ES2432118T3 - Multipotent adult stem cells, sources of these, methods to obtain and maintain them, methods of differentiation of these, methods of use of these and cells derived from these - Google Patents

Abstract

Un método para obtener una población de células madre adultas multipotentes de mamíferos que no soncélulas germinales ni embrionarias y que pueden ser inducidas a diferenciarse en al menos un tipo celulardiferenciado de cada una de las estirpes embrionarias mesodérmicas, ectodérmicas y endodérmicas, donde lascélulas expresan oct4 y telomerasa, y donde el método comprende: a) proporcionar una muestra de sangre del cordón umbilical o de la placenta b) establecer una población de células adherentes c) eliminar la población de células CD45+ presentes en las células; d) recuperar las células CD45- y cultivar las células CD45- en un medio de cultivo que comprende FCE yFCDP; e) seleccionar las células que expresan oct4 y telomerasa; f) cultivar las células para formar una población y g) aislar la población de células madre adultas multipotentes de mamíferos.A method to obtain a population of multipotent adult stem cells from mammals that are not germ or embryonic cells and that can be induced to differentiate into at least one differentiated cell type from each of the mesodermal, ectodermal and endodermal embryonic lines, where the cells express oct4 and telomerase, and where the method comprises: a) providing a blood sample from the umbilical cord or placenta b) establishing a population of adherent cells c) eliminating the population of CD45 + cells present in the cells; d) recovering the CD45- cells and culturing the CD45- cells in a culture medium comprising FCE and FCDP; e) select the cells expressing oct4 and telomerase; f) culturing the cells to form a population and g) isolating the population of multipotent adult stem cells from mammals.

Description

Células madre adultas multipotentes, fuentes de estas, métodos para obtenerlas y mantenerlas, métodos de 5 diferenciación de estas, métodos de uso de estas y células derivadas de estas Multipotent adult stem cells, sources of these, methods to obtain and maintain them, methods of differentiation of these, methods of use of these and cells derived from these

Campo de la invención Field of the Invention

La presente invención se refiere generalmente a células madre adultas multipotentes de mamíferos (CMAM) y más específicamente a métodos para obtener, mantener y diferenciar las CMAM. También se proporcionan usos de CMAM en el tratamiento terapéutico de la enfermedad. The present invention generally relates to multipotent adult mammalian stem cells (CMAM) and more specifically to methods for obtaining, maintaining and differentiating CMAMs. CMAM uses are also provided in the therapeutic treatment of the disease.

Antecedentes de la invención Background of the invention

15 La generación de un órgano y un tejido a partir de células madre, y su posterior trasplante proporcionan tratamientos prometedores para diferentes patologías, lo que convierte a las células madre en un punto central de investigación en muchos campos. La tecnología de las células madre proporciona una terapia alternativa prometedora para la diabetes, enfermedad de Parkinson, enfermedad hepática, enfermedad cardíaca y trastornos autoinmunitarios, por nombrar unos pocos. Sin embargo, hay al menos dos grandes problemas asociados con el trasplante de órganos y tejidos. 15 The generation of an organ and tissue from stem cells, and subsequent transplantation provide promising treatments for different pathologies, which makes stem cells a central point of research in many fields. Stem cell technology provides a promising alternative therapy for diabetes, Parkinson's disease, liver disease, heart disease and autoimmune disorders, to name a few. However, there are at least two major problems associated with organ and tissue transplantation.

En primer lugar, hay escasez de donantes de órganos y tejidos. Tan solo un 5 por ciento de los órganos que se necesitan para trasplantes en los Estados Unidos llega alguna vez a estar disponible para el receptor (Evans et al. 1992). De acuerdo con la Asociación Americana del Corazón, únicamente 2300 de los 40 000 americanos que First, there is a shortage of organ and tissue donors. Only 5 percent of the organs needed for transplants in the United States ever become available to the recipient (Evans et al. 1992). According to the American Heart Association, only 2300 of the 40,000 Americans who

25 necesitaron un corazón nuevo en 1997 recibieron uno. La Fundación Americana del Hígado declara que hay menos de 3000 donantes para los cerca de 30 000 pacientes que fallecen cada año debido a la insuficiencia hepática. 25 needed a new heart in 1997 they received one. The American Liver Foundation states that there are fewer than 3,000 donors for the nearly 30,000 patients who die each year due to liver failure.

El segundo gran problema reside en la potencial incompatibilidad del tejido trasplantado con el sistema inmunitario del receptor. Debido a que el sistema inmunitario del receptor reconoce como extraño el órgano o tejido donado es necesario proporcionar al paciente medicamentos inmunosupresores con un coste significativo tanto económico como físico. The second major problem lies in the potential incompatibility of the transplanted tissue with the recipient's immune system. Because the recipient's immune system recognizes the donated organ or tissue as foreign, it is necessary to provide the patient with immunosuppressive medications at a significant economic and physical cost.

El xenotrasplante, o el trasplante de órganos o tejidos de otras especies, podrían proporcionar un medio alternativo para superar la escasez de órganos y tejidos humanos. El xenotrasplante ofrecería la ventaja de una planificación 35 avanzada. El órgano se podría extraer cuando todavía está sano y el paciente podría someterse a cualquier tratamiento previo beneficioso antes de la intervención quirúrgica para el trasplante. Desgraciadamente, el xenotrasplante no soluciona el problema de la incompatibilidad tisular, sino que lo exacerba. Además, de acuerdo con los Centros para el Control de Enfermedades, se dispone de evidencia de que los virus dañinos cruzan las barreras entre especies. Los cerdos se han convertido en candidatos probables como donantes de órganos y tejidos, sin embargo, se ha documentado la transmisión entre especies de más de un virus de cerdos a humanos. Por ejemplo, más de un millón de cerdos fueron sacrificados recientemente en Malasia en un esfuerzo por contener un brote del virus Hendra, una enfermedad que fue transmitida a más de 70 humanos con resultados mortales (Butler, Xenotransplantation, or transplantation of organs or tissues of other species, could provide an alternative means to overcome the shortage of human organs and tissues. The xenotransplant would offer the advantage of advanced planning. The organ could be removed when it is still healthy and the patient could undergo any previous beneficial treatment before the surgical intervention for the transplant. Unfortunately, xenotransplantation does not solve the problem of tissue incompatibility, but rather exacerbates it. In addition, according to the Centers for Disease Control, there is evidence that harmful viruses cross barriers between species. Pigs have become likely candidates as organ and tissue donors, however, transmission between species of more than one pig virus to humans has been documented. For example, more than one million pigs were recently slaughtered in Malaysia in an effort to contain an outbreak of the Hendra virus, a disease that was transmitted to more than 70 humans with deadly results (Butler,

D. 1999). D. 1999).

45 Células madre: Definición y uso 45 Stem cells: Definition and use

La fuente más prometedora de órganos y tejidos para trasplantes, por tanto, reside en el desarrollo de la tecnología de las células madre. En teoría, las células madre pueden llevar a cabo una división celular autorrenovadora para dar lugar a células hija idénticas genotípica y fenotípicamente durante un tiempo indefinido y, finalmente, pueden diferenciarse en al menos un tipo celular final. Mediante la generación de órganos o tejidos a partir de las propias células madre del paciente, o mediante la alteración genética de células heterólogas de modo que el sistema inmunitario del receptor no las reconozca como extrañas, se pueden generar tejidos para trasplantes para proporcionar las ventajas asociadas con el xenotrasplante sin los riesgos asociados de infección o rechazo del tejido. The most promising source of organs and tissues for transplants, therefore, lies in the development of stem cell technology. In theory, stem cells can carry out a self-renewing cell division to give rise to genotypically and phenotypically identical daughter cells for an indefinite time and, finally, they can be differentiated into at least one final cell type. By generating organs or tissues from the patient's own stem cells, or by genetically altering heterologous cells so that the recipient's immune system does not recognize them as foreign, transplant tissues can be generated to provide the associated advantages. with xenotransplantation without the associated risks of infection or tissue rejection.

55 Las células madre también proporcionan la promesa de una mejora en los resultados de la terapia génica. Las propias células madre del paciente se podrían alterar in vitro y a continuación introducirlas de nuevo in vivo para producir el producto génico deseado. Estas células madre alteradas genéticamente tendrían el potencial de ser inducidas a diferenciarse para formar una multitud de tipos celulares para su implante en sitios específicos del cuerpo o para una aplicación sistémica. De manera alternativa, las células madre heterólogas podrían alterarse genéticamente para expresar los antígenos del complejo principal de histocompatibilidad (MHC, por sus siglas en inglés) del receptor, o ningún antígeno del MHC, lo que permitiría el trasplante de células de un donante a un receptor sin el riesgo asociado de rechazo. 55 Stem cells also provide the promise of an improvement in the results of gene therapy. The patient's own stem cells could be altered in vitro and then introduced again in vivo to produce the desired gene product. These genetically altered stem cells would have the potential to be induced to differentiate to form a multitude of cell types for implantation at specific sites in the body or for systemic application. Alternatively, heterologous stem cells could be genetically altered to express the main histocompatibility complex (MHC) antigens of the recipient, or no MHC antigen, which would allow transplantation of cells from a donor to a donor. recipient without the associated risk of rejection.

65 Se define a las células madre como células que poseen el potencial de una proliferación amplia, se diferencian en varias estirpes celulares y repueblan los tejidos tras el trasplante. La célula madre por excelencia es la célula madre embrionaria (ME) ya que posee un potencial de diferenciación multipotente y autorrenovador ilimitado (Thomson, J. et al. 1995; Thomson, J.A. et al. 1998; Shamblott, M et al. 1998; Williams, R.L. et al. 1998; Orkin, S. 1998; Reubinoff, 65 Stem cells are defined as cells that have the potential for wide proliferation, differentiate into several cell lines and repopulate tissues after transplantation. The stem cell par excellence is the embryonic stem cell (ME) because it has unlimited multipotent and self-innovative differentiation potential (Thomson, J. et al. 1995; Thomson, JA et al. 1998; Shamblott, M et al. 1998; Williams, RL et al. 1998; Orkin, S. 1998; Reubinoff,

B.E. et al. 2000). Estas células se derivan de la masa celular interna del blastocisto (Thomson, J et al. 1995; Thomson, J.A. et al. 1998; Martin, G.R. 1981) o se pueden derivar de las células germinales primordiales a partir de B.E. et al. 2000). These cells are derived from the internal cell mass of the blastocyst (Thomson, J et al. 1995; Thomson, J.A. et al. 1998; Martin, G.R. 1981) or can be derived from the primary germ cells from

5 un embrión tras la implantación (células germinales embrionarias o células GE). Se han derivado células ME y GE de ratón y más recientemente también de primates no humanos y humanos. Cuando se introducen en los blastocistos de ratón, las células ME pueden contribuir a todos los tejidos del ratón (animal) (Orkin, S. 1998). Las células ME murinas son por tanto pluripotentes. Cuando se trasplantan en animales que ya han nacido, las células ME y GE pueden generar teratomas, lo cual demuestra de nuevo su multipotencia. Las células ME (y GE) se pueden identificar por la tinción positiva con anticuerpos que detectan los antígenos embrionarios 1 y 4 específicos de la etapa (SSEA, por sus siglas en inglés). 5 an embryo after implantation (embryonic germ cells or GE cells). Mouse ME and GE cells have been derived and more recently from nonhuman and human primates. When introduced into mouse blastocysts, ME cells can contribute to all mouse (animal) tissues (Orkin, S. 1998). Murine ME cells are therefore pluripotent. When they are transplanted into animals that have already been born, ME and GE cells can generate teratomas, which again demonstrates their multipotence. ME (and GE) cells can be identified by positive staining with antibodies that detect stage-specific embryonic antigens 1 and 4 (SSEA).

A nivel molecular, las células ME y GE expresan varios factores de transcripción muy específicos para estas células indiferenciadas. Estos incluyen oct-4 y Rex-1 y el receptor del factor inhibidor de la leucemia (R-FIL). Los factores de At the molecular level, ME and GE cells express several very specific transcription factors for these undifferentiated cells. These include oct-4 and Rex-1 and the leukemia inhibitor factor receptor (R-FIL). The factors of

15 transcripción sox-2 y Rox-1 se expresan tanto en las células ME como en las células no ME. Oct-4 se expresa en el embrión antes de la gastrulación, en el embrión en la etapa de segmentación temprana, en las células de la masa celular interna del blastocisto y en las células de carcinoma embrionario (CE). En el animal adulto, oct-4 únicamente se encuentra en las células germinales. Sox-2 and Rox-1 transcription are expressed in both ME cells and non-ME cells. Oct-4 is expressed in the embryo before gastrulation, in the embryo in the early segmentation stage, in the cells of the internal cell mass of the blastocyst and in the embryonic carcinoma (EC) cells. In the adult animal, oct-4 is only found in germ cells.

Oct-4, en combinación con Rox-1, provoca la activación transcripcional de la proteína con dedo de zinc Rex-1 y también se necesita para mantener las células ME en un estado indiferenciado. El gen oct-4 experimenta una disminución regulada cuando se induce la diferenciación in vitro de las células. Varios estudios han mostrado que se necesita oct-4 para el mantenimiento del fenotipo indiferenciado de las células ME y que desempeña un papel principal en la determinación de las primeras etapas de la embriogénesis y diferenciación. Se necesita sox-2 junto Oct-4, in combination with Rox-1, causes the transcriptional activation of the Rex-1 zinc finger protein and is also needed to keep ME cells in an undifferentiated state. The oct-4 gene undergoes a regulated decrease when cell differentiation is induced in vitro. Several studies have shown that oct-4 is needed for the maintenance of the undifferentiated phenotype of ME cells and that it plays a major role in determining the early stages of embryogenesis and differentiation. Sox-2 is needed together

25 con oct-4 para mantener el estado indiferenciado de las células ME/CE y para mantener las células ME murinas pero no las humanas. Las células germinales primordiales murinas o humanas requieren la presencia de FIL. Otra característica distintiva de las células ME es la presencia de niveles elevados de telomerasa, la cual proporciona a estas células un potencial ilimitado de autorrenovación in vitro. 25 with oct-4 to maintain the undifferentiated state of ME / CE cells and to maintain murine ME cells but not human ones. Murine or human primordial germ cells require the presence of FIL. Another distinguishing feature of ME cells is the presence of elevated levels of telomerase, which provides these cells with unlimited potential for in vitro self-renewal.

Se han identificado células madre en la mayor parte de los órganos o tejidos. La mejor caracterizada es la célula madre hematopoyética (CMH). Esta célula derivada del mesodermo se ha purificado basándose en los marcadores de la superficie celular y en características funcionales. La CMH, aislada a partir de la médula ósea (MO), sangre, sangre del cordón umbilical, hígado fetal y saco vitelino, es la célula progenitora que genera los glóbulos sanguíneos Stem cells have been identified in most organs or tissues. The best characterized is the hematopoietic stem cell (CMH). This cell derived from the mesoderm has been purified based on cell surface markers and functional characteristics. CMH, isolated from the bone marrow (MO), blood, umbilical cord blood, fetal liver and yolk sac, is the progenitor cell that generates blood cells

o tras la traducción inicia de nuevo varias estirpes hematopoyéticas y puede reiniciar hematopoyesis de por vida en or after the translation starts again several hematopoietic strains and can restart hematopoiesis for life in

35 el receptor. (Remítase a Fei, R., et al., patente de los EE. UU. N.º 5.635.387; McGlave, et al., patente de los EE. UU. N.º 5.460.964; Simmons, P., et al., patente de los EE. UU. N.º 5.677.136; Tsukamoto, et al., patente de los EE. UU. N.º 5.750.397; Schwartz, et al., patente de los EE. UU. N.º ,759,793; DiGuisto, et al., patente de los EE. UU. N.º 5.681.599; Tsukamoto, et al., patente de los EE. UU. N.º 5.716.827; Hill, B., et al. 1996). Cuando se trasplantan en animales o humanos irradiados de manera letal, las CMH pueden regenerar la población celular hemopoyética linfoide, de megacariocitos, de neutrófilos-macrófagos y eritroide. In vitro, se puede inducir a las células madre hematopoyéticas a llevar a cabo al menos algunas divisiones celulares autorrenovadoras y se las puede inducir a diferenciarse en las mismas estirpes que se observan in vivo. Por tanto, esta célula cumple los requisitos de una célula madre. Las células madre que se diferencian únicamente para formar células de la estirpe hematopoyética, sin embargo, son incapaces de proporcionar una fuente de células para reparar otros tejidos dañados, por ejemplo, 35 the receiver. (See Fei, R., et al., U.S. Patent No. 5,635,387; McGlave, et al., U.S. Patent No. 5,460,964; Simmons, P. , et al., U.S. Patent No. 5,677,136; Tsukamoto, et al., U.S. Patent No. 5,750,397; Schwartz, et al., U.S. Patent. U.S. No. 759,793; DiGuisto, et al., U.S. Patent No. 5,681,599; Tsukamoto, et al., U.S. Patent No. 5,716,827; Hill, B., et al. 1996). When transplanted in lethal irradiated animals or humans, CMHs can regenerate the lymphoid, megakaryocyte, neutrophil-macrophage and erythroid hemopoietic cell population. In vitro, hematopoietic stem cells can be induced to carry out at least some self-renewing cell divisions and can be induced to differentiate into the same strains that are observed in vivo. Therefore, this cell meets the requirements of a stem cell. Stem cells that differ only to form cells of the hematopoietic lineage, however, are unable to provide a source of cells to repair other damaged tissues, for example,

45 tejido de pulmón o corazón dañado por una dosis elevada de agentes quimioterapéuticos. 45 lung or heart tissue damaged by a high dose of chemotherapeutic agents.

Un segundo tipo de célula madre que se ha estudiado de manera exhaustiva es la célula madre neural (CMN) (Gage A second type of stem cell that has been extensively studied is the neural stem cell (CMN) (Gage

F.H. 2000; Svendsen C.N. et al, 1999; Okabe S. et al. 1996). Las CMN se identificaron inicialmente en la zona subventricular y en el bulbo olfativo del cerebro fetal. Hasta hace poco, se creía que el cerebro adulto ya no contenía células con el potencial de las células madre. Sin embargo, varios estudios en roedores, y más recientemente también en primates no humanos y humanos, han mostrado que las células madre continúan estando presentes en el cerebro adulto. Estas células madre pueden proliferar in vivo y regenerar de manera continua al menos algunas células neuronales in vivo. Cuando se cultivan ex vivo, se puede inducir a las CMN a proliferar así como a diferenciarse en diferentes tipos de neuronas y células neurogliales. Cuando se trasplantan en el cerebro, las CMN F.H. 2000; Svendsen C.N. et al, 1999; Okabe S. et al. nineteen ninety six). CMNs were initially identified in the subventricular zone and in the olfactory bulb of the fetal brain. Until recently, it was believed that the adult brain no longer contained cells with the potential of stem cells. However, several studies in rodents, and more recently also in nonhuman and human primates, have shown that stem cells continue to be present in the adult brain. These stem cells can proliferate in vivo and continuously regenerate at least some neuronal cells in vivo. When grown ex vivo, CMNs can be induced to proliferate as well as to differentiate into different types of neurons and neuroglia cells. When they are transplanted in the brain, CMNs

55 pueden injertarse y generar células neurales y células neurogliales. Por tanto, esta célula también se ajusta a la definición de una célula madre, aunque sea una célula madre hematopoyética. 55 can be grafted and generate neural cells and neuroglial cells. Therefore, this cell also conforms to the definition of a stem cell, even if it is a hematopoietic stem cell.

Clarke et al. señalaron que las CMN de ratones transgénicos Lac-Z inyectadas en blastocistos murinos o embriones de pollo contribuían a varios tejidos del embrión de pollo o ratón quimérico (Clarke, D.L. et al. 2000). Se detectaron células que expresan LacZ con un grado variable de mosaicismo, no solamente en el sistema nervioso central, sino también en los derivados del mesodermo así como en las células epiteliales del hígado e intestino pero no en otros tejidos, incluido el sistema hematopoyético. Estos estudios, por tanto, sugieren que las CMN adultas pueden poseer un potencial de diferenciación significativamente mayor de lo que se pensaba anteriormente pero todavía no poseen la capacidad pluripotente de las células ME o de las células madre adultas multipotentes derivadas de adultos 65 (CMAM) descritas en Furcht et al. (WO 01/11011) y en la presente. Los términos MAPC, MPC (ambas por sus siglas Clarke et al. They noted that the CMN of Lac-Z transgenic mice injected into murine blastocysts or chicken embryos contributed to various tissues of the chimeric chicken or mouse embryo (Clarke, D.L. et al. 2000). Cells expressing LacZ with a varying degree of mosaicism were detected, not only in the central nervous system, but also in mesoderm derivatives as well as in liver and intestine epithelial cells but not in other tissues, including the hematopoietic system. These studies, therefore, suggest that adult CMNs may have a significantly greater differentiation potential than previously thought but do not yet possess the pluripotent capacity of ME cells or multipotent adult stem cells derived from adults 65 (CMAM) described in Furcht et al. (WO 01/11011) and herein. The terms MAPC, MPC (both by its acronym

en inglés) y CMAM también se pueden emplear indistintamente para describir células madre adultas multipotentes derivadas de adultos. in English) and CMAM can also be used interchangeably to describe multipotent adult stem cells derived from adults.

