ES2472791T3 - Polip�ptidos natriur�ticos - Google Patents

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John C. Burnett Jr.
Candace Y. W. Lee
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Abstract

Un polipéptido de menos de 44 restos de aminoácidos de longitud, en el que dicho polipéptido comprende, en orden de amino terminal a carboxilo terminal: (a) la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 1 o la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 1 con no más de una adición de aminoácidos, sustracción de aminoácidos o sustitución de aminoácidos, (b) la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 2 o la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 2 con no más de dos adiciones de aminoácidos, sustracciones de aminoácidos o sustituciones de aminoácidos, y (c) la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 3 o la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 3 con no más de una adición de aminoácidos, sustracción de aminoácidos o sustitución de aminoácidos, en el que dicho polipéptido comprende actividad natriurética.

Description

Polip�ptidos natriur�ticos
Declaraci�n respecto de la presente investigación patrocinada por el gobierno federal
La presente invención se llev� a cabo con ayuda del gobierno mediante la subvención HL036634 concedida por los Institutos Nacionales del Corazón, Pulmón y Sangre. El gobierno tiene ciertos derechos sobre la presente invención.
Antecedentes
1. Campo técnico
El presente documento se refiere a polip�ptidos natriur�ticos. Por ejemplo, el presente documento proporciona procedimientos y materiales relacionados con polip�ptidos natriur�ticos y el uso de polip�ptidos natriur�ticos para tratar afecciones cardiovasculares y renales.
2. Información de antecedentes
Los polip�ptidos natriur�ticos son polip�ptidos que pueden causar natriuresis (excreci�n aumentada de sodio en la orina). Dichos polip�ptidos pueden producirse por el cerebro, corazón, ri��n y/o tejido vascular.
El documento EP 0497 368 A1 describe p�ptidos natriur�ticos, que incluyen p�ptidos natriur�ticos quiméricos. También se describe en el documento EP 0497 368 A1 agentes para suprimir el crecimiento de células musculares lisas vasculares que contienen esos p�ptidos como ingredientes eficaces.
Lee y Burnett (Heart Failure Reviews 2007, 12(2): 131-142) describen del mismo modo p�ptidos natriur�ticos quiméricos. Los autores proporcionan un artículo de revisión acerca de las aplicaciones terapéuticas de ciertos p�ptidos natriur�ticos en síndromes de insuficiencia cardiaca aguda.
Sumario
La invención puede definirse por las reivindicaciones adjuntas.
De acuerdo con una realización de la invención, se proporciona un polip�ptido de menos de 44 restos de amino�cidos de longitud, en el que dicho polip�ptido comprende, en orden de amino terminal a carboxilo terminal:
(a)
la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 con no más de una adición, sustracción o sustitución,
(b)
la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 con no más dos adiciones, sustracciones o sustituciones,
(c)
la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 con no más de una adición, sustracción o sustitución, en la que dicho polip�ptido comprende actividad natriur�tica.
El polip�ptido de acuerdo con la invención puede comprender, en un orden de amino terminal a carboxilo terminal:
(a)
la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1,
(b)
la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 con no más de dos adiciones, sustracciones o sustituciones, y
(c)
la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 con no más de una adición, sustracción o sustitución; o
(a)
la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 con no más de una adición, sustracción o sustitución,
(b)
la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2, y
(c)
la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 con no más de una adición, sustracción o sustitución; o
(a)
la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 con no más de una adición, sustracción o sustitución,
(b)
la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 con no más de dos adiciones, sustracciones o sustituciones, y
(c)
la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3.
El polip�ptido de acuerdo con la invención puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 4.
El polip�ptido de acuerdo con la invención puede comprender, en orden de amino terminal a carboxilo terminal:
(a)
la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 con no más de una sustitución conservativa de amino�cidos,
(b)
la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 con no más de dos adiciones, sustracciones o sustituciones, y
(c)
la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 con no más de una adición, sustracción o sustitución; o
(a)
la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 con no más de una adición, sustracción o sustitución,
(b)
la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 con no más de dos sustituciones conservativas de amino�cidos, y
(c)
la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 con no más de una adición, sustracción o sustitución; o
(a)
la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 con no más de una adición, sustracción o sustitución,
(b)
la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 con no más de dos adiciones, sustracciones o sustituciones, y
(c)
la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 con no más de una sustitución conservativa de amino�cidos.
El polip�ptido de acuerdo con la invención puede carecer de la capacidad para inducir hipotensi�n sist�mica.
El polip�ptido de acuerdo con la invención puede ser un polip�ptido sustancialmente puro.
De acuerdo con una realización de la invención, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica el polip�ptido de la invención.
Tambi�n, de acuerdo con una realización de la invención, se proporciona un vector, comprendiendo el vector un ácido nucleico que codifica el polip�ptido de la invención.
Adem�s, de acuerdo con una realización de la invención, se proporciona una célula huésped, comprendiendo la célula huésped un ácido nucleico que codifica el polip�ptido de la invención.
La célula huésped puede ser una célula huésped eucariota.
De acuerdo con una realización de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmac�uticamente aceptable y el polip�ptido de la invención.
Tambi�n, de acuerdo con una realización de la invención, se proporciona un polip�ptido de la invención para su uso en el aumento de la actividad natriur�tica en un mamífero sin disminuir la presión sanguínea.
De acuerdo con una realización de la invención, se proporciona un polip�ptido de la invención para su uso en el tratamiento de un mamífero que tiene una afección cardiovascular o afección renal, en el que dicho polip�ptido es para suministrarse en condiciones en las que la gravedad de una manifestación de dicha afección cardiovascular o afección renal se reduce. De acuerdo con una realización preferente, la administración de dicho polip�ptido a dicho mamífero no disminuye la presión sanguínea de dicho mamífero.
El presente documento se refiere a polip�ptidos natriur�ticos. Por ejemplo, el presente documento proporciona procedimientos y materiales relacionados con polip�ptidos natriur�ticos y el uso de polip�ptidos natriur�ticos para tratar afecciones cardiovasculares, afecciones renales, o tanto a afecciones cardiovasculares como afecciones renales. En algunos casos, un polip�ptido proporcionado en el presente documento puede tener actividad diurética, actividad natriur�tica, la capacidad para activar GMPc, la capacidad para aumentar la tasa de filtración glomerular, la capacidad para reducir la producción de renina, la capacidad para reducir la producción de angiotensina, la capacidad para reducir la producción de aldosterona, la capacidad para reducir las presiones de llenado cardiaco anormalmente elevadas, la capacidad para optimizar el flujo sanguíneo renal, o una combinación de las mimas. En algunos casos, un polip�ptido proporcionado en el presente documento puede aumentar los niveles end�genos de ANP, BNP y CNP. En algunos casos, un polip�ptido proporcionado en el presente documento puede carecer de la capacidad para disminuir la presión sanguínea y puede carecer de la capacidad para causar hipotensi�n sist�mica. En algunos casos, un polip�ptido proporcionado en el presente documento puede ser un agonista para el receptor A del p�ptido natriur�tico, receptor B del p�ptido natriur�tico, o tanto del receptor A del p�ptido natriur�tico como del receptor B del p�ptido natriur�tico.
En general, un aspecto del presente documento presenta un polip�ptido de menos de 44 restos de amino�cidos de longitud, en el que el polip�ptido comprende, en un orden de amino terminal a carboxilo terminal: (a) la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 con no más de una adición, sustracción o sustitución, (b) la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 con no más de dos adiciones, sustracciones o sustituciones, y (c) la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 con no más de una adición, sustracción o sustitución. El polip�ptido comprende actividad natriur�tica. El polip�ptido puede carecer de la capacidad para inducir hipotensi�n sist�mica. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1, la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2, y la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 con no más de una sustitución conservativa de amino�cidos. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 con no más de dos sustituciones conservativas de amino�cidos. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 con no más de una sustitución conservativa de amino�cidos. El polip�ptido puede ser un polip�ptido sustancialmente puro.
En otro aspecto, el presente documento presenta un ácido nucleico aislado que codifica un polip�ptido de menos de 44 restos de amino�cidos de longitud, en el que el polip�ptido comprende, en orden de amino terminal a carboxilo terminal: (a) la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 con no más de una adición, sustracción o sustitución, (b) la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 con no más de dos adiciones, sustracciones o sustituciones, y (c) la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 con no más de una adición, sustracción o sustitución. El polip�ptido comprende actividad natriur�tica. El polip�ptido puede carecer de la capacidad para inducir hipotensi�n sist�mica. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1, la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2, y la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 con no más de una sustitución conservativa de amino�cidos. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 con no más de dos sustituciones conservativas de amino�cidos. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 con no más de una sustitución conservativa de amino�cidos. El polip�ptido puede ser un polip�ptido sustancialmente puro.
En otro aspecto, el presente documento presenta un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un polip�ptido de menos de 44 restos de amino�cidos de longitud, en el que el polip�ptido comprende, en orden de amino terminal a carboxilo terminal: (a) la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 con no más de una adición, sustracción o sustitución, (b) la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 con no más de dos adiciones, sustracciones o sustituciones, y (c) la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 con no más de una adición, sustracción o sustitución. El polip�ptido comprende actividad natriur�tica. El polip�ptido puede carecer de la capacidad para inducir hipotensi�n sist�mica. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1, la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2, y la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 con no más de una sustitución conservativa de amino�cidos. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 con no más de dos sustituciones conservativas de amino�cidos. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 con no más de una sustitución conservativa de amino�cidos. El polip�ptido puede ser un polip�ptido sustancialmente puro.
En otro aspecto, el presente documento presenta una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica un polip�ptido de menos de 44 restos de amino�cidos de longitud, en la que el polip�ptido comprende, en orden de amino terminal a carboxilo terminal: (a) la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 con no más de una adición, sustracción o sustitución, (b) la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 con no más de dos adiciones, sustracciones o sustituciones, y (c) la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 con no más de una adición, sustracción o sustitución. El polip�ptido comprende actividad natriur�tica. El polip�ptido puede carecer de la capacidad para inducir hipotensi�n sist�mica. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1, la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2, y la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 con no más de una sustitución conservativa de amino�cidos. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 con no más de dos sustituciones conservativas de amino�cidos. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 con no más de una sustitución conservativa de amino�cidos. El polip�ptido puede ser un polip�ptido sustancialmente puro. La célula huésped puede ser una célula huésped eucari�tica.
