ES2433380T3 - Anticuerpos específicos para el complejo de interleucina 6 y el receptor de interleucina 6 - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo aislado, que se une al complejo IL-6 : IL-6Ra formado por la IL-6 y el IL-6Ra, y que no se une ni aIL-6 ni a IL- 6Ra solos y que inhibe la unión del complejo IL-6:IL-6Ra a gp130, en el que el anticuerpo comprende undominio VH de anticuerpo y un dominio VL de anticuerpo, en el que la molécula de anticuerpo comprende unconjunto de CDR, en el que el dominio VH comprende HCDR1, HCDR2, HCDR3 y una región estructural y eldominio VL comprende LCDR1, LCDR2, LCDR3 y una región estructural, en el que el conjunto de CDR seselecciona del grupo que consiste en: a. HCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 , HCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidosSEQ ID NO: 4, HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5, LCDR1 que tiene la secuencia deaminoácidos SEQ ID NO: 8, LCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9 y LCDR3 que tiene lasecuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 10; b. HCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13, HCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidosSEQ ID NO: 14, HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15, LCDR1 que tiene la secuencia deaminoácidos SEQ ID NO: 18, LCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 19 y LCDR3 que tiene lasecuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20; c. HCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 23, HCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidosSEQ ID NO: 24, HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25, LCDR1 que tiene la secuencia deaminoácidos SEQ ID NO: 28, LCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 29 y LCDR3 que tiene lasecuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 30; d. HCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 33, HCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidosSEQ ID NO: 34, HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 35, LCDR1 que tiene la secuencia deaminoácidos SEQ ID NO: 38, LCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 39 y LCDR3 que tiene lasecuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 40; y e. HCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 43, HCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidosSEQ ID NO: 44, HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 45, LCDR1 que tiene la secuencia deaminoácidos SEQ ID NO: 48, LCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 49 y LCDR3 que tiene lasecuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 50.

Description

Anticuerpos específicos para el complejo de interleucina 6 y el receptor de interleucina 6

5 Esta invención divulga miembros de unión, especialmente moléculas de anticuerpo, que inhiben los efectos biológicos de la IL-6. Los miembros de unión son útiles para el tratamiento de trastornos asociados con la IL-6, incluyendo enfermedades inflamatorias y tumores.

La interleucina 6 (IL-6) es una citocina proinflamatoria pleiotrópica de 26 kDa producida por una variedad de tipos de

10 células, incluyendo fibroblastos estimulados, monocitos y células endoteliales, que constituyen la fuente principal de IL-6 in vivo. Células tales como los linfocitos T, los linfocitos B, los macrófagos, los queratinocitos, los osteoblastos y varias otras pueden producir IL-6 con estimulación. La IL-6 también se expresa por líneas de células tumorales y células tumorales, por ejemplo, células de carcinoma de pulmón, cáncer de próstata, mieloma, hipernefroma y mixoma cardíaco (Kishimoto, T., Blood 74:1-10 (1989) y Smith P.C. et al. Cytokine and Growth factor Reviews 12:33

15 40 (2001)). En condiciones no inflamatorias, se secreta IL-6 desde el tejido adiposo (Wallenius et al., Nat. Med. 8:75 (2002)).

La regulación de la expresión de la IL-6 depende del tipo de célula que la produce. En células de mieloma múltiple parece que la IL-6 actúa en un bucle de retroalimentación positiva, que estimula el crecimiento de las células y la

20 producción de más IL-6 (Kawano et al. Nature 332:83 (1988) y Van Zaanen et al. J. Clin Invest. 98:1441-1448 (1996)). En otros tipos de células, parece que la IL-6 inhibe el crecimiento y la activación de las células y puede actuar como regulador negativo para algunas citocinas proinflamatorias.

Para iniciar la señalización celular, la IL-6 se une con baja afinidad a un receptor transmembranario, el receptor de

25 IL-6 alfa (denominado también IL-6Ra, IL-6Ra, IL-6R, gp80 o CD126) para formar un complejo "IL-6:IL-6Ra". Este complejo se une al receptor de señales gp130; IL-6Ra y gp130 forman conjuntamente un sitio de unión de IL-6 de alta afinidad e inducen la formación de un hexámero compuesto por dos copias de cada uno de IL-6, IL-6Ra y gp130 (Somers, W., et al. 1997. 1.9 EMBO J. 16:989-997). Los dominios transmembranario y citoplásmico del IL-6Ra no son necesarios para la transducción de señales, ya que el IL-6Ra existe también en forma secretada soluble (sIL-6R

30 o sIL-6Ra). El receptor soluble se produce por ayuste diferencial del mensajero de IL-6Ra o por liberación proteolítica. El sIL-6R puede formar un complejo ligando-receptor con la IL-6, "IL-6:sIL-6Ra". Este complejo se puede unir a gp130 de las células y, de este modo, iniciar la señalización celular en células positivas para gp130, incluso si esas células no expresan el IL-6Ra. Así, el sIL-6R tiene el potencial de ampliar el repertorio de células que responden a la IL-6 y se cree que desempeñan un papel importante en la inflamación mediada por IL-6 (Jones, S. A

35 et al. 2001. FASEB J. 15:43-58).

Se ha dilucidado la estructura cristalina del ligando de IL-6 humana (Somers et al. EMBO J. (1997) 16:989-997). También se han resuelto la estructura cristalina del dominio extracelular del IL-6Ra humano (Varghese et al. Proc Nat Acad Sci (2002) 99:15959-15964) y la estructura hexamérica del complejo IL-6/IL-6R/gp130 (Boulanger et al. 40 Science 300:2101-2104 (2003)). Estas estructuras combinadas con estudios de mutagénesis han identificado tres sitios sobre la superficie de la IL-6 que están implicados en la actividad funcional de la IL-6 en complejo con los diversos componentes del receptor. Los residuos del sitio 1 están implicados en la interacción entre la IL-6 y el IL6Ra. Los residuos del sitio 2 están implicados en la interacción entre la IL-6 y el dominio de unión a citocinas de gp130. Los residuos del sitio 3 de la IL-6 están implicados en la interacción con el dominio de tipo Ig del segundo

45 gp130 del complejo hexamérico. También se ha identificado un cuarto sitio en IL-6 donde la IL-6 interacciona con la segunda molécula de IL-6 del complejo hexamérico IL-6/IL-6R/gp130 (Menziani et al. (1997) Proteins: Structure Function and Genetics 29, 528).

Se han llevado a cabo estudios similares en el dominio extracelular del IL-6Ra humano. Esta región extracelular

50 tiene 3 dominios D1 (P26-V112), D2 (P113-Q215), D3 (P216-M311). Aunque se ha demostrado que el dominio Ig D1 no es imprescindible para el reconocimiento del ligando y la inhibición de la señal, está implicado en la internalización del receptor y la estabilidad de la proteína. Los dominios D2 y D3 son dominios de fibronectina de tipo III y forman el dominio de unión a citocinas. En estudios estructurales se han identificado tres sitios "de agrupación" en este dominio extracelular (Varghese et al. Proc Nat Acad Sci (2002) 99:15959-15964); Los residuos de la

55 agrupación 1 están implicados de forma predominante en la unión al ligando IL-6. Los residuos de la agrupación 2 forman parte de la interfaz de dimerización del IL-6Ra. Estos residuos interfieren con la formación del dímero de IL6R y tienen un efecto significativo sobre la señalización de IL-6, pero no en la unión de IL-6. Los residuos de la agrupación 3 del IL-6Ra están implicados en la formación del complejo IL-6/IL6R con gp130 para formar el complejo hexamérico IL-6/IL-6Ra/gp130.

60 Se han aislado una serie de anticuerpos monoclonales anti-ligando IL-6. Se han realizado estudios de mapeo que demuestran que éstos se unen a diferentes sitios de unión, como se describe anteriormente, sobre la superficie de la IL-6 humana (Brakenhoff et al. J. Immunol. (1990) 145:561-568, Wijdenes et al. Mol Immunol. (1991) 28:1183-1191, Brakenhoff et al. (1994) JBC 269:86, Kalai et al. (1996) Eur J Biochem 238 714-723, Kalai et al. (1997) Blood

65 89:1319-1333).

También se han generado una serie de anticuerpos monoclonales anti-IL-6Ra y se han mapeado sus sitios de unión en el IL-6Ra (Hirata et al. (1989) J. Immunol 143:2900-2906, Kalai et al. (1996) Eur J Biochem 238 714-723, Kalai et al. (1997) Blood 89:1319-1333, Kalai et al. (1997) Eur J. Biochem 249:690-700).

5 La IL-6 pertenece a una familia de citocinas que incluye la interleucina 11 (IL-11), el factor neurotrófico ciliar (CNTF), la oncostatina M (OsM), el factor inhibidor de la leucemia (LIF), la citocina similar a la cardiotrofina (CLC) y la cardiotrofina 1 (CT-1). Cada uno de los miembros de esta familia tiene sus propias subunidades de receptor alfa específicas y forma complejos con la subunidad de receptor común gp130. La alteración dirigida del gen de gp130 es mortal para los embriones (Ernst, M. y B. J. Jenkins. 2004. Trends Genet. 20:23-32 y Yoshida, K. et al. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:407-411). Todos los miembros de la familia de la IL-6 pueden inducir la expresión de proteínas de fase aguda a partir de hepatocitos.

La señalización de IL-6 implica la fosforilación de tirosinas por cinasas de la familia JAK y la posterior activación de dos cascadas de señalización intracelular principales, las rutas SHP2/ERK MAPK y STAT1/3, que dan lugar a la 15 expresión génica a través de NF-IL-6 y AP-1 (Ernst, M. y B. J. Jenkins. 2004. Trends Genet. 20:23-32, y Heinrich, P.

C. et al. 2003. Biochem.J. 374:1-20).

La IL-6 muestra un amplio espectro de funciones biológicas, incluyendo la hematopoyesis, la inducción de respuestas de fase aguda, la activación de linfocitos T, la estimulación de la secreción de anticuerpos, la defensa del huésped contra la infección, la activación de células de mieloma y de osteoclastos (Choy, E. 2004. Rheum.Dis.Clin.North Am. 30:405-415 y Jones SA et al. FASEB J 15:43-58 (2001)). Para una revisión de los efectos de la IL-6, véase Kishimoto Arthritis Research & Therapy 2006 8: Supl. 2/S2. Originalmente, se identificó la IL-6 como un factor de diferenciación de linfocitos B generado por linfocitos T (Hirano T et al. Nature (1986) 324:73-76), pero posteriormente se ha identificado como un potente factor activador y promotor del crecimiento de muchos tipos 25 de células. Induce la maduración final de los linfocitos B a células productoras de anticuerpos y es un factor accesorio esencial para la activación y proliferación de los linfocitos T. Se ha demostrado en estudios que la IL-6 está implicada en la activación de linfocitos T autorreactivos y la proliferación y diferenciación de linfocitos T citotóxicos. Se ha implicado la IL-6 en la hematopoyesis como un cofactor que provoca la activación y la diferenciación de células madre hematopoyéticas. El efecto de la IL-6 sobre la respuesta de fase aguda también está bien documentado (para una revisión, véase Moshage J Pathol. (1997) 181:257-266). La IL-6 induce una variedad de proteínas de fase aguda, incluyendo, el fibrinógeno, la alfa-anti-quimotripsina, la proteína amiloide A sérica y la Creactiva, a partir de hepatocitos humanos. Las proteínas de fase aguda controlan las respuestas inmunitarias y la inflamación y tienen efectos sobre la remodelación de los tejidos. El nivel sérico de IL-6 se correlaciona bien con el de la proteína C-reactiva en una variedad de patologías, lo que apunta a un papel causal de la IL-6 en la respuesta

35 de fase aguda. También se ha demostrado que la IL-6 se produce por osteoblastos y parece estar implicada en la activación de los osteoclastos y la resorción ósea (Guillen, C. et al. 2004. Calcif.Tissue Int. 75:153-159, Tamura, T., et al. . 1993. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:11924-11928, Udagawa, N et al. 1995. J.Exp.Med. 182:1461-1468). Paradójicamente, se ha sugerido que la IL-6 no sólo desempeña papeles como citocina proinflamatoria, sino que, en determinadas circunstancias y tipos de células, también puede amortiguar los efectos de otras citocinas proinflamatorias, dando lugar a una disminución de la inflamación.

Debido a que la IL-6 tiene una variedad de efectos biológicos, se ha implicado la elevación de la IL-6 como citocina clave en indicaciones de una variedad de enfermedades. Se ha demostrado que los niveles de IL-6 circulante son elevados en enfermedades tales como la artritis reumatoide, la enfermedad de Castleman, la artritis idiopática juvenil

45 y la enfermedad de Crohn (Nishimoto N, y Kishimoto T., Curr Op in Pharmaclogy (2004) 4:386-391). Por este motivo, se ha implicado la IL-6 en el control de la patología de estas indicaciones inflamatorias. Además, se ha demostrado que la IL-6 estimula una variedad de tipos de tumores, incluyendo el melanoma, el carcinoma de células renales, el sarcoma de Kaposi, el carcinoma ovárico, el linfoma y la leucemia, el mieloma múltiple y el carcinoma de próstata (Keller E.T. et al. Front Biosci;1:340-57 (1996)). Además, se ha informado de niveles circulantes de IL-6 aumentados en varios cánceres. En algunas indicaciones de cáncer, se han usado los niveles de IL-6 elevados como indicadores de diagnóstico de la enfermedad.

Debido al papel de la IL-6 en las enfermedades, se han desarrollado una variedad de anticuerpos monoclonales murinos y quiméricos anti-IL-6 humana como tratamientos potenciales.

55 El documento US 5856135 describe un anticuerpo humano remodelado frente a IL-6, derivado de un anticuerpo monoclonal de ratón "SK2".

El documento JP-10-66582 informa de un anticuerpo quimérico frente a IL-6, del que se indica que reconoce la región de hélice D de la IL-6 (sitio 1).

El documento WO 2004/020633 (documento EP 1536012) describe una molécula de anticuerpo scFv humano frente a IL-6 aislado usando tecnología de presentación en fagos. Se informa de que el scFv tiene una afinidad de 13 nM.

65 Se ha usado un anticuerpo murino anti-IL-6, elsilimomab (también conocido como B-E8) para tratar pacientes con mieloma múltiple (Bataille et al. Blood (1995) 86:685-691, Lu et al. Blood (1995) 68:3123-3131), carcinoma de células renales (Blay et al. Int J. Cancer 1997, 424-430 y artritis reumatoide (Wendling et al. J. Rheumatol. (1993). 20:259-262) y en pacientes tratados con estas tres enfermedades se observaron mejoras en determinados marcadores de diagnóstico. También se ha usado el BE-8 para tratar pacientes VIH-positivos con linfoma inmunoblástico o de células grandes polimorfas (Emilie et al. Blood 1994, 84:2472-2479) con alivio de síntomas

5 sistémicos (es decir, fiebre, sudores, caquexia) y supresión del crecimiento espontáneo del linfoma en aproximadamente un 50 % de los pacientes.

Sin embargo, la rápida eliminación de este anticuerpo y las posibles reacciones anafilácticas debidas a la producción de anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA) frente al elsilimomab han limitado su uso en el ámbito clínico (Brochier J et al. Int. J. of Immunopharm. 1995, 17:41-48).

En general, el uso clínico de anticuerpos monoclonales murinos es limitado, ya que estos anticuerpos inducen frecuentemente HAMA. Con frecuencia, se producen HAMA dirigidos contra la porción Fc de la inmunoglobulina de ratón, lo que da lugar a una rápida eliminación de Acm anti-IL-6 y una posible reacción anafiláctica (Brochier J et al.

15 Int. J. of Immunopharm. 1995, 17:41-48). También se sabe que la farmacocinética de los anticuerpos de ratón en los seres humanos es diferente de la de los anticuerpos humanos, con semividas más cortas y tasas de eliminación aumentadas.

Para reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos murinos en los seres humanos, se han construido anticuerpos quiméricos con regiones variables de ratón y regiones constantes humanas. Se ha usado un anticuerpo quimérico humano-de ratón anti-IL-6 cCLB8 (conocido como CNTO 328) para tratar pacientes con mieloma múltiple (van Zaanen et al. J. Clin Invest 1996, 98:1441-1448 y van Zaanen et al. Brit. Journal. Haematology 1998, 102:783), con estabilización de la enfermedad observada en la mayoría de los pacientes.

25 Sin embargo, aunque los anticuerpos quiméricos son menos inmunógenos que los Acm murinos, se ha informado de respuestas de anticuerpos humanos anti-anticuerpos quiméricos (HACA) (Bell y Kamm, (2000) Aliment. Phamacol. Ther. 14, 501-514).

El efecto positivo de la inhibición de la señalización de IL-6 en el cáncer y en enfermedades inflamatorias también se ha resaltado adicionalmente por el uso de un anticuerpo humanizado anti-IL-6Ra Tocilizumab (también conocido como hPM-1, MRA y Actemra). Esta es una versión humanizada del anticuerpo murino anti-IL6Ra PM-1. El tratamiento de pacientes con este anticuerpo se ha demostrado eficaz en una serie de enfermedades, incluyendo la artritis reumatoide, la artritis idiopática juvenil, la enfermedad de Crohn, trastornos mieloproliferativos, la enfermedad de Castleman y el lupus sistémico eritematoso (Mihara et al. Expert Opinion on Biological Therapy. 2005 5:683-90).

35 La invención proporciona un anticuerpo aislado, que se une al complejo IL-6:IL-6Ra formado por la IL-6 y el IL-6Ra, y que no se une ni a IL-6 ni a IL-6Ra solos y que inhibe la unión del complejo IL-6:IL-6Ra a gp130, en el que el anticuerpo comprende un dominio VH de anticuerpo y un dominio VL de anticuerpo, en el que la molécula de anticuerpo comprende un conjunto de CDR, en el que el dominio VH comprende HCDR1, HCDR2, HCDR3 y una región estructural y el dominio VL comprende LCDR1, LCDR2, LCDR3 y una región estructural, en el que el conjunto de CDR se selecciona del grupo que consiste en:

a. HCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3, HCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4, HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5, LCDR1 que tiene la secuencia de

45 aminoácidos SEQ ID NO: 8, LCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9 y LCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 10;

b.

HCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13, HCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 14, HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15, LCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18, LCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 19 y LCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20;

c.

HCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 23, HCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 24, HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25, LCDR1 que tiene la secuencia de

55 aminoácidos SEQ ID NO: 28, LCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 29 y LCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 30;

d.

HCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 33, HCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 34, HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 35, LCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 38, LCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 39 y LCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 40; y

e.

HCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 43, HCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 44, HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 45, LCDR1 que tiene la secuencia de

65 aminoácidos SEQ ID NO: 48, LCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 49 y LCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 50.

Preferentemente, un anticuerpo de la invención comprende:

un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 y un dominio VL que tiene una secuencia de 5 aminoácidos SEQ ID NO: 7; o

un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 12 y un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 17; o

10 un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 22 y un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 27; o

un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 32 y un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 37; o

15 un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 42 y un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 47.

Preferentemente, un anticuerpo de acuerdo con la invención puede inhibir la unión del complejo IL-6:IL-6Ra a gp130

20 y tiene una CI50 de no más de 700 nM en un ensayo de fluorescencia de resolución temporal homogénea para la inhibición de la unión del complejo IL-6:IL-6Ra a gp130, con una concentración final de 1 nM de complejo y 1 nM de gp130.

La invención proporciona además una composición que comprende un anticuerpo aislado de acuerdo con la 25 invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o de animal por intervención quirúrgica o tratamiento.

La invención proporciona un anticuerpo de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento de un trastorno asociado con la IL-6 en un individuo, en el que el trastorno asociado con la IL-6 se selecciona de entre: una

30 enfermedad inflamatoria y/o autoinmunitaria, un tumor y/o un cáncer, un trastorno linfoproliferativo, rechazo de aloinjerto, caquexia, osteoporosis, traumatismo cerebral, edema cerebral, depresión, insuficiencia cardíaca congestiva o dolor óseo.

La invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que 35 codifica un anticuerpo de acuerdo con la invención.

La invención proporciona una célula huésped transformada in vitro con ácido nucleico de acuerdo con la invención.

La invención proporciona un método de producción de un anticuerpo que comprende cultivar células huésped de 40 acuerdo con la invención en condiciones para la producción del anticuerpo. Este método de acuerdo con la invención puede comprender además aislar y/o purificar el anticuerpo.

Un método de la invención puede comprender además formular el anticuerpo en una composición que comprende al menos un componente adicional.

45 Los anticuerpos aislados de la invención se unen al complejo IL-6:IL-6Ra formado por IL-6 e IL-6Ra y no se unen ni a IL-6 ni a IL-6Ra solos. En el presente documento se describen miembros de unión que se unen al complejo formado por IL-6 y sIL-6Ra (IL-6:sIL-6Ra) y que no se unen ni a IL-6 ni sIL-6Ra solos. Por tanto, los anticuerpos de la invención no se unen a IL-6 que no está complejada con IL-6Ra, por ejemplo, sIL-6Ra. Los anticuerpos de la

50 invención tampoco se unen al IL-6Ra, por ejemplo, sIL-6Ra, a menos que el IL-6Ra esté complejado con IL-6.

Se reconoció que un miembro de unión que podría unirse al complejo formado por IL-6 e IL-6Ra y que no se une ni a IL-6 ni a IL-6Ra solos podría ofrecer ventajas significativas en comparación con miembros de unión que se unen a IL-6 y/o a IL-6Ra fuera del complejo IL-6:IL-6Ra. Como se describe en el ejemplo 1, se inventó un método novedoso 55 para seleccionar miembros de unión para un complejo formado entre un ligando y un receptor (en este caso, IL-6 y IL-6Ra), en el que los miembros de unión no se unen ni al ligando (en este caso, IL-6) ni al receptor (en este caso, IL-6Ra) solos (es decir, cuando el ligando y el receptor no están unidos entre sí). Por tanto, se aislaron por primera vez anticuerpos que se unen específicamente a IL-6:IL-6Ra. Como se describe en otra parte del presente documento, este complejo representa el mecanismo por el que la IL-6 ejerce sus efectos in vivo. La unión y la 60 inhibición de este complejo (por ejemplo, la inhibición de la unión del complejo a gp130) es un mecanismo por el que se puede inhibir directamente la actividad biológica de la IL-6 y ofrece la posibilidad de lograr la inhibición de manera más específica que dirigiéndose a la IL-6 o a su receptor solos. Los miembros de unión divulgados en el presente documento tienen numerosas aplicaciones útiles, por ejemplo en los campos del tratamiento terapéutico y el diagnóstico, y ofrecen ventajas nuevas y únicas con respecto a la técnica anterior, dado que todos los anticuerpos

65 conocidos anteriormente se unen a IL-6 o a IL-6Ra fuera del complejo IL-6:IL-6Ra.

Debido al mecanismo de señalización de IL-6, para que se active la IL-6, tiene que formar un complejo con el IL-6Ra (soluble o unido a la membrana). Los niveles circulantes de IL-6 son significativamente más bajos que los niveles circulantes de sIL-6Ra en la enfermedad (Desgeorges et al. J. Rheumatol (1997) 24:1510; Yokota et al. Arth & Rheum (2005) 52:818). Como IL-6 se une al IL-6R con afinidad nanomolar, la concentración de complejo IL-6:IL-6R

5 será aproximadamente 10 veces menor que las concentraciones de IL-6 libre e IL-6Ra libre. Por lo tanto, un miembro de unión dirigido al complejo IL-6:IL-6Ra, por ejemplo, dirigido a IL-6:sIL-6Ra, tiene una cantidad mucho más baja de objetivo que neutralizar y, en consecuencia, potencialmente, puede ser necesario menos miembro de unión, es decir, una dosis más baja, para inhibirlo.

Esto tiene ventajas significativas en cuanto que la cantidad de fármaco que se debe fabricar para cada dosis para los pacientes puede ser más baja. Asimismo, si la dosis de un tratamiento anti-IL-6 es más baja, entonces puede haber ventajas significativas en cuanto que la dosis baja facilita las inyecciones subcutáneas, así como las inyecciones intravenosas (i.v.). Los expertos en la técnica conocen bien que la dosificación subcutánea puede estar limitada por la cantidad de anticuerpo necesaria por dosis. Esto se debe a que las inyecciones subcutáneas están

15 limitadas por el volumen que se puede inyectar en un sitio en la piel. Típicamente, se utilizan volúmenes de inyección subcutánea de 1,2 ml o menos. Como puede ser cada vez más difícil formular un anticuerpo para inyección subcutánea a concentraciones mayores de 50 mg/ml, las dosis superiores a 100 mg por esta vía suelen requerir varias inyecciones y más molestias para el paciente.

Por lo tanto, una dosis más baja de tratamiento anti-IL-6:IL-6Ra puede tener ventajas significativas con respecto a un tratamiento anti-ligando IL-6 o anti-IL-6Ra que podría requerir dosis mayores.

Al tener una dosis más baja de tratamiento anti-IL-6:IL-6Ra, también puede ser necesario una dosis "de carga" más baja de miembro de unión para inhibir toda la IL-6 activa complejada con IL-6Ra, en comparación con IL-6 y sIL-6Ra

25 libres sistémicos (no complejados) que están a concentraciones significativamente más altas.

En la circulación sistémica de los individuos puede haber IL-6Ra soluble e IL-6:sIL-6Ra y, en individuos que tienen un trastorno relacionado con la IL-6, pueden estar presentes a niveles elevados. Se cree que muchos efectos patológicos de la IL-6, es decir, su implicación en las enfermedades, están mediados por el complejo IL-6 soluble:IL6Ra. Sin embargo, la IL-6 también tiene efectos biológicos beneficiosos in vivo, tal como en la mediación de la respuesta del organismo frente a la infección. Determinados efectos beneficiosos de la IL-6 pueden estar mediados a través de la unión a IL-6Ra transmembranario más que a través de sIL-6Ra. Dado que el complejo IL-6:sIL-6Ra se forma en la circulación sistémica, mientras que el complejo IL-6:IL-6Ra transmembranario se forma sobre la superficie de la célula y se internaliza rápidamente en la célula, el IL-6:sIL-6Ra puede estar más disponible que el 35 complejo transmembranario para la unión por miembros de unión de la invención. En consecuencia, los miembros de unión divulgados en el presente documento pueden tener mayor especificidad por inhibir los efectos patológicos de la IL-6 que por los efectos beneficiosos de la IL-6, en comparación con los miembros de unión que se unen a IL-6

o a IL-6Ra fuera del complejo IL-6:IL-6Ra.