Las terapias para los trastornos cerebrales traumáticos y degenerativos se podrían impulsar significativamente con Therapies for traumatic and degenerative brain disorders could be significantly boosted with

5 las terapias de reemplazo celular. Se han identificado CMN en la zona subventricular (ZSV) y el hipocampo del cerebro de mamíferos adultos (Ciccolini et al., 1998; Morrison et al., 1999; Palmer et al., 1997; Reynolds y Weiss, 1992; Vescovi et al., 1999) y también pueden estar presentes en el epéndimo y otras áreas del cerebro que se consideran no neurogénicas (Doetsch et al., 1999; Johansson et al., 1999; Palmer et al., 1999). Las CMN derivadas de cerebro adulto o fetal se pueden expandir ex vivo e inducir su diferenciación en astrocitos, oligodendrocitos y neuronas funcionales (Ciccolini et al., 1998; Johansson et al., 1999; Palmer et al., 1999; Reynolds et al., 1996; Ryder et al., 1990; Studer et al., 1996; Vescovi et al., 1993). In vivo, las CMN indiferenciadas cultivadas durante períodos variables de tiempo se diferencian en células neurogliales, neuronas dopaminérgicas y GABAérgicas (Flax et al., 1998; Gage et al., 1995; Suhonen et al., 1996). La fuente de CMN utilizada más comúnmente es el cerebro fetal alogénico, el cual presenta problemas tanto éticos como inmunitarios. De manera alternativa, se pueden recolectar 5 cell replacement therapies. CMN in the subventricular zone (ZSV) and the hippocampus of the brain of adult mammals have been identified (Ciccolini et al., 1998; Morrison et al., 1999; Palmer et al., 1997; Reynolds and Weiss, 1992; Vescovi et al. ., 1999) and may also be present in the epidendum and other areas of the brain that are considered non-neurogenic (Doetsch et al., 1999; Johansson et al., 1999; Palmer et al., 1999). CMN derived from adult or fetal brain can be expanded ex vivo and induce its differentiation into astrocytes, oligodendrocytes and functional neurons (Ciccolini et al., 1998; Johansson et al., 1999; Palmer et al., 1999; Reynolds et al. , 1996; Ryder et al., 1990; Studer et al., 1996; Vescovi et al., 1993). In vivo, undifferentiated CMNs cultured for varying periods of time differ in neuroglial cells, dopaminergic neurons and GABAergic (Flax et al., 1998; Gage et al., 1995; Suhonen et al., 1996). The most commonly used source of CMN is the allogeneic fetal brain, which presents both ethical and immune problems. Alternatively, they can be collected

15 CMN del cerebro autólogo. Debido a que no se sabe si una patología neural preexistente afectará la capacidad de las CMN para ser cultivadas e inducidas a diferenciarse en células neurogliales y neuronales ex vivo, y debido a que una cirugía adicional en un cerebro que ya está enfermo puede agravar la enfermedad subyacente, esta estrategia es menos atractiva. 15 CMN of the autologous brain. Because it is not known whether a preexisting neural pathology will affect the ability of CMNs to be cultured and induced to differentiate into neuroglia and neuronal cells ex vivo, and because an additional surgery on a brain that is already sick can aggravate the disease underlying, this strategy is less attractive.

La fuente ideal de neuronas y neuroglía para las estrategias de reemplazo serían células que se puedan extraer de tejidos autólogos adultos diferentes del cerebro que sean fácilmente accesibles y que se puedan expandir in vitro y diferenciar ex vivo o in vivo en el tipo celular que es deficiente en el paciente. Informes recientes han sugerido que las células derivadas de la MO adquieren características fenotípicas de las células neuroectodérmicas cuando se cultivan in vitro en condiciones de las CMN o cuando entran en el sistema nervioso central (Sanchez-Ramos et al., The ideal source of neurons and neuroglia for replacement strategies would be cells that can be removed from adult autologous tissues other than the brain that are easily accessible and that can be expanded in vitro and differentiated ex vivo or in vivo into the cell type that is deficient in the patient Recent reports have suggested that MO-derived cells acquire phenotypic characteristics of neuroectodermal cells when grown in vitro under CMN conditions or when they enter the central nervous system (Sanchez-Ramos et al.,

25 2000; Woodbury et al., 2000). No se conoce el fenotipo de las células de la MO con esta capacidad. Tampoco se conoce la capacidad de diferenciación en otros tipos celulares de las células que adquieren características neuroectodérmicas. 25 2000; Woodbury et al., 2000). The phenotype of MO cells with this capacity is unknown. The ability to differentiate other cell types from cells that acquire neuroectodermal characteristics is also unknown.

Una tercera célula histoespecífica con propiedades de célula madre es la célula madre mesenquimatosa (CMM), descrita inicialmente por Fridenshtein (1982). La CMM, derivada originalmente del mesodermo embrionario y aislada de MO de adultos, se puede diferenciar para formar músculo, hueso, cartílago, grasa, estroma medular y tendón. Durante la embriogénesis, el mesodermo se desarrolla para dar el mesodermo dorsal somítico, tejido que genera el hueso, cartílago, grasa, músculo esquelético y posiblemente el endotelio. El mesodermo también se diferencia en el mesodermo visceral, el cual da lugar al músculo cardíaco, músculo liso o islotes sanguíneos constituidos por el A third histo-specific cell with stem cell properties is the mesenchymal stem cell (CMM), initially described by Fridenshtein (1982). The CMM, originally derived from the embryonic mesoderm and isolated from adult MO, can be differentiated to form muscle, bone, cartilage, fat, medullary stroma and tendon. During embryogenesis, the mesoderm develops to give the somitic dorsal mesoderm, tissue that generates bone, cartilage, fat, skeletal muscle and possibly the endothelium. The mesoderm also differs in the visceral mesoderm, which gives rise to the heart muscle, smooth muscle or blood islets constituted by the

35 endotelio y las células progenitoras hematopoyéticas. Las CMM o células del mesodermo primitivo, por tanto, podrían proporcionar una fuente de diferentes tipos tisulares y celulares. Se han aislado varias CMM. (Remítase a, por ejemplo, Caplan, A., et al., patente de los EE. UU. N.º 5.486.359; Young, H., et al., patente de los EE. UU. N.º 5.827.735; Caplan, A., et al., patente de los EE. UU. N.º 5.811.094; Bruder, S., et al., patente de los EE. UU. N.º 5.736.396; Caplan, A., et al., patente de los EE. UU. N.º 5.837.539; Masinovsky, B., patente de los EE. UU. N.º 5.837.670; Pittenger, M., patente de los EE. UU. N.º 5.827.740; Jaiswal, N., et al., 1997; Cassiede P., et al., 1996; Johnstone, B., et al., 1998; Yoo, et al., 1998; Gronthos, S., 1994). 35 endothelium and hematopoietic progenitor cells. The CMM or cells of the primitive mesoderm, therefore, could provide a source of different tissue and cell types. Several CMMs have been isolated. (See, for example, Caplan, A., et al., U.S. Patent No. 5,486,359; Young, H., et al., U.S. Patent No. 5,827 .735; Caplan, A., et al., U.S. Patent No. 5,811,094; Bruder, S., et al., U.S. Patent No. 5,736,396; Caplan , A., et al., U.S. Patent No. 5,837,539; Masinovsky, B., U.S. Patent No. 5,837,670; Pittenger, M., U.S. Patent U.S. 5,827,740; Jaiswal, N., et al., 1997; Cassiede P., et al., 1996; Johnstone, B., et al., 1998; Yoo, et al., 1998; Gronthos, S., 1994).

De las muchas CMM que se han descrito, todas han mostrado una diferenciación limitada para formar células consideradas generalmente de origen mesenquimatoso. Hasta la fecha, la CMM más multipotente descrita es la Of the many CMMs that have been described, all have shown limited differentiation to form cells generally considered of mesenchymal origin. To date, the most multipotent CMM described is the

45 célula aislada por Pittenger et al., la cual expresa el fenotipo SH2+ SH4+ CD29+ CD44+ CD71+ CD90+ CD106+ CD120a+ CD124- CD 14- CD34- CD45-. Esta célula es capaz de diferenciarse para formar varios tipos celulares de origen mesenquimatoso, pero aparentemente posee un potencial limitado de diferenciación en células de la estirpe mesenquimatosa, ya que el equipo que la aisló señaló que nunca se identificaron células hematopoyéticas en los cultivos expandidos (Pittenger et al., 1999). 45 cell isolated by Pittenger et al., Which expresses the phenotype SH2 + SH4 + CD29 + CD44 + CD71 + CD90 + CD106 + CD120a + CD124- CD 14- CD34- CD45-. This cell is able to differentiate to form several cell types of mesenchymal origin, but apparently it has a limited potential for differentiation in mesenchymal line cells, since the team that isolated it indicated that hematopoietic cells were never identified in expanded cultures (Pittenger et al., 1999).

Se han identificado otras células madre histoespecíficas, incluidas las células madre gastrointestinales (Potten, C. 1998), células madre epidérmicas (Watt, F. 1997) y células madre hepáticas, también denominadas células ovales (Alison, M. et al., 1998). La mayoría de estas están peor caracterizadas. Other histospecific stem cells have been identified, including gastrointestinal stem cells (Potten, C. 1998), epidermal stem cells (Watt, F. 1997) and liver stem cells, also called oval cells (Alison, M. et al., 1998 ). Most of these are worse characterized.

55 Comparadas con las células ME, las células madre histoespecíficas poseen una capacidad de autorrenovación menor y, aunque se diferencian en múltiples estirpes, no son pluripotentes. Ningún estudio ha abordado si las células histoespecíficas expresan los marcadores descritos anteriormente como se ha observado en las células ME. Además, el grado de actividad telomerasa en las células comprometidas con una estirpe o histoespecíficas no se ha explorado completamente, en parte debido a que es difícil obtener números elevados de poblaciones muy enriquecidas de estas células. 55 Compared to ME cells, histo-specific stem cells have a lower self-renewal capacity and, although they differ in multiple strains, they are not pluripotent. No study has addressed whether histo-specific cells express the markers described above as observed in ME cells. In addition, the degree of telomerase activity in cells compromised with a strain or histo-specific has not been fully explored, in part because it is difficult to obtain high numbers of highly enriched populations of these cells.

Hasta hace poco, se pensaba que las células madre histoespecíficas únicamente podían diferenciarse en células del mismo tejido. Varias publicaciones recientes han sugerido que las células madre adultas específicas de un órgano pueden ser capaces de diferenciarse en células de diferentes tejidos. Sin embargo, no se ha comprendido 65 completamente la verdadera naturaleza de estos tipos de células. Varios estudios han mostrado que las células trasplantadas en el momento de un trasplante de MO pueden diferenciarse en músculo esquelético (Ferrari, 1998; Gussoni, 1999). Se podría considerar que esto significa un posible potencial de diferenciación de las células mesenquimatosas que están presentes en la médula. Jackson publicó que las células satélite musculares se pueden diferenciar en células hematopoyéticas, de nuevo un cambio en el fenotipo en el mesodermo esplácnico del embrión (Jackson, 1999). Otros estudios han mostrado que las células madre de una capa embrionaria (por ejemplo, el 5 mesodermo esplácnico) se pueden diferenciar en tejidos que se creían derivados durante la embriogénesis de una capa embrionaria diferente. Por ejemplo, las células endoteliales o sus precursores detectados en humanos o animales que se sometieron a un trasplante de médula se derivan, al menos en parte, de la médula del donante (Takahashi, 1999; Lin, 2000). Por tanto, las capacidades del mesodermo visceral pero no del mesodermo esplácnico tales como la progenie derivada de las CMM, se transfieren junto con la médula infundida. Incluso más 10 sorprendentes son los informes que demuestran, tanto en roedores como en humanos, que las células epiteliales hepáticas y las células epiteliales del conducto biliar se pueden observar en componentes que se derivan de la médula del donante (Petersen, 1999; Theise, 2000; Theise, 2000). De modo similar, tres grupos han mostrado que las CMN se pueden diferenciar en células hematopoyéticas. Finalmente, Clarke et al., publicaron que las células denominadas CMN cuando se inyectan en los blastocistos pueden contribuir a todos los tejidos del ratón quimérico Until recently, it was thought that histo-specific stem cells could only be differentiated into cells of the same tissue. Several recent publications have suggested that the specific adult stem cells of an organ may be able to differentiate into cells of different tissues. However, the true nature of these cell types has not been fully understood. Several studies have shown that cells transplanted at the time of an MO transplant can be differentiated into skeletal muscle (Ferrari, 1998; Gussoni, 1999). It could be considered that this means a possible differentiation potential of the mesenchymal cells that are present in the medulla. Jackson published that muscle satellite cells can be differentiated into hematopoietic cells, again a change in the phenotype in the splanchnic mesoderm of the embryo (Jackson, 1999). Other studies have shown that stem cells from an embryonic layer (for example, splanchnic mesoderm) can be differentiated into tissues that were believed derived during embryogenesis from a different embryonic layer. For example, endothelial cells or their precursors detected in humans or animals that underwent a bone marrow transplant are derived, at least in part, from the donor's bone marrow (Takahashi, 1999; Lin, 2000). Therefore, the capabilities of the visceral mesoderm but not of the splanchnic mesoderm, such as the progeny derived from the CMMs, are transferred along with the infused medulla. Even more surprising are the reports that demonstrate, both in rodents and in humans, that hepatic epithelial cells and bile duct epithelial cells can be seen in components that are derived from the donor's marrow (Petersen, 1999; Theise, 2000 ; Theise, 2000). Similarly, three groups have shown that CMNs can be differentiated into hematopoietic cells. Finally, Clarke et al., Published that cells called CMN when injected into blastocysts can contribute to all tissues of the chimeric mouse.

15 (Clarke et al., 2000). 15 (Clarke et al., 2000).

Es necesario destacar que la mayoría de estos estudios no han demostrado de manera concluyente que una única célula se pueda diferenciar en tejidos de diferentes órganos. También, las células madre aisladas a partir de un órgano dado puede que no sean necesariamente células comprometidas con una estirpe. De hecho, la mayor parte 20 de los investigadores no identificaron el fenotipo de la célula iniciadora. Una excepción es el estudio de Weissman y Grompe, quienes mostraron que las células que repueblan el hígado estaban presentes en células medulares Lin Thy1LowSca1+, las cuales están muy enriquecidas en CMH. De modo similar, el grupo de Mulligan mostró que las células Sp medulares, muy enriquecidas en CMH, se pueden diferenciar en músculo y endotelio, y Jackson et al. mostraron que las células Sp musculares son responsables de la reconstitución hemopoyética (Gussoni et al., 1999). It is necessary to highlight that most of these studies have not conclusively demonstrated that a single cell can be differentiated into tissues of different organs. Also, stem cells isolated from a given organ may not necessarily be cells compromised with a strain. In fact, most 20 of the researchers did not identify the phenotype of the starter cell. An exception is the study by Weissman and Grompe, who showed that the cells that repopulate the liver were present in Lin Thy1LowSca1 + marrow cells, which are very enriched in CMH. Similarly, the Mulligan group showed that spinal cord cells, very enriched in CMH, can be differentiated into muscle and endothelium, and Jackson et al. showed that muscle Sp cells are responsible for hemopoietic reconstitution (Gussoni et al., 1999).

25 El trasplante de órganos y tejidos generados a partir de células ME heterólogas requiere que las células se modifiquen genéticamente de manera adicional para inhibir la expresión de ciertos marcadores de la superficie celular o que se continúen usando supresores inmunitarios quimioterapéuticos con el fin de proteger contra el rechazo al trasplante. Por tanto, aunque la investigación en células ME proporciona una solución alternativa 25 Transplantation of organs and tissues generated from heterologous ME cells requires that cells be genetically modified further to inhibit the expression of certain cell surface markers or to continue using chemotherapeutic immune suppressants in order to protect against transplant rejection. Therefore, although research in ME cells provides an alternative solution

30 prometedora al problema del suministro limitado de órganos para trasplantes, los problemas y riesgos asociados con la necesidad de la inmunosupresión para mantener el trasplante de tejido o células heterólogas seguirían existiendo. Se estima que se necesitaría establecer 20 líneas de células ME diferentes inmunológicamente para poder proporcionar células inmunocompatibles para las terapias dirigidas a la mayoría de la población. 30 promising the problem of the limited supply of organs for transplants, the problems and risks associated with the need for immunosuppression to maintain transplantation of heterologous tissue or cells would continue to exist. It is estimated that it would be necessary to establish 20 different immunologically ME cell lines in order to provide immunocompatible cells for therapies targeting the majority of the population.

35 La utilización de células del individuo desarrollado, antes que de un embrión, como fuente de células madre alogénicas compatibles con un histotipado o células autólogas, podría mitigar o solucionar el problema de la incompatibilidad tisular asociada con el uso de células ME trasplantadas, así como resolver el problema ético asociado con la investigación con células ME. Hasta el momento, la mayor desventaja asociada con el uso de células madre autólogas para el trasplante de tejido reside en su potencial de diferenciación relativamente limitado. 35 The use of cells of the developed individual, rather than an embryo, as a source of allogeneic stem cells compatible with a histotyping or autologous cells, could mitigate or solve the problem of tissue incompatibility associated with the use of transplanted ME cells, as well as solve the ethical problem associated with research with ME cells. So far, the greatest disadvantage associated with the use of autologous stem cells for tissue transplantation lies in their relatively limited differentiation potential.

40 Se han aislado varias células madre a partir de organismos totalmente desarrollados, particularmente humanos, pero estas células, aunque se ha publicado que son multipotentes, han demostrado un potencial limitado para diferenciarse en múltiples tipos celulares. 40 Several stem cells have been isolated from fully developed organisms, particularly humans, but these cells, although published as multipotent, have shown limited potential to differentiate into multiple cell types.

Por tanto, a pesar de que previamente otros y los presentes inventores hayan aislado células madre con un Therefore, although previously others and the present inventors have isolated stem cells with a

45 potencial de diferenciación múltiple, no se ha descrito una célula progenitora con el potencial de diferenciarse en una amplia variedad de tipos celulares de diferentes estirpes, que incluya las células hemopoyéticas, de músculo cardíaco, músculo liso, estroma, endotelio, músculo esquelético, adipocitos, condrocitos, osteoblastos, fibroblastos y hepáticas. Si el trasplante de tejidos y células y la terapia génica van a proporcionar los avances terapéuticos esperados, se necesita una célula madre o célula progenitora con un potencial de diferenciación mayor o más A potential for multiple differentiation has not been described as a progenitor cell with the potential to differentiate into a wide variety of cell types of different strains, including hemopoietic, heart muscle, smooth muscle, stroma, endothelium, skeletal muscle, adipocyte cells. , chondrocytes, osteoblasts, fibroblasts and liver. If tissue and cell transplantation and gene therapy are going to provide the expected therapeutic advances, a stem cell or progenitor cell with a greater or greater differentiation potential is needed.

50 amplio. Lo que se necesita es el equivalente adulto de una célula ME. 50 wide. What is needed is the adult equivalent of an ME cell.