En otro aspecto, el presente documento presenta una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmac�uticamente aceptable y un polip�ptido de menos de 44 restos de amino�cidos de longitud, en el que el polip�ptido comprende, en un orden de amino terminal a carboxilo terminal: (a) la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 con no más de una adición, sustracción o sustitución, (b) la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 con no más de dos adiciones, sustracciones o sustituciones, y (c) la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 con no más de una adición, sustracción o sustitución. El polip�ptido comprende actividad natriur�tica. El polip�ptido puede carecer de la capacidad para inducir hipotensi�n sist�mica. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1, la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2, y la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 con no más de una sustitución conservativa de amino�cidos. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 con no más de dos sustituciones conservativas de amino�cidos. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 con no más de una sustitución conservativa de amino�cidos. El polip�ptido puede ser un polip�ptido sustancialmente puro.
Tambi�n se divulga un procedimiento para aumentar la actividad natriur�tica en un mamífero sin disminuir la presión sanguínea. El procedimiento comprende administrar, al mamífero, un polip�ptido de menos de 44 restos de amino�cidos de longitud, en el que el polip�ptido comprende, en orden de amino terminal a carboxilo terminal: (a) la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 con no más de tres adiciones, sustracciones o sustituciones, (b) la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 con no más de cinco adiciones, sustracciones o sustituciones, y (c) la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 con no más de tres adiciones, sustracciones o sustituciones. El polip�ptido puede comprender actividad natriur�tica. El polip�ptido puede carecer de la capacidad para inducir hipotensi�n sist�mica. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1, la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2, y la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 con no más de tres sustituciones conservativas de amino�cidos. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 con no más de cinco sustituciones conservativas de amino�cidos. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 con no más de tres sustituciones conservativas de amino�cidos. El polip�ptido puede ser un polip�ptido sustancialmente puro.
Tambi�n se divulga un procedimiento para tratar a un mamífero que tiene una afección cardiovascular o afección renal. El procedimiento comprende administrar, al mamífero, un polip�ptido de menos de 44 restos de amino�cidos de longitud en condiciones en las que la gravedad de una manifestación de la afección cardiovascular o afección renal se reduce, en el que el polip�ptido comprende, en orden de amino terminal a carboxilo terminal: (a) la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 con no más de tres adiciones, sustracciones o sustituciones, (b) la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 con no más de cinco adiciones, sustracciones o sustituciones, y (c) la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 con no más de tres adiciones, sustracciones o sustituciones. El polip�ptido puede comprender actividad natriur�tica. El polip�ptido puede carecer de la capacidad para inducir hipotensi�n sist�mica. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1, la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2, y la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 con no más de tres sustituciones conservativas de amino�cidos. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 con no más de cinco sustituciones conservativas de amino�cidos. El polip�ptido puede comprender la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 con no más de tres sustituciones conservativas de amino�cidos. El polip�ptido puede ser un polip�ptido sustancialmente puro. La administración del polip�ptido al mamífero puede ser de tal forma que no disminuya la presión sanguínea del mamífero.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. En caso de conflicto, prevalecer� la presente memoria descriptiva, incluyendo sus definiciones.
Los detalles de una o más realizaciones de la invención se exponen en los dibujos adjuntos y la descripción a continuación. Otras características, objetos y ventajas de la invención ser�n evidentes a partir de la descripción y dibujos, y a partir de las reivindicaciones.
Descripci�n de los dibujos
La Figura 1 es un diagrama esquemático de un polip�ptido de CU-NP que tiene 32 restos de amino�cidos de longitud (SEC ID N�: 4). Los diez primeros restos de amino�cidos de SEC ID N�: 4 corresponden a los restos de amino�cido 1 a 10 de urodilatina humana y se designan como SEC ID N�: 1. Los restos de amino�cidos 11 a 27 de SEC ID N�: 4 corresponden a los restos de amino�cidos 6 a 22 de CNP humana madura y se designan como SEC ID N�: 2. Los restos de amino�cidos 28 a 32 de SEC ID N�: 4 corresponden a los restos de amino�cidos 28 a 32 de urodilatina humana y se designan como SEC ID N�: 3. La Figura 2 es un gráfico que representa la Presión de Perfusi�n Renal (estimada por PPR = PAM – PAD) de
perros normales anestesiados tratados con CU-NP o URO como se indica (media ! ETM; * = P<0,05 frente a línea basal; ‡ = P<0,05 entre grupos). La Figura 3 es un gráfico que representa la respuesta de GMPc a concentraciones equimolares de CU-NP, CNP y URO en glom�rulos caninos aislados (n = 3-7 para blancos, es decir, controles; n = 5-8 para glom�rulos,
† = P<0,0001 frente a blanco; * = P<0,01 frente a blanco). La Figura 4 es un gráfico que representa la respuesta de GMPc a concentraciones equimolares de CU-NP en presencia o ausencia de un antagonista de NPR-A (1 ∀M de A7195), un antagonista de NPR-B (1 ∀M de P19), o ambos antagonistas (A71915 seguido de P19, concentración final 1 ∀M para ambos) evaluado en glom�rulos caninos aislados (n = 2-4 para blancos; n = 3-6 para glom�rulos; * = P<0,05 frente a blanco; † = P<0,01 frente a blanco; ‡ = P<0,0001 frente a blanco). La Figura 5 es un gráfico que representa la respuesta de GMPc a CNP o CU-NP en ausencia o presencia de un anticuerpo de NPR-B (1:100) evaluado en células endoteliales a�rticas humanas.
Descripci�n detallada
El presente documento se refiere a polip�ptidos natriur�ticos. Por ejemplo, el presente documento proporciona procedimientos y materiales relacionados con polip�ptidos natriur�ticos y el uso de polip�ptidos natriur�ticos para tratar afecciones cardiovasculares (por ejemplo, insuficiencia cardiaca aguda descompensada, síndromes coronarios agudos, y la remodelación ventricular post-infarto de miocardio) y afecciones renales (por ejemplo, disfunción renal perioperatoria, disfunción renal secundaria a fallo cardiaco y nefropat�a diab�tica).
Un polip�ptido proporcionado en el presente documento tiene actividad natriur�tica. En algunos casos, tiene la capacidad para activar el GMPc, la capacidad para aumentar la tasa de filtración glomerular, la capacidad para reducir la producción de renina, la capacidad para reducir la producción de angiotensina, la capacidad para reducir la producción de aldosterona, la capacidad para reducir presiones de llenado cardiaco anormalmente elevadas, la capacidad para optimizar el flujo sanguíneo renal, o una combinación de las mismas. En algunos casos, un polip�ptido proporcionado en el presente documento puede aumentar los niveles end�genos de ANP, BNP y CNP. En algunos casos, un polip�ptido proporcionado en el presente documento puede carecer de la capacidad para disminuir la presión sanguínea y causar hipotensi�n sist�mica. En algunos casos, un polip�ptido proporcionado en el presente documento puede ser un agonista para el receptor A de p�ptido natriur�tico, receptor B de p�ptido natriur�tico, o tanto receptor A de p�ptido natriur�tico como receptor B de p�ptido natriur�tico.
Por ejemplo, un polip�ptido proporcionado en el presente documento puede incluir la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1, SEC ID N�: 2 y SEC ID N�: 3. En algunos casos, un polip�ptido proporcionado en el presente documento puede contener una secuencia de amino�cidos que se alinea con (a) la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 con una o cero adiciones, deleciones o sustituciones de amino�cidos, (b) la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 con dos
o menos (una o cero) adiciones, deleciones o sustituciones de amino�cidos y (c) la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 con una o cero adiciones, deleciones o sustituciones de amino�cidos. Por ejemplo, un polip�ptido proporcionado en el presente documento puede contener la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 con la excepción de que el primer resto de treonina o el último resto de serina de SEC ID N�: 1 se suprimen o reemplazan con un resto de amino�cido diferente.
Las sustituciones de amino�cidos pueden ser sustituciones de amino�cidos conservativas. La sustituciones conservativas de amino�cidos pueden ser, por ejemplo, asp�rtico-glut�mico como amino�cidos ácidos; lisina/arginina/histidina como amino�cidos básicos; leucina/isoleucina, metionina/valina, alanina/valina como amino�cidos hidrófobos; serina/glicina/alanina/treonina como amino�cidos hidrófilos. Las sustituciones conservativas de amino�cidos también incluyen agrupamientos basados en las cadenas laterales. Por ejemplo, un grupo de amino�cidos que tiene cadenas laterales alif�ticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de amino�cidos que tiene cadenas laterales alif�ticas-hidrox�licas es serina y treonina; un grupo de amino�cidos que tiene cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de amino�cidos que tiene cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y tript�fano; un grupo de amino�cidos que tiene cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de amino�cidos que tiene cadenas laterales que contienen azufre es ciste�na y metionina. Después de efectuar una sustitución de amino�cidos, las actividades del polip�ptido que contiene la sustitución de amino�cidos pueden evaluarse usando los ensayos descritos en el presente documento.
En algunos casos, un polip�ptido proporcionado en el presente documento puede contener (a) una primera secuencia de amino�cidos que o bien se expone en SEC ID N�: 1 o se alinea con la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 con una o cero deleciones o sustituciones de amino�cidos, (b) una segunda secuencia de amino�cidos que o bien se expone en SEC ID N�: 2 o se alinea con la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 con dos o menos (una o cero) adiciones o sustituciones de amino�cidos y (c) una tercera secuencia de amino�cidos que o bien se expone en SEC ID N�: 3 o se alinea con la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 con una o cero deleciones o sustituciones de amino�cidos. Por ejemplo, un polip�ptido proporcionado en el presente documento puede comprender o consistir en la secuencia expuesta en SEC ID N�: 4.
Un polip�ptido proporcionado en el presente documento tiene menos de 44 amino�cidos de longitud. Por ejemplo, un polip�ptido proporcionado en el presente documento puede ser de entre 28 y 42, entre 29 y 41, entre 30 y 40, entre 31 y 39 o entre 30 y 35 restos de amino�cidos de longitud. Se apreciar� que el polip�ptido con una longitud de 25 restos de amino�cidos es un polip�ptido con una longitud de 25 restos de amino�cidos.