Se puede usar cualquier método adecuado para determinar si un miembro de unión se une a IL-6:IL-6Ra (por ejemplo, IL-6:sIL-6Ra), IL-6 y/o IL-6Ra (por ejemplo, sIL-6Ra). En la técnica se conocen métodos de determinación y cuantificación de miembros de unión y en el presente documento se describen ejemplos con detalle (véase la sección de materiales y métodos). Los métodos descritos en los ejemplos se ejemplifican para su uso con moléculas de anticuerpo, pero se pueden adaptar para su uso con cualquier miembro de unión. Un método adecuado puede 45 comprender cuantificar la unión de un miembro de unión (i) a IL-6 sola (no complejada con IL-6Ra), (ii) a IL-6Ra solo, por ejemplo, sIL-6Ra (no complejado con IL-6), y (iii) a IL-6:IL-6Ra, por ejemplo, IL-6:sIL-6Ra. Como se destaca en otra parte del presente documento, se puede usar hiper IL-6 en ensayos para representar IL-6:IL-6Ra. Por tanto, un miembro de unión divulgado en el presente documento se puede unir a hiper IL-6 y no unirse a IL-6 o a IL-6Ra solos. Como se ejemplifica en el presente documento, un método puede comprender un ELISA para determinar la especificidad de moléculas de anticuerpo. En los ejemplos, se midió el nivel de unión como cuentas de europio; sin embargo, se puede emplear cualquier sistema indicador o marcador detectable adecuado. Además, un método puede comprender cuantificar la unión a (iv) un antígeno de control, en el que el antígeno de control es un antígeno al que no se une el miembro de unión, es decir, un control negativo. Se puede decir que un miembro de unión se une a IL-6 si el nivel de unión a IL-6 es al menos 2,5 veces mayor que el nivel de unión al antígeno de control. Se

55 puede decir que un miembro de unión se une a IL-6R si el nivel de unión a IL-6R es al menos 2,5 veces mayor que el nivel de unión al antígeno de control. Se puede decir que un miembro de unión se une a IL-6:IL-6Ra si el nivel de unión a IL-6:IL-6Ra es al menos 2,5 veces mayor que el nivel de unión al antígeno de control.

El nivel de unión a (iii) con relación a la unión a (i) y (ii) cuantificado para un miembro de unión indica el grado de especificidad del miembro de unión para el complejo IL-6:IL-6Ra en relación con IL-6 y IL-6Ra solos. Por ejemplo, el nivel de unión a IL-6:IL-6Ra puede ser al menos 2,5 veces mayor que el nivel de unión a IL-6 y IL-6Ra, respectivamente. El nivel de unión puede ser al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 80, 85 o al menos 90 veces mayor.

65 Como se describe con más detalle a continuación, se ha demostrado que los miembros de unión divulgados en el presente documento neutralizan el IL-6:IL-6Ra con gran potencia. La neutralización significa la inhibición de una actividad biológica de IL-6:IL-6Ra (por ejemplo, IL-6:sIL-6Ra). Los miembros de unión divulgados en el presente documento pueden neutralizar una o más actividades de IL-6:IL-6Ra. Típicamente, la actividad biológica inhibida es la unión de IL-6:IL-6Ra (por ejemplo, IL-6:sIL-6Ra) a gp130. De acuerdo con la invención, se inhibe la unión de IL6:IL-6Ra a gp130.

5 La inhibición de la actividad biológica puede ser parcial o total. Los miembros de unión pueden inhibir la actividad biológica de IL-6:IL-6Ra en un 100 %, o al menos un 95 %, al menos un 90 %, al menos un 85 %, al menos un 80 %, al menos un 75 %, al menos un 70 %, al menos un 60 %, o al menos un 50 % de la actividad en ausencia del miembro de unión.

Se puede determinar la potencia neutralizadora de un miembro de unión. Normalmente, la potencia se expresa como un valor de CI50, en nM a menos que se indique lo contrario. En ensayos funcionales, la CI50 es la concentración de un miembro de unión que reduce una respuesta biológica en un 50 % de su máximo. En estudios de unión de ligando, la CI50 es la concentración que reduce la unión al receptor en un 50 % del nivel de unión

15 específica máxima. Por tanto, en un ensayo que mide la inhibición de la unión del complejo IL-6:IL-6Ra a gp130, la CI50 es la concentración que reduce la unión a gp130 en un 50 % del nivel de unión específica máxima. La CI50 se puede calcular representando gráficamente el % de respuesta biológica máxima en función del log de la concentración de miembro de unión, y usando un programa informático, tal como Prism (GraphPad) para ajustar una función sigmoidal a los datos para generar valores de CI50. La potencia se puede determinar o medir usando uno o más ensayos conocidos por el experto y/o como se describe o se refiere en el presente documento.

La neutralización de la actividad de IL-6:IL-6Ra por un miembro de unión en un ensayo descrito en el presente documento indica que el miembro de unión se une y neutraliza IL-6:IL-6Ra. Otros métodos que se pueden usar para determinar la unión de un miembro de unión a IL-6:IL-6Ra incluyen ELISA, transferencia de bandas western,

25 inmunoprecipitación, cromatografía de afinidad y ensayos bioquímicos.

Un miembro de unión divulgado en el presente documento puede inhibir la unión del complejo IL-6:IL-6Ra a gp130. La inhibición de la unión de IL-6:IL-6Ra a gp130 se puede medir en un ensayo, por ejemplo, un ensayo HTRF® (de fluorescencia de resolución temporal homogénea) para la inhibición de la unión de hiper IL-6 marcada con FLAG HIS a Fc de gp130 humano recombinante, como se describe en la sección de materiales y métodos de los ejemplos. Los valores de CI50 del ensayo HTRF como se describe en el presente documento son para una concentración final de 1 nM de complejo y 1 nM de gp130. Como se muestra en los ejemplos del presente documento, un miembro de unión puede tener una potencia neutralizadora o CI50 de no más de 700 nM en un ensayo HTRF con una concentración final de 1 nM de complejo IL-6:IL-6Ra y una concentración final de 1 nM de gp130, por ejemplo, de no

35 más de 30, 25, 20, 15, 10, 5, 1,5, 1, 0,8 o 0,7 nM (véase, por ejemplo, la tabla 2).

Un miembro de unión puede comprender una molécula de anticuerpo, por ejemplo, una molécula de anticuerpo humano. Normalmente, el miembro de unión comprende un dominio VH y/o VL de anticuerpo. También se proporcionan como parte de la invención dominios VH y VL de miembros de unión. Dentro de cada uno de los dominios VH y VL hay regiones determinantes de la complementariedad ("CDR") y regiones estructurales ("FR"). Un dominio VH comprende un conjunto de HCDR y un dominio VL comprende un conjunto de LCDR. Una molécula de anticuerpo puede comprender un dominio VH de anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 y una región estructural de VH. Una molécula de anticuerpo puede comprender alternativamente o además un dominio VL de anticuerpo que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 y una región estructural de VL. Los ejemplos de dominios VH y VL

45 de anticuerpo y CDR son como se enumera en el listado de secuencias adjunto que forma parte de la presente divulgación.

Como se describe en el presente documento, un "conjunto de CDR" comprende CDR1, CDR2 y CDR3. Por tanto, un conjunto de HCDR se refiere a HCDR1, HCDR2 y HCDR3, y un conjunto de LCDR se refiere a LCDR1, LCDR2 y LCDR3. A menos que se indique lo contrario, un "conjunto de CDR" incluye HCDR y LCDR. Típicamente, los miembros de unión divulgados en el presente documento son anticuerpos monoclonales.

Un miembro de unión como se divulga puede comprender un sitio de unión a antígeno dentro de una molécula que no es un anticuerpo, proporcionado normalmente por una o más CDR, por ejemplo, un conjunto de CDR en un

55 esqueleto proteínico que no es un anticuerpo, como se analiza con más detalle a continuación.

Como se describe con más detalle en los ejemplos, se aislaron cinco moléculas de anticuerpo, numerados anticuerpos de 1 a 5. Las secuencias de cada uno de los anticuerpos 1 a 5 se proporcionan en el listado de secuencias adjunto, en el que para cada anticuerpo se muestran las siguientes secuencias en orden: secuencia de nucleótidos que codifica el dominio VH; secuencia de aminoácidos del dominio VH; secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH, secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH; secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH; secuencia de nucleótidos que codifica el dominio VL; secuencia de aminoácidos del dominio VL; secuencia de aminoácidos de CDR1 de VL; secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL; y secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL, respectivamente.

65 Un miembro de unión como el de la divulgación puede comprender una o más CDR como se describe en el presente documento, por ejemplo, una CDR3, y, opcionalmente, también una CDR1 y una CDR2 para formar un conjunto de CDR. La CDR o conjunto de CDR puede ser una CDR o conjunto de CDR de cualquiera de los anticuerpos 1 a 5, o puede ser una variante de los mismos como se describe en el presente documento.

5 La invención divulga miembros de unión que comprenden una HCDR1, HCDR2 y/o HCDR3 de cualquiera de los anticuerpos 1 a 5 y/o una LCDR1, LCDR2 y/o LCDR3 de cualquiera de los anticuerpos 1 a 5, por ejemplo, un conjunto de CDR de cualquiera de los anticuerpos 1 a 5.

El miembro de unión puede comprender un conjunto de CDR de VH de uno de estos anticuerpos. Opcionalmente, también puede comprender un conjunto de CDR de VL de uno de estos anticuerpos, y las CDR de VL pueden ser del mismo anticuerpo o de uno diferente que las CDR de VH.

Se divulgan un dominio VH que comprende un conjunto de HCDR de cualquiera de los anticuerpos 1 a 5 y/o un dominio VL que comprende un conjunto de LCDR de cualquiera de los anticuerpos 1 a 5.

15 Típicamente, se empareja un dominio VH con un dominio VL para proporcionar un sitio de unión a antígeno de anticuerpo, aunque como se analiza con más detalle a continuación, se puede usar un dominio VH o VL solo para unir el antígeno. Se puede emparejar el dominio VH del anticuerpo 1 con el dominio VL del anticuerpo 1, de modo que se forma un sitio de unión a antígeno de anticuerpo que comprende tanto el dominio VH como el VL del anticuerpo 1. Se proporcionan modos de realización análogos para los demás dominios VH y VL divulgados en el presente documento. En otros aspectos, el VH del anticuerpo 1 VH se empareja con un dominio VL distinto del VL del anticuerpo. La mezcla de cadenas ligeras está ben establecida en la técnica. De nuevo, la invención proporciona modos de realización análogos para los demás dominios VH y VL divulgados en el presente documento.

25 Por tanto, el VH de cualquiera de los anticuerpos 1 a 5 se puede emparejar con el VL de cualquiera de los anticuerpos 1 a 5.

Un miembro de unión puede comprender un conjunto de H y/o L CDR de cualquiera de los anticuerpos 1 a 5 con una o más mutaciones de aminoácidos dentro del conjunto de H y/o L CDR divulgado. La mutación puede ser una sustitución, deleción o inserción de aminoácido. Por tanto, por ejemplo, puede haber una o más sustituciones de aminoácidos dentro del conjunto de H y/o L CDR divulgado. Por ejemplo, puede haber hasta 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 mutaciones, por ejemplo, sustituciones, dentro del conjunto de H y/o L CDR. Por ejemplo, puede haber hasta 6, 5, 4, 3 o 2 mutaciones, por ejemplo, sustituciones, en HCDR3 y/o puede haber hasta 6, 5, 4, 3, o 2 mutaciones, por ejemplo, sustituciones, en LCDR3.

35 Un miembro de unión puede comprender una molécula de anticuerpo que tiene una o más CDR, por ejemplo, un conjunto de CDR, dentro de una región estructural de un anticuerpo. Por ejemplo, se pueden injertar una o más CDR

o un conjunto de CDR de un anticuerpo en una región estructural (por ejemplo, una región estructural humana) para proporcionar una molécula de anticuerpo. Las regiones estructurales pueden ser de secuencias de segmentos génicos de línea germinal humana. Por tanto, la región estructural se puede germinalizar, de manera que se cambian uno o más residuos de la región estructural para que coincidan con los residuos en la posición equivalente de la región estructural germinalizada más similar. Un miembro de unión puede ser una molécula de anticuerpo humano aislado que tiene un dominio VH que comprende un conjunto de HCDR en una región estructural de línea germinal humana.

45 Normalmente, el miembro de unión también tiene un dominio VL que comprende un conjunto de LCDR, por ejemplo, en una región estructural de línea germinal humana.

Un dominio VL germinalizado puede estar o no germinalizado en el residuo de Vernier, pero normalmente no lo está.

El codón ggt en 3' y el residuo de glicina correspondiente, mostrados en las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de los dominios VL de los anticuerpos 1, 2, 3, 4 y 5, respectivamente, se incluyeron en las secuencias de scFv e IgG expresadas de estos anticuerpos. El residuo de glicina C terminal es el residuo 109 de SEQ ID NO: 7, el residuo 114 de SEQ ID NO: 17, el residuo 112 de SEQ ID NO: 27 y 47 y el residuo 113 de SEQ ID NO: 37.

55 Usando la numeración de Kabat, estas posiciones corresponden al residuo de Kabat 108. El origen de este residuo y su triplete codificante ggt se explica a continuación.

Para expresar la cadena ligera de la IgG, se proporcionó una secuencia de nucleótidos que codificaba la cadena ligera, que comprendía un primer exón que codificaba el dominio VL, un segundo exón que codificaba el dominio CL y un intrón que separaba el primer exón y el segundo exón. En circunstancias normales, el intrón se elimina por ayuste por la maquinaria celular de procesamiento del ARNm, uniendo el extremo 3' del primer exón al extremo 5' del segundo exón. Por tanto, cuando se expresó el ADN que tenía dicha secuencia de nucleótidos como ARN, se juntaron por ayuste el primer y el segundo exón. La traducción del ARN ayustado produce un polipéptido que comprende el dominio VL y el dominio CL. Después del ayuste, la glicina C terminal (correspondiente al residuo de

65 Kabat 108) se codifica por la última base (g) de la secuencia de la región estructural 4 del dominio VL y las dos primeras bases (gt) del dominio CL. Se puede considerar que el residuo de glicina del residuo de Kabat 108 es el

residuo C terminal del dominio VL de la molécula de anticuerpo.

Un miembro de unión puede ser uno que compite por la unión a IL-6:IL-6Ra, por ejemplo, IL-6:sIL-6Ra, con cualquier miembro de unión que (i) se une a IL-6:IL-6Ra, por ejemplo, IL-6:sIL-6Ra y (ii) comprende un miembro de unión, una 5 CDR, por ejemplo, HCDR3, y/o un conjunto de CDR de dominio VH y/o VL divulgadas en el presente documento.

La competición entre los miembros de unión se puede someter a ensayo fácilmente in vitro, por ejemplo, usando un ELISA y/o uniendo como marca a un miembro de unión una molécula indicadora específica que se puede detectar en presencia de uno o más miembros de unión no marcados, para permitir la identificación de miembros de unión que se unen al mismo epítopo o a un epítopo superpuesto. Un experto en la técnica conoce fácilmente estos métodos y se describen con más detalle en el presente documento. Por tanto, otro aspecto de la presente divulgación proporciona un miembro de unión que comprende un sitio de unión a antígeno de anticuerpo que compite con una molécula de anticuerpo, por ejemplo, una molécula de anticuerpo que comprende una CDR, por ejemplo, HCDR3, o un conjunto de CDR de dominio VH y/o VL de cualquiera de los anticuerpos 1 a 5 para la unión a

15 IL-6:IL-6Ra, por ejemplo, IL-6:sIL-6Ra.

En otros aspectos, la invención divulga un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un miembro de unión, un dominio VH y/o un dominio VL de acuerdo con la presente invención y métodos de preparación de un miembro de unión, un dominio VH y/o un dominio VL de la invención, que comprenden expresar dicho ácido nucleico en condiciones para dar lugar a la producción de dicho miembro de unión, dominio VH y/o dominio VL, y recuperarlo.

Otro aspecto de la presente invención divulga un ácido nucleico, en general aislado, que codifica una secuencia CDR de VH o CDR de VL divulgada en el presente documento.

25 Otro aspecto divulga una célula huésped que contiene o está transformada con un ácido nucleico de la invención.

Otros aspectos de la presente invención divulgan composiciones que contienen miembros de unión de la invención y su uso en métodos de unión, inhibición y/o neutralización de IL-6:IL-6Ra, por ejemplo, el complejo IL-6:sIL-6Ra, incluyendo métodos para tratar el cuerpo humano o de animal mediante tratamiento.

Los miembros de unión de la divulgación son útiles para tratar trastornos asociados con la IL-6, como se describe con detalle en otra parte del presente documento.

35 Los miembros de unión de acuerdo con la divulgación se pueden usar en un método de tratamiento o diagnóstico, tal como un método de tratamiento (que puede incluir tratamiento profiláctico) de una enfermedad o trastorno del cuerpo humano o de animal (por ejemplo, en un paciente humano), que comprende administrar a dicho paciente una cantidad eficaz de un miembro de unión de la invención. Las afecciones tratables de acuerdo con la presente divulgación incluyen cualquiera en la que la IL-6 desempeñe un papel, como se analiza con detalle en otra parte del presente documento.

Estos y otros aspectos de la invención se describen con más detalles a continuación.

Terminología

45 Conviene destacar aquí que "y/o" cuando se usa en el presente documento se debe tomar como la divulgación específica de cada uno de los dos componentes o características especificados con o sin el otro. Por ejemplo "A y/o B" se debe tomar como la divulgación específica de cada uno de (i) A, (ii) B y (iii) A y B, exactamente igual que si se describiera cada uno individualmente en el presente documento.

IL-6 y receptor de IL-6

IL-6 es interleucina 6.

55 La secuencia de aminoácidos de longitud completa de la IL-6 humana es SEQ ID NO: 51. Esta secuencia se escinde in vivo para eliminar un péptido líder N-terminal y la secuencia madura de la IL-6 es SEQ ID NO: 59. La secuencia madura representa la IL-6 circulante in vivo, que es el antígeno objetivo para las aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico in vivo como se describe en el presente documento. En consecuencia, normalmente, la IL-6 a la que se hace referencia en el presente documento es la IL-6 humana madura, a menos que el contexto indique lo contrario.

El receptor a de IL-6, IL-6Ra, es el receptor de la interleucina 6. El IL-6Ra también se conoce como IL-6Ra, IL-6Ra, IL-6R y CD126. El IL-6Ra existe in vivo en forma transmembranaria y en forma soluble. Las referencias al IL-6Ra pueden ser al IL-6Ra transmembranario y/o al IL-6Ra soluble, a menos que el contexto indique lo contrario.

65 Una secuencia de aminoácidos del IL-6Ra humano soluble (sIL-6R, sIL-6Ra) es SEQ ID NO: 51. Una secuencia de aminoácidos del IL-6Ra humano transmembranario es SEQ ID NO: 57.

La IL-6 se une al IL-6Ra para formar un complejo, IL-6:IL-6Ra. El IL-6:IL-6Ra también se puede denominar en el presente documento "el antígeno". El complejo puede ser soluble (con sIL-6Ra) o estar unido a la membrana (con IL6Ra). Cuando el IL-6Ra está en la forma soluble, es complejo se denomina IL-6:sIL-6Ra. Las referencias al IL-6:IL

5 6Ra pueden incluir IL-6 complejada con IL-6Ra transmembranario o soluble, a menos que se indique lo contrario.

Los aspectos de la invención como se describen en el presente documento se detallan en los ejemplos con referencia al sIL-6Ra y el IL-6:sIL-Ra, y el IL-6:sIL-6Ra es un antígeno objetivo de interés, por ejemplo, para aplicaciones in vivo, ya que este complejo se puede unir en la circulación sistémica a miembros de unión de la invención. Sin embargo, los miembros de unión de la invención pueden unirse también o en su lugar al complejo formado por la IL-6 y el IL-6Ra transmembranario, lo que también es un antígeno objetivo de interés para aplicaciones in vivo.

La hiper IL-6 es una proteína de fusión en la que la IL-6 está unida covalentemente al sIL-6Ra por medio de un 15 péptido enlazador. La secuencia de la hiper IL-6 como se usa en los ejemplos es SEQ ID NO: 55.

La IL-6, el IL-6Ra (por ejemplo, el sIL-6Ra) y la hiper IL-6 se pueden conjugar con un marcador detectable, tal como HIS FLAG, por ejemplo, para su uso en ensayos como se describe en el presente documento. Por ejemplo, se puede usar una proteína de fusión que comprenda IL-6, IL-6Ra (por ejemplo, sIL-6Ra) o hiper IL-6 conjugados con una secuencia HIS FLAG. Una secuencia de IL-6 humana marcada con HIS FLAG es SEQ ID NO: 52. Una secuencia de sIL-6Ra humano marcado con HIS FLAG es SEQ ID NO: 53. Una secuencia de hiper IL-6 marcada con HIS FLAG es SEQ ID NO: 56.

gp130

25 gp130 es un receptor del complejo IL-6:IL-6Ra. En Hibi et al., Cell 63:1149-1157 1990 se informa de la clonación y la caracterización de gp130. Una secuencia de gp130 humano es SEQ ID NO: 58.

Miembro de unión

Esto describe un miembro de un par de moléculas que se unen entre sí. Los miembros de un par de unión se pueden obtener de forma natural o producirse total o parcialmente de forma sintética. Un miembro del par de moléculas tiene una zona en su superficie, o una cavidad, que se une a y, por lo tanto, es complementaria a una organización espacial y polar en particular del otro miembro del par de moléculas. Los ejemplos de tipos de pares de

35 unión son antígeno-anticuerpo, biotina-avidina, hormona-receptor de hormona, receptor-ligando, enzima-sustrato. La presente invención se refiere a las reacciones de tipo antígeno-anticuerpo.

Normalmente, un miembro de unión comprende una molécula que tiene un sitio de unión a antígeno. Por ejemplo, un miembro de unión puede ser una molécula de anticuerpo o una proteína que no es un anticuerpo que comprende un sitio de unión a antígeno.

Se puede proporcionar un sitio de unión a antígeno por medio del reordenamiento de CDR en esqueletos de proteínas que no son anticuerpos, tales como fibronectina o citocromo B etc. [1, 2, 3], o por aleatorización o mutación de residuos de aminoácido de un bucle del esqueleto de la proteína para conferir especificidad de unión 45 por un objetivo deseado. Los esqueletos para crear sitios de unión novedosos en proteínas se han revisado con detalle por Nygren et al. [3]. Se divulgan esqueletos proteínicos para miméticos de anticuerpos en el documento WO /0034784, en el que los inventores describen proteínas (miméticos de anticuerpos) que incluyen un dominio de fibronectina tipo III que tiene al menos un bucle aleatorizado. Un esqueleto adecuado en el que injertar una o más CDR, por ejemplo, un conjunto de HCDR, lo puede proporcionar cualquier miembro de dominio de la superfamilia de genes de inmunoglobulina. El esqueleto puede ser una proteína humana o no humana. Una ventaja de un esqueleto proteínico que no es un anticuerpo es que puede proporcionar un sitio de unión a antígeno en una molécula esqueleto que es más pequeña y/o más fácil de fabricar que al menos algunas moléculas de anticuerpo. El tamaño pequeño de un miembro de unión puede conferir propiedades fisiológicas útiles, tales como una capacidad de entrar en las células, penetrar profundamente en tejidos o alcanzar objetivos dentro de otras estructuras, o unirse dentro de

55 cavidades proteínicas del antígeno objetivo. El uso de sitios de unión a antígeno en esqueletos proteínicos que no son anticuerpos se revisa en Wess, 2004 [4]. Son típicas las proteínas que tienen una estructura estable y uno o más bucles variables, en los que se muta la secuencia de aminoácidos del bucle o bucles de forma específica o aleatoria para crear un sitio de unión a antígeno que se una al antígeno objetivo. Estas proteínas incluyen los dominios de unión a IgG de la proteína A de S. aureus, la transferrina, la tetranectina, la fibronectina (por ejemplo, el 10º dominio de fibronectina de tipo III), las lipocalinas y la gamma-cristalina y otros esqueletos Affilin™ (Scil Proteins). Los ejemplos de otros enfoques incluyen "microcuerpos" sintéticos a base de ciclótidos (proteínas pequeñas que tienen enlaces disulfuro intramoleculares), microproteínas (Versabodies™, Amunix) y proteínas con repeticiones de anquirina (DARPins, Molecular Partners).

65 Además de las secuencias de anticuerpo y/o un sitio de unión a antígeno, un miembro de unión puede comprender otros aminoácidos, por ejemplo, que formen un péptido o polipéptido, tal como un dominio plegado, o para impartir a la molécula otra característica funcional además de la capacidad de unir antígenos. Los miembros de unión de la invención pueden llevar un marcador detectable o pueden estar conjugados con una toxina o un resto marcador o enzima (por ejemplo, por medio de un enlazador o un enlace peptidilo). Por ejemplo, un miembro de unión puede comprender un sitio catalítico (por ejemplo, en un dominio enzimático), así como un sitio de unión a antígeno, en el

5 que el sitio de unión a antígeno se une al antígeno y dirige así el sitio catalítico al antígeno. El sitio catalítico puede inhibir la función biológica del antígeno, por ejemplo, por escisión.

No obstante, como se indica, las CDR las pueden llevar esqueletos que no son anticuerpos, por lo general, la estructura portadora de una CDR o un conjunto de CDR de la invención será una secuencia de cadena pesada o ligera de anticuerpo o una parte sustancial de la misma en la que se sitúa la CDR o el conjunto de CDR en una posición que corresponde a la CDR o conjunto de CDR de dominios variables de anticuerpo VH y VL naturales codificados por genes de inmunoglobulina reordenados. Las estructuras y posiciones de los dominios variables de inmunoglobulina se pueden determinar por referencia a Kabat, et al., 1987 [5] y actualizaciones del mismo. En esta base de datos existen una serie de recursos académicos y comerciales en línea disponibles para su consulta. Por

15 ejemplo, véase la ref. [6] y el recurso en línea asociado, actualmente en la dirección de Internet http://www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html.

Con región CDR o CDR, se pretende indicar las regiones hipervariables de las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina como se define por Kabat et al. 1991 [7] y ediciones posteriores. Típicamente, un anticuerpo contiene 3 CDR de cadena pesada y 3 CDR de cadena ligera. El término CDR se usa aquí con el fin de indicar, según el caso, una de estas regiones o varias, o incluso la totalidad, de estas regiones que contienen la mayoría de los residuos de aminoácido responsables de la unión por afinidad del anticuerpo por el antígeno o el epítopo que reconoce.

25 Entre las seis secuencias de CDR cortas, las tercera CDR de la cadena pesada (HCDR3) tiene una mayor variabilidad de tamaño (mayor diversidad, debida esencialmente a los mecanismos de reordenamiento de los genes que dan lugar a ella). Puede ser de tan solo 2 aminoácidos, aunque el tamaño más largo conocido es de 26. La longitud de la CDR puede variar también de acuerdo con la longitud que pueda alojar la región estructural subyacente en particular. Funcionalmente, la HCDR3 desempeña un papel en parte en la determinación de la especificidad del anticuerpo [refs. 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15].

Molécula de anticuerpo

Esto describe una inmunoglobulina bien natural o parcial o totalmente producida de forma sintética. El término

35 también cubre cualquier polipéptido o proteína que comprenda un sitio de unión a antígeno de anticuerpo. Se debe entender aquí que la invención no se refiere a los anticuerpos en forma natural, es decir, no están en su entorno natural, sino que se han podido aislar u obtener por purificación a partir de fuentes naturales, o se han obtenido por recombinación genética, o por síntesis química, y que pueden contener aminoácidos no naturales como se describirá más adelante. Los fragmentos de anticuerpo que comprenden un sitio de unión a antígeno de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, moléculas tales como Fab, Fab', Fab'-SH, scFv, Fv, dAb y Fd. Se han creado diversas otras moléculas de anticuerpo que incluyen uno o más sitios de unión a antígeno de anticuerpo, incluyendo, por ejemplo, Fab2, Fab3, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y minicuerpos. En [16] se describen moléculas de anticuerpo y métodos para su construcción y uso.

