ES2453946T3 - Hormona del crecimiento modificada con polietilenglicol bicatenario, método de preparación y aplicación de esta - Google Patents
Hormona del crecimiento modificada con polietilenglicol bicatenario, método de preparación y aplicación de esta Download PDFInfo
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Abstract
Metodo de preparacion de una hormona de crecimiento humana polietilenglicolada (pegilada) o una preparacion de hormona de crecimiento humana polietilenglicolada (pegilada), que comprende: (a) en una solucion con pH no inferior a 6.0, poner el polietilenglicol (PEG) bicatenario ramificado con forma de U o con forma de Y en contacto con la hormona de crecimiento humana; (b) evaluar el producto modificado por el PEG bicatenario en un unico sitio obtenido en el paso a) en SDS-PAGE de concentracion apropiada, donde el producto muestra dos bandas; (c) separar y recuperar el producto de peso molecular aparente inferior en las dos bandas modificado por el PEG bicatenario en un unico sitio, donde el polietilenglicol bicatenario ramificado con forma de U presenta la siguiente formula (IV)**Fórmula**, donde, R y R' son independientemente alquilo de bajo peso molecular; n y n' indican el grado de polimerizacion y pueden ser cualquier numero entero; n+n' esta entre 600 y 1500; el peso molecular medio del PEG ramificado con forma de U es aproximadamente desde 26kD hasta 66kD, o donde el polietilenglicol bicatenario ramificado con forma de Y presenta la siguiente formula (III):**Fórmula** donde, R y R' son independientemente alquilo de bajo peso molecular, m y m' indican el grado de polimerizacion y pueden ser cualquier numero entero, j es un numero entero de 1 a 12, y el peso molecular total medio del PEG ramificado con forma de Y es de aproximadamente 26kD a 60kD.
Description
Hormona del crecimiento modificada con polietilenglicol bicatenario, método de preparación y aplicación de esta
[0001] La invención pertenece al campo de tecnología de preparación biológica, en particular a una hormona del crecimiento (GH) modificada con polietilenglicol bicatenario (PEG) con actividad biológica alta, y el método de preparación de esta, al igual que el uso de la hormona del crecimiento pegilada obtenida en el campo farmacéutico.
[0002] La hormona de crecimiento humana (HuGH) es una hormona de proteína segregada por la glándula pituitaria anterior humana, el precursor de la cual consiste en 217 residuos de aminoácidos, donde los primeros 26 residuos de aminoácidos componen un péptido señal, y los restantes 191 residuos de aminoácidos componen la molécula madura. Hay dos enlaces disulfuro intra-moleculares (Cys79 y Cys191; Cys208 y Cys215), y la molécula no está glicosilada con un peso molecular de 22kD. La secuencia del HuGH se describe en SEC ID n.º: 1 (NCBI: P01241; AAA72260; Denoto F M, et al. Human growth hormone DNA sequence and mRNA structure: possible alternative splicing. Nucleic Acids Res., 9: 3719-3730, 1981; Roskam W, et al. Molecular cloning and nucleotide sequence of the human growth hormone structural gene. Nucleic Acids Res., 7: 305-320, 1979; Martial J A, et al. Human growth hormone: Complementary DNA cloning and expression in bacteria. Science,
205: 602-607, 1979; Chen E Y, et al. The human growth hormone locus: nucleotide sequence, biology and evolution. Genomics, 4: 479-497, 1989). Las funciones primarias del HuGH incluyen promover el crecimiento de una célula, órgano o hueso, y está íntimamente relacionado con el anabolismo del cuerpo (Iglesias P, et al. Recombinant human growth hormone therapy in malnourished dialysis patients: a randomized controlled study. Am. J. Kidney Dis., 32(3): 454-463, 1998; Neely E K, Use and abuse of human growth hormone. Annu. Rev. Med., 45:407-410, 1994). Después de más de 20 años de aplicación clínica de la hormona de crecimiento humana recombinante (rHuGH) producida por tecnología del ADN recombinante, la eficacia clínica y seguridad del rHuGH han sido demostradas.
[0003] Los resultados de muchas investigaciones han indicado que, rHuGH muestra efectos terapéuticos significativos en el tratamiento del enanismo, quemaduras, heridas, fracturas de hueso, úlceras de sangrado, insuficiencia renal, SIDA, trastornos anabólicos, enanismo por deficiencia de hormona del crecimiento endógena, síndrome Turner y deficiencia de la hormona del crecimiento adulta, y también muestra efecto significativo en la terapia antienvejecimiento. Actualmente, rHuGH es el único medicamento eficaz para el tratamiento del enanismo. En marzo de 2001, las indicaciones que han sido aprobadas por FDA para introducir investigación clínica de rHuGH incluyen: tratamiento intensivo de retención de nitrógeno de quemaduras severas, síndrome de intestino corto (administrado solo o en combinación con glutamina), detención del crecimiento relacionado con SIDA etc. Actualmente, las indicaciones de rHuGH que han sido aprobadas para el mercado incluyen: enanismo por deficiencia de la hormona del crecimiento endógena de adolescentes, enanismo relacionado con el síndrome Turner, enanismo por deficiencia de la hormona del crecimiento de órgano o espontáneo de adolescentes, síndrome Prader-Willi, trastorno del crecimiento prematuro, trastorno catabólico relacionado con SIDA, insuficiencia renal crónica relacionada con retraso del crecimiento y deficiencia de la hormona del crecimiento adulta etc.
[0004] El polietilenglicol es un polímero orgánico inerte, biodegradable y no tóxico, y es importante en los campos tanto de la biotecnología como de la farmacéutica. La técnica de la modificación con PEG es conectar PEG a una proteína activa a través de un enlace covalente. Después de la polietilenglicolación (PEGilación), las propiedades de la proteína pueden mejorar significativamente, por ejemplo la prolongación de la vida media metabólica del medicamento, la reducción de inmunogenicidad, el aumento de seguridad, la mejora de eficacia terapéutica, la reducción de la frecuencia de dosificación, el aumento de la solubilidad de medicamento/solubilidad de agua, el aumento de resistencia contra la proteólisis, la facilitación de la liberación controlada del medicamento etcétera (Inada et al. J. Bioact. and Compatible Polymers, 5, 343, 1990; Delgado, et al. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9, 249, 1992; Katre, Advanced Drug Delivery Systems, 10, 91, 1993 and Davis et al. U.S. Patent N.º 4179337). Se describe en la patente EE. UU. n.º 4179337 que después de enlazar PEG a una proteína tal como una enzima o insulina, la inmunogenicidad de la proteína se redujo, mientras que simultáneamente las actividades de la proteína se redujeron también, pero al mismo tiempo la proteína modificada retuvo una proporción determinada de las actividades de la proteína no modificada original. Tal efecto fue también encontrado en G-CSF (Satake-Ishikawa et al. Cell Structure and Function, 17, 157-160, 1992), IL-2 (Katre et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1487, 1987), TNF-α (Tsutsumi et al. Jpn. J. Cancer Res., 85, 9, 1994), IL-6 (Inoue et al. J. Lab. Clin. Med., 124, 529, 1994) y CD4-IgG (Chamow et al. Bioconj. Chem., 5, 133, 1994).
[0005] Se describe en la patente EE. UU. n.º 5824784 que un modificador PEG con un grupo aldehído al final fue usado para obtener un PEG-G-CSF que fue modificado por un único PEG en un sitio fijo (aminoácido N-terminal de la proteína). El modificador PEG- NHS sintetizado por activación con N-hidroxisuccinimida (NHS) puede formar un enlace amida con grupo el ε-amino de lisina en G-CSF. PEG-NHS tiene una alta actividad química pero selectividad pobre, y así es difícil obtener un producto modificado por un único PEG en un sitio fijo. En comparación con un producto modificado multi-PEG, el producto modificado mono-PEG es más homogéneo y es así beneficioso para la separación y purificación, que por lo tanto facilita el control de la calidad y asegura estabilidad entre lotes en la producción a gran escala.
[0006] Actualmente algunos tipos de fármacos de proteína terapéutica pegilada, tal como adenosina deaminasa pegilada (Adagen.RTM, Enzon Pharmaceuticals), L-asparaginasa pegilada (Oncapspar.RTM, Enzon Pharmaceuticals), interferón-α2b pegilado (PEG-Intron.RTM, Schering-Plough) e interferón-α2a pegilado (Pegasys, Roche), factor estimulante de colonias de granulocitos pegilado (Neulasta.RTM, Amgen), han sido aplicados clínicamente. El metabolismo in vivo de la fracción de PEG en un medicamento (o PEG en sí mismo) ha sido ya claramente entendido, y se ha probado que el PEG es un buen y seguro modificador de medicamento sin ningún efecto adverso.
[0007] El PEG que se puede enlazar a un medicamento de proteína normalmente necesita ser derivatizado, de modo que uno o dos grupos terminales en los extremos de PEG pueden ser químicamente activados para poseer un grupo funcional apropiado que muestre actividad para, y así pueda formar un enlace covalente estable con, al menos un grupo funcional del medicamento al que se debe enlazar. Por ejemplo, PEG se puede enlazar al ε-NH2 de un residuo de Lys en la cadena peptídica de proteína, o al α-NH2 del residuo de aminoácido N-terminal de la cadena peptídica de proteína. Hay normalmente tres formas de politilenglicoles que han sido usadas para modificar una proteína: una molécula de cadena lineal (EP 0593868; Yu-Sen Wang et al. Advanced Drug Delivery Reviews, 54: 547-570, 2002; Yu-Sen Wang et al. Biochemistry, 39, 10634-10640, 2000.), una molécula ramificada en forma de U (EP 0809996) y una molécula ramificada en forma de Y (CN1243779C, EP1496076). La Patente Europea n.º EP0809996 describe la PEGilación de IFN-α.
[0008] Se cree generalmente en la técnica que, después de la modificación con PEG, las propiedades de la mayoría de proteínas sufrirán los siguientes cambios: 1. la inmunogenicidad y antigenicidad se reducen; 2. la vida media cíclica se prolonga; 3. la solubilidad aumenta; 4. la proteína es tolerante a proteolisis; 5. la disponibilidad biológica aumenta; 6. la toxicidad disminuye; 7. la termoestabilidad y estabilidad mecánica aumenta; 8. el punto isoeléctrico, el comportamiento electroforético, y propiedades dinámicas cambian, etc. Además, uno de los puntos más importantes es que la modificación con PEG tendrá como resultado la reducción de las actividades celulares de una proteína, que es principalmente debido a los grupos que han sido introducidos en el producto final, incluyendo PEG y los enlaces entre PEG y la proteína que debe ser modificada, y también relacionado con las condiciones de acoplamiento al igual que el producto secundario generado. Doris Brugger et al. (Patente EE. UU., Pub. n.º: US 2004/0223950 A1) divulga que los productos de modificación del interferon-α2a mono-modificado por un único UPEG bicatenario en uno de diferentes sitios muestran actividades antivíricas in vitro significativamente diferentes, donde el producto de modificación mono-modificado por UPEG en el sitio Lys31 tiene la máxima actividad específica, mientras que el producto mono-modificado por UPEG en el sitio Lys121 tiene la actividad específica mínima, donde la diferencia entre ambos puede ser hasta 5 veces.
[0009] Li, Weihua et al. (China Patent Pub. N.º: CN 1477126A) divulga un método de preparación de una hormona del crecimiento modificada con PEG. Se prefiere llevar a cabo la reacción de modificación de la hormona del crecimiento por PEG ramificado (mPEGn-NHS) a pH 6,5-7,0, y la actividad biológica de la hormona del crecimiento purificada monomodificada por PEG ramificado en un único sitio fue medida utilizando ratas con las glándulas pituitarias quitadas. Los resultados demuestran que la hormona del crecimiento acoplada a PEG (donde PEG es PEG-NHS bicatenario con un peso molecular de 40kD) tiene efecto de aumento de peso comparable a la misma cantidad de hormona del crecimiento inyectada diariamente.
