multiples almuotas para permitir multiples determinaciones de los niveles de la protema regulada por citocinas en una muestra particular). Alternativamente, la muestra (o una almuota de la misma) se puede ensayar para determinar los niveles de protema regulada por citocinas multiples en una sola reaccion usando un analisis capaz de medir los niveles individuales de diferente protema regulada por citocinas en un solo analisis, tal como un analisis de tipo matriz o analisis que utiliza tecnologfa de deteccion multiple (por ej., un analisis que utiliza reactivos de deteccion marcados con diferentes marcadores de colorante fluorescentes).

Es comun en la tecnica realizar mediciones "replicadas". Normalmente, se obtienen mediciones replicadas por division de una muestra en multiples almuotas y midiendo por separado el biomarcador o los biomarcadores en reacciones separadas del mismo sistema de analisis. Las mediciones replicadas no son necesarias para los metodos de la invencion, pero muchas realizaciones de la invencion utilizaran ensayo de replicados, en particular ensayo por duplicado y triplicado. En algunas realizaciones, el agente de referencia y el agente candidato se analizaran usando almuotas separadas de celulas obtenidas del mismo cultivo celular. En otra realizacion, el agente de referencia (y/o control negativo) y el agente candidato se analizara usando el mismo lote de celulas. En esta realizacion, cada agente se analiza en momentos diferentes, se reemplaza el medio de analisis entre mediciones y se permite que las celulas se recuperen a una densidad celular apropiada despues de cada medicion.

Los metodos descritos en la presente memoria se pueden implantar y/o registrar los resultados usando cualquier dispositivo capaz de implantar los metodos y/o registrar los resultados. Ejemplos de dispositivos que se pueden usar incluyen, pero no estan limitados a, dispositivos computacionales electronicos, incluyendo ordenadores de todos los tipos. Cuando se implantan los metodos descritos en la presente memoria y/o se registran en un ordenador, el programa informatico que se puede usar para configurar el ordenador para realizar las etapas de los metodos puede estar contenido en cualquier medio que pueda leer el ordenador capaz de contener el programa informatico. Los ejemplos de medio que puede leer el ordenador que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, disquetes, los CD-ROM, los DVD, rOm, RAM y otros dispositivos de memoria y almacenaje del ordenador. El programa informatico que se puede usar para configurar el ordenador para realizar las etapas de los metodos y/o registrar los resultados tambien se pueden proporcionar por una red electronica, por ejemplo, por internet, intranet u otra red.

El procedimiento de comparacion de un valor medido y un valor de referencia se puede llevar a cabo de cualquier manera conveniente apropiada para el tipo de valor medido y valor de referencia para la protema regulada por citocinas en cuestion. Como se discutio anteriormente, la "medicion” se puede llevar a cabo usando tecnicas de medicion cuantitativas o cualitativas y el modo de comparar un valor medido y un valor de referencia puede variar dependiendo de la tecnologfa de medicion empleada. Por ejemplo, cuando se usa un analisis colorimetrico cualitativo para medir los niveles de protema regulada por citocinas, los niveles se pueden comparar por comparacion de manera visual de la intensidad del producto de reaccion coloreado o por comparacion de datos de mediciones densitometricas o espectrometricas del producto de reaccion coloreado (por ej., comparando datos numericos o datos graficos, tales como graficos de barras, procedentes del dispositivo de medicion). Sin embargo, se espera que los valores medidos usados en los metodos de la invencion sean lo mas comunmente valores cuantitativos (por ej., mediciones cuantitativas de concentracion, tales como nanogramas de protema regulada por citocinas por mililitro de muestra o cantidad absoluta). En otros ejemplos, los valores medidos son cualitativos. Como

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con mediciones cualitativas, la comparacion se puede hacer por inspeccion de los datos numericos o por inspeccion de representaciones de los datos (por ej., inspeccionando representaciones graficas tales como graficos de barras o de lmeas).

En general se considera que un valor medido es sustancialmente similar a un valor de referencia si es aproximadamente 80% a aproximadamente 125% del valor de referencia.

