ES2434328T3 - Polipéptido con actividad de fitasa y estabilidad térmica incrementada de la actividad enzimática, así como secuencia de nucleótidos que codifica a este polipéptido - Google Patents

Abstract

Molécula de ADN recombinante que, después de su expresión en una célula hospedadora procariótica oeucariótica, codifica un polipéptido con actividad de fitasa, conteniendo la molécula de ADN recombinante unasecuencia de ADN, seleccionada entre a) secuencias de ADN que codifican un polipéptido con una actividad de fitasa, que se habíaobtenido mediante variación de la secuencia de la fitasa madura de E. coli de tipo salvaje,comprendiendo la variación la mutación lisina → ácido aspártico en la posición 74 (K74D), b) secuencias de ADN que, debido a la degeneración del código genético, están emparentadas conlas secuencias de acuerdo con a), en donde la molécula de ADN recombinante, en el caso de su expresión en una adecuada célula hospedadora, vaacompañada de unas estabilidades térmica y frente a proteasas incrementadas de la actividad enzimática de laproteína así codificada.

Description

Polipéptido con actividad de fitasa y estabilidad térmica incrementada de la actividad enzimática, así como secuencia de nucleótidos que codifica a este polipéptido

La invención se refiere a una molécula de ADN recombinante que codifica un polipéptido con actividad de fitasa y estabilidad térmica incrementada y estabilidad proteolítica incrementada de la actividad enzimática, así como al polipéptido codificado como tal. En particular, la invención se refiere a una molécula de ADN recombinante que codifica un polipéptido con actividad de fitasa y estabilidad térmica incrementada y estabilidad proteolítica incrementada de la actividad enzimática, habiendo sido obtenida la secuencia de ADN mediante una variación de la fitasa de E. coli de tipo salvaje madura, en donde posiciones de aminoácidos definidas están modificadas en comparación con la secuencia de tipo salvaje o bien están presentes extensiones N-y/o C-terminales. La invención se refiere, además, a un procedimiento para la expresión de la fitasa recombinante, así como a su uso en la tecnología alimentaria y de alimentos para animales.

Ácido fítico o mioinositol-1,2,3,4,5,6-hexaquisdihidrogenofosfato (abreviado mioinositol-hexaquisfosfato) es la fuente principal de inositol y la forma de almacenamiento primaria de fosfato en semillas de vegetales. En las semillas de leguminosas, aproximadamente el 70% del contenido en fosfato se presenta en forma de una sal de potasio, magnesio y calcio mixta del ácido fítico. Semillas, granos de cereales y leguminosas son componentes importantes de preparados alimentarios y de alimentos para animales, en particular de preparados de piensos para animales; pero también en la alimentación humana los cereales y las leguminosas adquieren importancia de forma creciente.

Las unidades fosfato del ácido fítico ligan en forma de complejo cationes divalentes y trivalentes tales como iones de metales, es decir, iones importantes para la fisiología nutricional tales como calcio, hierro, zinc y magnesio, así como los oligoelementos manganeso, cobre y molibdeno. Junto a ello, en cierta medida, el ácido fítico liga también proteínas mediante interacción electrostática.

El ácido fítico y sus sales, los fitatos, no son a menudo metabolizados, dado que no son absorbidos por el tracto gastrointestinal, es decir, ni el fósforo contenido en ellos ni los iones de metales quelados ni las proteínas fijadas están disponibles desde un punto de vista fisiológico nutricional.

Dado que el fósforo es un elemento esencial para el desarrollo de todos los organismos, los alimentos y alimentos para animales deben ser suplementados con fosfato inorgánico. Muy a menudo, también deben ser suplementados los iones esenciales para la fisiología nutricional tales como hierro y calcio. Además, el valor fisiológico nutricional de cada dieta disminuye, dado que las proteínas son fijadas por parte del ácido fítico. Como consecuencia. el ácido fítico se designa a menudo como factor anti-nutricional.

Además, en virtud de un metabolismo carente del ácido fítico, el fósforo del fitato es segregado a través del tracto gastrointestinal de los animales, lo cual conduce a una contaminación indeseada con fosfatos del medio ambiente, como consecuencia de la cual se puede producir, por ejemplo, la eutrofización de las aguas y un desarrollo excesivo de algas.

Ácido fítico o fitatos (estas expresiones se utilizan en lo que sigue de manera sinónima, a no ser que se indique de otro modo) pueden ser degradados por parte de fitasas. Las fitasas catalizan la hidrólisis de fitato en mino-inositol y/o mono-, di-, tri-, tetra- y/o penta-fosfatos así como fosfato inorgánico. Se diferencian dos tipos distintos de fitasas microbianas: 1) 3-fitasa/mio-inositolhexafosfato-3-fosfohidrolasa, EC 3.1.3.8; 2) 6-fitasa/mioinositolhexafosfato-6-fosfohidrolasa, EC 3.1.3.26. La 3-fitasa hidroliza preferiblemente primero el enlace éster en la posición 3, la 6-fitasa hidroliza preferiblemente primero el enlace éster en la posición 6. Semillas de vegetales con contenido en ácido fítico contienen enzimas fitasa endógenas. En su absorción, los fitatos en alimentos o bien alimentos para animales pueden ser hidrolizados teóricamente por parte de las fitasas de vegetales endógenas, por parte de fitasas de la flora intestinal y por parte de fitasas de la mucosa intestinal. En la práctica, sin embargo, el potencial de hidrólisis de las fitasas vegetales endógenas y de las fitasas que se presentan en el intestino, en la medida en que estén presentes, no son con mucho suficientes como para garantizar de manera significativa la biodisponibilidad del fósforo ligado en los fitatos. Por lo tanto, a los alimentos o a alimentos para animales se les añade a menudo fitasas exógenas.

Las fitasas pueden ser producidas por plantas así como por microorganismos. Entre los microorganismos se conocen bacterias productoras de fitasa, así como hongos y levaduras productores de fitasa.

Los productores de fitasa que se presentan de forma natural tienen, sin embargo, el inconveniente de que la fitasa sólo puede ser formada en determinadas cantidades y con propiedades definidas. Tal como se expone precedentemente, existe, sin embargo, una demanda incrementada de fitasa, en particular para la industria alimentaria y de alimentos para animales.

A pesar de en que la industria alimentaria y de alimentos para animales existe una demanda incrementada de fitasa y el uso de fitasa puede ser ventajoso, sólo unas pocas de las fitasas conocidas han encontrado una amplia aceptación en la industria alimentaria y de alimentos para animales. Consideraciones típicas se refieren a los costes de preparación relativamente elevados y/o a la mala estabilidad o bien actividad de la enzima en el entorno de aplicación deseado. Además de ello, una enzima de este tipo debe cumplir una serie de criterios con el fin de poder ser empleada en la industria. Éstos comprenden una elevada actividad total específica, un óptimo de pH bajo, resistencia frente a proteasas gastrointestinales, así como estabilidad térmica o bien termoestabilidad. La estabilidad térmica es una premisa importante para una aplicación industrial exitosa, dado que, por ejemplo en procesos de granulación, las enzimas son expuestas a temperaturas entre 60ºC y 95ºC.

Todas las fitasas microbianas conocidas se despliegan a temperaturas entre 56ºC y 78ºC (Lehman et al., 2000), con lo cual pierden su actividad. Por lo tanto, existe en particular una demanda de fitasas que, también a temperaturas elevadas, posean una actividad tecnológicamente suficiente o bien no sean inactivadas.

Por consiguiente, la presente invención se basa en el cometido de habilitar un polipéptido con actividad de fitasa que presente una termoestabilidad incrementada o bien que posea una actividad tecnológicamente suficiente a temperaturas elevadas. Además, el polipéptido con actividad de fitasa debe poseer también una estabilidad proteolítica incrementada.

El polipéptido ha de poder ser producido de forma rentable. En particular, la fitasa debe ser más termoestable que la enzima de tipo salvaje. Además, la fitasa debe conservar las propiedades esenciales de la fitasa de tipo salvaje de E. coli natural, pero debe distinguirse por una termoestabilidad mejorada. A las propiedades esenciales de la fitasa de tipo salvaje natural pertenecen, en particular, la capacidad de mejorar la disponibilidad de fosfato in-vivo e in-vitro mediante su actividad como fitasa, al igual que como fosfatasa, su óptimo del pH en el intervalo ácido con una actividad residual en el intervalo fuertemente ácido, así como su idoneidad como coadyuvante de panificación.

La presente invención se basa, además, en la misión de poner a disposición un gen para un polipéptido con actividad de fitasa con termoestabilidad incrementada así como estabilidad proteolítica incrementada. El polipéptido ha de poder ser producido de forma rentable y económica. En particular, la expresión del polipéptido en microorganismos eucarióticos ha de conducir a un polipéptido con termoestabilidad incrementada en comparación con la fitasa de tipo salvaje producida de manera similar. Se han de proporcionar, además, las secuencias de ADN codificadoras del polipéptido, construcciones de ADN y vectores correspondientes, así como una fuente para la enzima recombinante que sea adecuada para el uso comercial para alimentos y alimentos para animales y en procesos industriales, y composiciones que contengan a la enzima de acuerdo con la invención.

Sorprendentemente, se ha encontrado ahora que mutaciones en determinadas posiciones de la secuencia de fitasa de tipo salvaje de E. coli conducen a un aumento intrínseco de la termoestabilidad o bien estabilidad térmica, así como a un aumento de la estabilidad proteolítica de la proteína fitasa, sin afectar de manera desventajosa a los demás efectos y propiedades esenciales de la fitasa de E. coli de tipo salvaje.

Sorprendentemente, se encontró que una mutación en la posición 74 (K74D) de la secuencia de aminoácidos, y/o una combinación de mutaciones en las posiciones 139 (N139R) y 142 (D142E), y/o una combinación de mutaciones en las posiciones 145 (L145I) y 198 (L198I) y/o una mutación en la posición 200 (V200P) de la fitasa de tipo salvaje de E. coli así como combinaciones de estas mutaciones conducen a una termoestabilidad mejorada de la proteína fitasa sin perjudicar a los efectos favorables ni a las propiedades esenciales de la fitasa de tipo salvaje de E. coli. Además, se encontró que la complementación de la fitasa de E. coli mediante secuencias de la fosfatasa ácida procedente de Aspergillus niger var. awamori en el extremo N-terminal o C-terminal o bien en los extremos N-y C-terminales, también en unión con las mutaciones antes mencionadas, conduce a una mejora de la termoestabilidad y de la estabilidad proteolítica de la enzima.

Por consiguiente, la invención se refiere a una molécula de ADN recombinante que, después de la expresión en una célula hospedadora procariótica o eucariótica, codifica un polipéptido con actividad de fitasa, comprendiendo la molécula de ADN recombinante una secuencia de ADN elegida de a) secuencias de ADN que codifican un polipéptido con actividad de fitasa que ha sido obtenido mediante

variación de la secuencia de fitasa de tipo salvaje madura de E. coli, comprendiendo la variación

la mutación lisina → ácido aspártico en la posición 74 (K74D) y, eventualmente, una combinación de las mutaciones leucina → isoleucina en la posición 145 (L145I) y leucina → isoleucina en la posición 198 (L198I), y/o una mutación valina → prolina en la posición 200 (V200P),

5 adición de un segmento de la secuencia de la fosfatasa ácida de Aspergillus niger var. awamori, o de la fitasa de Aspergillus niger y b) secuencias de ADN que, en virtud de la degeneración del código genético, están emparentadas con las secuencias conforme a a) y b), en donde la molécula de ADN recombinante, en el caso de una expresión en una célula hospedadora adecuada, va

10 acompañada de una estabilidad térmica y frente a proteasas incrementada de la actividad enzimática de la proteína así codificada. En la bibliografía se describen varias fitasas de E. coli., p. ej. el gen appA que codifica una fitasa de E. coli K-12 (Dassa et al., J. Bacteriol. 172: 5497-5500 (1990)). Este gen codifica una enzima periplasmática que presenta tanto actividad de fosfatasa ácida como actividad de fitasa (véase Greiner et al., Arch. Biochim. Biophys. 303: 107-113

15 (1993)). Se conocen mutantes naturales de esta enzima (véase, p. ej., Rodríguez et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 257: 117-123 (1999)). Asimismo, se describieron mutantes genéticamente modificados de la fitasa de E. coli que conducían a una estabilidad térmica incrementada y/o a una actividad específica más elevada. Rodríguez et al. (Arch. Biochem. Biophys. 382: 105-112 (2000)) expresaron AppA de tipo salvaje y varios mutantes generados mediante mutagénesis específica del lugar en Pichia pastoris, con el fin de examinar el efecto de la N-glicosilación

20 sobre la estabilidad térmica de la proteína AppA. A pesar de que la glicosilación no fue reforzada, un mutante era más activo a pH 3,5 hasta 5,5 y, después de tratamiento térmico, presentaba una mayor actividad que la proteína de tipo salvaje producida en P. pastoris,

La familia de patentes basada en el documento WO 03/057248 contiene las solicitudes de patente US

25 2003/0170293 A1 y US 2003/0157646 A1. En ellas se describe la preparación microbiana de una fitasa termotolerante para piensos. La mutante (Nov9X) de la cepa de B fitasa (appA) de E. coli se lleva a expresión en E. coli, Pichia pastoris y Schizosaccharomyces pombe. El mutante Nov9X contiene 8 mutaciones de aminoácidos con respecto a la enzima de tipo salvaje. El mutante tiene en líquido a 70ºC, con respecto a la enzima de tipo salvaje, una termoestabilidad mejorada. El hospedador en el que se produce la enzima tiene también influencia sobre su

30 termoestabilidad tal como lo implica el mismo grupo de trabajo en la solicitud de patente de EE.UU. US 2003/0157646 A1. El modo de recuento de las posiciones de aminoácidos es en el caso de NOV9X 2 posiciones mayor que en la presente invención (W48 NOV9X corresponde a W46 en la presente invención).

En las solicitudes de patente WO 02/095003 y WO 2004/015084 se describe una serie de mutaciones puntuales de

35 la fitasa de E. coli, pero que ninguna de ellas conducía a un aumento de la termoestabilidad. La numeración en el documento WO 2004/015084 es mayor en 30 posiciones de aminoácidos en comparación con la presente invención.

También la memoria de publicación DE 10 2004 050 410 describe mutantes de fitasa de E. coli, pero con la

40 finalidad de aumentar la eficacia de secreción en la producción de hongos filamentosos. En la mencionada memoria impresa no existen declaraciones respecto al aumento de la termoestabilidad de los mutantes.

Además, la memoria impresa de Garrett et al.; Applied Environ, Microbiol., 2004, 70 (5), 3041-3046, describe mutantes de la fitasa de E. coli con una estabilidad térmica y gastroinestinal incrementada.

45 Prácticamente no es posible predecir el efecto de una o bien de varias mutaciones sobre el comportamiento de la actividad enzimática bajo condiciones de temperatura elevada. En general, a temperaturas elevadas tiene lugar una desnaturalización o bien despliegue de las estructuras secundaria y terciaria de la proteína.

50 La estabilidad térmica o bien termoestabilidad de proteínas depende de una pluralidad de interacciones. La conformación de proteínas es mantenida por un gran número de interacciones débiles. La estabilización puede comprender todos los planos jerárquicos de la estructura de la proteína: empaquetamiento local de la cadena polipéptidica, elementos estructurales secundarios y super-secundarios, dominios y sub-unidades de un proteína multímera. Existen numerosos motivos que informan en relación con la estabilidad térmica incrementada de una

55 proteína, siendo los más frecuentes (a) el almacenamiento conjunto de pares de iones dentro y/o entre las subunidades; (b) empaquetamiento mejorado del núcleo hidrófobo (interacciones de van-der-Waals); (c) redes adicionales a base de puentes de hidrógeno; (d) tendencia reforzada a la formación de estructuras secundarias; (e) estabilización dipolar incrementada dentro de la hélice; (f) una superficie polar aumentada; (g) un número reducido y un volumen total reducido de cavidades; (h) la reducción de la tensión

60 conformacional (estabilización de bucle) e (i) resistencia frente a la modificación química (oxidación de restos

metionina y/o desaminación de restos asparagina y glutamina).