[0010] La invención proporciona un método de preparación de una hormona del crecimiento modificada con PEG bicatenario, que comprende:
a) en una solución con un pH no inferior a 6,0, preferiblemente no inferior a 7,0, preferiblemente no inferior a 8,0, preferiblemente no inferior a 9,0, preferiblemente no inferior a 9,5, preferiblemente no inferior a 10,0, de la forma más preferible pH 10,5, poner en contacto PEG bicatenario ramificado en forma de U o de Y con la hormona del crecimiento, preferiblemente hormona de crecimiento humana, preferiblemente la proporción molar de la hormona del crecimiento respecto al PEG bicatenario siendo aproximadamente 1: 2;
b) evaluar el producto modificado por PEG en un único sitio obtenido en el paso a) en SDS-PAGE de concentración apropiada, preferiblemente 12% SDS-PAGE, donde el producto muestra dos bandas o es principalmente una banda de peso molecular aparente inferior;
c) separar y recuperar el producto de peso molecular aparente inferior en dichas dos bandas que está modificado por PEG en un único sitio;
opcionalmente que comprende un paso de purificación, preferiblemente utilizando cromatografía de gel tal como cromatografía de Q Sepharose FF, cromatografía DEAE Sepharose FF o cromatografía MacroCap SP.
[0011] En una forma de realización preferida, la invención proporciona un método de preparación de una hormona del crecimiento modificada con PEG bicatenario, donde dicho PEG bicatenario está en forma de PEG ramificado en forma de Y de la siguiente fórmula estructural (I),
donde, Pa y Pb son el mismo o diferentes PEG; j es un número entero de 1 a 12; Ri es H, alquilo C1-12 no sustituido o sustituido, arilo, aralquilo, o heteroalquileno sustituido; X1 y X2 son independientemente grupos de enlace, donde X1 es (CH2)n, X2 es seleccionado del grupo que consiste en: (CH2)n, (CH2)n OCO, (CH2)n NHCO, (CH2)nCO, donde n es un número entero de 1 a 10; F es un grupo terminal seleccionado del grupo que consiste en: hidroxilo, carboxilo, grupo éster, cloruro de acilo, hidracida, maleimida, bisulfuro de piridina, capaz de reaccionar con un amino, hidroxilo o grupo de hidrosulfuro de un agente terapéutico o sustrato para formar un enlace covalente.
[0012] En una forma de realización preferida, la invención proporciona un método de preparación de una hormona del crecimiento modificada con PEG bicatenario, donde el PEG con forma de Y presenta la siguiente fórmula estructural (II)
donde, R y R' son independientemente alquilos de bajo peso molecular, preferiblemente alquilo C1 -C4, de la forma más preferible metilo; m y m' indican el grado de polimerización y pueden ser cualquier número entero; m+m' está preferiblemente entre 600 y 1500; j es un número entero de 1 a 12; Ri es H, alquilo C1-12 no sustituido o sustituido, arilo sustituido, aralquilo o heteroalquileno; F es un grupo terminal seleccionado del grupo que consiste en: hidroxilo, carboxilo, grupo éster, cloruro de acilo, hidracida, maleimida, bisulfuro de piridina, capaces de reaccionar con un amino, hidroxilo o grupo hidrosulfuro de un agente terapéutico o sustrato para formar un enlace covalente.
[0013] En una forma de realización preferida, la invención proporciona un método de preparación de una hormona del crecimiento modificada con PEG bicatenario, donde el PEG con forma de Y tiene la siguiente fórmula estructural (III):
donde, R y R' son independientemente alquilos de bajo peso molecular, preferiblemente alquilo C1 -C4, de la forma más preferible metilo; m y m' indican el grado de polimerización y pueden ser cualquier número entero; m+m' está preferiblemente entre 600 y 1500, de la forma más preferible 910; el peso molecular total medio del PEG con forma de Y es de aproximadamente 26kD a 60kD, preferido 40kD; j es un número entero de 1 a 12.
[0014] En una forma de realización preferida, la invención proporciona un método de preparación de una hormona del crecimiento modificada con PEG bicatenario, donde el PEG bicatenario está en forma de PEG con forma de U de la siguiente fórmula estructural (IV),
donde, R y R' son independientemente alquilo de bajo peso molecular, preferiblemente alquilo C1 -C4; n y n' indican el grado de polimerización y pueden ser cualquier número entero; n+n' está preferiblemente entre 600 y 1500, de la forma más preferible 910; el peso molecular medio del PEG con forma de U es de aproximadamente 26kD a 66kD, de la forma más preferible aproximadamente 40 kD.
[0015] En una forma de realización preferida, la invención proporciona un método de preparación de una hormona del crecimiento modificada con PEG bicatenario, que comprende:
a) poner en contacto en una solución con pH 9,0 o 10,5, el PEG de la siguiente fórmula (III) con la hormona de crecimiento humana, donde la proporción molar de la hormona del crecimiento respecto al PEG bicatenario es aproximadamente 1: 2;
donde, R y R' son independientemente alquilo de bajo peso molecular, preferiblemente alquilo C1 -C4, de la forma más preferible metilo; m+m' es 910; j es un número entero de 1 a 12; el peso molecular total medio del PEG es aproximadamente 40kD;
b) evaluar el producto modificado por el PEG en un único sitio obtenido en el paso a) en 12% SDS-PAGE, donde el producto muestra dos bandas;
c) purificación, separación y recuperación del producto de peso molecular aparente inferior que está modificado en un único sitio, usando cromatografía de gel seleccionada de cromatografía Q Sepharose FF, cromatografía DEAE Sepharose FF o cromatografía MacroCap SP.
[0016] La invención también proporciona una hormona del crecimiento pegilada preparada según el método descrito anteriormente, donde la hormona del crecimiento es extraída de una fuente natural o es una hormona del crecimiento recombinante obtenida por las biotecnologías recombinantes, preferiblemente la hormona del crecimiento tiene la secuencia de SEC ID n.º:1.
[0017] En una forma de realización preferida, la invención proporciona una hormona del crecimiento pegilada de la siguiente fórmula (VII), que se prepara según el método descrito anteriormente y tiene un peso molecular de 62kD:
donde, R y R' son independientemente alquilo de bajo peso molecular, preferiblemente alquilo C1 -C4, de la forma más preferible metilo; m+m' es 910; y j es un número entero de 1 a 12.
[0018] La invención también proporciona un método de preparación de una preparación de hormona del crecimiento
pegilada, que comprende:
a) en una solución con un pH no inferior a 8,0, preferiblemente no inferior a 9,0, preferiblemente no inferior a 9,5,
preferiblemente no inferior a 10,0, de la forma más preferible pH 10,5, poner PEG bicatenario ramificado con forma de U o
con forma de Y en contacto con la hormona del crecimiento, preferiblemente hormona de crecimiento humana,
preferiblemente la proporción molar entre la hormona del crecimiento y el PEG bicatenario es aproximadamente 1: 2;
b) evaluar el producto modificado por el PEG en un único sitio obtenido en el paso a) en SDS-PAGE de concentración
apropiada, preferiblemente 12% SDS-PAGE, donde el producto muestra dos bandas;
c) separación y recuperación del producto modificado por PEG en un único sitio;
dicho producto recuperado es una mezcla que comprende predominantemente el producto de peso molecular aparente
inferior que se modifica por PEG en un único sitio, donde el contenido del producto de peso molecular aparente inferior que
se modifica por PEG en un único sitio, detectado por SDS-PAGE, no es inferior al 70%, preferiblemente no inferior al 80%,
de la forma más preferible no inferior al 90%,
opcionalmente comprende un paso de purificación, preferiblemente utilizando cromatografía de gel tal como cromatografía Q
Sepharose FF, cromatografía DEAE Sepharose FF o cromatografía MacroCap SP.
[0019] En una forma de realización preferida, la invención proporciona un método de preparación de una preparación de
hormona del crecimiento modificada por PEG bicatenario, donde el PEG bicatenario es PEG en forma de Y de la siguiente
fórmula estructural (I),
donde, Pa y Pb son el mismo o diferentes PEG; j es un número entero de 1 a 12; Ri es H, alquilo C1-12 no sustituido o sustituido, arilo, aralquilo, o heteroalquileno sustituido; X1 y X2 son independientemente grupos de enlace, donde X1 es (CH2)n, X2 es seleccionado del grupo que consiste en: (CH2)n, (CH2)nOCO, (CH2)nNHCO, (CH2)nCO, donde n es un número entero de 1 a 10; F es un grupo terminal seleccionado del grupo que consiste en: hidroxilo, carboxilo, grupo de éster, cloruro de acilo, hidracida, maleimida, bisulfuro de piridina, capaces de reaccionar con un grupo amino, hidroxilo o hidrosulfuro de un agente terapéutico o sustrato para formar un enlace covalente.
[0020] En una forma de realización preferida, la invención proporciona un método de preparación de una preparación de hormona del crecimiento modificada con PEG bicatenario, donde el PEG con forma de Y presenta la siguiente fórmula estructural (II):
donde, R y R' son independientemente alquilo de bajo peso molecular, preferiblemente alquilo C1 -C4, de la forma más preferible metilo; m y m' indican el grado de polimerización y pueden ser cualquier número entero; m+m' está preferiblemente entre 600 y 1500, de la forma más preferible 910; j es un número entero de 1 a 12; Ri es H, alquilo C1-12 no sustituido o sustituido, arilo, aralquilo o heteroalquileno sustituido; F es un grupo terminal seleccionado del grupo que consiste en: hidroxilo, carboxilo, grupo éster, cloruro de acilo, hidracida, maleimida, bisulfuro de piridina, capaces de reaccionar con un grupo amino, hidroxilo o hidrosulfuro de un agente terapéutico o sustrato para formar un enlace covalente.
[0021] En una forma de realización preferida, la invención proporciona un método de preparar una preparación de hormona del crecimiento modificada con PEG bicatenario, donde el PEG con forma de Y presenta la siguiente fórmula estructural (III): donde, R y R' son independientemente alquilo de bajo peso molecular, preferiblemente alquilo C1 -C4, de la forma más preferible metilo; m y m' indican el grado de polimerización y pueden ser cualquier número entero; m+m' está preferiblemente entre 600 y 1500, de la forma más preferible 910; j es un número entero de 1 a 12; preferiblemente el peso molecular total medio del PEG es de aproximadamente 26 kD a 60 kD, preferiblemente 40 kD.
[0022] En una forma de realización preferida, la invención proporciona un método de preparación de una preparación de hormona del crecimiento modificada con PEG bicatenario, donde el PEG bicatenario es PEG con forma de U de la siguiente fórmula estructural (IV),
donde, R y R' son independientemente alquilo de bajo peso molecular, preferiblemente alquilo C1 -C4; n y n' indican el grado de polimerización y pueden ser cualquier número entero; n+n' está preferiblemente entre 600 y 1500, de la forma más preferible 910; el peso molecular medio del PEG con forma de U es de aproximadamente 26kD a 66kD, de la forma más preferible aproximadamente 40 kD.
[0023] En una forma de realización preferida, la invención también proporciona un método de preparación de una preparación de hormona del crecimiento modificada con PEG bicatenario, que comprende:
a) en una solución con pH 9,0 o 10,5, poner el PEG de la siguiente fórmula (III) en contacto con la hormona de crecimiento humana, donde la proporción molar de la hormona del crecimiento respecto al PEG bicatenario es aproximadamente 1: 2
donde, R y R' son independientemente alquilo de bajo peso molecular, preferiblemente alquilo C1 -C4; m+m' es 910, j es un número entero de 1 a 12; el peso molecular total medio del PEG es aproximadamente 40 kD;
b) evaluar el producto modificado por PEG en un único sitio obtenido en el paso a) en 12% SDS-PAGE;
c) separar y recuperar el producto modificado por PEG en un único sitio usando cromatografía de gel seleccionada de cromatografía Q Sepharose FF, cromatografía DEAE Sepharose FF o cromatografía MacroCap SP, y el contenido en SDSPAGE del producto de peso molecular aparente inferior, que se modifica por PEG en un único sitio, en el producto recuperado no es inferior al 70%, preferiblemente no inferior al 80%, de la forma más preferible no inferior al 90%.
