JP5647758B2 - 新しいカロテノイドケトラーゼ - Google Patents
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Description
(a)配列番号2、4、6に記載のアミノ酸をコードする単離された核酸分子、
(b)0.1×SSC、0.1%SDSで65℃の洗浄条件で(a)とハイブリダイズする単離された核酸分子、または
(a)または(b)と相補的な単離された核酸分子
よりなる群から選択されるカロテノイドケトラーゼ酵素コードする単離された核酸分子を提供する。
(a)環状カロテノイドを生成する宿主細胞を提供し、
(b)(a)の宿主細胞をカロテノイドケトラーゼ酵素をコードする本発明の遺伝子で形質転換し、そして
(c)(b)の形質転換宿主細胞を環状ケトカロテノイドが生成する条件下で生育させる、
ことを含んでなる、環状ケトカロテノイド化合物の生成方法を提供する。
(a)適切な調節配列の制御下にある本発明のカロテノイドケトラーゼ遺伝子を宿主細胞に導入し、
(b)(a)の宿主細胞をカロテノイドケトラーゼ遺伝子が発現し、環状ケトカロテノイドの生合成が制御される条件下で生育させる、
ことを含んでなる、生物において環状ケトカロテノイド生合成を制御する方法を提供する。
(a)環状カロテノイドを生成する宿主細胞を提供し、
(b)(a)の宿主細胞をCrtWカロテノイドケトラーゼ酵素をコードする本発明の第1の遺伝子で形質転換し、
(c)(a)の宿主細胞をCrtWカロテノイドケトラーゼ酵素をコードする第2の遺伝子で形質転換し、そして
(d)前記(a)の第1の遺伝子および前記(b)の第2の遺伝子を含んでなる形質転換宿主細胞を前記第1の遺伝子または前記第2の遺伝子いずれかのみを発現する形質転換宿主細胞に比べて、環状ケトカロテノイドの生成が増大する条件下で生育させる、
ことを含んでなり、
前記第2の遺伝子が前記第1の遺伝子と比べると65%未満の核酸配列同一性を有する、
環状ケトカロテノイド化合物の生成を増大させる方法を提供する。
ii)前記天然カロテノイドケトラーゼ遺伝子とハイブリダイズするヌクレオチド断片の第1の集団、
iii)前記天然カロテノイドケトラーゼ遺伝子とハイブリダイズしないヌクレオチド断片の第2の集団
を含んでなるヌクレオチド配列の混合物を制限エンドヌクレアーゼで消化して、制限酵素断片の混合物が生成され、
(b)前記制限酵素断片の混合物を変性させ、
(c)ステップ(b)の変性した前記制限酵素断片の混合物をポリメラーゼと共にインキュベートし、
(d)ステップ(b)および(c)を反復して、改変された生物学的活性を有するタンパク質をコードする変異カロテノイドケトラーゼ遺伝子が生成される、
ことを含んでなる方法によって生成される、本発明の変異遺伝子もまた提供される。
本願明細書の一部を形成する以下の詳細な説明および添付の配列説明によって、本発明をより完全に理解できるであろう。
1.小型脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基:Ala、Ser、Thr(Pro、Gly)、
2.極性、負に帯電した残基およびそれらのアミド:Asp、Asn、Glu、Gln、
3.極性、正に帯電した残基:His、Arg、Lys、
4.大型脂肪族、非極性残基:Met、Leu、Ile、Val(Cys)、および
5.大型芳香族残基:Phe、Tyr、Trp。
本発明の核酸断片を使用して、同一またはその他の微生物種から相同タンパク質をコードする遺伝子を単離しても良い。配列依存プロトコルを使用した相同遺伝子の単離は、技術分野で良く知られている。配列依存プロトコルの例としては、以下が挙げられるが、これに限定されるものではない。核酸ハイブリダイゼーション法、および様々な核酸増幅技術の使用によって例証されるようなDNAおよびRNA増幅法(例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ミュリス(Mullis)ら、米国特許第4,683,202号明細書;リガーゼ連鎖反応(LCR)、タボール(Tabor)S.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:1074(1985);または鎖置換増幅(SDA)、ウォーカー(Walker)ら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、89:392(1992))。
カロテノイドの生合成に関与する酵素経路は、ピルビン酸およびグリセルアルデヒド−3−リン酸からファルネシルピロリン酸(FPP)への転換を提供する上流イソプレノイド経路、およびフィトエンの合成と、全ての引き続いて生成されるカロテノイドを提供する下流カロテノイド生合成経路の2つの部分に都合良く分けることができる。上流経路は多くの非カロテノイド産生性微生物に遍在性であり、これらの場合、所望のカロテノイド生合成のための下流経路を含んでなる遺伝子を導入することだけが必要である。2つの経路間の主要な区分は、ファルネシルピロリン酸塩の合成に関わる。FPPが天然に存在する場合、下流カロテノイド経路の要素のみが必要である。しかしカロテノイド生成において下流経路カロテノイド遺伝子が効果的であるためには、宿主細胞が細胞内に適切なレベルのFPPを有することが必要なことが理解される。別の実施態様では、イソプレノイド生合成遺伝子を任意にアップレギュレートされて、利用できるカロテノイド生合成のFPPのレベルが増大されてもよい。FPP合成が宿主細胞によって提供されない場合、FPPの生成に必要な遺伝子を導入することが必要である。これらの各経路について下で詳細に述べる。