La MO, el músculo y el cerebro son los tres tejidos en los que se han identificado células con una plasticidad aparentemente mayor de lo que se suponía previamente. La MO contiene células que pueden contribuir a varias estructuras del mesodermo (Ferrari G. et al., 1998; Gussoni E. et al., 1999; Rafii S. et al., 1994; Asahara T. et al., 55 1997; Lin Y. et al., 2000; Orlic D. et al., 2001; Jackson K. et al., 2001), endodermo (Petersen B.E. et al., 1999; Theise, N.D. et al., 2000; Lagasse E. et al., 2000; Krause D. et al., 2001), neuroectodermo (Mezey D.S. et al., 2000; Brazelton T.R., et al., 2000, Sanchez-Ramos J. et al., 2000; Kopen G. et al., 1999) y de la piel (Krause, D. et al., 2001). Las células del músculo pueden contribuir al sistema hematopoyético (Jackson K. et al., 1999; Seale P. et al., 2000). También se dispone de evidencia de que las CMN pueden diferenciarse en células hematopoyéticas MO, muscle and brain are the three tissues in which cells with a seemingly greater plasticity than previously assumed have been identified. MO contains cells that can contribute to various mesoderm structures (Ferrari G. et al., 1998; Gussoni E. et al., 1999; Rafii S. et al., 1994; Asahara T. et al., 55 1997; Lin Y. et al., 2000; Orlic D. et al., 2001; Jackson K. et al., 2001), endoderm (Petersen BE et al., 1999; Theise, ND et al., 2000; Lagasse E. et al., 2000; Krause D. et al., 2001), neuroectoderm (Mezey DS et al., 2000; Brazelton TR, et al., 2000, Sanchez-Ramos J. et al., 2000; Kopen G. et al., 1999) and skin (Krause, D. et al., 2001). Muscle cells can contribute to the hematopoietic system (Jackson K. et al., 1999; Seale P. et al., 2000). There is also evidence that CMN can differentiate into hematopoietic cells

60 (Bjornson C. et al., 1999; Shih C. et al., 2001), mioblastos de músculo liso (Tsai R. Y. et al., 2000) y que las CMN dan lugar a varios tipos celulares cuando se inyectan en un blastocisto de ratón (Clarke, D.L. et al, 2000). 60 (Bjornson C. et al., 1999; Shih C. et al., 2001), smooth muscle myoblasts (Tsai RY et al., 2000) and that CMNs give rise to various cell types when injected into a blastocyst of mouse (Clarke, DL et al, 2000).

El documento WO 95/03062 describe métodos y composiciones para prevenir el rechazo inmunitario de injertos de órganos sólidos. WO 95/03062 describes methods and compositions for preventing immune rejection of solid organ grafts.

65 Erices et al., (2000), British Journal of Haematology: 109, 235-242 describe células progenitoras mesenquimatosas en sangre del cordón umbilical humano. 65 Erices et al., (2000), British Journal of Haematology: 109, 235-242 describes mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood.

El documento WO 02/36751 describe células madre somáticas sin restricciones derivadas de la sangre del cordón 5 umbilical humano. WO 02/36751 describes unrestricted somatic stem cells derived from human umbilical cord blood.

El presente estudio demuestra que se pueden aislar células con características progenitoras adultas multipotentes en un cultivo a partir de varios órganos diferentes, concretamente MO, músculo y cerebro. Las células poseen la misma morfología, fenotipo, capacidad de diferenciación in vitro y poseen un perfil de genes expresado muy similar. The present study demonstrates that cells with multipotent adult progenitor characteristics can be isolated in a culture from several different organs, namely MO, muscle and brain. The cells have the same morphology, phenotype, in vitro differentiation capacity and have a very similar expressed gene profile.

Compendio de la invención Compendium of the invention

La invención se expone en las reivindicaciones. The invention is set forth in the claims.

15 La presente invención se refiere a un método para obtener una población de células madre adultas multipotentes (CMAM) aisladas a partir de un mamífero, preferentemente un ratón, rata o humano. La célula se deriva de un órgano o tejido no embrionario y posee la capacidad de ser inducida a diferenciarse para formar al menos un tipo celular diferenciado de origen mesodérmico, ectodérmico y endodérmico. El órgano o tejido a partir del cual se aíslan las CMAM es la sangre del cordón umbilical o la placenta. The present invention relates to a method for obtaining a population of multipotent adult stem cells (CMAM) isolated from a mammal, preferably a mouse, rat or human. The cell is derived from a non-embryonic organ or tissue and has the ability to be induced to differentiate to form at least one differentiated cell type of mesodermal, ectodermal and endodermal origin. The organ or tissue from which CMAMs are isolated is umbilical cord blood or placenta.

Algunos ejemplos de células diferenciadas que se pueden derivar de las CMAM son los osteoblastos, condrocitos, adipocitos, fibroblastos, estroma medular, músculo esquelético, músculo liso, músculo cardíaco, oculares, endoteliales, epiteliales, hepáticas, pancreáticas, hematopoyéticas, neurogliales, neuronales u oligodendrocitos. Se puede inducir la diferenciación in vivo o ex vivo. Some examples of differentiated cells that can be derived from CMAM are osteoblasts, chondrocytes, adipocytes, fibroblasts, medullary stroma, skeletal muscle, smooth muscle, cardiac muscle, ocular, endothelial, epithelial, hepatic, pancreatic, hematopoietic, neuroglia, neuronal or oligodendrocytes Differentiation can be induced in vivo or ex vivo.

25 La CMAM producida por el método de la presente invención también se resume como una célula que expresa de manera constitutiva oct4 y niveles elevados de telomerasa, y es negativa para la expresión del MHC de clase II, MHC de clase I y CD44. Como un método de tratamiento, esta célula se administra a un paciente en una cantidad terapéuticamente eficaz. Un beneficio sorprendente de este tratamiento es que no se forman teratomas in vivo. The CMAM produced by the method of the present invention is also summarized as a cell constitutively expressing oct4 and elevated levels of telomerase, and is negative for the expression of MHC class II, MHC class I and CD44. As a method of treatment, this cell is administered to a patient in a therapeutically effective amount. A surprising benefit of this treatment is that no teratomas are formed in vivo.

Se describen animales no humanos normales que comprenden CMAM. Preferentemente el animal es quimérico. Normal nonhuman animals comprising CMAM are described. Preferably the animal is chimeric.

También se describe una composición que comprende una población de CMAM y un medio de cultivo que expande la población de las CMAM. En algunos casos es beneficioso que el medio contenga factor de crecimiento epidérmico A composition comprising a population of CMAM and a culture medium that expands the population of CMAM is also described. In some cases it is beneficial that the medium contains epidermal growth factor

35 (FCE), factor de crecimiento derivado de plaquetas (FCDP) y factor inhibidor de la leucemia (FIL). 35 (FCE), platelet-derived growth factor (FCDP) and leukemia inhibitor factor (FIL).

Además se describe una composición que comprende una población de una progenie de CMAM total o parcialmente purificada. La progenie puede poseer la capacidad de ser diferenciada adicionalmente o puede estar totalmente diferenciada In addition, a composition comprising a population of a totally or partially purified CMAM progeny is described. The progeny may possess the ability to be further differentiated or it may be totally differentiated

La progenie puede ser de los siguientes tipos celulares: de oligodendrocitos, neuronal, neuroglial, hematopoyética, pancreática, hepática, epitelial, endotelial, ocular, de músculo cardíaco, de músculo liso, de músculo esquelético, de estroma medular, de fibroblastos, adipocitos, condrocitos u osteoblastos. The progeny can be of the following cell types: oligodendrocytes, neuronal, neuroglial, hematopoietic, pancreatic, hepatic, epithelial, endothelial, ocular, cardiac muscle, smooth muscle, skeletal muscle, medullary stroma, fibroblasts, adipocytes, chondrocytes or osteoblasts.

45 La presente invención también proporciona un método para aislar y propagar CMAM obteniendo tejido de un mamífero, estableciendo una población de células adherente, eliminando la población de células CD45+, recuperando las células CD45-y cultivándolas en condiciones de expansión para producir una población celular expandida. Un objeto de la presente invención, por tanto, es producir una población celular expandida obtenida por este método. The present invention also provides a method for isolating and propagating CMAM by obtaining tissue from a mammal, establishing a population of adherent cells, eliminating the population of CD45 + cells, recovering CD45-cells and culturing them under expansion conditions to produce an expanded cell population. . An object of the present invention, therefore, is to produce an expanded cell population obtained by this method.

Un aspecto de la invención consiste en un método para diferenciar CMAM ex vivo mediante su aislamiento y propagación, y a continuación el cultivo de las células propagadas en presencia de los factores de diferenciación deseados. Los factores de diferenciación preferidos son el factor de crecimiento de fibroblastos básico (FCFb), factor de crecimiento endotelial vascular (FCEV), sulfuro de dimetilo (DMSO) e isoproterenol; o factor de crecimiento de One aspect of the invention consists of a method for differentiating CMAM ex vivo by its isolation and propagation, and then the cultivation of propagated cells in the presence of the desired differentiation factors. Preferred differentiation factors are the basic fibroblast growth factor (FCFb), vascular endothelial growth factor (FCEV), dimethyl sulfide (DMSO) and isoproterenol; or growth factor of

55 fibroblastos 4 (FCF4) y factor de crecimiento de hepatocitos (FCH). La propia célula diferenciada también se describe. 55 fibroblasts 4 (FCF4) and hepatocyte growth factor (FCH). The differentiated cell itself is also described.

Se describe un método para diferenciar CMAM in vivo mediante su aislamiento y expansión y, a continuación, la administración de la población celular expandida a un receptor mamífero, donde dicha población celular se injerta y diferencia in vivo en células histoespecíficas, de modo que la función de una célula u órgano defectuosos debido a una lesión, enfermedad genética, enfermedad adquirida o tratamientos yatrógenos, se aumenta, reconstituye o proporciona por primera vez. Utilizando este método, la CMAM puede experimentar autorrenovación in vivo. A method for differentiating CMAM in vivo by its isolation and expansion is described, and then the administration of the expanded cell population to a mammalian receptor, where said cell population is grafted and differentiated in vivo into histo-specific cells, so that the function of a defective cell or organ due to an injury, genetic disease, acquired disease or iatrogenic treatments, is increased, reconstituted or provided for the first time. Using this method, CMAM can experience self-renewal in vivo.

También se describe una célula diferenciada obtenida por diferenciación ex vivo o in vivo. La célula diferenciada A differentiated cell obtained by differentiation ex vivo or in vivo is also described. The differentiated cell

65 puede ser de ectodermo, mesodermo o endodermo. La célula diferenciada puede ser de los siguientes tipos celulares: de oligodendrocitos, neuronal, neuroglial, hematopoyética, pancreática, hepática, epitelial, endotelial, 65 may be of ectoderm, mesoderm or endoderm. The differentiated cell can be of the following cell types: oligodendrocytes, neuronal, neuroglial, hematopoietic, pancreatic, hepatic, epithelial, endothelial,

ocular, de músculo cardíaco, de músculo liso, de músculo esquelético, de estroma medular, de fibroblastos, adipocitos, condrocitos u osteoblastos. ocular, cardiac muscle, smooth muscle, skeletal muscle, medullary stroma, fibroblasts, adipocytes, chondrocytes or osteoblasts.

Una aplicación importante de esta tecnología es el método para tratar a un paciente mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de CMAM o su progenie. La progenie puede poseer la capacidad de ser diferenciada adicionalmente o puede estar totalmente diferenciada. Un beneficio inesperado de este enfoque es que se reduce o elimina la necesidad de tratamiento previo y/o tratamiento posterior del paciente con irradiación, quimioterapia, agentes inmunosupresores u otros fármacos o tratamientos. Tampoco se requiere la inducción de la tolerancia antes o durante el tratamiento. An important application of this technology is the method of treating a patient by administering a therapeutically effective amount of CMAM or its progeny. The progeny may possess the ability to be further differentiated or it may be totally differentiated. An unexpected benefit of this approach is that the need for prior treatment and / or subsequent treatment of the patient with irradiation, chemotherapy, immunosuppressive agents or other drugs or treatments is reduced or eliminated. Nor is induction of tolerance required before or during treatment.

Un tratamiento de este tipo puede tratar diferentes enfermedades y afecciones, incluidos el cáncer, la enfermedad cardiovascular, enfermedad metabólica, enfermedad hepática, diabetes, hepatitis, hemofilia, afecciones neurológicas traumáticas o degenerativas, enfermedad autoinmuntaria, deficiencia genética, trastornos del tejido conectivo, anemia, enfermedad infecciosa y rechazo del trasplante. Such a treatment can treat different diseases and conditions, including cancer, cardiovascular disease, metabolic disease, liver disease, diabetes, hepatitis, hemophilia, traumatic or degenerative neurological conditions, autoimmune disease, genetic deficiency, connective tissue disorders, anemia , infectious disease and transplant rejection.

Las CMAM o su progenie se administran a través de una inyección localizada, incluida la administración por catéter, inyección sistémica, administración parenteral, administración oral o inyección intrauterina en un embrión. La administración puede ser en combinación con una matriz farmacéuticamente aceptable, la cual puede ser biodegradable. CMAMs or their progeny are administered through a localized injection, including catheter administration, systemic injection, parenteral administration, oral administration or intrauterine injection into an embryo. Administration may be in combination with a pharmaceutically acceptable matrix, which may be biodegradable.

Las CMAM o su progenie administradas a un paciente alteran el sistema inmunitario para resistir la infección fúngica, bacteriana o vírica. CMAMs or their progeny administered to a patient alter the immune system to resist fungal, bacterial or viral infection.

Sorprendentemente, no se forman teratomas cuando las CMAM o su progenie se administran a un paciente. Surprisingly, no teratomas form when CMAMs or their progeny are administered to a patient.

Cuando se administran a un paciente, las CMAM o su progenie también son capaces de aumentar, reconstituir o proporcionar por primera vez la función de una célula u órgano defectuosos debido a una lesión, enfermedad genética, enfermedad adquirida o tratamientos yatrógenos. El órgano puede ser cualquiera de los siguientes: médula ósea, sangre, bazo, hígado, pulmón, tracto intestinal, cerebro, sistema inmunitario, sistema circulatorio, hueso, tejido conectivo, músculo, corazón, vasos sanguíneos, páncreas, sistema nervioso central, sistema nervioso periférico, riñón, vejiga, piel, apéndices epiteliales, glándulas mamarias del pecho, tejido graso y superficie de las mucosas incluidas la bucal, esofágica, vaginal y anal. Algunos ejemplos de enfermedades tratables por este método son el cáncer, enfermedad cardiovascular, enfermedad metabólica, enfermedad hepática, diabetes, hepatitis, hemofilia, afecciones neurológicas traumáticas o degenerativas, enfermedad autoinmunitaria, deficiencia genética, trastornos del tejido conectivo, anemia, enfermedad infecciosa y rechazo del trasplante. When administered to a patient, CMAM or its progeny are also able to increase, reconstitute or provide for the first time the function of a defective cell or organ due to an injury, genetic disease, acquired disease or yatrogenic treatments. The organ can be any of the following: bone marrow, blood, spleen, liver, lung, intestinal tract, brain, immune system, circulatory system, bone, connective tissue, muscle, heart, blood vessels, pancreas, central nervous system, system peripheral nervous, kidney, bladder, skin, epithelial appendages, breast mammary glands, fatty tissue and mucosal surface including buccal, esophageal, vaginal and anal. Some examples of diseases treatable by this method are cancer, cardiovascular disease, metabolic disease, liver disease, diabetes, hepatitis, hemophilia, traumatic or degenerative neurological conditions, autoimmune disease, genetic deficiency, connective tissue disorders, anemia, infectious disease and rejection of the transplant

Las CMAM o su progenie se dirigen a uno o más órganos en el paciente y se injertan en estos de modo que la función de una célula u órgano defectuosos debido a una lesión, enfermedad genética, enfermedad adquirida o tratamientos yatrógenos se aumenta, reconstituye o proporciona por primera vez, lo cual es sorprendente e inesperado. En una realización preferida, la lesión es isquemia o inflamación. The CMAM or its progeny are directed to one or more organs in the patient and are grafted into them so that the function of a defective cell or organ due to an injury, genetic disease, acquired disease or yatrogenic treatments is increased, reconstituted or provided for the first time, which is surprising and unexpected. In a preferred embodiment, the lesion is ischemia or inflammation.

Las CMAM o su progenie pueden promover la angiogénesis. CMAMs or their progeny can promote angiogenesis.

Las CMAM o su progenie puede transformarse genéticamente para suministrar un agente terapéutico, preferentemente un agente antiangiogénico. The CMAM or its progeny can be genetically transformed to deliver a therapeutic agent, preferably an antiangiogenic agent.

Se describe una composición terapéutica que comprende CMAM y un portador farmacéuticamente aceptable, donde las CMAM están presentes en una cantidad eficaz para producir tejido seleccionado del grupo constituido por médula ósea, sangre, bazo, hígado, pulmón, tracto intestinal, cerebro, sistema inmunitario, hueso, tejido conectivo, músculo, corazón, vasos sanguíneos, páncreas, sistema nervioso central, riñón, vejiga, piel, apéndices epiteliales, glándulas mamarias del pecho, tejido graso y superficie de las mucosas incluidas la bucal, esofágica, vaginal y anal. A therapeutic composition comprising CMAM and a pharmaceutically acceptable carrier is described, where CMAMs are present in an amount effective to produce tissue selected from the group consisting of bone marrow, blood, spleen, liver, lung, intestinal tract, brain, immune system, bone, connective tissue, muscle, heart, blood vessels, pancreas, central nervous system, kidney, bladder, skin, epithelial appendages, breast mammary glands, fatty tissue and mucosal surface including buccal, esophageal, vaginal and anal.

También se describe un método terapéutico para restaurar la función de la célula, tejido u órgano en un paciente que comprende los pasos de extraer CMAM de un mamífero donante, expandir las CMAM para formar una población expandida de células indiferenciadas y administrar las células expandidas al paciente y donde se restaura la función de la célula, tejido u órgano. La función restaurada puede ser enzimática o genética. El mamífero donante puede ser el paciente. A therapeutic method is also described to restore the function of the cell, tissue or organ in a patient comprising the steps of extracting CMAM from a donor mammal, expanding the CMAMs to form an expanded population of undifferentiated cells and administering the expanded cells to the patient. and where the function of the cell, tissue or organ is restored. The restored function can be enzymatic or genetic. The donor mammal may be the patient.

Se describe un método para inhibir el rechazo de una CMAM heteróloga trasplantada en un paciente, que comprende los pasos de introducir en la CMAM, ex vivo, un secuencia de ácido nucleico que codifica el antígeno del MHC del receptor ligado operablemente a un promotor, donde la CMAM expresa el antígeno del MHC, y trasplantar la CMAM al paciente, donde el antígeno del MHC se expresa en un nivel suficiente para inhibir el rechazo de la CMAM trasplantada. El paciente es de la misma especie que el donante de la CMAM o de otra especie de mamíferos. A method for inhibiting the rejection of a heterologous CMAM transplanted in a patient is described, comprising the steps of introducing into the CMAM, ex vivo, a nucleic acid sequence encoding the receptor MHC antigen operably linked to a promoter, where CMAM expresses the MHC antigen, and transplants the CMAM to the patient, where the MHC antigen is expressed at a level sufficient to inhibit rejection of the transplanted CMAM. The patient is of the same species as the donor of the CMAM or another mammalian species.

Un método alternativo para inhibir el rechazo de una CMAM heteróloga trasplantada en el paciente comprende inhibir transgénicamente la expresión del antígeno del MHC en la CMAM y trasplantar la CMAM transgénica en el paciente, la célula CMAM no expresa el antígeno del MHC y se evita el rechazo de las células trasplantadas. An alternative method to inhibit the rejection of a heterologous CMAM transplanted in the patient comprises transgenically inhibiting the expression of the MHC antigen in the CMAM and transplanting the transgenic CMAM in the patient, the CMAM cell does not express the MHC antigen and rejection is avoided. of the transplanted cells.

5 También se describe un método para generar sangre o componentes sanguíneos individuales ex vivo mediante el proceso de aislar CMAM y diferenciar la CMAM para generar sangre o componentes sanguíneos. Preferentemente, los componentes sanguíneos individuales son eritrocitos, leucocitos o plaquetas. 5 A method of generating individual blood or blood components ex vivo by the process of isolating CMAM and differentiating CMAM to generate blood or blood components is also described. Preferably, the individual blood components are erythrocytes, leukocytes or platelets.

Adicionalmente se describe un método de descubrimiento de fármacos que comprende los pasos de analizar la composición genómica o proteómica de las CMAM o de su progenie, emplear el análisis de estos a través de análisis informáticos y/o bioinformáticos utilizando algoritmos y ensamblar y comparar datos nuevos con bases de datos conocidas para comparar y contrastar estos. Additionally, a method of drug discovery is described which comprises the steps of analyzing the genomic or proteomic composition of the CMAM or its progeny, using the analysis of these through computer and / or bioinformatics analysis using algorithms and assembling and comparing new data. with known databases to compare and contrast these.

También se describe un método para identificar los componentes de una ruta de diferenciación que comprende los A method is also described to identify the components of a differentiation path comprising the

15 pasos de analizar la composición genómica o proteómica de las CMAM, inducir la diferenciación de las CMAM in vitro o in vivo, analizar la composición genómica o proteómica de las células intermediarias de la ruta de diferenciación, analizar la composición genómica o proteómica de las células totalmente diferenciadas de la ruta de diferenciación, utilizando algoritmos y/o herramientas bioinformáticas para caracterizar la composición genómica o proteómica de las CMAM y su progenie, y comparar los datos obtenidos en (e) para identificar los componentes de la ruta. Utilizando este método, se puede comparar la diferenciación que tiene lugar in vitro con la diferenciación que tiene lugar in vivo de modo que se pueden caracterizar las diferencias fundamentales entre los dos sistemas. 15 steps to analyze the genomic or proteomic composition of the CMAMs, induce the differentiation of the CMAMs in vitro or in vivo, analyze the genomic or proteomic composition of the intermediary cells of the differentiation pathway, analyze the genomic or proteomic composition of the cells totally differentiated from the differentiation route, using algorithms and / or bioinformatics tools to characterize the genomic or proteomic composition of the CMAMs and their progeny, and compare the data obtained in (e) to identify the components of the route. Using this method, the differentiation that takes place in vitro can be compared with the differentiation that takes place in vivo so that the fundamental differences between the two systems can be characterized.