En algunos casos, un polip�ptido proporcionado en el presente documento puede ser un polip�ptido sustancialmente puro. Como se usa en el presente documento, la expresión “sustancialmente puro” en referencia a un polip�ptido significa que el polip�ptido est� sustancialmente libre de otros polip�ptidos, lípidos, carbohidratos y ácido nucleico con los que naturalmente se asocia. Por tanto, un polip�ptido sustancialmente puro es cualquier polip�ptido que est� retirado de su entorno natural y es al menos un 60 por ciento puro o es cualquier polip�ptido sintetizado químicamente. Un polip�ptido sustancialmente puro puede ser al menos aproximadamente un 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 por ciento puro. Típicamente, un polip�ptido sustancialmente puro producir� una única banda principal en un gel de poliacrilamida no reductor.
Un polip�ptido proporcionado en el presente documento puede obtenerse mediante expresión de un ácido nucleico recombinante que codifica el polip�ptido o por síntesis química (por ejemplo, usando procedimientos de síntesis de polip�ptidos en fase sólida o un sintetizador pept�dico como un Peptide Synthesizer ABI 431A; Applied Biosystems; Foster City, CA). Por ejemplo, puede usarse tecnología recombinante convencional que usa vectores de expresión que codifican un polip�ptido proporcionado en el presente documento. Los polip�ptidos resultantes pueden purificarse a continuación usando, por ejemplo, técnicas cromatogr�ficas de afinidad y HPLC. Puede medirse el alcance de la purificación por cualquier procedimiento adecuado, incluyendo pero sin limitación: cromatograf�a en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatograf�a líquida de alto rendimiento. Un polip�ptido proporcionado en el presente documento puede diseñarse o modificarse por ingeniería genética para contener una secuencia marcadora que permite que el polip�ptido se purifique (por ejemplo, capturado en una matriz de afinidad). Por ejemplo, puede usarse un marcador como c-myc, hemaglutinina, polihistidina o marcador Flag™ (Kodak) para ayudar en la purificación del polip�ptido. Dichos marcadores pueden insertarse en cualquier parte en el polip�ptido incluyendo tanto en los extremos carboxilo como amino. Otras fusiones que pueden emplearse incluyen enzimas que ayuden en la detección del polip�ptido, tales como fosfatasa alcalina.
Un polip�ptido proporcionado en el presente documento puede producirse para contener tres regiones, una primera región que incluye un extremo N-terminal (por ejemplo, una secuencia N-terminal de un polip�ptido de urodilatina humana), una segunda región que incluye una estructura en anillo de un polip�ptido natriur�tico maduro tal como un polip�ptido de CNP humano, y una tercera región que incluye un extremo C-terminal (por ejemplo, una secuencia Cterminal de un polip�ptido de urodilatina humana).
Un polip�ptido proporcionado en el presente documento puede usarse para tratar enfermedades cardiovasculares, insuficiencia cardiaca congestiva, infarto de miocardio, enfermedades de las arterias coronarias, enfermedades renales. Por ejemplo, un polip�ptido de CU-NP que tiene la secuencia de amino�cidos expuesta en SEC ID N�: 4 puede administrarse a un ser humano que tenga enfermedad de las arterias coronarias en condiciones en las que la gravedad de los síntomas de la enfermedad de la arteria coronaria en humanos se reduzca.
Un polip�ptido proporcionado en el presente documento puede formularse como una composición farmacéutica mediante la mezcla con excipientes o vehículos no tóxicos farmac�uticamente aceptables. Dichas composiciones pueden administrarse a un sujeto que lo necesite en una cantidad eficaz para tratar, por ejemplo, afecciones de corazón, hígado, ri��n, u otras que retengan sodio. Las composiciones farmacéuticas pueden prepararse para administración parenteral, particularmente en forma de soluciones o suspensiones líquidas en soluciones fisiológicas tamponadas acuosas; para administración oral, particularmente en forma de comprimidos o cápsulas; o para administración intranasal, particularmente en forma de polvos, gotas nasales o aerosoles. Las composiciones para otras vías de administración pueden prepararse según se desee empleando procedimientos apropiados.
Las formulaciones para administración parenteral pueden incluir como excipientes comunes, agua estéril, solución salina, polialquilenglicoles tales como polietilenglicol, aceites de origen vegetal, naftalenos hidrogenados, y combinaciones de los mismos. En algunos casos, pueden usarse pol�mero l�ctido biodegradable, biocompatible, copol�mero l�ctido/glic�lido, copol�meros de polioxietileno-polioxipropileno, o combinaciones de los mismos como excipientes para controlar la liberación del polip�ptido in vivo. Otros sistemas adecuados de suministro parenteral que pueden usarse incluyen, sin limitación, partículas de copol�mero de etileno-acetato de vinilo, bombas osm�ticas, sistemas de infusión implantables, liposomas, y combinaciones de los mismos. Las formulaciones para administración por inhalaci�n pueden incluir excipientes tales como lactosa. Las formulaciones para inhalaci�n pueden ser soluciones acuosas que contienen, por ejemplo, polioxietileno-9-lauril éter, glicocolato, desoxicolato, o combinaciones de los mismos, o pueden ser soluciones oleosas para administración en forma de gotas nasales. Si se desea, una composición que contiene un polip�ptido proporcionado en el presente documento puede formularse como gel para aplicarse por vía intranasal. Las formulaciones para administración parenteral pueden incluir glicocolato para administración bucal.
Para administración oral, pueden prepararse comprimidos o cápsulas empleando procedimientos apropiados con excipientes farmac�uticamente aceptables tales como agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); cargas (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina
o hidrogenofosfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); disgregantes (por ejemplo, almidón de patata o glicolato de almidón de sodio); o agentes humectantes (por ejemplo, lauril sulfato de sodio). Los comprimidos pueden recubrirse usando procedimientos apropiados. Pueden formularse preparaciones para administración oral para proporcionar liberación controlada del polip�ptido.
Las preparaciones nasales pueden presentarse en forma de líquido o como un producto seco. Las suspensiones o soluciones acuosas nebulizadas pueden incluir vehículos o excipientes para ajustar el pH y/o la tonicidad.
�cidos nucleicos que codifican polip�ptidos
El presente documento también proporciona ácidos nucleicos aislados que codifican uno o más de los polip�ptidos proporcionados en el presente documento. El término “aislado” como se usa en el presente documento en referencia a ácido nucleico se refiere a un ácido nucleico de origen natural que no se encuentra inmediatamente contiguo con ambas de las secuencias con las que es inmediatamente contiguo (una en el extremo 5’ y otra en el extremo 3’) en el genoma de origen natural del organismo del que se deriva. Por ejemplo, un ácido nucleico aislado puede ser, sin limitación, una molécula de ADN recombinante de cualquier longitud, siempre que una de las secuencias de ácido nucleico normalmente encontradas flanqueando inmediatamente esa molécula de ADN recombinante en un genoma de origen natural est� eliminada o ausente. Por tanto, un ácido nucleico aislado incluye, sin limitación, un ADN recombinante que existe como una molécula separada (por ejemplo, un ADNc o un fragmento de ADN gen�mico producido mediante PCR o tratamiento con endonucleasa de restricción) independiente de otras secuencias as� como un ADN recombinante que se incorpora en un vector, un pl�smido de replicaci�n autónoma, un virus (por ejemplo, un retrovirus, adenovirus o herpes virus), o en el ADN gen�mico de un procariota o eucariota. Además, un ácido nucleico aislado puede incluir una molécula de ADN recombinante que es parte de una secuencia de ácido nucleico híbrida o de fusión.
El término “aislado” como se usa en el presente documento en referencia a un ácido nucleico también incluye cualquier ácido nucleico de origen no natural ya que las secuencias de ácido nucleico de origen no natural no se encuentran en la naturaleza y no tienen secuencias inmediatamente contiguos en un genoma de origen natural. Por ejemplo, un ácido nucleico de origen no natural tal como un ácido nucleico modificado por ingeniería genética se considera un ácido nucleico aislado. Un ácido nucleico modificado por ingeniería genética (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un polip�ptido que comprende o consiste en la secuencia de amino�cidos expuesta en SEC ID N�: 4) puede fabricarse empleando técnicas comunes de clonaci�n molecular o síntesis química de ácidos nucleicos. Un ácido nucleico aislado de origen no natural puede ser independiente de otras secuencias, o incorporarse en un vector, un pl�smido de replicaci�n autónoma, un virus (por ejemplo, un retrovirus, adenovirus o herpes virus) o el ADN gen�mico de un procariota o eucariota. Además, un ácido nucleico de origen no natural puede incluir una molécula de ácido nucleico que es parte de una secuencia de ácido nucleico híbrida o de fusión. Un ácido nucleico existente de entre cientos a millones de otros ácidos nucleicos dentro de, por ejemplo, bibliotecas de ADNc o bibliotecas gen�micas, o cortes de geles que contienen un producto de digestión de restricción de ADN gen�mico, no deben considerarse un ácido nucleico aislado.
Como se usa en el presente documento, la expresión “ácido nucleico” se refiere tanto a ARN como a ADN, incluyendo ARNm, ADNc, ADN gen�mico, ADN sintético (por ejemplo, sintetizado químicamente), y análogos de ácidos nucleicos. El ácido nucleico puede ser bicatenario o monocatenario, y en el caso de monocatenario, puede ser la cadena sentido o la cadena antisentido. Además, el ácido nucleico puede ser circular o lineal. Los análogos de ácidos nucleicos pueden modificarse en el resto de la base, en el resto del azúcar o la cadena principal de fosfato para mejorar, por ejemplo, la estabilidad, hibridación o solubilidad de un ácido nucleico. Las modificaciones en el resto de la base incluyen desoxiuridina por desoxitimidina, y 5-metil-2’-desoxicitidina y 5-bromo-2’-desoxicitidina por desoxicitidina. Las modificaciones en el resto de azúcar pueden incluir modificación del hidroxilo 2’ del azúcar de ribosa para formar azúcares de 2’-O-metilo o 2’-O-alilo. La cadena principal de fosfato de desoxirribosa puede modificarse para producir ácidos nucleicos morfolino, en los que cada resto de base se une a un anillo morfolino de seis miembros, o ácidos nucleicos pept�dicos, en los que el esqueleto de desoxifosfato se reemplaza por una cadena principal de pseudop�ptido y se mantienen las cuatro bases. Véase, por ejemplo, Summerton y Weller Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 7: 187-195 (1997); y Hyrup y col. Bioorgan. Med. Chem., 4: 5-23 (1996). Además, el esqueleto de desoxifosfato puede reemplazarse con, por ejemplo, una cadena principal de fosforotioato o fosforoditioato, una cadena principal de fosforamidita, o una cadena principal de alquil fosfotri�ster.