イソプレノイド生合成は、一般的なC5イソプレンサブユニットであるイソペンテニルピロリン酸塩(IPP)を生じる2つの経路のどちらかを通じて起きる。最初に良く知られている酢酸/メバロン酸経路を通じてIPPを合成しても良い。しかし最近の研究は、メバロン酸依存経路が全ての生物で作動しているわけではないことを実証している。IPP生合成のための代案のメバロン酸非依存経路が、細菌および緑藻類および高等植物で特性決定されている(ホルバック(Horbach)ら、FEMS Microbiol.Lett.111:135〜140(1993);ローマー(Rohmer)ら、Biochem.295:517〜524(1993);シュベンダー(Schwender)ら、Biochem.316:73〜80(1996);およびアイゼンライヒ(Eisenreich)ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:6431〜6436(1996))。
上流イソプレノイド経路と下流カロテノイド経路の間の区分は、いくぶん主観的である。FPP合成はカロテン産生性および非カロテン産生性細菌の双方において一般的であるので、下流カロテノイド生合成経路中の第1のステップは、ファルネシルピロリン酸(FPP)をゲラニルゲラニルピロリン酸(GGPP)に転換する、プレニル転移酵素反応によって開始すると考えられる。GGPP合成酵素をコードする遺伝子crtEは、IPPをFPPに付加して炭素数20の分子であるGGPPを生成するこのプレニル転移酵素反応に関与する。2つのGGPP分子の縮合反応が起きて、下流カロテノイド生合成経路における第1の炭素数40の分子であるフィトエン(PPPP)が形成する。この酵素的反応は、フィトエンシンターゼをコードするcrtBによって触媒される。
本配列の遺伝子および遺伝子産物は、異種の宿主細胞中、特に微生物宿主の細胞中で生成されてもよい。組換え微生物宿主中での発現は、様々な経路中間体の発現のため、宿主中に既存の経路の調節のため、またはこれまで宿主を使用して可能でなかった新しい生成物の合成のために有用かもしれない。
組換え微生物源からいくつかのカロテノイドが生成されている[例えばリコペン生成のための大腸菌およびカンジダ・ユチリス(Candida utilis)(ファーマー(Farmer)W.R.およびJ.C.リヤオ(Liao)、Biotechnol.Prog.17:57〜61(2001);ワング(Wang)C.ら、Biotechnol Prog.16:922〜926(2000);ミサワ(Misawa)N.およびH.シマダ(Shimada)、J.Biotechnol.59:169〜181(1998);シマダ(Shimada)H.ら、Appl.Environm.Microbiol.64:2676〜2680(1998));β−カロテン生成のための大腸菌、カンジダ・ユチリス(Candida utilis)、およびパフィア・ロドジマ(Pfaffia rhodozyma)(アルブレヒト(Albrecht)M.ら、Biotechnol.Lett.21:791〜795(1999);ミウラ(Miura)Y.ら、Appl.Environm.Microbiol.64:1226〜1229(1998);米国特許第5,691,190号明細書);ゼアキサンチン生成のための大腸菌およびカンジダ・ユチリス(Candida utilis)(アルブレヒト(Albrecht)M.ら、前出;ミウラ(Miura)Y.ら、前出);アスタキサンチン生成のための大腸菌およびパフィア・ロドジマ(Pfaffia rhodozyma)(米国特許第5,466,599号明細書、米国特許第6,015,684号明細書、米国特許第5,182,208号明細書、米国特許第5,972,642号明細書;米国特許第5,656,472号明細書、米国特許第5,545,816号明細書、米国特許第5,530,189号明細書、米国特許第5,530,188号明細書、米国特許第5,429,939、および米国特許第6,124,113号明細書もまた参照されたい)]が、異なるcrt遺伝子の様々な組み合わせを使用したこれらのカロテノイド生成法には、低い収率と比較的高価な供給材料への依存という欠点がある。したがって微生物宿主中で安価な供給材料から、高収率のカロテノイドを製造する方法を同定することが望ましい。
・通性メチロトローフは、炭素−炭素結合を含有しない有機化合物を酸化する能力を有するが、エネルギーおよびバイオマスのために、糖および複合炭水化物などのその他の炭素基質を使用しても良い。通性メチロトローフ細菌は多くの環境中に見られるが、最も一般には土壌、ごみ埋め立て、および廃棄物処理場から単離される。多くの通性メチロトローフは、プロテオバクテリア(Proteobacteria)のβおよびγ亜群のメンバーである(ハンソン(Hanson)ら、Microb.Growth C1 Compounds[国際シンポジウム]第7回(1993)、p285〜302、マレルJ.コリン(Murrell J.Collin)およびドンP.ケリー(DonP.Kelly)編、Intercept:Andover、UK;マディガン(Madigan)ら、ブロックの微生物生物学(Brock Biology of Microorganisms)、第8版、Prentice Hall:Upper Saddle River、NJ(1997))。