En el estado de la técnica, no se conocen indicios sobre cómo y de qué modo se ha de modificar de manera preestablecida la secuencia de fitasa de tipo salvaje de E. coli con el fin de alcanzar un aumento de la 5 termoestabilidad. El estado conocido de la técnica no contiene, además, indicios sobre las mutaciones precedentemente mencionadas en la secuencia de fitasa de E. coli.

El estado conocido de la técnica no contiene, en particular, indicios en el sentido de que una mutación en la posición 74 (K74D) de la secuencia de aminoácidos o una combinación de mutaciones en las posiciones 139 10 (N139R) y 142 (D142E) o una combinación de mutaciones en las posiciones 145 (L145I) y 198 (L198I) o una mutación en la posición 200 (V200P) de la fitasa de tipo salvaje de E. coli o combinaciones de estas mutaciones conduzca a una termoestabilidad mejorada de la proteína fitasa sin perjudicar a los efectos favorables y las propiedades esenciales de la fitasa de E. coli de tipo salvaje. Además, el estado conocido de la técnica no contiene indicios de que la complementación de la secuencia de la fitasa de E. coli por parte de secuencias de la fosfatasa

15 ácida de Aspergillus niger var. awamori en el extremo N-terminal o C-terminal o bien en los extremos N- y Cterminales, tampoco en unión con las mutaciones antes mencionadas, conduzca a una mejora de la termoestabilidad de la enzima.

Moléculas de ADN recombinante preferidas de acuerdo con la invención con las variaciones de acuerdo con la

20 invención de la secuencia de la fitasa de tipo salvaje madura de E. coli son las construcciones PhyM7 y PhyM10. Éstas y otras construcciones están representadas en la siguiente Tabla 1. La construcción PhyM1 se tomó como producto comparativo.

Tabla 1: Genotipos de las mutaciones PhyM1, PhyM2, PhyM3, PhyM7, PhyM9 y PhyM10 25

Genotipo

Posición de AA Secuencia de tipo salvaje Mutaciones

PhyM1

200 E-L-K Val200 S-A-D E-L-K Tyr200 S-A-D

PhyM2

139 D-N-A-Asn139-V-T-D142-A D-N-A-Arg139-V-T-E142-A

142

D-N-A-N139-V-T-Asp142-A D-N-A-R139-V-T-Glu142-A

PhyM3

200 E-L-K Val200S-A-D E-L-K Pro200S-A-D

PhyM7

74 L-L-A-Lys74-K-G L-L-A-Asp74-K-G

PhyM9

145 D-A-I Leu145 S-R-A D-A-I Ile145 S-R-A

198

P-S-E Leu198 K-V-S P-S-E Ile198 K-V-S

PhyM10

74 L-L-A-Lys74-K-G L-L-A-Asp74-K-G

139

N-A-Asn139-V-T-D142-A D-N-A-Arg139-V-T-E142-A

142

N-A-N139-V-T-Asp142-A D-N-A-R139-V-T-Glu142-A

200

E-L-K Val200 S-A-D E-L-K Pro200 S-A-D

Los siguientes plásmidos han sido depositados el 18.10.2006 en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstr. 7B, 38124 Braunschweig de acuerdo con las condiciones del Tratado de 30 Budapest.

Plásmido

Número de depósito

pET-PhyM2

DSM 18715

pUC-PhyM3

DSM 18717

pET-PhyM7

DSM 18716

pUC-PhyM9

DSM 18718

pUC-PhyM10

DSM 18719

pPhy2005

DSM 18720

pPhy2006

DSM 18721

Era sorprendente que mutaciones que afectan a la superficie hidrófoba de la proteína (PhyM3, PhyM7 y PhyM9), así como mutaciones que incorporan un enlace iónico en la hélice D (PhyM2) o bien estabilizan el bucle B4 a 35 través de un puente iónico (PhyM7) cooperen de manera significa en el aumento de la termoestabilidad de la fitasa de E. coli.

También la adición de partes de secuencias de la fosfatasa ácida de Aspergillus niger var. awamori, que en el caso de la fosfatasa ácida conducen a una formación de dímeros y tetrámeros, tenía efectos estabilizantes en el caso de 40 la fitasa de E. coli . Lo correspondiente se cumple para la adición de partes de secuencia de la fitasa de Aspergillus

niger.

Los polipéptidos de acuerdo con la invención con actividad de fitasa muestran, en comparación con la enzima de tipo salvaje de E. coli, una temperatura o bien termoestabilidad incrementada de su actividad enzimática. Esta mejora de la termoestabilidad puede medirse en líquidos mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC – siglas en inglés). En particular, la mejora de la termoestabilidad se manifiesta en la actividad residual fuertemente incrementada de los mutantes enzimáticos frente a la enzima de tipo salvaje cuando son expuestos a la carga térmica tal como se utiliza en la granulación de piensos. Además, los polipéptidos de acuerdo con la invención poseen también una estabilidad incrementada frente a la degradación proteolítica tal como se manifiesta especialmente en el estómago de aves de corral y animales monogástricos. Dado que la fitasa en el caso de la alimentación animal debe liberar especialmente durante el paso por el estómago el fosfato a partir de ácido fítico y sus productos de degradación, esta estabilidad es de interés particular con el fin de mantener lo más baja posible la dosificación de la enzima. En virtud de la estabilidad térmica y/o proteolítica incrementada, las fitasas de acuerdo con la invención se adecúan especialmente para aplicaciones en las que se manifiestan condiciones de temperatura elevada o bien en las que se ha de contar con una degradación proteolítica incrementada. Ejemplos de aplicación para ello son la preparación de la enzima en la que ésta debe ser protegida frente a proteasas de la cepa hospedadora, la preparación de pienso en forma de gránulos, pero también la aplicación como enzima líquida en la aplicación post-granulación sobre el pienso granulado. Una estabilidad térmica incrementada permite la aplicación temprana sobre los gránulos todavía no enfriados demasiado, con lo que se acorta el tiempo de evaporación del líquido aplicado. Esto conlleva también ventajas desde un punto de vista microbiológico, dado que entonces el elevado contenido en agua sólo se presenta brevemente a altas temperaturas a las que no pueden desarrollarse la mayoría de los gérmenes patógenos.

La secuencia de ADN de acuerdo con la invención que codifica una fitasa comprende la mutación lisina → ácido aspártico en la posición 74 (K74D) y eventualmente una combinación de las mutaciones leucina → isoleucina en la posición 145 (L145I) y leucina → isoleucina en la posición 198 (L198I) y/o una mutación valina → prolina en la posición 200 (V200P).

Una posibilidad de combinación preferida la representa la combinación que se designa en lo que sigue como genotipo PhyM10.

Además, adicionalmente a las mutaciones descritas puede estar adicionalmente presente una adición N-terminal o C-terminal o una adición N-y C-terminal de un segmento de la secuencia de la fosfatasa ácida de Aspergillus niger var. awamori. También, la sola presencia de estos segmentos de secuencia conduce ya a un aumento de la termoestabilidad. En el caso del segmento N-terminal de la fosfatasa ácida de A. niger var.awamori se trata de los primeros 51 aminoácidos de la proteína madura (FSYGAAIPQS TQEKQFSQEF RDGYSILKHY GGNGPYSERV SYGIARDPPTS). Los 4 últimos aminoácidos de este polipéptido reemplazan en este caso a los primeros 4 aminoácidos (QSEP) de la fitasa madura de E. coli. También es posible la adición de partes de este segmento de la fosfatasa ácida. Alternativamente, también puede utilizarse la parte o partes N-terminales de la misma de los primeros 40 aminoácidos de la proteína madura de la fitasa de Aspergillus niger (SCDTVDQGYQ CFSETSHLWG QYAPFFSLAN ESVISPEVPA). La adición a la fitasa de E. coli puede tener lugar también en otros lugares distintos a la posición 4 descrita, siempre que se conserve la actividad de la enzima. Para la prolongación C-terminal, los últimos 29 aminoácidos (LSFWWNYNTT TELNYRSSPI ACQEGDAMD) de la fosfatasa ácida de A. niger var. awamori se fusionaron directamente al extremo C-terminal de la fitasa de E. coli. Esta fusión o bien fusiones pueden ir también acompañadas de otras mutaciones en la fitasa de E. coli y no se limitan a las mutaciones adicionales recogidas en esta solicitud. Mediante la mutación Lys43Cys sería posible una formación de puentes disulfuro entre la nueva parte C-terminal y el núcleo de la fitasa de E. coli y, con ello, una dimerización mejorada. Son posibles otras mutaciones que favorezcan o estabilicen los puentes intermoleculares de van der Waals, hidrófobos o iónicos y, con ello, aumenten la termoestabilidad o puedan continuar mejorándola. Ejemplos de prolongaciones de la secuencia N-o bien C-terminales son las formas de realización Phy2005 y Phy2006 descritas más adelante.

La termoestabilidad de la fitasa de acuerdo con la invención puede continuar aumentándose en productos comerciales, p. ej. mediante la adición de sustancias al concentrado de ultrafiltración antes del secado o la granulación. Por ejemplo, puede prepararse una formulación estable de la enzima fitasa de acuerdo con la invención debido a que se pulveriza una mezcla a base de una disolución enzimática líquida sobre un agente de relleno tal como maltodextrina y luego la mezcla se seca, o a la disolución enzimática líquida se añade, antes del secado, leche desnatada en polvo al 20%-60% (p/p referido a la proteína total de la disolución enzimática) y/o propionato de calcio al 1%-5% (p/p referido a la proteína total de la disolución enzimática) y el valor del pH se

ajusta a valor definido, en particular a pH 5,2 + 0,5. La disminución de la humedad y las interacciones de unión de la fitasa con el agente de relleno protegen a la enzima, adicionalmente a su estabilidad definida en su estructura, frente a influencias del entorno tales como valores extremos de temperatura que pueden manifestarse durante la preparación del alimento para animales. Formulaciones secas y líquidas pueden estabilizarse ulteriormente si se reduce la actividad de enzimas proteolíticas potenciales que puedan estar presentes como productos secundarios en la mezcla de fermentación líquida que se utiliza para la preparación de la enzima de acuerdo con la invención.

La secuencia de ADN correspondiente a la secuencia de fitasa mutada de acuerdo con la invención puede realizarse utilizando usos de codones arbitrarios. Así, por ejemplo, puede utilizarse el uso de codón del microorganismo utilizado para la expresión, pero también puede utilizarse el uso de codón de E. coli o bien una variante del mismo. Además, la secuencia de fitasa de E. coli mutada de acuerdo con la invención puede contener otras variaciones en la secuencia. En este caso, pueden efectuarse variaciones arbitrarias adicionalmente a las mutaciones precedentemente descritas, siempre que no se perjudique de forma desventajosa a la propiedad de la estabilidad incrementada frente a la temperatura y siempre que se conserve la actividad enzimática y otras propiedades esenciales de la fitasa de tipo salvaje de E. coli.

Variaciones correspondientes son bien conocidas por un experto en la materia en el sector de la técnica de ADN recombinante y comprenden las mutaciones precedentes así como las variaciones expuestas más adelante a modo de ejemplo.

De acuerdo con la invención, pueden utilizarse moléculas de adición y/o deleción del polipéptido modificado de acuerdo con la invención. Así, el polipéptido modificado de acuerdo con la invención con actividad de fitasa puede prolongarse mediante adición de otras secuencias en el extremo N-terminal y/o C-terminal. Con ello, pueden crearse moléculas híbridas que poseen otras propiedades ventajosas. Por ejemplo, pueden añadirse proteínas de fusión o bien proteínas secretadas de forma nativa en gran medida, con lo que se mejora la eficacia de la secreción. Preferiblemente, para ello se utiliza una parte de la proteína CBH2 de Trichoderma reesei de los aminoácidos Met 1 a Ser 86.

De acuerdo con la invención, también pueden suprimirse segmentos de secuencias del polipéptido con actividad de fitasa, siempre que no se perjudique la propiedad de la estabilidad incrementada frente a la temperatura manteniendo la actividad de fitasa.

Las mutaciones, elongaciones y acortamientos pueden llevarse a cabo de manera en sí conocida según procedimientos bien conocidos en el sector especializado.

Las variaciones del polipéptido con actividad de fitasa, consideradas precedentemente, corresponden a mutaciones

o bien modificaciones correspondientes de la molécula de ADN respectiva.

También se describen secuencias que se hibridan bajo condiciones relajantes o rigurosas con las secuencias de acuerdo con la invención. Como condiciones rigurosas se consideran: hibridación a 65ºC, 18 h en disolución de sulfato de dextrano (GenescreenPlus, DuPont), después lavado de los filtros en cada caso durante 30 min, primero con 6 x SSC, dos veces con 2 x SSC, dos veces con 2 x SSC con SDS al 0,1% y, a continuación, con 0,2 x SSC a 65ºC (métodos de transferencia y detección de membrana, Amersham).

También se describen secuencias que con la secuencia de nucleótidos revindicada o bien las partes reivindicadas de la misma, presentan una homología de al menos el 70%, preferiblemente de al menos el 80%, todavía más preferiblemente de al menos el 90% y, en particular, de al menos el 95%, siempre que las secuencias respectivas conduzcan al aumento de la estabilidad de la temperatura del polipéptido con actividad de fitasa codificado por las mismas. Preferiblemente, la homología asciende a 70 hasta 100 por ciento. En este caso, la homología se define como el grado de identidad. El grado de identidad se determina preferiblemente en este caso de manera que se determina el número de los restos de la secuencia más corta que participan en la comparación y que poseen en la otra secuencia un trozo antagonista “correspondiente”. La homología se determina en este caso preferiblemente de manera habitual utilizando los algoritmos habituales. Para comparación se recurre sólo a los ADNcs de las respectivas proteínas maduras. Como secuencias homólogas se determinan trozos opuestos de secuencia similares, preferiblemente idénticos, con ayuda de programas de ordenador conocidos. Un ejemplo de un programa de este tipo es el programa Clone Manager Suite, que contiene la parte de programa Align Plus y que es comercializado por Scientific & Educational Software, Durham, NC, EE.UU. En este caso, se lleva a cabo una comparación de dos secuencias de ADN definidas como antecede, bajo la opción “alineación local”, ya sea según el método FastScan – MaxScore, o según el método Needleman – Wunsch conservando los valores por defecto. Especialmente, de acuerdo con la invención, para el cálculo de la homología se utilizó la versión de programa

“Clone Manager 7 Align Plus 5” con las funciones “Compare Two Sequences/Local Fast Scan-Max Score/Compare DNA sequences”. En este caso, se utilizaron los algoritmos accesibles a partir de las siguientes fuentes: Hirschberg, D.S. (1975) A linear space algorithm for computing longest common subsequences, Commun Assoc Comput Mach 18: 341-343; Myers, E.W. y W. Miller. (1988) Optimal alignments in linear space, CABIOS 4: 1, 1117; Chao, K-M, W.R. Pearson y W. Miller. (1992) Aligning two sequences within a specified diagonal band, CABIOS 8:5, 481-487.

La invención se refiere, además, también a secuencias de ADN que, en virtud de la degeneración del código genético, están emparentadas con las secuencias de acuerdo con la invención. La degeneración del código genético puede resultar en este caso en virtud de una degeneración natural o en virtud de un uso de codones elegidos especialmente. Variantes alélicas que se presentan de forma natural pueden identificarse utilizando técnicas bien conocidas de la biología molecular tales como, p. ej. la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y técnicas de hibridación.

Puede utilizarse una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de acuerdo con la invención con el fin de transformar células hospedadoras arbitrarias tales como, por ejemplo, células de hongos, levaduras, bacterias, vegetales o mamíferos. Células transformadas de este modo se distinguen por una producción y eventual secreción de fitasa con termoestabilidad incrementada. La enzima fitasa con termoestabilidad incrementada, así producida, conduce también a una liberación eficaz de fosfato a partir de fitatos.