Un ácido nucleico proporcionado en el presente documento puede comprender o consistir en una secuencia que codifica la secuencia de amino�cidos expuesta en SEC ID N�: 4. Por ejemplo, dicho ácido nucleico puede contener la secuencia de ácido nucleico humana para CNP y urodilatina modificada por ingeniería genética para codificar la secuencia de amino�cidos expuesta en SEC ID N�: 4.
T�picamente, un ácido nucleico aislado proporcionado en el presente documento tiene al menos 10 nucleótidos de longitud (por ejemplo, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400 o más nucleótidos de longitud). Las moléculas de ácido nucleico que son menores que la longitud completa pueden ser útiles, por ejemplo, como cebadores o sondas para fines de diagnóstico. Las moléculas de ácido nucleico aisladas pueden producirse por técnicas convencionales, incluyendo, sin limitación, técnicas de clonaje molecular comunes y de síntesis química de ácidos nucleicos. Por ejemplo, pueden usarse técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). PCR se refiere a un procedimiento o técnica en la que se amplifican enzim�ticamente ácidos nucleicos diana. La información de secuencia de los extremos de la región de interés o más all� se emplea típicamente para diseñar cebadores de oligonucle�tidos que son idénticos en secuencia a las cadenas opuestas del molde a amplificar. La PCR puede usarse para amplificar secuencias específicas a partir de ADN as� como de ARN, incluyendo secuencias de ADN gen�mico total o ARN celular total. Los cebadores típicamente tienen de 15 a 50 nucleótidos de longitud, pero pueden variar desde 10 nucleótidos a cientos de nucleótidos de longitud. Por ejemplo, un cebador puede tener 12, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40 o 45 nucleótidos de longitud. Un cebador puede purificarse a partir de una digestión de restricción mediante procedimientos convencionales, o puede sintetizarse químicamente. Los cebadores típicamente son monocatenarios para máxima eficiencia en la amplificación, pero un cebador puede ser bicatenario. Los cebadores bicatenarios se desnaturalizan primero (por ejemplo, tratados con calor) para separar las cadenas antes de usarse en amplificación. Las técnicas generales de PCR se describen, por ejemplo, en PCR Primer: A Laboratory Manual, ed. por Dieffenbach y Dveksler, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995. Cuando se emplea ARN como fuente de plantilla, puede usarse transcriptasa inversa para sintetizar una cadena de ADN complementario (ADNc). La reacción en cadena de la ligasa, amplificación por desplazamiento de cadena, replicaci�n de secuencia autosostenida o amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico también pueden usarse para obtener ácidos nucleicos aislados como se describe en otros documentos (Lewis, Genetic Engineering News, 12(9): 1 (1992); Guatelli y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 1874-1878 (1990); y Weiss, Science, 254: 1292 (1991)).
Los ácidos nucleicos aislados también pueden sintetizarse químicamente, ya sea como una única molécula de ácido nucleico (por ejemplo, usando síntesis de ADN automatizada en la dirección 3’ a 5’ usando tecnología de fosforamidita) o como una serie de oligonucle�tidos. Por ejemplo, pueden sintetizarse uno o más pares de oligonucle�tidos largos (por ejemplo, >100 nucleótidos) que contengan la secuencia deseada, conteniendo cada par un segmento corto de complementariedad (por ejemplo, de aproximadamente 15 nucleótidos) de tal forma que se forma un dúplex cuando el par de oligonucle�tidos se hibrida. Se usa la ADN polimerasa para extender los oligonucle�tidos, dando lugar a una molécula de ácido nucleico bicatenaria sencilla por par de oligonucle�tidos, que a continuación puede ligarse en un vector.
Los ácidos nucleicos aislados también pueden obtenerse mediante mutag�nesis. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polip�ptido que tiene la secuencia expuesta en las SEC ID N�: 1, 2, 3 o 4 puede mutarse utilizando técnicas convencionales tales como, por ejemplo, mutag�nesis dirigida a oligonucle�tidos y/o mutag�nesis dirigida al sitio mediante PCR. Véase Short Protocols in Molecular Biology, Capítulo 8, Green Publishing Associates y John Wiley & Sons, Editado por Ausubel y col., 1992. Dichas mutaciones incluyen adiciones, deleciones, sustituciones y combinaciones de las mismas.
Vectores y células huésped
El presente documento también proporciona vectores que contienen un ácido nucleico proporcionado en el presente documento. Como se usa en el presente documento, un “vector” es un replic�n, tal como un pl�smido, fago o c�smido, en el cual puede insertarse otro segmento de ADN para producir la replicaci�n del segmento insertado. Un vector puede ser un vector de expresión. Un “vector de expresión” es un vector que incluye una o más secuencias de control de la expresión, y una “secuencia de control de la expresión” es una secuencia de ADN que controla y regula la transcripción y/o traducción de otra secuencia de ADN.
En un vector de expresión proporcionado en el presente documento, el ácido nucleico puede unirse operativamente a una o más secuencias de control de la expresión. Como se usa en el presente documento, “unido operativamente” significa incorporado en una construcción genética de tal forma que las secuencias de control de la expresión controlen de manera eficaz la expresión de una secuencia codificante de interés. Los ejemplos de secuencias de control de la expresión incluyen promotores, potenciadores y regiones terminadoras de la transcripción. Un promotor es una secuencia de control de la expresión compuesta de una región de una molécula de ADN, típicamente dentro de 100 nucleótidos cadena arriba del punto en el que comienza la transcripción (generalmente cerca del sitio de iniciación para la ARN polimerasa II). Para poner una secuencia codificante bajo el control de un promotor, puede ser necesario posicionar el sitio de inicio de la traducción del marco de lectura traduccional del polip�ptido entre uno y aproximadamente cincuenta nucleótidos cadena abajo del promotor. Los potenciadores proporcionan especificidad de expresión en términos de tiempo, localización, y nivel. A diferencia de los promotores, los potenciadores pueden funcionar cuando se localizan a diversas distancias del sitio de transcripción. Un potenciador también puede localizarse cadena abajo del sitio de iniciación de la transcripción. Una secuencia codificante est� “unida operativamente” y “bajo el control” de secuencias de control de la expresión en una célula cuando la ARN polimerasa es capaz de transcribir la secuencia codificante en ARNm, que a continuación puede traducirse en el polip�ptido codificado por la secuencia codificante.
Los vectores de expresión adecuados incluyen, sin limitación, pl�smidos y vectores virales derivados de, por ejemplo, bacteri�fagos, baculovirus, virus del mosaico del tabaco, herpes virus, citomegalovirus, retrovirus, poxvirus, adenovirus y virus adeno-asociados. Se encuentran disponibles en el mercado numerosos vectores y sistemas de expresión de corporaciones tales como Novagen (Madison, WI), Clontech Laboratories (Mountain View, CA), Stratagene (La Jolla, CA), e Invitrogen/Life Technologies (Carlsbad, CA).
Un vector de expresión puede incluir una secuencia marcadora diseñada para facilitar la manipulación posterior de la secuencia de ácido nucleico expresada (por ejemplo, purificación o localización). Las secuencias marcadoras, tales como las secuencias de la proteína verde fluorescente (GFP), glutati�n S-transferasa (GST), polihistidina, c-myc, hemaglutinina o marcador Flag™ (Kodak, New Haven, CT) se expresan típicamente como una fusión con el polip�ptido codificado. Dichos marcadores pueden insertarse en cualquier parte del polip�ptido incluyendo los extremos carboxilo o amino.
El presente documento también proporciona células huéspedes que contienen una molécula de ácido nucleico y/o un vector de ácido nucleico proporcionado en el presente documento. La expresión “célula huésped” se refiere a células procariotas y eucariotas en las que puede introducirse una molécula de ácido nucleico o vector. Puede usarse cualquier procedimiento para introducir ácido nucleico en una célula. Por ejemplo, pueden usarse precipitación de fosfato cálcico, electroporaci�n, choque térmico, lipofecci�n, microinyecci�n, y transferencia de ácido nucleico mediada por virus para introducir el ácido nucleico en las células. Además, el ADN desnudo puede dispensarse directamente a las células in vivo como se describe en otros documentos (Patentes de los Estados Unidos N� 5.580.859 y 5.589.466).
Detecci�n de polip�ptidos
El presente documento proporciona procedimientos y materiales para detectar un polip�ptido proporcionado en el presente documento. Dichos procedimientos y materiales pueden usarse para controlar los niveles de polip�ptido en un mamífero que recibe el polip�ptido como un agente terapéutico. Un polip�ptido proporcionado en el presente documento (por ejemplo, un polip�ptido de CU-NP que tiene la secuencia de amino�cidos expuesta en SEC ID N�: 4) puede detectarse, por ejemplo, inmunol�gicamente usando uno o más anticuerpos. Como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” incluye moléculas intactas as� como fragmentos de las mismas que son capaces de unirse a un determinante epit�pico de un polip�ptido proporcionado en el presente documento. El término “ep�topo” se refiere a un determinante antig�nico o un ant�geno al que se une el par�topo de un anticuerpo. Los determinantes epit�picos normalmente consisten en agrupaciones de superficie químicamente activas de moléculas tales como amino�cidos o cadenas laterales de azúcares, y típicamente tienen características estructurales tridimensionales específicas, as� como características de carga específicas. Los ep�topos generalmente tienen al menos cinco amino�cidos contiguos (un ep�topo continuo), o como alternativa pueden ser un conjunto de amino�cidos no contiguos que definen una estructura concreta (por ejemplo, un ep�topo conformacional). El término “anticuerpo" incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados o quiméricos, fragmentos de anticuerpo Fv de cadena sencilla, fragmentos Fab, y fragmentos F(ab)2. Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpo que est�n contenidas en el suero de los animales inmunizados. Los anticuerpos monoclonales son poblaciones homogéneas de anticuerpos para un ep�topo concreto de un ant�geno.