45 Es posible tomar anticuerpos monoclonales y otros y usar técnicas de tecnología de ADN recombinante para producir otros anticuerpos o moléculas quiméricas que se unen al antígeno objetivo. Estas técnicas pueden implicar introducir ADN que codifica la región variable de inmunoglobulina, o las CDR, de un anticuerpo en las regiones constantes, o regiones constantes más regiones estructurales, de una inmunoglobulina diferente. Véanse, por ejemplo, los documentos EP-A-184187, GB 2188638A o EP-A-239400, y un gran volumen de literatura posterior. Se puede someter un hibridoma u otra célula que produzca un anticuerpo a mutación genética u otros cambios, que pueden o no modificar la especificidad de unión de los anticuerpos producidos.

Como los anticuerpos se pueden modificar de una serie de maneras, se debería considerar que el término "molécula de anticuerpo" cubre cualquier miembro de unión o sustancia que tenga un sitio de unión a antígeno de anticuerpo

55 con la especificidad y/o unión al antígeno necesarias. Por tanto, este término cubre fragmentos de anticuerpo y derivados, incluyendo cualquier polipéptido que comprenda un sitio de unión a antígeno de anticuerpo, sea natural o total o parcialmente sintético. Por lo tanto, se incluyen las moléculas quiméricas que comprenden un sitio de unión a antígeno de anticuerpo, o equivalente, fusionado a otro polipéptido (por ejemplo, derivado de otra especie o perteneciente a otra clase o subclase de anticuerpo). La clonación y expresión de anticuerpos quiméricos se describen en los documentos EP-A-0120694 y EP-A-0125023 y en un gran volumen de literatura posterior.

Otras técnicas disponibles en la técnica de la creación de anticuerpos han permitido aislar anticuerpos humanos y humanizados. Por ejemplo, se pueden preparar hibridomas humanos como se describe por Kontermann y Dubel [17]. La presentación en fagos, otra técnica establecida para generar miembros de unión, se ha descrito con detalle 65 en muchas publicaciones, tales como Kontermann y Dubel [17] y en el documento WO 92/0104 (analizado con detalle a continuación) y en las patentes de EE. UU. US 5969108, US 5565332, US 5733743, US 5858657, US

5871907, US 5872215, US 5885793, US 5962255, US 6140471, US 6172197, US 6225447, US 6291650, US 6492160, US 6521404.

Para aislar anticuerpos humanos se pueden usar ratones transgénicos en los que se inactivan los genes de

5 anticuerpo de ratón y se reemplazan funcionalmente con genes de anticuerpo humanos dejando intactos al mismo tiempo otros componentes del sistema inmunitario del ratón [18]. Se pueden producir anticuerpos humanos usando técnicas conocidas en la técnica como las divulgadas, por ejemplo, en los documentos WO 91/09967, US 5585089, EP 592106, US 565332 y WO 93/17105. WO 93/17105. Además, el documento WO 2004/006955 describe métodos para humanizar anticuerpos, basados en seleccionar secuencias de región estructural de región variable de genes de anticuerpo humanos por comparación de tipos de estructuras de CDR canónicas para secuencias CDR de la región variable de un anticuerpo no humano con tipos de estructuras de CDR canónicas para CDR correspondientes de una colección de secuencias de anticuerpos humanos, por ejemplo, segmentos de genes de anticuerpos de línea germinal. Las regiones variables de anticuerpos humanos que tienen tipos de estructuras de CDR canónicas similares a las de CDR no humanas forman un subconjunto de miembros de secuencias de anticuerpos humanos

15 del que seleccionar secuencias de región estructural humanas. Los miembros del subconjunto se pueden clasificar además por similitud de aminoácidos entre las secuencias de CDR humanas y no humanas. En el método del documento WO 2004/006955, se seleccionan las secuencias humanas mejor clasificadas para proporcionar las secuencias de región estructural para construir un anticuerpo quimérico que reemplace funcionalmente las secuencias de CDR humanas con las equivalentes de CDR no humanas usando las regiones estructurales humanas de los miembros del subconjunto seleccionados, proporcionando de este modo un anticuerpo humanizado de alta afinidad y baja inmunogenicidad sin necesidad de comparar las secuencias de región estructural entre anticuerpos humanos y no humanos. También se divulgan anticuerpos quiméricos preparados de acuerdo con el método.

Se pueden crear moléculas de anticuerpo sintéticas por expresión de genes generados por medio de

25 oligonucleótidos sintetizados y ensamblados en vectores de expresión adecuados, por ejemplo, como se describe por Knappik et al. [19] o Krebs et al. [20].

Se ha demostrado que los fragmentos de un anticuerpo completo pueden realizar la función de unir antígenos. Son ejemplos de fragmentos de unión (i) el fragmento Fab que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) el fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iii) el fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un anticuerpo individual; (iv) el fragmento dAb [21, 22, 23], que consiste en un dominio VH o uno VL; (v) regiones CDR aisladas; (vi) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados (vii) moléculas Fv monocatenarias (scFv), en las que un dominio VH y uno VL están enlazados por un enlazador peptídico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión a antígeno [24, 25]; (viii)

35 dímeros biespecíficos de Fv monocatenarios (en el documento PCT/US92/09965) y (ix) "diacuerpos", fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos por fusión génica (en el documento WO 94/13804 [26]). Las moléculas de Fv, scFv o diacuerpos se pueden estabilizar por la incorporación de puentes disulfuro que enlazan los dominios VH y VL [27]. También se pueden preparar minicuerpos que comprenden un scFv unido a un dominio CH3 [28]. Otros ejemplos de fragmentos de unión son Fab', que difiere de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxilo del de cadena pesada CH1, incluyendo una o más cisteínas de la región de bisagra del anticuerpo, y Fab'-SH, que es un fragmento Fab' en el que el/los residuo(s) de cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol libre.

Qui et al. [29] describieron moléculas de anticuerpo que contenían sólo dos CDR enlazadas por una región

45 estructural. La CDR3 del dominio VH o VL estaba enlazada al bucle CDR1 o CDR2 del otro dominio. El enlace era a través del extremo C terminal de las CDR1 o CDR2 seleccionadas al extremo N terminal de la CDR3, por medio de una región FR. Qui et al. seleccionaron la región FR con menos parches hidrófobos. Se descubrió que la mejor combinación para los anticuerpos sometidos a prueba era la CDR1 de VL enlazada por la FR2 de VH a la CDR3 de VH (VHCDR1-VHFR2-VLCDR3). A un peso molecular de aproximadamente 3 kDa, estas moléculas de anticuerpo ofrecen ventajas en términos de mejor penetración en el tejido en comparación con inmunoglobulinas completas (aprox. 150 kDa) o scFv (aprox. 28 kDa).

Se pueden obtener fragmentos de anticuerpo de la invención partiendo de cualquiera de las moléculas de anticuerpo 1 a 5, por métodos tales como digestión con enzimas, por ejemplo, pepsina o papaína, y/o por escisión de los

55 puentes disulfuro por reducción química.

De otro modo, los fragmentos de anticuerpo comprendidos en la presente invención se pueden obtener por técnicas de recombinación genética bien conocidas también por el experto en la técnica o, si no, por síntesis peptídica, por ejemplo, por medio de sintetizadores peptídicos automáticos, tales como los suministrados por la empresa Applied Biosystems, etc., o por síntesis y expresión de ácidos nucleicos.

Los fragmentos de anticuerpo funcionales de acuerdo con la presente divulgación incluyen cualquier fragmento funcional cuya semivida esté aumentada por una modificación química, especialmente por PEGilación, o por incorporación en un liposoma.

65 Un dAc (anticuerpo de dominio) es un fragmento de unión a antígeno monomérico pequeño de un anticuerpo, a saber, la región variable de una cadena pesada o ligera de un anticuerpo [23]. Los dAc de VH se producen de forma natural en camélidos (por ejemplo, camello, llama) y se pueden producir inmunizando un camélido con un antígeno objetivo, aislando linfocitos B específicos de antígeno y clonando directamente los genes de dAc a partir de linfocitos B individuales. Los dAc también se pueden reproducir en cultivo celular. Su pequeño tamaño, buena solubilidad y

5 estabilidad térmica los hace particularmente útiles en el ámbito fisiológico y adecuados para la selección y la maduración de la afinidad.

Se están desarrollando dAc de VH de camélidos para uso terapéutico con el nombre "nanocuerpos ™". Un miembro de unión de la presente divulgación puede ser un dAc que comprende un dominio VH o VL sustancialmente como se describe en el presente documento, o un dominio VH o VL que comprende un conjunto de CDR sustancialmente como se describe en el presente documento.

Los anticuerpos biespecíficos o bifuncionales forman una segunda generación de anticuerpos monoclonales en la que se combinan dos regiones variables diferentes en la misma molécula [30]. Se ha demostrado su uso tanto en el 15 campo del diagnóstico como en el campo del tratamiento por su capacidad para reclutar nuevas funciones efectoras

o para dirigirse a varias moléculas sobre la superficie de células tumorales. Cuando se quieren usar anticuerpos biespecíficos, pueden ser anticuerpos biespecíficos convencionales, que se pueden fabricar de una variedad de maneras [31], por ejemplo, preparados químicamente o a partir de hibridomas híbridos, pueden ser cualquiera de los fragmentos de anticuerpo biespecíficos mencionados anteriormente. Estos anticuerpos se pueden obtener por métodos químicos [32, 33] o métodos somáticos [34, 35], pero también y de forma preferente, por técnicas de ingeniería genética que permiten forzar la heterodimerización y facilitar así el proceso de purificación del anticuerpo deseado [36]. Los ejemplos de anticuerpos biespecíficos incluyen los de la tecnología BiTE ™, en los que se pueden usar los dominios de unión de dos anticuerpos con diferente especificidad y enlazarlos directamente por medio de péptidos flexibles cortos. Esto combina dos anticuerpos en una sola cadena polipeptídica corta. Se pueden construir

25 diacuerpos y scFv sin una región Fc, usando sólo dominios variables, reduciendo potencialmente los efectos de la reacción antiidiotípica.

Los anticuerpos biespecíficos se pueden construir como IgG enteras, como Fab'2 biespecíficos, como Fab'PEG, como diacuerpos o, si no, como scFv biespecíficos. Además, se pueden enlazar dos anticuerpos biespecíficos usando métodos de rutina conocidos en la técnica para formar anticuerpos tetravalentes.

Los anticuerpos biespecíficos, en contraposición con los anticuerpos completos biespecíficos, también pueden ser particularmente útiles porque se pueden construir fácilmente y expresarse en E.coli. Los diacuerpos (y muchos otros polipéptidos, tales como fragmentos de anticuerpo) de especificidades de unión apropiadas se pueden seleccionar

35 fácilmente usando presentación en fagos (en el documento WO 94/13804) de colecciones. Si se debe mantener constante un brazo del diacuerpo, por ejemplo, con una especificidad dirigida contra IL-6:IL-6Ra, entonces se puede preparar una colección donde se varíe el otro brazo y seleccionar un anticuerpo de especificidad apropiada. Se pueden preparar anticuerpos completos biespecíficos por métodos de creación alternativos como los descritos en Ridgeway et al., 1996 [37].

En la técnica están disponible diversos métodos para obtener anticuerpos contra IL-6:IL-6Ra.

Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales, especialmente de origen humano, murino, quimérico o humanizado, que se pueden obtener de acuerdo con los métodos estándar bien conocidos por el experto en la

45 técnica.

En general, para la preparación de anticuerpos monoclonales o sus fragmentos funcionales, especialmente de origen murino, es posible referirse a técnicas que se describen en particular en el manual "Antibodies" [38] o a la técnica de preparación a partir de hibridomas descrita por Köhler y Milstein [39].

Se pueden obtener anticuerpos monoclonales, por ejemplo, a partir de una célula animal inmunizada contra IL-6:IL6Ra, por ejemplo, usando hiper IL-6, o uno de sus fragmentos que contiene el epítopo reconocido por dichos anticuerpos monoclonales. En el presente documento se describen fragmentos adecuados y péptidos o polipéptidos que los comprenden, y se pueden usar para inmunizar animales para generar anticuerpos contra IL-6:IL-6Ra, por

55 ejemplo, IL-6:sIL-6Ra. Dicho IL-6:sIL-6Ra, o uno de sus fragmentos, se puede producir especialmente de acuerdo con los métodos de trabajo habituales, por recombinación genética partiendo de una secuencia de ácido nucleico contenida en una secuencia de ADN que codifica la hiper IL-6 o un fragmento de la misma, por síntesis peptídica partiendo de una secuencia de aminoácidos comprendida en la secuencia peptídica del IL-6:sIL-6Ra y/o un fragmento de la misma.

Los anticuerpos monoclonales se pueden purificar, por ejemplo, en una columna de afinidad en la que se ha inmovilizado previamente IL-6:sIL-6Ra, o hiper IL-6, o uno de sus fragmentos que contiene el epítopo reconocido por dichos anticuerpos monoclonales. Más en particular, los anticuerpos monoclonales se pueden purificar por cromatografía sobre proteína A y/o G, seguida o no seguida de cromatografía de intercambio iónico con el objetivo 65 de eliminar los contaminantes proteínicos residuales, así como el ADN y los LPS, en sí mismos, seguida o no seguida de cromatografía de exclusión en gel de sefarosa con el fin de eliminar los posibles agregados debidos a la

presencia de dímeros u otros multímeros. En un modo de realización, se pueden usar la totalidad de estas técnicas simultánea o sucesivamente.

Sitio de unión a antígeno

5 Esto describe la parte de una molécula que se une a y es complementaria a la totalidad o a parte del antígeno objetivo. En una molécula de anticuerpo, se denomina sitio de unión a antígeno del anticuerpo y comprende la parte del anticuerpo que se une a y es complementaria a la totalidad o a parte del antígeno objetivo. Cuando un antígeno es grande, un anticuerpo puede unirse sólo a una parte en particular del antígeno, parte que se llama epítopo. Un sitio de unión a antígeno de anticuerpo se puede proporcionar por uno o más dominios variables de anticuerpo. Un sitio de unión a antígeno de anticuerpo puede comprender una región variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo y una región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo.

Aislado/a(s)

15 Esto se refiere al estado en el que estarán por lo general los miembros de unión de la invención, o los ácidos nucleicos que codifican tales miembros de unión, de acuerdo con la presente invención. Por tanto, los miembros de unión, dominios VH y/o VL y vectores y moléculas de ácido nucleico codificantes de acuerdo con la presente divulgación se pueden proporcionar aislados y/o purificados, por ejemplo, a partir de su entorno natural, en forma sustancialmente pura u homogénea o, en el caso del ácido nucleico, libre o sustancialmente libre de ácido nucleico o genes de origen distinto de la secuencia que codifica un polipéptido con la función necesaria. Los miembros aislados y el ácido nucleico aislado estarán libres o sustancialmente libres de material con el que se asocian de forma natural, tales como otros polipéptidos o ácidos nucleicos con los que se encuentran en su entorno natural o el entorno en el que se preparan (por ejemplo, cultivo celular) cuando dicha preparación es por tecnología de ADN recombinante

25 practicada in vitro o in vivo. Los miembros y el ácido nucleico se pueden formular con diluyentes o coadyuvantes y, aun así, aislarse con fines prácticos (por ejemplo, normalmente, los miembros estarán mezclados con gelatina u otros vehículos si se usan para recubrir placas de microvaloración para su uso en inmunoensayos, o estarán mezclados con vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables cuando se usen en diagnóstico o tratamientos). Los miembros de unión pueden estar glucosilados, bien de manera natural o por sistemas heterólogos de células eucariotas (por ejemplo, células CHO o NSO (ECACC 85110503), o pueden estar no glucosilados (por ejemplo, si se producen por la expresión en una célula procariota).

Las preparaciones heterogéneas que comprenden moléculas de anticuerpo anti-IL-6:IL-6Ra (por ejemplo, anti-IL6:sIL-6Ra) también forman parte de la invención. Por ejemplo, las preparaciones de este tipo pueden ser mezclas de

35 anticuerpos con cadenas pesadas de longitud completa y cadenas pesadas que carecen de la lisina C-terminal, con diversos grados de glucosilación y/o con aminoácidos derivatizados, tal como la ciclación de un ácido glutámico Nterminal para formar un residuo de ácido piroglutámico.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "sustancialmente como se describe" se refiere a que la(s) característica(s) de las CDR pertinentes del dominio VH o VL de los miembros de unión descritos en el presente documento serán idénticas o muy similares a las regiones especificadas cuya secuencia se describe en el presente documento. Tal como se describe en el presente documento, la expresión "muy similar(es)" con respecto a la(s) región/regiones especificadas de uno o más dominios variables, se contempla que se pueden realizar desde 1 hasta aproximadamente 5, por ejemplo, desde 1 hasta 4, incluyendo de 1 a 3, o 1 o 2, o 3 o 4, sustituciones de

45 aminoácidos en la CDR y/o el dominio VH o VL.

Descripción detallada de la invención

Como se destaca anteriormente, un miembro de unión de acuerdo con la presente divulgación modula y puede neutralizar una actividad biológica de la IL-6 y/o el IL-6Ra, por ejemplo, el sIL-6Ra. Un miembro de unión de la presente divulgación se puede someter a una optimización de potencia, para mejorar más su potencia neutralizadora. En general, la optimización de la potencia implica mutar la secuencia de un miembro de unión seleccionado (normalmente la secuencia del dominio variable de un anticuerpo) para generar una colección de miembros de unión, que después se someten a ensayo para determinar la potencia y se seleccionan los miembros

55 de unión más potentes. Por tanto, los miembros de unión de "potencia optimizada" seleccionados tienden a tener una potencia mayor que el miembro de unión a partir del cual se generó la colección.

No obstante, se pueden obtener miembros de unión de alta potencia sin optimización. Como se demuestra en el presente documento, se pueden obtener miembros de unión de potencia alta directamente a partir de un cribado inicial, por ejemplo, un ensayo de neutralización bioquímica.

Un miembro de unión de "potencia optimizada" se refiere a un miembro de unión con una potencia de neutralización optimizada de una actividad o función posterior en particular de IL-6 y/o IL-6Ra, por ejemplo, sIL-6Ra. En otra parte del presente documento se describen con más detalle ensayos y potencias.

65 Los miembros de unión de potencia optimizada y no optimizada son aspectos de la invención, así como todos los métodos para la optimización de la potencia de un miembro de unión seleccionado. La presente invención permite, por tanto, que el experto en la técnica genere miembros de unión con potencia alta.

Tal como se describe en el presente documento, el anticuerpo 1 tenía una potencia neutralizadora (CI50) de menos

5 de 700 nM en un ensayo HTRF® (fluorescencia de resolución temporal homogénea) para la inhibición de la unión de hiper IL-6 marcada con FLAG HIS a Fc de gp130 humano recombinante. Por tanto, un miembro de unión que comprende el conjunto de CDR del anticuerpo 1 puede presentar una CI50 de menos de 700 nM en este ensayo. La variantes del anticuerpo 1, con una o más sustituciones, deleciones o inserciones en el conjunto de CDR del anticuerpo 1, pueden ser de la misma potencia o más potentes que el anticuerpo 1.

Tal como se describe en el presente documento, el anticuerpo 2 tenía una potencia neutralizadora (CI50) de menos de 1,5 nM en un ensayo HTRF® (fluorescencia de resolución temporal homogénea) para la inhibición de la unión de hiper IL-6 marcada con FLAG HIS a Fc de gp130 humano recombinante. Por tanto, un miembro de unión que comprende el conjunto de CDR del anticuerpo 2 puede presentar una CI50 de menos de 1,5 nM en este ensayo. La

15 variantes del anticuerpo 2, con una o más sustituciones, deleciones o inserciones en el conjunto de CDR del anticuerpo 2, pueden ser de la misma potencia o más potentes que el anticuerpo 2.

Tal como se describe en el presente documento, el anticuerpo 3 tenía una potencia neutralizadora (CI50) de menos de 25 nM en un ensayo HTRF® (fluorescencia de resolución temporal homogénea) para la inhibición de la unión de hiper IL-6 marcada con FLAG HIS a Fc de gp130 humano recombinante. Por tanto, un miembro de unión que comprende el conjunto de CDR del anticuerpo 3 puede presentar una CI50 de menos de 25 nM en este ensayo. La variantes del anticuerpo 3, con una o más sustituciones, deleciones o inserciones en el conjunto de CDR del anticuerpo 3, pueden ser de la misma potencia o más potentes que el anticuerpo 3.

25 Tal como se describe en el presente documento, el anticuerpo 4 tenía una potencia neutralizadora (CI50) de menos de 30 nM en un ensayo HTRF® (fluorescencia de resolución temporal homogénea) para la inhibición de la unión de hiper IL-6 marcada con FLAG HIS a Fc de gp130 humano recombinante. Por tanto, un miembro de unión que comprende el conjunto de CDR del anticuerpo 4 puede presentar una CI50 de menos de 30 nM en este ensayo. La variantes del anticuerpo 4, con una o más sustituciones, deleciones o inserciones en el conjunto de CDR del anticuerpo 4, pueden ser de la misma potencia o más potentes que el anticuerpo 4.

Tal como se describe en el presente documento, el anticuerpo 5 tenía una potencia neutralizadora (CI50) de menos de 0,8 nM en un ensayo HTRF® (fluorescencia de resolución temporal homogénea) para la inhibición de la unión de hiper IL-6 marcada con FLAG HIS a Fc de gp130 humano recombinante. Por tanto, un miembro de unión que

35 comprende el conjunto de CDR del anticuerpo 5 puede presentar una CI50 de menos de 0,8 nM en este ensayo. La variantes del anticuerpo 5, con una o más sustituciones, deleciones o inserciones en el conjunto de CDR del anticuerpo 5, pueden ser de la misma potencia o más potentes que el anticuerpo 5.

En otro aspecto, la presente invención divulga un método de obtención de uno o más miembros de unión que se pueden unir al antígeno, incluyendo el método poner en contacto una colección de miembros de unión de acuerdo con la divulgación y dicho antígeno, y seleccionar uno o más miembros de unión de la colección que se pueden unir a dicho antígeno.

La colección se puede presentar en partículas o complejos moleculares, por ejemplo, paquetes genéticos

45 replicables, tales como partículas de levadura, bacterianas o de bacteriófagos (por ejemplo, T7), virus, células o sistemas de presentación covalentes, ribosómicos u otros in vitro, conteniendo cada partícula o complejo molecular ácido nucleico que codifica el dominio variable VH de anticuerpo presentado en ellos y, opcionalmente, también un dominio VL presentado si está presente. La presentación en fagos se describe en el documento WO 92/01047 y, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. US 5969108, US 5565332, US 5733743, US 5858657, US 5871907, US 5872215, US 5885793, US 5962255, US 6140471, US 6172197, US 6225447, US 6291650, US 6492160 y US 6521404.

Después de la selección de miembros de unión que se pueden unir al antígeno y presentarlos en bacteriófagos o partículas o complejos moleculares de otra colección, se puede tomar el ácido nucleico de un bacteriófago u otra

55 partícula o complejo molecular que presenta uno de dichos miembros de unión seleccionados. Este ácido nucleico se puede usar en la producción posterior de un miembro de unión o un dominio variable VH o VL de anticuerpo por expresión a partir del ácido nucleico con la secuencia de ácido nucleico tomada de un bacteriófago u otra partícula o complejo molecular que presenta uno de dichos miembros de unión seleccionados.

Un dominio variable VH de anticuerpo con la secuencia de aminoácidos de un dominio variable VH de anticuerpo de uno de dichos miembros de unión seleccionados se puede proporcionar en forma aislada, como un miembro de unión que comprende un dominio VH de este tipo.

Otros aspectos de la divulgación se refiere en general al aislamiento o selección de un miembro de unión de entre

65 una pluralidad de miembros de unión, en los que el miembro de unión seleccionado o aislado se une a un complejo formado por una primera entidad y una segunda entidad y no se une a la primera entidad o a la segunda entidad solas.

La pluralidad de miembros de unión puede ser una colección de miembros de unión, como se describe anteriormente. En otra parte del presente documento se definen y describen con más detalle los miembros de unión.

5 Convenientemente, como es común en las colecciones, cada miembro de unión de la pluralidad de miembros de unión puede estar asociado con información genética que lo codifica, lo que permite la recuperación de la información genética cuando se selecciona un miembro de unión.

En un aspecto, la divulgación es un método de selección de un miembro de unión de entre una pluralidad de

10 miembros de unión, en el que el miembro de unión se une a un complejo formado por una primera entidad y una segunda entidad y no se une a la primera entidad o a la segunda entidad solas.

en el que el método comprende:

15 (i) exponer la pluralidad de miembros de unión a la primera entidad, en condiciones que permitan la unión de los miembros de unión a la primera entidad;

(ii) exponer la pluralidad de miembros de unión al complejo formado por la primera entidad y la segunda entidad, en

condiciones que permitan la unión de los miembros de unión al complejo; 20

(iii) aislar el complejo sobre un soporte sólido al que está unida la segunda entidad; y

(iv) recuperar uno o más miembros de unión unidos al complejo.

25 Por tanto, el método puede seleccionar, de entre una pluralidad de miembros de unión, una población de miembros de unión que se unen al complejo.

Opcionalmente, el método puede comprender además amplificar los uno o más miembros de unión recuperados para producir una pluralidad de miembros de unión, por ejemplo:

(v)

amplificando la información genética que codifica los uno o más miembros de unión recuperados; y

(vi)

expresando la información genética para producir una pluralidad de miembros de unión.

35 El método puede comprender repetir las etapas (i) a (iv) anteriores, para ciclos de selección posteriores. Por tanto, en ciclos de selección posteriores se puede seleccionar adicionalmente de entre una población de miembros de unión que se unen al complejo y se puede seleccionar negativamente contra miembros de unión inespecíficos o miembros de unión que se unen a la primera o la segunda entidad sola.

40 De forma ventajosa, en ciclos de selección posteriores se puede alternar la orientación en la que se une el complejo al soporte (es decir, si está unido por medio de la primera entidad o por medio de la segunda entidad). Por tanto, opcionalmente, el método puede comprender además:

(vii) exponer la pluralidad de miembros de unión a la segunda entidad, en condiciones que permitan la unión de los 45 miembros de unión a la segunda entidad;

(viii) exponer la pluralidad de miembros de unión al complejo formado por la primera entidad y la segunda entidad, en condiciones que permitan la unión de los miembros de unión al complejo;

50 (ix) aislar el complejo sobre un soporte sólido al que está unida la primera entidad; y

(x) recuperar uno o más miembros de unión unidos al complejo.