Las expresiones proteína, péptido y polipéptido deben utilizarse de manera indistinta. Un polipéptido o enzima con actividad de fitasa o una fitasa debe designar a toda enzima que pueda determinar la liberación de fosfato inorgánico a partir de diferentes mioinositol-fosfatos. Ejemplos de sustratos de mioinositol-fosfato (fitasa) de este tipo son el ácido fítico y sales arbitrarias del mismo, por ejemplo fitato sódico o fitato potásico, o sales mixtas. También pueden servir como sustrato de fitasa isómeros de posición arbitrarios de los di-, tri-, tetra- o pentafosfatos de mioinositol. La actividad de fitasa puede determinarse utilizando cualquier ensayo arbitrario en el que se utilice uno de estos sustratos. Una variante de fitasa comprende variantes de polipéptidos que se derivan de una fitasa especial por deleción o adición de uno o varios aminoácidos en el extremo N-terminal y/o C-terminal de la proteína nativa, deleción o adición de uno o varios aminoácidos en uno o varios lugares en la proteína nativa o sustitución de uno o varios aminoácidos en uno o varios lugares en la fitasa. La creación de variantes de este tipo es generalmente conocida en el sector técnico. Por ejemplo, variantes de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos pueden prepararse mediante mutación en el ADN. Procedimientos para la mutagénesis y modificación de la secuencia de nucleótidos son bien conocidos en el sector técnico (véase, por ejemplo, Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 488 (1985), Kunkel et al., Methods in Enzymol., 154:367 (1987), nº de patente de EE.UU. 4.873.192, Walker y Gaastra, comps., Techniques in Molecular Biology, Mac Millan Publishing Company, Nueva York (1983)). Indicios sobre sustituciones de aminoácidos adecuadas que no perjudican a la actividad biológica de la proteína de interés, se encuentran en modelo de Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, Natl. Biomed. Res. Found. Washington, D.C. (1978). Se prefieren sustituciones conservativas tales como el intercambio de un aminoácido por otro con propiedades similares.

Aminoácidos de este tipo, intercambiables dentro de un grupo, se recogen a modo de ejemplo en la siguiente Tabla sin que se limiten a ellos.

Alifático

No polar GAP

ILV

Polar y descargado

CSTMNQ

Polar y cargado

DE

KR

Aromático

HFWY

La invención se refiere también a composiciones de ácidos nucleicos o proteínas aisladas o esencialmente purificadas. En este caso, un polinucleótido/polipéptido o bien segmento del mismo aislado y purificado designa a un polinúcleótico o bien polipéptido o bien segmento del mismo que se presenta aislado de su entorno nativo. Un segmento de ácido polinucleico o polipéptido aislado puede presentarse en forma purificada o puede presentarse en un entorno no nativo tal como, por ejemplo, en una célula hospedadora transgénica. Por ejemplo, un segmento de polinucleótido o proteína aislado o purificado o una parte biológicamente activa del mismo está esencialmente exento de otro material celular o medio de cultivo en la producción según técnicas recombinantes o está esencialmente exento de precursores químicos o de otros compuestos químicos. Preferiblemente, un polinucleótido aislado está exento de secuencias (preferiblemente secuencias codificadoras de proteínas) que flanquean de modo

natural al ácido nucleico (es decir, secuencias que están localizadas en los extremos 5’ y 3’ del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del que procede el ácido nucleico. Por ejemplo, de acuerdo con diferentes formas de realización, la molécula de ácido nucleico aislada puede contener secuencias de nucleótidos de menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb que flanquean de forma natural a la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la que se deriva el ácido nucleico. Una proteína que está esencialmente exenta de material celular, comprende composiciones de proteína o polipéptido con menos de aproximadamente 70%, 50%, 30%, 20%, 10%, 5% (referido al peso en seco) de proteína impurificadora. Si la proteína de acuerdo con la invención o un fragmento biológicamente activo de la misma se produce de forma recombinante, el medio de cultivo comprende preferiblemente menos de aproximadamente 70%, 50%, 30%, 20%, 10% o 5% (referido al peso en seco) de los precursores químicos o de sustancias químicas no proteicas. Fragmentos y variantes de las secuencias de nucleótidos o proteínas o segmentos de proteínas de acuerdo con la invención, que son codificadas con los mismos, están asimismo comprendidos de acuerdo con la invención. Fragmento designa una parte de la secuencia de nucleótidos o una parte de la secuencia de aminoácidos y, por lo tanto, una parte del polipéptido o proteína que es codificado por el mismo.

La invención se refiere también a casetes de expresión que pueden utilizarse para la transfección del marco de lectura abierto, codificador de una fitasa de acuerdo con la invención, en una célula hospedadora. Estas casetes comprenden preferiblemente una región de inicio de la transcripción que está enlazada con el marco de lectura abierto. Una casete de expresión de este tipo puede contener una pluralidad de sitios de escisión por restricción para la inserción del marco de lectura abierto y/u otros ADNs, p. ej. una región reguladora de la transcripción y/o genes marcadores seleccionables. La casete de transcripción comprende en la dirección 5’ → 3’ de la transcripción una región de inicio de la transcripción y de la traducción, la secuencia de ADN de interés y una región de detención de la transcripción y de la traducción que es funcional en una célula microbiana. La región de terminación puede ser nativa en relación con la región de inicio de la transcripción, puede ser nativa en relación con la secuencia de ADN de interés o puede derivarse de otra fuente arbitraria.

La expresión “marco de lectura abierto” (ORF – siglas en inglés) designa la secuencia de aminoácidos que es codificada entre el codón de inicio y de terminación de la traducción de una secuencia codificadora. Las expresiones “codón de inicio” y “codón de terminación” designan una unidad a base de tres nucleótidos contiguos (codones) en una secuencia codificadora que especifica el comienzo y la detención de la cadena de la síntesis de proteínas (traducción de ARNm).

“Enlace funcional” designa, en relación con un ácido nucleico, una unión como parte de la misma molécula de ácido nucleico en posición y orientación adecuadas con respecto al comienzo de la transcripción del promotor. ADN en unión funcional a un promotor se encuentra bajo la regulación del inicio de la transcripción del promotor. Secuencias codificadoras pueden estar enlazadas funcionalmente con la secuencia reguladora en una orientación sentido o antisentido. Haciendo referencia a polipéptidos, enlace funcional significa la unión como parte del mismo polipéptido, es decir, a través de enlaces peptidilo.

De acuerdo con la invención, pueden utilizarse promotores arbitrarios. Promotor designa la secuencia de nucleótidos habitualmente situada aguas arriba (5’) en relación con la secuencia codificadora y controla la expresión de la secuencia codificadora, poniendo a disposición el reconocimiento de la ARN-polimerasa y de otros factores que son necesarios para una transcripción correcta. El promotor utilizado de acuerdo con la invención puede comprender un promotor mínimo, es decir, una secuencia de ADN corta a base de una caja TATA y otras secuencias que especifican el lugar de inicio de la transcripción al que están agregados los elementos reguladores para el control de la expresión.

El promotor de acuerdo con la invención puede comprender también una secuencia de nucleótidos que comprende un promotor mínimo y elementos reguladores, promotor que puede controlar la expresión de una secuencia codificadora o ARN funcional. Este tipo de secuencia del promotor se compone de elementos proximales y distales situados aguas arriba, designándose a menudo a los mencionados en último lugar como potenciadores. Por consiguiente, un potenciador es una secuencia de ADN que puede estimular la actividad del promotor y puede ser un elemento inherente al promotor o un elemento heterólogo insertado con el fin de reforzar el nivel de expresión o la especificidad para el tejido de un promotor. Puede funcionar en ambas orientaciones y puede funcionar incluso en el caso de una disposición aguas arriba o aguas abajo del promotor. Tanto el potenciador como también otros elementos promotores situados aguas arriba fijan proteínas de unión a ADN específicas para la secuencia, las cuales transmiten sus efectos. Los promotores pueden derivarse en su conjunto de un gen nativo o pueden estar compuestos de diferentes elementos que se derivan de diferentes promotores que se presentan de forma natural, o pueden estar incluso compuestos de segmentos de ÁDN sintéticos. Un promotor puede contener también secuencias de ADN que participan en la unión de factores proteicos, que controlan la eficacia del inicio de la

transcripción como respuesta a condiciones fisiológicas o condicionadas por el desarrollo.

Elementos promotores, en particular elementos TATA, que son inactivos o que poseen una actividad del promotor fuertemente disminuida en ausencia de una activación de aguas arriba, se designan promotores mínimos o promotores del núcleo. En presencia de un factor de la transcripción adecuado o bien de factores de la transcripción adecuados, la función del promotor mínimo estriba en la posibilitación de la transcripción. Un promotor mínimo o del núcleo se compone, por consiguiente, sólo de todos aquellos elementos básicos que son necesarios para el inicio de la transcripción, p. ej. una caja TATA y/o un iniciador.

La invención se refiere también a vectores que contienen el ADN de acuerdo con la invención. Estos vectores comprenden plásmidos, cósmidos, fagos y otros vectores arbitrarios en una forma de doble hebra o de hebra sencilla, lineal o circular, que eventualmente pueden ser transmitidos o movilizados por sí mismos y que pueden transformar a un hospedante procariótico o eucariótico ya sea por integración en el genoma celular o pueden presentarse de manera extracromosómica (p. ej. plásmidos de replicación autónoma con un origen de la replicación).

Vectores, plásmidos, cósmidos, cromosomas de levadura artificiales (YACs – siglas en inglés), cromosomas de bacterias artificiales (BACs – siglas en inglés) y segmentos de ADN para uso para la transformación de células comprenden, en general, el ADN codificador de fitasa de acuerdo con la invención, así como otro ADN tal como ADNc, un gen o genes que deben ser transfectados en las células. Estas construcciones de ADN pueden comprender otras estructuras tales como promotores, potenciadores, poli-enlazadores o también genes reguladores, en la medida en que sea necesario. Uno de los segmentos de ADN o genes que fue o fueron elegidos para la transfección celular, codifica/codifican de manera oportuna una proteína que es expresada en las células transformadas (recombinantes) así obtenidas, lo cual conduce a una característica rastreable o seleccionable y/o confiere un fenotipo mejorado a la célula transformada.

La construcción de vectores que pueden utilizarse de acuerdo con la invención es conocida por un experto en el sector a la vista de la divulgación precedente (véase, p. ej. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed. Coldspring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y. (1989)). La casete de expresión de acuerdo con la invención puede contener uno o varios puntos de corte por restricción con el fin de disponer al nucleótido codificador de fitasa bajo la regulación de una secuencia reguladora. La casete de expresión puede contener también una señal de terminación en enlace funcional con el polinucleótido, así como secuencias reguladoras que se requieren para la traducción reglamentaria del polinucleótido. La casete de expresión que contiene al polinucleótido de acuerdo con la invención puede ser quimérica, es decir, al menos uno de sus componentes es heterólogo en relación con al menos uno de los otros componentes. La expresión del polinucleótido en la casete de expresión puede encontrarse bajo el control de un promotor constitutivo, de un promotor inducible, de un promotor regulado, de un promotor viral o de un promotor sintético.

Los vectores pueden contener ya elementos reguladores, p. ej. promotores, o las secuencias de ADN de acuerdo con la invención pueden ser manipuladas de manera que contengan elementos de este tipo. Elementos promotores adecuados que pueden utilizarse son conocidos en el sector especializado y, por ejemplo, para Trichoderma reesei, son el promotor cbh 1 o el promotor cbh-2, para Aspergillus oryzae es el promotor amy, para Aspergillus niger son el promotor xyl, glaA, alcA, aphA, tpiA, gpdA, sucl y el promotor pkiA. Elementos promotores adecuados que pueden utilizarse para la expresión en levaduras son conocidos en el sector especializado y son, por ejemplo, el promotor pho5 o el promotor gap para la expresión en Saccharomyces cerevisiae, y para Pichia pastoris, p. ej., el promotor aoxl o el promotor fmd, o el promotor mox para H. polymorpha.

ADN que es adecuado para la transfección en células puede comprender junto al ADN de acuerdo con la invención, también ADN que se derivó de una fuente arbitraria o que se aisló de la misma. Un ejemplo de un ADN derivado es una secuencia de ADN que fue identificada como fragmento útil en un organismo dado y que luego fue sintetizado químicamente en forma esencialmente pura. Un ejemplo de un ADN de este tipo es una secuencia de ADN adecuada que se obtuvo, por ejemplo, utilizando endonucleasas de restricción, de modo que pueda continuar siendo manipulado de acuerdo con la invención, por ejemplo, pueda ser amplificado. Un ADN de este tipo se designa habitualmente como ADN recombinante. Por lo tanto, un ADN adecuado comprende ADN totalmente sintético, ADN semi-sintético, ADN aislado de fuentes biológicas y ADN derivado de ARN transfectado. Por lo general, el ADN transfectado no es ningún componente original del genotipo del ADN receptor, pero de acuerdo con la invención, también un gen puede ser aislado de un genotipo dado y eventualmente modificado y, a continuación, múltiples copias del gen pueden ser transfectadas en el mismo genotipo, p. ej. con el fin de reforzar la producción de un producto génico dado.

El ADN transfectado comprende, sin limitación, ADN de genes tales como, por ejemplo, de bacterias, levaduras, hongos o virus. El ADN transfectado puede comprender genes modificados o sintéticos, partes de genes o genes quiméricos, incluidos genes del mismo o de un genotipo diferente.

El ADN utilizado de acuerdo con la invención para la transformación puede ser circular o lineal, de doble hebra o de una sola hebra. Por lo general, el ADN se presenta en forma de un ADN quimérico tal como un ADN de plásmido, que contiene también regiones codificadoras que son flanqueadas por secuencias reguladoras que sustentan la expresión del ADN recombinante presente en la célula transformada. Por ejemplo, el propio ADN puede contener un promotor o puede consistir en el mismo, que es activo en una célula, que se deriva de una fuente que se diferencia de la célula, o puede utilizarse un promotor que ya esté presente en la célula, es decir, la célula diana de la transformación.

Por lo general, el ADN transfectado es relativamente pequeño, menor que aproximadamente 30 kb, con el fin de minimizar la sensibilidad frente a la degradación, física, química o enzimática, la cual aumenta con el tamaño del ADN.

La selección de un vector de expresión adecuado depende de las células hospedadoras. Vectores de expresión en levaduras u hongos pueden comprender un origen de la replicación, un promotor y un potenciador adecuado, y también puntos de unión a ribosomas, puntos de poliadenilación, puntos de corte y empalme con el donante y el aceptor, secuencias de terminación de la transcripción y secuencias 5’-flanqueantes no transcritas, arbitrarios necesarios.

Ejemplos de células hospedadoras adecuadas son: células de hongos del género Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma, Neurospora, Mucor, Penicilium, etc. tales como, por ejemplo, levaduras de los géneros Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Trichosporon, Schwanniomyces, Hansenula, Pichia y similares. Sistemas hospedadores adecuados son, por ejemplo, hongos tales como Aspergilli, p. ej. Aspergillus niger (ATCC 9142) o Aspergillus ficuum (NRLL 3135) o Trichoderma (p. ej. Trichoderma reseei QM6a) y levaduras tales como Saccharomyces, p. ej. Saccharormyces cereviseiae o Pichia tal como, p. ej., Pichia pastoris, o Hansenula, p. ej. H. polymorpha (DSMZ 70277). Microorganismos de este tipo pueden obtenerse de lugares de depósito reconocidos, p. ej. de American Type Culture Collection (ATCC), de Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) o de Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) o de otros lugares de depósito arbitrarios.

La casete de expresión puede contener en la dirección de transcripción 5’-3’ una región de transcripción y de traducción del polinucleótido de acuerdo con la invención y una región de transcripción y de terminación que es funcional in vivo o in vitro. La región de terminación puede ser nativa en relación con la región de inicio de la transcripción o puede ser nativa en relación con el polinucleótido o puede ser de otro origen. Las secuencias reguladoras pueden estar localizadas aguas arribas (secuencias 5’ no codificadoras), en el interior (intrón) o aguas abajo (secuencias 3’ no codificadoras) de una secuencia codificadora y pueden afectar a la transcripción, al procesamiento de ARN o a la estabilidad y/o a la traducción de la secuencia codificadora asociada. Secuencias reguladoras pueden comprender, sin limitación, potenciadores, promotores, sitios de unión al represor, secuencias conductoras de la traducción, intrones o secuencias señal de la poliadenilación. Pueden comprender secuencias naturales y sintéticas así como secuencias que son una combinación a base de secuencias sintéticas y naturales.

El vector utilizado de acuerdo con la invención puede también comprender secuencias adecuadas para la amplificación de la expresión.