Pueden generarse fragmentos de anticuerpo que tienen afinidad de unión específica por un polip�ptido proporcionado en el presente documento (por ejemplo, un polip�ptido de CU-NP) que tiene la secuencia de amino�cidos expuesta en SEC ID N�: 4) mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, pueden producirse fragmentos F(ab’)2 mediante digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo; los fragmentos Fab pueden generarse reduciendo los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab’)2. En algunos casos, pueden construirse bibliotecas de expresión de Fab. Véase, por ejemplo, Huse y col., Science, 246: 1275 (1989). Una vez producidos, los anticuerpos
o fragmentos de los mismos pueden ensayarse para reconocimiento de un polip�ptido proporcionado en el presente documento mediante procedimientos de inmunoensayo convencional incluyendo técnicas de ELISA, radioinmunoensayo, y transferencias de Western. Véase, Short Protocols in Molecular Biology, Capítulo 11, Green Publishing Associates y John Wiley & Sons, Editado por Ausubel, F.M y col., 1992.
En los ensayos inmunol�gicos, puede marcarse un anticuerpo que tenga afinidad de unión específica por un polip�ptido proporcionado en el presente documento o un anticuerpo secundario que se una a dicho anticuerpo, ya sea directa o indirectamente. Los marcadores adecuados incluyen, sin limitación, radion�clidos (por ejemplo, 125I 131I,35S 3H, 32P, 33Po 14C), restos fluorescentes (por ejemplo, fluoresce�na, FITC, PerCP, rodamina o PE), restos luminiscentes (por ejemplo, nanopart�culas de Qdot™ proporcionadas por Invitrogen (Carlsbad, CA)), compuestos que absorben luz de una longitud de onda definida, o enzimas (por ejemplo, fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante). Los anticuerpos pueden marcarse indirectamente mediante conjugación con biotina y a continuación detectarse con avidina o estreptavidina marcada con una molécula descrita anteriormente. Los procedimientos de detección o cuantificación de un marcador dependen de la naturaleza del marcador y son conocidos en la técnica. Los ejemplos de detectores incluyen, sin limitación, película de rayos x, contadores de radiactividad, contadores de centelleo, espectrofotómetros, color�metros, fluor�metros, lumin�metros y densit�metros. Pueden usarse combinaciones de estos enfoques (incluyendo ensayos “multi-capa”), familiares para los expertos en la técnica, para mejorar la sensibilidad de los ensayos.
Los ensayos inmunol�gicos para detectar un polip�ptido proporcionado en el presente documento pueden efectuarse en una variedad de formatos conocidos, incluyendo ensayos tipo s�ndwich, ensayos de competición (RIA competitivo), o inmunoensayos de puente. Véase, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos N� 5.296.347, 4.233.402, 4.098.876, y 4.034.074. Los métodos de detección de un polip�ptido proporcionado en el presente documento incluyen generalmente poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo que se una a un polip�ptido proporcionado en el presente documento y detectar la unión del polip�ptido al anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo que tenga afinidad de unión específica por un polip�ptido proporcionado en el presente documento puede inmovilizarse en un sustrato sólido mediante cualquiera de una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica y después exponerse a la muestra biológica. La unión del polip�ptido al anticuerpo en el sustrato sólido puede detectarse aprovechando el fenómeno de resonancia de plasm�n superficial, que da como resultado un cambio en la intensidad de la resonancia de plasm�n superficial tras la unión que puede detectarse cualitativamente
o cuantitativamente mediante un instrumento apropiado, por ejemplo, un aparato Biacore (Biacore International AB, Rapsgatan, Suecia). En algunos casos, el anticuerpo puede marcarse y detectarse como se ha descrito anteriormente. Puede generarse una curva patrón usando cantidades conocidas de un polip�ptido proporcionado en el presente documento para ayudar en la cuantificación de los niveles del polip�ptido.
En algunas realizaciones, un ensayo de tipo “s�ndwich” en que se inmoviliza un anticuerpo de captura en un sustrato sólido puede usarse para detectar la presencia, ausencia o nivel de un polip�ptido proporcionado en el presente documento. El sustrato sólido puede ponerse en contacto con la muestra biológica de tal forma que cualquier polip�ptido de interés en la muestra pueda unirse al anticuerpo inmovilizado. La presencia, ausencia o nivel del polip�ptido unido al anticuerpo puede determinarse usando un anticuerpo “de detección” que tenga afinidad de unión específica por el polip�ptido. En algunas realizaciones, puede usarse un anticuerpo de captura que tiene afinidad de unión por CNP o urodilatina as� como por un polip�ptido proporcionado en el presente documento. En esta realización, puede usarse un anticuerpo de detección que tiene afinidad de unión específica por un polip�ptido particular proporcionado en el presente documento (por ejemplo, un polip�ptido de CU-NP que tiene la secuencia de amino�cidos expuesta en SEC ID N�: 4). Se entiende que en los ensayos de tipo s�ndwich, el anticuerpo de captura no debe unirse al mismo ep�topo (o intervalo de ep�topos en el caso de un anticuerpo policlonal) que el anticuerpo de detección. Por tanto, si se usa un anticuerpo monoclonal como anticuerpo de captura, el anticuerpo de detección puede ser otro anticuerpo monoclonal que se una a un ep�topo que o bien est� físicamente separado o se solapa únicamente de manera parcial con el ep�topo al que se une el anticuerpo monoclonal de captura, o un anticuerpo policlonal que se une a ep�topos distintos de, o además de, aquellos a los que se une el anticuerpo monoclonal de captura. Si se usa un anticuerpo policlonal como anticuerpo de captura, el anticuerpo de detección puede ser o bien un anticuerpo monoclonal que se une a un ep�topo que est� o bien físicamente separado de o parcialmente solapado sobre cualquiera de los ep�topos a los que se une el anticuerpo policlonal de captura, o un anticuerpo policlonal que se une a ep�topos distintos de, o además de, aquellos a los que se une el anticuerpo policlonal de captura. Los ensayos de tipo s�ndwich pueden efectuarse como ensayos de ELISA de tipo s�ndwich, ensayos de transferencia de Western de tipo s�ndwich, o ensayos de detección inmunomagn�tica de tipo s�ndwich.
Los sustratos sólidos adecuados a los que un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo de captura) puede unirse incluyen, sin limitación, placas de microtitulaci�n, tubos, membranas tales como membranas de nailon o nitrocelulosa, y perlas o partículas (por ejemplo, perlas o partículas de agarosa, celulosa, vidrio, poliestireno, poliacrilamida, magnéticas o magnetizables). Las partículas magnéticas o magnetizables pueden ser particularmente útiles cuando se usa un sistema de inmunoensayo automatizado.
Pueden producirse anticuerpos que tienen afinidad de unión específica por un polip�ptido proporcionado en el presente documento mediante procedimientos convencionales. Por ejemplo, un polip�ptido puede producirse de manera recombinante como se ha descrito anteriormente, puede purificarse a partir de una muestra biológica (por ejemplo, un sistema de expresión heter�logo), o puede sintetizarse químicamente, y usarse para inmunizar animales huéspedes, incluyendo conejos, pollos, ratones, cobayas o ratas. Por ejemplo, un polip�ptido que tiene la secuencia de amino�cidos expuesta en SEC ID N�: 4 o fragmentos de la misma que tengan al menos seis amino�cidos de longitud, puede usarse para inmunizar un animal. Varios adyuvantes que pueden usarse para aumentar la respuesta inmunol�gica dependen de las especies huéspedes e incluyen adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plur�nicos, polianiones, p�ptidos, emulsiones oleaginosas, hemocianina de lapa californiana y dinitrofenol. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando un polip�ptido proporcionado en el presente documento y tecnología de hibridoma convencional. En particular, los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse mediante cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo tal como se describe por Kohler y col., Nature, 256: 495 (1975), la técnica de hibridoma de linfocito B humano (Kosbor y col., Immunology Today, 4: 72 (1983); Cole y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 2026 (1983)), y la técnica de hibridoma EBV (Cole y col., “Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,” Alan R. Liss, Inc., p�gs. 77-96 (1983)). Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, y cualquier subclase de las mismas. El hibridoma que produce los anticuerpos monoclonales puede cultivarse in vitro e in vivo.
Otras técnicas para detectar un polip�ptido proporcionado en el presente documento incluyen técnicas espectrofotom�tricas de masas tales como ionizaci�n por electropulverizaci�n (ESI) y desorci�n-ionizaci�n por láser asistida por matriz (MALDI). Véase, por ejemplo, Gevaert y col., Electrophoresis, 22(9): 1645-51 (2001); Chaurand y col., J. Am. Soc. Mass Spectrom., 10(2): 91-103 (1999). Los espectrómetros de masas útiles para dichas aplicaciones est�n disponibles a través de Applied Biosystems (Foster City, CA), Bruker Daltronics (Billerica, MA), y Amersham Pharmacia (Sunnyvale, CA).
La invención se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos. Los ejemplos no pertenecientes a la invención son para fines únicamente ilustrativos.
Ejemplos
Ejemplo 1 – Síntesis de CU-NP
Se dise�� un polip�ptido con la secuencia expuesta en la Figura 1 y se sintetizó usando un Sintetizador Pept�dico ABI 431A. Este polip�ptido se cita como polip�ptido de CU-NP (Figura 1). El polip�ptido de CU-NP sintetizado se
5 confirm� mediante cromatograf�a líquida de alto rendimiento/espectrometr�a de masas. Su peso molecular es 3535,09, y su secuencia de amino�cidos es Thr-Ala-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Met-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr (SEC ID N�: 4) con un puente disulfuro que une los restos de Cys (Figura 1).
Ejemplo 2 – Efectos in vivo de CU-NP
10 Se evalu� la función cardiorrenal en tres perros normales anestesiados. Se obtuvieron los aclaramientos en la preinfusi�n, durante la infusión intravenosa de 10, 50 y 100 ng de CU-NP/kg/minuto durante 45 minutos a cada nivel de dosificación (es decir, cada perro recibió infusiones de 45 minutos consecutivas de 10, 50 y 100 ng/kg/minuto) y post-infusión. La reabsorci�n tubular de Na+ y TFG se evaluaron por el aclaramiento de Li+ e inulina, respectivamente. Se cuantificaron las neurohormonas mediante radioinmunoensayos. Los datos se analizaron
15 mediante ANOVA de medidas repetidas seguidas de test de Dunnett. Los resultados (media ! ETM) se presentan en la Tabla 1.