Después, se pueden repetir las etapas (i)-(vi) anteriores y se pueden realizar múltiples ciclos de selección, en los

55 que se alterna la entidad unida al soporte. Por tanto, el método puede comprender un primer ciclo de selección en el que la primera entidad está unida al soporte, y un segundo ciclo de selección en el que la segunda entidad está unida al soporte, después un tercer ciclo de selección en el que la primera entidad está unida al soporte, y así sucesivamente en ciclos posteriores hasta completar el número de ciclos de selección deseados, alternando así la orientación en la que se aísla el complejo sobre el soporte. Esta alternancia de la orientación de unión del complejo

60 al soporte contribuye a la selección específica de miembros de unión que se unen al complejo y no se unen a la primera o a la segunda entidad solas. La alternancia puede ayudar en particular en la selección contra miembros de unión que se unen a la primera o a la segunda entidad solas.

El soporte al que se une la entidad puede ser, por ejemplo, una perla. Convenientemente, se pueden usar perlas 65 paramagnéticas, que se pueden recuperar fácilmente de la solución.

La entidad unida al soporte puede estar unida directa o indirectamente. Por ejemplo, el soporte puede comprender o estar recubierto con un miembro de unión que se une a la entidad. De forma alternativa, la entidad puede estar marcada, es decir, unida covalentemente a una marca tal como un péptido, para la unión del soporte, en el que el soporte comprende o está recubierto con un miembro de unión que se une a la marca. Por ejemplo, un polipéptido

5 puede estar enlazado a una marca peptídica heteróloga, por ejemplo una marca FLAG, y puede estar unido a un soporte sólido por medio de una molécula de anticuerpo u otro miembro de unión que se une a la marca, por ejemplo, un anticuerpo anti-FLAG. Convenientemente, se pude recubrir el miembro de unión que se une a la marca sobre el soporte por medio de un complejo de estreptavidina:biotina, por ejemplo, se puede unir un miembro de unión biotinilado a un soporte recubierto con estreptavidina, por ejemplo, perlas recubiertas con estreptavidina.

Convenientemente, en cada ciclo de selección, una entidad puede estar enlazada a una marca para la unión al soporte, mientras que la otra entidad no está enlazada a la marca (la otra entidad puede estar no marcada o puede estar enlazada a una marca diferente). Por tanto, en un primer ciclo de selección, la segunda entidad puede estar enlazada a una marca para la unión al soporte, mientras que la primera entidad no está enlazada a la marca, y en el

15 segundo ciclo de selección la primera entidad puede estar enlazada a la marca mientras que la segunda entidad no lo está. El uso de la misma marca para la unión de la primera y la segunda entidad al soporte en ciclos de selección alternos permite convenientemente usar el mismo tipo de soporte en todos los ciclos.

Normalmente, la primera y/o la segunda entidad y el complejo se proporcionan en solución. Sin embargo, en algunos casos, la primera y/o la segunda entidad puede estar sobre una superficie, por ejemplo, presentada sobre una superficie celular, de modo que el complejo se forma sobre la superficie, entonces el método puede comprender exponer la pluralidad de miembros de unión en solución a células que expresan la primera y/o la segunda entidad sobre la superficie celular. Los métodos que usan células son adecuados, por ejemplo, cuando una o ambas de las entidades primera y segunda son proteínas transmembranarias o proteínas asociadas a la membrana. Sin embargo,

25 una alternativa es el uso de porciones solubles de estas proteínas, por ejemplo, se puede usar un dominio extracelular o porción de un dominio extracelular en el método, lo que permite proporcionar el polipéptido en solución.

Se puede formar el complejo exponiendo la primera entidad a la segunda entidad, de tal forma que la primera y la segunda entidad se asocian para formar un complejo. En cada ciclo de selección, normalmente, se proporciona la entidad que no se tiene que unir al soporte a una concentración en exceso de la entidad que se tiene que unir al soporte, por ejemplo, un exceso molar de al menos el doble. Esto garantiza que toda la entidad que se va a unir al soporte está presente en forma complejada, lo que reduce al mínimo la cantidad de entidad no complejada que se recupera del soporte y, de este modo, se reduce al mínimo la recuperación no deseada de miembro de unión que se

35 une a la entidad en forma no complejada. Una alternativa es exponer los miembros de unión a un complejo preformado, por ejemplo, un complejo en el que la primera y la segunda entidad están unidas covalentemente entre sí. Por ejemplo, cuando las entidades primera y segunda son polipéptidos, se puede usar una proteína de fusión que comprende la primera entidad y la segunda entidad, por ejemplo, en la que la primera y la segunda entidad están enlazadas por medio de una marca peptídica. Sin embargo, formar el complejo mediante la exposición de la primera entidad a la segunda entidad tiene ventajas, ya que esto representa la situación in vivo y evita anomalías en la conformación o la formación de epítopos provocadas por el enlace covalente de la primera y la segunda entidad en el complejo, si el enlace covalente del complejo no es fisiológico.

La etapa (i) y la etapa (ii) se pueden realizar secuencialmente (la etapa (i) y después la (ii)) o simultáneamente. Por

45 ejemplo, se pueden exponer los miembros de unión a la primera entidad y después a la segunda, a la primera y a la segunda entidad simultáneamente, en el que la primera entidad está a una concentración en exceso de la segunda entidad, por ejemplo, un exceso molar de al menos el doble, y en el que la primera y la segunda entidad forman el complejo.

Una ventaja de realizar la etapa (i) antes que la etapa (ii) es que los miembros de unión se exponen a la primera entidad antes de exponerse al complejo y, por lo tanto, los miembros de unión que se unen a la primera entidad sola se pueden unir en la etapa inicial, lo que reduce la probabilidad de que estos miembros de unión se unan al complejo en la etapa (ii). La situación es análoga para las etapas (viii) y (iv), excepto porque se intercambian las entidades primera y segunda.

55 La unión de la segunda entidad al soporte se puede producir antes de la etapa (ii) o en la etapa (ii) o la etapa (iii). Por ejemplo, la etapa (iii) puede comprender exponer el complejo a un soporte que se une a la segunda entidad, por ejemplo, se une a una marca unida a la segunda entidad. La situación es análoga para las etapas (ix) y (x) en relación con la unión de la primera entidad al soporte.

Los complejos aislados se pueden lavar para eliminar los miembros de unión no unidos y, de este modo, se puede recuperar en el soporte el miembro de unión unido al complejo de entre la pluralidad de miembros de unión.

Los métodos pueden comprender además ensayos adicionales (por ejemplo, un ELISA, donde los miembros de

65 unión seleccionados son moléculas de anticuerpo) para confirmar que los miembros de unión seleccionados se unen al complejo y no se unen a la primera o a la segunda entidad solas, y/o para seleccionar más miembros de unión

con propiedades deseadas tales como mayor especificidad por el complejo.

En un ejemplo, la divulgación es un método de selección de un miembro de unión de entre una pluralidad de miembros de unión, en el que el miembro de unión se une a un complejo formado por una primera entidad y una 5 segunda entidad y no se une a la primera entidad o a la segunda entidad solas, en el que el método comprende:

proporcionar la primera y la segunda entidad, una de las cuales está enlazada a una marca para unirse a un soporte sólido ("entidad marcada") y una de las cuales no está enlazada a la marca ("entidad no marcada");

(i)

exponer la pluralidad de miembros de unión a la entidad no marcada, en condiciones que permitan la unión de los miembros de unión a la entidad no marcada;

(ii)

exponer la pluralidad de miembros de unión y la entidad no marcada a la entidad marcada, en el que la entidad no marcada está a una concentración al menos dos veces mayor que la concentración de la entidad marcada, de tal

15 forma que la entidad marcada forma un complejo con la entidad no marcada, exponiendo de este modo la pluralidad de miembros de unión al complejo, en condiciones que permiten la unión de miembros de unión al complejo;

(iii) aislar el complejo sobre un soporte sólido al que está unida la entidad marcada; y

(iv) recuperar uno o más miembros de unión unidos al complejo.

Opcionalmente, el método puede comprender además:

(v) amplificar la información genética que codifica los uno o más miembros de unión recuperados; y 25

(vii) expresar la información genética para producir una pluralidad de miembros de unión.

El método puede comprender además repetir después las etapas (i) a (iv), para uno o más ciclos de selección posteriores. De forma ventajosa, se puede alternar la orientación en la que el complejo se une al soporte en ciclos posteriores. Por tanto, si la primera entidad está marcada en el ciclo 1, la segunda entidad está marcada en el ciclo 2, después la primera entidad está marcada en el ciclo 3 y así sucesivamente. Como se describe anteriormente, el uso de la misma marca para la primera y la segunda entidad en ciclos de selección alternos permite convenientemente usar el mismo tipo de soporte en todos los ciclos, es decir, un soporte que comprende o está recubierto con un miembro de unión que se une a la marca. Opcionalmente, sin embargo, se pueden marcar ambas

35 entidades primera y segunda y usar un tipo de soporte diferente para aislar el complejo en ciclos de selección alternos. Por tanto, opcionalmente, la "entidad no marcada" puede estar unida a la marca, con la condición de que no sea la misma marca que está unida a la entidad marcada.

Típicamente, las entidades primera y segunda son moléculas orgánicas, normalmente moléculas biológicas que se asocian para forma un complejo. Los ejemplos incluyen complejos ligando:receptor formados por un ligando y un receptor, complejos enzima:sustrato formados por una enzima y un sustrato de la enzima; y complejos anticuerpo:antígeno formados por una molécula de anticuerpo y un antígeno al que se une la molécula de anticuerpo. La primera y/o la segunda entidad puede ser un polipéptido y, por tanto, el método puede comprender seleccionar un miembro de unión que se une a un complejo formado por un primer polipéptido y un segundo

45 polipéptido y no se une al primer o al segundo polipéptido solos.

Las entidades primera y segunda pueden ser iguales o diferentes. Típicamente, las entidades primera y segunda son diferentes, por ejemplo, moléculas orgánica o biológicas diferentes, por ejemplo, polipéptidos diferentes. Por tanto, el método puede comprender seleccionar un miembro de unión que se une a un complejo en el que están asociadas dos entidades diferentes, por ejemplo, en el que el complejo es un heterodímero.

Cuando las entidades primera y segunda forman un complejo, se forma un epítopo unido por miembros de unión de la invención. Por ejemplo, el epítopo puede comprender una parte de la primera entidad y una parte de la segunda entidad, por ejemplo, puede comprender uno o más aminoácidos del primer polipéptido y uno o más aminoácidos del

55 segundo polipéptido. De forma alternativa, el epítopo puede estar sólo en una entidad y puede estar presente o expuesto sólo cuando esa entidad está complejada con la otra entidad, como consecuencia de un cambio conformacional en la entidad cuando forma el complejo.

En métodos de la divulgación, se puede someter a prueba adicionalmente la capacidad para unirse a IL-6:IL-6Ra (por ejemplo, IL-6:sIL-6Ra), también se puede determinar la capacidad para competir con un miembro de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo de 1 a 5 (por ejemplo, en formato scFv y/o formato IgG, por ejemplo, IgG1), para unirse a IL-6:IL-6Ra, por ejemplo, IL-6:sIL-6Ra. Se puede someter a prueba la capacidad para neutralizar IL6:IL-6Ra (por ejemplo, IL-6:sIL-6Ra), como se analiza con más detalle en otra parte del presente documento.

65 Un miembro de unión de acuerdo con la presente divulgación se puede unir a IL-6:IL-6Ra, por ejemplo, IL-6:sIL-6Ra, con la afinidad de uno de los anticuerpos de 1 a 5, por ejemplo, scFv o IgG1, o con una afinidad mejor.

Un miembro de unión de acuerdo con la presente divulgación puede neutralizar una actividad biológica de IL-6:IL6Ra (por ejemplo, IL-6:sIL-6Ra) con la potencia de uno de los anticuerpos de 1 a 5, por ejemplo, scFv o IgG1, o con una potencia mejor.

5 Se pueden comparar la afinidad de unión y la potencia de neutralización de los diferentes miembros de unión en condiciones apropiadas.

Las variantes de los dominios VH y VL y las CDR de la presente divulgación, incluyendo aquellas para las que se

10 exponen secuencias de aminoácidos en el presente documento, y que se pueden emplear en miembros de unión de la divulgación, se pueden obtener por medio de métodos de alteración o mutación de secuencia y detección de miembros de unión a antígeno con las características deseadas. Los ejemplos de características deseadas incluyen, pero no se limitan a:

15 • Incremento en la afinidad de unión para antígeno con relación a anticuerpos conocidos que son específicos para el antígeno

• Incremento en la neutralización de una actividad de antígeno con relación a anticuerpos conocidos que son

específicos para el antígeno si se conoce la actividad 20

• Capacidad competitiva especificada con un anticuerpo o ligando conocido para el antígeno a una proporción molar específica

• Capacidad para inmunoprecipitar el complejo 25

• Capacidad para unirse a un epítopo especificado

o Epítopo lineal, por ejemplo secuencia peptídica identificada usando unión a péptido como se describe en el

presente documento, por ejemplo usando péptidos detectados en conformación lineal y/o restringida 30

o Epítopo conformacional, formado por residuos no continuos

o Capacidad para modular una actividad biológica nueva de IL-6:IL-6Ra (por ejemplo, IL-6:sIL-6Ra) o molécula posterior.

35 Tales métodos también se proporcionan en el presente documento.

Se pueden producir y usar variantes de moléculas de anticuerpo divulgadas en el presente documento. Siguiendo el ejemplo de la química computaciones en la aplicación de técnicas para el análisis de datos multivariados para las

40 relaciones de estructura/propiedad-actividad [40], se pueden derivar relaciones cuantitativas de actividad-propiedad de anticuerpos usando técnicas matemáticas bien conocidas, tales como regresión estadística, reconocimiento de patrones y clasificación [41, 42, 43, 44, 45, 46]. Las propiedades de los anticuerpos se pueden derivar de modelos empíricos y teóricos (por ejemplo, análisis de residuos en contacto probable o propiedad fisicoquímica calculada) de secuencia de anticuerpo, las estructuras funcionales y tridimensionales y estas propiedades se pueden considerar

45 de forma individual y en combinación.

Típicamente, un sitio de unión a antígeno del anticuerpo compuesto de un dominio VH y a dominio VL se forma por seis bucles de polipéptido: tres del dominio variable de cadena ligera (VL) y tres del dominio variable de cadena pesada (VH). El análisis de anticuerpos de estructura atómica conocida ha dilucidado relaciones entre la secuencia y

50 la estructura tridimensional de sitios de combinación de anticuerpo [47, 48]. Estas relaciones implican que, excepto para la tercera región (bucle) en dominios VH, los bucles del sitio de unión tiene uno de un pequeño número de conformaciones de cadena principal: estructuras canónicas. Se ha demostrado que la estructura canónica formada en un bucle particular está determinada por su tamaño y la presencia de determinados residuos en sitios clave tanto en las regiones de bucle como en las regiones estructurales [47, 48].

55 Este estudio de relación de secuencia-estructura se puede usar para la predicción de estos residuos en un anticuerpo de secuencia conocida, pero de una estructura tridimensional desconocida, que son importantes en el mantenimiento de la estructura tridimensional de sus bucles de CDR y por lo tanto, mantienen la especificidad de unión. Estas predicciones se pueden respaldar comparando las predicciones con los resultados de los experimentos

60 de optimización principales. En un enfoque estructural, se puede crear un modelo de la molécula de anticuerpo [49] usando cualquier paquete informático comercial o disponible gratuitamente, tal como WAM [50]. Entonces, se puede usar un paquete de programas informáticos de análisis y visualización de proteínas, tal como Insight II (Accelrys, Inc.) o Deep View [51] para evaluar posibles sustituciones en cada posición en la CDR. A continuación, se puede usar esta información para realizar sustituciones propensas a tener un efecto mínimo o beneficioso sobre la

65 actividad.

En general, las técnicas necesarias para realizar sustituciones dentro de secuencias de aminoácidos de CDR, dominios VH o VL de anticuerpo y miembros de unión están disponibles en la técnica. Las secuencias de variantes se pueden realizar con sustituciones que se puede predecir o no que tengan un efecto mínimo o beneficioso sobre la

5 actividad, y se pueden someter a prueba para determinar su capacidad para unirse a y/o neutralizar la IL-6 y/o IL6Ra (por ejemplo, sIL-6Ra) y/o para cualquier otra propiedad deseada.

Las variantes de secuencia de aminoácidos de dominio variable de cualquiera de los dominios VH y VL con secuencias que se divulgan específicamente en el presente documento se pueden emplear de acuerdo con la presente divulgación, como se analizó.

Las variantes de dominios VL de la divulgación, y los miembros de unión o moléculas de anticuerpo que los comprenden, incluyen dominios VL en los que la glicina no está presente en el residuo de Kabat 108, por ejemplo donde el residuo de Kabat 108 es un residuo diferente o está eliminado. Por ejemplo, una molécula de anticuerpo,

15 tal como una molécula de anticuerpo que carece de un dominio constante, por ejemplo un scFv, puede comprender un dominio VL que tiene una secuencia de dominio VL o variante del mismo como se describe en el presente documento, en el que la glicina en el residuo Kabat 108 es un residuo de aminoácido diferente de glicina o está eliminado.

Otro aspecto de la divulgación es una molécula de anticuerpo que comprende un dominio VH que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos el 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 % con un dominio VH de cualquiera de los anticuerpos 1 a 5 mostrados en el listado de secuencias adjunto, y/o que comprende un dominio VL que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos el 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 % con un dominio VL de cualquiera de los anticuerpos 1 a 5 mostrados en el listado de secuencias adjunto. Los algoritmos

25 que se pueden usar para calcular el % de identidad de dos secuencias de aminoácidos incluyen, por ejemplo, BLAST [52], FASTA [53], o el algoritmo Smith-Waterman [54], por ejemplo, que emplean parámetros por defecto.

Las variantes particulares pueden incluir una o más alteraciones de secuencia de aminoácidos (adición, deleción, sustitución y/o inserción de un residuo de aminoácido).

Las alteraciones se pueden realizar en una o más regiones estructurales y/o una o más CDR. Normalmente las alteraciones no dan como resultado una pérdida de función, de modo que un miembro de unión que comprende una secuencia de aminoácidos alterada de este modo puede retener una capacidad para unirse a y/o neutralizar la IL-6 y/o IL-6Ra (por ejemplo sIL-6Ra). Puede retener la misma capacidad de unión y/o neutralización cuantitativa que un

35 miembro de unión en el que no se realiza la alteración, por ejemplo medida en un ensayo descrito en el presente documento. El miembro de unión que comprende una secuencia de aminoácidos alterada de este modo puede tener una capacidad mejorada para unirse a y/o neutralizar la IL-6 y/o IL-6Ra (por ejemplo sIL-6Ra).

La alteración puede comprender reemplazar uno o más residuos de aminoácido con un aminoácido no natural o no estándar, modificar uno o más residuos de aminoácido de una forma no natural o no estándar, o insertar uno o más aminoácidos no naturales o no estándar en la secuencia. Los ejemplos de números y localizaciones de las alteraciones en secuencias de la invención se describen en otra parte del presente documento. Los aminoácidos naturales incluyen los 20 L-aminoácidos "estándar" identificados como G, A, V, L, I, M, P, F, W, S, T, N, Q, Y, C, K, R, H, D, E por sus códigos de una letra estándar. Los aminoácidos no estándar incluyen cualquier otro residuo que

45 se pueda incorporar en un esqueleto polipeptídico o que pueda resultar de una modificación de un residuo de aminoácido existente. Los aminoácidos no estándar pueden ser naturales o no naturales. Varios aminoácidos naturales no estándar son conocidos en la técnica, tales como 4-hidroxiprolina, 5-hidroxilisina, 3-metilhistidina, Nacetilserina, etc. [55]. Estos residuos de aminoácido que están derivatizados en su posición N-alfa estarán situados sólo en el extremo N-terminal de una secuencia de aminoácidos. Normalmente, en la presente invención, un aminoácido es un L-aminoácido, pero puede ser un D-aminoácido. Por lo tanto, la alteración puede comprender modificar un L-aminoácido en, o reemplazarlo con, un D-aminoácido. También son conocidas formas metiladas, acetiladas y/o fosforiladas de aminoácidos, y los aminoácidos en la presente divulgación pueden estar sujetos a dicha modificación.

55 Las secuencias de aminoácidos en dominios de anticuerpo y miembros de unión de la divulgación pueden comprender aminoácidos no naturales o no estándar descritos anteriormente. Los aminoácidos no estándar (por ejemplo D-aminoácidos) se pueden incorporar en una secuencia de aminoácidos durante la síntesis, o por la modificación o la sustitución de los aminoácidos estándar "originales" después de la síntesis de la secuencia de aminoácidos.

El uso de aminoácidos no estándar y/o no naturales incrementa la diversidad estructural y funcional, y por tanto puede incrementar el potencial para lograr las propiedades de neutralización y unión a IL-6:IL-6Ra (por ejemplo IL6:sIL-6Ra) deseadas en un miembro de unión de la invención. Adicionalmente, se ha demostrado que los Daminoácidos y análogos tienen perfiles farmacocinéticos diferentes en comparación con L-aminoácidos estándar, 65 debido a una degradación in vivo de polipéptidos que tienen L-aminoácidos después de la administración a un animal, por ejemplo, un ser humano, lo que significa que los D-aminoácidos son ventajosos para algunas

aplicaciones in vivo.

Las regiones VH o VL novedosas que llevan secuencias derivadas de CDR de la divulgación se pueden generar usando mutagénesis aleatoria de uno o más genes de VH y/o VL seleccionados para generar mutaciones dentro de

5 todo el dominio variable. Dicha técnica se describe por Gram et al. [56], que usó PCR propensa a error. En algunos aspectos, se realizan una o dos sustituciones de aminoácidos dentro de todo un dominio variable o conjunto de CDR.

Otro método que se puede usar es dirigir la mutagénesis a regiones CDR de los genes de VH o VL. Dichas técnicas 10 se describen por Barbas et al. [57] y Schier et al. [58].

Todas las técnicas descritas anteriormente son conocidas como tales en la técnica y el experto será capaz de usar dichas técnicas para proporcionar miembros de unión de la invención usando metodología rutinaria en la técnica.

15 Otro aspecto de la invención divulga un método para obtener un sitio de unión a antígeno del anticuerpo para IL-6:IL6Ra, por ejemplo IL-6:sIL-6Ra, comprendiendo el método proporcionar por medio de adición, deleción, sustitución o inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de un dominio VH expuesto en el presente documento un dominio VH que es una variante de secuencia de aminoácidos del dominio VH, combinando opcionalmente el dominio VH proporcionado así con uno o más dominios VL, y sometiendo a prueba el dominio VH

20 o la combinación o combinaciones de VH/VL para identificar un miembro de unión o un sitio de unión a antígeno del anticuerpo para IL-6:IL-6Ra, por ejemplo IL-6:sIL-6Ra y opcionalmente con una o más propiedades deseadas, por ejemplo, la capacidad para neutralizar la actividad de IL-6 y/o IL-6Ra (por ejemplo sIL-6Ra). Dicho dominio VL puede tener una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente como se expone en el presente documento. Se puede emplear un método análogo en el que una o más variantes de secuencia de un dominio VL divulgado en el presente

25 documento se combinan con uno o más dominios VH.

Como se destaca anteriormente, una secuencia de aminoácidos de CDR como se expone sustancialmente en el presente documento se pueden llevar como una CDR en un dominio variable de anticuerpo humano o una partes sustancial del mismo. Las secuencias de HCDR3 como se exponen sustancialmente en el presente documento

30 representan modos de realización de la presente invención y cada una de éstas se puede llevar como una HCDR3 en un dominio variable de cadena pesada humano o una parte sustancial del mismo.

Los dominios variables empleados en la invención se pueden obtener o derivar de cualquier línea germinal o dominio variable humano reorganizado, o puede ser un dominio variable sintético en secuencias reales o de 35 consenso de dominios variables humanos conocidos. Un dominio variable se puede derivar de un anticuerpo no humano. Una secuencia de CDR de la invención (por ejemplo CDR3) se puede introducir en un repertorio de dominios variables que carecen de una CDR (por ejemplo CDR3), usando tecnología de ADN recombinante. Por ejemplo, Marks et al. [59] describen métodos de producción de repertorios de dominios variables de anticuerpo en los que los cebadores de consenso dirigidos a o adyacentes al extremo 5' del área de dominio variable se usan junto 40 con cebadores de consenso para la tercera región estructural de genes de VH humano para proporcionar un repertorio de dominios variables VH que carecen de una CDR3. Marks et al. describen además cómo se puede combinar este repertorio con una CDR3 de un anticuerpo particular. Usando técnicas análogas, las secuencias derivadas de CDR3 de la presente invención se pueden reordenar con repertorios de dominios VH o VL que carecen de una CDR3, y los dominios VH o VL completos reordenados se pueden combinar con un dominio VL o VH afín 45 para proporcionar miembros de unión de la divulgación. Después, el repertorio se puede presentar en un sistema de huésped adecuado, tal como el sistema de presentación de fagos del documento WO 92/01047, o cualquiera de un gran volumen de literatura posterior, incluyendo Kay, Winter y McCafferty [60], de modo que se puedan seleccionar los miembros de unión adecuados. Un repertorio puede consistir en desde cualquier número de 104 miembros individuales en adelante, por ejemplo al menos 105, al menos 106, al menos 107, al menos 108, al menos 109 o al

50 menos 1010 miembros o más. Otros sistemas de huésped adecuados incluyen, pero no se limitan a, presentación de levaduras, presentación bacteriana, presentación de T7, presentación vírica, presentación celular, presentación ribosómica y presentación covalente.

Se proporciona un método de preparación de un miembro de unión para IL-6:IL-6Ra, por ejemplo IL-6:sIL-6Ra, 55 método que comprende:

(a) proporcionar un repertorio de partida de ácidos nucleicos que codifican un dominio VH que incluyen una CDR3 que se va a reemplazar o bien una región codificante de CDR3;

60 (b) combinar dicho repertorio con un ácido nucleico dador que codifica una secuencia de aminoácidos como se expone sustancialmente en el presente documento para una CDR3 de VH de modo que se inserta dicho ácido nucleico dador en la región CDR3 en el repertorio, para proporcionar un repertorio producto de ácidos nucleicos que codifican un dominio VH;

65 (c) expresar los ácidos nucleicos de dicho repertorio de producto;

(d)

seleccionar un miembro de unión para IL-6:IL-6Ra, por ejemplo IL-6:sIL-6Ra; y

(e)

recuperar dicho miembro de unión o ácido nucleico que lo codifica.

5 De nuevo, se puede emplear un método análogo en el que una CDR3 VL de la invención se combina con un repertorio de ácidos nucleicos que codifican un dominio VL que incluye una CDR3 que se va a reemplazar o bien que carece de una región codificante de CDR3.

De forma similar, una o más, o las tres CDR se pueden injertar en un repertorio de dominios VH o VL que a 10 continuación se criban para detectar un miembro de unión o miembros de unión para IL-6:IL-6Ra, por ejemplo IL6:sIL-6Ra.