Además se describe un método para generar, in vitro, productos que poseen utilidad terapéutica, diagnóstica o investigadora identificando los productos en las CMAM y aislando los productos de las CMAM. Los productos In addition, a method is described for generating, in vitro, products that have therapeutic, diagnostic or investigative utility identifying the products in the CMAM and isolating the products of the CMAM. The products

25 pueden ser proteínas, lípidos, carbohidratos complejos, ADN o ARN. 25 may be proteins, lipids, complex carbohydrates, DNA or RNA.

También se describe un método para inducir en un mamífero tolerancia a un antígeno administrado a dicho mamífero, donde el método comprende el paso de administrar a dicho mamífero, después de o simultáneamente a la administración de dicho antígeno, una cantidad eficaz de las CMAM o su progenie de modo que se suprima la respuesta inmunitaria humoral de dicho mamífero a una provocación posterior con dicho antígeno. A method is also described for inducing tolerance in an mammal to an antigen administered to said mammal, wherein the method comprises the step of administering to said mammal, after or simultaneously to the administration of said antigen, an effective amount of the CMAM or its progeny so that the humoral immune response of said mammal to a subsequent provocation with said antigen is suppressed.

Se describe un método para eliminar toxinas de la sangre de un paciente que comprende poner en contacto sangre ex vivo con células derivadas de las CMAM, donde dichas células recubren un dispositivo basado en fibra hueca. Las células pueden ser células hepáticas o renales. A method for removing toxins from the blood of a patient is described, which comprises contacting blood ex vivo with cells derived from CMAMs, where said cells cover a hollow fiber-based device. The cells can be liver or kidney cells.

35 Adicionalmente se describe un método para suministrar productos terapéuticos a un paciente que comprende poner en contacto la sangre de dicho paciente ex vivo con CMAM o su progenie, donde dichas CMAM o su progenie se han transformado genéticamente para suministrar un agente terapéutico, junto con un método para evaluar la toxicidad de un fármaco que comprende poner en contacto las CMAM o su progenie ex vivo con dicho fármaco y monitorizar la supervivencia de la célula. Se puede seleccionar la progenie del grupo constituido por células renales, epiteliales, endoteliales y hepáticas. In addition, a method is described for delivering therapeutic products to a patient comprising contacting the blood of said ex vivo patient with CMAM or its progeny, where said CMAM or its progeny have been genetically transformed to deliver a therapeutic agent, together with a method for assessing the toxicity of a drug comprising contacting CMAM or its progeny ex vivo with said drug and monitoring cell survival. The progeny can be selected from the group consisting of renal, epithelial, endothelial and liver cells.

Breve descripción de los dibujos Brief description of the drawings

45 La siguiente descripción detallada, proporcionada a modo de ejemplo, pero que no pretende limitar la invención a las realizaciones específicas descritas, puede entenderse en conjunto con los dibujos que la acompañan, en los cuales: The following detailed description, provided by way of example, but which is not intended to limit the invention to the specific embodiments described, can be understood in conjunction with the accompanying drawings, in which:

La Fig. 1 muestra una ilustración gráfica del potencial de expansión de CMAM derivadas del cerebro, músculo y médula ósea (MO). Fig. 1 shows a graphic illustration of the expansion potential of CMAM derived from the brain, muscle and bone marrow (MO).

La Fig. 2 muestra gráficas de dispersión que representan la expresión génica en (A) CMAM de músculo y cerebro y Fig. 2 shows scatter plots representing gene expression in (A) CMAM of muscle and brain and

(B) CMAM de músculo y médula ósea. (B) CMAM of muscle and bone marrow.

La Fig. 3 muestra una ilustración gráfica del análisis FACS de CMAM indiferenciadas y CMAM cultivadas con FCEV. Fig. 3 shows a graphic illustration of the FACS analysis of undifferentiated CMAM and CMAM cultured with FCEV.

55 Las gráficas muestran el perfil de tinción de IgG de control isotópico (línea fina) vs. el perfil de tinción de un anticuerpo específico (línea gruesa). El panel A muestra el fenotipo de CMAM indiferenciadas. Las CMAM expresan niveles bajos de microglobulina �2, Flk1, Flt1 y AC 133, pero no se tiñen con ningún otro de los marcadores antiendoteliales; el panel B muestra el fenotipo de CMAM cultivadas durante 14 días con 10 ng/mL de FCEV. Las CMAM expresan niveles bajos de la mayoría de los marcadores asociados con las células endoteliales pero pierden la expresión de AC 133; y el panel C muestra el fenotipo de CMAM cultivadas durante 3-9 días con 10 ng/mL de FCEV. En el día 3 del cultivo con FCEV las CMAM han perdido la expresión de AC 133, en el día 3 han adquirido la expresión de Tek y VE-cadherina y en el día 9 de Tie, vWF, CD34 y HIP 12. 55 The graphs show the isotopic control (thin line) IgG staining profile. the staining profile of a specific antibody (thick line). Panel A shows the undifferentiated CMAM phenotype. CMAMs express low levels of microglobulin �2, Flk1, Flt1 and AC 133, but do not stain with any of the other anti-endothelial markers; Panel B shows the phenotype of CMAM grown for 14 days with 10 ng / mL of FCEV. CMAMs express low levels of most markers associated with endothelial cells but lose AC 133 expression; and panel C shows the CMAM phenotype grown for 3-9 days with 10 ng / mL of FCEV. On day 3 of the FCEV culture the CMAMs have lost the expression of AC 133, on day 3 they have acquired the expression of Tek and VE-cadherin and on day 9 of Tie, vWF, CD34 and HIP 12.

La Fig. 4 muestra una microfotografía de un injerto y diferenciación in vivo de CMAMr. Se examinaron las Fig. 4 shows a photomicrograph of a graft and differentiation in vivo of CMAMr. The

65 preparaciones por microscopía confocal o de fluorescencía. Los paneles A, G, J, N, Q y S representan tejidos de control teñidos de manera idéntica de animales NOD-SCID a los que no se les inyectaron CMAMr. Los paneles A-F 65 preparations by confocal or fluorescence microscopy. Panels A, G, J, N, Q and S represent control tissues stained identically from NOD-SCID animals that were not injected with CMAMr. A-F panels

muestran una fotomicrografía de médula ósea (MO), obtenidas por centrifugación con una cytospin de un control (A) y un animal de estudio (B-F), teñida con un anticuerpo anti �-gal-FITC y anticuerpos conjugados con PE que reconocen varios antígenos hematopoyéticos. A-B: CD45, C: CD19, D: MAC1, E: GR1, F: TER119 y DAPI; los paneles G-I muestran una fotomicrografía de un corte de bazo de un animal de control (G) y de estudio (H, I) teñido 5 con un anticuerpo anti-�-gal-FITC y un anticuerpo anti-CD45-PE. Las células anti-�-gal+ derivadas del donante se observan en agrupaciones. H e I son amplificaciones 10X y 60X respectivamente; los paneles J-M muestran una fotomicrografía de un corte de hígado de un ratón de control (J) y un animal de estudio (K-M) teñido con anti-�-gal-FITC. J-L están teñidos conjuntamente con anticuerpos de ratón-anti-CK-18 / antirratón-Cy5 más CD45-PE y M con anticuerpos de ratón antialbúmina /antirratón-Cy3. J-K, L y M son amplificaciones 20X, 60X y 10X respectivamente; los paneles N-P muestran una fotomicrografía de una sección de intestino de un ratón de control y un animal de estudio (O-P), teñido con anticuerpos anti-�-gal-FITC más anticuerpos de ratón-anti-pan-CK / antirratón-Cy5 (N-P). N y P se tiñen conjuntamente con anticuerpos CD45-PE. Células epiteliales �-gal+Pan-CK+CD45- cubren un 50% (flecha sólida, panel P) de la circunferencia de las vellosidades. Las células Pan-CK-/ �-gal+ en el núcleo de las vellosidades (flecha abierta, panel O) teñida conjuntamente para CD45 (P); los paneles Q-R muestran una show a bone marrow photomicrograph (MO), obtained by centrifugation with a cytospin of a control (A) and a study animal (BF), stained with an anti �-gal-FITC antibody and antibodies conjugated to PE that recognize several antigens hematopoietic A-B: CD45, C: CD19, D: MAC1, E: GR1, F: TER119 and DAPI; G-I panels show a photomicrograph of a spleen section of a control (G) and study (H, I) animal stained with an anti-�-gal-FITC antibody and an anti-CD45-PE antibody. Donor-derived anti-�-gal + cells are observed in clusters. H and I are 10X and 60X amplifications respectively; J-M panels show a photomicrograph of a liver section of a control mouse (J) and a study animal (K-M) stained with anti-�-gal-FITC. J-L are stained together with mouse-anti-CK-18 / anti-mouse-Cy5 antibodies plus CD45-PE and M with anti-albumin / anti-mouse-Cy3 mouse antibodies. J-K, L and M are 20X, 60X and 10X amplifications respectively; NP panels show a photomicrograph of a bowel section of a control mouse and a study animal (OP), stained with anti-�-gal-FITC antibodies plus mouse-anti-pan-CK / anti-mouse-Cy5 antibodies ( NP). N and P are stained together with CD45-PE antibodies. Epithelial cells �-gal + Pan-CK + CD45- cover 50% (solid arrow, panel P) of the circumference of the villi. Pan-CK- / �-gal + cells in the nucleus of the villi (open arrow, panel O) stained together for CD45 (P); Q-R panels show a

15 fotomicrografía de un corte de pulmón de un ratón de control (Q) y un animal de estudio (R) teñido con anticuerpos anti-�-gal-FITC más ratón-anti-pan-CK / antirratón-Cy5 más CD45-PE. Se observan varias células �-gal+ pan-CK+ del donante recubriendo los alveolos del animal receptor (R). Se observan las células CD45+ / pan-CK- de origen hematopoyético claramente diferenciadas de las células epiteliales; y los paneles S-T muestran una fotomicrografía de un corte de un vaso sanguíneo de un ratón de control (S) y un linfoma tímico que se desarrolló en animal de estudio 16 semanas después del trasplante (T) teñido con anti-�-gal-FITC, anti-vWF-PE y TO-PRO3. Las células gal+ del donante se diferenciaron en células endoteliales vWF+ en el linfoma tímico el cual es originario del receptor, ya que las células tumorales no se tiñeron con anticuerpos anti-�-Gal. Photomicrograph of a lung section of a control mouse (Q) and a study animal (R) stained with anti-�-gal-FITC antibodies plus mouse-anti-pan-CK / anti-mouse-Cy5 plus CD45-PE. Several donor �-gal + pan-CK + cells are observed covering the alveoli of the recipient animal (R). CD45 + / pan-CK- cells of hematopoietic origin are clearly distinguished from epithelial cells; and the ST panels show a photomicrograph of a cut of a blood vessel of a control mouse (S) and a thymic lymphoma that developed in a study animal 16 weeks after transplantation (T) stained with anti-�-gal-FITC , anti-vWF-PE and TO-PRO3. Donor gal + cells differentiated into vWF + endothelial cells in thymic lymphoma which is native to the recipient, since tumor cells were not stained with anti-�-Gal antibodies.

La Fig. 5 muestra la evaluación inmunohistoquímica de células endoteliales derivadas de CMAM utilizando la 25 microscopía de fluorescencia confocal. (a) CMAM cultivadas durante 14 días con FCEV. Se observa la tinción de la membrana típica para el receptor de adhesión, av�5, y para las proteínas de las uniones adherentes, ZO-1, catenina y y. Barra de escala = 50 μm. (b) Morfología en campo claro de CMAM el día 0 (panel superior) y día 21 (panel Fig. 5 shows the immunohistochemical evaluation of endothelial cells derived from CMAM using confocal fluorescence microscopy. (a) CMAM grown for 14 days with FCEV. Typical membrane staining is observed for the adhesion receptor, av5, and for adherent junction proteins, ZO-1, catenin and y. Scale bar = 50 μm. (b) CMAM clear field morphology on day 0 (upper panel) and day 21 (panel

inferior) tras el tratamiento con FCEV. Barra = 25 μm. lower) after treatment with FCEV. Bar = 25 μm.

La Fig. 6 muestra una fotomicrografía de células endoteliales derivadas de CMAM. El panel A muestra la liberación de vWF mediada por histamina a partir de endotelio derivado de CMAM. La tinción con anticuerpos contra miosina muestra cambios citoesqueléticos que consisten en un mayor número de fibras de estrés de miosina y un ensanchamiento de las uniones de abertura (flechas) (ejemplo representativo de 3 experimentos). Barra de escala = 60 μm; el panel B muestra que el endotelio derivado de CMAM capta a-LDL. Tras 7 días, las células expresaron TieFig. 6 shows a photomicrograph of endothelial cells derived from CMAM. Panel A shows the release of histamine-mediated vWF from endothelium derived from CMAM. Staining with antibodies against myosin shows cytoskeletal changes consisting of a greater number of myosin stress fibers and a widening of the opening junctions (arrows) (representative example of 3 experiments). Scale bar = 60 μm; Panel B shows that the CMAM-derived endothelium captures a-LDL. After 7 days, the cells expressed Tie

35 1, pero de nuevo no captaron a-LDL. Sin embargo, la expresión de vVWF en el día 9 se asoció con la captación de aLDL (ejemplo representativo de 10 experimentos). Barra de escala = 100 μm; y el panel C muestra la formación del tubo vascular por parte de endotelio derivado de CMAM. Tras 6 h, se pudieron apreciar los tubos vasculares típicos (ejemplo representativo de 6 experimentos). Barra de escala = 200 μm. 35 1, but again they did not get LDL. However, vVWF expression on day 9 was associated with aLDL uptake (representative example of 10 experiments). Scale bar = 100 μm; and panel C shows the formation of the vascular tube by endothelium derived from CMAM. After 6 h, typical vascular tubes could be seen (representative example of 6 experiments). Scale bar = 200 μm.

La Fig. 7 muestra una ilustración gráfica del análisis FACS de células endoteliales derivadas de CMAM. Las gráficas muestran el perfil de tinción de IgG de control isotópico (línea delgada) vs. el perfil de tinción de un anticuerpo específico (línea gruesa) (ejemplo representativo de > 3 experimentos). El número sobre las gráficas es la intensidad fluorescente media (IFM) para la tinción de IgG de control y la tinción específica del anticuerpo. El panel A muestra que la hipoxia incrementa de manera regulada la expresión de Flk1 y Tek en las células endoteliales derivadas de Fig. 7 shows a graphic illustration of the FACS analysis of endothelial cells derived from CMAM. The graphs show the isotopic control (thin line) IgG staining profile. the staining profile of a specific antibody (thick line) (representative example of> 3 experiments). The number on the graphs is the average fluorescent intensity (IFM) for control IgG staining and antibody specific staining. Panel A shows that hypoxia regulates the expression of Flk1 and Tek in endothelial cells derived from

45 CMAM analizadas por citometría de flujo; el panel B muestra que la hipoxia incrementa de manera regulada la producción de FCEV por parte de las células endoteliales derivadas de CMAM. Se midieron por ELISA los niveles de FCEV y se muestran los resultados como la media ± EEM de 6 experimentos; y el panel C muestra que la IL-1a induce la expresión de los antígenos de HLA de clase II e incrementa la expresión de los receptores de adhesión. Las gráficas muestran el perfil de tinción de IgG de control isotópico (línea delgada) vs. el perfil de tinción de un anticuerpo específico (línea gruesa) (ejemplo representativo de 3 experimentos). El número sobre las gráficas muestra la IFM para la tinción de IgG de control y para la tinción de un anticuerpo específico. 45 CMAM analyzed by flow cytometry; Panel B shows that hypoxia increases the production of FCEV in a regulated manner by endothelial cells derived from CMAM. FCEV levels were measured by ELISA and the results are shown as the mean ± SEM of 6 experiments; and panel C shows that IL-1a induces the expression of HLA class II antigens and increases the expression of adhesion receptors. The graphs show the isotopic control (thin line) IgG staining profile. the staining profile of a specific antibody (thick line) (representative example of 3 experiments). The number on the graphs shows the MFI for staining control IgG and for staining a specific antibody.

La Fig. 8 muestra una fotomicrografía de células endoteliales derivadas de CMAM humanas. Los paneles C-F muestran las figuras reconstruidas 3D tanto para el anticuerpo anti-microglobulina-2 humana-FITC (panel C) como Fig. 8 shows a photomicrograph of endothelial cells derived from human CMAM. The C-F panels show the reconstructed 3D figures for both the human anti-microglobulin-2 antibody-FITC (panel C) and

55 para el anti-CD31 de ratón-FITC (panel D) y la unión de ambas (panel E), anti-vWF-Cy3 (panel F) y la unión de los tres patrones de tinción (panel G). Los paneles A y B muestran la imagen confocal de un único corte teñido con el anticuerpo anti-microglobulina-2 humana-FITC y anti-vWF-Cy3 o anti-CD31 de ratón-Cy5 y anti-vWF-Cy3. Barra de escala = 100 μm. El panel H muestra la curación de una herida que da como resultado un área muy vascularizada en la oreja perforada teñida con antimicroglobulina-2-FITC y anti-vWF en ratones inyectados con células endoteliales derivadas de CMAM humanas (panel superior) o fibroblastos de prepucio humano (panel inferior). Barra de escala = 20 μm. C = cartílago. D = dermis. El panel I muestra que la angiogénesis tumoral se deriva de las células endoteliales generadas in vivo a partir de CMAM y que resulta en un área muy vascularizada en el tumor teñido con anti-X32-microglobulina-FITC, anti-vWF y TOPRO-3. Barra de escala = 20 μm. 55 for the mouse anti-CD31-FITC (panel D) and the union of both (panel E), anti-vWF-Cy3 (panel F) and the union of the three staining patterns (panel G). Panels A and B show the confocal image of a single cut stained with the human anti-microglobulin-2-FITC and anti-vWF-Cy3 or anti-CD31 mouse-Cy5 and anti-vWF-Cy3 antibody. Scale bar = 100 μm. Panel H shows the healing of a wound that results in a highly vascularized area in the perforated ear stained with antimicroglobulin-2-FITC and anti-vWF in mice injected with endothelial cells derived from human CMAM (upper panel) or foreskin fibroblasts human (lower panel). Scale bar = 20 μm. C = cartilage. D = dermis. Panel I shows that tumor angiogenesis is derived from endothelial cells generated in vivo from CMAM and results in a highly vascularized area in the tumor stained with anti-X32-microglobulin-FITC, anti-vWF and TOPRO-3. Scale bar = 20 μm.

65 La Fig. 9 muestra el comportamiento en espigas y las corrientes de sodio dependientes de voltaje expresadas en células similares a las neuronas derivadas de CMMh. El panel A muestra una fotomicrografía de neuronas derivadas de CMMh cultivadas que muestran un comportamiento en espigas y expresan corrientes de sodio dependientes de voltaje (la sombra de la pipeta apunta hacia la célula). El panel B muestra ilustraciones gráficas de registros del pinzamiento de corriente de una neurona derivada de una CMMh. El panel C muestra ilustraciones gráficas de trazas de corriente a las que se les han sustraído las fugas de la misma neurona derivada de CMMh. 65 Fig. 9 shows the behavior in spikes and the voltage-dependent sodium currents expressed in cells similar to CMMh-derived neurons. Panel A shows a photomicrograph of cultured CMMh-derived neurons that show spike behavior and express voltage-dependent sodium currents (the shadow of the pipette points towards the cell). Panel B shows graphic illustrations of current clamp records of a neuron derived from a CMMh. Panel C shows graphic illustrations of current traces to which the leaks of the same CMMh-derived neuron have been subtracted.