Adem�s, la actividad de renina en plasma disminuyó de 9 ! 2 a 5 ! 1 * a 3 ! 1† a 3 ! 1† ng/ml/hora, y los niveles de angiotensina II disminuyeron de 18 ! 1 a 10 ! 0,4† a 5 ! 0,4†a 7 ! 1† pg/ml. No se observaron cambios significativos en el intervalo de QTc (ms) al final de la infusión a 100 ng/kg/minuto (329 ! 15) frente a pre-infusión (323 ! 6).
20 Estos resultados demuestran que un polip�ptido que contiene secuencias de amino�cidos de CNP y urodilatina puede, de manera dependiente de la dosis, (1) aumentar la natriuresis, diuresis y TFG, (2) disminuir las presiones de llenado cardiaco, y (3) inhibir la renina y angiotensina, sin inducir hipotensi�n significativa.
Tabla 1
Datos renales y cardiovasculares para CU-NP
Pre-Infusión
10 ng/kg/ minuto 50 ng/kg/ minuto 100 ng/kg/ minuto Post-Infusión
TFG (ml/min)
31 ! 5 39 ! 1 43 ! 4* 53 ! 3† 36 ! 2
Flujo de orina (ml/min)
0,09 ! 0,01 0,3 ! 0,07 1,5 ! 0,5† 1,9 ! 0,3† 0,3 ! 0,05
Excreci�n de Na+ (∀Eq/ min)
1,9 ! 0,9 33 !1 3 235 ! 72† 342 ! 60† 66 ! 12
RFPNa+ (%)
92 ! 0,9 73 ! 4,5† 54 ! 1,8† 55 ! 2,6† 62 ! 3,5†
RFDNa+ (%)
99 ! 0,3 98 ! 0,5 92 ! 1,6† 90 ! 0,8† 97 ! 0,6*
Generaci�n de GMPc renal (pmol/ min)
356 ! 36 534 ! 94 1301 ! 60* 4608 ! 370† 1086 ! 27
PCP (mmHg)
4,6 ! 0,7 3,8 ! 1 2,5 ! 1† 1,7 ! 0,9† 3,2 ! 1*
PAD (mmHg)
1,5 ! 1 0,9 ! 0,9 0,6 ! 1* -0,2 ! 0,8† 0,1 ! 0,9†
PAM (mmHg)
129 ! 17 129 ! 13 128 ! 10 120 ! 11 124 ! 13
* = P<0,05; † = P<0,01; TFG = tasa de filtración glomerular; RFPNa+ = reabsorci�n de sodio fraccional proximal; RFD-Na+ = reabsorci�n de sodio fraccional distal; PCP = presión capilar pulmonar; PAD = presión de la aurícula derecha; PAM = presión arterial media.
25 Ejemplo 3 – Efectos biológicos adicionales de CU-NP
El polip�ptido de CU-NP o CNP se infusion� por vía intravenosa en perros normales anestesiados a 50 ng/kg/minuto durante 75 minutos. Se recogieron muestras de orina y sangre pre-infusión (pre-I), a los 30 y 60 minutos de infusión y post-infusión (post-1). Se us� el aclaramiento de inulina para evaluar la tasa de filtración glomerular (TFG). Se us� la técnica del aclaramiento de litio para la medida de reabsorci�n de Na+ fraccional proximal y distal (RFPNa+ y 30 RFDNa+, respectivamente). Se hicieron comparaciones de los tres últimos puntos de tiempo frente a pre-I. Se us� la prueba de la t de Student cuando se compararon los resultados de dos puntos de tiempo, mientras que se us� ANOVA de medidas repetidas para comparar cuatro puntos de tiempo. Los resultados (media ! ETM) se presentan
en las Tablas 2A y 2B.
El polip�ptido de CU-NP aument� significativamente GMPc en plasma y la excreci�n urinaria de GMPc. CU-NP también aument� el flujo de orina y la excreci�n urinaria de Na+, y condujo a una tasa de filtración glomerular mejorada. Se redujeron la presión capilar pulmonar y la presión de la aurícula derecha sin reducir la hipotensi�n
5 sist�mica. La presión pulmonar arterial también se redujo significativamente, y se conserv� el rendimiento cardiaco. Se suprimieron la actividad de la renina en plasma, los niveles de angiotensina II, y los niveles de aldosterona durante la infusión de CU-NP, pero se produjo una elevación o “rebote” después del cese de la infusión de CU-NP. Estos datos sugieren que puede usarse una forma de larga duración de CU-NP para una supresión continuada de neurohormonas.
10 CU-NP también aument� significativamente la generación renal de GMPc y excreci�n urinaria de K+. Se redujeron significativamente tanto RFPNa+ como RFDNa+. Estos hallazgos se asociaron con un aumento en el flujo sanguíneo renal ajustado al peso y una reducción en la resistencia vascular renal. También se observ� un aumento en el hematocrito. Se aumentaron la ANP en plasma, BNP en plasma y CNP en plasma, as� como la excreci�n urinaria de ANP, BNP y CNP.
15 Estos resultados demuestran que un polip�ptido de CU-NP puede tener actividades activadoras de GMPc, diuréticas, natriur�ticas, potenciadoras de TFG, supresoras del sistema renina-angiotensina-aldosterona (RAAS), descarga cardiaca, y actividades hemodin�micas renales favorables mientras que carece de la capacidad de disminuir la presión sanguínea y causar hipotensi�n sist�mica. Además, estos resultados demuestran que un polip�ptido de CU-NP puede aumentar los niveles end�genos de ANP y BNP. Los efectos tubulares del polip�ptido
20 de CU-NP sintetizado son coherentes con acciones a nivel del t�bulo proximal y células del conducto de recolección medular interno.
Tabla 2A
Datos renales y cardiovasculares para CU-NP
Pre-Infusión
30 minutos 60 minutos Post-Infusión
TFG (ml/min)
38,4 ! 3,6 50,7 ! 2,6* 53,8 ! 2,8†‡ 50,1 ! 3,5*
Flujo de orina (ml/min)
0,13 ! 0,02 1,28 ! 0,25†� 1,34 ! 0,22†� 0,33 ! 0,04
Excreci�n de Na+ (∀Eq/min)
8,0 ! 3,3 216,4 ! 42,3†� 237,7 ! 35,8†� 51,2 ! 9,4
Excreci�n de K+ (∀Eq/min)
14,9 ! 4,5 68,3 ! 12,5† 74,6 ! 15,3† 32,9 ! 3,0
RFPNa+ (%)
84,9 ! 2,5 62,4 ! 4,0† 61,3 ! 1,9† 70,4 ! 2,8†
RFDNa+ (%)
99,2 ! 0,2 92,4 ! 1,2† 92,2 ! 1,1†� 97,7 ! 0,4
Generaci�n de GMPc renal (pmol/min)
469,0 ! 55,4 2168 ! 53†� 2987 ! 622†� 1394 ! 185
GMPc en plasma (pmol/ml)
8,2 ! 0,7 26,2 ! 1,3†� 29,8 ! 1,5†� 13,0 ! 0,9†
Excreci�n urinaria de GMPc (pmol/min)
770 ! 48 3508 ! 574†� 4591 ! 664†� 2052 ! 208
PCP (mmHg)
5,6 ! 0,9 3,9 ! 0,7* 2,9 ! 0,9† 4,3 ! 0,8
PAD (mmHg)
1,1 ! 0,6 0,3 ! 0,5 -0,1 ! 0,5* 0,7 ! 0,4
Hipotensi�n sist�mica (mmHg)
135,9 ! 3,9 135,9 ! 2,7 133,9 ! 3,6 142,3 ! 2,7†
PAP (mmHg)
11,8 ! 0,9 10,7 ! 0,8* 10,5 ! 0,7† 12,3 ! 0,7
Rendimiento cardiaco (l/min)
3,1 ! 0,3 3,4 ! 0,5 3,0 ! 0,5 2,8 ! 0,5
Actividad de renina en plasma (ng/ml/hora)
8,8 ! 2 2,5 ! 0,8† 1,5 ! 0,4† 14,0 ! 1,3†
Angiotensina II (pg//ml)
13,9 ! 2,0 6,9 ! 0,7† 4,5 ! 0,3† 22,6 ! 1,6†
Aldosterona (ng/dl)
15,8 ! 2,7 14,2 ! 2,2 12,1 ! 2,1 30,4 ! 3,5†
FSR ajustada (ml/kg/min)
10,8 ! 0,8 11,64 ! 0,5 12,21 ! 0,4† 11,60 ! 0,5
RVR (x 10-3 mmHg•min•l-1)
0,55 ! 0,05 0,50 ! 0,04 0,47 ! 0,03† 0,53 ! 0,04
Hematocrito (%)
37,8 ! 1,3 40,3 ! 1,3† 41,1 ! 1,4† 40,3 ! 1,8†
(continuación)
Datos renales y cardiovasculares para CU-NP
Pre-Infusión
30 minutos 60 minutos Post-Infusión
ANP en plasma (pg/ml)
14,1 ! 0,8 16,7 ! 0,9* 16,6 ! 1,1* 15,2 ! 0,6
BNP en plasma (pg/ml)
8,2 ! 0,9 21,0 ! 1,8† 17,0 ! 2,2† 10,1 ! 1,4
CNP en plasma (pg/ml)
4,0 ! 0,3 15,4 ! 0,9† 15,1 ! 1,4† 3,2 ! 0,2
Excreci�n de ANP (pg/min)
3,2 ! 1,5 21,9 ! 9,5 28,3 ! 13,6 10,4 ! 2,5
Excreci�n de BNP (pg/min)
13,9 ! 1,5 18,2 ! 1,5 19,3 ! 1,2 28,3 ! 5,4*
Excreci�n de CNP (pg/min)
2,0 ! 0,4 4,0 ! 1,2 9,1 ! 3,9 21,5 ! 17,4
* = P<0,05 frente a pre-I; † = P<0,01 frente a pre-I; ‡ = P<0,05 frente a CNP; �= P<0,01 frente a CNP; � = P<0,001 frente a CNP; TFG = tasa de filtración glomerular; RFPNa+ = reabsorci�n de sodio fraccional proximal; RFDNa+ = reabsorci�n de sodio fraccional distal; PCP = presión capilar pulmonar; PAD = presión de la aurícula derecha; PAP = presión arterial pulmonar; FSR = flujo sanguíneo renal; RVR = resistencia vascular renal.