Por ejemplo, se puede emplear uno o más del anticuerpo de 1 a 5 HCDR1, HCDR2 y HCDR3 o el conjunto de anticuerpos de 1 a 5 de HCDR, y/o se puede emplear uno o más del anticuerpo de 1 a 5 LCDR1, LCDR2 y LCDR3 o 15 el conjunto de anticuerpo de 1 a 5 de LCDR.

De forma similar, se pueden emplear otros dominios VH y VL, conjuntos de CDR y conjuntos de HCDR y/o conjuntos de LCDR divulgados en el presente documento.

20 Una parte sustancial de un dominio variable de inmunoglobulina puede comprender al menos las tres regiones CDR, junto con sus regiones estructurales de intervención. La parte también puede incluir al menos aproximadamente un 50 % de cualquiera o ambas de la primera y cuarta regiones estructurales, siendo el 50 % un 50 % del extremo C terminal de la primera región estructural y un 50 % del extremo N terminal de la cuarta región estructural. Los residuos adicionales en el extremo N terminal o C terminal de la parte sustancial del dominio variable pueden ser los

25 que normalmente no están asociados con regiones de dominios variables naturales. Por ejemplo, la construcción de miembros de unión de la presente invención realizada por técnicas de ADN recombinante puede dar como resultado la introducción de residuos N o C terminales codificados por enlazadores introducidos para facilitar la clonación u otras etapas de manipulación. Otras etapas de manipulación incluyen la introducción de enlazadores para unir dominios variables de la invención a secuencias de proteínas adicionales que incluyen regiones constantes del

30 anticuerpo, otros dominios variables (por ejemplo en la producción de diacuerpos) o marcadores detectables/funcionales como se analiza con más detalle en otra parte del presente documento.

Aunque en algunos aspectos de la divulgación, los miembros de unión comprenden un par de dominios VH y VL, los dominios de unión individuales basados en secuencias de dominio VH o bien VL forman otros aspectos de la 35 divulgación. Se sabe que los dominios de inmunoglobulina individuales, en especial los dominios VH, se pueden unir a antígenos objetivo de una manera específica. Por ejemplo, véase el análisis de dAc anterior.

En el caso de cualquiera de los dominios de unión individuales, se pueden usar estos dominios para cribar dominios complementarios que pueden formar un miembro de unión de dos dominios que se puede unir a IL-6:IL-6Ra, por 40 ejemplo IL-6:sIL-6Ra.

Esto se puede lograr por métodos de cribado de presentación de fagos usando el denominado enfoque combinatorio dual jerárquico como se divulga en el documento WO 92/01047, en el que una colonia individual que contiene un clon de cadena H o bien L se usa para infectar una colección completa de clones que codifican la otra cadena (L o

45 H) y el miembro de unión de dos cadenas resultante se selecciona de acuerdo con técnicas de presentación de fagos, tales como las descritas en esa referencia. Esta técnica también se divulga en Marks et al, ibid. [59]

Los miembros de unión de la presente divulgación pueden comprender además regiones constantes de anticuerpo o partes de las mismas, por ejemplo regiones constantes de anticuerpo humano o partes de las mismas. Por ejemplo, 50 un dominio VL puede estar unido en su extremo C terminal a dominios constantes de cadena ligera de anticuerpo incluyendo cadenas CK o CA humanas. De forma similar, un miembro de unión basado en un dominio VH puede estar unido en su extremo C terminal a toda o parte (por ejemplo, un dominio CH1) de una cadena pesada de inmunoglobulina derivada de cualquier isotipo de anticuerpo, por ejemplo IgG, IgA, IgE y IgM y cualquiera de las subclases de isotipos, en particular IgG1 y IgG4. La IgG1 es ventajosa, debido a su función efectora y a la facilidad

55 de fabricación. También puede ser útil cualquier variante de región sintética u otra constante que tiene estas propiedades y que estabiliza regiones variables, en la presente divulgación.

Los miembros de unión de la divulgación pueden estar marcados con un marcador detectable o funcional. Por tanto, un miembro de unión o molécula de anticuerpo puede estar presente en forma de un inmunoconjugado para obtener 60 una señal detectable y/o cuantificable. Un inmunoconjugado puede comprender una molécula de anticuerpo de la invención conjugada con un marcador detectable o funcional. Un marcador puede ser cualquier molécula que produzca o que se pueda inducir para que produzca una señal, incluyendo pero sin limitarse a agentes fluorescentes, radiomarcadores, enzimas, quimioluminiscentes o fotosensibilizadores. Por tanto, la unión se puede detectar y/o medir detectando la fluorescencia o luminiscencia, radioactividad, actividad enzimática o absorbancia de

65 luz.

Los marcadores adecuados incluyen, a modo de ilustración y sin limitación,

-

enzimas, tales como fosfatasa alcalina, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa ("G6PDH"), alfa-D-galactosidasa,

glucosa oxidasa, glucosa amilasa, anhidrasa carbónica, acetilcolinesterasa, lisozima, malato deshidrogenasa y 5 peroxidasa, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante;

-

colorantes;

-

marcadores fluorescentes o agentes fluorescentes, tales como fluoresceína y sus derivados, fluorocromo, compuestos de rodamina y derivados, GFP (GFP de "Green Fluorescent Protein"), dansilo, umbelliferona, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído, y fluorescamina; fluoróforos tales como criptatos de lantánidos y quelatos, por ejemplo, europio, etc (Perkin Elmer y Cis Biointernational),

-

marcadores quimioluminiscentes o agentes quimioluminiscentes, tales como isoluminol, luminol y los dioxetanos; 15

-

marcadores bioluminescentes, tales como luciferasa y luciferina;

-

sensibilizadores;

-

coenzimas;

-

sustratos enzimáticos;

-

radiomarcadores incluyendo pero sin limitarse a bromo77, carbono14, cobalto57, flúor8, galio67, galio 68,

25 hidrógeno3 (tritio), indio111, indio 113m, yodo123m, yodo125, yodo126, yodo131, yodo133, mercurio107, mercurio203, fósforo32, renio99m, renio101, renio105, rutenio95, rutenio97, rutenio103 , rutenio105, scandio47, selenio75, azufre35, tecnetio99, tecnetio99m, telurio121m, telurio122m, telurio125m, tulio165, tulio1,67, tulio168, ytrio199 y otros radiomarcadores mencionados en el presente documento;

-

partículas, tales como látex o partículas de carbono; sol metálica; cristalita; liposomas; células, etc., que pueden estar marcadas adicionalmente con un colorante, catalizador u otro grupo detectable;

-

moléculas tales como biotina, digoxigenina o 5-bromodesoxiuridina;

35 - restos de toxina, tales como por ejemplo un resto de toxina seleccionado de un grupo de exotoxina de Pseudomonas (PE o un fragmento citotóxico o mutante del mismo), toxina de difteria o un fragmento citotóxico o mutante del mismo, una toxina botulínica A, B, C, D, E o F, ricina o un fragmento citotóxico de la misma por ejemplo ricina A, abrina o un fragmento citotóxico de la misma, saporina o un fragmento citotóxico de la misma, toxina antivírica de fitolaca o a fragmento citotóxico de la misma y briodina 1 o un fragmento citotóxico de la misma.

Las enzimas y coenzimas adecuadas se divulgan en Litman, et al., documento US 4275149, y Boguslaski, et al., documento US 4318980. Los agentes fluorescentes y quimioluminiscentes adecuados se divulgan en Litman, et al., documento US 4275149. Los marcadores incluyen además restos químicos, tales como biotina que se puede detectar por medio de la unión a un resto detectable afín específico, por ejemplo avidina o estreptavidina marcada.

45 Los marcadores detectables se pueden unir a anticuerpos de la invención usando química convencional conocida en la técnica.

Los inmunoconjugados o sus fragmentos funcionales se pueden preparar por métodos conocidos para el experto en la técnica. Se pueden acoplar a enzimas o a marcadores fluorescentes directamente o por el intermediario de un grupo espaciador o de un grupo enlazador, tal como un polialdehído, como glutaraldehído, ácido etilendiamintetraacético (EDTA), ácido dietilentriaminpentaacético (DPTA), o en presencia de agentes de acoplamiento, tales como los mencionados anteriormente para los conjugados terapéuticos. Los marcadores que contienen conjugados de tipo fluoresceína se pueden preparar por reacción con un isotiocianato.

55 Los métodos conocidos para el experto en la técnica que existen para el acoplamiento de los radioisótopos terapéuticos a los anticuerpos directamente o bien por medio de un agente quelante, tal como EDTA, DTPA mencionado anteriormente se pueden usar para los radioelementos que se pueden usar en diagnóstico. Asimismo es posible realizar el marcado con sodio125 por el método de cloramina T [61] o también con tecnetio99m por la técnica de Crockford et al., (documento US 4424200), o unirse por medio de DTPA como se describe por Hnatowich (documento US 4479930).

Existen numerosos métodos por los que el marcador puede producir una señal detectable por medios externos, por ejemplo, por examen visual, radiación electromagnética, calor y reactivos químicos. El marcador también se puede unir a otro miembro de unión que se une al anticuerpo de la invención, o a un soporte.

65 El marcador puede producir directamente una señal, y por lo tanto, no se requieren componentes adicionales para producir una señal. Numerosas moléculas orgánicas, por ejemplo agentes fluorescentes, pueden absorber luz ultravioleta y visible, donde la absorción de luz transfiere energía a estas moléculas y las eleva a un estado de energía excitado. Esta energía absorbida se disipa a continuación por emisión de luz a una segunda longitud de onda. Esta emisión de segunda longitud de onda también puede transferir energía a una molécula aceptora

5 marcada, y la energía resultante disipada de la molécula aceptora por emisión de luz, por ejemplo transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). Otros marcadores que producen directamente una señal incluyen colorantes e isótopos radioactivos.

De forma alternativa, el marcador puede necesitar otros componentes para producir una señal, y entonces el sistema que produce la señal incluiría todos los componentes necesarios para producir una señal medible, que puede incluir sustratos, coenzimas, potenciadores, enzimas adicionales, sustancias que reaccionan con productos enzimáticos, catalizadores, activadores, cofactores, inhibidores, neutralizadores, iones metálicos, y una sustancia de unión específica necesaria para la unión de sustancias que generan señal. Se puede encontrar un análisis detallado de sistemas de producción de señal adecuados en Ullman et al. documento US 5185243,

15 La presente invención divulga un método que comprende provocar o permitir la unión de un miembro de unión como se proporciona en el presente documento a IL-6:IL-6Ra, por ejemplo IL-6:sIL-6Ra. Como se destaca, dicha unión puede tener lugar in vivo, por ejemplo después de la administración de un miembro de unión, o ácido nucleico que codifica un miembro de unión, o puede tener lugar in vitro, por ejemplo en ELISA, transferencia western, inmunocitoquímica, inmunoprecipitación, cromatografía de afinidad, y ensayos basados en células o bioquímicos, tales como un ensayo de proliferación de TF-1.

La presente invención también divulga niveles de medida de antígeno directamente, empleando un miembro de unión de acuerdo con la invención, por ejemplo, en un sistema de biosensor. Por ejemplo, la presente invención

25 comprende un método de detección y/o medida de la unión a IL-6:IL-6Ra, por ejemplo IL-6:sIL-6Ra, que comprende,

(i) exponer dicho miembro de unión a IL-6:IL-6Ra, por ejemplo IL-6:sIL-6Ra y (ii) detección de la unión de dicho miembro de unión a IL-6:IL-6Ra, por ejemplo IL-6:sIL-6Ra, en el que la unión se detecta usando cualquier método o marcador detectable descrito en el presente documento. Este , y cualquier otro método de detección de la unión descrito en el presente documento, puede ser interpretado directamente por la persona que lleva a cabo el método, por ejemplo, observando visualmente un marcador detectable. De forma alternativa, este método, o cualquier otro método de detección de la unión descrito en el presente documento, puede producir un informe en forma de autorradiografía, una fotografía, una impresión de ordenador, un informe de citometría de flujo, una gráfica, un gráfico, un tubo de ensayo o recipiente o pocillo que contiene el resultado, o cualquier otra representación visual o física de un resultado del método.

35 Se puede determinar la cantidad de unión del miembro de unión a IL-6:IL-6Ra, por ejemplo IL-6:sIL-6Ra. La cuantificación puede estar relacionada con la cantidad del antígeno en una muestra de prueba, que puede ser de interés diagnóstico. El cribado para detectar IL-6:IL-6Ra, por ejemplo IL-6:sIL-6Ra, la unión y/o la cuantificación del mismo puede ser útil, por ejemplo, en el cribado de pacientes para detectar enfermedades o trastornos denominados en el presente documento y/o cualquier otra enfermedad o trastorno que implique una expresión y/o actividad de IL-6 y/o IL-6Ra (por ejemplo sIL-6Ra) anómalo. Los niveles de IL-6:IL-6Ra (por ejemplo IL-6:sIL-6Ra) se pueden usar como una medida del nivel de IL-6 en una muestra.

Varias enfermedades están asociadas con un incremento en los en los niveles de IL-6. Los niveles de IL-6 son un

45 indicador de diagnóstico y/o pronóstico útil para varios trastornos, por ejemplo cánceres asociados con un incremento en los niveles de IL-6, y enfermedades inflamatorias y/o autoinmunitarias, como se describe en otra parte en el presente documento.

Un método de diagnóstico o pronóstico de la divulgación puede comprender (i) obtener una muestra de tejido o fluido de un sujeto, (ii) exponer dicha muestra de tejido i fluido a uno o más miembros de unión de la presente invención; y (iii) detectar IL-6:IL-6Ra unido, por ejemplo IL-6:sIL-6Ra, en comparación con una muestra de control, en el que un incremento en la cantidad de unión de IL-6:IL-6Ra (por ejemplo IL-6:sIL-6Ra) en comparación con el control puede indicar un nivel anómalo de expresión o actividad de IL-6 y/o IL-6Ra (por ejemplo sIL-6Ra). Las muestras de tejido o fluido que se van a someter a prueba incluyen sangre, suero, orina, material de biopsia,

55 tumores, o cualquier tejido sospechoso de contener niveles anómalos de IL-6:IL-6Ra (por ejemplo IL-6:sIL-6Ra). Los sujetos puestos a prueba positivos para actividad o niveles anómalos de IL-6:IL-6Ra (por ejemplo IL-6:sIL-6Ra) también se pueden beneficiar de los métodos de tratamiento divulgados en el presente documento.

Los expertos en la técnica son capaces de elegir un modo adecuado de determinación de la unión del miembro de unión a un antígeno de acuerdo con su preferencia y conocimiento general, en vista de los métodos divulgados en el presente documento.

Las reactividades de los miembros de unión en una muestra se pueden determinar por cualquier medio apropiado. El radioinmunoensayo (RIA) es una posibilidad. El antígeno marcado radioactivo se mezcla con antígeno no

65 marcado (la muestra de prueba) y se deja que se una al miembro de unión. El antígeno unido se separa físicamente del antígeno no unido y se determina la cantidad de antígeno radioactivo unido al miembro de unión. Cuanto más antígeno haya en la muestra de prueba, menos antígeno radioactivo se unirá al miembro de unión. También se puede usar un ensayo de unión competitiva con antígeno no radioactivo, usando un antígeno o un análogo enlazado a una molécula indicadora. La molécula indicadora puede ser un fluorocromo, fósforo o colorante de láser con características de absorción o emisión espectralmente aisladas. Los fluorocromos adecuados incluyen fluoresceína,

5 rodamina, ficoeritrina y Texas Red, y quelatos de lantánidos o criptatos. Los colorantes cromógenos adecuados incluyen diaminobenzidina.

Otros indicadores incluyen partículas coloidales macromoleculares o material particulado, tal como perlas de látex que son agentes coloreados, magnéticos o paramagnéticos, y biológica o químicamente activos que pueden provocar directa o indirectamente señales detectables para observarse visualmente, detectarse electrónicamente o registrarse de otro modo. Estas moléculas pueden ser enzimas, que catalizan reacciones que desarrollan, o cambian de color o provocan cambios en las propiedades eléctricas, por ejemplo. Pueden ser molecularmente excitables, de modo que las transiciones electrónicas entre los estados de energía dan como resultado absorciones y emisiones espectrales características. Pueden incluir entidades químicas usadas junto con biosensores. Se pueden emplear

15 sistemas de detección de biotina/avidina o biotina/estreptavidina y fosfatasa alcalina.

Las señales generadas por conjugados individuales de miembro de unión-indicador se pueden usar para derivar datos absolutos o relativos cuantificables de la unión del miembro de unión relevante en muestras (normal y prueba).

También se divulga un kit que comprende un miembro de unión de acuerdo con cualquier aspecto o modo de realización de la presente invención. En el kit, el miembro de unión puede estar marcado para permitir que se determine su reactividad en una muestra, por ejemplo como se describe con más detalle a continuación. Además, el miembro de unión puede o no estar unido a un soporte sólido. Los componentes de un kit, en general, son estériles y están en viales sellados u otros recipientes. Se pueden emplear kits en el análisis de diagnóstico u otros métodos

25 para los que son útiles los miembros de unión. Un kit puede contener instrucciones para el uso de los componentes en un método, por ejemplo un método de acuerdo con la presente invención. Dentro de un kit de la invención pueden estar incluidos materiales auxiliares para ayudar en o para permitir la realización de dicho método. Los materiales auxiliares incluyen un segundo miembro de unión diferente que se une al primer miembro de unión y se conjuga a un marcador detectable (por ejemplo, un marcador fluorescente, isótopo radioactivo o enzima). Los kits basados en anticuerpos también pueden comprender perlas para llevar a cabo una inmunoprecipitación. En general, cada componente de los kits está en su propio recipiente adecuado. Por tanto, en general, estos kits comprenden distintos recipientes adecuados para cada miembro de unión. Además, los kits pueden comprender instrucciones para realizar el ensayo y métodos para interpretar y analizar los datos que resultan de la realización del ensayo.

35 La presente invención también divulga el uso de un miembro de unión como antes para medir los niveles de antígeno en un ensayo de competición, es decir un método de medida del nivel de antígeno en una muestra empleando un miembro de unión como se proporciona por la presente invención en un ensayo de competición. Esto puede ser cuando no se requiere la separación física del antígeno unido del no unido. El enlace de una molécula indicadora al miembro de unión de modo que se produzca un cambio físico u óptico en la unión es una posibilidad. La molécula indicadora puede generar directa o indirectamente señales, que pueden ser cuantificables. El enlace de las moléculas indicadoras puede ser directa o indirectamente, covalentemente, por ejemplo por medio de un enlace peptídico o no covalentemente. La unión por medio de un enlace peptídico puede ser como resultado de la expresión recombinante de una fusión génica que codifica el anticuerpo y la molécula indicadora.

45 En varios aspectos y modos de realización, la presente divulgación se extiende a un miembro de unión que compite por la unión a IL-6:IL-6Ra, por ejemplo IL-6:sIL-6Ra, con cualquier miembro de unión definido en el presente documento, por ejemplo cualquiera de los anticuerpos 1 a 5, por ejemplo en el formato de IgG1. La competición entre los miembros de unión se puede someter a ensayo fácilmente in vitro, por ejemplo uniendo como marca a un miembro de unión una molécula indicadora específica que se puede detectar en presencia de otro(s) miembro(s) de unión no marcado(s), para permitir la identificación de miembros de unión que se unen al mismo epítopo o a un epítopo superpuesto. La competición se puede determinar, por ejemplo, usando el ELISA en el que se inmoviliza IL6:sIL-6Ra a una placa y se una a la placa un primer miembro de unión marcado con marca o marcador junto con uno

o más de otros miembros de unión no marcados. Como se describe en otra parte del presente documento, se puede usar hiper IL-6 para representar IL-6:IL-6Ra y/o IL-6:sIL-6Ra en ensayos tales como ELISA. Se observa la presencia

55 de un miembro de unión no marcado que compite con el miembro de unión marcado por una disminución en la señal emitida por el miembro de unión marcado.

Por ejemplo, la presente divulgación incluye un método de identificación de un compuesto de unión a IL-6:IL-6Ra (por ejemplo un compuesto de unión a IL-6:sIL-6Ra), que comprende (i) inmovilizar IL-6:IL-6Ra, por ejemplo IL-6:sIL6Ra, a un soporte, (ii) poner en contacto dicho IL-6:IL-6Ra inmovilizado, por ejemplo IL-6:sIL-6Ra, simultáneamente

o en una manera por etapas con al menos un miembro de unión marcado con marca o marcador de acuerdo con la invención y uno o más compuestos de unión de prueba no marcados, y (iii) identificar un compuesto de unión IL-6:IL6Ra nuevo, por ejemplo compuesto de unión IL-6:sIL-6Ra, observando una disminución en la cantidad de marca unida del miembro de unión marcado. Dichos métodos se pueden realizar en una manera de alto rendimiento

65 usando un formato de matriz o multipocillo. Dichos ensayos también se pueden realizar en solución. Véase, por ejemplo, el documento US 5814468, el cual, como se describe anteriormente, la detección de la unión se puede interpretar directamente por la persona que realiza el método, por ejemplo, observando visualmente un marcador detectable, o una disminución en la presencia del mismo. De forma alternativa, los métodos de unión de la invención pueden producir un informe en forma de una autorradiografía, una fotografía, una impresión de ordenador, un informe de citometría de flujo, una gráfica, un gráfico, un tubo de ensayo o recipiente o pocillo que contiene el

5 resultado, o cualquier otra representación visual o física de un resultado del método.

Los ensayos de competición también se pueden usar en el mapeo de epítopos. En un caso, se puede usar el mapeo de epítopos para identificar el epítopo unido por el miembro de unión para IL-6:IL-6Ra (por ejemplo para IL-6:sIL6Ra) que se puede haber optimizado opcionalmente neutralizando y/o modulando características. Dicho epítopo puede ser lineal o conformacional. Un epítopo conformacional puede comprender al menos dos fragmentos diferentes de IL-6:IL-6Ra (por ejemplo de IL-6:sIL-6Ra), en el que dichos fragmentos están posicionados en proximidad entre sí en el complejo para formar un epítopo conformacional que se reconoce por un inhibidor de IL6:IL-6Ra (por ejemplo IL-6:sIL-6Ra), tal como un miembro de unión-IL-6:IL-6Ra (por ejemplo un miembro de unión -IL-6:sIL-6Ra). En la pruebas para determinar la competición, se puede emplear un fragmento peptídico del antígeno,

15 en especial un péptido que incluye o que consiste esencialmente en un epítopo de interés. Se puede usar un péptido que tiene la secuencia peptídica más uno o más aminoácidos en cualquier extremo. Los miembros de unión de acuerdo con la presente divulgación pueden ser tales que su unión al antígeno se inhiba por un péptido con o que incluye la secuencia dada.

La presente invención divulga además un ácido nucleico aislado que codifica un miembro de unión de la presente invención. El ácido nucleico puede incluir ADN y/o ARN. En uno, la presente invención divulga un ácido nucleico que codifica una CDR o un conjunto de CDR o dominio VH o dominio VL o sitio de unión a antígeno de anticuerpo o molécula de anticuerpo, por ejemplo scFv o IgG1, de la invención como se define anteriormente.

25 La presente invención también divulga construcciones en forma de plásmidos, vectores, casetes de transcripción o expresión que comprenden al menos un polinucleótido como anteriormente.

La presente invención también divulga una célula huésped recombinante que comprende una o más construcciones como anteriormente. Un ácido nucleico que codifica cualquier CDR o conjunto de CDR o dominio VH o dominio VL o sitio de unión a antígeno de anticuerpo o molécula de anticuerpo, por ejemplo scFv o IgG1 como se proporciona, forma él mismo un aspecto de la presente invención, al igual que un método de producción del producto codificado, método que comprende la expresión del ácido nucleico que lo codifica. La expresión se puede lograr de forma conveniente cultivando en condiciones apropiadas células huésped recombinantes que contienen el ácido nucleico. Después de la producción por expresión, un dominio VH o VL, o miembro de unión se puede aislar y/o purificar

35 usando cualquier técnica adecuada, usada después según sea apropiada.

El ácido nucleico de acuerdo con la presente divulgación puede comprender ADN o ARN y puede ser total o parcialmente sintético. La referencia a una secuencia de nucleótidos como se describe en el presente documento engloba una molécula de ADN con la secuencia especificada y engloba una molécula de ARN con la secuencia especificada en la que U se sustituye por T, a menos que el contexto requiera otra manera.

Otro aspecto más divulga un método de producción de un dominio variable VH de anticuerpo, incluyendo el método provocar la expresión del ácido nucleico codificante. Dicho método puede comprender cultivar células huésped en condiciones para la producción de dicho dominio variable VH de anticuerpo.

45 Se proporcionan métodos análogos para la producción de dominios variables VL y miembros de unión que comprenden un dominio VH y/o VL como otros aspectos de la presente divulgación.

Un método de producción puede comprender una etapa de aislamiento y/o purificación del producto. Un método de producción puede comprender formular el producto en una composición incluyendo al menos un componente adicional, tal como un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Los sistemas para la clonación y expresión de un polipéptido en una variedad de células huésped diferentes son bien conocidos. Las células huésped adecuadas incluyen bacterias, células de mamífero, células vegetales, hongos

55 filamentosos, levaduras y sistemas de baculovirus y plantas y animales transgénicos. La expresión de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo en células procariotas está bien establecida en la técnica. Para una revisión, véase, por ejemplo, Plückthun [62]. Un huésped bacteriano común es E. coli.

La expresión en células eucariotas en cultivo también está disponible para los expertos en la técnica como opción para la producción de un miembro de unión [63, 64, 65]. Las líneas celulares de mamífero disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de cría de hámster, células de melanoma de ratón NS0, células de mieloma de rata YB2/0, células de riñón embrionario humano, células de retina embrionaria humana y muchas otras.

65 Los vectores adecuados se pueden elegir o construir para que contengan secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotoras, secuencias de terminación, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias, según sea apropiado. Los vectores pueden ser plásmidos, por ejemplo, fagémido, o vírico por ejemplo 'fago, según sea apropiado [66]. Muchas técnicas conocidas y protocolos para la manipulación de ácido nucleico, por ejemplo en la preparación de construcciones de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y expresión génica, y análisis de proteínas, se

5 describen en detalle en Ausubel et al. [67].

Otro aspecto de la presente invención divulga una célula huésped que contiene ácido nucleico como se divulga en el presente documento. Dicha célula huésped puede estar in vitro y puede estar en cultivo. Dicha célula huésped puede estar in vivo. La presencia in vivo de la célula huésped puede permitir la expresión intracelular de los miembros de unión de la presente invención como "intracuerpos" o anticuerpos intracelulares. Los Intracuerpos se pueden usar para tratamiento génico.

Otro aspecto adicional divulga un método que comprende introducir ácido nucleico de la invención en una célula huésped. La introducción puede emplear cualquier técnica disponible. Para células eucariotas, las técnicas 15 adecuadas pueden incluir transfección de fosfato de calcio, DEAE-dextrano, electroporación, transfección y transducción mediada por liposomas usando retrovirus u otro virus, por ejemplo vaccinia o, para células de insecto, baculovirus. La introducción de ácido nucleico en la célula huésped, en particular una célula eucariota puede usar un sistema basado en plásmido o vírico. El sistema plasmídico se puede mantener episomalmente o se puede incorporar en la célula huésped o en un cromosoma artificial. La incorporación puede ser por integración aleatoria o bien dirigida de una o más copias en un único locus o múltiples locus. Para células bacterianas, las técnicas adecuadas pueden incluir transformación con cloruro de calcio, electroporación y transfección usando bacteriófagos.