[0024] La invención también proporciona una preparación de hormona del crecimiento pegilada preparada según el método descrito anteriormente, donde la hormona del crecimiento es extraída de una fuente natural o es una hormona del crecimiento recombinante obtenida por las biotecnologías recombinantes, preferiblemente la hormona del crecimiento tiene la secuencia de SEC ID n.º:1. Preferiblemente, el producto modificado por el PEG en un único sitio en la preparación de hormona del crecimiento pegilada presenta la siguiente fórmula (VII):
donde, R y R' son independientemente alquilo de bajo peso molecular, preferiblemente alquilo C1 -C4, de la forma más preferible metilo; m+m' es 910, j es un número entero de 1 a 12, donde el contenido en SDS-PAGE del producto de peso molecular aparente inferior que está modificado por el PEG en un único sitio en la preparación de hormona del crecimiento pegilada no es inferior al 70%, preferiblemente no inferior al 80%, de la forma más preferible no inferior al 90%.
[0025] En una forma de realización preferida de la invención, la hormona de crecimiento humana recombinante es artificialmente sintetizada o expresada a partir de un sistema de expresión seleccionado del grupo que consiste en: un sistema procariótico tal como E. coli., un sistema eucariota tal como Pichia de levadura; un sistema celular de insecto, y un sistema celular mamífero tal como célula CHO.
[0026] La invención también proporciona una composición que comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz de la hormona del crecimiento pegilada descrita anteriormente o la preparación de la hormona del crecimiento pegilada y un portador farmacéuticamente aceptable o excipiente, preferiblemente que comprende manitol, un aminoácido, cloruro sódico, ácido acético o acetato sódico, preferiblemente el aminoácido es seleccionado del grupo que consiste en aspartato, asparagina, lisina y glicina.
[0027] La invención también proporciona el uso de la hormona del crecimiento pegilada descrita anteriormente o la preparación de la hormona del crecimiento pegilada o la composición en la producción de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad que necesita tratamiento con la hormona del crecimiento o para tratamiento antienvejecimiento, preferiblemente la enfermedad que necesita tratamiento con la hormona del crecimiento se selecciona del grupo que consiste en enanismo, quemaduras, heridas, fracturas de hueso, úlceras de sangrado, insuficiencia renal, SIDA, enanismo por deficiencia de hormona del crecimiento endógena, síndrome Turner, trastorno anabólico y deficiencia de hormona del crecimiento adulta.
[0028] La invención también proporciona un método de tratar un paciente con una enfermedad que necesita tratamiento con la hormona del crecimiento o tratamiento antienvejecimiento, el método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la hormona del crecimiento pegilada descrita anteriormente o la preparación de hormona del crecimiento pegilada o la composición a dicho paciente, preferiblemente la enfermedad que necesita tratamiento con la hormona del crecimiento se selecciona del grupo que consiste en enanismo, quemaduras, heridas, fracturas de hueso, úlceras de sangrado, insuficiencia renal, SIDA, enanismo por deficiencia de hormona del crecimiento endógena, síndrome Turner, trastorno anabólico y deficiencia de hormona del crecimiento adulta.
[0029] La invención proporciona hormona del crecimiento modificada con polietilenglicol bicatenario (PEG) con alta actividad biológica, y el método de preparación de esta. La característica notable de esta invención reside en que, después de optimizar las condiciones de reacción y el método de separación, el contenido del componente de actividad celular baja en la hormona del crecimiento modificada por PEG en un único sitio es significativamente disminuido. En un ejemplo del PEG bicatenario con un peso molecular de 40kD, el producto de baja actividad celular modificado en un único sitio se caracteriza por el hecho de que, este producto y el producto de alta actividad celular modificado en un único sitio están completamente separados en dos bandas en 12% SDS-PAGE, y el peso molecular aparente del producto de baja actividad celular modificada en un único sitio es superior que el del producto de alta actividad celular modificado en un único sitio. Utilizando una rata con su glándula pituitaria eliminada como modelo animal y la hormona de crecimiento humana recombinante como control positivo, la actividad biológica in vivo del producto de alta actividad celular modificado en un único sitio se evalúa según el bioensayo de hormona crecimiento como se describe en Pharmacopoeia of the People's Republic of China, version 2005, Volume 2, Appendix XII P. El producto de alta actividad celular modificado en un sitio único tiene una actividad específica biológica significativamente más alta que la hormona del crecimiento normal, mostrando más de 1,5 veces de la actividad biológica de la hormona del crecimiento normal, y se muestra en la investigación farmacocinética en el macaco cangrejero (Macaca fascicularis) que tiene un promedio de vida media metabólica de medicamento en el suero más de 20 veces más largo que la de la hormona del crecimiento normal, y así tiene efectos a largo plazo.
[0030] En una forma de realización de la invención, la reacción de modificación de la hormona del crecimiento con el PEG-NHS bicatenario se realiza a pH 8,0, se utiliza electroforesis SDS-PAGE para el ensayo de los productos de la reacción, y coloración de plata se usa para visualización. Es sorprendente que, el producto de hormona del crecimiento modificado por PEG en un único sitio muestra dos bandas principales, lo cual es diferente de informes precedentes (Ross Clark, Kenneth Olson, et al. Long-acting growth hormones produced by conjugation with polyethylene glycol. J. Biol. Chem., 271:2196921977, 1996. Li, Weihua, Dong Jian et al., Long-term effective growth hormone and the pharmacological composition, China Patent Pub. n.º: CN1477126A). En experimentos posteriores, las modificaciones de la hormona del crecimiento por PEG-NHS bicatenario realizadas en un rango de pH 6,0-10,5 han sido estudiadas, y se ha encontrado por SDS-PAGE que todos los productos modificados en un único sitio muestran dos bandas principales. Conforme el pH aumenta, el contenido de la banda de peso molecular aparente inferior también aumenta. A pH ≥ 10,0, el producto modificado en un único sitio muestra sustancialmente una banda de peso molecular aparente inferior.
[0031] En una forma de realización preferida de la invención, algunas técnicas de purificación de cromatografía de gel apropiadas se utilizan para preparar la hormona de crecimiento humana recombinante purificada modificada por PEG en un único sitio a pH 10,5 y pH 6,0 respectivamente. SDS-PAGE con 12% de gel de separación se usa para la detección, y coloración de plata se usa para visualización. La hormona de crecimiento humana recombinante purificada modificada por PEG en un único sitio a pH 6,0 claramente muestra dos bandas. La hormona de crecimiento humana recombinante purificada modificada por PEG en un único sitio a pH 10,5 muestra principalmente la banda de peso molecular aparente inferior, el contenido de SDS-PAGE del cual no es inferior al 80%. Sólo cantidades traza de la proteína de sustrato se detecta en ambos casos (no más del 0,5%). MALDI-TOF MS confirma que los productos modificados en las dos condiciones de pH son sustancialmente los productos de hormona del crecimiento modificados por PEG en un único sitio. El ensayo de actividad celular indica que el producto modificado en un único sitio a pH 10,5 tiene una actividad celular significativamente más alta que el producto modificado en un único sitio a pH 6,0, la actividad específica celular del anterior es alrededor de dos veces la de este último.
[0032] En una forma de realización preferida de la invención, el producto de modificación purificado de la hormona de crecimiento humana recombinante, que se modifica por PEG en un único sitio a pH 6,0 y tiene un peso molecular aparente más alto, se prepara por purificación por cromatografía Q Sepharose FF o purificación por cromatografía MacroCap SP etc. La detección MALDI-TOF MS confirma que la hormona de crecimiento humana recombinante modificada por PEG es un producto modificado por PEG en un único sitio, y el ensayo de actividad celular ha demostrado que su actividad específica celular es significativamente inferior la de la hormona de crecimiento humana recombinante purificada modificada en un único sitio (con un peso molecular aparente inferior) a pH 10,5. La actividad específica celular del último es hasta 3 veces la del anterior.
[0033] En otra forma de realización de la invención, según el bioensayo para hormona del crecimiento como se describe en Pharmacopoeia of the People's Republic of China, version 2005, Volume 3, Appendix XII P, utilizando hormona de crecimiento humana recombinante como control positivo, el método que utiliza una rata con glándula pituitaria eliminada se utiliza para ensayo de la actividad biológica in vivo de los productos de modificación de la hormona de crecimiento humana recombinante modificada por PEG-NHS de 40kD en un único sitio a pH 10,5. La hormona de crecimiento humana recombinante se administra una vez todos los días, 6 veces en total. El producto de la hormona de crecimiento humana recombinante modificada por PEG en un único sitio se administra una vez en una dosis igual que la suma de 6 veces la administración de la hormona de crecimiento humana recombinante. La hormona de crecimiento humana recombinante modificada por PEG en un único sitio tiene una actividad biológica significativamente más alta que la hormona de crecimiento humana recombinante, y puede alcanzar hasta una actividad específica biológica superior a 1,5 veces la de la última. Su farmacología tiene un efecto a largo plazo. La investigación farmacocinética en el macaco cangrejero ha demostrado que la vida media metabólica de medicamento de la hormona de crecimiento humana recombinante modificada por PEG en un único sitio se alarga más de 20 veces la de la hormona del crecimiento recombinante normal.
[0034] La invención emplea derivados de PEG ramificado (ramificado con forma de Y y ramificado con forma de U) para modificar la hormona de crecimiento. El derivado de PEG ramificado con forma de Y empleado en la invención es un derivado de PEG ramificado nuevo, la estructura del cual es diferente de PEG lineal o PEG ramificado con forma de U, y su diferencia principal de PEG ramificado con forma de U reside en que las dos cadenas de PEG ramificado del derivado de PEG con forma de Y de la presente invención están enlazadas a través de un átomo de N, mientras que las dos cadenas de PEG ramificado del derivado de PEG con forma de U están enlazadas a través de un átomo de C. La modificación con PEG con forma de Y o con forma de U principalmente ocurre en α-amino libre del N-terminal de una proteína o péptido o en εamino de la cadena lateral de un residuo de Lys. El derivado de PEG con forma de Y presenta la siguiente fórmula molecular (I):
donde, Pa y Pb son el mismo o diferentes PEG; j es un número entero de 1 a 12; Ri es H, alquilo C1-12 no sustituido o sustituido, arilo, aralquilo, o heteroalquileno sustituido; X1 y X2 son independientemente grupos de enlace respectivamente, donde X1 es (CH2)n, X2 es seleccionado del grupo que consiste en: (CH2)n, (CH2)nOCO, (CH2)nNHCO, (CH2)nCO, donde n es un número entero de 1 a 10; F es un grupo terminal seleccionado del grupo que consiste en: hidroxilo, carboxilo, grupo éster, cloruro de acilo, hidracida, maleimida, bisulfuro de piridina, capaces de reaccionar con un grupo amino, hidroxilo o hidrosulfuro de un agente terapéutico o sustrato para formar un enlace covalente.
[0035] En una forma de realización preferida de la invención, Pa y Pb del derivado de PEG con forma de Y pueden ser el mismo o diferentes PEG, como se muestra en la fórmula (II):
Donde, R y R' son alquilos independientemente de bajo peso molecular, preferiblemente alquilo C1 -C4,de la forma más preferible metilo; m y m' indican el grado de polimerización y pueden ser cualquier número entero; m+m' está preferiblemente entre 600 y 1500, de la forma más preferible 910; Ri es H, alquilo C1-12 no sustituido o sustituido, arilo, aralquilo, o heteroalquileno sustituido; j es un número entero de 1 a 12. F es un grupo terminal seleccionado del grupo que consiste en: hidroxilo, carboxilo, grupo éster, cloruro de acilo, hidracida, maleimida, bisulfuro de piridina, capaces de reaccionar con un grupo amino, hidroxilo o hidrosulfuro de un agente terapéutico o sustrato para formar un enlace covalente. Preferiblemente, el peso molecular total medio del PEG es alrededor de 26kD a 60kD, de la forma más preferible 40kD.