・絶対メチロトローフは、エネルギー生成が、炭素−炭素結合を含有しない有機化合物の使用に限定された生物である。
・絶対メタノトローフは、メタンを酸化する特徴的能力を有する絶対メチロトローフである。
C1代謝性細菌形質の転換技術は十分開発されていないが、当業者に良く知られているその他の細菌のために用いられる一般方法を応用しても良い。メチロバクテリウム・エキストロクエン(Methylobacterium extorquens)AM1(トヤマ(Toyama)H.ら、FEMS Microbiol.Lett.166:1〜7(1998))、メチロフィラス・メチロトロファス(Methylophilus methylotrophus)AS1(キム(Kim)C.S.およびT.K.ウッド(Wood)、Appl.Microbiol.Biotechnol.48:105〜108(1997))、およびメチロバシラス(Methylobacillus)種株12S(ヨシダ(Yoshida)T.ら、Biotechnol.Lett.、23:787〜791(2001))の形質転換のために、電気穿孔が成功裏に使用されている。しかし当業者には良く知られているように、1つの特定のC1代謝性利用生物から別の生物への具体的電気穿孔パラメーターの推定は、困難かもしれない。
1.場合によっては、供与体と受容体のみが接合にとって必要とされる。これは転位されるプラスミドが接合性かつ可動性である自己伝播性のプラスミドの場合(すなわちtra−遺伝子と、Mobタンパク質をコードする遺伝子の双方を保有する)に起きる。一般にプロセスは、1.)oriT中の特定部位で二本鎖プラスミドDNAにニックが入れられ、2.)細孔構造または繊毛構造を通じて、一本鎖DNAが受容体に放出され、3.)DNAリラクセース酵素が二本鎖DNAをoriTで開裂して結合し、5’末端を放出し(中間体構造としてリラクソゾームを形成する)、そして4.)引き続いて、補助タンパク質の複合体がoriTでアセンブルして、DNA転位プロセスを容易にする、ことを伴う。
2.代案としては、供与体プラスミドの受容体への転位のために「三親交雑」接合が必要とされる。このタイプの接合には、供与細胞、受容細胞、および「ヘルパー」プラスミドが関与する。供与細胞は、可動性プラスミドまたは接合トランスポゾンを保有する。可動性ベクターは、ニッケースをコードする遺伝子であるoriTを含有し、Mobタンパク質をコードする遺伝子を有する。しかしMobタンパク質は、単独ではゲノムの転位達成するのに十分でない。したがって可動性プラスミドは、ヘルパープラスミド(供与体内または「ヘルパー」細胞内に位置する)によって適切な接合システムが提供されない限り、それら自身の転位を促進できない。プラスミドは、細孔または繊毛の形成に関与する転位タンパク質(Tra)をコードするので、接合プラスミドは噛合対の形成およびDNA転位のために必要とされる。
本crtW遺伝子を使用した環状ケトカロテノイド化合物の商業的生産が所望される場合、多様な培養方法を応用してもよい。例えば、組換え微生物宿主から過剰発現する特定の遺伝子産物の大規模生産は、バッチおよび連続の培養方法の双方で生産してもよい。
植物および藻類もまた、カロテノイド化合物を製造することが知られている。本発明の核酸断片を使用して、微生物タンパク質を発現する能力を有する遺伝子導入植物を作り出しても良い。好ましい植物宿主は、本タンパク質の高生成レベルを支えるいずれかの品種であることができる。適切な緑色植物としては、ダイズ、アブラナ(Brassica napus、B.campestris)、コショウ、ヒマワリ(Helianthus annus)、綿(Gossypium hirsutum)、トウモロコシ、タバコ(Nicotiana tabacum)、アルファルファ(Medicago sativa)、コムギ(Triticum種)、オオムギ(Hordeum vulgare)、カラスムギ(Avena sativa、L)、モロコシ(Sorghum bicolor)、イネ(Oryza sativa)、シロイヌナズナ(Arabidopsis)、アブラナ科野菜(ブロッコリー、カリフラワー、キャベツ、アメリカボウフウなど)、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、落花生、ブドウ、草種子、甜菜、サトウキビ、豆、エンドウ豆、ライムギ、亜麻、堅木、軟木、および飼料としての草が挙げられるが、これに限定されるものではない。商業的に重要な宿主としては、スピルリナ(Spirulina)、ヘマトコッカス(Haematococcus)、およびデュナリエラ(Dunaliella)などの藻類の種が挙げられるが、これに限定されるものではない。カロテノイド化合物の生成は、最初に本発明のキメラ遺伝子を構築することによって達成されても良く、その中でコード領域は、所望の発生段階で所望の組織中の遺伝子の発現を導くプロモーターに作動可能に連結される。便宜上、キメラ遺伝子は、同一遺伝子に由来するプロモーター配列および翻訳リーダー配列を含んでなっても良い。転写終止シグナルをコードする3’非コード配列もまた、提供されなくてはならない。本キメラ遺伝子はまた、遺伝子発現を容易にするために1個もしくはそれ以上のイントロンも含んでなる。