5 La Fig. 10 muestra análisis por inmunoelectrotransferencia y RT-PCR cuantitativa que confirman el fenotipo de tipo hepatocítico. Los paneles A y B muestran CMAMr (A) y CMAMh (B) cultivadas en Matrigel™ con FCF4 y FCH o FCF4 solo durante 21 y 28 días respectivamente. Para aFP, Cyp2b9 y Cyp2b13, los números bajo las membranas son relativos al ARNm del hígado, ya que no se detectaron transcritos en CMAM indiferenciadas. Li = ARNm 5 Fig. 10 shows immunoelectrotransfer analysis and quantitative RT-PCR confirming the hepatocyte type phenotype. Panels A and B show CMAMr (A) and CMAMh (B) grown in Matrigel ™ with FCF4 and FCH or FCF4 only for 21 and 28 days respectively. For aFP, Cyp2b9 and Cyp2b13, the numbers under the membranes are relative to the mRNA of the liver, since no transcripts were detected in undifferentiated CMAM. Li = mRNA

10 hepático de humanos o de ratón; NT = sin plantilla. Ejemplo representativo de 5 estudios en ratones y 1 estudio en humanos, el panel C muestra CMAMh (B) cultivadas en Matrigel™ con FCF4 y FCH o FCF4 solo durante 21 días. FH = CMAMh inducidas por FCH y FCF4 en Matrigel™, Huh = línea celular Huh7 utilizada como control. 10 human or mouse liver; NT = no template. Representative example of 5 studies in mice and 1 study in humans, panel C shows CMAMh (B) grown in Matrigel ™ with FCF4 and FCH or FCF4 for only 21 days. FH = CMAMh induced by FCH and FCF4 in Matrigel ™, Huh = Huh7 cell line used as a control.

La Fig. 11 muestra una fotomicrografía de células de tipo hepatocítico. Las CMAM inducidas por FCF4 producen 15 glucógeno. Se aprecia el almacenamiento de glucógeno como una acumulación de manchas oscuras (ejemplo representativo de 3 estudios). Barra de escala = 25 μm. Fig. 11 shows a photomicrograph of hepatocytic type cells. CMF-induced CMAMs produce 15 glycogen. Glycogen storage is seen as an accumulation of dark spots (representative example of 3 studies). Scale bar = 25 μm.

Descripción detallada de la invención Detailed description of the invention

20 Definiciones 20 Definitions

Tal como se emplean en la presente, los siguientes términos y expresiones tienen los siguientes significados: As used herein, the following terms and expressions have the following meanings:

El término “expansión” se refiere a la propagación de una célula sin diferenciación. The term "expansion" refers to the propagation of a cell without differentiation.

25 La expresión “células intermediarias” se refiere a células producidas durante la diferenciación de una CMAM que poseen algunas pero no todas las características de una CMAM o su progenie totalmente diferenciada. Las células intermediarias pueden ser células progenitoras que están comprometidas con una ruta específica, pero no con un tipo celular específico. The term "intermediary cells" refers to cells produced during the differentiation of a CMAM that possess some but not all the characteristics of a CMAM or its totally differentiated progeny. Intermediary cells can be progenitor cells that are committed to a specific path, but not to a specific cell type.

30 El término “normal” se refiere a un animal que no sufre una malformación, mutación o enfermedad, es decir, animales sanos. 30 The term "normal" refers to an animal that does not suffer from a malformation, mutation or disease, that is, healthy animals.

El término “autorrenovación” se refiere a la capacidad de las células para propagarse sin la adición de una 35 estimulación externa. La presencia de citocinas u otros factores de crecimiento producidos localmente en el órgano o tejido no constituye una estimulación externa. The term "self-renewal" refers to the ability of cells to propagate without the addition of external stimulation. The presence of cytokines or other growth factors produced locally in the organ or tissue does not constitute external stimulation.

El término “dirigirse” se refiere a la capacidad de ciertas CMAM o su progenie para migrar de manera específica a sitios donde se puedan necesitar células adicionales. 40 La expresión “inhibir la expresión” se refiere a la eliminación de la función de un gen particular. The term "target" refers to the ability of certain CMAMs or their progeny to migrate specifically to sites where additional cells may be needed. The term "inhibit expression" refers to the elimination of the function of a particular gene.

Tal como se emplea en la presente, la expresión “composición genómica o proteómica” se refiere a los componentes proteicos o génicos de una célula dada. As used herein, the term "genomic or proteomic composition" refers to the protein or gene components of a given cell.

45 Los “niveles elevados de actividad telomerasa” se pueden correlacionar con la duplicación del nivel observada en la línea celular humana inmortal MCF7. Soule et al. (1973) J. Cancer Inst. 51:1409-1416. 45 "High levels of telomerase activity" can be correlated with doubling the level observed in the immortal human cell line MCF7. Soule et al. (1973) J. Cancer Inst. 51: 1409-1416.

Aplicación de esta tecnología Application of this technology

50 La tecnología de las CMAM se podría emplear para reemplazar células inertes, disfuncionales, enfermas o dañadas en el cuerpo de un mamífero. Además, estas células se podrían inyectar en el receptor utilizando células alogénicas 50 CMAM technology could be used to replace inert, dysfunctional, diseased or damaged cells in the body of a mammal. In addition, these cells could be injected into the receptor using allogeneic cells.

o autólogas con o sin soportes artificiales o naturales, matrices o polímeros para corregir la pérdida de células, función anormal de células u órganos, p. ej., genética tales como mutaciones de genes que afectan a una función or autologous with or without artificial or natural supports, matrices or polymers to correct cell loss, abnormal function of cells or organs, e.g. eg, genetics such as gene mutations that affect a function

55 proteica tal como la anemia drepanocítica, hemofilia o “tesaurismosis” donde los productos se acumulan en el cuerpo debido a un procesamiento defectuoso, p. ej., enfermedad de Gaucher, enfermedad de Niemann-Pick, mucopolisacaridosis, etc. Algunos ejemplos de la restitución de células inertes o moribundas podrían ser el uso de CMAM o su progenie diferenciada en el tratamiento de la degeneración macular y otras enfermedades neurodegenerativas. 55 protein such as sickle cell anemia, hemophilia or "thesaurisms" where products accumulate in the body due to defective processing, e.g. eg, Gaucher disease, Niemann-Pick disease, mucopolysaccharidosis, etc. Some examples of restitution of inert or dying cells could be the use of CMAM or its differentiated progeny in the treatment of macular degeneration and other neurodegenerative diseases.

60 Dada la capacidad de hacer que estas CMAM “se dirijan” y se incorporen a los órganos/tejidos de un animal receptor, proliferen y se diferencien, podrían emplearse potencialmente para proporcionar nuevas células endoteliales a un corazón isquémico y también las propias células de miocardio. Existen muchos otros ejemplos diferentes. 60 Given the ability to make these CMAMs "target" and incorporate into the organs / tissues of a recipient animal, proliferate and differentiate, they could potentially be used to provide new endothelial cells to an ischemic heart and also myocardial cells themselves . There are many other different examples.

65 Puede haber circunstancias médicas donde los beneficios transitorios en la función de órganos o tejidos podrían tener los efectos deseables. Por ejemplo, existen casos en la actualidad de pacientes con insuficiencia hepática conectados a un hígado bioartificial, lo cual ha sido suficiente para permitir la recuperación de la función hepática normal, obviando la necesidad de un trasplante hepático. Esta constituye una seria necesidad médica no cubierta, 65 There may be medical circumstances where the transitory benefits in the function of organs or tissues could have the desirable effects. For example, there are currently cases of patients with hepatic impairment connected to a bioartificial liver, which has been sufficient to allow the recovery of normal liver function, obviating the need for a liver transplant. This constitutes a serious unmet medical need,

5 por ejemplo en una enfermedad hepática específica – la hepatitis C. En la actualidad existen 4-5 millones de americanos infectados con hepatitis C y se estima que un 50% de esta población contraerá cirrosis y necesitará un trasplante hepático. Este constituye un enorme problema de salud pública para el cual se necesita urgentemente un remedio. Los hepatocitos, derivados de CMAM autólogas o alogénicas, se pueden trasplantar en esta o en otras enfermedades hepáticas. Tales trasplantes pueden o bien proporcionar la función hepática de manera transitoria para permitir la recuperación de las células hepáticas del propio receptor o bien repoblar de manera permanente un hígado dañado para permitir la recuperación de la función hepática normal a través de las células del donante. 5 for example in a specific liver disease - hepatitis C. There are currently 4-5 million Americans infected with hepatitis C and it is estimated that 50% of this population will get cirrhosis and will need a liver transplant. This constitutes a huge public health problem for which a remedy is urgently needed. Hepatocytes, autologous or allogeneic CMAM derivatives, can be transplanted in this or other liver diseases. Such transplants can either provide liver function transiently to allow recovery of liver cells from the recipient itself or permanently repopulate a damaged liver to allow recovery of normal liver function through donor cells.

Además de muchas terapias celulares donde se administran las CMAM indiferenciadas a un humano o a otro mamífero para que se diferencien a continuación en células específicas en el donante, la progenie de las CMAM se 15 podría diferenciar ex vivo y a continuación administrarse como células purificadas o incluso como mezclas de células para proporcionar un beneficio terapéutico. Estas CMAM en estado indiferenciado también se podrían utilizar como portadores o vehículos para suministrar fármacos o moléculas terapéuticamente beneficiosas. Esto podría emplearse para tratar cualquiera de las diferentes enfermedades que incluyen, pero sin carácter limitante, cáncer, enfermedad cardiovascular, inflamatoria, inmunitaria, infecciones, etc. De modo que, por ejemplo, se podría administrar a un paciente una célula, tal vez una célula endotelial que expresa una molécula nueva o niveles altos de una molécula angiogénica, la cual se incorporaría en los vasos sanguíneos existentes para promover la angiogénesis, por ejemplo, en el corazón; del mismo modo se podrían tener células endoteliales que producen moléculas que podrían suprimir la angiogénesis que se podrían incorporar en las células sanguíneas e inhibir su formación posterior, por ejemplo, en la retinopatía diabética o en el cáncer donde la formación de nuevos vasos In addition to many cell therapies where undifferentiated CMAMs are administered to a human or other mammal so that they are then differentiated into specific cells in the donor, the progeny of the CMAMs could be differentiated ex vivo and then administered as purified cells or even as cell mixtures to provide a therapeutic benefit. These CMAMs in an undifferentiated state could also be used as carriers or vehicles to deliver therapeutically beneficial drugs or molecules. This could be used to treat any of the different diseases that include, but are not limited to, cancer, cardiovascular, inflammatory, immune, infections, etc. So, for example, a cell could be administered to a patient, perhaps an endothelial cell that expresses a new molecule or high levels of an angiogenic molecule, which would be incorporated into existing blood vessels to promote angiogenesis, for example , in the heart; In the same way, endothelial cells that produce molecules that could suppress angiogenesis that could be incorporated into blood cells and inhibit their subsequent formation, for example, in diabetic retinopathy or cancer where the formation of new vessels

25 sanguíneos es clave en la patogénesis, propagación y extensión de la enfermedad. 25 blood is key in the pathogenesis, spread and spread of the disease.

La capacidad de poblar la MO y de generar sangre ex vivo posee un uso incalculable en importantes aplicaciones médicas. Por ejemplo, en lo que respecta a la producción ex vivo de sangre, la transfusión de sangre y productos sanguíneos en todo el mundo todavía se lleva a cabo con una seguridad variable debido a la transmisión de agentes infecciosos. Las transfusiones de sangre han provocado VIH, hepatitis C y B y en la actualidad la amenaza inminente de las vacas locas o la enfermedad de Creuzfeldt-Jakob, ECJ. La capacidad de generar sangre in vitro, especialmente eritrocitos, podría proporcionar una alternativa segura y fiable a la extracción de sangre de personas. Puede que nunca reemplace totalmente la extracción de sangre de donantes. Las CMAMh o su progenie hematopoyética se podrían introducir en el útero de animales tal como las ovejas las cuales podrían formar células The ability to populate the MO and generate blood ex vivo has an incalculable use in important medical applications. For example, with regard to the ex vivo production of blood, the transfusion of blood and blood products throughout the world is still carried out with variable safety due to the transmission of infectious agents. Blood transfusions have caused HIV, hepatitis C and B and currently the imminent threat of crazy cows or Creuzfeldt-Jakob disease, ECJ. The ability to generate blood in vitro, especially erythrocytes, could provide a safe and reliable alternative to blood collection from people. You may never completely replace donor blood collection. CMAMh or its hematopoietic progeny could be introduced into the uterus of animals such as sheep which could form cells

35 hematopoyéticas humanas y servir como fuente componentes sanguíneos humanos o proteínas de utilidad terapéutica. Lo mismo podría aplicarse a hepatocitos, islotes o muchos otros tipos celulares pero proporcionaría una alternativa a la producción de células humanas in vitro y el uso de animales como fábricas de células. También podría ser de utilidad en la escasez de sangre que se predice que tendrá lugar. Las CMAMh también podrían posiblemente trasplantarse en un embrión humano para corregir uno cualquiera de una serie de defectos. 35 human hematopoietic and serve as a source human blood components or proteins of therapeutic utility. The same could apply to hepatocytes, islets or many other cell types but would provide an alternative to the production of human cells in vitro and the use of animals as cell factories. It could also be useful in the blood shortage that is predicted to take place. CMAMh could also possibly be transplanted into a human embryo to correct any one of a series of defects.

Debido a que las CMAM pueden dar lugar a poblaciones clonales de células diferenciadas de manera específica, suponen una plataforma rica para el descubrimiento de fármacos. Esto podría implicar llevar a cabo la expresión génica, analizar la expresión génica, descubrir nuevas pautas de activación activadas por genes, proteómica y pautas de expresión proteica y modificación que las rodean. Esto podría analizarse mediante herramientas Because CMAMs can lead to clonal populations of specifically differentiated cells, they are a rich platform for drug discovery. This could involve carrying out gene expression, analyzing gene expression, discovering new activation patterns activated by genes, proteomics and patterns of protein expression and modification that surround them. This could be analyzed using tools

45 bioinformáticas, utilizando bases de datos y algoritmos para el análisis de estos datos en comparación con las bases de datos de dominio público o privadas. La información de cómo podrían actuar agentes o fármacos conocidos podría compararse con la información derivada de las CMAM, su progenie diferenciada y de un población de personas que podría estar disponible. Se podrían identificar rutas, dianas y receptores. Se podría descubrir que nuevos fármacos, anticuerpos u otros compuestos pueden producir respuestas biológicamente deseables. De manera análoga, las CMAM y su progenie diferenciada se podrían emplear como dispositivos de control de respuestas indeseadas, junto con las bases de datos, herramientas bioinformáticas y algoritmos. 45 bioinformatics, using databases and algorithms for the analysis of this data compared to public or private domain databases. Information on how known agents or drugs could act could be compared with information derived from CMAMs, their differentiated progeny and a population of people that might be available. Routes, targets and receptors could be identified. It could be discovered that new drugs, antibodies or other compounds can produce biologically desirable responses. Similarly, CMAMs and their differentiated progeny could be used as control devices for unwanted responses, together with databases, bioinformatics tools and algorithms.

Estas CMAM derivadas de un humano, ratón, rata u otro mamífero parecen ser la única célula somática (célula no germinal), no maligna, normal que se conoce hasta la fecha que expresa niveles muy altos de telomerasa incluso en These CMAMs derived from a human, mouse, rat or other mammal appear to be the only somatic cell (non-germ cell), non-malignant, normal known to date that expresses very high levels of telomerase even in

55 células en pases avanzados. Los telómeros están extendidos en las CMAM y son cariotípicamente normales. Debido a que las CMAM inyectadas en un mamífero se dirigen a varios órganos, existe la posibilidad de que las CMAM recién llegadas a un órgano particular puedan ser autorrenovables. Como tal, poseen el potencial de repoblar un órgano no solamente por sí mismas sino también con tipos celulares diferenciados autorrenovables que podrían haber sido dañados, haber muerto o que podrían tener una función anormal debido a una enfermedad adquirida o genética. 55 cells in advanced passes. Telomeres are widespread in CMAMs and are karyotypically normal. Because CMAMs injected into a mammal target several organs, there is a possibility that newly arrived CMAMs to a particular organ may be self-renewable. As such, they have the potential to repopulate an organ not only by themselves but also with self-renewed differentiated cell types that could have been damaged, died or could have abnormal function due to an acquired or genetic disease.

Por ejemplo en la diabetes de tipo I tiene lugar una pérdida progresiva de células beta productoras de insulina en los islotes pancreáticos. En varias enfermedades renales tiene lugar una pérdida progresiva de la función y en algunos casos la obstrucción del glomérulo. En el caso de la diabetes, las CMAM o la progenie diferenciada podrían dirigirse 65 hacia el páncreas y ellas mismas o mediante la interacción con las células endógenas en el páncreas, inducir la formación de islotes. Esto podría tener un impacto reparador en la diabetes. En última instancia, se podrían For example, in type I diabetes there is a progressive loss of insulin-producing beta cells in pancreatic islets. In several renal diseases a progressive loss of function and in some cases the obstruction of the glomerulus takes place. In the case of diabetes, the CMAM or the differentiated progeny could be directed towards the pancreas and themselves or by interacting with the endogenous cells in the pancreas, inducing the formation of islets. This could have a restorative impact on diabetes. Ultimately, they could

descubrir condiciones, agentes o fármacos para controlar in vivo, es decir, promover o inhibir la capacidad de autorrenovación de las CMAM y controlar, o potenciar o inhibir el movimiento de una progenie diferenciada, p.ej., precursores de islotes, precursores de hepatocitos, precursores sanguíneos, precursores cardíacos y/o neurales utilizando CMAM se encontrarán probablemente rutas, métodos de activación y control que podrían inducir a las discover conditions, agents or drugs to control in vivo, that is, promote or inhibit the self-renewal capacity of CMAMs and control, or enhance or inhibit the movement of a differentiated progeny, e.g., islet precursors, hepatocyte precursors , blood precursors, cardiac and / or neural precursors using CMAM will probably find routes, activation and control methods that could induce the

5 células precursoras endógenas a proliferar y diferenciarse en un órgano. 5 endogenous precursor cells to proliferate and differentiate into an organ.

Esta misma capacidad para repoblar un tejido celular o un compartimento de un órgano y autorrenovarse y también diferenciarse podría tener numerosos usos y poseer una utilidad sin precedentes para ofrecer soluciones a las necesidades médicas no cubiertas. De modo que, por ejemplo, ciertas enfermedades genéticas donde existen deficiencias enzimáticas se han tratado mediante un trasplante de MO. A menudo esto puede ayudar pero no cura las complicaciones de la enfermedad donde pueden persistir los efectos residuales de la enfermedad en el cerebro, los huesos o en otro sitio. Las CMAM y las CMAM modificadas por ingeniería genética ofrecen la esperanza de mejorar numerosas enfermedades genéticas y adquiridas. También son útiles con fines investigadores y diagnósticos y en el descubrimiento de fármacos. This same ability to repopulate a cellular tissue or an organ compartment and self-renew and also differentiate could have numerous uses and have an unprecedented utility to offer solutions to unmet medical needs. So, for example, certain genetic diseases where there are enzymatic deficiencies have been treated by an MO transplant. This can often help but does not cure the complications of the disease where the residual effects of the disease may persist in the brain, bones or elsewhere. CMAMs and CMAMs modified by genetic engineering offer the hope of improving numerous genetic and acquired diseases. They are also useful for investigative and diagnostic purposes and in drug discovery.

15 La presente invención también proporciona métodos para el descubrimiento de fármacos, genómica, proteómica y rutas de identificación; comprende analizar la composición genómica o proteómica de una CMAM, junto con el análisis de estas mediante herramientas bioinformáticas, análisis informáticos mediante algoritmos, para ensamblar y comparar bases de datos conocidas y nuevas, y comparar y contraer estas. Esto identificará componentes claves, rutas, nuevos genes y/o nuevas pautas de expresión proteica y génica, y modificación proteica (proteómica) que podría llevar a la definición de dianas para nuevos compuestos, anticuerpos, proteínas, compuestos orgánicos de peso molecular bajo u otras moléculas biológicamente activas que podrían suponer un beneficio terapéutico. The present invention also provides methods for the discovery of drugs, genomics, proteomics and identification routes; It includes analyzing the genomic or proteomic composition of a CMAM, together with their analysis using bioinformatics tools, computer analysis using algorithms, to assemble and compare known and new databases, and compare and contract these. This will identify key components, pathways, new genes and / or new patterns of protein and gene expression, and protein (proteomic) modification that could lead to the definition of targets for new compounds, antibodies, proteins, organic compounds of low molecular weight or other biologically active molecules that could be a therapeutic benefit.

EJEMPLOS EXAMPLES

25 Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar pero no limitan la invención. The following examples are provided to illustrate but do not limit the invention.