El procedimiento de comparacion puede ser manual (tal como inspeccion visual por el profesional habilitado del metodo) o puede ser automatizado. Por ejemplo, un dispositivo de analisis (tal como un luminometro para medir senales quimioluminiscentes) puede incluir circuitos y programas informaticos que le permiten comparar un valor medido con un valor de referencia para una protema regulada por citocinas. Alternativamente, se puede usar un dispositivo separado (por ej., un ordenador digital) para comparar el valor o los valores medidos y el valor o los valores de referencia. Los dispositivos automatizados para comparacion pueden incluir valores de referencia almacenados para la protema o las protemas reguladas por citocinas que se estan midiendo o pueden comparar el valor o los valores medidos con valores de referencia que proceden de muestras de referencia medidas contemporaneamente (por ej., muestras de acetato de glatiramer).

Como sera evidente para los expertos en la materia, cuando se toman mediciones por replicado para el biomarcador o los biomarcadores ensayados, el valor medido que se compara con el valor de referencia es un valor que tiene en cuenta las mediciones replicadas. Las mediciones replicadas se pueden considerar usando la media o la mediana de los valores medidos como el “valor medido”.

Metodo de preparacion de acetato de glatiramer.

Los metodos y las composiciones de la presente invencion son utiles para evaluar una o mas propiedades de un lote de acetato de glatiramer. Los metodos comprenden preparar un lote de acetato de glatiramer, evaluar uno o mas de estabilidad, especificidad, potencia y actividad biologica usando los analisis descritos en la presente memoria y comparar las propiedades del lote de acetato de glatiramer con los de un compuesto de referencia (por ej., un lote estandarizado de acetato de glatiramer, por ej., uno que se haya homologado para uso terapeutico) o valor de referencia para un compuesto de referencia (por ej., una especificacion farmaceutica para acetato de glatiramer). Se dice que el lote de acetato de glatiramer es aceptable para uso farmaceutico si al menos se detecta un nivel predeterminado de una o mas protemas reguladas por citocina. El "nivel predeterminado" es el que se puede detectar usando el compuesto de referencia o el que se especifica en una especificacion farmaceutica para acetato de glatiramer.

Los siguientes Ejemplos se han incluido para proporcionar grna a un experto en la materia para practicar realizaciones representativas del contenido descrito en el momento presente. A la luz de la presente descripcion y el nivel general de destreza en la tecnica, los expertos pueden apreciar que los siguientes Ejemplos estan destinados a ser ejemplares solo y que se pueden emplear numerosos cambios, modificaciones y alteraciones sin apartarse del alcance del contenido descrito en el momento presente. Asf, se ofrecen los siguientes Ejemplos a modo de ilustracion y no a modo de limitacion.

Ejemplos

Ejemplo 1: Analisis de copolfmero.

Metodos

Se recibieron celulas THP-1 (ATCC, TIB-202) de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATCC). Se mostro que las celulas THP-1 estaban libres de contaminacion por micoplasmas usando un analisis de cultivo directo multimedios combinado con un analisis de tincion con el fluorocromo de ADN - celulas indicadoras (cat. # M-250, Bionique Testing Laboratories, Inc., Saranac Lake, NY). Se cultivaron celulas en medio de cultivo completo y se incubaron en una incubadora de CO2 al 5% a 37°C.

Se preparo medio de analisis fresco el dfa del analisis. El medio de analisis consistio en Suplemento Glutamax I 2 mM (Invitrogen, 35050-79) en medio sin suero X-VIVO 15 (Cambrex, 04-418Q). Estos reactivos se filtraron en una unidad de filtro de acetato de celulosa de 0,2 micrometros (Nalgene, 156-4.020). Despues de filtracion, se cubrio el frasco con papel de estano para proteger el medio de la luz.

Se almaceno COPAXONE® (acetato de glatiramer; Teva Pharmaceuticals) en la jeringa del fabricante a 4°C. Se prepararon muestras a una concentracion X2 en el medio de analisis de IFN-y X2 en tubos de microfuga siliconizados, esteriles. Las concentraciones finales de 0 pg/ml a 400 pg/ml se ensayaron en el analisis.

Se reconstituyo IFN-y humano (R&D Systems, 285-IF-100) con albumina de suero bovino (BSA) al 0,2% esteril en disolucion salina tamponada con fosfato (PBS) (Chemicon, 3.225-80).