本ヌクレオチドを使用して、向上されたまたは改変された活性を有する遺伝子産物を製造できるかもしれないことが考察された。誤りがちなPCR(メルニコフ(Melnikov)ら、Nucleic Acids Research、27(4):1056〜1062(1999))、部位特異的変異誘発(クームズ(Coombs)ら、Proteins(1998)、259〜311、1図版。編集者(ら):(アンジェレッティ,ルース・ホーグ(Angeletti,Ruth Hogue)、出版社:Academic:SanDiego、CA)、および「遺伝子シャフリング(gene shuffling)」(参照によってここに援用する米国特許第5,605,793号明細書、米国特許第5,811,238号明細書、米国特許第5,830,721号明細書、米国特許第5,837,458号明細書、および米国特許出願第10/374366号明細書)をはじめとするが、これに限定されるものではない、天然遺伝子配列を変異させて活性が改変または向上された遺伝子産物を生成する様々な方法が知られている。
着色微生物は、環境サンプルから単離され、標準微生物学的技術使用して培養された(実施例1)。2つの着色コロニー(DC18およびDC263)を選択し、16S rRNA遺伝子配列決定を実施した。DC18株(配列番号4)からの16S rRNA遺伝子配列をジェンバンク(GenBank)(登録商標)に対するBLASTNを使用したクエリー検索として使用した。公開データベースに対する最も近い整合は、スフィンゴモナス・メロニス(Sphingomonas melonis)に対して98%同一であった。本株をスフィンゴモナス・メロニス(Sphingomonas melonis)DC18と命名した。DC263株(配列番号5)からの16S rRNA遺伝子配列は、ブレバンジモナス・ベシキュラリス(Brevundimonas vesicularis)に対して相同性(99%同一)を示した。単離された株をブレバンジモナス・ベシキュラリス(Brevundimonas vesicularis)DC263と命名した。第3の着色微生物株(フラボバクテリウム(Flavobacterium)種K1−202C)は、ドイツ国のJ.W.ゲーテ大学(J.W.Goethe University,Germany)のゲルハルト・サンドマン(Gerhard Sandmann)博士から得られた。この株は、サイトファーガ(Cytophaga)種KK1020Cとしても知られており、日本国の海洋バイオテクノロジー研究所(MBI)から入手できる。
実施例で使用される標準組換えDNAおよび分子クローン化技術は技術分野で良く知られており、サムブルック(Sambrook)J.、フリッチュ(Fritsch)E.F.、およびマニアティス(Maniatis)T.「分子クローン化:実験室マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)」;Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor(1989)(マニアティス(Maniatis))、およびT.J.シルハビー(Silhavy)、M.L.ベンナン(Bennan)およびL.W.エンクイスト(Enquist)「遺伝子融合実験(Experiments with Gene Fusions)」Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor,NY(1984);およびオースベル(Ausubel)F.M.ら「分子生物学現代プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」Greene Publishing Assoc.and Wiley−Interscienceによる出版(1987)で述べられている。
細菌株生成するケトカロテノイド
この実施例は、ケトカロテノイドを生成する3つの細菌株の単離、およびそれらのカロテノイドの予備分析について述べる。
新しいカロテノイド生成細菌株を単離するために、環境サンプルのコレクションからから着色微生物を単離した。デラウェア州ウィルミントン(Wilmington,Delaware)の庭からのおよそ1gの表面土壌を10mLの水道水に再懸濁した。10μLのループを満たす水をルリアブロス(LB)プレート上に画線し、プレートを30℃でインキュベートした。多様なコロニーの外見がある着色細菌を拾い出し、均一に2回LBプレートに画線して、30℃でインキュベートした。これらのコロニーから、オレンジ〜ピンクのコロニーを形成したものをDC263株と命名した。DC18株は、ペンシルベニア州の河川から単離した。水性サンプルの連続希釈(10−2、10−4、および10−6)をトリプトンおよび酵母で栄養強化した基礎培地の大型245×245mm 15%寒天プレート上に播種した。基礎培地構成要素(1リットルあたり)は次のようであった。NH4Cl 0.8g、KH2PO4 0.5g、MgCl2・6H20 0.2g、CaCl2・2H20 0.1g、NaNO3 1.3g、およびNa2SO4 0.5g。原液1の構成要素(1リットルあたり)は次のようであった。ニトリロ三酢酸12.8g、FeCl2・4H2O 0.3g、CuCl2・2H2O 0.0254g、MnCl2・4H2O 0.1g、CoCl2・6H2O 0.312g、ZnCl2 0.1g、H3BO3 0.01g、Na2MoO4・2H2O 0.01g、およびNiCl2・6H2O 0.184g。1リットルの基礎培地あたり10ミリリットルの原液1を添加した。培地を濃度10g/Lのトリプトンおよび5g/Lの酵母抽出物で強化した。培地のpHを7に調節した。プレートを室温でインキュベートし、単一コロニーを同一プレートに2回画線した。オレンジコロニーを形成した1つの株を選択して、DC18株と命名した。