Ejemplo 1. Selección, cultivo y caracterización de células madre adultas multipotentes de ratón (CMAMR) Example 1. Selection, culture and characterization of multipotent adult mouse stem cells (CMAMR)

Aislamiento celular y expansión Cellular isolation and expansion

Todos los tejidos se obtuvieron de acuerdo con las directrices del IACUC de la Universidad de Minnesota. Se obtuvieron células mononucleares de MO (CMNMO) mediante la separación ficoll-hypaque de MO obtenida de ratones C57/BL6 o ratones ROSA26 de 5-6 semanas. De manera alternativa, se obtuvo tejido cerebral y muscular All tissues were obtained according to the IACUC guidelines of the University of Minnesota. MO mononuclear cells (CMNMO) were obtained by ficoll-hypaque separation of MO obtained from C57 / BL6 mice or ROSA26 mice of 5-6 weeks. Alternatively, brain and muscle tissue was obtained

35 de 129 ratones de 3 días de edad. Se extirparon músculos de las partes proximales de las patas delanteras y traseras, y se trocearon completamente. Se trató el tejido con colagenasa al 0,2% (Sigma Chemical Co, San Luis, MO) durante 1 hora a 37 ºC, seguido de tripsina al 0,1% (Invitrogen, Grand Island, NY) durante 45 minutos. A continuación se trituraron las células vigorosamente y se pasaron a través de un filtro de 70 μm. Se recogieron las suspensiones celulares y se centrifugaron durante 10 minutos a 1600 rpm. Se diseccionaron los tejidos cerebrales y se trocearon completamente. Se disociaron las células por incubación con tripsina al 0,1% y ADNasa al 0,1% (Sigma) durante 30 minutos a 37 ºC. A continuación se trituraron vigorosamente las células y se pasaron a través de un filtro de 70 μm. Se recogió la suspensión celular y se centrifugó durante 10 minutos a 1600 rpm. 35 of 129 mice 3 days old. Muscles were removed from the proximal parts of the front and back legs, and completely chopped. The tissue was treated with 0.2% collagenase (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) for 1 hour at 37 ° C, followed by 0.1% trypsin (Invitrogen, Grand Island, NY) for 45 minutes. The cells were then crushed vigorously and passed through a 70 µm filter. The cell suspensions were collected and centrifuged for 10 minutes at 1600 rpm. Brain tissues were dissected and completely chopped. The cells were dissociated by incubation with 0.1% trypsin and 0.1% DNase (Sigma) for 30 minutes at 37 ° C. The cells were then vigorously crushed and passed through a 70 µm filter. The cell suspension was collected and centrifuged for 10 minutes at 1600 rpm.

Se colocaron en placas suspensiones de cerebro, músculo o CMNMO con una concentración de 1 x 105/cm2 en Suspensions of brain, muscle or CMNMO suspensions with a concentration of 1 x 105 / cm2 were placed in

45 medio de expansión [FCS al 2% en medio esencial mínimo de Dulbecco bajo en glucosa (LG-DMEM, por sus siglas en inglés), 10 ng/mL de cada uno de los siguientes factores: factor de crecimiento derivado de plaquetas (FCDP), factor de crecimiento epidérmico (FCE) y factor inhibidor de la leucemia (FIL)] y se mantuvieron a 5 x 103/cm2. Tras 3-4 semanas, se eliminaron con microesferas magnéticas las células CD45+/glucoforina (Gly)-A+ de las células recuperadas por tripsina/EDTA. Las células CD45-/Gly-A- se colocaron de nuevo en placas con una concentración de 10 células/pocillo en placas de 96 pocillos recubiertas con FN y se expandieron en una densidad celular comprendida entre 0,5 y 1,5 x 103/cm2. El potencial de expansión de las CMAM fue similar independientemente del tejido a partir del cual se derivaron (Fig. 1). 45 expansion medium [2% FCS in minimum essential glucose medium of Dulbecco (LG-DMEM), 10 ng / mL of each of the following factors: platelet-derived growth factor (FCDP ), epidermal growth factor (FCE) and leukemia inhibitor factor (FIL)] and were maintained at 5 x 103 / cm2. After 3-4 weeks, CD45 + / glucoforin (Gly) -A + cells were removed with magnetic microspheres recovered by trypsin / EDTA. CD45- / Gly-A- cells were placed back in plates with a concentration of 10 cells / well in 96-well plates coated with FN and expanded in a cell density between 0.5 and 1.5 x 103 / cm2 The expansion potential of CMAMs was similar regardless of the tissue from which they were derived (Fig. 1).

Caracterización de las CMAM CMAM characterization

55 Fenotípicamente, las CMAMr derivadas de MO, músculo y cerebro, y cultivadas en FN fueron CD13+, CD44-, CD45-, (antígeno de histocompatibilidad de clase I y clase II)-, Flklbajo y cKit-, idénticas a las características de las CMAMh, tal como se describen en la solicitud internacional N.º PCT/US00/21387. Aunque la expansión celular durante los 2-3 meses iniciales fue mayor cuando las células se cultivaron en colágeno de tipo IV, laminina o Matrigel™, las células poseyeron características fenotípicas de CMM, es decir, expresaron CD44 y no expresaron CD13. Al igual que con las células humanas, las CMAMr cultivadas en FN expresaron los transcritos de oct-4 y el R-FIL. 55 Phenotypically, the CMAMr derived from MO, muscle and brain, and cultured in FN were CD13 +, CD44-, CD45-, (histocompatibility class I and class II antigen) -, Flklbajo and cKit-, identical to the characteristics of the CMAMh, as described in international application No. PCT / US00 / 21387. Although the cell expansion during the initial 2-3 months was greater when the cells were cultured in type IV collagen, laminin or Matrigel ™, the cells possessed phenotypic characteristics of CMM, that is, they expressed CD44 and did not express CD13. As with human cells, CMAMr cultured in FN expressed the transcripts of oct-4 and R-FIL.

Aproximadamente un 1% de los pocillos en los que se colocaron células 10 CD45-/GlyA- dieron cultivos de crecimiento continuo. Esto sugiere que las células capaces de iniciar cultivos de CMAM son raras y probablemente Approximately 1% of the wells in which 10 CD45- / GlyA- cells were placed gave continuous growth cultures. This suggests that cells capable of starting CMAM cultures are rare and probably

65 suponen menos de un 1/1000 de las células CD45-/G1yA-. Las CMAMr cultivadas en FN presentaron un diámetro de 8-10 μm con un núcleo grande y un citoplasma escaso. Varias poblaciones se han cultivado durante > 100 DP (número de veces que se duplicó la población celular). La morfología y fenotipo de las células permaneció invariante durante todo el cultivo. 65 account for less than 1/1000 of the CD45- / G1yA- cells. The CMAMr cultured in FN had a diameter of 8-10 μm with a large nucleus and a small cytoplasm. Several populations have been cultivated for> 100 DP (number of times the cell population doubled). The morphology and phenotype of the cells remained invariant throughout the culture.

Se recolectaron las CMAMr que habían experimentado 40 y 102 DP y se evaluó la longitud de los telómeros. La CMAMr that had experienced 40 and 102 DP were collected and telomere length was evaluated. The

5 longitud del telómero se midió utilizando el kit de ensayo para la longitud del telómero de Pharmingen (Nueva Jersey, EE. UU.) de acuerdo con las recomendaciones del productor. La longitud media del telómero (LMT) de las CMAMr cultivadas durante 40 DP fue de 27 Kb. Cuando se evaluaron de nuevo tras 102 DP, la LMT permaneció invariante. Para el cariotipado de las CMAMr, se subcultivaron las células con una dilución 1:2, 12 h antes de la recolección, se aislaron con tripsina-EDTA y se sometieron a una incubación de 1,5 h con colcemida seguido de lisis The telomere length was measured using the Pharmingen telomere length test kit (New Jersey, USA) according to the producer's recommendations. The average telomere length (LMT) of the CMAMr cultured during 40 DP was 27 Kb. When evaluated again after 102 DP, the LMT remained invariant. For the karyotype of the CMAMr, the cells were subcultured with a 1: 2 dilution, 12 h before collection, isolated with trypsin-EDTA and subjected to a 1.5 h incubation with colcemide followed by lysis

10 con KCl hipotónico y fijación en ácido/alcohol tal como se describió previamente (Verfaillie et al., 1992). El análisis citogenético se llevo a cabo mensualmente y mostró un cariotipo normal, excepto para una única población que se convirtió en hiperdiploide tras 45 DP, la cual no se usó posteriormente para los estudios. 10 with hypotonic KCl and acid / alcohol fixation as previously described (Verfaillie et al., 1992). The cytogenetic analysis was carried out monthly and showed a normal karyotype, except for a single population that became hyperdiploid after 45 DP, which was not used later for the studies.

Las CMAM murinas obtenidas después de 46 y hasta >80 DP se ensayaron mediante (Q)-RT-PCR (Q = cuantitativa) Murine CMAMs obtained after 46 and up to> 80 DP were tested by (Q) -RT-PCR (Q = quantitative)

15 para determinar los niveles de expresión de Oct4 y RexI, dos factores de transcripción importantes en el mantenimiento del estado indiferenciado de las células ME. Se extrajo ARN de CMAM de ratón, progenie diferenciada neuroectodérmica (día 1-7 tras la adición de FCFb) y células ME de ratón. Se transcribió de manera inversa el ARN y el ADNc resultante se sometió a 40 ciclos de amplificación (ABI PRISM 7700, Perkin Elmer/Applied Biosystems) en las siguientes condiciones de reacción: 40 ciclos de una PCR de dos etapas (95 ºC durante 15 15 to determine the expression levels of Oct4 and RexI, two important transcription factors in maintaining the undifferentiated state of ME cells. Mouse CMAM RNA, neuroectodermal differential progeny (day 1-7 after the addition of FCFb) and mouse ME cells were extracted. RNA was reverse transcribed and the resulting cDNA was subjected to 40 cycles of amplification (ABI PRISM 7700, Perkin Elmer / Applied Biosystems) under the following reaction conditions: 40 cycles of a two-stage PCR (95 ° C for 15 ° C).

20 segundos, 60 ºC durante 60 segundos) tras la desnaturalización inicial (95 ºC durante 10 minutos) con 2 μL de solución de ADN, tampón de reacción para PCR TaqMan SYBR Green Universal Mix 1X. Los cebadores se enumeran en la Tabla 1. 20 seconds, 60 ° C for 60 seconds) after initial denaturation (95 ° C for 10 minutes) with 2 μL of DNA solution, reaction buffer for TaqMan SYBR Green Universal Mix 1X PCR. The primers are listed in Table 1.

Tabla 1: Cebadores utilizados Table 1: Primers used

NEO NEO

5'-TGGATTGCACGCAGGTTCT-3' 5'-TGGATTGCACGCAGGTTCT-3 '

5'-TTCGCTTGGTGGTCGAATG-3' 5'-TTCGCTTGGTGGTCGAATG-3 '

Oct4 Oct4

5'-GAAGCGTTTCTCCCTGGATT-3' 5'-GAAGCGTTTCTCCCTGGATT-3 '

5'-GTGTAGGATTGGGTGCGTT-3' 5'-GTGTAGGATTGGGTGCGTT-3 '

Rcx 1 Rcx 1

5'-GAAGCGTTCTCCCTGGAATTTC-3' 5'-GAAGCGTTCTCCCTGGAATTTC-3 '

5'-GTGTAGGATTGGGTGCGTTT-3' 5'-GTGTAGGATTGGGTGCGTTT-3 '

otx 1 otx 1

5'-GCTGTTCGCAAAGACTCGCTAC-3' 5'-GCTGTTCGCAAAGACTCGCTAC-3 '

5'-ATGGCTCTGGCACTGATACGGATG-3' 5'-ATGGCTCTGGCACTGATACGGATG-3 '

otx2 otx2

5'-CCATGACCTATACTCAGGCTTCAGG-3' 5'-CCATGACCTATACTCAGGCTTCAGG-3 '

5'-GAAGCTCCATATCCCTGGGTGGAAAG-3' 5'-GAAGCTCCATATCCCTGGGTGGAAAG-3 '

Nestin 5' Nestin 5 '

5'-GGAGTGTCGCTTAGAGGTGC-3' 5'-GGAGTGTCGCTTAGAGGTGC-3 '

5'-TCCAGAAAGCCAAGAGAAGC-3' 5'-TCCAGAAAGCCAAGAGAAGC-3 '

Se normalizaron los niveles de ARNm utilizando GADPH como gen constitutivo y se compararon con los niveles en las células ME de ratón. Los ARNm de Oct4 y Rex 1 estuvieron presentes en niveles similares en CMAM derivadas de MO, músculo y cerebro. Los niveles de ARNm de RexI fueron similares en CMAMr y células MEr, mientras que MRNA levels were normalized using GADPH as a constitutive gene and compared with levels in mouse ME cells. Oct4 and Rex 1 mRNAs were present at similar levels in CMAM derived from MO, muscle and brain. RexI mRNA levels were similar in CMAMr and MEr cells, while

30 los niveles de ARNm de Oct4 fueron aproximadamente 1000 veces menores en las CMAM que en las células ME. 30 Oct4 mRNA levels were approximately 1000 times lower in CMAMs than in ME cells.

El perfil génico expresado de CMAM derivadas de MO, músculo y cerebro de ratón es muy similar The expressed gene profile of CMAM derived from MO, muscle and mouse brain is very similar

Para evaluar de manera adicional si las CMAM derivadas de diferentes tejidos eran similares, se examinó el perfil To further assess whether CMAMs derived from different tissues were similar, the profile was examined.

35 génico expresado por CMAM derivadas de MO, músculo y cerebro utilizando la micromatriz génica U74A de Affimetrix. Resumiendo, se extrajo ARNm de 2-3 x 106 CMAM derivadas de MO, músculo o cerebro, cultivadas durante 45 duplicaciones de la población. La preparación del ADNc, la hibridación con la micromatriz U74A que contenía 6000 genes murinos y 6000 grupos de EST (secuencias de identificación expresadas, siglas en inglés) y la adquisición de los datos se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (todos de Affimetrix, Gene gene expressed by CMAM derived from MO, muscle and brain using the U74A gene microarray of Affimetrix. In summary, 2-3 x 106 CMAM mRNA derived from MO, muscle or brain, cultured during 45 duplications of the population was extracted. The cDNA preparation, hybridization with the U74A microarray containing 6000 murine genes and 6000 EST groups (expressed identification sequences) and data acquisition were carried out in accordance with the manufacturer's recommendations (all from Affimetrix,

40 Santa Clara, CA). El análisis de los datos se llevó a cabo utilizando el software GeneChip® (Affimetrix). Se consideró significativo un aumento o descenso en una proporción de 2,2 (Iyer V.R. et al., 1999; Scherf U. et al. 2000; Alizadeh 40 Santa Clara, CA). Data analysis was carried out using GeneChip® software (Affimetrix). An increase or decrease in a proportion of 2.2 was considered significant (Iyer V.R. et al., 1999; Scherf U. et al. 2000; Alizadeh

A.A. et al., 2000). Se determinó el valor r2 utilizando un análisis de regresión lineal (Fig. 2). A.A. et al., 2000). The R2 value was determined using a linear regression analysis (Fig. 2).

La comparación entre el perfil génico expresado por CMAM de los tres tejidos mostró que <1% de los genes fueron The comparison between the gene profile expressed by CMAM of the three tissues showed that <1% of the genes were

45 expresados en niveles que diferían en una proporción > 2,2 en las CMAM de MO respecto a las CMAM de músculo. De manera análoga, únicamente <1% de los genes fueron expresados en un nivel que difería en una proporción >2,2 en las CMAM derivadas de MO respecto a las de cerebro. Ya que el coeficiente de correlación entre las diferentes poblaciones de CMAM fue >0,975, se concluyó que las CMAM derivadas de los diferentes tejidos son extremadamente homólogas, en línea con el fenotipo descrito anteriormente y las características de diferenciación descritas en el Ejemplo 5. 45 expressed in levels that differed by a proportion> 2.2 in CM CMAMs compared to muscle CMAMs. Similarly, only <1% of genes were expressed at a level that differed by a proportion> 2.2 in CMAMs derived from MO compared to those in the brain. Since the correlation coefficient between the different populations of CMAM was> 0.975, it was concluded that the CMAM derived from the different tissues are extremely homologous, in line with the phenotype described above and the differentiation characteristics described in Example 5.

5 Empleando las condiciones de cultivo específicas para ratón, se mantuvieron los cultivos de CMAMr durante más de 100 duplicaciones de la población. Los cultivos de CMAMr se iniciaron con médula de ratones C57B1/6, ratones ROSA26 y ratones CS7BL/6 transgénicos para –HMG-LacZ. 5 Using the mouse-specific culture conditions, CMAMr cultures were maintained for more than 100 population duplications. The cultures of CMAMr were initiated with the marrow of C57B1 / 6 mice, ROSA26 mice and transgenic CS7BL / 6 mice for –HMG-LacZ.

Ejemplo 2. Selección y cultivo de células madre adultas multipotentes de rata (CMAMrata) Example 2. Selection and culture of rat multipotent adult stem cells (CMAMrata)

Se obtuvieron CMN y de MO a partir de ratas Sprague Dawley o Wistar y se colocaron en placas en condiciones similares a las de las CMAMr. Tras 21-28 días, se eliminaron las células CD45+ de las células y se subcultivaron las células CD45- resultantes con una concentración de 10 células/pocillo. CMN and MO were obtained from Sprague Dawley or Wistar rats and plated under conditions similar to those of CMAMr. After 21-28 days, the CD45 + cells were removed from the cells and the resulting CD45-cells were subcultured with a concentration of 10 cells / well.

15 Las CMAM de rata se expandieron en cultivo de manera similar a las CMAMr durante >100 DP. Las condiciones de expansión del cultivo de CMAM de rata requirió la adición de FCE, FCDP-BB y FIL y ser cultivadas en FN, pero no en colágeno de tipo 1, laminina o Matrigel™. Las CMAMrata fueron CD44, CD45 y clase I y clase II de MHC negativas, y expresaron niveles elevados de telomerasa. La capacidad de una célula normal para crecer durante más de 100 duplicaciones celulares no tiene precedentes, es algo inesperado y va contra los dogmas convencionales de más de dos décadas. 15 Rat CMAMs expanded in culture similar to CMAMr for> 100 DP. The expansion conditions of the rat CMAM culture required the addition of FCE, FCDP-BB and FIL and to be cultured in FN, but not in type 1 collagen, laminin or Matrigel ™. The CMAMrata were CD44, CD45 and class I and class II of MHC negative, and expressed elevated levels of telomerase. The ability of a normal cell to grow for more than 100 cell duplications is unprecedented, it is somewhat unexpected and goes against conventional dogmas for more than two decades.

Se recolectaron las CMAMrata que habían experimentado 42 DP, 72 DP, 80 DP y 100 DP y se evaluó la longitud de los telómeros. Los telómeros no se acortaron en el cultivo, como se determinó mediante análisis por transferencia de Southern tras 42 DP, 72 DP, 80 DP y 100 DP. Análisis mensuales citogenéticos de CMAMrata revelaron un cariotipo CMAMrata that had experienced 42 DP, 72 DP, 80 DP and 100 DP were collected and telomere length was evaluated. Telomeres were not shortened in the culture, as determined by Southern blot analysis after 42 DP, 72 DP, 80 DP and 100 DP. Monthly cytogenetic analyzes of CMAMrata revealed a karyotype

25 normal. 25 normal.

Ejemplo 3. Selección y cultivo de células madre adultas multipotentes humanas (CMAMh) Example 3. Selection and culture of human multipotent adult stem cells (CMAMh)

Se obtuvo MO de donantes voluntarios sanos (edad entre 2 y 50 años) tras el consentimiento informado utilizando las directrices del comité de la Universidad de Minesota sobre el uso del sujeto humano en investigación. Se obtuvieron CMNMO mediante la centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll-Paque y se eliminaron las células de glucoforina-A+ y CD45+ utilizando esferas micromagnéticas (Miltenyii Biotec, Sunnyvale, CA). MO was obtained from healthy voluntary donors (age between 2 and 50 years) after informed consent using the guidelines of the University of Minnesota committee on the use of the human subject in research. CMNMO were obtained by density gradient centrifugation of Ficoll-Paque and glucoforin-A + and CD45 + cells were removed using micromagnetic spheres (Miltenyii Biotec, Sunnyvale, CA).