[0036] En una forma de realización, la invención proporciona una hormona del crecimiento pegilada de la siguiente fórmula de estructura (VI):
donde, R y R' son independientemente alquilo de bajo peso molecular, preferiblemente alquilo C1 -C4, de la forma más preferible metilo; j es un número entero de 1 a 12; m y m' indican el grado de polimerización y pueden ser cualquier número entero; m+m' está preferiblemente entre 600 y 1500; Ri es H, alquilo C1-12 no sustituido o sustituido, arilo, aralquilo, o heteroalquileno sustituido; j es un número entero de 1 a 12. F es un grupo terminal seleccionado del grupo que consiste en: hidroxilo, carboxilo, grupo éster, cloruro de acilo, hidracida, maleimida, bisulfuro de piridina, capaces de reaccionar con un grupo amino, hidroxilo o hidrosulfuro de un agente terapéutico o sustrato para formar un enlace covalente. En una forma de realización preferida de la invención, la estructura de la molécula de derivado de PEG con forma de Y (YPEG-NHS) se muestra en la siguiente fórmula (III):
donde, R y R' son independientemente alquilo de bajo peso molecular, preferiblemente alquilo C1 -C4, de la forma más preferible metilo; j es un número entero de 1 a 12; m y m' indica el grado de polimerización y pueden ser cualquier número entero; m+m' está preferiblemente entre 600 y 1500, de la forma más preferible 910.
[0037] En una forma de realización preferida de la invención, la estructura de la molécula de derivado de PEG con forma de U (UPEG-NHS) se muestra en la siguiente fórmula (IV):
donde, R y R' son independientemente alquilo de bajo peso molecular, preferiblemente alquilo C1 -C4; n y n' indican el grado de polimerización y pueden ser cualquier número entero; n+n' está preferiblemente entre 600 y 1500, de la forma más preferible 910; el peso molecular medio del PEG es alrededor de 26kD a 66kD, de la forma más preferible aproximadamente 40 kD.
[0038] En una forma de realización de la invención, para obtener GH modificada con YPEG o UPEG, la fracción PEG de un derivado activado YPEG y UPEG tal como éster succinimidílico PEG (YPEG-NHS) está enlazada de manera covalente a un amino (-NH2) de una proteína a través de sustitución nucleofílica, el -NH2 incluye el α-NH2 del N-terminal de la proteína y ε-NH2 de un residuo de Lys. La ecuación de reacción de la producción de YPEG-GH de GH y YPEG-NHS es como se muestra a continuación:
[0039] La ecuación de reacción de la producción de UPEG-GH a partir de GH y UPEG-NHS es como se muestra a continuación:
[0040] Preferiblemente, el peso molecular total medio del PEG es acerca de 26kD a 66kD, de la forma más preferible aproximadamente 40 kD.
[0041] En otra forma de realización preferida de la invención, la GH pegilada de la invención presenta la siguiente fórmula de estructura (VII):
donde, R y R' son independientemente alquilo de bajo peso molecular, preferiblemente alquilo C1 -C4, de la forma más preferible metilo; j es un número entero de 1 a 12; m y m' indican el grado de polimerización y pueden ser cualquier número entero; m+m' está preferiblemente entre 600 y 1500. En la estructura, el PEG ramificado con forma de Y se enlaza a la molécula de GH en un único sitio. m y m' pueden ser el mismo o diferentes números enteros. El peso molecular del YPEG-GH en la fórmula anterior depende del grado de polimerización m y m'. Donde m+m' está preferiblemente entre 600 y 1500, el peso molecular medio correspondiente del YPEG es de aproximadamente 26kD a aproximadamente 66kD. Donde m+m' está preferiblemente entre 795 y 1030, el peso molecular medio correspondiente del YPEG está entre aproximadamente 35kD y aproximadamente 45kD. Donde m+m' está particularmente preferiblemente entre 885 y 1030, el peso molecular medio correspondiente del YPEG es alrededor de 39kD a 45kD. Donde m+m' es más preferible 910, el peso molecular medio correspondiente del YPEG es aproximadamente 40kD. La proporción de m a m' puede estar en un rango de 0,5 a 1,5, preferiblemente de 0,8 a 1,2.
[0042] Opcionalmente, la GH de la invención puede ser extraída de una fuente natural u obtenida por las biotecnologías recombinantes. Preferiblemente, la GH es GH humana con la secuencia de SEC ID n.º:1, que es extraída de una fuente natural u obtenida por las biotecnología recombinantes. Más preferiblemente, la GH humana es GH humana recombinante. La GH puede ser artificialmente sintetizada, o expresada a partir de un sistema procariótico como E. coli, o ser expresada de un sistema de levadura como Pichia pastoris, o ser expresada de un sistema celular de insecto o sistema celular mamífero como CHO. El método de preparación de la GH recombinante o natural y las pruebas de actividad de GH y productos modificados con PEG se conocen bien en la técnica.
[0043] Similar a la GH, el YPEG-GH y UPEG-GH de la invención se pueden usar clínicamente para tratar el enanismo, quemaduras, heridas, fracturas de hueso, úlceras de sangrado, insuficiencia renal, SIDA, trastorno anabólico, deficiencia de hormona del crecimiento adulta y para el tratamiento antienvejecimiento. El YPEG-GH y UPEG-GH de la invención se puede administrar a un paciente en forma de una composición que comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz del YPEG-GH o UPEG-GH, y un portador farmacéuticamente aceptable o excipiente. Por lo tanto, en otro aspecto, la invención proporciona una composición que comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz de la GH pegilada de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable o excipiente. El portador farmacéuticamente aceptable usado en la invención comprende poner un portador farmacéuticamente aceptable, estabilizador o excipiente que no es tóxico para la célula o mamífero en contacto con este en la dosificación usada o concentración. Normalmente un portador fisiológicamente aceptable es un tampón de pH acuoso. Ejemplos de un portador fisiológicamente aceptable comprenden un tampón tal como fosfato, citrato, y otro tampón de ácido orgánico, un antioxidante tal como ácido ascórbico, un polipéptido de peso molecular bajo (no más de 10 residuos), una proteína tal como seralbúmina, gelatina, o inmunoglobulina, un polímero hidrofílico tal como polivinilpirrolidona, un aminoácido tal como glicina, aspartato, glutamina, asparagina, arginina o lisina, un monosacárido tal como glucosa y manosa, otros sacáridos como disacárido y dextrina etc., un agente quelante tal como EDTA, un alcohol de azúcar tal como manitol y sorbitol, un contraión que forma sales tal como sodio, y/o un surfactante no iónico tal como TWEEN, PEG y PLURONICS. El excipiente es preferiblemente estéril y está normalmente libre de sustancias nocivas. La composición se puede esterilizar utilizando técnicas de esterilización de rutina. En una forma de realización de la invención, la composición comprende además manitol, un aminoácido, cloruro sódico, ácido acético y acetato sódico, donde el aminoácido es preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en lisina, aspartato, asparagina y glicina.
[0044] En otro aspecto, la invención también proporciona el uso de la GH pegilada de la invención o la composición que comprende la GH pegilada de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad que necesita tratamiento con GH y para tratamiento de antienvejecimiento. Preferiblemente, la enfermedad que necesita tratamiento con GH se selecciona del grupo que consiste en enanismo, quemaduras, heridas, fracturas de hueso, úlceras de sangrado, insuficiencia renal, SIDA, enanismo por deficiencia de hormona del crecimiento endógena, síndrome Turner, trastorno anabólico y deficiencia de hormona del crecimiento adulta.
[0045]
Fig. 1: los resultados de SDS-PAGE no reductivo de las muestras de rHuGH modificadas por YPEG-NHS 40kD o UPEG-NHS 40kD a pH 8,0. La concentración del gel de separación es 12%, y coloración de plata se usa para visualización. Línea
1: marcador, LMW, GE Healthcare; Línea 2: muestra de rHuGH modificada por YPEG-NHS a pH 8,0, cantidad de carga 2µg;
Línea 3: muestra de rHuGH modificada por YPEG-NHS a pH 8,0, cantidad de carga 5µg; Línea 4: muestra rHuGH
modificada por UPEG-NHS a pH 8,0, cantidad de carga 5µg.
Fig. 2: los resultados de SDS-PAGE no reductivo de muestras de rHuGH modificadas por YPEG-NHS 40kD a pH diferentes.
La concentración del gel de separación es 12%, y coloración de plata se usa para visualización. Línea 1: muestra de rHuGH
modificada por YPEG-NHS a pH 6,0; Línea 2: muestra de rHuGH modificada por YPEG-NHS a pH 7,0; línea 3: muestra de
rHuGH modificada por YPEG-NHS a pH 8,0; línea 4: muestra de rHuGH modificada por YPEG-NHS a pH 9,0; línea 5:
muestra rHuGH modificada por YPEG-NHS a pH 9,5; línea 6: muestra de rHuGH modificada por YPEG-NHS a pH 10,0;
línea 7: muestra de rHuGH modificada por YPEG-NHS a pH 10,5; línea 8:marcador, LMW, GE Healthcare. La cantidad de
carga de todas muestras es 5µg.
Fig. 3: los resultados de SDS-PAGE no reductivo de las muestras de rHuGH modificada por UPEG-NHS a diferentes pH. La
concentración del gel de separación es 12%, y coloración de plata se usa para visualización. Línea 1: muestra de rHuGH
modificada por UPEG-NHS a pH 6,0; línea 2: muestra rHuGH modificada por UPEG-NHS a pH 7,0; línea 3: muestra de
rHuGH modificada por UPEG-NHS a pH 8,0; línea 4: muestra de rHuGH modificada por UPEG-NHS a pH 9,0; línea 5:
muestra de rHuGH modificada por UPEG-NHS a pH 9,5; línea 6: muestra de rHuGH modificada por UPEG-NHS a pH 10,0;
línea 7: muestra de rHuGH modificada por UPEG-NHS a pH 10,5; línea 8: marcador, LMW, GE Healthcare. La cantidad de
carga de todas muestras es 5µg.
Fig. 4: los resultados de SDS-PAGE no reductivo de los productos de modificación purificados de rHuGH modificados por
YPEG-NHS 40kD O UPEG-NHS 40kD en un único sitio a pH 6,0 o pH 10,5. La concentración del gel de separación es 12%,
y coloración de plata se usa para visualización. Línea 1: UPEG-rHuGH U10,5, cantidad de carga 10µg; Línea 2: UPEG-
rHuGH U10,5, cantidad de carga 2µg; Línea 3: UPEG-rHuGH U6,0, cantidad de carga 10µg; Línea 4: UPEG-rHuGH U6,0,
cantidad de carga 2µg; Línea 5: marcador, LMW, GE Healthcare; línea 6: YPEG-rHuGH Y10,5, cantidad de carga 10µg;
línea 7: YPEG-rHuGH Y10,5, cantidad de carga 2µg; línea 8: YPEG-rHuGH Y6,0, cantidad de carga 10µg; línea 9: YPEGrHuGH Y6,0, cantidad de carga 2µg; línea 10: rHuGH, cantidad de carga 100ng; línea 11: rHuGH, cantidad de carga 50ng.
Fig. 5: los resultados del ensayo de la actividad celular de los productos de modificación de rHuGH purificados modificados
por UPEG-NHS 40kD en un único sitio a pH 6,0 o pH 10,5, placas de duplicado.
Fig. 6: los resultados del ensayo de la actividad celular de los productos de modificación de rHuGH purificados modificados
por YPEG-NHS 40kD en un único sitio a pH 6,0 o pH 10,5, placas de duplicado.