Ejemplos de promotores que pueden utilizarse de acuerdo con la invención son promotores de los que se sabe que controlan la expresión en las células eucarióticas. Pueden utilizarse promotores arbitrarios con la capacidad de expresión en ficomicetos. Ejemplos son un promotor que es inducido fuertemente por el almidón o la celulosa, p. ej. un promotor para glucoamilasa o α-amilasa del género Aspergillus, o celulasa (celobiohidrolasa) del género Trichoderma, un promotor para enzimas en la vía metabólica glicolítica tal como, por ejemplo, fosfogliceratoquinasa (PGK) y glicerinaldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GPD), etc. Se prefiere el promotor de celobiohidrolasa-I, de celobiohidrolasa-II, de amilasa, de glucoamilasa, de xilanasa o de enolasa.

Se conocen dos métodos principales para el control de la expresión, es decir, la sobre-expresión y la subexpresión. La sobre-expresión puede conseguirse mediante la inserción de una o de varias copias extra del gen elegido. Para la sub-expresión existen dos métodos principales que habitualmente se designan en el sector especializado como “sub-regulación antisentido” y “sub-regulación sentido”. Por lo general, estos procedimientos se designan como de “silenciamiento de genes”. Estos dos métodos conducen a una inhibición de la expresión del

gen diana.

Adicionalmente al uso de un promotor especial, otros tipos de elementos pueden afectar a la expresión de transgenes. En particular, se demostró que los intrones poseen el potencial para reforzar la expresión del transgen.

La casete de expresión puede comprender además otros elementos, por ejemplo aquellos que pueden ser regulados por elementos endógenos o exógenos tales como proteínas dedo de zinc, incluidas proteínas dedo de zinc que se presentan de forma natural o proteínas dedo de zinc quiméricas.

La casete de expresión utilizada de acuerdo con la invención puede contener, además, elementos potenciadores o elementos de promotor situados aguas arriba.

Vectores para el uso de acuerdo con la invención pueden construirse de manera que contengan un elemento potenciador. Las construcciones de acuerdo con la invención comprenden, por consiguiente, al gen de interés junto con una secuencia de ADN 3’ que actúa como señal con el fin de terminar la transcripción y permitir la poliadenilación de ARNm así obtenido. Pueden utilizarse secuencias señal arbitrarias que posibiliten la secreción a partir del organismo hospedante elegido. Una secuencia señal preferida es la secuencia señal de fitasa de Aspergillus niger o secuencias señal derivadas de la misma para la secreción a partir de hongos filamentosos.

También puede utilizarse una secuencia conductora especial dado que la secuencia de ADN entre el sitio de inicio de la transcripción y el comienzo de la secuencia codificadora, es decir, de la secuencia conductora no traducida, puede afectar a la expresión del gen. Secuencias conductoras preferidas comprenden secuencias que controlan la expresión óptima del gen adherido, es decir, comprenden una secuencia consenso conductora preferida que aumenta o adquiere la estabilidad de ARNm e impide un inicio de la traducción inadecuado. La elección de secuencias de este tipo es bien conocida por un experto en el sector.

Con el fin de mejorar la posibilidad de identificar a los transformantes, puede incorporarse en la casete de expresión un gen marcador seleccionable o rastreable. Genes marcadores de este tipo son bien conocidos por un experto en el sector.

La casete de expresión o una construcción de vector que contiene la casete de expresión se introduce en una célula hospedadora. Está disponible una pluralidad de técnicas y son bien conocidas por un experto en el sector para la transfección de construcciones en una célula hospedadora. La transformación de células microbianas puede llevarse a cabo utilizando polietilenglicol, cloruro de calcio, infección viral, DEAE-dextrano, infecciones por fagos, electroporación y otros métodos conocidos en el sector especializado. La transformación de hongos puede llevarse a cabo según Penttilä et al., Gene 61: 155-164, 1987. La transfección de un vector recombinante en levaduras puede llevarse a cabo según procedimientos en sí conocidos, incluida la electroporación, uso de esferoplastos, acetato de litio y similares.

Tan pronto como se haya obtenido la casete de expresión o bien la secuencia de ADN de acuerdo con la invención, puede introducirse en vectores según procedimientos en sí conocidos con el fin de sobre-expresar el polipéptido codificado en sistemas hospedadores adecuados. Sin embargo, también pueden utilizarse secuencias de ADN como tales con el fin de transformar sistemas hospedadores adecuados de la invención, con el fin de conseguir una sobre-expresión del polipéptido codificado.

Tan pronto como fue expresada una secuencia de ADN de acuerdo con la invención en una célula hospedadora adecuada en un medio adecuado, la fitasa codificada puede concentrarse y/o aislarse según procedimientos en sí conocidos a partir del medio, en el caso de que la fitasa sea segregada al medio, o a partir del organismo hospedador, en el caso de que la fitasa esté presente intracelularmente, p. ej. en el espacio periplasmático. Procedimientos conocidos para la separación de los componentes insolubles del medio de cultivo y de la biomasa, seguidos de procedimientos para la concentración de la fitasa, pueden aplicarse para la preparación de las disoluciones concentradas de fitasa o como preparación para el secado de la fitasa. Por ejemplo, pueden utilizarse procedimientos de filtración o procedimientos de centrifugación para la separación de los componentes insolubles, seguidos de procedimientos de ultrafiltración para la concentración, o se emplean procedimientos de filtración de flujo cruzado. El secado puede tener lugar mediante liofilización y secado por pulverización, procedimientos de granulación, extrusión u otros procedimientos. Pueden utilizarse procedimientos conocidos para la purificación de proteínas con el fin de aislar a las fitasas de acuerdo con la invención. Por ejemplo, pueden utilizarse diferentes procedimientos cromatográficos o cromátográficos en gel, individualmente o en combinación. En función de la célula hospedadora utilizada en el caso de un procedimiento de producción recombinante, la enzima de acuerdo con la invención puede ser modificada o no de forma covalente mediante glicosilación. En células eucarióticas, la

glicosilación de las proteínas segregadas sirve para modular el plegamiento de las proteínas, la estabilidad de la conformación, la estabilidad térmica y la resistencia frente a la proteólisis. En relación con una aplicación específica de la fitasa, se puede preferir una variante glicosilada de la enzima frente a una variante no glicosilada. Por ejemplo, el uso de una fitasa glicosilada en piensos sirve para la protección de la enzima frente a una desnaturalización térmica durante la formación de gránulos de pienso y frente a una inactivación proteolítica en el paso a través del estómago del animal, con lo cual se fomenta la distribución de la enzima activa en el tracto intestinal y en el lugar de acción. Para aplicaciones en la elaboración de alimentos, en la que la actividad enzimática sólo es deseada durante el tratamiento y no en el producto final, se puede preferir una fitasa sensible a una degradación termolábil, es decir, no glicosilada y más sensible a frente a una degradación proteolítica.

La invención se refiere también a composiciones de fitasa que contienen al polipéptido de acuerdo con la invención. En general, las composiciones de fitasa son líquidas o secas. Composiciones líquidas contienen la enzima fitasa preferiblemente en una forma purificada o enriquecida. Sin embargo, también pueden añadirse coadyuvantes tales como, por ejemplo, un estabilizador tal como glicerol, sorbita o monopropilenglicol, aditivos tales como sales, azúcares, sustancias conservantes, agentes para el ajuste del valor del pH, proteínas y fitato o sales de mioinositolfosfato (un sustrato de fitasa). Composiciones líquidas típicas son suspensiones acuosas u oleosas. A las composiciones líquidas pueden agregarse un alimento o pienso antes o después de una posible granulación o bien etapa de elaboración.

Composiciones secas pueden ser composiciones liofilizadas, secadas por pulverización, granuladas o extrudidas que pueden contener exclusivamente a la enzima. Sin embargo, antes del secado pueden añadirse también sustancias con el fin de regular el valor del pH, así como otros aditivos y sustancias de relleno tales como maltodextrina, lactosa, leche desnatada en polvo, sales de cationes bivalentes como las de Mg, Ca, Zn, etc. Las composiciones secas pueden ser granulados que pueden mezclarse fácilmente, por ejemplo con alimentos o componentes para piensos o, preferiblemente pueden formar un componente de una pre-mezcla. El tamaño de partículas del granulado enzimático es preferiblemente compatible con el de los otros componentes de la mezcla. Esto posibilita medios seguros y convenientes con el fin de incorporar enzimas, por ejemplo, en alimentos procesados, pre-mezclas o piensos.

Por ejemplo, una formulación estable de la enzima fitasa de acuerdo con la invención se puede preparar pulverizando una mezcla a base de una disolución enzimática líquida sobre un agente de relleno tal como maltodextrina y luego secando la mezcla, o a la disolución enzimática líquida se añade, antes del secado, leche desnatada en polvo al 20%-60% (p/p referido a la proteína total de la disolución enzimática) y/o propionato de calcio al 1%-5% (p/p referido a la proteína total de la disolución enzimática) y ajustando el valor del pH a un valor definido, en particular a pH 5,2 + 0,5. La disminución de la humedad y las interacciones de unión de la fitasa con el agente de relleno protegen a la enzima, adicionalmente a su estabilidad definida en su estructura, frente a influencias del entorno tales como temperaturas que pueden manifestarse durante la preparación del alimento para animales. Formulaciones secas y líquidas pueden estabilizarse ulteriormente si se reduce la actividad de enzimas proteolíticas potenciales que pueden estar presentes como productos secundarios en la mezcla de fermentación líquida que se utiliza para la preparación de la enzima de acuerdo con la invención. La mezcla de enzimas seca, así obtenida, puede utilizarse como suplemento para piensos para uso en la crianza de aves de corral y de cerdos. Además, una reducción de la suplementación de fosfato conduce a una disminución de las impurezas de fosfato que, a su vez, reduce significativamente la contaminación medioambiental a través de la crianza intensiva de animales.

Tan pronto como se haya obtenido un preparado de enzimas seco, a partir del mismo puede prepararse, en etapas adicionales, un granulado de aglomeración. Para ello, se utiliza un mezclador con fuerzas de cizalla elevadas, con lo que el material de relleno y la enzima se co-aglomeran y se forma un granulado. Los granulados de absorción se preparan revistiendo núcleos a base de un material de soporte mediante la enzima de acuerdo con la invención. Materiales de carga típicos son sales tales como sulfato disódico. Otros materiales de carga comprenden caolín, talco, silicato de magnesio y aluminio y fibras de celulosa. Eventualmente también en el granulado de aglomeración se recogen aglutinantes tales como dextrina.

Materiales de soporte típicos comprenden almidón, p. ej. en forma de mandioca, patata y cereales, en particular maíz, arroz y trigo, o productos proteicos tales como, p. ej., proteína de soja. También pueden utilizarse sales. El granulado se recubre eventualmente con una mezcla de revestimiento. Una mezcla de este tipo comprende agente de revestimiento, preferiblemente agente de revestimiento hidrófobo, aceite de palma deshidratado y talco y, eventualmente, otros aditivos tales como carbonato de calcio o caolín con el fin de mejorar la biodisponibilidad en el lugar de acción determinado.

Adicionalmente, las mezclas con fitasa pueden contener otras sustancias tales como agentes colorantes, compuestos aromatizantes, estabilizadores, vitaminas, minerales, otras enzimas para alimentos o piensos, y similares. Esto concierne, en particular, a las denominadas pre-mezclas.

Un aditivo para alimentos o alimentos para animales es un compuesto esencialmente puro o una composición a base de varios compuestos que está destinado o es adecuado para ser añadido a alimentos o alimentos para animales. En particular, es una sustancia que, de acuerdo con su finalidad de uso, se convierte en un componente de un alimento o alimento para animales o afecta a propiedades de un producto alimenticio o de alimento para animales. Así, un aditivo de fitasa debe designar una fitasa que no es ningún componente natural de las sustancias utilizadas principalmente para alimentos o alimentos para animales o que no está presente en ellos en su concentración natural. Por ejemplo, la fitasa es añadida al alimento para animales por separado de las sustancias para alimentos para animales solas o en combinación con otros aditivos de alimentos para animales. Una premezcla típica comprende habitualmente uno o varios compuestos tales como vitaminas, minerales o enzimas potenciadoras de los alimentos para animales y soportes y/o excipientes adecuados.

Un aditivo de fitasa listo para ser utilizado es un aditivo que no se produce in situ en alimentos para animales o en alimentos elaborados. Un aditivo de fitasa listo para ser utilizado puede ser administrado al hombre o a los animales directamente o, de preferencia, directamente después de la mezcladura con otros componentes de los alimentos para animales o de los alimentos. Por ejemplo, un aditivo de alimento para animales de acuerdo con este aspecto de la presente invención es reunido con otros alimentos y aditivos para animales, manteniendo una pre-mezcla o un alimento para animales complementario. Componentes de otros alimentos para animales de este tipo comprenden uno o varios de otros suplementos enzimáticos (preferiblemente termoestables), otros aditivos de alimentos para animales, alimentos para animales minerales y aminoácidos. Los aditivos de alimentos para animales (combinados), así obtenidos, pueden comprender varios tipos de compuestos diferentes y pueden entonces mezclarse en su cantidad adecuada con los alimentos para animales tales como portadores de cereales y proteínas bajo la formación de un alimento para animales compuesto. La elaboración de estos componentes para formar un alimento para animales puede llevarse a cabo después de la mezcladura con dispositivos de tratamiento en sí conocidos, tales como una máquina de doble granulación, un granulador de vapor, un expandidor o una extrusora.

De manera similar, un aditivo para alimentos de acuerdo con esta forma de realización de la presente invención puede reunirse con otros componentes de los alimentos, con lo cual se crean productos alimenticios elaborados. Otros componentes para alimentos de este tipo comprenden uno o varios suplementos enzimáticos, vitaminas, minerales y oligoelementos. El suplemento nutricio combinado, así obtenido, puede entonces mezclarse en una cantidad adecuada con otros componentes de los alimentos tales como cereales y proteínas vegetales, con el fin de proporcionar un alimento elaborado. La elaboración de estos componentes para formar un alimento elaborado puede llevarse a cabo utilizando dispositivos de elaboración en sí conocidos.

En una forma de realización preferida, las composiciones de fitasa de acuerdo con la invención comprenden adicionalmente una cantidad eficaz de una o varias enzimas para alimentos o alimentos para animales, preferiblemente elegidas de alfa-galactosidasas, beta-galactosidasas, lacasas, otras fitasas, fosfatasas, endoglucanasas, en particular endo-beta-1,4-glucanasas, endo-beta-1,3(4)-glucanasas, endo-1,2-beta-glucanasas y endo-1,3-alfa-glucanasas, celulasas, xilosidasas, galactanasas, en particular arabinogalactan-endo-1,4-betagalactosidasas y arabinogalactan-endo-1,3-beta-galactosidasas, enzimas degradadoras de pectinas, en particular pectinasas, pectinesterasas, pectinliasas, poligalacturonasas, arabananasas, ramnogalacturonasas, ramnogalacturonanacetilesterasas, ranmnogalacturonan-alfa-ramnosidasas, pectatliasas y alfa-galacturonidasas, mananasas, beta-mannosidasas, manananacetilesterasas, xilanacetilesterasas, proteasas, xilanasas, arabinoxilanasas y enizmas lipolíticas tales como lipasas, fosfolipasas y cutinasas.

El aditivo de alimentos para animales de acuerdo con la invención es administrado al animal antes o al mismo tiempo con el pienso. Preferiblemente, el aditivo de alimento para animales de acuerdo con la invención es administrado al animal al mismo tiempo con el pienso.

Una cantidad eficaz de fitasa en los alimentos o alimentos para animales asciende a aproximadamente 10-20.000 PPU/kg, de preferencia a aproximadamente 10-15.000 PPU/kg, más preferiblemente a aproximadamente 10

10.000 PPU/kg, todavía más preferiblemente a aproximadamente 50-5.000 PPU/kg, en particular a 50-2.000 PPU/kg de alimento para animales o alimento.