Tabla 2B
Datos comparativos renales y cardiovasculares para CNP
Pre-Infusión
30 minutos 60 minutos Post-Infusión
TFG (ml/min)
38 ! 4 42 ! 4 39 ! 3 44 ! 3
Flujo de orina (ml/min)
0,1 ! 0,02 0,3 ! 0,06† 0,4 ! 0,02† 0,3 ! 0,04
Excreci�n de Na+ (∀Eq/min)
16 ! 6 56 ! 21 71 ! 8* 30 ! 8
RFPNa+ (%)
83 ! 3 67 ! 3 51 ! 7† 68 ! 3*
RFDNa+ (%)
99 ! 0,5 98 ! 0,8 98 ! 0,5 99 ! 0,2
Generaci�n renal de GMPc (pmol/min)
491 ! 65 452 ! 202 603 ! 199 582 ! 91
GMPc en plasma (pmol/ml)
8 ! 1 11 ! 1† 12 ! 1† 12 ! 1†
Excreci�n de GMPc urinaria (pmol/min)
830 ! 74 1119 ! 102* 1338 ! 81† 1090 ! 76*
* = P<0,05 frente a pre-I; † = P<0,01 frente a pre-I; TFG = tasa de filtración glomerular; RFPNa+ = reabsorci�n de sodio fraccional proximal; RFDNa+ = reabsorci�n de sodio fraccional distal
5 Ejemplo 3 – Evaluación de CU-NP en las células endoteliales a�rticas humanas e in vivo
CU-NP se ensay� en células endoteliales a�rticas humanas (HAEC), y se definió el transcurso de tiempo de activación de GMPc in vivo. CU-NP se incub� con HAEC (2-5 pasos, a 80-90 % de confluencia) a 10-10, 10-8 o 10-6 M durante 10 minutos en un incubador de CO2. Se infundió CU-NP (n = 6) o CNP (n = 3) por vía intravenosa en perros normales anestesiados a 14 pmol/kg/min durante 75 minutos. Se recogió sangre pre-infusión, a los 25, 30, 45, 60, 75
10 minutos durante la infusión (I) y a los 1, 2, 4, 6, 10, 20, 30, 45, 60 minutos después de la infusión (post-1). El GMP cíclico se cuantific� mediante radioinmunoensayo.
Como se muestra en la Tabla 3, CU-NP estimul� la producción de GMPc en HAEC (P<0,01 para 10-6 M frente a sin tratamiento). Además, CU-NP aument� el GMPc en plasma in vivo frente a pre-I (todos los puntos temporales durante I y post-I, P<0,01, excepto a los 45 minutos post-I, P<0,05). CU-NP activ� GMPc en mayor medida en
15 comparación con CNP (P<0,001, 25 minutos I hasta 30 minutos post-I). Por tanto, CU-NP activ� significativamente GMPc en HAEC, y también estimul� significativamente GMPc en mayor medida que CU-NP in vivo.
Tabla 3
Efectos de CU-NP en HAEC
Concentraci�n de CU-NP
GMPc (media ETM, pmol/ml)
10-10 M
0,0007 ! 0,0007
10-8 M
0,03 ! 0,02
10-6 M
0,571 ! 0,05†
Sin tratamiento
0,003 ! 0,002
† = P<0,01 frente a sin tratamiento.
Ejemplo 4 – Acciones estimulantes sobre GMPc de CU-NP en glom�rulos caninos aislados
Se llevaron a cabo experimentos para determinar si CU-NP estimula directamente GMPc en glom�rulos aislados, y
5 para comparar las acciones activadoras sobre GMPc de CU-NP con CNP, URO, y CNP-C, que consistía en la longitud completa de 22 AA de CNP con un duplicado del extremo N-terminal fusionado en la posición C-terminal. Se aislaron los glom�rulos tras la recolección de riñones caninos normales. Se incubaron CU-NP, CNP, URO y CNP-C (10-5 M) con glom�rulos frente a control. Se midió el GMP cíclico mediante RIA, con corrección para niveles de proteína. CU-NP y URO suscitaron mayores respuestas de GMPc que los controles respectivos (P<0,01), pero sin
10 diferencia entre grupos. CU-NP y URO estimularon mayores respuestas de GMPc frente a CNP y frente a CNP-C (P<0,001). Por tanto, CU-NP estimul� GMPc en los glom�rulos en mayor medida que CNP, pero en una medida similar a URO. CNP-C no activ� GMPc. Estos datos sugieren que el GMPc mejorado activado potencialmente puede requerir extremos N y/o C terminales de ligandos para el receptor A de NP.
Tabla 4
Efectos de CU-NP sobre la producción de GMPc en glom�rulos aislados
Tratamiento
GMPc (media ETM; fmol/ g)
CU-NP
0,73 ! 0,09†‡
CNP
0,0019 ! 0,0005
URO
0,69 ! 0,07†‡
CNP-C
0,00597 ! 0,0053
† = P<0,01 frente a control correspondiente. ‡ = P<0,001 frente a 0CNP y CNP-C
Ejemplo 5 – Efectos hemoconcentradores de CU-NP
Tres NP humanos (BNP, CNP, URO, y CU-NP) se estudiaron para evaluar sus efectos en la permeabilidad vascular como se manifest� por un aumento en el hematocrito. Perros normales anestesiados recibieron infusiones intravenosas de BNP (n = 7), CNP (n = 6), URO (n = 5) o CU-NP (n = 6) a 14 pmol/kg/minuto. Se recogió sangre en
20 tubos de EDTA en hielo y se centrifug�. Los datos se presentan para la línea basal y a los 60 minutos de la infusión. Además de aumentar el hematocrito (Tabla 5), CU-NP redujo la presión CP in vivo (línea basal 6 ! 0,9 mmHg, 60 minutos 3 ! 0,9 mmHg; P<0,05). Por tanto, los efectos hemoconcentradores de CU-NP pueden contribuir a sus acciones de descarga cardiaca in vivo.
Tabla 5
Efectos de CU-NP en hematocrito
Tratamiento
Hematocrito (media ETM; %)
L�nea basal
60 min
BNP
36 ! 1 40 ! 2*
CNP
36 ! 1 37 ! 1
(continuación)
Efectos de CU-NP en hematocrito
Tratamiento
Hematocrito (media ETM; %)
L�nea basal
60 min
URO
37 ! 1 40 ! 1*
CU-NP
38 ! 1 41 ! 1†
(* = P<0,05; † = P<0,01)
Ejemplo 6 – Acciones cardiorrenales y neurohumorales de CU-NP en insuficiencia cardiaca experimentalcanina
5 CU-NP se evalu� en insuficiencia cardiaca canina (IC) para determinar si CU-NP podría activar el segundo mensajero GMPc y ejercer acciones favorables sin hipotensi�n excesiva. Se indujo IC leve por estimulaci�n (180 bpm durante 10 días). Se infundió CU-NP en 6 perros anestesiados por vía intravenosa a 75 ng/kg/minuto durante 75 minutos. Se midió la TFG mediante el aclaramiento de inulina. La reabsorci�n fraccional de Na+ (RFNa) se evalu� mediante el aclaramiento de Li+. Se recogieron los datos pre-infusión (pre-I), a los 30 y 60 minutos I, y post-I. La
10 actividad de renina en plasma, angiotensina II, aldosterona y GMPc también se midieron. Los resultados (media ! ETM) se presentan en la Tabla 6.
CU-NP aument� el GMPc en plasma, la excreci�n urinaria de GMPc, generación neta renal de GMPc, flujo de orina, y excreci�n de Na+ urinaria. Se redujeron la RFNa proximal y distal. Se mejoraron el flujo sanguíneo renal y TFG, con un descenso leve de PAM. Tanto RC como RVS permanecieron sin cambios. PCP y PAP se redujeron. La
15 actividad de renina en plasma, angiotensina II y aldosterona también se suprimieron. Por tanto, CU-NP activ� GMPc en IC canina y ejerció acciones potenciadoras renales, de descarga cardiaca y supresoras del Sistema de ReninaAngiotensina-Aldosterona sin hipotensi�n excesiva.
Tabla 6
Datos renales y cardiovasculares para CU-NP en IC experimental
Pre-Infusión
30 minutos 60 minutos Post-Infusión
TFG (ml/min)
40 ! 5 51 ! 9 51 ! 3 53 ! 7*
Flujo de orina (ml/min)
0,09 ! 0,01 0,50 ! 0,15† 0,56 ! 0,11† 0,19 ! 0,03
Excreci�n de Na+ (∀Eq/min)
2,9 ! 0,9 80,5 ! 29,4† 102,0 ! 22,2† 22,1 ! 7,9
RFPNa+ (%)
89 ! 2 68 ! 5† 67 ! 3† 79 ! 3*
RFDNa+ (%)
99,6 ! 0,1 96 ! 1† 96 ! 1† 99 ! 0,3
Generaci�n renal de GMPc (pmol/min)
610 ! 66 2977 ! 549+ 3255 ! 662† 1342 ! 200
GMPc en plasma (pmol/ml)
17 ! 3 41 ! 3+ 43 ! 2† 21 ! 2
Excreci�n urinaria de GMPc (pmol/min)
1186 ! 152 5066 ! 826† 5476 ! 876† 2394 ! 197
PCP (mmHg)
11 ! 1 9 ! 1† 8 ! 1† 10 ! 1
PAP (mmHg)
16 ! 0,8 15 ! 0,6* 14 ! 0,7† 16 ! 0,7
Actividad de renina en plasma (ng/ml/hora)
9 ! 2 3 ! 1† 2 ! 1† 9 ! 2
Angiotensina II (pg/ml)
32 ! 7 9 ! 2† 9 ! 3† 19 ! 4
Aldosterona (ng/dl)
14 ! 5 9 ! 2 6 ! 2* 11 ! 3
FSR (ml/min)
238 ! 39 281 ! 42* 294 ! 42† 275 ! 42*
PAM (mmHg)
108 ! 9 100 ! 8† 96 ! 8† 107 ! 8
RC (l/min)
2,4 ! 0,1 2,5 ! 0,1 2,4 ! 0,1 2,3 ! 0,04
35 (continuación)
Datos renales y cardiovasculares para CU-NP en IC experimental
Pre-Infusión
30 minutos 60 minutos Post-Infusión
RVS (mmHg•l-1•Min)
42 ! 3 39 ! 3 39 ! 3 45 ! 3
* = P<0,05 frente a pre-I; † = P<0,01 frente a pre-I; TFG = tasa de filtración glomerular; RFPNa+ = reabsorci�n de sodio fraccional proximal; RFDNa+= reabsorci�n de sodio fraccional distal; PCP = presión capilar pulmonar; PAD = presión de la aurícula derecha; PAP = presión arterial pulmonar; FSR = flujo sanguíneo renal; PAM = presión arterial media; RC = rendimiento cardiaco; RVS = resistencia vascular sist�mica.