Fig. 7: los pesos moleculares de los productos de modificación de rHuGH purificados modificados por YPEG-NHS 40kD o
UPEG- NHS 40kD en un único sitio a pH 6,0, pH 9,0 o pH 10,5, detectado por MALDI-TOF MS. a: YPEG-rHuGH, Y6; b:
YPEG-rHuGH, Y9; c: YPEG-rHuGH, Y10,5; d: YPEG-rHuGH, Y6-1; e: UPEG-rHuGH, U6; f: UPEG-rHuGH, U9; g: UPEGrHuGH, U10,5; h: UPEG-rHuGH, U6-1; i: YPEG-NHS, 40kD; J: UPEG-NHS, 40kD; K: estándar calibrado de proteína II,
BRUKER; 1: rHuGH; m: estándar calibrado de proteína I, BRUKER. Fig. 8: los resultados de SDS-PAGE no reductivo del producto de modificación de rHuGH purificado de peso molecular aparente más alto modificado por PEG-NHS 40kD en un único sitio a pH 6,0, y del producto de modificación de rHuGH purificado modificado por PEG-NHS 40kD en un único sitio a pH10,5. La concentración del gel de separación es 12%, y coloración de plata se usa para visualización. Línea 1: YPEG-rHuGH Y10,5, cantidad de carga 2µg; Línea 2: YPEG- rHuGH Y6,0-1, cantidad de carga 2µg; Línea 3: UPEG-rHuGH U10,5, cantidad de carga 2µg; Línea 4: UPEG-rHuGH U6,0-1, cantidad de carga 2µg; línea 5: rHuGH, cantidad de carga 50ng; línea 6: rHuGH, cantidad de carga 100ng; línea 7: marcador, LMW, GE Healthcare; línea 8: YPEG-rHuGH Y10,5, cantidad de carga 10µg; línea 9: YPEG-rHuGH Y6,0-1, cantidad de carga 10µg; línea 10: UPEG-rHuGH U10,5, cantidad de carga 10µg; línea 11: UPEG-rHuGH U6,0-1, cantidad de carga 10µg. Fig. 9: los pesos moleculares aparentes detectados por SDS-PAGE no reductivo de los productos de modificación de rHuGH purificados (Y6-1; U6-1) de peso molecular aparente más alto modificados por PEG-NHS 40kD en un único sitio a pH 6,0, y de los productos de modificación de rHuGH purificados (Y10,5; U10,5) modificados por PEG-NHS 40kD en un único sitio a pH10,5. Línea 1: YPEG-rHuGH Y6-1+YPEG-rHuGH Y10,5, cada 25ng; línea 2: YPEG-rHuGH Y6-1,50ng de Y6-1,50ng; línea 3: YPEG-rHuGH Y10,5, 50ng; línea 4,6: blanco; línea 5: marcador, HMW, GE Healthcare; línea 7: UPEG-rHuGH U6- 1+UPEG-rHuGH U10,5, cada 25ng; línea 8: UPEG-rHuGH U6-1,50ng de U6-1,50ng; línea 9: UPEG-rHuGH U10,5, 50ng. Fig. 10: la curva de concentración de medicamento de suero medio vs. tiempo de inyección subcutánea única en el macaco cangrejero de 300µg·kg-1 de rHuGH y YPEG-rHuGH (Y10,5) respectivamente.
[0046] La presente invención será adicionalmente descrita a través de los ejemplos siguientes, pero cualquier ejemplo o combinación de los mismos no debería ser considerado como limitación del alcance y formas de realización de esta invención. El alcance de esta invención sólo se limita por las reivindicaciones anexas. Combinando esta descripción y estado de la técnica en la técnica, un experto en la técnica puede claramente entender el alcance limitado por las reivindicaciones.
Ejemplo 1
La modificación de la GH humana recombinante por PEG ramificado con forma de Y o con forma de U
[0047] 200 mg de cada de UPEG-NHS y YPEG-NHS (P.M. medio 40kD, brazos iguales; lot. n.º ZZ004P182 y ZZ004P167, respectivamente) (Beijing JenKem Technology Co., Ltd.) fueron pesados y disueltos en 2ml de HCl 2mM (Guangdong Guanghua Chemical Factory Co., Ltd.) respectivamente. 50mg de rHuGH (Xiamen Amoytop Biotech Co., Ltd.) y 50mM de tampón de ácido bórico-bórax, pH 8,0 (Sinopharm Shanghai Chemical Reagent Co., Ltd.) fueron adicionados respectivamente a un volumen de reacción de total final de 10 ml. En el sistema de reacción, la concentración de reacción final de rHuGH fue 5mg/ml, y la proporción molar de reacción de rHuGH respecto a PEG-NHS fue aproximadamente 1: 2. La incubación fue hecha a lt;10 °C durante 2h con agitación, y ácido acético glacial (Shantou Xilong Chemical Co., Ltd.) se añadió para conseguir pHlt;4,0 para parar la reacción. Una muestra fue tomada para SDS-PAGE, y coloración de plata fue usada para visualización. Los resultados del SDS-PAGE se muestran en la fig. 1. De los resultados de SDS-PAGE en fig. 1, los productos de modificación a pH 8.0 muestran dos bandas principales, y las muestras modificadas por UPEG-NHS y YPEG-NHS muestran las mismas características SDS-PAGE de electroforesis.
Ejemplo 2
Las modificaciones de la GH humana recombinante por PEG ramificado con forma de Y y con forma de U a diferentes pH
[0048] 200 mg de cada UPEG-NHS y YPEG-NHS (P.M. medio 40kD, brazos iguales; lot. Nos. ZZ004P182 y ZZ004P167 respectivamente) (Beijing JenKem Technology Co., Ltd.) fueron pesados y disueltos en 2ml de HCl 2mM (Guangdong Guanghua Chemical Factory Co., Ltd.) respectivamente. 50mg de rHuGH (Xiamen Amoytop Biotech Co., Ltd.) y el tampón correspondiente fueron adicionados respectivamente a un volumen de reacción total final de 10ml. 10mM de tampón PBNa (Sinopharm Shanghai Chemical Reagent Co., Ltd.) del correspondiente pH para la reacción a pH 6,0, 7,0 o 8,0 fueron usados, y 50mM tampón de bórax (Sinopharm Shanghai Chemical Reagent Co., Ltd.) del correspondiente pH para la reacción a pH 9,0, 9,5, 10,0 o 10.5 fue usado. En el sistema de reacción, la concentración de reacción final de rHuGH fue 5mg/ml, y la proporción molar de reacción de rHuGH a PEG-NHS fue aproximadamente 1: 2. La incubación se realizó a lt;10 °C durante 2h con agitación, y ácido acético glacial (Shantou Xilong Chemical Co., Ltd.) se añadió para conseguir pHlt;4,0 para parar la reacción. Una muestra fue tomada para SDS- PAGE, y coloración de plata fue usada para visualización. El sistema de visualización de gel (modelo n.º: FR-200, Shanghai FURI Science & Technology Co., Ltd.) fue usado para analizar los resultados de electroforesis. Los resultados de electroforesis SDS-PAGE se muestran en la fig. 2 y fig. 3, y los resultados del análisis por el sistema de visualización de gel se muestran en la tabla 1. De los resultados de electroforesis, los productos modificados a pH 6,0-9,5 muestran claramente dos bandas principales, y conforme el pH de la reacción aumenta, el contenido de la banda de peso molecular aparente inferior también aumenta correspondientemente. Los productos modificados a pH 10,0 y 10,5 son sustancialmente la banda de peso molecular aparente inferior. Las muestras modificadas UPEG-NHS y YPEG-NHS muestran las mismas características de electroforesis SDS-PAGE.
Tabla 1. El análisis del sistema de visualización de gel en los resultados SDS-PAGE de las GH humanas recombinantes modificadas por PEG ramificado con forma de Y y con forma de U a diferentes pH
- Reacción de modificación pH
- 6,0 7,0 8,0 9,0 9,5 10,0 10,5
- YPEG
- Contenido de banda 1 (%) 53,9 48,6 27,7 25,7 6,9 5,6 7,9
- Contenido de banda 2 (%)
- 46,1 51,4 72,3 74,3 93,1 94,4 92,1
- UPEG
- Contenido de banda 1 (%) 47,5 41,8 30,1 27,4 24,4 18,9 7,5
- Contenido de banda 2 (%)
- 52,5 58,2 69,9 72,6 75,6 81,1 92,5
- Nota: quot;contenidoquot; se refiere al contenido en porcentaje relativo de la banda 1 (P.M. aparente más alto) respecto a la banda 2 (P.M aprente inferior) de los productos de rHuGH modificados por PEG en un único sitio.
Ejemplo 3
[0049] La preparación, actividad celular y P.M. de la GH humana recombinante modificada por PEG ramificado con forma de Y o con forma de U en un único sitio a pH 6,0, pH 9,0 o 10,5 15 1 Modificación
[0050] Tres muestras de 1200 mg de cada UPEG-NHS y YPEG-NHS (P.M. medio 40kD, brazos iguales; lot. n.º ZZ004P182 y ZZ004P167 respectivamente) (Beijing JenKem Technology Co., Ltd.) fueron pesados y disueltos en 12 ml de HCl 2mM 20 (Guangdong Guanghua Chemical Factory Co., Ltd.) respectivamente. 300 mg de rHuGH (Xiamen Amoytop Biotech Co., Ltd.) y 50 mM de tampón bórax (pH 10,5) o 50 mM tampón de ácido bórico/bórax (pH 9,0) o 10mM PBNa (pH6,0) (Sinopharm Shanghai Chemical Reagent Co., Ltd.) fueron adicionados respectivamente a un volumen de reacción total final de 60 ml. En el sistema de reacción, la concentración de reacción final de rHuGH fue 5mg/ml, la proporción molar de reacción entre el rHuGH y el PEG- NHS fue aproximadamente 1:2, y los pH de reacción fueron 10,5, 9,0, 6,0
25 respectivamente. La incubación fue realizada a lt;10 °C durante 2h con agitación, y ácido acético glacial (Shantou Xilong Chemical Co., Ltd.) se añadió para conseguir pHlt;4,0 para parar la reacción. Una muestra fue tomada para SDS-PAGE, y coloración de plata fue usado para visualización.
2 Purificación 30
[0051] La muestra de modificación PEG de rHuGH fue diluida 3 veces utilizando agua ultrapura, y el pH de la muestra diluida fue ajustado a 9,0 con NaOH o HCl. 35
[0052] La columna de cromatografía (Shanhai Jinhua Chromatography Equipment Factory) fue Φ18mmX400mm, la especificación de embalaje del material para embalaje Q Sepharose FF (GE GE Healthcare) fue Φ18mmX240mm, y el 40 volumen del lecho de columna (CV) fue 61ml. La columna de cromatografía Q Sepharose FF se limpió en el lugar utilizando NaOH 0,5M a 5ml/min durante 30min, eluido con 3 CV de ddH2O a 5ml/min, regenerado con 3CV de 1M NaCl a 5ml/min, y eluido con 5CV de 20mM ácido bórico/borax-17mM NaCl (pH 9,0, solución A) a 5ml/min. Las muestras diluidas con agua ultrapura del rHuGH modificado con PEG fueron cargadas a una velocidad de flujo de 3ml/min, y el eluyente fue detectado a 280nm (AKTA Basic100, GE Healthcare). La elución fue hecha utilizando una solución A a 5ml/min hasta que el primer valor 45 máximo fue completamente detectado; y 20mM de ácido bórico/borax-100mM NaCl (pH 9,0, solución B) fue luego usada para eluir a 5ml/min hasta que el segundo valor máximo fue completamente detectado. 20 mM ácido bórico/borax-200 mM
NaCl (pH 9,0, solución C) fue luego usada para eluir a 5 ml/min hasta que el tercer valor máximo fue completamente detectado. La muestra del segundo valor máximo fue recogida como la muestra objetivo. El sistema de tampón de la muestra objetivo fue cambiado a 20 mM ácido bórico/bórax (pH 9,0) a través de ultrafiltración con ultrafiltro 5K (filtro millipore, material de polietersulfona).