スフィンゴモナス・メロニス(Sphingomonas melonis)DC18を株単離について述べたのと同一の100mLの培地中で生育させた。ブレバンジモナス・ベシキュラリス(Brevundimonas vesicularis)DC263を100mLのLB中で生育させた。フラボバクテリウム(Flavobacterium)種K1−202Cをミシガン州デトロイトのディフコ(Difco(Detroit,MI))からの100mLのマリンブロス中で生育させた。3株は全て振盪して30℃で一晩生育させた。4000gで15minの遠心分離によって細胞をペレットにし、細胞ペレットを10mLのアセトンで抽出した。抽出物を窒素下で乾燥させ、1〜2mLのアセトンに再溶解した。抽出物をミシガン州アナーバーのパル・コーポレーション(Pall Corporation(Ann Arbor,MI))からのアクロディスク(Acrodisc)aCR25mmシリンジフィルターで濾過した。次にそれをカリフォルニア州フォスター・シティのアジレント(Agilent(Foster City,CA))からのアジレント・シリーズ(Agilent Series)1100LC/MSDSIを使用して、HPLC分析用0.1mL 10%アセトン+90%アセトニトリル中で濃縮した。
・0〜2min:95%緩衝液Aおよび5%緩衝液B、
・2〜10min:95%緩衝液Aおよび5%緩衝液Bから60%緩衝液Aおよび40%緩衝液Bへの直線濃度勾配、
・10〜12min:60%緩衝液Aおよび40%緩衝液Bから50%緩衝液Aおよび50%緩衝液Bへの直線濃度勾配、
・12〜18min:50%緩衝液Aおよび50%緩衝液B、および
・18〜20min:95%緩衝液Aおよび5%緩衝液B。
・0〜30min:70%アセトニトリルおよび30%水から100%アセトニトリルへの直線濃度勾配、
・30〜45min:100%アセトニトリル。
小型挿入物ライブラリーの構築およびスクリーニング
この実施例は、細菌株からの小型挿入物ライブラリーの構築、および潜在的にケトラーゼ遺伝子を含有する陽性クローンの同定について述べる。
実施例1で述べるようにしてDC18、DC263、およびK1−202Cの細胞を生育させた。キアゲン(Qiagen)ゲノムDNA調製キットを使用して、細胞からゲノムDNAを調製した。部分的制限酵素消化法によって、K1−202C株の小型挿入物ライブラリーを調製した。K1−202CのゲノムDNAをウィスコンシン州マディソンのプロメガ(Promega(Madison,WI))からのHincIIで部分的に消化し、0.8%アガロース・ゲル上で分離した。4〜6kbの画分をゲルから切り取って、キアゲンミンエリュート(Qiagen MinElute)ゲル抽出キットを使用して抽出した。抽出したDNAをウィスコンシン州ミドルタウンのルシジェン(Lucigen(Middletown,WI))からのpEZSeqブラント(Blunt)クローニングキットを使用して、pEZseqベクターにライゲートした。ライゲーション混合物をβ−カロテン生成プラスミドpBHR−crt1(米国特許出願第09/941947号明細書)を含有する、新鮮に調製した大腸菌10Gのコンピテント細胞中に電気穿孔した。形質転換体を100μg/mLアンピシリンおよび50μg/mLカナマイシンと共にLBプレートに播種した。
各ライブラリーからおよそ20,000〜100,000個の形質転換体が得られた。各ライブラリーについて、数万の黄色コロニーからいくつかのオレンジコロニーが同定された。これらの陽性クローンをβ−カロテンをケトカロテノイドに転換するケトラーゼ遺伝子をおそらく含有するものとして同定した。各陽性株を抗生物質と共に100mLのLB中で振盪して30℃で3日間生育させた。実施例1で述べるようにして、細胞からのカロテノイドを抽出し、HPLCで分析した。DC18、DC263、およびK1−202Cのライブラリーから単離された陽性大腸菌クローン中で、ケトカロテノイド(カンタキサンチンおよびエキネノン)が生成された。
新しいカロテノイドケトラーゼ遺伝子の単離
この実施例は、陽性大腸菌クローン上の挿入物の配列決定、および挿入物上にコードされる新しいカロテノイドケトラーゼ遺伝子の同定について述べる。
β−カロテン合成プラスミドpDCQ330の構築
P.アグロメランス(agglomerans)DC404は、カロテノイド合成遺伝子クラスターcrtEidiYIBZ(配列番号12)(米国特許出願第10/808807号明細書参照)を含有する環境単離物であった。
大腸菌中における新しいCrtWカロテノイドケトラーゼ遺伝子の発現
この実施例は、β−カロテンを生成する大腸菌株における、新しいカロテノイドケトラーゼ遺伝子の発現について述べる。ケトラーゼ遺伝子の機能は、β−カロテンのカンタキサンチンへの転換によって実証された。
大腸菌中における多岐にわたるケトラーゼ遺伝子の同時発現
この実施例は、アスタキサンチンおよび中間体を生成する大腸菌株中における多岐にわたるケトラーゼ遺伝子の同時発現について述べる。追加的ケトラーゼ遺伝子の発現は、アスタキサンチン生成を増大させた。
β−カロテン合成プラスミドpDCQ340の構築