Las condiciones de expansión fueron las siguientes: se diluyeron 5 x 103 células CD45-/GlyA- en 200 μL de medio de The expansion conditions were as follows: 5 x 103 CD45- / GlyA- cells were diluted in 200 μL of medium

35 expansión [58% de DMEM-LG, 40% de MCDB-201 (Sigma Chemical Co, San Luis, MO), suplementado con 1X de insulina-transferrina-selenio (ITS), IX albúmina de suero bovino – ácido linoleico (LA-BSA, por sus siglas en inglés), dexametasona 10-8 M, 2-fosfato del ácido ascórbico 10-4 M (todos de Sigma), 100 U de penicilina y 1000 U de estreptomicina (Gibco)] y 0-10% de suero bovino fetal (FCS, por sus siglas en inglés) (Hyclone Laboratories, Logan, UT) con 10 ng/mL de FCE (Sigma) y 10 ng/mL de FCDP-BB (R&D Systems, Mineápolis, MN)] y se colocaron en placas de 96 pocillos que se habían recubierto con 5 ng/mL de FN (Sigma). Se renovó el medio cada 4-6 días. Una vez que los pocillos fueron confluentes en >40-50%, se separaron las células adherentes con 0.25% de tripsina -EDTA (Sigma) y se volvieron a colocar en placas con una dilución 1:4 en medio de expansión de CMAM y en recipientes de cultivo mayores recubiertos con 5 ng/mL de FN para mantener densidades celulares entre 2 y 8 x 103 células/cm2. 35 expansion [58% of DMEM-LG, 40% of MCDB-201 (Sigma Chemical Co, San Luis, MO), supplemented with 1X insulin-transferrin-selenium (ITS), IX bovine serum albumin - linoleic acid (LA -BSA, 10-8 M dexamethasone, 10-4 M ascorbic acid 2-phosphate (all from Sigma), 100 U of penicillin and 1000 U of streptomycin (Gibco)] and 0-10% of fetal bovine serum (FCS) (Hyclone Laboratories, Logan, UT) with 10 ng / mL of FCE (Sigma) and 10 ng / mL of FCDP-BB (R&D Systems, Minneapolis, MN)] and they were placed in 96-well plates that had been coated with 5 ng / mL of FN (Sigma). The medium was renewed every 4-6 days. Once the wells were confluent in> 40-50%, the adherent cells were separated with 0.25% trypsin-EDTA (Sigma) and replaced in plates with a 1: 4 dilution in CMAM expansion medium and in larger culture vessels coated with 5 ng / mL of FN to maintain cell densities between 2 and 8 x 103 cells / cm2.

45 Las CMAM indiferenciadas no expresaron CD31, CD34, CD36, CD44, CD45, CD62-E, CD62-L, CD62-P, HLA de clase I y clase II, cKit, Tie, TEk, av 3, VE-cadherina, molécula de adhesión celular vascular (MACV) ni molécula de adhesión intracelular (MAIC)-1. Las CMAM expresaron niveles bajos/muy bajos de microglobulina �2, av 5, CDw90, AC133, Flk1 y Flt1 y niveles elevados de CD13 y CD49b (Fig. 3). 45 The undifferentiated CMAMs did not express CD31, CD34, CD36, CD44, CD45, CD62-E, CD62-L, CD62-P, HLA class I and class II, cKit, Tie, TEk, av 3, VE-cadherin, molecule of vascular cell adhesion (MACV) or intracellular adhesion molecule (MAIC) -1. CMAMs expressed low / very low levels of microglobulin �2, av 5, CDw90, AC133, Flk1 and Flt1 and elevated levels of CD13 and CD49b (Fig. 3).

Ejemplo 4. Análisis inmunofenotípico Example 4. Immunophenotypic analysis

Inmunofluorescencia Immunofluorescence

55 1. Se fijaron células cultivadas con metanol y paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente y se incubaron de manera secuencial durante 30 minutos con cada anticuerpo primario y con o sin anticuerpo secundario. Entre los pasos, se lavaron las preparaciones con PBS/BSA. Se examinaron las células por microscopía de fluorescencia (Zeiss Axiovert; Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY) y microscopía de fluorescencia confocal (microscopio confocal 1024, Olympus AX70, Olympus Optical Co. LTD, Japón). Para determinar la frecuencia de los diferentes tipos celulares en un cultivo dado, se contó el número de células con tinción positiva para un anticuerpo dado en cuatro campos visuales (50-200 células por campo). 1. Cultured cells were fixed with 4% methanol and paraformaldehyde at room temperature and incubated sequentially for 30 minutes with each primary antibody and with or without secondary antibody. Between the steps, the preparations were washed with PBS / BSA. Cells were examined by fluorescence microscopy (Zeiss Axiovert; Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY) and confocal fluorescence microscopy (confocal microscope 1024, Olympus AX70, Olympus Optical Co. LTD, Japan). To determine the frequency of the different cell types in a given culture, the number of cells with positive staining for a given antibody in four visual fields (50-200 cells per field) was counted.

2. Tejidos recolectados: Se fijaron con acetona (Fisher Chemicals) muestras de MO y sanguíneas centrifugadas durante 10 minutos a temperatura ambiente con una citospin. En el caso de órganos sólidos, 2. Tissues collected: MO samples and centrifuged blood samples were fixed with acetone (Fisher Chemicals) for 10 minutes at room temperature with a cytospin. In the case of solid organs,

65 se colocaron sobre portaobjetos de vidrio cortes de tejidos congelados en fresco de 5 μm de grosor y se fijaron inmediatamente con acetona durante 10 a temperatura ambiente. Después de la incubación con sueros de isotipo durante 20 minutos, se tiñeron en serie cortes de tejidos o preparaciones obtenidas por centrifugación con una citospin para detectar antígenos específicos del tejido, �-gal y una tinción de contraste del núcleo (DAPI o TO-PRO-3). Los cubreobjetos se prepararon utilizando el kit Slowfade-antifade (Molecular Probes Inc., Eugene, OR. EE. UU.). Los portaobjetos se examinaron por microscopía de 65 5 µm thick fresh frozen tissue slices were placed on glass slides and immediately fixed with acetone for 10 at room temperature. After incubation with isotype sera for 20 minutes, tissue sections or preparations obtained by centrifugation were stained in series with a cytospin to detect specific tissue antigens, �-gal and a contrast staining of the nucleus (DAPI or TO-PRO -3). The coverslips were prepared using the Slowfade-antifade kit (Molecular Probes Inc., Eugene, OR. USA). The slides were examined by microscopy of

5 fluorescencia y microscopía de fluorescencia confocal 5 fluorescence and confocal fluorescence microscopy

3. Anticuerpos: Se fijaron las células con parafolmadehído al 4% a temperatura ambiente o metanol a -20 ºC y se incubaron de manera secuencial durante 30 minutos cada vez con un Ab primario y un Ab anti-IgG de conejo o de ratón conjugado con FITC o Cy3. Entre cada paso, las preparaciones se lavaron con PBS+1% de BSA. Los anticuerpos anti-Ter119, anti-CD3, anti-CD19, anti-Gr1, anti-MacI, anti-CD62E, anti-CD31 y anti-CD45 conjugados con FITC o PE se obtuvieron de BD Pharmingen. Los Abs (abreviatura de antibodies, anticuerpos en inglés) contra GFAP (clon G-A-5, 1:400), galactocerebrósido (GalC) (policlonal, 1:50), MBP (policlonal, 1:50), GABA (clon GB-69, 1:100), parvalbúmina (clon PARV-19, 1:2000), TuJI (clon SDL.3D10, 1:400), NF-68 (clon NR4, 1:400), NF-160 (clon NN 18, 1:40) y NF-200 (clon N52, 1:400), NSE (policlonal, 3. Antibodies: The cells were fixed with 4% parafolmadehyde at room temperature or methanol at -20 ° C and incubated sequentially for 30 minutes each time with a primary Ab and a rabbit or mouse anti-IgG Ab conjugated to FITC or Cy3. Between each step, the preparations were washed with PBS + 1% BSA. Anti-Ter119, anti-CD3, anti-CD19, anti-Gr1, anti-MacI, anti-CD62E, anti-CD31 and anti-CD45 antibodies conjugated to FITC or PE were obtained from BD Pharmingen. Abs (abbreviation for antibodies, antibodies in English) against GFAP (clone GA-5, 1: 400), galactocerebrósido (GalC) (polyclonal, 1:50), MBP (polyclonal, 1:50), GABA (clone GB- 69, 1: 100), parvalbumin (clone PARV-19, 1: 2000), TuJI (clone SDL.3D10, 1: 400), NF-68 (clone NR4, 1: 400), NF-160 (clone NN 18 , 1:40) and NF-200 (clone N52, 1: 400), NSE (polyclonal,

15 1:50), MAP2-AB (clon AP20, 1:400), Tau (policlonal, 1:400), TH (clon TH-2, 1:1000), DDC (clon DDC-109, 1:100), TrH (clon WH-3, 1:1000), serotonina (policlonal, 1:2000), glutamato (clon GLU-4, 1:400) y miosina de contracción rápida (clon MY-32, dilución 1:400) provinieron de Sigma. DAPI y TOPRO-3 provinieron de Molecular Probes. Los Abs contra vWF (policlonal; 1:50), Neuro-D (policlonal, 1:50), c-ret (policlonal, 1:50) y NurrI (policlonal; 1:50) provinieron de Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA. Los Abs contra PSA-NCAM (policlonal, 1:500) de Phanmingen, San Diego, CA y contra el transportador de serotonina (clon MAB 1564, 1:400), DTP (policlonal, 1:200), canal de voltaje dependiente de Na (policlonal, 1:100), receptores de glutamato 5, 6 y 7 (clon 3711:500) y receptor NMDA (policlonal 1:400) de Chemicon International, Temecula, CA. Los Abs anti-nestina (1:400) constituyeron un amable obsequio del Dr. U. Lendahl, Universidad de Lund, Suecia. Los anticuerpos contra NSE (1:50) pan-citoqueratina (número de catálogo C15 1:50), MAP2-AB (clone AP20, 1: 400), Tau (polyclonal, 1: 400), TH (clone TH-2, 1: 1000), DDC (clone DDC-109, 1: 100) , TrH (clone WH-3, 1: 1000), serotonin (polyclonal, 1: 2000), glutamate (clone GLU-4, 1: 400) and myosin rapid contraction (clone MY-32, dilution 1: 400) came of Sigma. DAPI and TOPRO-3 came from Molecular Probes. Abs vs. vWF (polyclonal; 1:50), Neuro-D (polyclonal, 1:50), c-ret (polyclonal, 1:50) and NurrI (polyclonal; 1:50) came from Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA. The Abs vs. PSA-NCAM (polyclonal, 1: 500) of Phanmingen, San Diego, CA and against the serotonin transporter (clone MAB 1564, 1: 400), DTP (polyclonal, 1: 200), voltage dependent channel Na (polyclonal, 1: 100), glutamate receptors 5, 6 and 7 (clone 3711: 500) and NMDA receptor (polyclonal 1: 400) from Chemicon International, Temecula, CA. The anti-nestine Abs (1: 400) constituted a kind gift from Dr. U. Lendahl, Lund University, Sweden. Antibodies against NSE (1:50) pan-cytokeratin (catalog number C

25 2562; 1:100), CK-18 (C-8541; 1:300), albúmina (A-6684; 1:100) provinieron todos de Sigma. Los anticuerpos policlonales contra Flk1, Flt1, Tek, HNF-1� se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA. Los anticuerpos anti-nestina (1:400) constituyeron un amable obsequio del Dr. U. Lendahl, Universidad de Lund, Suecia. Las IgGs de ratón, rata o conejo de control y los anticuerpos secundarios marcados con FITC/PE/Cy3 y Cy5 se obtuvieron de Sigma. El anticuerpo de conejo anti-�-gal-FITC se obtuvo de Rockland Immunochemicals, EE. UU. TO-PRO-3 se obtuvo de Molecular Probes Inc. y DAPI se obtuvo de Sigma. 25,262; 1: 100), CK-18 (C-8541; 1: 300), albumin (A-6684; 1: 100) all came from Sigma. Polyclonal antibodies against Flk1, Flt1, Tek, HNF-1� were obtained from Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA. The anti-nestin antibodies (1: 400) constituted a kind gift from Dr. U. Lendahl, Lund University, Sweden. Mouse, rat or control rabbit IgGs and secondary antibodies labeled with FITC / PE / Cy3 and Cy5 were obtained from Sigma. The rabbit anti-�-gal-FITC antibody was obtained from Rockland Immunochemicals, USA. UU. TO-PRO-3 was obtained from Molecular Probes Inc. and DAPI was obtained from Sigma.

B. Tinción con X-GAL: Se tiñeron cortes de tejido mediante la actividad de la enzima �-galactosidasa utilizando el kit de tinción �-gal de Invitrogen, pH 7,4. Se siguieron las instrucciones del fabricante excepto en el paso de la fijación, durante el cual se incubaron los cortes de tejido durante 5 min en lugar de 10 min. B. Staining with X-GAL: Tissue cuts were stained by the activity of the enzyme �-galactosidase using the Invitrogen �-gal staining kit, pH 7.4. The manufacturer's instructions were followed except in the fixation step, during which the tissue cuts were incubated for 5 min instead of 10 min.

35 C. FACS: Para la FACS, se separaron CMAM indiferenciadas y se tiñeron de manera secuencial con anti-CD44, CD45, CD13, cKit, MHC de clase I y clase II o microglobulina-2 (BD Pharmingen) y anticuerpos secundarios conjugados con FITC o PE, se fijaron con paraformaldehído al 2% hasta su análisis utilizando un FACS-Calibur (Becton-Dickinson). 35 C. FACS: For the FACS, undifferentiated CMAMs were separated and stained sequentially with anti-CD44, CD45, CD13, cKit, MHC class I and class II or microglobulin-2 (BD Pharmingen) and secondary antibodies conjugated with FITC or PE, were fixed with 2% paraformaldehyde until analysis using a FACS-Calibur (Becton-Dickinson).

Ejemplo 5. Origen celular único de estirpes diferenciadas a partir de CMAM Example 5. Unique cellular origin of differentiated strains from CMAM

Se evaluó la capacidad de diferenciación de las CMAMr o CMAMrata añadiendo factores de diferenciación (citocinas) elegidos basándose en lo que se ha descrito para la diferenciación de CMAMh o células ME en mesodermo, neuroectodermo y endodermo. La diferenciación requirió que las células se volvieran a colocar en The differentiation capacity of the CMAMr or CMAMrata was evaluated by adding differentiation factors (cytokines) chosen based on what has been described for the differentiation of CMAMh or ME cells in mesoderm, neuroectoderm and endoderm. Differentiation required that the cells be replaced in

45 medio libre de suero con una concentración de 1-2 x 104 células/cm2, sin FCE, FCDP-BB y FIL pero con citocinas específicas de la estirpe. Se determinó la diferenciación mediante inmunohistología con marcadores específicos de tejido [miosina de contracción lenta y MyoD (músculo), factor de von-Willebrand (vWF) y Tek (endotelio), NF200 y MAP2 (neuroectodérmico) y citoqueratina-18 y albúmina (endodérmico)], RT-PCR y estudios funcionales. 45 serum-free medium with a concentration of 1-2 x 104 cells / cm2, without FCE, FCDP-BB and FIL but with specific cytokines of the strain. Differentiation was determined by immunohistology with tissue specific markers [myosin of slow contraction and MyoD (muscle), von-Willebrand factor (vWF) and Tek (endothelium), NF200 and MAP2 (neuroectodermal) and cytokeratin-18 and albumin (endodermal) )], RT-PCR and functional studies.

Diferenciación de CMAM en células neuroectodérmicas CMAM differentiation in neuroectodermal cells

Palmer et al. mostraron que los neuroprogenitores se pueden expandir en cultivo con FCDP-BB y se puede inducir su diferenciación eliminando el FCDP y añadiendo como factor de diferenciación FCFb. Basándose en estos estudios y en estudios llevados a cabo utilizando CMAMh, CMAMr y CMAMrata se colocaron en pocillos recubiertos 55 con FN sin FCDP-BB y FCE pero con 100 ng/mL de FCFb. Se observó la maduración progresiva de células similares a las neuronas a lo largo de todo el cultivo. Tras 7 días, la mayoría de las células expresaron nestina. Tras 14 días, un 15-20% de las CMAM adquirieron características fenotípicas y morfológicas de astrocitos (GFAP+), un 15-20% de oligodendrocitos (galactocerebrósido (GalC)+) y un 50-60% de neuronas (neurofilamento-200 (NF-200)+). Nunca se detectaron en la misma célula NF200, GFAP o GalC, lo que sugiere que es poco probable que las células similares a las neuronas fueran CMAMh o células neurogliales que expresaban de manera inapropiada marcadores neuronales. Las células similares a las neuronas también expresaron Tau, MAP2 y NSE. Aproximadamente un 50% de las neuronas expresaron ácido gamma-aminobutírico (GABA) y parvalbúmina, un 30% tirosina-hidroxilasa y dopadecarboxilasa (DDC) y un 20% serotonina- y triptófano-hidroxilasa. La diferenciación fue similar cuando las CMAM se expandieron durante 40 o >90 DP. La Q-RT-PCR, llevada a cabo tal como se describe en el Ejemplo 1, confirmó Palmer et al. showed that neuroprogenitors can be expanded in culture with FCDP-BB and their differentiation can be induced by eliminating FCDP and adding FCFb as a differentiation factor. Based on these studies and studies carried out using CMAMh, CMAMr and CMAMrata, they were placed in wells coated with FN without FCDP-BB and FCE but with 100 ng / mL of FCFb. Progressive maturation of neuron-like cells was observed throughout the entire culture. After 7 days, most cells expressed nestin. After 14 days, 15-20% of CMAM acquired phenotypic and morphological characteristics of astrocytes (GFAP +), 15-20% of oligodendrocytes (galactocerebrósido (GalC) +) and 50-60% of neurons (neurofilament-200 ( NF-200) +). The NF200, GFAP or GalC cells were never detected in the same cell, suggesting that it is unlikely that neuron-like cells were CMAMh or neuroglial cells that inappropriately expressed neuronal markers. Neuron-like cells also expressed Tau, MAP2 and NSE. Approximately 50% of neurons expressed gamma-aminobutyric acid (GABA) and parvalbumin, 30% tyrosine hydroxylase and dopadecarboxylase (DDC) and 20% serotonin- and tryptophan hydroxylase. The differentiation was similar when the CMAMs expanded during 40 or> 90 DP. The Q-RT-PCR, carried out as described in Example 1, confirmed

65 la expresión de marcadores neuroectodérmicos: en el día 2, las CMAM expresaron ARNm de otx1 y otx2 y tras 7 días se detectó ARNm de nestina. 65 expression of neuroectodermal markers: on day 2, the CMAMs expressed mRNA of otx1 and otx2 and after 7 days nestin mRNA was detected.

A continuación se evaluó el efecto del factor de crecimiento de fibroblastos (FCF)-8b como factor de diferenciación. Este es importante para el desarrollo in vivo del mesencéfalo y se utilizó in vitro para inducir neuronas serotoninérgicas y dopaminérgicas en células ME murinas que se diferenciaron en CMAMh. Cuando se cultivaron The effect of fibroblast growth factor (FCF) -8b as a differentiation factor was then evaluated. This is important for the in vivo development of the midbrain and was used in vitro to induce serotonergic and dopaminergic neurons in murine ME cells that differentiated into CMAMh. When they were grown

5 CMAMh confluentes (n = 8) con 10 ng/mL de FCF-8b + FCE, se observó diferenciación en células con una tinción positiva de marcadores neuronales pero no así oligodendrocitos ni astrocitos. Las neuronas presentaron características de neuronas GABAérgicas (GABA+, 40 ± 4 %), dopaminérgicas (DOPA, TH, DCC y DTP+, 26 ± 5 %) y serotoninérgicas (TrH, serotonina y transportador de serotonina+, 34 ± 6 %). Las neuronas DOPA+ se tiñeron con Abs contra NurrI, lo que sugiere diferenciación en neuronas DA mesencefálicas. Las neuronas inducidas por FCF-8b no presentaron características electrofisiológicas de neuronas maduras. Por tanto, las células cultivadas a partir de cultivos de 3 semanas mantenidos con FCF-8b junto con la línea celular de glioblastoma, U-87, y el FCF-8b durante 2-3 semanas adicionales. 5 CMAMh confluent (n = 8) with 10 ng / mL FCF-8b + FCE, differentiation was observed in cells with a positive staining of neuronal markers but not oligodendrocytes or astrocytes. The neurons presented characteristics of GABAergic (GABA +, 40 ± 4%), dopaminergic (DOPA, TH, DCC and DTP +, 26 ± 5%) and serotonergic (TrH, serotonin and serotonin + transporter, 34 ± 6%) neurons. DOPA + neurons stained with Abs against NurrI, suggesting differentiation in mesencephalic DA neurons. The neurons induced by FCF-8b did not show electrophysiological characteristics of mature neurons. Thus, cells grown from 3-week cultures maintained with FCF-8b together with the glioblastoma cell line, U-87, and FCF-8b for an additional 2-3 weeks.