El dfa previo al analisis, se sembraron celulas THP-1 a 2 x 105 celulas/ml (20 ml de volumen final). Estas celulas se recogieron por centrifugacion a 400 x g, 5 min, 18°C. Se lavaron las celulas una sola vez con medio de analisis (sin

IFN-y) y se volvieron a suspender en medio de analisis (sin IFN-y) y se contaron. Se volvieron a suspender celulas THP-1 a 5 X 105 celulas/ml en medio de analisis (con 0, 1, 10 y 100 ng/ml de concentracion final de IFN-y). Se sembraron celulas de concentraciones bajas a altas de acetato de glatiramer (50, 10, 2 y 0 ng/ml) a 50 jl por pozo con una pipeta multicanal. Se incubaron las placas de analisis durante 0 a 23 horas en una incubadora de CO2 al 5% 5 a 37°C.

Se recogio medio acondicionado en tubos siliconizados, no esteriles. Se centrifugaron los tubos a 400 x g, 5 min, 4°C. Se transfirieron los sobrenadantes a tubos siliconizados nuevos y se congelaron instantaneamente en nitrogeno lfquido. Se almaceno medio acondicionado congelado a -80°C hasta que se sometieron a analisis de citocina multiple Searchlight (Pierce Endogen, Woburn, MA).

10 Resultados

Efecto de COPAXONE® en un amplio panel de protemas:

Se examino el efecto de COPAXONE®, junto con IFN-y en la secrecion de un amplio panel de citocinas, quimiocinas, receptores solubles y proteasas de celulas tHP-1. La adicion de COPAXONE®, indujo un aumento acusado en la secrecion de la quimiocina, IP-10 (Tabla 1). IP-10 es una quimiocina regulada por IFN-y que se une al 15 receptor de CXCR3. Curiosamente, el tratamiento de COPAXONE® tambien dio como resultado mayores niveles de IFN-y observados en el medio de cultivo a 24 h, aun cuando se anadio IFN-y de manera exogena al comienzo del experimento. El efecto de COPAXONE® sobre la produccion de IFN-y puede justificar en parte su accion sinergica sobre la secrecion de IP-10. Otras quimiocinas tales como MCP-1 y MDC, que se unen a los receptores de CCR2 y CCR4, respectivamente, tambien mostraron una respuesta secretora robusta a COPAXONE®, aunque la magnitud 20 de la induccion no fue tan alta como se observo con IP-10 (Tabla 1). De manera similar, otras citocinas, tales como IL6, mostraron una respuesta sinergica a COPAXONE® e IFN-y. Algunas quimiocinas, tales como RANTES y TARC y las citocinas, tales como IL-10, IL12, p70, TNFalfa, TIMP1 y MMP9 mostraron pequenos incrementos con tratamiento de COPAXONE®.

Tabla 1: Efecto de tratamiento de COPAXONE® sobre la secrecion de quimiocina y citocina de celulas THP-1.

Quimiocinas: IP10 MCP1 MDC I309 IL-8 MIP1a RANTES TARC

IFNy solo (10 ng/ml): 17,9* 32,3* 2,2* 1,6* 25,6* 10,5* 96,7* 11,7*

IFNy+50 jg/ml I356: 4.060,5* 688,2* 23,6* 15,6* 217,1* 73,9* 352,2* 35,2*

Veces de incremento: 226,3 21,3 10,6 9,7 8,5 7,1 3,6 3,0

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Citocinas: IFNy IL-6 IL1p IL-10 IL12p70 TNFa

IFNy solo (10 ng/ml): 470,9* * CM cT * CM o' 0,4* * CD 33,3*

IFNy+ 50 jg/ml I356: 4.575,9* 3,8* 0,5* 0,7* 8,9* 61,3*

Veces de incremento: 9,7 19,0 2,4 2,0 1,9 1,8

Receptores/Proteasas: ICAM1 MMP2 TNFR1 TNFR2 TIMP1 MMP9

IFNy solo (10 ng/ml): 46,4* 158,2* 6,9* 11,0* 3.848,4* 39,1*

IFNy +50 jg/ml I356: 279,9* 915,9* 35,8* 34,4* 6.364,3* 8,9*

Veces de incremento: 6,0 5,8 5,2 3,1 1,7 0,2

*pg/ml

Efectos sinergicos:

Algunas realizaciones del analisis muestran un efecto sinergico. La Figura 1 ilustra el efecto sinergico de 30 COPAXONE® e IFN-y en la secrecion de IP-10 y otras quimiocinas. Las celulas THP-1 tratadas con IFN-y solo mostraron solo una produccion modesta de IP-10, I-TAC y MIG (todos ligandos de CXCR3). La adicion de COPAXONE® junto con IFN-y indujo un efecto dependiente de la concentracion, acusado, sobre la secrecion de las tres quimiocinas. Los niveles de IP-10, I-TAC y MIG segregados en presencia de 50 jg/ml de COPAXONE® y 10 ng/ml de IFN-y fueron 329-, 412- y 573 veces mayores, respectivamente, que los valores de referencia que

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contienen IFN-y solo. Los niveles de IFN-y medidos a las 24 horas tambien mostraron un incremento dependiente de la concentracion con tratamiento de COPAXONE®. Las celulas THP-1 se cultivaron en presencia de diversas concentraciones de suero fetal bovino (FBS) o en medio sin suero X-VIVO15. COPAXONE® indujo una secrecion robusta de las tres quimiocinas, IP-10, MIG e I-TAC, asf como secrecion de IFN-y en todas las condiciones; sin embargo, las celulas cultivadas en el medio definido sin suero X-VIVO15 mostraron las mayores veces de la induccion por encima de los valores de referencia. Se observo una respuesta similar con otras dos estirpes celulares mieloides humanas, U-937 y HL-60 y con celulas dendnticas humanas primarias.

La Tabla 2 muestra las veces de la induccion para IP-10, I-TAC y MIG con tratamiento de COPAXONE® e IFN- y por encima de IFN-y solo a las 23 horas. Las veces de la induccion por encima de los valores de referencia son maximas para 1-10 ng/ml de IFN-y. En gran medida, las celulas THP-1 no producen ninguna cantidad significativa de IP-10 cuando se tratan con COPAXONE® en ausencia de IFN-y e IFN-y solo (en ausencia de COPAXONE®) induce solo pequenas cantidades de secrecion de quimiocinas. El efecto sinergico de COPAXONE® e IFN-y se ilustra claramente en la Tabla 2. Se pueden detectar niveles inferiores de IP-10, I-TAC y MIG en el ensayo tan claramente como 3-6 horas de tratamiento con COPAXONE® y las concentraciones de IFN-y mayores; sin embargo, el intervalo dinamico es mejor a las 18-24 horas a que se pueden usar concentraciones de IFN-y inferiores.

Tabla 2. Induccion de quimiocinas a las 23 horas (expresado como veces de incremento por encima del control (0)

: IP-10 I-TAC MIG

: GA (pg/ml) GA (pg/ml) GA (pg/ml)

: 0 2 10 0 2 10 0 2 10

IFNy 0 ng/ml: 0 0 0 1 1 4 1 1 1

IFNy 10 ng/ml: 1 72 233 1 10 51 1 21 284

IFNy 100 ng/ml: 1 49 67 1 46 113 1 39 333

IFNy 1.000 ng/ml: 1 13 14 1 23 49 1 23 160

Dependencia de la dosis:

La Tabla 3 muestra la dependencia de la concentracion del analisis. Los valores de pg/ml con desviaciones estandar se muestran para induccion mediada por IFN-y (10 ng/ml) de IP-10, I-TAC y MIG a cada concentracion de acetato de glatiramer (GA). Cada valor representa 12 muestras de 6 analisis de THP-1 independientes con puntos duplicados, cada uno medido a las 22-24 horas de incubacion. En este caso, la lectura fue ensayo ELISA multiple Endogen Searchlight. Los numeros de pg/ml absolutos seran diferentes dependiendo del metodo de deteccion. Por ejemplo, se puede observar una diferencia de 5-10 veces entre el ensayo ELISA multiple Endogen Searchlight y un ELISA estandar. Los numeros absolutos tambien seran diferentes dependiendo del tiempo de incubacion y la concentracion de IFN-y. Sin embargo, dentro del mismo formato y metodo de analisis, el analisis se puede usar para comparar dos o mas preparaciones de copolfmero y/o para determinar un valor de referencia (por ej., un intervalo de equivalencia) por comparacion con los valores obtenidos con una preparacion de ensayo.