[0053] La columna de cromatografía (Shanhai Jinhua Chromatography Equipment Factory) fue Φ18mmX400mm, la especificación de embalaje del material para embalaje Q Sepharose FF (GE Healthcare) fue Φ18mmX240mm, y el volumen del lecho de columna (CV) fue 61ml. La columna de cromatografía Q Sepharose FF se limpió en el sitio utilizando 0,5M NaOH a 5 ml/min durante 30 min, eluido con 3 CV de ddH2O a 5ml/min, regenerado con 3CV de 1M NaCl a 5ml/min, y eluido con 5CV de 20mM ácido bórico/borax-17mM NaCl (pH 9,0, solución A) a 5 ml/min. La muestra diluida con agua ultrapura de rHuGH modificado con PEG fue cargada a una velocidad de flujo de 3 ml/min, y el eluyente fue detectado a 280 nm (AKTA Basic100, GE Healthcare). La elución se realizó utilizando una solución A a 5 ml/min hasta que el primer valor máximo fue completamente detectado, y 20 mM ácido bórico/borax-40 mM NaCl (pH 9,0, solución B) fue usada para eluir a 5ml/min hasta que el segundo valor máximo fue completamente detectado. 20 mM ácido bórico/borax-100 mM NaCl (pH 9,0, solución C) fue luego usada para eluir a 5ml/min hasta que el tercer valor máximo fue completamente detectado, y 20 mM de ácido bórico/borax-200 mM NaCl (pH 9.0, solución D) fue usada para eluir a 5ml/min hasta que el cuarto valor máximo fue completamente detectado. La muestra del tercer valor máximo fue recogida como la muestra objetivo. El sistema de tampón de la muestra objetivo fue cambiado a 20 mM ácido bórico/bórax (pH 9,0) a través de ultrafiltración con ultrafiltro 5K (filtro millipore, material de polietersulfona).
[0054] La columna de cromatografía (Shanhai Jinhua Chromatography Equipment Factory) fue Φ18mmX400mm, la especificación de embalaje del material para embalaje de la DEAE Sepharose FF (GE Healthcare) fue Φ18mmX235mm, 1CV=60 ml.
[0055] La columna de cromatografía DEAE Sepharose FF se limpió en el lugar utilizando 0,5 M NaOH a 5 ml/min durante 30 min, eluido con 3 CV de ddH2O a 5 ml/min, regenerado con 3 CV de 1 M NaCl a 5 ml/min, y eluido con 3 CV de 20 mM ácido bórico/bórax (pH 9,0, solución A) a 5 ml/min. La muestra de PEG-rHuGH purificada por Q Sheparose FF fue cargada a una velocidad de flujo de 3 ml/min, eluido con 3 CV de solución A a 5ml/min, y eluido con 6 CV de 20 mM ácid bórico/borax-30 mM NaCl (pH 9,0, solución B) a 5ml/min. 20 mM ácido bórico/bórax-100 mM NaCl (pH 9,0, solución C) fue usada para eluir a 5 ml/min hasta que los primeros y segundos picos fueron completamente detectados. El eluyente fue detectado a 280 nm (AKTA Basic100, GE Healthcare). La muestra del segundo valor máximo fue recogida como la muestra objetivo. El sistema de tampón de la muestra objetivo fue cambiado a 5 mM PBNa (pH 8,5) y apropiadamente concentrado a través de ultrafiltración con ultrafiltro 5K (filtro millipore, material de polietersulfona).
[0056] La columna de cromatografía (Shanhai Jinhua Chromatography Equipment Factory) fue Φ25mmX400mm, la especificación de embalaje del material para embalaje Q Sepharose FF (GE Healthcare) fue Φ25mmX200mm, 1 CV=98 ml.
[0057] La columna de cromatografía Q Sepharose FF se limpió en el lugar utilizando 0,5 M NaOH a 10 ml/min durante 30 min, eluido con 3 CV de ddH2O a 10 ml/min, regenerado con 3 CV de 1 M NaCl a 10 ml/min, y eluido con 3 CV de 5 mM PBNa (pH 8,5, solución A) a 10 ml/min. La DEAE Sepharose FF purificada PEG-rHuGH muestra fue cargada a una velocidad de flujo de 6 ml/min, y eluido con 3 CV de solución A a 10ml/min. 5 mM PBNa-90 mM NaCl (pH 8,5, solución B) fue usada para eluir a 10 ml/min hasta que el primer valor máximo fue completamente detectado, y 5 mM PBNa-300 mM NaCl (pH 8,5, solución C) fue usada para eluir a 10 ml/min hasta que el segundo valor máximo fue completamente detectado. El eluyente fue detectado a 280 nm (AKTA Basic100, GE Healthcare). La muestra desde el primer valor máximo fue recogida como la muestra objetivo. El sistema de tampón de la muestra objetivo fue cambiado a 3 mM NaAc/HAc-7 mM NaCl-5 mM Lys (pH 5,0) a través de ultrafiltración utilizando ultrafiltro 5K (filtro millipore, material de polietersulfona), y manitol fue suplementado a la concentración final de 45 mg/ml. La muestra fue esterilizada a través de filtración 0,2 µm. Una muestra fue tomada para electroforesis SDS-PAGE, y coloración de plata fue usado para visualización. La muestra restante fue almacenada a -70 °C. El producto de modificación modificado a pH 6,0 fue designado como Y6 o U6, donde la banda de
P.M. aparente más alto fue designada como Y6-1 o U6-1, mientras que la banda de P.M. aparente inferior fue designada como Y6-2 o U6-2.,El producto de modificación a pH 9,0 fue designado como Y9 o U9, y el producto de modificación a 10,5 fue designado como Y10,5 o U10,5.
[0058] Los resultados de SDS-PAGE se muestran en la fig. 4. De los resultados de electroforesis, los productos de modificación a pH 6,0 muestran claramente dos bandas, pero los productos de modificación a pH 10,5 fueron principalmente
la banda de P.M. aparente inferior con un contenido SDS-PAGE no inferior al 80%.
3 Actividad celular
[0059] Utilizando estándar nacional de GH como control, una línea celular Nb2-11 de linfoma de rata dependiente de HuGH fue empleada para el ensayo de la actividad celular de cada muestra de PEG-rHuGH.
[0060] Células Nb2-11 fueron diluidas a la concentración final de 5X104 células/ml. Estándar nacional de GH (lot. n.º: 35-20002, 1 mg/ml/tube, 3IU/tubo; comprado de National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products) fueron pre-diluidos a 100ng/ml (0,0003 IU/ml), y cada muestra de PEG-rHuGH que debía ser evaluada fue pre-diluida a 0,0003 IU/ml según los resultados de pre-experimentos. En base a la pre-dilución, cada muestra fue evaluada después de una vez y media de dilución de gradiente. La actividad de la muestra fue calculada según la siguiente ecuación:
C1 D1
Actividades de las muestras de examen= Actividades de los estándares x x C2 D2
donde: C1 es el número de veces de dilución de la muestra que debe ser evaluada equivalente a la cantidad de semi-efecto del estándar
C2 Es el número de veces de dilución del estándar de semi-efecto
D1 Es el número de veces de pre-dilución de la muestra que debe ser evaluada
D2 Es el número de veces de pre-dilución del estándar
[0061] Método de ensayo:
- (1)
- las células en la fase de crecimiento logarítmico fueron tomadas, reiteradamente pipetadas, centrifugadas y lavadas. Las células fueron resuspendidas en el diluyente, y fueron ajustadas a una concentración de 5X104 células/ml.
- (2)
- cada muestra pre-diluida que debe ser evaluada fue diluida a doble gradiente respectivamente en la placa celular (placa de 96 pocillos, Coming), 10 gradientes en total, y duplicados de pocillos fueron hechos para cada gradiente, 50 µl/pocillo. El control positivo fue hecho en 8 gradientes de la misma manera. El diluyente fue usado como control negativo.
- (3)
- las células fueron adicionadas en una densidad de 100 µl/pocillo, colocadas en un incubador de CO2 e incubadas a 37 °C durante aproximadamente 70 horas. Solución AlamarBlue™ (BioSource) fue añadida a 30 µl/pocillo, mezclada con agitación durante 1 min. La incubación se realizó en un incubador de CO2 a 37 °C durante 5 horas. Después de agitar a temperatura ambiente durante 5 min, la placa fue leída (longitud de onda de luz excitada 530 nm; longitud de onda de luz de emisión 590nm).
- (4)
- un método de regresión de cuatro parámetros fue usado para representar el estándar y la muestra que debe ser evaluada. Los títulos de cada muestra que debe ser evaluada fueron calculados según la ecuación de los gráficos del estándar y las muestras que deben ser evaluadas.
[0062] Los resultados de la actividad celular se muestran en la tabla 2 y fig. 5 también fig. 6. Muestras de duplicado se estudiaron para cada muestra. La actividad específica celular de rHuGH modificado con YPEG-NHS a pH 6,0 (Y6) es 1,08x10-1 IU/mg, la actividad específica celular del producto modificado a pH 9,0 (Y9) es 1,66X10-1 IU/mg, y la actividad específica celular del producto modificado a pH 10,5 (Y10,5) es 2,09X10-1 IU/mg, donde la actividad específica celular de Y10,5 es aproximadamente 2 veces la de Y6. La actividad específica celular de rHuGH modificado con UPEG-NHS a pH 6,0 (U6) es 8,85X10-2 IU/mg, la actividad específica celular del producto modificado a pH 9,0 (U9) es 1,42X10-1 IU/mg; y la actividad específica celular del producto modificado a pH 10,5 (U10,5) es 1,82X10-1 IU/mg, donde la actividad específica celular de U10,5 es alrededor de dos veces la de U6. Conforme el pH de la reacción de modificación aumenta, la actividad celular del producto modificado por PEG en un único sitio (2 bandas principales) también aumenta correspondientemente.
Tabla 2. La actividad celular de cada muestra de YPEG-rHuGH y UPEG-rHuGH * 5
- Muestra
- Tipo PEG PEG P.M. (kD) Actividad específica celular (X 10-1 IU/mg)
- Placa 1
- Placa 2 promedio
- YPEG-rHuGH, Y6
- ramificado Y 40 1,04 1,12 1,08
- YPEG-rHuGH, Y9
- ramificado Y 40 1,58 1,74 1,66
- YPEG-rHuGH, Y10,5
- ramificado Y 40 2,06 2,12 2,09
- UPEG-rHuGH, U6
- ramificado U 40 0,88 0,89 0,88
- UPEG-rHuGH, U9
- ramificado U 40 1,38 1,46 1,42
- UPEG-rHuGH, U10,5
- ramificado U 40 1,84 1,80 1,82
- Nota: * estándar nacional de GH fue usado como o estándar. Lot. n.º del estándar: 35-20002, LMG/ml/tubo, 3IU/tubo, comprado de National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products.
4 El peso molecular determinado por MALDI-TOF MS
[0063] Utilizando el espectroscopio de masas Autoflex � TOF/TOF (BRUKER; Alemania), el método MALDI-TOF MS fue empleado para determinar el peso molecular de cada muestra de PEG-rHuGH. Ácido sinapínico (SA, C11H12O5, P.M. 224,22, número de lote: 2006 236870 002, BRUKER) fue usado como matriz, patrón de calibración de proteína I (Part n.º 206355) y patrón de calibración de proteína II (parte n.º 207234) de BRUKER fueron usados como estándares de peso molecular de proteína, y el software de análisis fue flexAnalysis Ver.3.0.54.0. Los resultados se muestran en la Fig. 7.