Ejemplo 7 – Efectos in vivo de CU-NP en la presión de perfusi�n renal
Se llevaron a cabo estudios para determinar las acciones in vivo de CNP, CU-NP y URO en la presión de perfusi�n renal (PPR, estimada mediante PAM -PAD), ya que PPR es un determinante clave de la función renal. Debido a la acción potenciadora de TFG de CU-NP, también se efectuaron estudios in vitro para evaluar la hipótesis de que CU-NP (a diferencia de CNP) también activa NPR-A, un potente receptor NP de actuación renal.
Se infundieron dosis equimolares de CU-NP, CNP humana o URO humano por vía intravenosa a 14,14 pmol/kg/minuto en 17 perros normales anestesiados durante 75 minutos. Se evalu� PPR en línea basal y a los 60 minutos de infusión. Los datos se expresan como media ! ETM. Se midieron los aclaramientos a partir del minuto 16 al 45 y a partir del minuto 46 al 75 después de la iniciación de infusión de p�ptido. Con cada grupo, se us� una prueba t de 2 colas para muestras relacionadas para comparar PPR a los 60 minutos de infusión de p�ptido frente a línea basal. Se efectuaron comparaciones entre grupos mediante ANOVA de dos vías seguida de post-test de Bonferroni.
Las respuestas de GMPc a los 3 p�ptidos también se evaluaron en glom�rulos aislados de riñones caninos después de la recolección, en presencia o ausencia de un antagonista de NPR-A, A719153 (1 ∀M), o un antagonista de NPR-B, P194 (1 ∀M), o ambos antagonistas añadidos secuencialmente (A71915 seguido de P 194, concentración final para ambos de 1 ∀M). Para confirmar la participación de NPR-B en la respuesta de GMPc a CU-NP, se llevaron a cabo experimentos adicionales usando células endoteliales a�rticas humanas (HAEC). La respuesta de GMP cíclico se determin� incubando CU-NP (10-6 M) durante 10 minutos en ausencia o presencia de un anticuerpo para el dominio de unión al ligando de NPR-B. Los datos in vitro (media ! ETM) se analizaron mediante ANOVA de una vía seguida de post-test de Bonferroni. Se definió la significación estadística como P<0,05. Se us� GraphPad Prism 4 (GraphPad Software, San Diego, CA) para los análisis estadísticos.
En los estudios in vivo, PPR (mmHg) se preservó con CU-NP comparado con URO. Cuando se compararon los dos grupos, PPR era significativamente más baja con URO frente a CU-NP a 60 minutos de infusión de p�ptido (P<0,05, Figura 2). PPR no cambi� con CNP.
Tabla 7
Efectos de CU-NP en PPR
PPR (media ETM; mmHg)
Tratamiento
Pre-I 60 minutos
CNP
120 ! 4 123 ! 8
URO
127 ! 4 119 ! 4*
CU-NP
135 ! 4 134 ! 4
* = P = 0,05 frente a línea basal
In vitro, CU-NP a 10-5 aument� GMPc 7 veces frente a CNP (0,76 ! 0,05‡ fmol/∀g frente a 0,11 ! 0,05 fmol/∀g), con una tendencia a activar GMPc incluso más que URO (0,54 ! 0,10 fmol/∀g; P = 0,086). Estos resultados se ilustran en la Figura 3. La acción estimulante sobre GMPc de CU-NP se atenu� mediante el bloqueo NPR-A con A71915 (0,31 ! 0,05† fmol/∀g), bloqueo de NPR-B con P19 (0,28 ! 0,04† fmol/∀g), o bloqueo de tanto NPR-A como NPR-B con A71915 y P19 (0,23 ! 0,05† fmol/∀g), como se muestra en la Figura 4.
En HAEC, CU-NP y CNP 10-6 M aumentaron GMPc a 0,30 ! 0,02 pmol/ml y 0,17 ! 0,04 pmol/ml, respectivamente (P<0,01 para CU-NP frente a CNP; P<0,001 para CU-NP frente a control; P<0,001 para CNP frente a control). En presencia del anticuerpo de NPR-B (1:100), las respuestas de GMPc se atenuaron a 0,19 ! 0,02 pmol/ml para CU-NP y 0,08 ! 0,01 pmol/ml para CNP (P<0,01 para CU-NP frente a sin anticuerpo y P<0,05 para CNP frente a sin anticuerpo). Los resultados se representan gráficamente en la Figura 5. Estos datos sugieren que NPR-B est� involucrado, al menos en parte, en la respuesta de GMPc a CU-NP.
Por tanto, CU-NP preserva PPR a dosis potenciadoras renales, en comparación con URO, que reduce PPR. Además, en glom�rulos aislados las acciones de CU-NP incluyen co-activación tanto de NPR-A como de NPR-B, lo que representa un activador dual novedoso de receptores NP en el ri��n. NPR-B est� implicado en parte en la respuesta de GMPc a CU-NP en células endoteliales a�rticas humanas. Por tanto, CU-NP representa una nueva tecnología de p�ptido novedosa que es capaz de la activación dual de NPR-A y NPR-B.

Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un polip�ptido de menos de 44 restos de amino�cidos de longitud, en el que dicho polip�ptido comprende, en orden de amino terminal a carboxilo terminal:
    (a)
    la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 con no más de una adición de amino�cidos, sustracción de amino�cidos o sustitución de amino�cidos,
    (b)
    la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 con no más de dos adiciones de amino�cidos, sustracciones de amino�cidos o sustituciones de amino�cidos, y
    (c)
    la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 con no más de una adición de amino�cidos, sustracción de amino�cidos o sustitución de amino�cidos,
    en el que dicho polip�ptido comprende actividad natriur�tica.
  2. 2. El polip�ptido de la reivindicación 1, en el que dicho polip�ptido comprende, en orden de amino terminal a carboxilo terminal:
    (a)
    la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1
    (b)
    la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 con no más de dos adiciones de amino�cidos, sustracciones de amino�cidos o sustituciones de amino�cidos, y
    (c)
    la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 con no más de una adición de amino�cidos, sustracción de amino�cidos o sustitución de amino�cidos; o
    (a)
    la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 con no más de una adición de amino�cidos, sustracción de amino�cidos o sustitución de amino�cidos,
    (b)
    la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2, y
    (c)
    la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 con no más de una adición de amino�cidos, sustracción de amino�cidos o sustitución de amino�cidos; o
    (a)
    la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 con no más de una adición de amino�cidos, sustracción de amino�cidos o sustitución de amino�cidos,
    (b)
    la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 con no más de dos adiciones de amino�cidos, sustracciones de amino�cidos o sustituciones de amino�cidos, y
    (c)
    la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3.
  3. 3.
    El polip�ptido de la reivindicación 1, en el que dicho polip�ptido comprende la secuencia expuesta en SEC ID N�: 4.
  4. 4.
    El polip�ptido de la reivindicación 1, en el que dicho polip�ptido comprende, en orden de amino terminal a carboxilo terminal:
    (a)
    la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 con no más de una sustitución de amino�cidos conservativa,
    (b)
    la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 con no más de dos adiciones de amino�cidos, sustracciones de amino�cidos o sustituciones de amino�cidos, y
    (c)
    la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 con no más de una adición de amino�cidos, sustracción de amino�cidos o sustitución de amino�cidos; o
    (a)
    la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 con no más de una adición de amino�cidos, sustracción de amino�cidos o sustitución de amino�cidos,
    (b)
    la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 con no más de dos sustituciones conservativas de amino�cidos, y
    (c)
    la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 con no más de una adición de amino�cidos, sustracción de amino�cidos o sustitución de amino�cidos; o
    (a)
    la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 1 con no más de una adición de amino�cidos, sustracción de amino�cidos o sustitución de amino�cidos,
    (b)
    la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 o la secuencia expuesta en SEC ID N�: 2 con no más de dos adiciones de amino�cidos, sustracciones de amino�cidos o sustituciones de amino�cidos, y
    (c)
    la secuencia expuesta en SEC ID N�: 3 con no más de una sustitución conservativa de amino�cidos.
  5. 5.
    El polip�ptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho polip�ptido carece de la capacidad para inducir hipotensi�n sist�mica.
  6. 6.
    El polip�ptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho polip�ptido es un polip�ptido sustancialmente puro.
  7. 7.
    Un ácido nucleico aislado que codifica el polip�ptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  8. 8.
    Un vector que comprende un ácido nucleico que codifica el polip�ptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  9. 9.
    Una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica el polip�ptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
    5 10. La célula huésped de la reivindicación 9, en la que dicha célula huésped es una célula huésped eucariota.
  10. 11.
    Una composición farmacéutica que comprende un transportador farmac�uticamente aceptable y el polip�ptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
  11. 12.
    Un polip�ptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en el tratamiento de afecciones cardiovasculares o afecciones renales en un mamífero sin disminuir la presión sanguínea.
    10 13. Un polip�ptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en el tratamiento de un mamífero que tiene una afección cardiovascular o afección renal, en el que dicho polip�ptido se administra en condiciones en las que se reduce la gravedad de una manifestación de dicha afección cardiovascular o afección renal.
  12. 14. El polip�ptido para su uso en el tratamiento de un mamífero que tiene una afección cardiovascular o afección
    15 renal de la reivindicación 13, en el que la administración de dicho polip�ptido a dicho mamífero no disminuye la presión sanguínea de dicho mamífero.
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