La invención se refiere también al uso de fitasa para la elaboración y la preparación de alimentos y alimentos para animales. Cereales y harinas para alimentos pueden ser tratados enzimáticamente con fitasa, con el fin de reducir

el contenido en fitina de las materias primas. Contenidos en fitina reducidos mejoran la calidad del alimento aumentando la disponibilidad de minerales esenciales tales como hierro, calcio y zinc. Adicionalmente al aumento de la calidad de los alimentos, el uso de fitasa durante la elaboración puede mejorar la eficacia total de la preparación de los alimentos. Por ejemplo, la adición de fitasa a copos de soja blancos durante la preparación de un aislado de proteínas de soja, puede aumentar significativamente el rendimiento y la calidad de la proteína extraíble. En este caso, la fitasa sólo es activa durante la preparación y la elaboración y ya no es activa en el producto final. Este aspecto es de importancia en particular en la preparación de la masa de panificación y durante la panificación y en la producción de otros productos digeribles a base de cereales. De manera similar, componentes de alimentos para animales tales como harina de soja tostada o harina de canola pueden ser tratados previamente con fitasa antes del proceso de preparación propiamente dicho. La separación de factores anti-nutritivos en componentes de alimentos para animales antes de la preparación conduce a una calidad fisiológicamente superior y a sustancias constitutivas de los alimentos para animales más valiosas. En el caso de estos procedimientos de elaboración, la fitasa es activa durante la preparación y ya no es activa, por norma general, en el tracto digestivo del animal después de la ingesta del pienso tratado.

Adicionalmente al uso de fitasa como coadyuvante en la elaboración de alimentos para animales, la presente invención se refiere al uso de la fitasa de acuerdo con la invención como auxiliar de la digestión. Fitasa, en forma de comprimido, puede ser ingerida junto con la ingesta del alimento, con el fin distribuir la enzima activa en el tracto gastrointestinal.

La fitasa de acuerdo con la invención puede pasar a emplearse asimismo de una manera ventajosa tanto en animales monogástricos como poligástricos, en particular en terneros jóvenes. Alimentos para peces y crustáceos pueden ser suplementados asimismo con fitasa, con el fin de mejorar el aprovechamiento del alimento y reducir el contenido en fósforo segregado en el caso de una crianza intensiva de animales. El alimento para animales de acuerdo con la invención puede administrarse también a animales tales como aves de corral, p. ej. pollos de engorde, pavos, gansos, patos así como cerdos, caballos, ganado vacuno, ovejas, cabras, perros y gatos, así como peces y crustáceos. Sin embargo, se prefiere particularmente que el alimento para animales de acuerdo con la invención sea administrado a cerdos o a aves de corral.

Formulaciones de fitasa de acuerdo con la invención pueden combinarse también con otras sustancias constitutivas, con lo cual se forman composiciones de alimentos para animales nuevas y particularmente ventajosas. Dado que, como se ha señalado precedentemente, la disponibilidad de fosfato vegetal en la harina de soja y en cereales es baja como consecuencia de la fijación al ácido fítico, se añade al pienso fosfato inorgánico con el fin de garantizar un suministro adecuado de fósforo a los animales. Sin embargo, estos alimentos para animales contienen demasiado fosfato total y conducen, con ello, a una contaminación del medio ambiente con fosfato. Especialmente, el alimento para animales de acuerdo con la invención comprende la combinación de una fitasa de acuerdo con la invención con sustancias constitutivas de alimentos para animales, con el fin de proporcionar un alimento para animales que tenga contenidos esencialmente más bajos de fósforo inorgánico añadido. En una forma de realización preferida, el alimento para animales de acuerdo con la invención comprende sustancias constitutivas para alimentos para animales típicas, sustancias nutricias, oligoelementos, vitaminas, etc., así como una cantidad eficaz de fitasa y fósforo inorgánico, oscilando las cantidades de la fitasa y del fósforo entre 50 y 20.000 unidades de fitasa/kg de alimento para animales y menos de 0,45% de fósforo inorgánico, preferiblemente entre contenidos de 100-10.000 unidades de fitasa/kg de alimento para animales y menos de 0,225% de fósforo inorgánico, preferiblemente contenidos de 150-10.000 unidades de fitasa/kg de alimentos para animales y menos de 0,15% de fósforo inorgánico, todavía más preferiblemente, contenidos de 200-20.000 unidades de fitasa/kg de alimento para animales y ningún aditivo adicional de fósforo inorgánico.

La invención se refiere también a un procedimiento para mejorar el aumento de peso y la capacidad de aprovechamiento del alimento para animales (relación de conversión de alimentos, FCR) en la alimentación de animales, así como al uso de las fitasas de acuerdo con la invención en estos procedimientos. Una fitasa de acuerdo con la invención permite aumentos mejorados en el peso y una capacidad mejorada de aprovechamiento de los alimentos para animales, en particular en relación con el alimento para animales que contiene poco fosfato inorgánico. Conforme al procedimiento de acuerdo con la invención, el contenido en fosfato inorgánico en el alimento para animales puede reducirse a contenidos de 0,45%, preferiblemente inferiores a 0,225%. Preferiblemente, no se añade fosfato inorgánico alguno. Mediante una disponibilidad incrementada de fosfato como consecuencia de la adición de la enzima de acuerdo con la invención, la mineralización de los huesos de los animales se puede mejorar significativamente, lo cual es de gran importancia, en particular en el caso de animales de rápido crecimiento.

De acuerdo con todavía otra forma de realización, la invención se refiere al uso de la enzima de acuerdo con la

invención en la panificación, con lo cual se mejora el desarrollo, la elasticidad y/o estabilidad de la masa de panificación y/o el volumen, la estructura de la corteza y/o la resistencia del artículo panificado frente a las prácticas de panificar antiguas. A pesar de que el preparado enzimático de acuerdo con la invención puede ser utilizado para la preparación de masa de panificación o productos panificados de tipos arbitrarios de harina, p. ej. a 5 base de centeno, cebada, avena o maíz, el preparado enzimático de acuerdo con la invención se manifestó particularmente útil en la preparación de masas de panificación o productos panificados de trigo o de una parte esencial de trigo. Los productos panificados que se pueden preparar con el preparado enzimático de acuerdo con la invención, comprenden pan, panecillos, baguetes y similares. Para la panificación, el preparado enzimático de acuerdo con la invención puede utilizarse con otra actividad enzimática tal como, p. ej. xilanasa, lipasa, amilasa,

10 oxidasa o lacasa, junto a la fitasa o puede utilizarse en combinaciones con otras enzimas tales como lipasa, amilasa, oxidasa (p. ej. glucosaoxidasa, peroxidasa).

Además de ello, se describen los siguientes objetos:

15 1. Molécula de ADN recombinante que, después de la expresión en una célula hospedadora procariótica o eucariótica, codifica un polipéptido con actividad de fitasa, comprendiendo la molécula de ADN recombinante una secuencia de ADN elegida de a) secuencias de ADN que codifican un polipéptido con actividad de fitasa que ha sido obtenido

mediante variación de la secuencia de fitasa de tipo salvaje madura de E. coli, en donde la

20 variación se elige de i) la mutación lisina → ácido aspártico en la posición 74 (K74D) y/o ii) una combinación de las mutaciones asparagina → arginina en la posición 139 (N139R)

y ácido aspártico → ácido glutámico en la posición 142 (D142E), y/o iii) una combinación de las mutaciones leucina → isoleucina en la posición 145 (L145I) y

25 leucina → isoleucina en la posición 198 (L198I), y/o iv) una mutación valina → prolina en la posición 200 (V200P) y/o v) una adición N-o C-terminal o una adición N- y C-terminal de un segmento de la

secuencia de la fosfatasa ácida de Aspergillus niger var. awamori, o de la fitasa de Aspergillus niger, 30 b) secuencias de ADN que presentan una homología de 70% a 100% con respecto a las secuencias conforme a a), c) secuencias de ADN que, en virtud de la degeneración del código genético, están emparentadas con las secuencias conforme a a) y b), en donde la molécula de ADN recombinante, en el caso de una expresión en una célula hospedadora

35 adecuada, va acompañada de una estabilidad térmica y frente a proteasas incrementada de la actividad enzimática de la proteína así codificada, presentándose las variaciones iii) y iv) sólo en combinación con una variación i), ii) y/o v), o presentándose conjuntamente con una variación i), ii) y/o v).

2. Molécula de ADN recombinante según el objeto 1, caracterizada por que la secuencia de ADN comprende 40 la variación N139R y D142E del polipéptido codificado.

3. Molécula de ADN recombinante según el objeto 1, caracterizada por que la secuencia de ADN comprende al menos la variación V200P del polipéptido codificado.

45 4. Molécula de ADN recombinante según el objeto 1, caracterizada por que la secuencia de ADN comprende la variación K74D del polipéptido codificado.

5. Molécula de ADN recombinante según el objeto 1, caracterizada por que la secuencia de ADN comprende

al menos las variaciones L145I y L198I del polipéptido codificado. 50

6.

Molécula de ADN recombinante según el objeto 1, caracterizada por que la secuencia de ADN comprende al menos las variaciones K74D, N139R, D142E y V200P del polipéptido codificado.

7.

Molécula de ADN recombinante según el objeto 1, caracterizada por que la adición N-terminal del

55 polipéptido codificado comprende la secuencia FSYGAAIPQS TQEKQFSQEF RDGYSILKHY GGNGPYSERV SYGIARDPPTS.

8. Molécula de ADN recombinante según el objeto 1, caracterizada por que la adición C-terminal del

polipéptido codificado comprende la secuencia LSFWWNYNTT TELNYRSSPI ACQEGDAMD. 60

9. Molécula de ADN recombinante según el objeto 1, caracterizada por que la adición N-terminal del polipéptido codificado comprende la secuencia FSYGAAIPQS TQEKQFSQEF RDGYSILKHY GGNGPYSERV SYGIARDPPTS y la adición C-terminal del polipéptido codificado comprende la secuencia LSFWWNYNTT TELNYRSSPI ACQEGDAMD.

10. Molécula de ADN recombinante según uno de los objetos 1 a 8, caracterizada por que comprende una secuencia elegida de las secuencias SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21.

10 11. Polipéptido que posee actividad de fitasa y que es codificado por una molécula de ADN recombinante según uno de los objetos 1 a 10 o que se obtiene mediante la expresión de una célula hospedadora transformada con el mismo.

12. Polipéptido según el objeto 11, caracterizado por que comprende una secuencia elegida de SEQ ID NO: 15 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22.

13. Construcción de ADN con la capacidad de, después de la introducción en una célula hospedadora adecuada, controlar la expresión de un gen fitasa mutado en un hospedador, caracterizada por que contiene eventualmente un promotor, eventualmente secuencias señal y marcadoras, una secuencia de

20 ADN según una de las reivindicaciones 1 a 10, un terminador y, eventualmente, secuencias flanqueantes en 5’ y 3’.

14. Construcción de ADN según el objeto 13, caracterizada por que en el caso del promotor se trata del

promotor de celobiohidrolasa-I, de celobiohidrolasa-II, de amilasa, de glucoamilasa, de xilanasa o de 25 enolasa.

15. Construcción de ADN según el objeto 14, caracterizada por que en el caso de la secuencia señal y/o de las secuencias flanqueantes en 5’ y 3’ se trata de secuencias señal de fitasa eventualmente modificadas de Aspergillus niger.

16.

Vector con capacidad de transformar una célula hospedadora, caracterizado por que el vector contiene una construcción según el objeto 13.

17.

Vector según el objeto 16, caracterizado por que se elige del plásmido pET-PhyM2, depositado bajo el

35 número de depósito DSM 18715, el plásmido pUC-PhyM3, depositado bajo el número de depósito DSM 18717, el plásmido pET-PhyM7, depositado bajo el número de depósito DSM 18716, el plásmido pUC-PhyM9, depositado bajo el número de depósito DSM 18718, el plásmido pUC-PhyM10, depositado bajo el número de depósito DSM 18719, el plásmido pPhy2005, depositado bajo el número de depósito DSM18720, el plásmido pPhy2006, depositado bajo el número de depósito DSM 18721.

18. Célula hospedadora transformada, elegida de hongos, levaduras, bacterias y células de mamíferos, que contiene una molécula de ADN recombinante según uno de los objetos 1 a 10 y provista de la capacidad de expresar un polipéptido con actividad de fitasa.

45 19. Célula hospedadora transformada según el objeto 18, caracterizada por que pertenece al género Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma, Neurospora, Mucor o Penicilium.

20. Procedimiento para la producción de fitasa, caracterizado por que se cría una célula hospedadora

transformada según el objeto 18 ó 19 bajo condiciones que fomentan la formación de fitasa y se aísla la 50 fitasa así producida.

21. Composición que comprende un polipéptido según el objeto 11 ó 12, eventualmente junto con otros coadyuvantes y/o sustancias activas.

55 22. Composición según el objeto 21, caracterizada por que contiene leche desnatada en polvo y/o propionato de calcio.

23. Composición según el objeto 21, caracterizada por que la composición es una composición de alimentos

o alimentos para animales. 60

24. Composición según el objeto 21, 22 ó 23, caracterizada por que la composición es un producto panificado.

25. Uso de un polipéptido según el objeto 11 ó 12 para la preparación de un preparado para mejorar el 5 aprovechamiento del fosfato de la alimentación en animales y hombres.

26. Uso de un polipéptido según el objeto 11 ó 12 para mejorar las propiedades reológicas de masas de panificación para la preparación de artículos de panadería.

10 27. Uso de una variación de la secuencia de fitasa de tipo salvaje madura de E. coli, elegida de i) la mutación lisina → ácido aspártico en la posición 74 (K74D) y/o ii) una combinación de las mutaciones asparagina → arginina en la posición 139 (N139R)

y ácido aspártico → ácido glutámico en la posición 142 (D142E), y/o iii) una combinación de las mutaciones leucina → isoleucina en la posición 145 (L145I) y

15 leucina → isoleucina en la posición 198 (L198I), y/o iv) una mutación valina → prolina en la posición 200 (V200P) y/o v) una adición N-o C-terminal o una adición N- y C-terminal de un segmento de la

secuencia de la fosfatasa ácida de Aspergillus niger var. awamori, o de la fitasa de Aspergillus niger,

20 para la preparación de una molécula de ADN recombinante que, después de la expresión en una célula hospedadora procariótica o eucariótica codifica un polipéptido con actividad de fitasa que posee una estabilidad térmica y frente a proteasas incrementada.

28. Uso según el objeto 27, caracterizado porque la variación es K74D. 25

29.

Uso según el objeto 27, caracterizado porque la variación es N139R y D142E.

30.

Uso según el objeto 27, caracterizado porque la variación es L145I y L198I.

30 31. Uso según el objeto 27, caracterizado porque la variación es V200P.

32. Uso según el objeto 27, caracterizado porque la variación es K74D, N139R, D142E, V200P.

33. Uso según el objeto 27, caracterizado porque la variación es la adición N-terminal de la secuencia 35 FSYGAAIPQS TQEKQFSQEF RDGYSILKHY GGNGPYSERV SYGIARDPPTS.

34. Uso según el objeto 27, caracterizado porque la variación es la adición C-terminal de la secuencia LSFWWNYNTT TELNYRSSPI ACQEGDAMD.

40 35. Uso según el objeto 27, caracterizado porque la variación es la adición N-terminal de la secuencia FSYGAAIPQS TQEKQFSQEF RDGYSILKHY GGNGPYSERV SYGIARDPPTS y la adición C-terminal de la secuencia LSFWWNYNTT TELNYRSSPI ACQEGDAMD.

Las Figuras adjuntas muestran: 45 Fig. 1: mapa de plásmidos de PET-PhyM2

Fig. 2: mapa de plásmidos de pAB490-PhyM2

50 Fig. 3: mapa de plásmidos de pUC-PhyM3

Fig. 4: mapa de plásmidos de pAB489-PhyM3

Fig. 5: mapa de plásmidos de pUC-PhyM10 55 Fig. 6: mapa de plásmidos de pAB600-PhyM10

Fig. 7: mapa de plásmidos de pPhy2005

60 Fig. 8: mapa de plásmidos de pAB-Phy2005

Fig. 9: mapa de plásmidos de pPhy2006

Fig. 10: mapa de plásmidos de pAB-Phy2006 5 Fig. 11: comparación de las secuencias de mutantes individuales y variantes a base de la secuencia de tipo salvaje (Dassa). Están destacadas las mutaciones o bien variaciones.