Tabla 3: Dependencia de la dosis de acetato de glatiramer (GA).

[GA] mg/ml: IP-10 pg/ml + Dev. Std. I-TAC pg/ml + Dev. Std. MIG pg/ml + Dev. Std.

0: 13,5 2,8 3,2 0,8 13,6 2,3

0,78: 259,2 69,1 16,5 5,2 149,7 33,2

1,56: 483,7 87 42,1 12,8 345,6 69,3

3,13: 580,8 107 82,6 9,1 933,6 132,9

6,25: 581,4 124,7 105,9 15 2.704,5 650,9

12,5: 782,6 179,9 179,2 21,9 3.608 635,2

25: 829 135,2 247,1 41 4.480,6 726,4

(continuacion)

50: 2.150,8 840,1 532,6 129,4 13.771,2 5.694

100: 12.865,1 1.839,5 2.444 238,4 45.353,3 8.983,7

200: 10.899 1.933,7 2.091,2 250,9 37.897,5 8.052,1

400: 6.111,3 976,7 1.560,5 220,8 27.574,5 4.725,5

Resumen

Este ejemplo muestra que la induccion mediada por acetato de glatiramer de citocinas, por ej., las quimiocinas IP-10, MIG e I-TAC, como respuesta a la estimulacion de la citocina pro-inflamatoria IFN-y se puede usar para evaluar la 5 actividad (por ej., una o mas de: potencia, pureza, estabilidad en el tiempo, actividad biologica o equivalencia para un estandar de referencia) de acetato de glatiramer. En general, una muestra con una mejora mayor dentro de un analisis comparativo se correlaciona con mayor potencia o estabilidad.

La mejora mediada por acetato de glatiramer de secrecion de IP-10, MIG e I-TAC en presencia de IFN-y es un resultado inesperado. Estos cuatro factores solubles se asocian tipicamente a una respuesta de las citocinas pro- 10 inflamatorias Th1 y se piensa que el acetato de glatiramer actua, en parte, disminuyendo una respuesta de Thl y activando una respuesta de Th2.

El mecanismo de accion preciso de acetato de glatiramer es complejo y aun no completamente entendido pero los metodos presentes proporcionan una manera de medir en una preparacion de copolfmero de muestra la actividad, potencia, estabilidad, especificidad (por ej., para equivalencia a COPAXONE® o equivalencia a un intervalo de 15 especificacion farmaceutica) de un ensayo o preparacion de copolfmero candidato.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

REIVINDICACIONES

1. Un metodo para evaluar una propiedad de acetato de glatiramer, comprendiendo el metodo:

(a) proporcionar al menos una celula mieloide;

(b) poner en contacto al menos una celula mieloide con una cantidad de acetato de glatiramer e IFN-y a una concentracion y un periodo de tiempo suficiente para inducir que la celula exprese una o mas protemas inducidas por IFN-y seleccionadas del grupo que consiste en: protema 10 inducible por interferon- y (IP-10), quimioatrayente-a de celulas T inducible con interferon (I-TAC) y monocina inducida por interferon-y (MIG) y

(c) detectar la protema inducida seleccionada del grupo que consiste en: protema 10 inducible por interferon- y (IP- 10), quimioatrayente-a de celulas T inducible con interferon (I-TAC) y monocina inducida por interferon-y (MIG) para evaluar una propiedad de acetato de glatiramer.
2. Un metodo para evaluar acetato de glatiramer, comprendiendo el metodo:

(a) proporcionar al menos una celula mieloide que es capaz de expresion de una protema que es inducida por IFN-y seleccionada del grupo que consiste en: protema 10 inducible por interferon- y (IP-10), quimioatrayente-a de celulas T inducible con interferon (I-TAC) y monocina inducida por interferon-y (MIG);

(b) poner en contacto al menos una celula mieloide con una cantidad de acetato de glatiramer e IFN-y a una concentracion y durante un periodo de tiempo suficiente para inducir que la celula exprese la protema inducida;