[0064] El rHuGHs modificado con YPEG-NHS a pH 6,0 (Y6), pH 9,0 (Y9) y pH 10,5 (Y10,5) todos tienen un peso molecular MS en un rango de 62012 Dalton ± 10%, que es consistente con el peso molecular teórico del rHuGH modificado por YPEG en un único sitio (el peso molecular de YPEG-NHS es 40kD±10 %), indicando que Y6, Y9 y Y10,5 son el producto de modificación de rHuGH modificado por YPEG en un único sitio. El rHuGHs modificado con UPEG-NHS a pH 6,0 (U6), pH 9,0 (U9) y pH 10,5 (U10,5) todos tienen un peso molecular MS en un rango de 62012 Dalton ± 10%, que es consistente con el peso molecular teórico de los productos de modificación de rHuGH modificados por UPEG en un único sitio (el peso molecular de UPEG-NHS es 40kD ± 10%), indicando que U6, U9 y U10,5 son el producto de modificación de rHuGH modificado por UPEG en un único sitio.
Ejemplo 4
La preparación también el ensayo de la actividad celular y P.M. del producto de modificación de GH humana recombinante de peso molecular aparente más alto modificada por PEG ramificado con forma de Y o con forma de U en un único sitio a pH 6,0 (Y6-1; U6-1)
1 Modificación
[0065] Dos muestras de 1200 mg de cada UPEG-NHS y YPEG-NHS (P.M. medio 40kD, brazos iguales; n.º de lot. son ZZ004P182; ZZ004P167 respectivamente) (Beijing JenKem Technology Co., Ltd.) fueron pesados y disueltos en 12 ml de 2 mM HCl (Guangdong Guanghua Chemical Factory Co., Ltd.) respectivamente. 300 mg de rHuGH (Xiamen Amoytop Biotech Co., Ltd.) y 10 mM PBNa (pH 6,0)(Sinopharm Shanghai Chemical Reagent Co., Ltd.) fueron adicionados respectivamente a un volumen de reacción de total final de 60 ml. En el sistema de reacción, la concentración de reacción final de rHuGH fue 5 mg/ml, la proporción molar de reacción del rHuGH respecto a PEG-NHS fue aproximadamente 1: 2, y el pH de la reacción fue 6,0. La incubación fue hecha a lt;10 °C durante 2 h con agitación, y ácido acético glacial (Shantou Xilong Chemical Co., Ltd.) se añadió conseguir pHlt;4,0 para parar la reacción.
2 La purificación del producto de peso molecular aparente más alto modificado por PEG en un único sitio (Y6-1; U6-1)
[0066] La muestra de rHuGH modificada por PEG (pH 6,0) fue diluida 3 veces utilizando agua ultrapura, y el pH fue ajustado a 9,0 utilizando NaOH.
[0067] La columna de cromatografía (Shanhai Jinhua Chromatography Equipment Factory) fue Φ25mmX500mm, y la especificación de embalaje del material para embalaje Q Sepharose FF (GE Healthcare) fue Φ25mmX310mm, 1 CV=152 ml. La columna de cromatografía Q Sepharose FF se limpió en el lugar utilizando 0,5 M NaOH a 10 ml/min durante 30min, eluido con 3 CV de ddH2O a 10 ml/min, regenerado con 3 CV de 1 M NaCl a 10 ml/min, y eluido con 5 CV de 20 mM ácido bórico/borax-17 mM NaCl (pH 9,0, solución A) a 10 ml/min. La muestra diluida de agua ultrapura del rHuGH modificada con PEG fue cargada a una velocidad de flujo de 6 ml/min, y eluido utilizando una solución A a 10 ml/min hasta que el primer valor máximo fue completamente detectado. 20 mM ácido bórico/borax-100 mM NaCl (pH 9,0, solución B) fue luego usada para eluir a 10 ml/min hasta que el segundo valor máximo fue completamente detectado, y 20 mM ácido bórico/borax-200 mM NaCl (pH 9,0, solución C) fue usado para eluir a 10 ml/min hasta que el tercer valor máximo fue completamente detectado. El eluyente fue detectado a 280 nm (AKTA Basic100, GE Healthcare). La muestra del segundo valor máximo fue recogida como la muestra objetivo. El sistema de tampón de la muestra de objetivo fue cambiado a 5 mM NaAc/HAc (pH 4,5) a través de ultrafiltración con ultrafiltro 5K (filtro millipore, material de polietersulfona).
[0068] La columna de cromatografía (Shanhai Jinhua Chromatography Equipment Factory) fue Φ12mmX300mm, y la especificación de embalaje para el material de embalaje Macro Cap SP (GE Healthcare) fue Φ12mmX180mm, 1 CV=20 ml. La columna de cromatografía MacroCap SP se limpió en el lugar utilizando 0,5 M NaOH a 1 ml/min durante 30 min, eluido con 3 CV de ddH2O a 1 ml/min, regenerado con 3 CV de 1 M NaCl a 1 ml/min, y eluido con 5 CV de 5 mM NaAc/HAc (pH 4,5, solución A) a 1 ml/min. La muestra de PEG-rHuGH purificada por Q Sepharose FF fue cargada a una velocidad de flujo de 1 ml/min, y eluido con 3 CV de solución A a 1 ml/min. 5 mM NaAc/HAc-100 mM NaCl (pH 4,5, solución B) fue usada para eluir con 5 CV en un gradiente de 0 % - 30 % solución B a 1 ml/min, eluido con 10CV en un gradiente de 30 % - 45 % B, y luego eluido con 5 mM NaAc/HAc-1M NaCl (pH 4,5, solución C) a 1 ml/min hasta que el primer y los segundos picos fueron completamente detectados. El eluyente fue detectado a 280 nm (AKTA Basic100, GE Healthcare). El eluyente entre el quinto y el octavo CV durante la elución con un gradiente de 30 % - 45 % solución B fue recogido como muestra objetivo. El sistema tampón de la muestra objetivo fue cambiado a 3 mM NaAc/HAc - 7 mM NaCl - 5 mM Lys (pH 5,0) a través de ultrafiltración con ultrafiltro 5K (filtro millipore, material de polietersulfona), y manitol fue complementado a una concentración final de 45 mg/ml. La muestra fue esterilizada a través de filtración 0,2 µm. Una muestra fue tomada para electroforesis SDS-PAGE, y coloración de plata fue usada para visualización. La muestra restante fue almacenada a -70 °C. Los números de muestra fueron: U6-1; Y6-1. Los resultados de la electroforesis SDS- PAGE se muestran en la fig. 8, y los resultados de peso molecular aparente de la electroforesis SDS-PAGE se muestran en la fig. 9.
[0069] En el caso de cargar 10 µg de muestra PEG-rHuGH, una pequeña cantidad del producto modificada en más de un sitio fue detectada en cada muestra de PEG-rHuGH, y el contenido de la proteína de sustrato (rHuGH) en cada muestra no era más del 0,5% (fig. 8), donde el contenido de la banda mayor no es inferior al 80%. El peso molecular aparente de cada muestra de PEG-rHuGH determinado por electroforesis SDS-PAGE muestra una banda principal, donde el peso molecular aparente de Y6-1 es claramente superior al de Y10,5, y el peso molecular aparente de U6-1 es claramente superior al de U10,5 (fig. 9).
3 El peso molecular detectado por MALDI-TOF MS
[0070] Utilizando un espectroscopio de masas autoflex TOF/TOF (BRUKER; Alemania), el método MALDI-TOF MS fue usado para el ensayo del peso molecular de cada muestra de PEG-rHuGH. El método de detección fue el mismo que en el ejemplo 3. Los resultados se muestran en la fig. 7.
[0071] Los pesos moleculares MS de Y6-1 y U6-1 están ambos en un rango de 62012 Dalton ± 10 %, que es consistente con el peso molecular teórico del rHuGH modificado por PEG en un único sitio (los pesos moleculares de YPEG-NHS y UPEG-NHS son 40 kD ± 10%), indicando que ambos son los productos modificados por PEG en un único sitio.
4 Ensayo de actividad celular
[0072] Utilizando el estándar nacional de GH como control, la línea celular de linfoma de rata Nb2-11 dependiente de HuGH fue usada para el ensayo de la actividad celular de cada muestra de PEG-rHuGH, comparando la diferencia de actividad celular entre Y6-1 y Y10,5, U6-1 y U10,5. El método de ensayo fue el mismo que en el ejemplo 3. Los resultados se muestran en la tabla 3, por triplicado para cada muestra.
[0073] La actividad específica celular media de Y10,5 es 2,08X10-1 IU/mg, la actividad específica celular media de Y6-1 es 5,50X10-2 IU/mg; la actividad específica celular media de U10,5 es 2,28X10-1 IU/mg, y la actividad específica celular media de U6-1 es 5,00X10-2 IU/mg. La actividad específica celular media de Y10,5/U10,5 es claramente superior que la de Y6-1/U6-1, y pueden alcanzar hasta 3 veces la última.
Tabla 3. La actividad celular de cada muestra de YPEG-rHuGH o UPEG-rHuGH 1
- Muestra
- Tipo de PEG P.M. de PEG (kD) Número de sitios de modificación PEG Actividad celular específica (X10-1 IU/mg)2
- YPEG-rHuGH, Y10,5
- ramificado Y 40 único 2,08±0,10
- YPEG-rHuGH, Y6-1
- ramificado Y 40 único 0,55±0,06
- UPEG-rHuGH, U10,5
- ramificado U 40 único 2,28±0,14
- UPEG-rHuGH, U6-1
- ramificado U 40 único 0,50±0,06
- Nota: 1 utilizando estándar nacional de GH como estándar n.º Lot. del estándar: 35-20002, LMG/ml/tubo, 3IU/tubo, comprado de National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products. 2 Promedio de muestras triplicadas.
Ejemplo 5
El ensayo de actividad biológica in vivo de YPEG-rHuGH (Y10,5) y UPEG-rHuGH (U10,5)
[0074] Utilizando ratas con la glándula pituitaria eliminada como modelos animales, la actividad biológica de promoción de crecimiento de animal in vivo de YPEG-rHuGH (Y10,5) y UPEG-rHuGH (U10,5) fueron evaluadas según el bioensayo de la hormona de crecimiento como se describe en Pharmacopoeia of the People's Republic of China, version 2005, Volume 3, Appendix XII P, es decir observando el efecto en el crecimiento y desarrollo de ratas con la glándula pituitaria quitada (sin GH endógena) una semana después de una administración única.
[0075] Ratas Wistar, nivel SPF, macho, nacidas 26-28d, peso corporal de 60-80g, proporcionadas por el centro de experimentos animales de National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products (certificación animal n.º: SCXK(Jing)2005- 0004), fueron usadas. 2-3 semanas antes el experimento, las glándulas pituitarias de las ratas fueron eliminadas asépticamente por cirugía, y las ratas fueron luego normalmente criadas en un laboratorio S-2 para la recuperación para otro experimento. Las ratas cualificadas con glándula pituitaria eliminada fueron seleccionadas, y divididas uniformemente en 10 grupos de 10 ratas según el peso corporal, en concreto: grupo de control negativo (solvente de blanco); grupos de control positivo rHuGH (estándar nacional de GH, preparado por National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Product, 3IU·mg-1·tubo-1), dosis baja (2,7 IU·kg-1), dosis media (5,3 IU·kg-1) y dosis alta (10,7 IU·kg-1), administrado en 6 veces, una vez al día, 6 administraciones consecutivas; grupos de baja dosis (2,7 IU·kg-1), dosis media (5,3 IU·kg-1) y dosis alta (10,7 IU·kg-1) de la muestra de prueba Y10,5, grupos de dosis baja (2,7 IU·kg-1), dosis media (5,3 IU·kg-1) y dosis alta (10,7 IU·kg-1) de la muestra de prueba U10,5, administración en una única una vez en el primer día cuando el estándar fue administrado. Y10,5 Y U10,5 fueron formulados según el título estimado de 3 IU/mg. La administración fue realizada por inyección subcutánea de 0,5 ml al cuello del animal. Al grupo de control negativo sólo le fue administrado el solvente, una vez al día, 6 veces en total. Las ratas fueron sacrificadas 24 h después de la última administración en el grupo de control positivo, y los pesos del cuerpo y la anchura de las placas de crecimiento tibial fueron medidas. Los datos fueron procesados según el ensayo de hormona de crecimiento en el apéndice XII P y el método estadístico para el ensayo biológico en el apéndice XIV de Pharmacopoeia of the People's Republic of China, version 2005.