Los siguientes ejemplos explican con mayor detalle la invención. 10

Ejemplos

Ejemplo 1 - Determinación de la actividad de fitasa

15 La actividad de fitasa se midió en una mezcla de ensayo a base de 0,5% de ácido fítico (aproximadamente 5 mM), citrato de sodio 200 mM, pH 5,0. Después de incubación durante 15 minutos a 37ºC, se detuvo la reacción mediante la adición de un volumen igual de ácido tricloroacético al 15%. Los iones fosfato liberados se determinaron cuantitativamente a 820 nm por mezcladura de 100 μl de la mezcla de ensayo con 900 μl de H2O y 1 ml de H2SO4 0,6 M, 2% de ácido ascórbico y 0,5% de molibdato de amonio, después de incubación a 50ºC y de un

20 tiempo de 20 min. Como referencia se utilizaron unas disoluciones patrón de fosfato de potasio.

Ejemplo 2 - Construcción de los plásmidos pET-PhyM2 y pAB490-PhyM2 (genotipo PhyM2)

La construcción del plásmido pAB490-PhyM2 se efectuó mediante las siguientes etapas: 25

1. Construcción del pET-PhyM2

El plásmido pET-PhyM2 contiene la secuencia de la fitasa de E. coli (Dassa et al. 1990, n° de acceso M58740) con las modificaciones de los aminoácidos N139R y D142E.

30 La secuencia de ADN, que con el codón CAG (Gln) en la posición 1 comprende un marco de lectura abierto de 1230 pb y que codifica una enzima con 410 aminoácidos, fue introducida utilizando el uso de codones de T. reesei (http://www.kazusa.or.jp/codon) en el plásmido pET26b(+) (Novagen, Alemania, modificado por Brain, Alemania). Para la realización de las mutagénesis se utilizó un método orientado a oligonucleótidos basado en una PCR.

35 Partiendo del plásmido que contiene el gen que codifica la secuencia de aminoácidos de Dassa de tipo salvaje, para cada triplete a intercambiar se sintetizaron dos cebadores complementarios con las respectivas mutaciones, estando localizada la mutación en cada caso en el centro del cebador. Con ayuda de los dos cebadores se amplificó entonces el plásmido total. El plásmido obtenido con las mutaciones para el genotipo M2 tiene la denominación pET-PhyM2.

40 Para la construcción se utilizaron los siguientes cebadores.

b) Para las mutaciones adicionales incorporadas seguidamente en la posición 142:

El plásmido está representado en la Fig. 1 y fue depositado bajo el número de depósito DSM 18715 el 18.10.2006.

2. Construcción de pAB490-PhyM2

Para la construcción del plásmido pAB490-PhyM2 se amplificó el gen PhyM2 que codifica la fitasa de E. coli, a partir del plásmido pET-PhyM2 mediante una PCR. El producto de la PCR fue cortado con las enzimas de restricción SpeI y PacI y fue insertado en los sitios de corte con SpeI y PacI detrás del fragmento del gen cbhII de

T. reesei en el plásmido pAB490. Con ello resultó un marco de lectura abierto, que codifica la fusión CBHII-KexII-PhyM2.

5 El plásmido resultante tiene la denominación pAB490-PhyM2 (Fig. 2) y fue representado en mapa mediante endonucleasas de restricción. La secuencia de la fitasa fue confirmada mediante secuenciación.

El plásmido pAB490 se basa en pUC18 y contiene el fragmento del gen cbhII (los nucleótidos 1-307 corresponden a los aminoácidos M1 hasta S86, Teeri et al., 1987, Gene 51: 43-52, n° de acceso 16190) bajo el control del 10 promotor de cbhI y del terminador de cbhI procedentes del plásmido pALK487 (documento WO 94/28117). Un fragmento de EcoRI/SpeI del plásmido PALK424 con una longitud de 4,78 kb, de extremos lisos (documento WO 93/24621), que contenía el marcador de amdS y las secuencias flanqueantes en 3' de cbhI, se incorporó en el sitio de corte con StuI en el extremo 3’ del terminador de cbhI. Además de ello, se introdujeron otros sitios de corte (con SpeI y PacI) aguas abajo del fragmento del gen cbhII. Estos sitios de corte se utilizaron para la clonación directa

15 de las variantes de la fitasa.

La casete de expresión aislada a partir del plásmido pAB490-PhyM2 contiene el siguiente material genético:

Promotor de cbhI (celobiohidrolasa I): el fragmento de EcoRI/SacII de 2,2 kb, que contiene el promotor de cbhI,

20 procede de Trichoderma reesei QM6a. La región de promotor funciona también como un ADN homólogo (junto con el fragmento de 3' de cbhI; véase más adelante), con el fin de controlar la integración del ADN transformante en el locus de cbhI.

Fragmento del gen cbhII: el fragmento del gen cbhII de 307 pb con su secuencia de señal se encuentra 25 directamente bajo el control del promotor de cbhI.

La secuencia de la fitasa de E. coli, que contiene la mutación de los aminoácidos N139R y D142E, se ha fusionado mediante un sitio de corte con KexII en el extremo de 3’ del fragmento del gen cbhII. La secuencia Kex contiene los siguientes aminoácidos: RTLVKR.

30 Terminador de cbhI: el fragmento de BamHI/StuI de una longitud de 0,75 kb, que contiene el terminador de cbhI, se agregó a continuación de la fitasa de E. coli, con el fin de garantizar la terminación de la transcripción.

Gen amdS: el gen, inclusive su promotor y su terminador, se aisló a partir de Aspergillus nidulans VH1-TRSX6 y

35 codifica la acetamidasa (Hynes et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 1430-1439; Kelly y Hynes, 1985, EMBO J. 4:475479). La acetamidasa permite a la cepa crecer utilizando acetamida como única fuente de nitrógeno y esta característica se utilizó para la selección de los transformantes

Fragmento de 3' de cbhI: el fragmento (1,7 kb, BamHI/EcoRI, que comienza 1,4 kb detrás del codón de detención

40 del gen) se aisló a partir de T. reesei ALKO2466. La cepa ALKO2466 procede de la cepa ALKO233 (Harkki et al., 1991, Enzyme Microb. Technol. 13: 227-233). El fragmento de 3' se utiliza en común con la región de promotor, con el fin de integrar de un modo dirigido al objetivo la casete de expresión de la fitasa en el locus de cbhI mediante recombinación homóloga.

45 La secuencia del plásmido pAB490-PhyM2 fue confirmada mediante representación en mapa con enzimas de restricción y secuenciación.

Ejemplo 3 - Construcción de los plásmidos pET-PhyM7 y pAB490-PhyM7 (genotipo PhyM7)

50 El plásmido pET-PhyM7 contiene la secuencia de la fitasa de E. coli (Dassa et al., 1990, n° de acceso M58740) utilizando el uso de codones de T. reesei (http://www.kazusa.or.jp/codon) con la mutación K74D. La construcción así como la clonación del plásmido pET-PhyM7 tuvieron lugar de una manera análoga a la producción descrita en el Ejemplo 2 del plásmido pET-PhyM2. Los cebadores utilizados para la introducción de las mutaciones en la posición de aminoácido 74 son:

55 El plásmido pET-PhyM7 ha sido depositado bajo el número de depósito DSM 18716 el 18.10.2006.

La construcción así como la clonación del plásmido pAB490-PhyM7 tuvieron lugar de una manera análoga a la producción descrita en el Ejemplo 2 del plásmido pAB490-PhyM2. La secuencia del plásmido pAB490-PhyM7 fue

5 confirmada mediante secuenciación. La casete de expresión aislada a partir del plásmido pAB490-PhyM7 contiene, por lo tanto, con la excepción de la nueva secuencia específica de la fitasa del genotipo PhyM7, los mismos elementos que se han descrito en el Ejemplo 2.

Ejemplo 4 - Construcción de los plásmidos pUC-PhyM3 y pAB489-PhyM3 (genotipo PhyM3)

10 La variante de fitasa PhyM3 contiene la secuencia de la fitasa de E. coli (Dassa et al., nº de acceso M58740) utilizando el uso de codones de T. reesei (http://www.kazusa.or.jp/codon) con la mutación V200P. La secuencia de ADN con el codón CAG (Gln) en la posición 1 abarca un marco de lectura abierto de 1230 pb y codifica una enzima con 410 aminoácidos. Se utilizó el péptido de señal con una longitud de 18 aminoácidos de la fitasa de A.

15 niger, con el fin de segregar el mutante de la fitasa de E. coli a partir de Trichoderma reesei.

Partiendo del plásmido que contiene el gen que codifica la secuencia de aminoácidos de Dassa de tipo salvaje, se llevó a cabo la mutación V200P mediante el método de PCR de una manera análoga al principio de Tomic et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18(6), 1656) y de Valette et al. (1989, Nucleic Acids Research, 17(2), 723-733). El 20 producto de la PCR fue cortado con AvrII y PacI e insertado en los sitios de disociación con SpeI y PacI detrás del promotor de cbhI de T. reesei en el plásmido pAB489. En el plásmido pAB489-PhyM3 resultante de nuevas, el gen para la variante de la fitasa de E. coli PhyM3 con la secuencia de señal modificada de la fitasa de A. niger -MGVSAILLPLYLLSGVTS-(Mullaney et al., Appl Microbiol Biotechnol, 1991, 35(5), 611-614, n° de acceso M94550) está directamente bajo el control del promotor de cbhI. Se utilizó el péptido de señal con una longitud de 18

25 aminoácidos de la fitasa de A. niger, con el fin de segregar el mutante de la fitasa de E. coli a partir de Trichoderma reesei. Los 16 pares de bases (CCGCGGACTGCGCATC atg) situados aguas arriba del codón de iniciación, que pertenecen al promotor de T. reesei (Shoemaker et al., 1983, Bio/Technology 1, 691-696), fueron modificados después de la incorporación del fragmento AvrII-PacI de la fitasa en los sitios de disociación con SpeI y PacI en el plásmido pAB489 para dar CCGCGGACTAGGCATC atg.

30 La construcción artificial pAB489-PhyM3 (Fig. 4) fue confirmada mediante representación en mapa y secuenciación.

La construcción del plásmido pAB489 se efectuó mediante las siguientes etapas:

35 A partir del plásmido pALK487 (documento WO 94/28117), mediante introducción de otros sitios de corte (con SpeI y PacI, CCGCGGACTAGTCCTTAATTAACCGCGG) en el sitio de SacII entre el promotor de cbhI y el terminador de cbhI, se produjo el plásmido pAB487. Los sitios de corte con SpeI y PacI se utilizan para la clonación directa de las variantes de la fitasa. Un fragmento de EcoRI/SpeI con una longitud de 4,78 kb, de

40 extremos lisos, del plásmido pALK424 (documento WO 93/24621), que contenía el marcador de amdS y las secuencias flanqueantes en 3' de cbhI, se insertó en el sitio de disociación con StuI de pAB487, con lo que se obtuvo el vector pAB489.

La casete de expresión aislada a partir de pAB489-PhyM3 contiene el siguiente material genético:

45 Promotor de cbhI (celobiohidrolasa I): el fragmento de EcoRI/SacII de 2,2 kb, que contiene el promotor de cbhI, procede de Trichoderma reesei QM6a. La región de promotor funciona también como un ADN homólogo (junto con el fragmento de 3' de cbhI; véase más adelante), con el fin de controlar la integración del ADN transformante en el locus de cbhI.

50 Secuencia de señal: Se utilizó el péptido de señal modificado de la fitasa de A. niger con el fin de segregar la fitasa de E. coli a partir de Trichoderma reesei.

La fitasa de E. coli con la secuencia de la mutación V200P, inclusive la secuencia de señal de la fitasa de A. niger, 55 se insertó entre el promotor de cbhI y el terminador de cbhI.

Terminador de cbhI: el fragmento de BamHI/StuI con una longitud de 0,75 kb, que contiene el terminador de cbhI, se agregó a continuación de la fitasa de E. coli, con el fin de garantizar la terminación de la transcripción.

60 Gen amdS: El gen, inclusive su promotor y su terminador, se aisló a partir de Aspergillus nidulans VH1-TRSX6 y codifica la acetamidasa (Hynes et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 1430-1439; Kelly y Hynes, 1985, EMBO J. 4:475479). La acetamidasa permite a la cepa crecer utilizando acetamida como única fuente de nitrógeno y esta característica se utilizó para la selección de los transformantes.

5 Fragmento de 3' de cbhI: el fragmento (1,7 kb, BamHI/EcoRI, que comienza 1,4 kb detrás del codón de detención del gen) se aisló a partir de T. reesei ALKO2466. La cepa ALKO2466 procede de la cepa ALKO233 (Harkki et al., 1991, Enzyme Microb. Technol. 13: 227-233). El fragmento de 3' se utilizó junto con la región de promotor, con el fin de integrar de un modo dirigido al objetivo la casete de expresión de la fitasa en el locus de cbhI mediante recombinación homóloga.

10 El gen de la variante de la fitasa PhyM3 se clonó en el plásmido pAB2004. El plásmido obtenido tiene la denominación pUC-PhyM3 (Fig. 3) y fue depositado como DSM 18717 de acuerdo con las condiciones precedentemente mencionadas.

15 El plásmido pAB2004 se basa en el plásmido pUC18 y fue producido mediante introducción de otros sitios de corte en los sitios de HindIII-EcoRI.

Ejemplo 5 - Construcción de los plásmidos pUC-PhyM9 y pAB489-PhyM9 (genotipo PhyM9)

20 La variante de la fitasa PhyM9 contiene la secuencia de la fitasa de E. coli (Dassa et al. 1990, n° de acceso M58740) como un gen sintético utilizando el uso de codones de T. reesei (http://www.kazusa.or.jp/codon) con las mutaciones L145I y L198I. La secuencia de ADN con el codón CAG (Gln) en la posición 1 comprende un marco de lectura abierto de 1230 pb y codifica una enzima con 410 aminoácidos.

25 En el plásmido pAB489-PhyM9, el gen que codifica la variante de la fitasa de E. coli PhyM9 con la secuencia de señal de la fitasa de A. niger (MGVSAVLLPLYLLSGVTS) Mullaney et al., Appl Microbiol Biotechnol, 1991, 35(5), 611-614, n° de acceso M94550) se encuentra directamente bajo el control del promotor de cbhI. El péptido de señal con una longitud de 18 aminoácidos de la fitasa de A. niger se utilizó con el fin de segregar el mutante de la fitasa de E. coli a partir de Trichoderma reesei.

30 La construcción de pAB489-PhyM9 y pUC-PhyM9 tuvo lugar de una manera análoga a la de los plásmidos pAB489-PhyM3 y pUC-PhyM3 en el Ejemplo 4 y contiene con ello, con la excepción de la secuencia de señal de A. niger y la secuencia específica de la fitasa de E. coli, los mismos elementos genéticos.

35 El plásmido pUC-PhyM9 fue depositado bajo el número de depósito DSM 18718 el 18.10.2006.

Ejemplo 6 - Construcción de los plásmidos pUC-PhyM10 y pAB600-PhyM10, que codifican mutantes múltiples (genotipo PhyM10)

40 El plásmido pAB600-PhyM10 contiene la secuencia de la fitasa de E. coli con las modificaciones de los aminoácidos K74D, N139R, D142E y V200P. A partir de los plásmidos pAB490-PhyM2, pAB490-PhyM7 y pAB489-PhyM3 se produjo el gen que codifica la variante de la fitasa PhyM10 mediante el método de PCR de una manera análoga al principio de Tomic et al. (1990), Nucleic Acids Research, 18(6), 1656) y Vallette et al. (1989), Nucleic Acids Research, 17(2), 723-733). El producto de PCR se cortó con SpeI y PacI y se insertó en los sitios de

45 disociación con SpeI y PacI en el plásmido pAB600.

El plásmido pAB600-PhyM10 resultante (véase la Fig. 6) fue confirmado mediante representación en mapa y secuenciación.

50 En el plásmido pAB600-PhyM10 se fusionó la secuencia de la fitasa de E. coli por medio de un sitio de corte con KexII junto al extremo de 3’ del fragmento del gen CBHII. La secuencia de Kex contiene los siguientes aminoácidos RTLVKR.

La construcción del plásmido pAB600 se efectuó mediante las siguientes etapas:

55 El plásmido pAB1280 se basa en pUC18 y contiene el fragmento del gen cbhII (nucleótidos 1-307, que corresponden a los aminoácidos M1 hasta S86, Teeri et al., 1987, Gene 51: 43-52, n° de acceso 16190) bajo el control del promotor de cbhI y del terminador de cbhI procedentes del plásmido pALK487 (documento WO 94/28117) . Además de ello, se introdujeron otros sitios de corte (con SpeI y PacI) aguas abajo del fragmento del

60 gen cbhII. Estos sitios de corte se utilizan para la clonación directa de la variante de la fitasa.