この実施例の目的は、ここでpDCQ340と称されるβ−カロテン発現プラスミドを調製することである。腸内細菌科(Enterobactericeae)DC260(米国特許出願第10/808979号明細書、参照によってここに援用する)は、天然遺伝子クラスターcrtEXYIBZを含有する。β−カロテン合成に必要な遺伝子(すなわちcrtEYIB)は、PCRによって結合される。crtE遺伝子は、プライマーcrt−260_F:5−GAATTCACTAGTACCAACCATGGATAGCCATTATG−3’(配列番号28)およびcrt−260SOE_R:5’−ATCAGGTCGCCTCCGCCAGCACGACTTTCAGTTGAATATCGCTAGCTGTTG−3’(配列番号29)を使用して増幅された。crtY遺伝子は、プライマーcrt−260SOE_F:5’−CAACAGCTAGCGATATTCAACTGAAAGTCGTGCTGGCGGAGGCGACCTGAT−3’(配列番号30)およびcrt−260R1_R:5’−CATTTTTTCTTCCCTGGTTCGACAGAGTTCAACAGCGCGCGCAGCGCTT−3’(配列番号31)を使用して増幅された。crtIB遺伝子は、プライマーcrt−260R1_F:5’−AAGCGCTGCGCGCGCTGTTGAACTCTGTCGAACCAGGGAAGAAAAAATG−3’(配列番号32)およびcrt−260_R:5’−GAATTCAACGAGGACGCTGCCACAGA−3’(配列番号33)を使用して増幅された。crtY遺伝子の3’末端に広がるプライマーに導入されたサイレント変化によって、crtY遺伝子の3’末端のEcoRI部位を除去した。crtEY遺伝子を最初にプライマーcrt−260_F(配列番号28)およびcrt−260R1_R(配列番号31)を使用して、SOEing PCRによって結合した。次にcrt−260_F(配列番号28)プライマーおよびcrt−260_R(配列番号32)プライマーを使用して、crtIB遺伝子とのPCRによってcrtEY遺伝子を結合した。最終的な4.5kBのcrtEYIB断片をpTrcHis2−TOPOベクター中にクローンして、次にpBHR1中にサブクローンしてpDCQ340を得た。pDCQ340を含有する大腸菌細胞は、β−カロテンを生成することが示された。
メチロモナス(Methylomonas)中における新しいカロテノイドケトラーゼ遺伝子の発現
この実施例は、以前報告された方法(米国特許出願第09/941947号明細書)および(米国特許出願第60/527083号明細書)に基づいて、当業者が、メチロモナス(Methylomonas)種16a(ATCCPTA−2402)中において、カンタキサンチンなどのケトカロテノイドの生成のための新しいカロテノイドケトラーゼ遺伝子をどのようにして発現できるかについて述べる。
ここで「合成培地」または「BTZ−3」培地とも称される硝酸塩液体培地は、下で示されるように(表5および6)溶液1と混合された様々な塩を含んでなり、明記される場合は、硝酸塩は15mM塩化アンモニウムで置き換えられた。溶液1は、微量元素の100倍濃縮原液のための組成を提供する。
Claims (25)
- (a)配列番号4に記載のアミノ酸をコードする単離された核酸分子、
(b)0.1×SSC、0.1%SDSで65℃の洗浄を含むストリンジェントな条件下で(a)とハイブリダイズする単離された核酸分子であって、カロテノイドケトラーゼ酵素をコードする核酸分子、または
(a)または(b)と相補的な単離された核酸分子
よりなる群から選択される、カロテノイドケトラーゼ酵素をコードする単離された核酸分子。 - 配列番号3で示される配列を有する請求項1に記載の単離された核酸分子。
- 請求項1に記載の単離された核酸分子によってコードされる、ポリペプチド。
- 配列番号4に記載の配列を有するポリペプチドと比較すると、スミス−ウォーターマンのアライメント法に基づいて少なくとも90%の同一性を有する、少なくともアミノ酸260個のカロテノイドケトラーゼ酵素をコードする第1のヌクレオチド配列を含んでなるか、または該第一のヌクレオチド配列の相補体を含む第2のヌクレオチド配列を含んでなる、単離された核酸分子。
- 適切な調節配列に作動的に結合した、請求項1または2に記載の単離された核酸分子を含んでなるキメラ遺伝子。
- 請求項5に記載のキメラ遺伝子を含んでなる形質転換宿主細胞。
- 宿主細胞が、細菌、酵母、糸状菌類、藻類、および緑色植物よりなる群から選択される、請求項6に記載の形質転換宿主細胞。
- 宿主細胞が、アスペルギルス(Aspergillus)、トリコデルマ(Trichoderma)、サッカロミセス(Saccharomyces)、ピチア(Pichia)、カンジダ(Candida)、ハンゼヌラ(Hansenula)、またはサルモネラ(Salmonella)、バシラス(Bacillus)、アシネトバクター(Acinetobacter)、ザイモモナス(Zymomonas)、アグロバクテリウム(Agrobacterium)、エリスロバクター(Erythrobacter)、クロロビウム(Chlorobium)、クロマチウム(Chromatium)、フラボバクテリウム(Flavobacterium)、サイトファーガ(Cytophaga)、ロドバクター(Rhodobacter)、ロドコッカス(Rhodococcus)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)、コリネバクテリア(Corynebacteria)、