La introducción se puede seguir provocando o permitiendo la expresión del ácido nucleico, por ejemplo, cultivando células huésped en condiciones para la expresión del gen. La purificación del producto expresado se puede lograr

25 por métodos conocidos para un experto en la técnica.

El ácido nucleico de la invención se puede integrar en el genoma (por ejemplo, cromosoma) de la célula huésped. La integración se puede promover por la inclusión de secuencias que promueven la recombinación con el genoma, de acuerdo con técnicas estándar.

La presente invención también divulga un método que comprende el uso de una construcción como se establece anteriormente en un sistema de expresión para expresar un miembro de unión o polipéptido como anteriormente.

Existen pruebas de la implicación de la IL-6 en una variedad de trastornos, como se analiza en otra parte del

35 presente documento. Por lo tanto, los miembros de unión de la presente invención se pueden usar en un método de diagnóstico o tratamiento de un trastorno asociado con IL-6. Dicho trastorno puede ser, por ejemplo, un trastorno inflamatorio y/o autoinmunitario tal como por ejemplo, artritis reumatoide, artrosis, caquexia, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, a idiopática juvenil, asma, lupus eritematoso sistémico, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn o ateroesclerosis. También se puede usar un miembro de unión de la presente invención para tratar un trastorno tal como a tumor y/o cáncer.

De este modo, se puede usar al menos un miembro de unión de la presente invención para modular o tratar al menos una enfermedad relacionada con IL-6, en un paciente, animal, órgano, tejido o célula, incluyendo, pero sin limitarse a:

(1) (el aparato respiratorio) enfermedades obstructivas de las vías incluyendo enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD); asma, tal como asma bronquial, alérgica, intrínseca, extrínseca y por alergia al polvo, en particular asma crónica o inveterada (por ejemplo asma tardía y hiperreactividad de las vías respiratorias); bronquitis; rinitis aguda, alérgica, atrófica y rinitis crónica incluyendo rinitis caseosa, rinitis hipertrófica, rinitis purulenta, rinitis seca y rinitis medicamentosa; rinitis membranosa incluyendo rinitis crupal, fibrinosa y pseudomembranosa y rinitis escrofulosa; rinitis estacional incluyendo rinitis nerviosa (fiebre del heno) y rinitis vasomotora, sinusitis, fibrosis pulmonar idiopática (IPF); sarcoidosis, pulmón de granjero y enfermedades relacionadas, síndrome de dificultad respiratoria en adultos, neumonitis por hipersensibilidad, neumonía intersticial idiopática y fibrosis pulmonar;

55 (2) (huesos y articulaciones) artritis reumatoide, artritis crónica juvenil, artritis juvenil de aparición sistémica, espondiloartropatías seronegativas (incluyendo espondilitis anquilosante, artritis psoriásica y enfermedad de Reiter), enfermedad de Behcet, síndrome de Siogren y esclerosis sistémica, gota, osteoporosis y artrosis;

(3)

(piel) psoriasis, dermatitis atópica, dermatitis de contacto y otras dermatosis eczematosas, dermatitis de contacto alérgica, dermatitis seborreica, liquen plano, escleroderma, pénfigo, penfigoide ampolloso, epidermólisis ampollosa, urticaria, angiodermas, vasculitis, eritemas, eosinofilias cutáneas, uveítis, alopecia en áreas, conjuntivitis alérgica y conjuntivitis primaveral;

(4)

(tubo gastrointestinal) úlcera gástrica, enfermedad celíaca, proctitis, gastroenteritis eosinofílica, mastocitosis,

65 enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, síndrome antifosfolipídico)), alergias relacionadas con alimentos que tienen efectos lejos del intestino, por ejemplo, migraña, rinitis y eccema;

(5) (otros tejidos y enfermedad sistémica) caquexia, esclerosis múltiple, ateroesclerosis, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (sida), glomerulonefritis proliferativa mesangial, síndrome nefrótico, nefritis, nefritis glomerular, insuficiencia renal aguda, hemodiálisis, uremia, lupus eritematoso localizado o discoide, lupus 5 eritematoso sistémico, enfermedad de Castleman, tiroiditis de Hashimoto, miastenia grave, diabetes de tipo I, diabetes insulinorresistente de tipo B, anemia drepanocítica, iridociclitis/uveitis/neuritis óptica, síndrome nefrítico, fascitis eosinofílica, síndrome hiper-IgE, vasculitis sistémica/granulomatosis de Wegener, orquitis/procedimientos de reversión de vasectomía, lepra lepromatosa, hepatitis inducida por alcohol, síndrome de Sézary y púrpura idiopática trombocitopénica; adhesiones postoperatorias, nefrosis, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, síndrome de 10 sepsis, sepsis grampositiva, sepsis gramnegativa, sepsis negativa para cultivo, sepsis fúngica, fiebre neutropénica, pancreatitis aguda, urosepsis, enfermedad de Graves, enfermedad de Raynaud, citotoxicidad mediada por anticuerpo, reacciones de hipersensibilidad de tipo III, síndrome de POEMS (polineuropatía, organomegalia, endocrinopatía, gammopatía monoclonal, y síndrome de cambios cutáneos), enfermedad mixta del tejido conjuntivo, enfermedad de Addison idiopática, diabetes mellitus, hepatitis activa crónica, cirrosis biliar primaria, vitiligo, síndrome 15 post-MI (cardiotomía), hipersensibilidad de tipo IV, granulomas debidos a orgánulos intracelulares, enfermedad de Wilson, hemacromatosis, deficiencia de antitripsina alfa-I, retinopatía diabética, tiroiditis de Hashimoto, evaluación de del eje hipotalámico-pituitario-supradrenal, tiroiditis, encefalomielitis, enfermedad de pulmón crónica neonatal, linfohistiocitosis hematofagocítica familiar, alopecia, tratamiento por radiación (por ejemplo, incluyendo pero sin limitarse a astenia, anemia, caquexia, y similares), intoxicación por salicilato crónica, apnea del sueño, obesidad,

20 insuficiencia cardíaca, y meningococcemia;

(6) (rechazo de aloinjerto) agudo y crónico después de, por ejemplo, trasplante de riñón, corazón, hígado, pulmón, páncreas, médula ósea, hueso, intestino delgado, piel, cartílago y córnea; y enfermedad de injerto frente a huésped crónica;

(7) (neoplasias malignas) leucemia, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia aguda, ALL de linfocitos T, linfocitos Bl o FAB, leucemia mielógena crónica (CML), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia de células pilosas, síndrome mielodisplásico (MDS), cualquier linfoma, enfermedad hodgkiniana, linfoma no hodgkiniano, cualquier linfoma maligno, linfoma de Burkitt, mieloma múltiple, sarcoma de Kaposi,

30 carcinoma de células renales, carcinoma colorrectal, carcinoma prostático, carcinoma pancreático, carcinoma nasofaríngeo, histiocitosis maligna, síndrome paraneoplásico/hipercalcemia de neoplasia maligna, tumores sólidos, adenocarcinomas, sarcomas, melanoma maligno, hemangioma, enfermedad metastásica, resorción ósea relacionada con cáncer, dolor óseo relacionado con cáncer; la supresión de metástasis del cáncer; la mejora de caquexia de cáncer;

(8)

Fibrosis cística, apoplejía, daño por reperfusión en el corazón, cerebro, miembros periféricos y otros órganos;

(9)

Heridas por quemadura, traumatismo/hemorragia, exposición a radiación ionizante, úlceras cutáneas crónicas;

40 (10) Enfermedades reproductivas (por ejemplo trastornos de ovulación, menstruación e implantación, parto prematuro, preeclampsia, endometriosis);

(11) (Infecciones) infección bacteriana aguda o crónica, procesos infecciosos o parasitarios agudos y crónicos, incluyendo infecciones bacterianas, víricas y fúngicas, infección de VIH/neuropatía por VIH, meningitis, hepatitis (A,B 45 o C, u otra hepatitis vírica similar), artritis séptica, peritonitis, neumonía, epiglotitis, E. coli 0157:h7, síndrome urémico hemolítico/púrpura idiopática trombocitopénica, malaria, fiebre hemorrágica por dengue, leishmaniasis, lepra, síndrome de choque tóxico, miositis estreptocócica, gangrena gaseosa, micobacteria tuberculosa, micobacteria de la tuberculosis aviar-intracelular, neumonía por Pneumocystis jirovecii, enfermedad inflamatoria pélvica, orquitis/epididimitis, legionela, enfermedad de Lyme, gripe a, virus Epstein-Barr, síndrome hemafagocítico asociado

50 a infección vírica, encefalitis vírica/meningitis aséptica, y similares.

En consecuencia, la invención divulga un método de tratamiento de un trastorno relacionado con IL-6, que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de uno o más miembros de unión de la presente invención sólo o en un régimen terapéutico combinado con otro medicamento apropiado conocido en la

55 técnica o descrito en el presente documento.

Las pruebas de la implicación de la IL-6 en determinados trastornos se resumen en otra parte del presente documento. Además, los datos presentados en el presente documento indican además que los miembros de unión de la invención se pueden usar para tratar dichos trastornos, incluyendo tratamiento preventivo y reducción de la 60 gravedad de los trastornos. En consecuencia, la invención divulga un método de tratamiento o reducción de la gravedad de al menos un síntoma de cualquiera de los trastornos mencionados en el presente documento, que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de uno o más miembros de unión de la presente invención sólo o en un régimen terapéutico combinado con otro medicamento apropiado conocido en la técnica o descrito en el presente documento de modo que se reduce la gravedad de al menos un síntoma de

65 cualquiera de los trastornos anteriores.

Por tanto, los miembros de unión de la presente invención son útiles como agentes terapéuticos en el tratamiento de enfermedades o trastornos que implican la IL-6, por ejemplo expresión y/o actividad de IL-6, en especial expresión/actividad anómala. Un método de tratamiento pude comprender administrar una cantidad eficaz de un miembro de unión de la invención a un paciente que lo necesita, en el que se disminuye la expresión y/o actividad

5 anómala de IL-6. Un método de tratamiento puede comprender (i) identificar un paciente que demuestra niveles o actividad anómalos de IL-6, por ejemplo usando los métodos de diagnóstico descritos anteriormente, y (ii) administrar una cantidad eficaz de un miembro de unión de la invención al paciente, en el que se disminuye la expresión y/o actividad anómala de IL-6, IL-6Ra y/o IL-6:IL-6Ra (por ejemplo IL-6:sIL-6Ra). Una cantidad eficaz es una cantidad que disminuye la expresión y/o actividad anómala de IL-6 para disminuir o reducir la gravedad de al menos un síntoma de la enfermedad o trastorno particular que se trata, pero que no cura necesariamente la enfermedad o el trastorno.

La invención también divulga un método de antagonización de al menos un efecto de IL-6 que comprende poner en contacto con o administrar una cantidad eficaz de uno o más miembros de unión de la presente invención de modo

15 que se antagonice dicho al menos un efecto de IL-6. Los efectos de IL-6 que se pueden antagonizar por los métodos de la divulgación incluyen la unión de IL-6:IL-6Ra (por ejemplo IL-6:sIL-6Ra) a su receptor gp130, y cualquier efecto posterior que surja como consecuencia de esta unión.

En consecuencia, otros aspectos de la invención divulgan métodos de tratamiento que comprenden la administración de un miembro de unión como se proporciona, composiciones farmacéuticas que comprenden dicho miembro de unión, y el uso de dicho miembro de unión en la fabricación de un medicamento para la administración, por ejemplo en un método de preparación de un medicamento o composición farmacéutica que comprende la formulación del miembro de unión con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Un excipiente farmacéuticamente aceptable puede ser un compuesto o una combinación de compuestos que entran en una composición farmacéutica

25 sin provocar reacciones secundarias y que permite, por ejemplo, facilitar la administración del/de los compuesto(s) activo(s), un incremento en su vida útil y/o en su eficacia en el cuerpo, un incremento en su solubilidad en solución o si no una mejora en su conservación. Estos vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos y se adaptarán por un experto en la técnica como función de la naturaleza y del modo de administración del/de los compuesto(s) activo(s) elegidos.

Normalmente, los miembros de unión de la presente invención se administrarán en forma de una composición farmacéutica, que puede comprender al menos un componente además del miembro de unión. Por tanto, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención, y para su uso de acuerdo con la presente invención, pueden comprender, además del principio activo, un excipiente, vehículo, tampón, estabilizante u otros

35 materiales farmacéuticamente aceptables bien conocidos para los expertos en la técnica. Dichos materiales deben ser no tóxicos y no deben interferir con la eficacia del principio activo. La naturaleza precisa del vehículo u otro material dependerá de la vía de administración, que puede ser oral, inhalada, intratecal, tópica, intravesicular o por inyección, como se analiza a continuación.

Las composiciones farmacéuticas para la administración oral, tal como por ejemplo moléculas de anticuerpo con un único dominio (por ejemplo "nanocuerpos ™") etc., también están previstas en la presente invención. Dichas formulaciones orales pueden ser en forma de comprimido, cápsula, polvo, líquida o semi-sólida. Un comprimido puede comprender un vehículo sólido, tal como gelatina o un coadyuvante. Las composiciones farmacéuticas líquidas, en general, comprenden un vehículo líquido, tal como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceite 45 mineral o aceite sintético. También se puede incluir solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacáridos

o glucoles, tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol.

Para inyección intravenosa, o inyección en el sitio de la dolencia, el principio activo estará en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable que esté libre de pirógenos y tenga un pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Los expertos en la técnica son bien capaces de preparar soluciones adecuadas usando, por ejemplo, vehículos isotónicos, tales como inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de Ringer con lactato. Se pueden emplear conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos según se requiera incluyendo tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, tales como ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de

55 benzalconio; cloruro de bencetonio; alcohol fenólico, butílico o bencílico, tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3'-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular; proteínas, tales seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparaginas, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; azúcares, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones de formación de sal, tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos, tales como TWEEN ™, PLURONICS ™ o polietilenglicol (PEG).

Los miembros de unión de la presente invención se pueden formular en formas líquida, semisólida o sólida dependiendo de las propiedades fisicoquímicas de la molécula y de la vía de administración. Las formulaciones 65 pueden incluir excipientes, o combinaciones de excipientes, por ejemplo: azúcares, aminoácidos y tensioactivos. Las formulaciones líquidas pueden incluir un amplio intervalo de concentraciones de anticuerpo y pH. Las formulaciones sólidas se pueden producir por liofilización, secado por pulverización, o secado por tecnología de fluido supercrítico, por ejemplo. Las formulaciones de los miembros de unión dependerán de la vía de administración destinada: por ejemplo, las formulaciones para la administración por vía pulmonar pueden consistir en partículas con propiedades físicas que garanticen la penetración profunda en el pulmón tras la inhalación; las formulaciones por vía tópica (por 5 ejemplo para el tratamiento de cicatrices, por ejemplo cicatrices dérmicas) pueden incluir agentes modificadores de la viscosidad, que prolongan el tiempo que el fármaco reside en el sitio de acción. Un miembro de unión se puede preparar con un vehículo que protegerá al miembro de unión contra la liberación rápida, tal como a una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos, y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo,

10 polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones son conocidos por los expertos en la técnica [68].

El tratamiento se puede dar por vía oral (tal como por ejemplo moléculas de anticuerpo con un único dominio (por ejemplo "nanocuerpos™")) por inyección (por ejemplo, por vía subcutánea, intraarticular, intravenosa, intraperitoneal, 15 intraarterial o intramuscular), por inhalación, intratraqueal, por la vía intravesicular (instilación en la vejiga urinaria), o por vía tópica (por ejemplo intraocular, intranasal, rectal, en heridas, sobre la piel). El tratamiento se puede administrar por infusión por pulso, en particular con dosis decrecientes del miembro de unión. La vía de administración se puede determinar por las características fisicoquímicas del tratamiento, por consideraciones especiales para la enfermedad o por el requisito de optimización de la eficacia o para minimizar efectos secundarios.

20 Una vía de administración particular es la intravenosa. Otra vía de administración de composiciones farmacéuticas de la presente invención es por vía subcutánea. Está previsto que el tratamiento no se restrinja al uso clínico. Por lo tanto, la inyección subcutánea usando un dispositivo sin aguja también es ventajoso.

Una composición se puede administrar sola o en combinación con otros tratamientos, de forma simultánea o bien 25 secuencial dependiendo de la afección que se trate.

Se puede usar un miembro de unión de la invención como parte de un tratamiento de combinación junto con un componente medicinal adicional. Los tratamientos de combinación se pueden usar para proporcionar efectos sinérgicos significativos, en particular la combinación de un miembro de unión de la invención con uno o más de

30 otros fármacos. Un miembro de unión de la invención se puede administrar de forma simultánea o secuencial o como una preparación combinada con otro agente o agentes terapéuticos, para el tratamiento de una o más de las afecciones enumeradas en el presente documento.

Se puede usar un miembro de unión de la invención como un quimiosensibilizador por el que se puede incrementar

35 la eficacia terapéutica de agentes citotóxicos, y por tanto se puede proporcionar para la administración en combinación con uno o más agentes citotóxicos, de forma simultánea o bien secuencial. El miembro de unión también se puede usar como un radio sensibilizador por el que se puede mejorar la eficacia de la radiación, y por tanto se puede proporcionar para la administración en combinación con radiación, de forma simultánea o bien secuencial.

40 Un miembro de unión de acuerdo con la presente invención se puede proporcionar en combinación o en adición con uno o más de los siguientes agentes:

-

una citocina o agonista o antagonista de la función de citocina (por ejemplo un agente que actúa en la ruta de

45 señalización de citocinas, tal como un modulador del sistema SOCS), tal como un interferón alfa-, beta- y/o gamma; factor de crecimiento insulinoide de tipo I (IGF-1), sus receptores y proteínas de unión asociadas; interleucinas (IL), por ejemplo una o más de IL-1 a -33, y/o un antagonista o inhibidor de interleucina, tal como Anakinra; inhibidores de receptores de los miembros de la familia de interleucina o inhibidores de subunidades específicas de dichos receptores, un inhibidor del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), tal como anticuerpos monoclonales anti-TNF

50 (por ejemplo infliximab, adalimumab y/o CDP-870) y/o un antagonista de receptor de TNF, por ejemplo una molécula de inmunoglobulina (tal como etanercept) y/o un agente de bajo peso molecular, tal como pentoxifilina;

-

un modulador de linfocitos B, por ejemplo un anticuerpo monoclonal que se dirige a linfocitos B (tal como CD20

(rituximab) o MRA-aIL16R) o linfocitos T (por ejemplo CTLA4-Ig, HuMax Il-15 o Abatacept); 55

-

un modulador que inhibe la actividad de osteoclastos, por ejemplo un anticuerpo para RANKL;

-

un modulador de quimiocina o de la función del receptor de quimiocina, tal como un antagonista de CCR1, CCR2,

CCR2A, CCR2B, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10 y CCR11 (para la familia C-C); CXCR1, 60 CXCR2, CXCR3, CXCR4 y CXCR5 y CXCR6 (para la familia C-X-C) y CX3CR1 para la familia C-X3-C;

-

un inhibidor de metaloproteasas de matriz (MMP), es decir una o más de las estromelisinas, las colagenasas y las gelatinasas así como aggrecanasa, en especial colagenasa-1 (MMP-1), colagenasa-2 (MMP-8), colagenasa-3 (MMP-13), estromelisina-1 (MMP-3), estromelisina-2 (MMP-10) y/o estromelisina-3 (MMP-11) y/o MMP-9 y/o MMP

65 12, por ejemplo un agente tal como doxiciclina; - un inhibidor de la biosíntesis de leucotrienos, inhibidor de 5-lipoxigenasa (5-LO) o antagonista de la proteína activadora de 5-lipoxigenasa (FLAP), tal como zileuton; ABT-761; fenleuton; tepoxalina; Abbott-79175; Abbott-85761; N-(5-sustituido)-tiofen-2-alquilsulfonamidas; 2,6-di-terc-butilfenolhidrazonas; metoxitetrahidropiranos tales como Zeneca ZD-2138; el compuesto SB-210661; un compuesto de 2-cianonaftaleno sustituido con piridinilo, tal como L

5 739,010; un compuesto de 2-cianoquinolina, tal como L-746,530; indol y/o un compuesto de quinolina, tal como MK591, MK-886 y/o BAY x 1005;

-

un agonista del receptor para leucotrienos (LT) B4, LTC4, LTD4, y LTE4, seleccionado del grupo que consiste en las fenotiazina-3-1s, tal como L-651,392; compuestos amidino, tales como CGS-25019c; benzoxalaminas, tales como ontazolast; bencenocarboximidamidas, tales como BIIL 284/260; y compuestos, tales como zafirlukast, ablukast, montelukast, pranlukast, verlukast (MK-679), RG-12525, Ro-245913, iralukast (CGP 45715A) y BAY x 7195;

-

un inhibidor de fosfodiesterasa (PDE), tal como una metilxantanina, por ejemplo teofilina y/o aminofilina; y/o un

15 inhibidor de la isoenzima PDE selectiva, por ejemplo un inhibidor de PDE4 y/o inhibidor de la isoforma PDE4D y/o un inhibidor de PDE5;

-

un antagonista del receptor de tipo 1 de histamina, tal como cetirizina, loratadina, desloratadina, fexofenadina, acrivastina, terfenadina, astemizol, azelastina, levocabastina, clorfeniramina, prometazina, ciclizina, y/o mizolastina (en general, aplicado por vía oral, tópica o parenteral);

-

un inhibidor de la bomba de protones (tal como omeprazol) o antagonista del receptor de tipo 2 de histamina gastroprotectora;

25 - un antagonista del receptor de tipo 4 de histamina;

-

un agente simpaticomimético vasoconstrictor agonista del adrenorreceptor alfa-1/alfa-2, tal como propilhexedrina, fenilefrina, fenilpropanolamina, efedrina, pseudoefedrina, clorhidrato de nafazolina, clorhidrato de oximetazolina, clorhidrato de tetrahidrozolina, clorhidrato de xilometazolina, clorhidrato de tramazolina y clorhidrato de etilnorepinefrina;

-

un agente anticolinérgico, por ejemplo un antagonista del receptor muscarínico (M1, M2, y M3), tal como atropina, hioscina, glucopirrrolato, bromuro de ipratropio, bromuro de tiotropio, bromuro de oxitropio, pirenzepina y telenzepina;

-

un agonista del beta-adrenoceptor (incluyendo beta-receptor subtipos 1-4), tal como isoprenalina, salbutamol, formoterol, salmeterol, terbutalina, orciprenalina, mesilato de bitolterol y/o pirbuterol, por ejemplo un enantiómero quiral de los mismos;

-

una cromona, por ejemplo cromoglicato de sodio y/o nedocromil sodio;

-

un glucocorticoide, tal como flunisolida, acetónido de triamcinolona, dipropionato de beclometasona, budesonida, propionato de fluticasona, ciclesonida, y/o furoato de mometasona;

45 - un agente que modula los receptores de hormona nuclear, tal como a PPAR;

-

una inmunoglobulina (Ig) o preparación de Ig o un antagonista o anticuerpo que modula la función de Ig, tal como anti-IgE (por ejemplo omalizumab);

- otro agente antiinflamatorio aplicado por vía tópica o sistémica, por ejemplo talidomida o un derivado del mismo, un retinoide, ditranol y/o calcipotriol;

-

combinaciones de aminosalicilatos y sulfapiridina, tal como sulfasalazina, mesalazina, balsalazida, y olsalazina; y

agentes inmunomoduladores, tales como las tiopurinas; y corticosteroides, tales como budesonida; 55

-

un agentes antibacterianos, por ejemplo un derivado de penicilina, una tetraciclina, un macrólido, una beta-lactama, una fluoroquinolona, metronidazol y/o un aminoglucósido inhalado; y/o un agente antivírico, por ejemplo acyclovir, famciclovir, valaciclovir, ganciclovir, cidofovir; amantadina, rimantadina; ribavirina; zanamavir y/o oseltamavir; un inhibidor de proteasa, tal como indinavir, nelfinavir, ritonavir y/o saquinavir; un inhibidor nucleosídico de transcriptasa inversa, tal como didanosina, lamivudina, stavudina, zalcitabina, zidovudina; un inhibidor no nucleosídico de transcriptasa inversa, tal como nevirapina, efavirenz;

-

un agente cardiovascular, tal como un bloqueante del canal de calcio, bloqueante de beta-adrenoceptor, inhibidor de una enzima conversora de angiotensina (ACE), antagonista del receptor de angiotensina-2; agente de

65 disminución de lípidos, tal como una estatina y/o fibrato; un modulador de morfología de células sanguíneas, tal como pentoxifilina; un trombolítico y/o un anticoagulante, por ejemplo un inhibidor de agregación plaquetaria;

-

un agente del CNS, tal como un antidepresivo (tal como sertralina), fármaco anti-Parkinsoniano (tal como deprenilo, L-dopa, ropinirol, pramipexol; inhibidor de MAOB, tal como selegina y rasagilina; inhibidor de comP, tal como tasmar; inhibidor de A-2, inhibidor de la recaptación de dopamina, antagonista de NMDA, agonista de nicotina, agonista de

5 dopamina y/o inhibidor de la óxido nítrico sintasa neuronal) y un fármaco anti-Alzheimer', tal como donepezil, rivastigmina, tacrina, inhibidor de COX-2, propentofilina o metrifonato;

-

un agente para el tratamiento del dolor agudo o crónico, por ejemplo un analgésico de acción central o periférica, tal como un análogo opioide o derivado, carbamazepina, fenitoína, valproato de sodio, amitriptilina u otro agente antidepresivo, paracetamol, o agente antiinflamatorio no esteroideo;

-

un agente anestésico local aplicado por vía parenteral o tópica (incluyendo inhalado), tal como lignocaína o un análogo de la misma;

15 - un agente anti-osteoporosis, por ejemplo un agente hormonal, tal como raloxifeno, o un bifosfonato, tal como alendronato;

-

(i) un inhibidor de triptasa; (ii) un antagonista del factor activador plaquetario (FAP) ; (iii) un inhibidor de la enzima convertidora de interleucina (ICE); (iv) un inhibidor de IMPDH; (v) un inhibidor de la molécula de adhesión incluyendo antagonista de VLA-4; (vi) una catepsina; (vii) un inhibidor de cinasa, por ejemplo un inhibidor de tirosina cinasas (tales como Btk, Itk, Jak3 MAP los ejemplos de inhibidores pueden incluir Gefitinib, Imatinib mesilato), una serina / treonina cinasa (por ejemplo un inhibidor de MAP cinasa, tal como p38, JNK, proteína cinasas A, B y C y IKK), o una cinasa implicada en la regulación del ciclo celular (por ejemplo, una cinasa dependiente de ciclina); (viii) un inhibidor de glucosa-6 fosfato deshidrogenasa; (ix) una quinina-B.sub1. - y/o B.sub2. -antagonista de receptores; (x) un 25 agente anti-gota, por ejemplo colchicina; (xi) un inhibidor de xantina oxidasa, por ejemplo allopurinol; (xii) un agente uricosúrico, por ejemplo probenecid, sulfinpirazona, y/o benzbromarona; (xiii) un secretagogo de la hormona del crecimiento; (xiv) factor de crecimiento transformante (TGF�); (xv) factor de crecimiento derivado r de plaquetas (PDGF); (xvi) factor de crecimiento fibroblástico, por ejemplo factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF); (xvii) factor estimulador de colonias de granulocitos macrófagos (GM-CSF); (xviii) crema capsaicina; (xix) un antagonista del receptor de tachicinina NK.subl. y/o NK.sub3., tal como NKP-608C, SB-233412 (talnetant) y/o D-4418; (xx) un inhibidor de elastasa, por ejemplo UT-77 y/o ZD-0892; (xxi) un inhibidor de la enzima convertidora de TNF-alfa (TACE); (xxii) inhibidor de óxido nítrico sintasa inducida (iNOS) o (xxiii) una molécula homóloga del receptor quimiotáctica expresada en linfocitos TH2 (tal como un antagonista de CRTH2); (xxiv) un inhibidor de un P38 (xxv) agente modulador de la función de receptores tipo Toll (TLR) y (xxvi) un agente modulador de la actividad de

35 receptores purinérgicos, tal como P2X7; (xxvii) un inhibidor de la activación del factor de transcripción, tal como NFkB, API, y/o STATS.