[0076] El título biológico de YPEG-rHuGH (Y10,5) es 5,0 IU·mg-1, el título biológico de UPEG-rHuGH (U10,5) es 5,2 IU·mg-1, ambos más de 1,5 veces el rHuGH normal. Administración única de YPEG-rHuGH (Y10,5) o UPEG-rHuGH (U10,5) tiene una actividad biológica más alta para la promoción del crecimiento del cuerpo en el animal y un efecto farmacéutico más largo que la suma de rHuGH inyectado diario.
Ejemplo 6
La vida media metabólica de medicamento de suero de YPEG-rHuGH (Y10,5) en el macaco cangrejero
[0077] 6 macacos cangrejeros fueron seleccionados, 3 hembras y 3 machos, peso corporal de 3,24-5,48 kg (Guangxi Beihai Yu Qi Experiment Animal technology co. Ltd., certificado n.º: SCXK(Gui)2005-0005). El experimento ha incluido dos grupos de 3 macacos cangrejeros: un grupo con inyección subcutánea de YPEG-rHuGH (Y10,5) a 300µg·kg-1 y el otro
grupo con inyección subcutánea de rHuGH (Saizen, Laboratoires Serono S.A. Suiza) a 300µg·kg-1 , administración única. Después de la administración, la sangre venosa fue tomada regularmente de la extremidad posterior opuesta al lado inyectado, y el suero fue separado. Un kit ELISA para la hormona del crecimiento humana de R&D fue usado para el ensayo de la concentración de medicamento sanguíneo a través de ELISA, y la curva de concentración de medicamento sanguíneo fue representada para calcular la vida media metabólica del medicamento. Los resultados se muestran en la fig. 10.
[0078] Después de la inyección subcutánea de YPEG-rHuGH (Y10,5) a 300 µg·kg-1 en macacos cangrejeros, el tiempo para alcanzar el valor máximo de concentración de medicamento en el suero es 8-24h. El medicamento fue eliminado lentamente. La vida media metabólica de medicamento en promedio en el suero es 41,33h. Después de la inyección subcutánea de rHuGH (Saizen) a 300 µg·kg-1 en macacos cangrejeros, el tiempo para alcanzar el valor máximo de concentración de medicamento en el suero es 1-2h, y a las 24 h la concentración se reduce al nivel anterior a la administración. La eliminación es claramente más rápida que YPEG-rHuGH (Y10,5). La vida media metabólica del medicamento en promedio en el suero es 1,80 h. La vida media metabólica de medicamento promedio en el suero de YPEG-rHuGH (Y10.5) es más de 20 veces la de rHuGH.
Listado de secuencias
[0079]
lt;110gt; Biosteed Gene Expression Tech. Co., Ltd.
lt;120gt; Hormona del crecimiento modificada con polietilenglicol bicatenario, método de preparación y aplicación de esta
lt;130gt; P2007466c
5 lt;160gt; 1
lt;170gt; PatentIn Versión 3.3
lt;210gt; 1 10 lt;211gt; 191
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 1
Claims (37)
- REIVINDICACIONES1. Método de preparación de una hormona de crecimiento humana polietilenglicolada (pegilada) o una preparación de hormona de crecimiento humana polietilenglicolada (pegilada), que comprende:
- (a)
- en una solución con pH no inferior a 6.0, poner el polietilenglicol (PEG) bicatenario ramificado con forma de U o con forma de Y en contacto con la hormona de crecimiento humana;
- (b)
- evaluar el producto modificado por el PEG bicatenario en un único sitio obtenido en el paso a) en SDS-PAGE de concentración apropiada, donde el producto muestra dos bandas;
- (c)
- separar y recuperar el producto de peso molecular aparente inferior en las dos bandas modificado por el PEG bicatenario en un único sitio, donde el polietilenglicol bicatenario ramificado con forma de U presenta la siguiente fórmula (IV),
donde, R y R' son independientemente alquilo de bajo peso molecular; n y n' indican el grado de polimerización y pueden ser cualquier número entero; n+n' está entre 600 y 1500; el peso molecular medio del PEG ramificado con forma de U es aproximadamente desde 26kD hasta 66kD, o donde el polietilenglicol bicatenario ramificado con forma de Y presenta la siguiente fórmula (III):donde, R y R' son independientemente alquilo de bajo peso molecular, m y m' indican el grado de polimerización y pueden ser cualquier número entero, j es un número entero de 1 a 12, y el peso molecular total medio del PEG ramificado con forma de Y es de aproximadamente 26kD a 60kD. -
- 2.
- Método según la reivindicación 1, donde el pH de (a) no es inferior a 7,0.
-
- 3.
- Método según la reivindicación 1, donde el pH de (a) no es inferior a 8,0.
-
- 4.
- Método según la reivindicación 1, donde el pH de (a) no es inferior a 9,0.
-
- 5.
- Método según la reivindicación 1, donde el pH de (a) es 10,5.
-
- 6.
- Método según la reivindicación 1, donde la proporción molar de la hormona del crecimiento respecto al PEG bicatenario es aproximadamente 1: 2.
-
- 7.
- Método según la reivindicación 1, donde el SDS-PAGE en (b) es 12% SDS-PAGE.
-
- 8.
- Método según la reivindicación 1, que comprende además purificar el producto recuperado.
-
- 9.
- Método según la reivindicación 8, donde la purificación del producto se realiza usando cromatografía de gel.
-
- 10.
- Método según la reivindicación 9, donde la cromatografía de gel comprende Cromatografía Q Sepharose FF, cromatografía DEAE Sepharose FF y cromatografía MacroCap SP.
-
- 11.
- Método según la reivindicación 1, este método es para preparar una preparación de hormona de crecimiento humana pegilada, en dicho método en el paso (a) una solución se usa con un pH no inferior a 8,0, y donde el producto recuperado en el paso (c) es una mezcla predominantemente que contiene el producto de peso molecular aparente inferior modificado por el PEG bicatenario en un único sitio, donde el contenido del producto de peso molecular aparente inferior modificado por el PEG bicatenario en un único sitio no es inferior al 70%.
-
- 12.
- Método según la reivindicación 11, donde el pH no es inferior a 9,0.
-
- 13.
- Método según la reivindicación 11, donde el pH es 10,5.
-
- 14.
- Método según la reivindicación 11, donde el contenido del producto de peso molecular aparente inferior modificado por el PEG bicatenario en un único sitio no es inferior al 80 %.
-
- 15.
- Método según la reivindicación 11, donde el contenido del producto de peso molecular aparente inferior modificado por el PEG bicatenario en un único sitio no es inferior al 90 %.
-
- 16.
- Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-15, donde R y R' independientemente son alquilo C1 -C4.
-
- 17.
- Método según la reivindicación 16, donde R y R' independientemente son metilo.
-
- 18.
- Método según la reivindicación 1, donde m+m' está entre 600 y 1500.
-
- 19.
- Método según la reivindicación 18, donde m+m' es 910.
-
- 20.
- Método según la reivindicación 1, donde el peso molecular total medio del polietilenglicol bicatenario ramificado con forma de Y es 40kD.
-
- 21.
- Método según la reivindicación 1 o 20, donde el polietilenglicol bicatenario ramificado con forma de Y es de brazos iguales.
-
- 22.
- Método según la reivindicación 1, donde n+n' es 910.
-
- 23.
- Método según la reivindicación 1, donde el peso molecular medio del polietilenglicol bicatenario ramificado con forma de U es aproximadamente 40 kD.
-
- 24.
- Método según cualquiera de las reivindicaciones 1, 22 o 23, donde el polietilenglicol bicatenario ramificado con forma de U es de brazos iguales.
-
- 25.
- Método según cualquiera de las reivindicaciones 1, 20 o 21, que comprende los pasos siguientes:
(a) en una solución con pH 9,0 o 10,5, poner un PEG bicatenario de la siguiente fórmula (III) en contacto con la hormona de crecimiento humana, donde la proporción molar de la hormona del crecimiento respecto al PEG bicatenario es aproximadamente 1: 2.donde m+m' es 910, el peso molecular total medio del PEG bicatenario es aproximadamente 40kD;- (b)
- evaluar el producto modificado por el PEG bicatenario en un único sitio obtenido en el paso a) en 12% SDS- PAGE, donde el producto es principalmente una banda de peso molecular aparente inferior;
- (c)
- separar y recuperar el producto de peso molecular aparente inferior modificado por el PEG bicatenario en un único sitio utilizando cromatografía de gel seleccionada de Cromatografía Q Sepharose FF, cromatografía DEAE Sepharose FF o cromatografía MacroCap SP.
-
- 26.
- Hormona de crecimiento humana pegilada de peso molecular aparente inferior o preparación de hormona de crecimiento
humana pegilada de peso molecular aparente inferior obtenida por el método de cualquiera de las reivindicaciones 1-25, donde la hormona del crecimiento es extraída de una fuente natural u obtenida por biotecnología recombinante. -
- 27.
- Hormona de crecimiento humana pegilada según la reivindicación 26, donde la hormona de crecimiento humana tiene la secuencia de SEC ID n.º:1.
-
- 28.
- Hormona del crecimiento humana pegilada según la reivindicación 26, que tiene un peso molecular 62kD, como se muestra en la siguiente fórmula (VII):
donde R y R' son independientemente alquilo de bajo peso molecular; m+m' es 910; j es un número entero de 1 a 12. -
- 29.
- Hormona de crecimiento humana pegilada según la reivindicación 28, donde R y R' son alquilo C1 -C4.
-
- 30.
- Hormona de crecimiento humana pegilada según la reivindicación 28, donde R y R' son metilo.
-
- 31.
- Hormona de crecimiento humana pegilada o preparación de hormona de crecimiento humana pegilada de cualquiera de las reivindicaciones 26 a 30, donde la hormona de crecimiento humana recombinante es artificialmente sintetizada o expresada por un sistema de expresión seleccionado del grupo que consiste en: un sistema procariótico tal como E. coli.; un sistema eucariota tal como Pichia; un sistema celular de insecto; y un sistema celular mamífero tal como célula CHO.
-
- 32.
- Composición que comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz de la hormona de crecimiento humana pegilada o la preparación de hormona de crecimiento humana pegilada de cualquiera de las reivindicaciones 26-31, y un portador farmacéuticamente aceptable o excipiente.
-
- 33.
- Composición según la reivindicación 32, que comprende manitol, un aminoácido, cloruro sódico, ácido acético y acetato sódico.
-
- 34.
- Composición según la reivindicación 33, donde el aminoácido es seleccionado del grupo que consiste en aspartato, asparagina, lisina y glicina.
-
- 35.
- Hormona de crecimiento humana pegilada o preparación de hormona de crecimiento humana pegilada de cualquiera de las reivindicaciones 26-31 o composición de cualquiera de las reivindicaciones 32-34 para uso como un medicamento.
-
- 36.
- Hormona de crecimiento humana pegilada o preparación de hormona de crecimiento humana pegilada de cualquiera de las reivindicaciones 26-31 o composición de cualquiera de las reivindicaciones 32-34, para uso en el tratamiento de una enfermedad que necesita tratamiento de hormona del crecimiento o para tratamiento antienvejecimiento.
-
- 37.
- Hormona de crecimiento humana pegilada o preparación de hormona de crecimiento humana pegilada de cualquiera de las reivindicaciones 26-31 o composición de cualquiera de las reivindicaciones 32-34 para uso en el tratamiento de una enfermedad que necesita tratamiento con hormona del crecimiento o para tratamiento antienvejecimiento, donde la enfermedad que necesita tratamiento con hormona del crecimiento se selecciona del grupo que consiste en enanismo, quemaduras, heridas, fracturas de hueso, úlceras de sangrado, insuficiencia renal, SIDA, enanismo por deficiencia de hormona del crecimiento endógena, síndrome Turner, trastorno anabólico y deficiencia de hormona del crecimiento adulta.
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-
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