(c) medir la expresion, secrecion, induccion, presencia o nivel de la protema inducida seleccionada del grupo que consiste en: protema 10 inducible por interferon- y (IP-10), quimioatrayente-a de celulas T inducible con interferon (I- TAC) y monocina inducida por interferon-y (MIG) y

(d) comparar la expresion, secrecion, induccion, presencia o nivel, medido, de la protema inducida con un valor de referencia, un perfil de induccion de citocinas o una especificacion farmaceutica para una preparacion farmaceutica del mercado de acetato de glatiramer para evaluar una propiedad de acetato de glatiramer.
3. El metodo segun la reivindicacion 1, que comprende ademas una etapa (d) de comparar un valor para la produccion, secrecion, induccion, presencia o nivel de una o mas protemas inducidas por IFN-y con un valor de referencia, un perfil de induccion de citocinas o una especificacion farmaceutica para una preparacion farmaceutica comercializada de acetato de glatiramer.
4. El metodo segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 3, en el que el valor de referencia, el perfil de induccion de citocinas o la propiedad de especificacion farmaceutica para la preparacion farmaceutica comercializada de acetato de glatiramer es un valor que corresponde a una propiedad seleccionada del grupo que consiste en: potencia, especificidad, estabilidad, actividad y combinaciones de las mismas.
5. El metodo segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que la concentracion de IFN-y en la etapa (b) induce la expresion de una o mas protemas inducidas por IFN-y a un nivel mayor que la suma de: i) la expresion de una o mas protemas inducidas por IFN-y cuando la celula se pone en contacto con acetato de glatiramer en ausencia de IFN-y y ii) la expresion de una o mas protemas inducidas por IFN-y cuando la celula se pone en contacto con IFN-y en ausencia de acetato de glatiramer.
6. El metodo segun la reivindicacion 5, en el que la concentracion de IFN-y esta entre 0,01 ng/ml y 100 ng/ml, entre 1 ng/ml y 50 ng/ml o 10 ng/ml.
7. El metodo segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que el periodo de tiempo es entre 1 hora y 48 horas, entre 6 horas y 36 horas o entre 12 horas y 24 horas.
8. El metodo segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que la concentracion del acetato de glatiramer esta entre 0,5 pg/ml y 100 pg/ml, IFN-y esta presente a entre 1 ng/ml y 50 ng/ml y el periodo de tiempo es entre 12 horas y 24 horas y las celulas son celulas THP-I.
9. Un metodo de preparacion de una composicion farmaceutica de acetato de glatiramer, comprendiendo el metodo:

(a) proporcionar un lote de acetato de glatiramer;

(b) evaluar una propiedad del lote segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y

(c) determinar que el lote es aceptable para uso farmaceutico si el nivel de una o mas protemas inducidas por IFN-y iguala a un valor de referencia para acetato de glatiramer.
10. El metodo segun la reivindicacion 9, en el que el valor de referencia es un perfil de induccion de citocinas,

intervalo de equivalencia o especificacion farmaceutica para potencia, especificidad, estabilidad y/o actividad biologica para una preparacion farmaceutica comercializada de acetato de glatiramer.
11. Un metodo para evaluar la actividad, potencia, especificidad o estabilidad de una preparacion de acetato de glatiramer, comprendiendo el metodo:

5 (a) proporcionar una celula mieloide;

(b) poner en contacto la celula con:

(i) una cantidad de acetato de glatiramer e

(ii) IFN-y, a una concentracion y un periodo de tiempo suficiente para inducir que la celula exprese una protema inducida por IFN-y seleccionada del grupo que consiste en: protema 10 inducible por interferon- y (IP-10),

10 quimioatrayente-a de celulas T inducible con interferon (I-TAC) y monocina inducida por interferon-y (MIG) y

(c) comparar la presencia, el nivel, la produccion, secrecion, induccion de la protema inducida por IFN-y con un valor de referencia para acetato de glatiramer.
12. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la protema inducida por IFN-y es IP-10.
13. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la protema inducida por IFN-y es I-TAC. 15 14. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la protema inducida por IFN-y es MIG.