Un inhibidor puede ser específico o puede ser un inhibidor mezclado, por ejemplo un inhibidor que dirige más de una de las moléculas (por ejemplo receptores) o clases moleculares mencionadas anteriormente.

El miembro de unión también se podría usar en asociación con un agente quimioterápico u otro inhibidor de tirosina cinasa en coadministración o en forma de un inmunoconjugado. Los fragmentos de dicho anticuerpo también se podrían usar en anticuerpos biespecíficos obtenidos por mecanismos recombinantes o acoplamiento bioquímico y asociando después la especificidad del anticuerpo descrito anteriormente con la especificidad de otros anticuerpos

45 que pueden reconocer otras moléculas implicadas en la actividad para la que está asociada la IL-6.

Para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria, un miembro de unión de la invención se puede combinar con uno o más agentes, tales como agentes antiinflamatorios no esteroideos (a continuación en el presente documento AINE) incluyendo inhibidores de ciclooxigenasa no selectivos (COX)-1 / COX-2 tanto si se aplican por vía tópica o sistémica, tales como piroxicam, diclofenac, ácidos propiónicos, tales como naproxeno, flurbiprofeno, fenoprofeno, cetoprofeno e ibuprofeno, fenamatos, tales como ácido mefenámico, indometacina, sulindac, azapropazona, pirazolonas, tales como fenilbutazona, salicilatos, tales como aspirina); inhibidores de COX-2 selectivos (tales como meloxicam, celecoxib, rofecoxib, valdecoxib, lumarocoxib, parecoxib y etoricoxib); dadores de óxido nítrico inhibidores de la ciclooxigenasa (CINOD); glucocorticosteroides (tanto si se administran por vías tópicas, oral,

55 intramuscular, intravenosa o intraarticular); metotrexato, leflunomida; hidroxicloroquina, d-penicilamina, auranofina u otras preparaciones de oro parenterales o orales; analgésicos; diacereína; tratamientos intraarticulares, tales como derivados de ácido hialurónico; y complementos nutricionales, tales como glucosamina.

Un miembro de unión de la invención también se puede usar en combinación con un agente terapéutico existente para el tratamiento de cáncer. Los agentes adecuados que se van a usar en combinación incluyen:

(i) fármacos antiproliferativos/antineoplásicos y combinaciones de los mismos, como se usan en oncología médica, tales como Gleevec (mesilato de imatinib), agentes alquilantes (por ejemplo cis-platino, carboplatino, ciclofosfamida, mostaza nitrogenada, melfalano, clorambucilo, busulfano y nitrosoureas); antimetabolitos (por ejemplo antifolatos,

65 tales como fluoropirimidinas como 5-fluorouracilo y tegafur, raltitrexed, metotrexato, arabinósido de citosina, hidroxiurea, gemcitabina y paclitaxel); antibióticos antitumorales (por ejemplo antraciclinas como adriamicina, bleomicina, doxorubicina, daunomicina, epirubicina, idarubicina, mitomicina-C, dactinomicina y mitramicina); agentes antimitóticos (por ejemplo alcaloides de la vinca como vincristina, vinblastina, vindesina y vinorelbina y taxoides como taxol y taxotero); e inhibidores de topoisomerasa (por ejemplo epipodofillotoxinas como etopósido y tenipósido, amsacrina, topotecano y camptotecinas);

(ii) agentes citostáticos tales como antiestrógenos (por ejemplo, tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, droloxifeno y yodoxifeno), reguladores por disminución del receptor de estrógenos (por ejemplo, Fulvestrant), antiandrógenos (por ejemplo, bicalutamida, flutamida, nilutamida y acetato de ciproxerona), antagonistas de la HLHL o agonistas de la HLHL (por ejemplo, goserelina, leuporelina y buserelina), progestágenos (por ejemplo, acetato de megestrol), inhibidores de aromatasa (por ejemplo como anastrozol, letrozol, vorazol y exemestano) e inhibidores de 5areductasa tales como finasterida;

(iii) agentes que inhiben la invasión de células cancerosas (por ejemplo, inhibidores de metaloproteinasas como

marimastato e inhibidores de la función del receptor activador del plasminógeno de la urocinasa); 15

(iv) inhibidores de la función del factor de crecimiento por ejemplo dichos inhibidores incluyen anticuerpos del factor de crecimiento, anticuerpos del receptor del factor de crecimiento (por ejemplo, el anticuerpo anti-erbB2 trastuzumab y el anticuerpo anti-erbB1 cetuximab [C225]), inhibidores de farnesiltransferasa, inhibidores de tirosina cinasas e inhibidores de serina-treonina cinasas, por ejemplo, inhibidores de la familia de tirosina cinasas del factor de crecimiento epidérmico tales como N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metoxi-6-(3-morfoIinopropoxi)quinazolín-4-amina (gefitinib, AZD1839), N-(3-etinilfenil)-6,7-bis(2-metoxietoxi)quinazolín-4-amina (erlotinib, OSI-774) y 6-acrilamido-N(3-cloro-4-fluorofenil)-7-(3-morfolinopropoxi)quinazolín-4-amina (CI 1033)), por ejemplo inhibidores de la familia del factor de crecimiento derivado de plaquetas y por ejemplo, inhibidores de la familia del factor de crecimiento de hepatocitos;

(v)

agentes antiangiogénicos, tales como los que inhiben los efectos del factor de crecimiento endotelial vascular (por ejemplo el anticuerpo anti-factor de crecimiento endotelial vascular bevacizumab, compuestos, tales como los divulgados en las solicitudes de patente internacional WO 97/22596, WO 97/30035, WO 97/32856 y WO 98/13354, y compuestos que funciones por otros mecanismos (por ejemplo linomida, inhibidores de la función de integrina av 3 y angiostatina);

(vi)

agentes de daño vascular, tales como combretastatina A4 y compuestos divulgados en las solicitudes de patente internacional WO 99/02166, WO 00/40529, WO 00/41669, WO 01/92224, WO 02/04434 y WO 02/08213;

35 (vii) tratamientos antisentido, por ejemplo, los se dirigen a los objetivos mencionados anteriormente, tales como ISIS 2503, un antisentido anti-ras;

(viii) enfoques de tratamiento génico, incluyendo, por ejemplo, enfoques para reemplazar genes anómalos tales como p53 anómalo o BRCA1 o BRCA2 anómalos, GDEPT (tratamiento de enzima-profármaco dirigido por genes), enfoques tales como los que usan citosina desaminasa, timidina cinasa o enzima nitrorreductasa bacteriana y enfoques para aumentar la tolerancia del paciente a la quimioterapia o la radioterapia tales como tratamiento génico de resistencia a multifármaco; y

(ix) enfoques de inmunotratamiento, incluidos, por ejemplo, enfoques ex vivo e in vivo para aumentar la

45 inmunogenicidad de las células tumorales del paciente, tales como transfección con citocinas tales como interleucina 2, interleucina 4 o factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos, enfoques para disminuir la anergia de los linfocitos T, enfoques de uso de células inmunitarias transfectadas tales como células dendríticas transfectadas con citocinas, enfoques de uso de líneas celulares tumorales transfectadas con citocinas y enfoques de uso de anticuerpos antiidiotípicos.

Un miembro de unión de la invención y uno o más de los componentes medicinales adicionales anteriores se pueden usar en la fabricación de un medicamento. El medicamento puede ser para una administración por separado

o combinada para un individuo, y en consecuencia, puede comprender el miembro de unión y el componente adicional como una preparación combinada o como preparaciones por separado. Las preparaciones por separado

55 se pueden usar para facilitar la administración por separado y secuencial o simultánea, y permite la administración de los componentes por diferentes vías, por ejemplo administración oral y parenteral.

De acuerdo con la presente invención, las composiciones proporcionadas se pueden administrar a mamíferos. La administración, normalmente, es en una "cantidad terapéuticamente eficaz", siendo esta suficiente para mostrar beneficio para un paciente. Dicho beneficio puede ser al menos una mejora de al menos un síntoma. La cantidad real administrada, y la tasa y el curso temporal de administración, dependerá de la naturaleza y la gravedad de lo que se está tratando, el mamífero particular que se está tratando, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración de la composición, el tipo de miembro de unión, el método de administración, la planificación de la administración y otros factores conocidos por los médicos. La prescripción del tratamiento, por 65 ejemplo decisiones sobre la dosificación, etc, está dentro de la responsabilidad de los médicos generalistas y otros médicos y puede depender de la gravedad de los síntomas y/o la progresión de una enfermedad que se está tratanto. Las dosis apropiadas de anticuerpo son bien conocidas en la técnica [69, 70]. Se pueden usar dosificaciones específicas indicadas en el presente documento en el vademécum estadounidense (2003) según sea apropiado para el tipo de medicamento que se va a administrar. Una cantidad terapéuticamente eficaz o dosis adecuada de un miembro de unión de la invención se puede determinar comparando su actividad in vitro y su 5 actividad in vivo en un modelo animal. Los métodos de extrapolación de las dosificaciones eficaces en ratones y otros animales de prueba con relación a seres humanos son conocidos. La dosis precisa dependerá de varios factores, incluyendo si el anticuerpo es para diagnóstico, prevención o para tratamiento, el tamaño y la localización del área que se va a tratar, la naturaleza precisa del anticuerpo (por ejemplo anticuerpo completo, fragmento o diacuerpo) y la naturaleza de cualquier marcador detectable u otra molécula unida al anticuerpo. Una dosis de anticuerpo típica estará en el intervalo de 100 μg a 1 g para aplicaciones sistémicas, y de 1 μg a 1 mg para aplicaciones tópicas. Se puede administrar una dosis de carga mayor inicial, seguida de una o más dosis menores. Típicamente, el anticuerpo será un anticuerpo completo, por ejemplo el isotipo IgG1. Esta es una dosis para un tratamiento individual de un paciente adulto, que se puede ajustar de forma proporcional para niños y lactantes, y se puede ajustar también para otros formatos de anticuerpos en proporción al peso molecular. Los tratamientos se

15 pueden repetir en intervalos diario, dos veces por semana, semanal o mensual, según el criterio del médico. Los tratamientos pueden ser cada de dos a cuatro semanas para administración subcutánea y cada de cuatro a ocho semanas para administración intravenosa. El tratamiento puede ser periódico, y el periodo entre administraciones es de aproximadamente dos semanas o más, por ejemplo aproximadamente tres semanas o más, aproximadamente cuatro semanas o más, o aproximadamente una vez al mes. El tratamiento se puede dar antes, y/o después de una intervención quirúrgica, y/o se puede administrar o aplicar directamente en el sitio anatómico del tratamiento quirúrgico.

Ejemplos

25 Ejemplo 1 Aislamiento de anticuerpos para el complejo de IL-6/sIL-6R humana de colecciones de presentación en fagos indiferenciados

Se llevaron a cabo selecciones en solución usando el complejo marcado con FLAG, y se capturaron usando perlas de recubiertas de estreptavidina tratadas con un anticuerpo monoclonal anti-FLAG biotinilado. La formación del complejo IL-6/sIL-6R se realizó sólo con una de las dos proteínas (ligando o receptor) que estaba marcada con FLAG. Por lo tanto, todo el complejo formado se capturaría con la misma orientación sobre perlas paramagnéticas recubiertas anti-FLAG. Para formar el complejo, siempre se le añadió un exceso de 2 veces de proteína no marcada al material marcado, para minimizar la cantidad de proteína marcada no complejada presente en la selección. A continuación, se completaron ciclos de selección posteriores usando la misma proteína marcada con FLAG en todo 35 o bien alternando la proteína que se marcó, que a su vez alternó la orientación en la que se capturó el complejo sobre las perlas. Para minimizar el potencial para el aislamiento de anticuerpos de fago específicos para cada estreptavidina o el anticuerpo monoclonal anti FLAG, en primer lugar se deseleccionaron las colecciones contra las perlas tratadas para retirar dicho fago antes de la adición del complejo. Los ScFv que se podía unir al complejo IL-6/sIL-6R y que inhibe su unión a gp130 se identificaron de las salidas de selección usando un ensayo bioquímico que implicaba la unión de gp130 a IL-6/sIL-6R unido covalentemente por medio de un enlazador (Hiper IL-6). Estos scFv neutralizantes se sometieron a prueba a continuación por ELISA de fagos para determinar la especificidad para el complejo IL-6/sIL-6R. Para determinar la especificidad, se sometieron a prueba las muestras contra los siguientes reactivos marcados con FLAG inmovilizados sobre placas recubiertas de estreptavidina con anticuerpo monoclonal anti-FLAG biotinilado: complejo IL-6, sIL-6R, IL-6/sIL-6R que consistía en ligando marcado con FLAG y receptor no

45 marcado, complejo IL-6/sIL-6R que consistía en ligando no marcado y receptor marcado con FLAG, hiper IL-6, y placas tratadas con anticuerpo anti FLAG solas. Los clones específicos del complejo se definieron como los que se unen a hiper IL-6 y ambas formas del complejo, y no se unieron al ligando o al receptor solo. Los clones específicos del complejo se reformatearon para IgG y se reevaluaron en el ensayo bioquímico de gp130-Hiper-IL-6. También se confirmó la especificidad para el complejo y no los componentes individuales por ELISA y en un ensayo de unión soluble.

Ejemplo 2 Ensayo HTRF® de unión de hiper IL-6/Fc gp130 (preparaciones periplásmicas en bruto)

Se cribaron los resultados de selección de un ensayo de unión de hiper IL-6/gp130 Fc HTRF® (fluorescencia de

55 resolución temporal homogénea) para la inhibición de la unión de hiper IL-6 marcada con FLAG HIS (expresado de forma interna HEK-EBNA) para un FC de gp130 humano recombinante (R&D systems 671-GP). El método detallado se proporciona en la sección de Materiales y métodos.

Ejemplo 3 Ensayo HTRF® de unión de hiper IL-6/Fc GP130 (preparaciones de scFv purificado)

Los ScFv que demostraron un efecto inhibidor significativo como preparaciones en bruto se secuenciaron y se produjeron como preparaciones purificadas. Se sometieron a prueba estas muestras en un ensayo HTRF® para determinar la inhibición de la unión de hiper IL-6 marcada con FLAG HIS a Fc de gp130 recombinante humano. Se usó una valoración de las concentraciones de scFv con el fin de establecer la potencia de los clones medida 65 mediante valores de CI50 en el ensayo. El método detallado se proporciona en Materiales y métodos. Las potencias de las valoraciones de scFv purificado en el ensayo HTRF® de unión de hiper IL-6/Fc GP130 se dan en la tabla 2

con los datos de IgG correspondientes. Ejemplo 4 Cribado ELISA en fagos para identificar el scFv específico de complejo Se realizó un cribado ELISA en fagos como se describe en Materiales y métodos. El ELISA para clones específicos

de complejo se muestra en la tabla 1. Tabla 1: Datos de ELISA en fagos para la identificación de clones específicos de complejo IL-6/sIL-6R del panel de scFv identificado a partir de los resultados de selección usando el ensayo de unión gp130-hiper-IL-6

Clon

Absorbancia (450 nM)

FLAG-IL-6

FLAG-sIL-6R Complejo 1 Complejo 2 HIPER-IL-6 Anti-FLAG

Anticuerpo 1

0,061 0,059 0,508 0,952 1,087 0,052

Anticuerpo 2

0,074 0,083 0,823 0,992 1,023 0,052

Anticuerpo 3

0,063 0,056 0,738 0,972 1,079 0,049

Anticuerpo 4

0,062 0,167 0,781 0,991 1,052 0,053

Anticuerpo 5

0,065 0,061 0,331 0,747 0,833 0,062

10 Complejo 1: HIS FLAG IL-6/sIL-6R Complejo 2: IL-6/HIS FLAG sIL-6R

Ejemplo 5 Reformateado de scFv para IgG1

15 Se convirtieron los clones de scFv al formato IgG por subclonación de los dominios VH y VL en vectores que expresan las cadenas pesada y ligera de anticuerpo completo, respectivamente. Se clonó el dominio VH en un vector (pEU15,1) que contenía los dominios constantes de cadena pesada humanos y elementos reguladores para expresar la cadena pesada de IgG completa en células de mamífero. De forma similar, se clonó el dominio VL en un vector (pEU4,4) para la expresión de los dominios constantes de cadena ligera humanos (lambda) y elementos

20 reguladores para expresar la cadena ligera de IgG completa en células de mamífero. Los vectores para la expresión de cadenas pesadas y cadenas ligeras se describieron originalmente en la ref. [71]. Los vectores de tecnología de anticuerpos de Cambridge se han modificado se forma sencilla introduciendo un elemento OriP. Para obtener IgG, los vectores de expresión de IgG de cadena ligera y pesada se transfectaron en células de mamífero EBNA-HEK293. Las IgG se expresaron y segregaron en el medio. Los cultivos se agruparon y se filtraron antes de la

25 purificación. Se purificó la IgG usando cromatografía de Protein A. Se cargan los sobrenadantes de cultivo en una columna de tamaño apropiado de Ceramic Protein A (BioSepra) y se lava con Tris-HCl 50 mM pH 8,0, NaCl 250 mM. Se eluyó IgG unida de la columna usando citrato de sodio 0,1 M (pH 3,0) y se neutralizó por la adición de Tris-HCl (pH 9,0). El material eluido se intercambió con tampón en PBS usando columnas Nap10 (Amersham, n.º 17-085402) y se determinó la concentración de IgG espectrofotométricamente usando un coeficiente de extinción basado en

30 la secuencia de aminoácidos de la IgG [72]. Las IgG purificadas se analizaron para determinar la agregación o degradación usando SEC-HPLC y por SDS-PAGE.

Ejemplo 6 Ensayo HTRF® de unión de hiper IL-6/Fc GP130 biotinilado

35 Las IgG purificadas de clones positivos identificados del cribado de scFv periplásmico en bruto y scFv purificado se sometieron a prueba en un ensayo HTRF® para determinar la inhibición de la unión de hiper IL-6 marcada con FLAG HIS a Fc gp130 recombinantes humano. Este ensayo se realizó como para el scFv purificado (ejemplo 3) con las siguientes modificaciones. Se usó Fc gp130 recombinantes humano biotinilado 6 nM (10 μl/pocillo) para dar una concentración final de 1 nM de Fc gp130. Para la detección de la unión, se usaron reactivos HTRF® combinados

40 con IgG anti-flag 2,598 nM marcado con criptato y 10,8 nM o 12 nM de estreptavidina XLent! (CIS Bio International 611SAXLB) (10 μl/pocillo).

Se incluyeron como controles en todos los ensayos una IgG contra un antígeno no pertinente y anticuerpo monoclonal anti-IL-6 (R&D systems MAB206). Los valores de % de deltaF, % de unión específica y CI50 se

45 calcularon como se describe previamente. Los valores de CI50 para los clones específicos de complejo se dan en la tabla 2.

Tabla 2: Datos de potencia para scFv purificado e IgG en el ensayo de unión gp130-hiper-IL-6 *Cuando se obtuvieron curvas incompletas, el resultado se da como el % de inhibición máximo observado en la concentración de competidor más alta usada.

Clon

Inhibición máx. (%)/CI50 (nM)

scFv

IgG

Anticuerpo 1

máximo 42% 654,6

Anticuerpo 2

máximo 58% 1,1

Anticuerpo 3

máximo 66% 20,8

Anticuerpo 4

máximo 36% 26,7

Anticuerpo 5

máximo 83% 0,7

Ejemplo 7 Prueba de especificidad de IgG anti-complejo usando un ensayo soluble HTRF®

5 Las IgG purificadas de clones positivos identificados del cribado de scFv periplásmico en bruto y scFv purificado se sometieron a prueba en un ensayo HTRF® para determinar la unión de la unión de hiper IL-6 marcada con FLAG HIS, IL-6 marcada con FLAG HIS y sIL-6R marcada con FLAG HIS.

10 Los datos del ejemplo para la unión de IgG de clones positivos se identificaron del cribado de scFv periplásmico en bruto. Los datos mostrados en la tabla 3 se expresan como % de delta F a una concentración de IgG de 1 nM (concentración de ensayo final) y 20 nM de proteína HIS FLAG (concentración de ensayo final).

Tabla 3: Unión del IgG específica de complejo a IL-6, sIL-6R y hiper IL-6 en un ensayo soluble HTRF®

Clon

Hiper IL-6 HIS FLAG Ligando IL-6 HIS FLAG Receptor IL-6 soluble HIS FLAG Ligando irrelevante HIS FLAG Receptor irrelevante HIS FLAG

Anticuerpo 1

329 4 4 8 11

Anticuerpo 2

316 2 10 11 5

Anticuerpo 3

290 4 6 10 11

Anticuerpo 4

273 1 18 13 7

Anticuerpo 5

331 4 9 1 3

15 Ejemplo 8 Prueba de especificidad de IgG anti-complejo por ELISA

Se sometieron a prueba las IgG para determinar la unión específica al complejo usando ELISA como se describe en la sección de Materiales y métodos.

20 Tabla 4: Datos de ELISA de especificidad de IgG para el complejo IL-6/sIL-6R complejo cuando se incubó con 50 nM de proteína

Clon

Cuentas de europio

Ligando

Receptor Complejo 1 Complejo 2 HIPER No pertinente

Anticuerpo 1

2620 1344 18722 68049 161823 1364

Anticuerpo 2

2647 2448 154957 450867 344773 1831

Anticuerpo 3

2090 1421 17297 40928 96027 1745

Anticuerpo 4

2054 2000 97315 387428 310693 1602

Anticuerpo 5

1726 1504 119647 417485 382951 1681

Materiales y métodos 25

Reactivos clave

-

Se obtuvo la IL-6 de R&D Systems (206-IL/CF) 30 - Se obtuvo el receptor IL-6 soluble (sIL-6R) de Peprotech (200-06R)

- Se proporcionó la IL-6 HIS FLAG por AstraZeneca (derivada de E.coli)

-

Se preparó sIL-6R HIS FLAG de forma interna en Cambridge Antibody Technology (derivado de HEK-EBNA) 35

-

Se proporcionó hiper-IL-6 (IL-6 unida covalentemente y sIL-R por medio de un enlazador) por AstraZeneca (derivado de HEK-EBNA)

-

Se obtuvo gp130-Fc recombinante de R&D systems (671-GP). Se produjo gp130-Fc a partir de una secuencia de

ADN que codifica el dominio extracelular de la secuencia de gp130 humana (Hibi et al; Cell 63:1149-1157) condensada con la región de Fc marcada con histidina 6X carboxi-terminal de IgG1 humana por medio de un enlazador polipeptídico. Se expresó la proteína quimérica en una línea celular de mieloma de ratón NS0.

Aislamiento de anticuerpos para el complejo IL-6/slL-6R humana de colecciones de presentación en fagos indiferenciados

Se usaron colecciones de presentación en fagos de Fv monocatenario humano indiferenciado Fv (scFv) clonadas en un vector de fagémido en el M13 de fago filamentoso para las selecciones [73, 74]. Para cada selección, se capturaron 500 μl de perlas paramagnéticas recubiertas con estreptavidina (Dynal M280, 602,10) sobre un imán, después se resuspendieron en 500 μl de anticuerpo monoclonal anti-FLAG biotinilado 50 μg/ml (Sigma F9291) en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS) pH 7,4 durante 1 h para recubrir las perlas. Se lavaron 3 veces las perlas en PBS que contenía Tween 20 al 0,05% (PBST) después se incubó en 500 μl de polvo de leche desnatada al 3% (p/v) (Premier Brands) en PBS (MPBS) durante 1 h para bloquear cualquier sitios de unión no específico.

Se diluyó una alícuota de la colección de 50 μl que contenía aproximadamente 1x1012 partículas de fago hasta 400 μl y se usó para volver a suspender las perlas recubiertas con anti-FLAG recuperadas de 150 μl de la solución de bloqueo. A continuación, se incubaron los fagos con las perlas en un rotor durante 1 h. Además, para algunos de los procedimientos de selección, la deselección contra un exceso de 10 veces de la proteína no marcada usando para formar el complejo se incorporó junto con la etapa de deselección contra las perlas paramagnéticas tratadas. A continuación, se retiraron las perlas por captura en un imán. Se añadió un volumen de 100 μl de una solución de reserva de complejo concentrada 5 veces (proteína marcada con FLAG 500 nM y proteína no marcada 1 pM) a la colección deseleccionada y se incubó durante 2 h. Se capturaron los fagos unidos al complejo marcado con FLAG incubando con los 350 μl restantes de las perlas paramagnéticas tratadas durante 15 min en un rotor. Se lavaron las perlas 5 veces en 0,9 ml de PBST para retirar las partículas de fago no unidas. A continuación, se eluyeron los fagos unidos de las perlas por incubación en 500 μl de tripsina 10 μg/ml en fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,0 durante 30 min a 37 OC. La infección de células TG-1 de E. coli con el fago eluido y el rescate de fagos para ciclos de selección posteriores se realizó esencialmente como se describe por Marks et al 1991 [75] usando fago colaborador de escisión de tripsina [76].

Ensayo HTRF® de unión de hiper IL-6/Fc gp130 (preparaciones periplásmicas en bruto)

Ensayo de unión de hiper IL-6/gp130 Fc HTRF® (fluorescencia de resolución temporal homogénea) para la inhibición de la unión de hiper IL-6 marcada con FLAG HIS (expresado de forma interna HEK-EBNA) para un FC de gp130 humano recombinante (R&D systems 671-GP).