A partir del plásmido p3SR2 (Hynes et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3, 1430-1439; Kelly y Hynes, 1985, EMBO J. 4, 475-479) se aisló el gen de la acetamidasa (amdS) mediante el método de PCR como el fragmento de AscI y NruI, y se insertó en el plásmido pAB1280 cortado con AscI/StuI.

Para la amplificación del gen amdS de derivaron los siguientes cebadores a partir de la información de la secuencia del gen de acetamidasa de A. nidulans.

10 El plásmido obtenido tiene la denominación pAB600 y fue confirmado mediante representación en mapa y secuenciación.

El gen de la variante de la fitasa PhyM10 se clonó en el plásmido pAB2004. El plásmido pUC-PhyM10 está 15 representado en la Fig. 5 y ha sido depositado bajo el número de depósito DSM 18719 el 18.10.2006.

Ejemplo 7 -Construcción de los plásmidos pPhy2005 y pAB-Phy2005 (genotipo Phy2005)

La construcción del plásmido pAB-Phy2005 se efectuó mediante las siguientes etapas: 20

1. Construcción de pPhy2005

El plásmido pPhy2005 contiene la fusión del gen (ap) de la fosfatasa ácida de A. niger var. awamori (Piddington et al., 1993, Gene 133(1), 55-62; n° de acceso L02420) y del gen de la fitasa de E. coli utilizando el uso de codones

25 de T. reesei (http://www.kazusa.or.jp/codon) (Dassa et al. 1990, n° de acceso M58740). Con ello resulta un marco de lectura abierto, que codifica una variante de la fitasa con 457 aminoácidos, habiendo sido reemplazados los primeros cuatro (4) aminoácidos del gen de la fitasa de E. coli por los primeros cincuenta y uno (51) aminoácidos del gen de la fosfatasa ácida. Para la secreción de la proteína, consistente en la fusión de la fosfatasa ácida y de la fitasa de E. coli en T. reesei, se utilizó la secuencia de señal de la fosfatasa ácida.

30 La fusión de la secuencia de la fosfatasa ácida de A. niger var. awamori y de la secuencia de la fitasa de E. coli, producida utilizando el uso de codones de T. reesei, fue sintetizada y clonada en el plásmido pUC18. El plásmido pPhy2005 obtenido fue confirmado mediante secuenciación.

35 El plásmido está representado en la Fig. 7 y ha sido depositado bajo el número de depósito DSM 18720 el 18.10.2006.

2. Construcción de pAB-Phy2005

40 Para la construcción del plásmido pAB-Phy2005, la secuencia de la fusión de la fosfatasa y de la fitasa procedente del plásmido pPhy2005 se cortó con AvrII y PacI y se insertó en el plásmido pAB489 en los sitios de corte con SpeI y PacI detrás del promotor de cbhI de T. reesei. El plásmido resultante tiene la denominación pAB-Phy2005 (Fig. 8) y fue representado en mapa mediante endonucleasas de restricción y la secuencia de la fitasa fue confirmada mediante secuenciación.

45 El pAB-Phy2005 aislado a partir de la casete de expresión contiene el siguiente material genético:

Promotor de cbhI (celobiohidrolasa I): el fragmento de EcoRI/SacII de 2,2 kb, que contiene el promotor de cbhI, procede de Trichoderma reesei QM6a. La región de promotor funciona también como un ADN homólogo (junto con 50 el fragmento de 3' de cbhI; véase más adelante), con el fin de controlar la integración del ADN transformante en el locus de cbhI.

Fragmento del gen de la fosfatasa ácida: el fragmento del gen de la fosfatasa ácida con su secuencia de señal se encuentra directamente bajo el control del promotor de cbhI. Los 16 pares de bases (CCGCGGACTGCGCATC atg) 55 situados aguas arriba del codón de iniciación, que pertenecen al promotor de T. reesei (Shoemaker et al. 1983,

Bio/Technology 1, 691-696), fueron modificados después de la incorporación del fragmento de AvrII-PacI de la fusión de la fosfatasa y la fitasa para dar CCGCGGACTAGGCATC atg.

Gen de la fitasa de E. coli: el gen sintético de la fitasa de E. coli se ha fusionado directamente en el extremo de 3’ 5 de la secuencia de la fosfatasa ácida para dar un marco de lectura abierto.

Terminador de cbhI: el fragmento de BamHI/StuI con una longitud de 0,75 kb, que contiene el terminador de cbhI, se agregó a continuación de la fitasa de E. coli, con el fin de garantizar la terminación de la transcripción.

10 Gen amdS: el gen, inclusive su promotor y su terminador, se aisló a partir de Aspergillus nidulans VH1-TRSX6 y codifica la acetamidasa (Hynes et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 1430-1439; Kelly y Hynes, 1985, EMBO J. 4:475479). La acetamidasa permite a la cepa crecer utilizando acetamida como única fuente de nitrógeno y esta característica se utilizó para la selección de los transformantes.

15 Fragmento de 3' de cbhI: El fragmento (1,7 kb, BamHI/EcoRI, que comienza 1,4 kb detrás del codón de detención del gen) se aisló a partir de T. reesei ALKO2466. La cepa ALKO2466 procede de la cepa ALKO233 (Harkki et al., 1991, Enzyme Microb. Technol. 13: 227-233). El fragmento de 3' se utiliza junto con la región de promotor, con el fin de integrar de un modo dirigido al objetivo la casete de expresión de la fitasa en el locus de cbhI mediante recombinación homóloga.

Ejemplo 8 -Construcción de los plásmidos pPhy2006 y pAB-Phy2006 (genotipo Phy2006)

La construcción del plásmido pAB-Phy2006 se efectuó mediante las siguientes etapas:

25 1. Construcción de pPhy2006

Para la construcción del plásmido pPhy2006, el fragmento del gen ap con una longitud de 87 pb, que codifica los 29 aminoácidos pertenecientes al extremo C del gen ap de la fosfatasa ácida de A. niger var. awamori, se fusionó directamente a la secuencia de ADN que codifica el último aminoácido (leucina) de la fitasa de E. coli, en el

30 plásmido pPhy2005. Con ello resulta un marco de lectura abierto de 486 aminoácidos.

La fusión Phy2006 procedente de la secuencia de la fosfatasa ácida de A. niger var. awamori y de la secuencia de la fitasa de E. coli producida utilizando el uso de codones de T. reesei fue sintetizada y clonada en el plásmido pUC18. La nueva secuencia contenida en el plásmido pPhy2006 obtenido fue confirmada mediante secuenciación.

35 El plásmido está representado en la Fig. 9 y ha sido depositado bajo el número de depósito DSM 18721 el 18.10.2006.

2. Construcción de pAB-Phy2006

40 La construcción así como la clonación del plásmido pAB-Phy2006 son idénticas a la producción del plásmido pAB-Phy2005 descrita en el Ejemplo 7.

La secuencia de la variante de la fitasa pAB-Phy2006 (Fig. 10) fue confirmada mediante secuenciación. 45

Ejemplo 9 - Transformación de T. reesei

T. reesei RH 3780d fue transformado por separado con las casetes de expresión linealizadas, aisladas a partir de los plásmidos pAB489-PhyM3, pAB490-PhyM2, pAB490-PhyM7, pAB489-PhyM9, pAB600-PhyM10, pAB-Phy2005

50 y pAB-Phy2006. Las técnicas utilizadas para la transformación y la manipulación de T. reesei eran las utilizadas según Penttilä et al. (1987, Gene 61: 155-164). Los transformantes fueron seleccionados y purificados dos veces mediante aislamiento de esporas individuales. Entre todos los transformantes se escogieron aquéllos que tenían la más alta potencia de secreción y se utilizaron ulteriormente en el Ejemplo 10 para la producción de un material enzimático. Los transformantes utilizados están recopilados en la siguiente Tabla 2.

Tabla 2: Listado de los transformantes para otros ensayos en los Ejemplos 10 - 13.

Genotipo

Transformante

Wt (pKDa4)

RH 31071

pKDa2 (V200Y; M1)

RH 31068

PhyM2

RH 31575

PhyM3

RH 31545

PhyM7

RH 31507

PhyM9

RH 31686

PhyM10

RH 31898

Phy2005

RH 31676

Phy2006

RH 31677

Ejemplo 10 - Producción de enzima con los mutantes individuales

5 A) Producción de disoluciones enzimáticas mediante fermentación en matraces de sacudimiento

Los transformantes, que portan las casetes de expresión de los Ejemplos 2 a 8, o bien los transformantes con el plásmido pKDa2 (M1) y pKDa4 (secuencia de aminoácidos de la fitasa de E. coli de tipo salvaje según Dassa) 10 procedentes del documento DE 10 2004 050 410, se cultivaron en matraces de sacudimiento con regulación del pH en una instalación DASGIP sobre un medio inductor de la celulasa con la siguiente composición: 10,5% (p/v) de lactosa, 5,25% (p/v) de DSG, 0,63% (p/v) de (NH4)2SO4, resto agua del grifo, con un ajuste del valor del pH a 4,5 antes de la esterilización. Después de inoculación, en el matraz de sacudimiento se estableció un gradiente de valores del pH en el espacio de 5 h a pH 3,3. Los filtrados del cultivo, obtenidos después de un cultivo durante 6 15 días con una regulación del valor del pH a un pH de 3,3, se utilizaron para la determinación de la actividad de fitasa y para el análisis de la termoestabilidad mediante una calorimetría diferencial de barrido (DSC) (Ejemplo 11).

B) Preparación de granulados de enzimas mediante fermentación en biorreactores de 30 l y secado en un ProCell5

20 Los transformantes del Ejemplo 10 A) se cultivaron en el medio del Ejemplo 10 A) en unos biorreactores de 30 l a un valor del pH de 3,2 ± 0,2, a 200 hasta 400 rpm y con una velocidad de aireación de 0,5 vvm. Al final de la fermentación realizada durante 6 días se separó la biomasa mediante filtración y el material sobrenadante del cultivo transparente se concentró en un factor de 6 por evaporación mediante ultrafiltración (membrana de separación por corte a 30 kDa). El material concentrado se filtró en condiciones estériles y luego se utilizó para la

25 subsiguiente producción de granulados de enzimas.

Los granulados se produjeron a partir de concentrados por UF mediante secado en un granulador por atomización del tipo ProCell5, de la razón social Glatt Systemtechnik GmbH, Dresden, Alemania. Para ello, el valor del pH de los concentrados por UF se ajustó a 5,2 y antes del secado se añadieron 50% (p/p) de leche desnatada en polvo

30 con un contenido de lactosa de 30% y 9,2% (p/p) de propionato de Ca, estando ambas adiciones referidas al contenido global de proteínas del material concentrado por UF. La mezcla se secó mediante una tobera para dos materiales con un Ø de 1,2 mm y a una presión creciente del aire desde 1,2 hasta 2,2 bar a una temperatura del aire de entrada 80°- 90ºC. Los rendimientos de actividad en el secado se situaban en el intervalo de 89 a 99%. Los granulados producidos de esta manera se utilizaron para el ensayo en el Ejemplo 12.

Ejemplo 11- Determinación de la estabilidad térmica mediante DSC

Las muestras procedentes del Ejemplo 10 A) se cambiaron de tampón mediante una columna PD-10 (Pharmacia) en un tampón de acetato de sodio 100 mM, de pH 5,2. Para ello, se aplicaron 1,5 ml de la muestra y se eluyeron

40 con 3,5 ml de un tampón según las instrucciones del fabricante. Todos los ensayos de DSC se llevaron a cabo en un aparato VP-DSC (MicroCal Inc., Northampton, MA, EE.UU.), y los datos fueron transferidos a un PC con el fin de ser evaluados en éste con ayuda del software Origin v7.0383 (OriginLab Corp. Northampton, MA, EE.UU.).

Las muestras fueron desgasificadas antes de la medición durante 20 min en un ThermoVac2 (MicroCal Inc., 45 Northampton, MA; EE.UU.) y reguladas en temperatura a 25ºC en un baño de agua.

Las mediciones se efectuaron con los siguientes parámetros:

A) Parámetros constantes del aparato: 50

Volumen de las celdas: 0, 51231 ml Resistencia eléctrica de calentamiento de referencia: 1009,1 ohms Resistencia eléctrica de calentamiento de la celda: 1002,7 ohms Tasa adiabática: 0,88181 Lectura del valor Delta T: 3,676

B) Los parámetros de barrido en el VP-DSC fueron los siguientes:

Velocidad de barrido (hacia arriba y hacia abajo) : 1ºC min-1 Temperatura antes del ciclo de barrido: 25ºC Período de tiempo de equilibrado antes del ciclo: 15 min Período de tiempo de equilibrado después del ciclo: 0 min Filtro: 10 s Retroalimentación: ninguna Temperatura inicial: 25ºC Temperatura final: 105ºC Presión en la celda: de 26,1 a 28,7 psi (1,827 a 2,009 bar)

La siguiente Tabla 3 muestra la temperatura de fusión Tm (en grados Celsius) y el desplazamiento de la temperatura de fusión ΔT (en grados Celsius) de las fitasas mutantes de E. coli, que se habían producido según los Ejemplos arriba indicados, en comparación con la fitasa de E. coli de tipo salvaje (Dassa et al., 1990) producidos con el mismo sistema de hospedador que las variantes mutantes de la fitasa de E. coli y una fitasa de E. coli con una mutación (M1) no de acuerdo con la invención, asimismo producida con el mismo sistema de hospedador que las variantes mutantes de acuerdo con la invención de la fitasa de E. coli.

Tabla 3: Temperatura de fusión Tm [ºC] y desplazamiento de la temperatura de fusión ΔT [ºC] de las mutantes de la fitasa de E. coli en comparación con la proteína de tipo salvaje, todas producidas en T. reesei de acuerdo con el Ejemplo 10 A

Muestra/genotipo

Fitasa Tm [ºC] ΔT [ºC]

Tipo salvaje

65,64 --

M1

65,01 - 0,63

M2

66,75 + 1,11

M3

66,04 + 0,40

M7

66,21 + 0,57

M9

66,27 + 0,63

Phy2005

66,06 + 0,42

Phy2006

66,06 + 0,42

Los resultados demuestran que en el caso de todos los mutantes ha aparecido un aumento de la temperatura de fusión de la proteína, lo cual se manifiesta en un desplazamiento positivo de la temperatura del punto de fusión. El aumento de la temperatura del punto de fusión es equivalente a un aumento de la estabilidad térmica. La mejora más alta de la termoestabilidad lo mostraba en este caso la mutación doble M2 con ΔT = +1,11ºC. En contraposición a ello, la mutación descrita en el documento DE 10 2004 050 410 para la mejora del nivel de secreción (V200Y = M1), mostraba un empeoramiento de la termoestabilidad (ΔT = -0, 63ºC).

También las prolongaciones en el extremo N-terminal o N- y C-terminal mostraron mejoras de la termoestabilidad. Éstas se sitúan el mismo orden de magnitud que la mutación puntual en el caso de M3.

Ejemplo 12 - Medición de la termoestabilidad en el procedimiento de granulación

Los granulados de enzimas producidos de acuerdo con el Ejemplo 10B) se mezclaron previamente con harina de trigo, tipo 550, con el fin de obtener 300 g de una mezcla previa que contiene enzimas. Esta mezcla previa se mezcló en el Instituto Biotecnológico del Research Institute for Food and Molecular Biotechnology, Kolding, Dinamarca, con 15 kg de un alimento para animales con el fin de garantizar una dilución óptima para la introducción por mezcladura en 285 kg de un alimento para animales y una actividad enzimática bien determinable en el material granulado. La cantidad empleada del granulado de enzimas condujo a una actividad de la fitasa de aprox. 3 hasta 6 unidades enzimáticas por cada gramo de alimento para animales en la mezcla antes del proceso de ensayo. Los 300 kg de alimento para animales fueron tratados en la instalación de granulación experimental, y

tienen la composición de la Tabla 4. Tabla 4: Composición del alimento para animales que debe de ser granulado

Componente

[%]

Trigo

hasta 75

Hipro Soja 48

20

Aceite de soja

4,75

Vitamina/minerales, Beta Avitren 90

0,25

Mezcla previa de enzimas*

300 g

*Contiene una fitasa con los genotipos wt, PhyM1, PhyM2, PhyM3, PhyM7, PhyM9, Phy2005 o Phy2006

Condiciones de granulación:

Mezclador horizontal con un volumen de 700 l, 48 rpm. La cantidad, que es mezclada, se sitúa en el intervalo de 80 a 300 kg por h.