マイコバクテリウム(Mycobacterium)、デイノコッカス(Deinococcus)、エシェリヒア(Escherichia)、エルウィニア(Erwinia)、パントエア(Pantoea)、シュードモナス(Pseudomonas)、スフィンゴモナス(Sphingomonas)、メチロモナス(Methylomonas)、メチロバクター(Methylobacter)、メチロコッカス(Methylococcus)、メチロジーナス(Methylosinus)、メチロミクロビウム(Methylomicrobium)、メチロシスティス(Methylocystis)、アルカリゲネス(Alcaligenes)、シネコシスティス(Synechocystis)、シネココッカス(Synechococcus)、アナベナ(Anabaena)、チオバシラス(Thiobacillus)、メタノバクテリウム(Methanobacterium)、クレブシエラ(Klebsiella)、およびミクソコッカス(Myxococcus)よりなる群から選択される、請求項7に記載の形質転換宿主細胞。
- 宿主細胞がC1代謝性細菌である、請求項7の形質転換宿主細胞。
- 宿主細胞が、ダイズ、アブラナ、ヒマワリ、綿、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、モロコシ、イネ、アラビドプシス(Arabidopsis)、アブラナ科野菜、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、落花生、ブドウ、草種子、甜菜、サトウキビ、豆、エンドウ豆、ライムギ、亜麻、堅木、軟木、および牧草よりなる群から選択される、請求項7の形質転換宿主細胞。
- (a)ゲノムライブラリーを請求項1または2に記載の核酸分子でプローブし、
(b)0.1×SSC、0.1%SDSで65℃の洗浄を含むストリンジェントな条件下で、請求項1または2に記載の核酸分子とハイブリダイズするDNAクローンであって、カロテノイドケトラーゼ酵素をコードするDNAクローンを同定し、そして
(c)ステップ(b)で同定されたクローンを含んでなるゲノム断片を配列決定する、ことを含んでなり、
配列決定されたゲノム断片がカロテノイドケトラーゼ酵素をコードする、
カロテノイドケトラーゼ酵素をコードする核酸分子を得る方法。 - ステップ(a)の核酸分子が、配列番号4で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項11に記載の方法。
- (a)環状カロテノイドを生成する宿主細胞を提供し、
(b)(a)の宿主細胞をカロテノイドケトラーゼ酵素をコードする請求項1または2に記載の遺伝子で形質転換し、そして
(c)(b)の形質転換宿主細胞を環状ケトカロテノイドが生成する条件下で生育させる、ことを含んでなる環状ケトカロテノイド化合物の生成方法。 - カロテノイドケトラーゼ遺伝子が、配列番号4で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項13に記載の方法。
- 環状ケトカロテノイド化合物が、カンタキサンチン、アスタキサンチン、アドニキサンチン、アドニルビン、エキネノン、3−ヒドロキシエキネノン、3'−ヒドロキシエキネノン、4−ケト−γ−カロテン、4−ケト−ルビキサンチン、4−ケト−トルレン、3−ヒドロキシ−4−ケト−トルレン、デオキシフレキシキサンチン、ミキソバクトンよりなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
- 環状カロテノイドが、β−カロテン、γ−カロテン、ゼアキサンチン、β−クリプトザンチン、アドニキサンチン、3−ヒドロキシエキネノン、3'−ヒドロキシエキネノン、ルビキサンチン、エキネノンおよびトルレンよりなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
- 形質転換された宿主が、細菌、酵母、糸状菌類、藻類、および緑色植物よりなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
- 形質転換宿主細胞が、アスペルギルス(Aspergillus)、トリコデルマ(Trichoderma)、サッカロミセス(Saccharomyces)、ピチア(Pichia)、カンジダ(Candida)、ハンゼヌラ(Hansenula)、またはサルモネラ(Salmonella)、バシラス(Bacillus)、アシネトバクター(Acinetobacter)、ザイモモナス(Zymomonas)、アグロバクテリウム(Agrobacterium)、エリスロバクター(Erythrobacter)、クロロビウム(Chlorobium)、クロマチウム(Chromatium)、フラボバクテリウム(Flavobacterium)、サイトファーガ(Cytophaga)、ロドバクター(Rhodobacter)、ロドコッカス(Rhodococcus)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)、コリネバクテリア(Corynebacteria)、マイコバクテリウム(Mycobacterium)、デイノコッカス(Deinococcus)、エシェリヒア(Escherichia)、エルウィニア(Erwinia)、パントエア(Pantoea)、シュードモナス(Pseudomonas)、スフィンゴモナス(Sphingomonas)、メチロモナス(Methylomonas)、メチロバクター(Methylobacter)、メチロコッカス(Methylococcus)、メチロジーナス(Methylosinus)、メチロミクロビウム(Methylomicrobium)、メチロシスティス(Methylocystis)、アルカリゲネス(Alcaligenes)、シネコシスティス(Synechocystis)、シネココッカス(Synechococcus)、アナベナ(Anabaena)、チオバシラス(Thiobacillus)、メタノバクテリウム(Methanobacterium)、クレブシエラ(Klebsiella)、およびミクソコッカス(Myxococcus)よりなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
- 形質転換宿主細胞がC1代謝性細菌である、請求項17に記載の方法。
- 形質転換宿主細胞が、ダイズ、アブラナ、ヒマワリ、綿、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、モロコシ、イネ、アラビドプシス(Arabidopsis)、アブラナ科野菜、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、落花生、ブドウ、草種子、甜菜、サトウキビ、豆、エンドウ豆、ライムギ、亜麻、堅木、軟木、および牧草よりなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
- (a)環状カロテノイドを生成する宿主細胞を提供し、
(b)(a)の宿主細胞をCrtWカロテノイドケトラーゼ酵素をコードする請求項1または2に記載の遺伝子から選択される第1の遺伝子で形質転換し、
(c)(a)の宿主細胞を前記第1の遺伝子と比較すると65%未満の核酸配列同一性を有し、CrtWカロテノイドケトラーゼ酵素をコードする第2の遺伝子で形質転換し、そして
(d)前記(a)の第1の遺伝子および前記(b)の第2の遺伝子を含んでなる形質転換宿主細胞を前記第1の遺伝子または前記第2の遺伝子のみを発現する形質転換宿主細胞に比べて環状ケトカロテノイドの生成が増大する条件下で生育させる、
ことを含んでなる環状ケトカロテノイド化合物の生成を増大させる方法。 - 宿主細胞が細菌、酵母、糸状菌類、藻類、および緑色植物よりなる群から選択される請求項21に記載の方法。
- 形質転換宿主細胞が、アスペルギルス(Aspergillus)、トリコデルマ(Trichoderma)、サッカロミセス(Saccharomyces)、ピチア(Pichia)、カンジダ(Candida)、ハンゼヌラ(Hansenula)、またはサルモネラ(Salmonella)、バシラス(Bacillus)、アシネトバクター(Acinetobacter)、ザイモモナス(Zymomonas)、アグロバクテリウム(Agrobacterium)、エリスロバクター(Erythrobacter)、クロロビウム(Chlorobium)、クロマチウム(Chromatium)、フラボバクテリウム(Flavobacterium)、サイトファーガ(Cytophaga)、ロドバクター(Rhodobacter)、ロドコッカス(Rhodococcus)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)、コリネバクテリア(Corynebacteria)、マイコバクテリウム(Mycobacterium)、デイノコッカス(Deinococcus)、エシェリヒア(Escherichia)、エルウィニア(Erwinia)、パントエア(Pantoea)、シュードモナス(Pseudomonas)、スフィンゴモナス(Sphingomonas)、メチロモナス(Methylomonas)、メチロバクター(Methylobacter)、メチロコッカス(Methylococcus)、メチロジーナス(Methylosinus)、メチロミクロビウム(Methylomicrobium)、メチロシスティス(Methylocystis)、アルカリゲネス(Alcaligenes)、シネコシスティス(Synechocystis)、シネココッカス(Synechococcus)、アナベナ(Anabaena)、チオバシラス(Thiobacillus)、メタノバクテリウム(Methanobacterium)、クレブシエラ(Klebsiella)、およびミクソコッカス(Myxococcus)よりなる群から選択される、請求項22に記載の方法。
- 形質転換宿主細胞が、スピルリナ(Spirulina)、ヘマトコッカス(Haematococcus)、およびデュナリエラ(Dunaliella)よりなる群から選択される、請求項22に記載の方法。
- 形質転換宿主細胞が、ダイズ、アブラナ、ヒマワリ、綿、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、モロコシ、イネ、アラビドプシス(Arabidopsis)、アブラナ科野菜、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、落花生、ブドウ、草種子、甜菜、サトウキビ、豆、エンドウ豆、ライムギ、亜麻、堅木、軟木、および牧草よりなる群から選択される請求項22に記載の方法。
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