Se cribaron los resultados de selección como extractos periplásmicos que contenían scFv en bruto no diluido preparados en tampón MOPS 50 mM pH 7,4, EDTA 0,5 mM y sorbitol 0,5 M. Se añadieron 10 μl de muestra de scFv en bruto a una placa de ensayo Optiplate de 384 pocillos negra Perkin Elmer 6007279). Esto se siguió por adición de Fc gp130 4 nM (10 μl/pocillo), hiper IL-6 4 nM (10 μl/pocillo) y reactivos HTRF combinados IgG anti-flag 1,732 nM marcada con criptato (CIS Bio International 61FG2KLB) y anticuerpos anti-Fc humano 20 nM marcado con XL665 (CIS Bio International 61HFCXLA). Se realizaron todas las diluciones en PBS que contenía fluoruro de potasio 0,4 M y BSA al 0,1% (tampón de ensayo). Se incubaron las placas durante 3 h a temperatura ambiente, antes de la lectura de la fluorescencia de resolución temporal a longitudes de onda de emisión de 620 nm y 665 nm usando un lector de placas EnVision (Perkin Elmer). Se analizaron los datos calculando el % de delta F y % de unión específica como se describe en la ecuación 1 y la ecuación 2.

Ecuación 1:

(valor de proporción muestra 665nM / 620nM) -(valor de proporción control no específico 665nM/620nM)

% Delta F =

(valor de proporción control no específico 665nM/620nM) X 100

Ecuación 2:

% unión específica =

% Delta F de muestra X 100

% Delta F de control de unión total

Ensayo HTRF® de unión de hiper IL-6/Fc GP130 (preparaciones de scFv purificado)

Ensayo HTRF® para determinar la inhibición de la unión de hiper IL-6 marcada con FLAG HIS a Fc de gp130 recombinante humano.

Se diluyeron scFv purificados 1:3 transfiriendo 15 μl de scFv purificado a 30 μl de tampón de ensayo y mezclando por pipeteo en una placa de 96 pocillos (Greiner 650201). Se llevaron a cabo diluciones secuencialmente por

duplicado 9 veces más. Se añadieron Fc GP130 3 nM (10 μl/pocillo ) para dar una concentración final de 0,5nM, hiper IL-6 6 nM (10 μl/pocillo) para dar una concentración final de 1nM y reactivos HTRF combinados de IgG anti-flag 2,598 nM marcada con criptato y anticuerpo anti-Fc humano 30 nM marcado con XL665 (10 μl/pocillo) a 30 μl de valoración de scFv purificado en una placa de 96 pocillos. A continuación se transfirieron 40 μl a una Optiplate de

5 384 pocillos negra. Todas las diluciones se realizaron en un tampón de ensayo. Como control positivo, para la inhibición de la unión, en todos los ensayos se incluyó el complejo de ligando IL-6 humano/receptor IL-6 soluble, (IL6 500 nM y sIL-6 R500 nM).

Se incubaron las placas durante 3 h a temperatura ambiente, antes de la lectura de la fluorescencia de resolución

10 temporal a longitudes de onda de emisión de 620 nm y 665 nm usando un lector de placas EnVision. Se analizaron los datos calculando el % de delta F y % de unión específica como se describe en la ecuación 1 y la ecuación 2. Se determinaron los valores CI50 usando el programa informático GraphPad Prism por ajuste de curvas usando una ecuación logística de cuatro parámetros (ecuación 3).

15 Ecuación 3:

Y= Inferior + (Superior - Inferior) / (1+10*((LogCE50-X)*ladera))

X es el logaritmo de la concentración. Y es la unión específica

Y comienza en la parte inferior y va hasta la parte superior con una forma sigmoide. 20

Cribado ELISA en fagos para identificar el scFv específico de complejo

La producción de fagos de cultivos individuales en volúmenes de 400 μl se realizó esencialmente como se describe por Marks et al 1991 [75]. Los cultivos de fagos durante la noche se bloquearon por adición de 400 μl de MPBS y se

25 incubaron durante 1 h. Los cultivos se centrifugaron en una centrífuga de Sorval RT6000D Benchtop a 3000 rpm durante 10 min. A continuación se retiraron los sobrenadantes para la prueba.

Se trató un número suficiente de placas de inmunoensayo recubiertas con estreptavidina (Abgene AB1226) con 50 μl/pocillo de anticuerpo monoclonal anti FLAG biotinilado 1 μg/ml en PBS y se incubó durante la noche (ca.16 h) a 30 4°C. A continuación, las placas de inmunoensayo se lavaron 3 veces con PBST. A continuación, todos los pocillos se bloquearon por adición de 300 μl de MPBS y se incubó durante 1 h. Cada placa se lavó como se describe previamente, después se trató con 50 μl/pocillo de uno de los siguientes reactivos de prueba; 0,5 μg/ml de IL-6 HIS FLAG, 1 μg/ml de sIL-6R marcado con HIS FLAG, 1,5 μg/ml de complejo de IL-6 que consiste en IL-6 HIS FLAG (0,5 μg/ml) y sIL-6R (1 μg/ml), 1,5 μg/ml de complejo de IL-6 que consiste en sIL-6R HIS FLAG (1 μg/ml) y IL-6 (0,5 35 μg/ml), 1,5 μg/ml de hiper IL-6, o MPBS. Se formaron complejos preincubando los reactivos juntos durante 10 min antes de la adición a las placas. A continuación, se incubaron las placas durante 1 h. Después de una etapa de lavado adicional, se añadieron 50 μl de cada sobrenadante de cultivo bloqueado a cada una de las placas tratadas de forma diferente y se incubó durante 1 h. Las placas se lavaron de nuevo antes de añadir 50 μl de anti M13 conjugado con peroxidasa de rábano picante (Amersham 27-9421-01) diluido 1 en 5000 en MPBS a todos los

40 pocillos y se incubó durante una hora adicional. Después de la etapa de lavado final, se añadieron 50 μl de 3,3,5,5,tetrametilbenzidina (Sigma T0440) a todos los pocillos y se incubó durante aproximadamente 3 min. A continuación, las reacciones en todos los pocillos se detuvieron por la adición de 50 μl de H2SO4 0,5 M, y se determinaron las densidades ópticas a 450 nm usando un lector de placas EnVision.

45 Prueba de especificidad de IgG anti-complejo usando un ensayo soluble HTRF®

Se usó una valoración de hiper IL-6 FLAG HIS, IL-6 FLAG HIS y sIL-6R FLAG HIS para establecer si la IgG se unió a cada una de estas proteínas. Se realizaron las valoraciones en tampón de ensayo (diluciones 1:3) de 160 nM. Se incluyeron ligando FLAG HIS no pertinente y receptor FLAG HIS como controles.

50 Se transfirieron 5 μl de cada valoración a una placa de ensayo de volumen bajo de 384 pocillos (Costar 3676). A continuación se añadió IgG 4 nM preparada de forma interna (5 μl/pocillo), seguido de 3,2 nM de IgG anti-flag marcada con XL665 (CIS Bio 61FG2XLB) y anticuerpo de anti-Fc humano 60nM marcado con criptato de europio (CIS Bio 61HFCKLB) (5 μl/pocillo). Todas las diluciones se realizaron en un tampón de ensayo.

55 A continuación se centrifugaron las placas de ensayo a 1000 rpm a temperatura ambiente durante 1 min y se incubaron durante 3 h a temperatura ambiente, antes de la lectura de la fluorescencia de resolución temporal a longitudes de onda de emisión de 620 nm y 665 nm usando un lector de placas EnVision.

60 Los datos se analizaron calculando los valores de % de Delta F para cada muestra como se describe previamente.

Prueba de especificidad de IgG anti-complejo por ELISA

Para cada anticuerpo sometido a prueba, se recubrieron placas de inmunoensayo de 96 pocillos (Nunc Maxisorp) con 50 μl/pocillo de 2 μg/ml de anticuerpo monoclonal anti-Fc humano (Jackson inmunoresearch 109-005-098) en PBS durante la noche (ca.16h) a 4°C. Se lavaron las placas de inmunoensayo 3 veces usando PBST, después se bloquearon por adición de 300 μl/pocillo MPBS durante 1 h a temperatura ambiente. Después de una segunda etapa 5 de lavado, se añadieron 2 μg/ml del anticuerpo anti-complejo en PBS a la placa a 50 μl/pocillo. Las placas se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente antes de volver a lavarse como se describe previamente. Los reactivos marcados con FLAG (complejos IL-6, sIL-6R, hiper) se diluyeron hasta 50 nM en MPBS. Los complejos se prepararon usando 50 nM del componente marcado con FLAG y un exceso molar de 2 veces del componente no marcado. Se prepararon diluciones en serie de 4 veces de cada uno de los reactivos, que a continuación se 10 añadieron a los pocillos duplicados de las placas de inmunoensayo a 50 μl/pocillo. También se prepararon los pocillos de control que contenían proteína no pertinente 50 nM (en este caso GMCSF-R murina marcada con FLAG),

o MPBS solo. A continuación se incubaron las placas de inmunoensayo durante 1 h a temperatura ambiente. Después de una etapa de lavado adicional, se añadió anticuerpo monoclonal anti-FLAG biotinilado (Sigma) diluido hasta μg/ml en MPBS a todos los pocillos a 50 μl/pocillo. Se incubaron las placas durante 1 h a temperatura 15 ambiente antes de que se volvieran a lavar las placas como antes. Se diluyó estreptavidina marcada con europio (Perkin Elmer 1244-360) hasta 100 ng/ml en tampón de ensayo Delfia (Perkin Elmer 4002-0010), se añadió a todos los pocillos a 50μl/pocillo y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, las placas de inmunoensayo se lavaron 7 veces en tampón de lavado Delfia, que consistía en solución salina tamponada con Tris 0,05 M (NaCl - 0,138 M, KCl - 0,0027 M) Tween 20 (0,05%), pH 8,0 (a 25°C). A continuación, se añadió un volumen

20 de 50 μl solución potenciada de Delfia (Perkin Elmer 4001-0010) a todos los pocillos. Se incubaron las placas durante 10 min antes de que se midiera la fluorescencia de resolución temporal a 620 nm usando un lector de placas EnVision.

Secuencias

25 Las secuencias de miembros de unión de la invención se muestran en el listado de secuencias adjunto, en el que los SEQ ID NOS corresponden como sigue:

PRT = secuencia de aminoácidos

1

Anticuerpo 1 VH nucleótido

2

Anticuerpo 1 VH aminoácido

3

Anticuerpo 1 VH CDR 1 aa

4

Anticuerpo 1 VH CDR 2 aa

5

Anticuerpo 1 VH CDR 3 aa

6

Anticuerpo 1 VL nucleótido

7

Anticuerpo 1 VL aminoácido

8

Anticuerpo 1 VL CDR 1 aa

9

Anticuerpo 1 VL CDR 2 aa

10

Anticuerpo 1 VL CDR 3 aa

11

Anticuerpo 2 VH nucleótido

12

Ab 2 VH aminoácido

13

Ab 2 VH CDR 1 aminoácido

14

Ab 2 VH CDR 2 aminoácido

15

Ab 2 VH CDR 3 aminoácido

16

Ab 2 VL nucleótido

17

Ab 2 VL aminoácido

18

Ab 2 VL CDR 1 aminoácido

19

Ab 2 VL CDR 2 aminoácido

20

Ab 2 VL CDR 3 aminoácido

21

Anticuerpo 3 VH nucleótido

22

Ab 3 VH aminoácido

23

Ab 3 VH CDR 1 aminoácido

24

Ab 3 VH CDR 2 aminoácido

25

Ab 3 VH CDR 3 aminoácido

26

Ab 3 VL nucleótido

27

Ab 3 VL aminoácido

28

Ab 3 VL CDR 1 aminoácido

29

Ab 3 VL CDR 2 aminoácido

30

Ab 3 VL CDR 3 aminoácido

31

Anticuerpo 4 VH nucleótido

32

Ab 4 VH aminoácido

33

Ab 4 VH CDR 1 aminoácido

34

Ab 4 VH CDR 2 aminoácido

35

Ab 4 VH CDR 3 aminoácido

36

Ab 4 VL nucleótido

37

Ab 4 VL aminoácido

38

Ab 4 VL CDR 1 aminoácido

39

Ab 4 VL CDR 2 aminoácido

40

Ab 4 VL CDR 3 aminoácido

41

Anticuerpo 5 VH nucleótido

42

Ab 5 VH aminoácido

43

Ab 5 VH CDR 1 aminoácido

44

Ab 5 VH CDR 2 aminoácido

45

Ab 5 VH CDR 3 aminoácido

46

Ab 5 VL nucleótido

47

Ab 5 VL aminoácido

48

Ab 5 VL CDR 1 aminoácido

49

Ab 5 VL CDR 2 aminoácido

50

Ab 5 VL CDR 3 aminoácido

51

aminoácido IL-6 humana longitud completa

52

IL-6 humana marcada HIS FLAG

53

IL-6Ra soluble (humana)

54

IL-6Ra soluble marcada FLAG HIS

55

Hiper IL-6

56

Hiper IL-6 marcada FLAG HIS

57

IL-6Ra transmembrana longitud completa (humana)

58

Aminoácido gp130 humana

59

Aminoácido IL-6 humana madura

Referencias

1 Haan y Maggos (2004) BioCentury, 12(5): A1-A6 2 Koide et al. (1998) Journal of Molecular Biology, 284: 1141-1151.

3 Nygren et al. (1997) Current Opinion in Structural Biology, 7: 463-469 4 Wess, L. In: BioCentury, The Bernstein Report on BioBusiness, 12(42), A1-A7, 2004 5 5 Kabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4ªEdición. US Department of Health and Human Services. 1987 6 Martin, A.C.R. Accessing the Kabat Antibody Sequence Database by Computer PROTEINS: Structure, Function 10 and Genetics, 25 (1996), 130-133 7 Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª edición. US Department of Health and Human Services, Public Service, NIH, Washington 15 8 Segal et al., PNAS, 71:4298-4302, 1974 9 Amit et al., Science, 233:747-753, 1986 10 Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901-917, 1987 20 11 Chothia et al., Nature, 342:877- 883, 1989 12 Caton et al., J. Immunol., 144:1965-1968, 1990 25 13 Sharon et al., PNAS, 87:4814-4817, 1990 14 Sharon et al.; J. Immunol., 144:4863-4869, 1990 15 Kabat et al., J. Immunol., 147:1709-1719, 1991 30 16 Holliger y Hudson, Nature Biotechnology 23(9):1126-1136 2005 17 Kontermann, R y Dubel, S, Antibody Engineering, Springer-Verlag New York, LLC; 2001, ISBN: 3540413545 35 18 Mendez, M. et al. (1997) Nature Genet, 15(2): 146-156 19 Knappik et al. J. Mol. Biol. (2000) 296, 57-86 20 Krebs et al. Journal of Immunological Methods 254 2001 67-84 40 21 Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989) 22 McCafferty et al (1990) Nature, 348, 552-554 45 23 Holt et al (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490 24 Bird et al, Science, 242, 423-426, 1988 25 Huston et al, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988 50 26 Holliger, P. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993 27 Reiter, Y. et al, Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996 55 28 Hu, S. et al, Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996 29 Qui et al., Nat. Biotechnol. 25:921-929 2007 30 Holliger y Bohlen 1999 Cancer and metastasis rev. 18: 411-419 60 31 Holliger, P. y Winter G. Current Opinion Biotechnol 4, 446-949 1993 32 Glennie M J et al., 1987 J. Immunol. 139, 2367-2375 65 33 Repp R. et al., 1995 J. Hemat. 377-382

34 Staerz U. D. y Bevan M. J. 1986 PNAS 83

35 Suresh M. R. et al., 1986 Method Enzymol. 121: 210-228

5 36 Merchand et al., 1998 Nature Biotech. 16:677-681

37 Ridgeway, J. B. B. et al, Protein Eng., 9, 616-621, 1996

38 Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y., p.

726, 1988 39 Köhler and Milstein, Nature, 256:495-497, 1975 40 Wold, et al. Multivariate data analysis in chemistry. Chemometrics -Mathematics and Statistics in Chemistry (Ed.:

15 B. Kowalski), D. Reidel Publishing Company, Dordrecht, Holland, 1984 (ISBN 90-277-1846-6)

41 Norman et al. Applied Regression Analysis. Wiley-Interscience; 3rd edition (abril 1998) ISBN: 0471170828

42 Kandel, Abraham & Backer, Eric. Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis. Prentice Hall PTR, (mayo 11,

1995), ISBN: 0133418847 43 Krzanowski, Wojtek. Principles of Multivariate Analysis: A User's Perspective (Oxford Statistical Science Series, N.º 22 (Paper)). Oxford University Press; (diciembre 2000), ISBN: 0198507089

25 44 Witten, Ian H. & Frank, Eibe. Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java

Implementations. Morgan Kaufmann; (11 de octubre de 1999), ISBN: 1558605525

45 Denison David G. T. (Editor), Christopher C. Holmes, Bani K. Mallick, Adrian F. M. Smith. Bayesian Methods for

Nonlinear Classification and Regression (Wiley Series in Probability and Statistics). John Wiley & Sons; (julio 2002),

ISBN: 0471490369 46 Ghose, Arup K. y Viswanadhan, Vellarkad N.. Combinatorial Library Design and Evaluation Principles, Software, Tools, and Applications in Drug Discovery. ISBN: 0-8247-0487-8

35 47 Chothia C. et al. Journal Molecular Biology (1992) 227, 799-817

48 Al-Lazikani, et al. Journal Molecular Biology (1997) 273(4), 927-948

49 Chothia, et al. Science, 223,755-758 (1986)

50 Whitelegg, N.R.u. y Rees, A.R (2000). Prot. Eng., 12, 815-824

51 Guex, N. y Peitsch, M.C. Electrophoresis (1997) 18, 2714-2723 45 52 Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 405-410

53 Pearson y Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448

54 Smith y Waterman (1981) J. Mol Biol. 147: 195-197

55 Voet & Voet, Biochemistry, 2nd Edition, (Wiley) 1995.

56 Gram et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:3576-3580 55 57 Barbas et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:3809-3813

58 Schier et al., 1996, J. Mol. Biol. 263:551-567

59 Marks et al Bio/Technology, 1992, 10:779-783

60 Kay, B.K., Winter, J., y McCafferty, J. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, San

Diego: Academic Press

61 Hunter W. M. y Greenwood F. C. (1962) Nature 194:495 65

62 Pluckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991)

63 Chadd HE y Chamow SM (2001) Current Opinion in Biotechnology 12: 188-194

64 Andersen DC y Krummen L (2002) Current Opinion in Biotechnology 13: 117 5 65 Larrick JW y Thomas DW (2001) Current Opinion in Biotechnology 12:411-418

66 Sambrook y Russell, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3ª edición, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press

10 67 Ausubel et al. eds., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 4ª edición 1999

68 Robinson, J. R. ed., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., New York, 15 1978

69 Ledermann J.A. et al. (1991) Int. J. Cancer 47: 659-664

70 Bagshawe K.D. et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922 20 71 Persic, L., et al. (1997) Gene 187, 9-18.

72 Mach et al Anal. Biochem. 200(1): 20-26, 1992

25 73 Vaughan, T. J., et al. (1996). Nature Biotechnology 14, 309-314.

74 Hutchings, C. Generation of Naive Human Antibody Libraries, in Antibody Engineering, R. Kontermann and S. Dubel, Editors. 2001, Springer Laboratory Manuals, Berlin. p. 93

30 75 Marks, J. D., et al. (1991). Journal of Molecular Biology 222, 581-597.

76 Kristensen, P., Winter G. (1998). Folding and Design 3 (5), 321-328.

Listado de secuencias

<110> AstraZeneca AB MedImmune Limited

<120> Compuestos

<130> 102484-1 CAT081 Complejo IL-6

<150> US60/861,705 40 <151> 30/11/2006

<160> 59

<170> CAT versión 1.0

<210> 1

<211> 357 45 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticuerpo 1

<400> 1

<210> 2

<211> 119

<212> PRT

<213> Homo sapiens 55 <220>

<223> Anticuerpo 1

<400> 2 <210> 3

<211> 5 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticuerpo 1

<400> 3 10 Ser Tyr Ala Met Ser 5

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15 <220>

<223> Anticuerpo 1

<400> 4

<210> 5 20 <211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticuerpo 1 25 <400> 5

<210> 6

<211> 327

<212> ADN 30 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticuerpo 1

<400> 6

35 <210> 7

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticuerpo 1

<400> 7

<210> 8

<211> 11

<212> PRT 10 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticuerpo 1

<400> 8

15 <210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 20 <223> Anticuerpo 1

<400> 9

<210> 10

<211> 11 25 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticuerpo 1

<400> 10

<210> 11

<211> 366

<212> ADN

<213>

Homo sapiens 35 <220>

<223> Anticuerpo 2

<400> 11

<210> 12

<211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticuerpo 2

<400> 12

<210> 13

<211> 5

<212> PRT

<213>

Homo sapiens 15 <220>

<223> Anticuerpo 2

<400> 13

<210> 14 20 <211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticuerpo 2 25 <400> 14

<210> 15

<211> 13

<212> PRT 30 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticuerpo 2

<400> 15

<210> 16

<211> 342

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticuerpo 2

<400> 16

<210> 17 10 <211> 114

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticuerpo 2 15 <400> 17

<210> 18

<211> 14

<212> PRT 20 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticuerpo 2

<400> 18

25 <210> 19

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 30 <223> Anticuerpo 2

<400> 19

<210> 20

<211> 13 35 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticuerpo 2

<400> 20

<210> 21 5 <211> 366

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticuerpo 3 10 <400> 21

<210> 22

<211> 122

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticuerpo 3

<400> 22

20 <210> 23

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 25 <223> Anticuerpo 3

<400> 23 Ser Tyr Ala Met Ser 5

<210> 24

<211> 17 30 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticuerpo 3

<400> 24

<210> 25

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticuerpo 3

<400> 25

10 <210> 26

<211> 336

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Anticuerpo 3

<400> 26

<210> 27

<211> 112 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticuerpo 3

<400> 27

<210> 28

<211> 14

<212> PRT 30 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticuerpo 3

<400> 28

35 <210> 29

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticuerpo 3

<400> 29

<210> 30 5 <211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticuerpo 3 10 <400> 30

<210> 31

<211> 357

<212> ADN 15 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticuerpo 4

<400> 31

<210> 32

<211> 119

<212> PRT

<213> Homo sapiens 25 <220>

<223> Anticuerpo 4

<400> 32

<210> 33 30 <211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticuerpo 4 35 <400> 33

<210> 34

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticuerpo 4

<400> 34

<210> 35

<211> 10

<212> PRT 10 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticuerpo 4

<400> 35

15 <210> 36

<211> 339

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220> 20 <223> Anticuerpo 4

<400> 36

<210> 37

<211> 113 25 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticuerpo 4

<400> 37

<210> 38

<211> 14

<212> PRT 35 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticuerpo 4

<210> 39

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticuerpo 4

<400> 39

<210> 40

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15 <220>

<223> Anticuerpo 4

<400> 40

<210> 41 20 <211> 366

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticuerpo 5 25 <400> 41

<210> 42

<211> 122

<212> PRT 30 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticuerpo 5

<400> 42

<210> 43

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticuerpo 5

<210> 44 10 <211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticuerpo 5 15 <400> 44

<210> 45

<211> 13

<212> PRT 20 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticuerpo 5

<400> 45

25 <210> 46

<211> 336

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220> 30 <223> Anticuerpo 5

<400> 46

<210> 47

<211> 112 35 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticuerpo 5

<400> 47

<210> 48

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticuerpo 5

<400> 48

10 <210> 49

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15 <223> Anticuerpo 5

<400> 49

<210> 50

<211> 11 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Anticuerpo 5

<400> 50

<210> 51

<211> 212

<212> PRT

<213> Homo sapiens 30 <220>

<223> IL-6 humana longitud completa

<400> 51

<210> 52

<211> 203

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> IL-6 humana marcada HIS FLAG

<400> 52

<210> 53

<211> 358

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> IL-6Ra soluble

<400> 53

<210> 54

<211> 395

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> sIL-6Ra marcada FLAG HIS

<400> 54

<210> 55

<211> 561

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Hiper IL-6

<400> 55

<210> 56

<211> 598

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Hiper IL-6 marcada FLAG HIS

<400> 56

<210> 57

<211> 468

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> IL-6Ra transmembrana longitud completa

<400> 57

<210> 58

<211> 918

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> gp130 humano

<400> 58

<210> 59

<211> 183

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> IL-6 madura

<400> 59

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo aislado, que se une al complejo IL-6 : IL-6Ra formado por la IL-6 y el IL-6Ra, y que no se une ni a IL-6 ni a IL- 6Ra solos y que inhibe la unión del complejo IL-6:IL-6Ra a gp130, en el que el anticuerpo comprende un dominio VH de anticuerpo y un dominio VL de anticuerpo, en el que la molécula de anticuerpo comprende un conjunto de CDR, en el que el dominio VH comprende HCDR1, HCDR2, HCDR3 y una región estructural y el dominio VL comprende LCDR1, LCDR2, LCDR3 y una región estructural, en el que el conjunto de CDR se selecciona del grupo que consiste en:

   a.

   HCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 , HCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4, HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5, LCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8, LCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9 y LCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 10;

   b.

   HCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13, HCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 14, HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15, LCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18, LCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 19 y LCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20;

   c.

   HCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 23, HCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 24, HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25, LCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 28, LCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 29 y LCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 30;

   d.

   HCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 33, HCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 34, HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 35, LCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 38, LCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 39 y LCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 40; y

   e.

   HCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 43, HCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 44, HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 45, LCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 48, LCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 49 y LCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 50.

2. 2. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la molécula de anticuerpo comprende:

   un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 y un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7; o

   un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 12 y un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 17; o

   un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 22 y un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 27; o

   un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 32 y un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 37; o

   un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 42 y un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 47.

3. 3.

   Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 que inhibe la unión del complejo IL-6:IL-6Ra a gp130 y tiene una CI50 de no más de 700 nM en un ensayo de fluorescencia de resolución temporal homogénea para la inhibición de la unión del complejo IL-6:IL-6Ra a gp130, con una concentración final de 1 nM de complejo de y 1 nM de gp130.

4. 4.

   Una composición que comprende un anticuerpo aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un excipiente farmacéuticamente aceptable para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o de animal por intervención quirúrgica o tratamiento.

5. 5.

   Un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en el tratamiento de un trastorno asociado con la IL-6 en un individuo, en el que el trastorno asociado con la IL-6 se selecciona de entre: una enfermedad inflamatoria y/o autoinmunitaria, un tumor y/o un cáncer, un trastorno linfoproliferativo, rechazo de aloinjerto, caquexia, osteoporosis, traumatismo cerebral, edema cerebral, depresión, insuficiencia cardíaca congestiva o dolor óseo.

6. 6.

   Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo,

   de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

7. 7.

   Una célula huésped transformada in vitro con ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6.

   5 8. Un método de producción de un anticuerpo, que comprende cultivar células huésped de acuerdo con la reivindicación 7 en condiciones para la producción del anticuerpo.
8. 9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende además aislar y/o purificar el anticuerpo.

   10 10. Un método de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, que comprende además formular el anticuerpo en una composición que comprende al menos un componente adicional.