Un tornillo sinfín de transporte horizontal está conectado con el mezclador para el vaciado del mezclador, cuya velocidad de transporte está adaptada a la etapa subsiguiente.

A continuación de la mezcladura, en el mezclador horizontal se efectúa un tratamiento térmico en un mezclador de cascada (acondicionador) de Kahl con una longitud de 130 cm, un diámetro de 30 cm, 155 rpm y 37 cámaras. El caudal de paso es de 300 kg por h. El alimento para animales y las enzimas están en contacto con un vapor húmedo aproximadamente durante 30 s y con ello se calientan a una temperatura de 70° a 95ºC. El vapor, que es puesto a disposición por una caldera de alta presión de Dan Stoker, circula con una sobrepresión de 2 bar a través de una válvula de regulación de la presión hacia el mezclador de cascada. La válvula regula la cantidad de vapor que afluye al mezclador de cascadas y da lugar allí al calentamiento del alimento para animales (inclusive la enzima).

El material acondicionado es granulado por medio de una prensa de Simon Heesen y a continuación es enfriado mediante aire en una caja perforada atravesada con un caudal de 1.500 m3 h-1. La prensa de granulación funciona con 500 rpm con una potencia absorbida de 7,5 kW y produce con ello unos gránulos de 3 x 20 mm.

El tratamiento en el mezclador de cascada dio lugar a una carga térmica de la enzima contenida en el material granulado. A continuación de la producción de los gránulos, se determinó el hallazgo renovado de la actividad de fitasa en el alimento para animales granulado. En la siguiente Tabla 5 se indica el hallazgo renovado de la actividad de fitasa en el alimento para animales granulado en función de la temperatura al realizar el tratamiento.

Tab. 5: Hallazgo renovado de la actividad de fitasa en el alimento para animales después del acondicionamiento a 70° hasta 95ºC y de una subsiguiente granulación. Todas las enzimas fueron expresadas por medios recombinantes con T. reesei.

T [ºC]

Hallazgo renovado de la actividad de fitasa [%]

wt

M1 M2 M3 M7 M9 Phy2005 Phy2006

70

93,0 64,0 103,1 101,6 109,5 108,4 97,6 93,6

75

90,3 47,8 104,9 90,7 88,2 105,0 85,4 90,1

80

46,6 27,8 73,0 43,7 55,5 55,3 32,9 58,6

85

7,8 5,9 37,9 9,2 16,8 11,0 7,6 27,5

90

1,3 0,0 9,7 2,8 5,4 3,0 0,6 11,8

95

0,5 0,0 4,9 0,0 1,4 0,0 1,0 0,5

Los resultados demuestran que la modificación de la termoestabilidad, que se encontró mediante DSC en el caso de las mediciones en un líquido, también se volvió a encontrar en los ensayos "secos" de granulación. La mejora de la termoestabilidad frente a la enzima de tipo salvaje no es constante en este caso en todos los mutantes a lo largo de todo el intervalo medido de temperaturas. M2 mostraba en el ensayo de DSC la estabilidad térmica más alta. También en el ensayo de granulación se consiguió la mejor estabilización mediante una mutación en una región aislada por la mutación doble M2, que introduce un puente iónico en la hélice D de la fitasa de E. coli. El mutante M1 no de acuerdo con la invención muestra, igual a como en el ensayo de DSC, un empeoramiento de la termoestabilidad en comparación con la enzima de tipo salvaje expresada en Trichoderma reesei. La mutación M3, que asimismo por sí sola no es de acuerdo con la invención, muestra unas propiedades de termoestabilidad similares a las de la enzima de tipo salvaje. La variante Phy2005, que sólo lleva la prolongación N-terminal por medio de la parte correspondiente de la fosfatasa ácida de A. niger var. awamori, no es tan estable a más altas temperaturas como la Phy2006, que contiene la prolongación tanto N-terminal como también C-terminal. Esto apunta a que estas prolongaciones pueden contribuir muy ciertamente a una acumulación de moléculas de la fitasa de E. coli de una manera análoga a la dimerización de la fosfatasa ácida en condiciones normales y, con

5 ello, mejorarla la termoestabilidad.

Ejemplo 13 - Medición de la estabilidad proteolítica en un procedimiento in vitro

Para la determinación de la estabilidad proteolítica in-vitro se utilizaron unas muestras de enzimas procedentes del

10 Ejemplo 10A), es decir, muestras de los transformantes M1 (la mutación que no es de acuerdo con la invención), M2, M3, M7, Phy2005 y Phy2006 producidas con los transformantes de la Tabla 2.

20 ml de una solución de pepsina (Merck 7190), que contiene 20 unidades de proteasa por ml en tampón de glicina-HCl (pH 2,5), estando referida la actividad, según la indicación del fabricante, a la hemoglobina, a pH de 1,6

15 y a 25ºC, se regularon a una temperatura de 40ºC.

Se añadieron 10 ml de una disolución de fitasa (diluida a razón de 1:100) y la disolución se completó hasta 50 ml con el tampón y a continuación se incubó a 40ºC, pH de 2,5 durante 30 min. La reacción se interrumpió mediante inmersión en un baño de hielo/agua y el valor del pH se aumentó inmediatamente a un pH de 5 con lejía de sosa y

20 la disolución se diluyó en este caso hasta 100 ml. La actividad de fitasa se midió entonces de acuerdo con el Ejemplo 1.

10 ml de la disolución tratada con pepsina se ajustaron a un pH de 7. Se añadieron 30 ml de una solución de pancreatina (Merck 7130), que contenía 30 unidades de una proteasa (caseína, pH 8,0, 35ºC) en un tampón Tris

25 HCl 0,05 M (pH 7 0), la disolución se diluyó hasta 50 ml con un tampón Tris-HCl, pH 7, y la disolución se incubó en un baño de agua a 40ºC durante 30 min. La reacción se detuvo mediante inmersión en un baño de hielo/agua y el valor de pH se disminuyó inmediatamente a un pH de 5 con HCl y la disolución se diluyó en este caso a 100 ml. La actividad de fitasa se midió entonces según el Ejemplo 1. Los resultados se representan en la Tabla 6.

Tab. 6: Hallazgo renovado de la actividad después de un tratamiento de los mutantes de la enzima con pepsina y a continuación con pancreatina

Genotipo

Actividad residual después del tratamiento con pepsina [%] Actividad residual después del tratamiento con pepsina y pancreatina [%]

PhyM1

84 71

PhyM2

111 85

PhyM3

112 80

PhyM7

101 75

Phy2005

110 99

Phy2006

109 78

5 Los resultados muestran para todos los mutantes una estabilidad proteolítica muy alta en presencia de pepsina y de pancreatina, en comparación con el mutante comparativo PhyM1, en unas condiciones in-vitro, tales como las que se presentan en el estómago de animales monogástricos, p. ej. cerdos. La alta estabilidad proteolítica aquí mostrada ilustra que estos mutantes de la enzima son especialmente adecuados para un empleo en el sector de

10 los alimentos para animales.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> AB Enzymes GmbH

<120> Polipéptido con actividad de fitasa y estabilidad térmica incrementada de la actividad enzimática, así como secuencia de nucleótidos que le codifican

<130> 16936EP1

<140>

<140>

<150> DE 10 2006 053 059.4

<151>

<160> 22

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 1

<210>

2

<211>

33

<212>

ADN

<213>

Secuencia Artificial

<220>

<223>

Cebador

<400>

2

<210>

3

<211>

27

<212>

ADN

<213>

Secuencia Artificial

<220>

<223>

Cebador

<400>

3

<210>

4

<211>

27

<212>

ADN

<213>

Secuencia Artificial

<220>

<223>

Cebador

<400>

4

<210>

5

<211>

29

<212>

ADN

<213>

Secuencia Artificial

<220>

<223>

Cebador

<400>

5

<210>

6

<211>

29

<212>

ADN

<213>

Secuencia Artificial

<220>

<223>

Cebador

<400>

6

<210>

7

<211>

40

<212>

ADN

<213>

Secuencia Artificial

<220>

<223>

Cebador

<400>

7

<210>

8

<211>

39

<212>

ADN

<213>

Secuencia Artificial

<220>

<223>

Cebador

<400>

8

<210>

9

<211>

1230

<212>

ADN

<213>

Secuencia Artificial

<220>

<223>

PhyM2 de ADN

<220>

<221>

CDS

<222>

(1) ... (1230)

<223>

<400>

9

5

<210> <211> <212> <213> 10 410 PRT Secuencia Artificial

10

<220> <223> PhyM2 de ADN

<400>

10

5

10

<210> <211> <212> <213> 11 1230 ADN Secuencia Artificial

<220> <223>

PhyM3 de ADN

15

<220> <221> <222> <223> 400> CDS (1) ... (1230) 11

5

<210> <211> <212> <213> 12 410 PRT Secuencia Artificial

10

<220> <223> <400> PhyM3 de ADN 12

<210>

13

5

<211> 1230

<212>

ADN

<213>

Secuencia Artificial

38

<220> <223>

PhyM7 de ADN

5

<220> <221> <222> <223> CDS (1) ... (1230)

10

<400> 13

5

<210> <211> <212> <213> 14 410 PRT Secuencia Artificial

10

<220> <223> PhyM7 de ADN

<400>

14

5

<210> <211> <212> <213> 15 1230 ADN Secuencia Artificial

10

<220> <223> PhyM9 de ADN

15

<220> <221> <222> <223> CDS (1) ... (1230)

<400>

15

5

<210> <211> <212> <213> 16 410 PRT Secuencia Artificial

10

<220> <223> PhyM9 de ADN

<400>

16

5

<210> <211> <212> <213> 17 1230 ADN Secuencia Artificial

10

<220> <223> PhyM10 de ADN

15

<220> <221> <222> <223> CDS (1) ... (1230)

<400>

17

5

<210> <211> <212> <213> 18 410 PRT Secuencia Artificial

10

<220> <223> <400> PhyM10 de ADN 18

5

<210> <211> <212> <213> 19 1371 ADN Secuencia Artificial

10

<220> <223> Phy2005 de ADN

15

<220> <221> <222> <223> CDS (1) ... (1371)

<400>

19

5

<210> <211> <212> <213> 20 457 PRT Secuencia Artificial

10

<220> <223> Phy2005 de ADN

<400>

20

<210>

21

<211>

1458

5

<212> ADN

<213>

Secuencia Artificial

<220>

<223>

Phy2006 de ADN

10

<220>

<221>

CDS

<222>

(1) ... (1458)

<223>

15

<400>

21

5

<210> <211> <212> <213> 22 486 PRT Secuencia Artificial

10

<220> <223> <400> Phy2006 de ADN 22

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   1. Molécula de ADN recombinante que, después de su expresión en una célula hospedadora procariótica o

   eucariótica, codifica un polipéptido con actividad de fitasa, conteniendo la molécula de ADN recombinante una 5 secuencia de ADN, seleccionada entre

   a) secuencias de ADN que codifican un polipéptido con una actividad de fitasa, que se había obtenido mediante variación de la secuencia de la fitasa madura de E. coli de tipo salvaje, comprendiendo la variación la mutación lisina → ácido aspártico en la posición 74 (K74D),

   10 b) secuencias de ADN que, debido a la degeneración del código genético, están emparentadas con las secuencias de acuerdo con a),

   en donde la molécula de ADN recombinante, en el caso de su expresión en una adecuada célula hospedadora, va acompañada de unas estabilidades térmica y frente a proteasas incrementadas de la actividad enzimática de la 15 proteína así codificada.
2. 2. Molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que la secuencia de ADN comprende adicionalmente la variación V200P del polipéptido codificado.

   20 3. Molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que la secuencia de ADN comprende adicionalmente las variaciones L145I y L198I del polipéptido codificado.
3. 4. Molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que como adición Nterminal del polipéptido codificado comprende la secuencia FSYGAAIPQS TQEKQFSQEF RDGYSILKHY

   25 GGNGPYSERV SYGIARDPPTS, y/o como adición C-terminal del polipéptido codificado comprende la secuencia LSFWWNYNTT TELNYRSSPI ACQEGDAMD.
4. 5. Molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que comprende una

   secuencia escogida entre las secuencias SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 17. 30
5. 6. Polipéptido, que posee una actividad de fitasa y que es codificado por una molécula de ADN recombinante de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5 o que se obtiene mediante expresión de una célula hospedadora transformada con ésta.

   35 7. Polipéptido de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado por que comprende una secuencia escogida entre las SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO:18.
6. 8. Construcción de ADN con la capacidad para regular la expresión de un gen de fitasa mutado en un hospedador,

   después de la introducción en una célula hospedadora adecuada, caracterizada por que contiene una secuencia 40 de ADN de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5 y un terminador.
7. 9. Construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada por que posee secuencias flanqueantes en 5' y 3', un promotor y/o secuencias de señal y de marcador.

   45 10. Construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizada por que en el caso del promotor se trata del promotor de la celobiohidrolasa I, de la celobiohidrolasa II, de la amilasa, de la glucoamilasa, de la xilanasa o de la enolasa.
8. 11. Construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 9 ó 10, caracterizada por que en el caso de la secuencia

   50 de señal y/o de las secuencias flanqueantes en 5' y 3' se trata de las secuencias de señal de la fitasa de Aspergillus niger.
9. 12. Construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizada por que en el caso de las secuencias

   de señal de la fitasa de Aspergillus niger se trata de secuencias de señal modificadas de la fitasa de Aspergillus 55 niger.
10. 13. Vector con la capacidad de transformar a una célula hospedadora, caracterizado por que el vector contiene una construcción de acuerdo con las reivindicaciones 8 a 12.

    60 14. Vector de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado por que se escoge entre el plásmido pET-PhyM7, depositado bajo el número de depósito DSM 18716 o el plásmido pUC-PhyM10, depositado bajo el número de depósito DSM 18719.
11. 15. Célula hospedadora transformada escogida entre hongos, levaduras, bacterias y células de mamíferos, que

    5 contiene una molécula de ADN recombinante de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, y que está dotada de la capacidad de expresar un polipéptido con actividad de fitasa.
12. 16. Célula hospedadora transformada de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizada por que pertenece al

    género Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma, Neurospora, Mucor o Penicillium. 10
13. 17. Procedimiento para la producción de fitasa, caracterizado por que se cultiva una célula hospedadora transformada de acuerdo con la reivindicación 15 ó 16 en condiciones que fomentan la formación de fitasa, y se aísla la fitasa así producida.

    15 18. Composición, que comprende un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, eventualmente junto con otros coadyuvantes y/o sustancias activas.
14. 19. Composición de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizada por que la composición es una composición de

    alimento o de alimento para animales o un agente de panificación. 20
15. 20. Uso de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 18 ó 19 para la producción de un preparado destinado a la mejora del aprovechamiento de fosfato a partir de la nutrición en animales y seres humanos o para la mejora de las propiedades reológicas de masas de panificación destinadas a la producción de productos de panificación.

    25 21. Uso de una variación de la secuencia de la fitasa de E. coli madura de tipo salvaje, que comprende la mutación lisina → ácido aspártico en la posición 74 (K74D) para la producción de una molécula de ADN recombinante que, después de su expresión en una célula hospedadora procariótica o eucariótica, codifica un polipéptido con una actividad de fitasa, que posee unas estabilidades térmica y frente a proteasas incrementadas.

    30 22. Uso de acuerdo con la reivindicación 21, caracterizado por que el uso tiene lugar junto con las variaciones L145I y L198I.
16. 23. Uso de acuerdo con la reivindicación 22, caracterizado por que el uso tiene lugar junto con la variación V200P.

    35 24. Uso de acuerdo con la reivindicación 22, caracterizado por que el uso tiene lugar junto con la variación de la adición N-terminal de la secuencia FSYGAAIPQS TQEKQFSQEF RDGYSILKHY GGNGPYSERV SYGIARDPPTS y/o la variación de la adición C-terminal de la secuencia LSFWWNYNTT TELNYRSSPI ACQEGDAMD.