Las neuronas adquirieron una morfología más madura con un tamaño celular, un número, una longitud y Neurons acquired a more mature morphology with a cell size, a number, a length and

15 complejidad de las neuritas mayores y adquirieron características electrofisiológicas de neuronas maduras (un flujo hacia el interior transitorio, bloqueado de manera reversible con tetrodotoxina 1 μM (TTX), junto con la evolución temporal transitoria y la activación dependiente de voltaje del flujo hacia el interior es típico de los flujos de sodio dependientes de voltaje y se observa únicamente en las neuronas maduras). 15 complexity of the major neurites and acquired electrophysiological characteristics of mature neurons (a transient inward flow, reversibly blocked with 1 μM tetrodotoxin (TTX), together with transient temporal evolution and voltage-dependent inward flow activation It is typical of voltage-dependent sodium fluxes and is observed only in mature neurons.)

Cuando se cultivaron CMAMh (n = 13) con 10 ng/mL de factor neurotrófico derivado del cerebro (FNDC) + FCE, tuvo lugar diferenciación exclusivamente en neuronas positivas para DOPA, TH, DCC, DTP y NurrI. Aunque el FNDC promueve la diferenciación neural de células ME y CMN (Peault, 1996; Choi et al. 1998), ningún estudio había mostrado la diferenciación exclusiva en neuronas similares a las DA. When CMAMh (n = 13) with 10 ng / mL of brain-derived neurotrophic factor (FNDC) + FCE were cultured, differentiation took place exclusively in neurons positive for DOPA, TH, DCC, DTP and NurrI. Although the FNDC promotes the neural differentiation of ME and CMN cells (Peault, 1996; Choi et al. 1998), no study had shown exclusive differentiation in DA-like neurons.

25 Se observaron resultados similares para CMAMr inducidas con FCFb y CMAMrata con FCFb y FNDC. En el ejemplo 10 se presentan estudios adicionales en células neuronales derivadas de CMAM. 25 Similar results were observed for CMAMr induced with FCFb and CMAMrata with FCFb and FNDC. Example 10 presents additional studies in neuronal cells derived from CMAM.

Diferenciación de CMAM en células endoteliales CMAM differentiation in endothelial cells

Se indujo la diferenciación en endotelio como un ejemplo de mesodermo. Las células CMAMr o CMAMrata indiferenciadas no expresaron los marcadores endoteliales CD31, CD62E, Tek o vWF, pero expresaron niveles bajos de Flk1. Se cultivaron las CMAMr o CMAMrata en pocillos recubiertos con FN con 10 ng/mL del factor de diferenciación endotelial FCEV-B. Tras el tratamiento con FCEV durante 14 días, > 90% de las CMAM, independientemente del número de DP que habían experimentado, expresaron Flt1, CD31, vWF o CD62, lo que es Differentiation in endothelium was induced as an example of mesoderm. The undifferentiated CMAMr or CMAMrata cells did not express the endothelial markers CD31, CD62E, Tek or vWF, but expressed low levels of Flk1. The CMAMr or CMAMrata were cultured in FN-coated wells with 10 ng / mL of the FCEV-B endothelial differentiation factor. After treatment with FCEV for 14 days,> 90% of CMAM, regardless of the number of PD they had experienced, expressed Flt1, CD31, vWF or CD62, which is

35 coherente con la diferenciación endotelial. Al igual que las células endoteliales primarias, las células endoteliales derivadas de CMAM formaron tubos vasculares en las 6 horas posteriores a su colocación de nuevo en Matrigel™. 35 consistent with endothelial differentiation. Like the primary endothelial cells, CMAM-derived endothelial cells formed vascular tubes within 6 hours after being placed back into Matrigel ™.

De manera similar, las CMAMh expresaron Flk1 y Flt1 pero no CD34, Muc18 (P1H12), PECAM, selectina P y E, CD36 o Tie/Tek. Cuando las CMAMh con una concentración de 2 x 104 células/cm2 se cultivaron en medio libre de suero con 20 ng/mL del factor de crecimiento endotelial vascular (FCEV), las células expresaron CD34, VEcadherina, MACV y Muc-18 a partir del 7.º día. El 14.º día también expresaron Tie, Tek, Flk1 y Flt1, PECAM, selectina P y selectina E, CD36, vWF y conexina-40. Además, las células pudieron incorporar lipoproteínas de baja densidad (LDL, por sus siglas en inglés). La inmunoelectrotransferencia confirmó los resultados de la tinción histoquímica. Para inducir la formación de los tubos vasculares, CMAM cultivadas durante 14 días con FCEV se Similarly, CMAMh expressed Flk1 and Flt1 but not CD34, Muc18 (P1H12), PECAM, selectin P and E, CD36 or Tie / Tek. When CMAMh with a concentration of 2 x 104 cells / cm2 were grown in serum-free medium with 20 ng / mL of vascular endothelial growth factor (FCEV), cells expressed CD34, VEcadherin, MACV and Muc-18 from 7th day On the 14th day they also expressed Tie, Tek, Flk1 and Flt1, PECAM, selectin P and selectin E, CD36, vWF and connexin-40. In addition, the cells were able to incorporate low density lipoproteins (LDL). Immunoelectrotransfer confirmed the results of histochemical staining. To induce the formation of vascular tubes, CMAM cultured for 14 days with FCEV is

45 colocaron de nuevo en Matrigel™ con 10 ng/mL de FCEV-B durante 6 horas. No se apreció diferenciación endotelial cuando se utilizaron CMAMh cultivadas en >2% de FCS. Además, cuando se dejó FCS en el medio durante la diferenciación, no se generaron células endoteliales. 45 were placed back in Matrigel ™ with 10 ng / mL of FCEV-B for 6 hours. No endothelial differentiation was observed when CMAMh grown in> 2% FCS were used. In addition, when FCS was left in the medium during differentiation, no endothelial cells were generated.

Cuando se subcultivaron CMAMh se obtuvo una expansión de al menos 1000 veces, lo que sugiere que los precursores endoteliales generados a partir de CMAMh mantienen un potencial proliferativo significativo. La expansión celular fue incluso mayor cuando se añadió FCS a los cultivos después del 7.º día. When CMAMh was subcultured, an expansion of at least 1000 times was obtained, suggesting that the endothelial precursors generated from CMAMh maintain significant proliferative potential. Cellular expansion was even greater when FCS was added to the cultures after the 7th day.

Cuando se administraron CMAMh derivadas de células endoteliales por vía intravenosa (i.v.) a ratones NOD-SCI a los que se les había implantado un carcinoma de colon humano bajo la piel, se pudo observar una contribución de When CMAMh derived from intravenous endothelial cells (i.v.) were administered to NOD-SCI mice that had a human colon carcinoma implanted under the skin, a contribution of

55 las células endoteliales humanas a la neovascularización en los tumores. Por tanto, puede que sea posible incorporar células endoteliales genéticamente modificadas para obtener un beneficio terapéutico, es decir, para inhibir la angiogénesis en, por ejemplo, un cáncer o para promoverla para potenciar la vascularización en miembros u otros órganos tales como el corazón. En el ejemplo 9 se presentan estudios adicionales en células endoteliales derivadas de CMAM. 55 human endothelial cells to neovascularization in tumors. Therefore, it may be possible to incorporate genetically modified endothelial cells to obtain a therapeutic benefit, that is, to inhibit angiogenesis in, for example, a cancer or to promote it to enhance vascularization in limbs or other organs such as the heart. Example 9 presents additional studies on endothelial cells derived from CMAM.

Diferenciación de CMAM en endodermo CMAM differentiation in endoderm

Se evaluó si las CMAMr o CMAMrata se podrían diferenciar en células endodérmicas. Se evaluaron varias condiciones de cultivo diferentes incluido el cultivo con los siguientes factores de diferenciación: factor de 65 crecimiento de queratinocitos (FCQ), factor de crecimiento de hepatocitos (FCH) y FCF-4, ya sea en pocillos recubiertos con Matrigel™, FN, colágeno o laminina. Cuando se colocaron de nuevo en Matrigel™ con 10 ng/mL de It was evaluated whether CMAMr or CMAMrata could be differentiated into endodermal cells. Several different culture conditions were evaluated including culture with the following differentiation factors: keratinocyte growth factor (FCQ), hepatocyte growth factor (FCH) and FCF-4, either in wells coated with Matrigel ™, FN , collagen or laminin. When they were placed back in Matrigel ™ with 10 ng / mL of

FCF-4 + 10 ng/mL de FCH, aproximadamente un 70% de las CMAM adquirieron características fenotípicas y morfológicas de células similares a hepatocitos. Las células se volvieron epitelioides, aproximadamente un 10% de las células se volvieron binucleares y aproximadamente un 70% de las células presentaron una tinción positiva para albúmina, citoqueratina (CK)-18 y HNF-1P. FCF-4 + 10 ng / mL of FCH, approximately 70% of CMAM acquired phenotypic and morphological characteristics of hepatocyte-like cells. The cells became epithelioid, approximately 10% of the cells became binuclear and approximately 70% of the cells had a positive staining for albumin, cytokeratin (CK) -18 and HNF-1P.

5 Las células similares a las células endodérmicas generadas en cultivos que contenían FCF4 y FCH también presentaron características funcionales de hepatocitos, determinadas midiendo los niveles de urea en los sobrenadantes de CMAM indiferenciadas y células inducidas con FCF4 y FCH utilizando el Kit 640 para urea y nitrógeno de Sigma de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. No se detectó urea en los cultivos de CMAM indiferenciadas. La producción de urea se situó en 10 μg/célula/hora 14 días después de la adición de FCF4 y FCH y permaneció detectable y con niveles similares hasta el día 25.º. Esto es comparable a los hepatocitos de rata primarios cultivados en monocapa. La presencia de albúmina junto con la producción de urea apoya la idea de la diferenciación de hepatocitos a partir de CMAM in vitro. En el ejemplo 11 se presentan más estudios en hepatocitos derivados de CMAM. 5 Cells similar to endodermal cells generated in cultures containing FCF4 and FCH also showed functional characteristics of hepatocytes, determined by measuring urea levels in undifferentiated CMAM supernatants and cells induced with FCF4 and FCH using Kit 640 for urea and nitrogen Sigma according to the manufacturer's recommendations. Urea was not detected in undifferentiated CMAM cultures. Urea production stood at 10 μg / cell / hour 14 days after the addition of FCF4 and FCH and remained detectable and with similar levels until the 25th day. This is comparable to primary rat hepatocytes cultured in monolayer. The presence of albumin together with urea production supports the idea of hepatocyte differentiation from CMAM in vitro. Example 11 shows more studies on hepatocytes derived from CMAM.

15 Dada la probable existencia de una célula precursora de una estirpe endodérmica, las CMAM probablemente darán lugar a una célula que forma diferentes células en el hígado, en el páncreas, componentes tanto exocrinos como endocrinos y otras estirpes tisulares celulares derivadas de células endodérmicas. 15 Given the probable existence of a precursor cell of an endodermal lineage, CMAMs will probably give rise to a cell that forms different cells in the liver, in the pancreas, both exocrine and endocrine components and other cellular tissue strains derived from endodermal cells.

Se indujo la diferenciación de CMAM derivadas de músculo o cerebro en mesodermo (células endoteliales), neuroectodermo (astrocitos y neuronas) y endodermo (células similares a los hepatocitos) utilizando los métodos descritos anteriormente para CMAM derivadas de MO. The differentiation of CMAM derived from muscle or brain into mesoderm (endothelial cells), neuroectoderm (astrocytes and neurons) and endoderm (cells similar to hepatocytes) was induced using the methods described above for CMAM derived from MO.

Transducción Transduction

25 Para demostrar que las células diferenciadas se derivaban de una única célula y que las CMAM eran realmente células multipotentes “clonales”, se prepararon cultivos en los cuales se habían transducido las CMAM con un vector retroviral y se observó que las células indiferenciadas y su progenie presentaban el retrovirus insertado en el mismo sitio en su genoma. 25 To demonstrate that the differentiated cells were derived from a single cell and that the CMAMs were actually "clonal" multipotent cells, cultures were prepared in which the CMAMs had been transduced with a retroviral vector and it was observed that undifferentiated cells and their progeny they presented the retrovirus inserted in the same site in their genome.

Se llevaron a cabo estudios utilizando dos CMAM derivadas de manera independiente de ROSA26, dos CMAM C57BL/6 y una población de CMAMrata expandidas entre 40 y >90 DP, así como con CMAM de rata “clonal” y de ratón “clonal” transducidas con eGFP. No se apreciaron diferencias entre células sin transducir y las transducidas con eGFP. Cabe señalar que la expresión de eGFP persistió en las CMAM diferenciadas. Studies were carried out using two CMAMs derived independently from ROSA26, two CMAM C57BL / 6 and a population of CMAMrata expanded between 40 and> 90 DP, as well as with "clonal" rat and "clonal" mouse CMAM transduced with eGFP. No differences were observed between untranslated cells and those transduced with eGFP. It should be noted that the expression of eGFP persisted in differentiated CMAMs.

35 En concreto las CMNMO de rata y murinas cultivadas en FN con FCE, FCDP-BB y FIL durante tres semanas se transdujeron en dos días consecutivos con un vector oncorretroviral de eGFP. Posteriormente, se eliminaron las células GlyA+ y CD45+ y se subcultivaron las células con una concentración de 10 células/pocillo. Las CMNMO de rata transducidas con eGFP se expandieron durante 85 DP. De manera alternativa, se emplearon CMAM de ratón expandidas durante 80 DP. Se generaron subcultivos de CMAM indiferenciadas colocando en placas 100 CMAM de cultivos mantenidos durante 75 DP y expandiéndolas de nuevo hasta >5 x 106 células. Se indujo in vitro la diferenciación de las CMAM expandidas en endotelio, neuroectodermo y endodermo. Tal como se describe en el ejemplo 4, se mostró la diferenciación de la estirpe tiñendo con anticuerpos específicos para esos tipos celulares. 35 Specifically, rat and murine CMNMOs grown in FN with FCE, FCDP-BB and FIL for three weeks were transduced on two consecutive days with an oncorretroviral eGFP vector. Subsequently, the GlyA + and CD45 + cells were removed and the cells were subcultured with a concentration of 10 cells / well. Rat CMNMOs transduced with eGFP were expanded during 85 DP. Alternatively, expanded mouse CMAMs were used for 80 DP. Undifferentiated CMAM subcultures were generated by plating 100 CMAM of cultures maintained for 75 DP and expanding them again to> 5 x 106 cells. Differentiation of expanded CMAMs in endothelium, neuroectoderm and endoderm was induced in vitro. As described in example 4, the differentiation of the lineage was shown by staining with antibodies specific for those cell types.

45 Origen celular único de la progenie neuroectodérmica y mesodérmica 45 Unique cellular origin of the neuroectodermal and mesodermal progeny

Para probar el origen celular único de la progenie neuroectodérmica y mesodérmica diferenciada se empleo el marcaje retroviral (Jordan et al., 1990; Nolta et al., 1996). Se transdujo una fracción de las CMAMh obtenidas tras 20 DP con un retrovirus MFG-eGFP. Se diluyeron las CMAMh eGFP+ en CMAM no transducidas de los mismos donantes para obtener una concentración final de ~ 5% de células transducidas. Se colocaron estas mezclas en placas con una concentración de 100 células/pocillo y se expandió el cultivo hasta que se obtuvieron >2 x 107 células. Se indujo la diferenciación de grupos de 5 x 106 CMAM en estirpes neuroectodérmicas, de endotelio y de mioblastos esqueléticos. Tras 14 días en condiciones de diferenciación, se recolectaron las células y se utilizaron para identificar el sitio de integración retroviral y la coexpresión de eGFP y marcadores endoteliales, musculares y To test the unique cellular origin of the differentiated neuroectodermal and mesodermal progeny, retroviral labeling was used (Jordan et al., 1990; Nolta et al., 1996). A fraction of the CMAMh obtained after 20 DP was transduced with an MFG-eGFP retrovirus. The eGFP + CMAMh were diluted in non-transduced CMAMs from the same donors to obtain a final concentration of ~ 5% of transduced cells. These mixtures were plated with a concentration of 100 cells / well and the culture was expanded until> 2 x 107 cells were obtained. Differentiation of 5 x 106 CMAM groups was induced in neuroectodermal, endothelial and skeletal myoblast lines. After 14 days under differentiation conditions, the cells were collected and used to identify the site of retroviral integration and the coexpression of eGFP and endothelial, muscular and

55 neuroectodérmicos. 55 neuroectodermal.

Para la diferenciación en mioblastos, las CMAMh se colocaron en placas con una concentración de 2 x 104 células/cm2 en FCS al 2%, medio de expansión que contenía FCE y FCDP y se trataron con 5-azacitidina 3 μM en el mismo medio durante 24 h. Posteriormente, se mantuvieron las células en medio de expansión con FCDP-BB, FCE y FCS al 2%. Para la diferenciación endotelial, las CMAMh se colocaron de nuevo en placas con una concentración de 2 x 104 células/cm2 en medio de expansión exento de suero sin FCE ni FCDP pero con 10 ng/mL de FCEV-B durante 14 días. For myoblast differentiation, the CMAMh were plated with a concentration of 2 x 104 cells / cm2 in 2% FCS, expansion medium containing FCE and FCDP and treated with 3 μM 5-azacitidine in the same medium during 24 h Subsequently, the cells were maintained in expansion medium with FCDP-BB, FCE and 2% FCS. For endothelial differentiation, the CMAMh were placed back on plates with a concentration of 2 x 104 cells / cm2 in serum-free expansion medium without FCE or FCDP but with 10 ng / mL of FCEV-B for 14 days.

La evaluación por inmunofluorescencia mostró que un 5-10% de las células en cultivos inducidos a diferenciarse con The immunofluorescence evaluation showed that 5-10% of the cells in cultures induced to differentiate with

65 5-azacitidina presentaban una tinción positiva para eGFP y actina esquelética, un 5-10% de las células inducidas a diferenciarse en endotelio se teñían tanto para eGFP como para vWF y un 5-10% de las células inducidas a diferenciarse en neuroectodermo se teñían de manera conjunta para eGFP y NF-200 o GFAP o MBP. Para definir el sitio de inserción retroviral, se secuenció la región adyacente genómica del hospedador en CMAM y su progenie diferenciada. El número de insertos retrovirales en las distintas poblaciones estuvo comprendido entre uno y siete. Tal como se muestra en la Tabla 2, se identificó la secuencia idéntica y única adyacente al inserto retroviral en células neuroectodérmicas, de endotelio y de músculo en la población A16 de la que se obtuvo el mapa genético del cromosoma 7. 65 5-azacitidine had a positive staining for eGFP and skeletal actin, 5-10% of the cells induced to differentiate in endothelium were stained for both eGFP and vWF and 5-10% of the cells induced to differentiate into neuroectoderm dyed together for eGFP and NF-200 or GFAP or MBP. To define the retroviral insertion site, the adjacent genomic region of the host was sequenced in CMAM and its differentiated progeny. The number of retroviral inserts in the different populations was between one and seven. As shown in Table 2, the identical and unique sequence adjacent to the retroviral insert in neuroectodermal, endothelial and muscle cells was identified in the A16 population from which the genetic map of chromosome 7 was obtained.

Tabla 2: Origen celular único de células neuroectodérmicas, de músculo y endotelio Table 2: Unique cellular origin of neuroectodermal, muscle and endothelial cells

Secuencia: 3'-LTR-ccaaaatt Sequence: 3'-LTR-ccaaaatt

Clon A16 (Crom. 7) Clone A16 (Chrom. 7)

TAG CGGCCGCTTG AATTCGAACG CGAGACTACT GTGACTCACA CT TAG CGGCCGCTTG AATTCGAACG CGAGACTACT GTGACTCACA CT

5-Azacitidina 5-Azacitidine

TAG CGGCCGCTTG AATTCGAACG CGAGACTACT GTGACTCACA CT TAG CGGCCGCTTG AATTCGAACG CGAGACTACT GTGACTCACA CT

FCEV FCEV

TAG CGGCCGCTTG AATTCGAACG CGAGACTACT GTGACTCACA CT TAG CGGCCGCTTG AATTCGAACG CGAGACTACT GTGACTCACA CT

FCFb FCFb

TAG CGGCCGCTTG AATTCGAACG CGAGACTACT GTGACTCACA CT TAG CGGCCGCTTG AATTCGAACG CGAGACTACT GTGACTCACA CT

Clon A12-A (Crom. 9) Clone A12-A (Chrom. 9)

ATTTATA TTCTAGTTTAT TTGTGTTTGGG GCAGACGAGG ATTTATA TTCTAGTTTAT TTGTGTTTGGG GCAGACGAGG

5-Azacitidina 5-Azacitidine

ATTTATA TTCTAGTTTAT TTGTGTTTGGG GCAGACGAGG ATTTATA TTCTAGTTTAT TTGTGTTTGGG GCAGACGAGG

FCEV FCEV

ATTTATA TTCTAGTTTAT TTGTGTTTGGG GCAGACGAGG ATTTATA TTCTAGTTTAT TTGTGTTTGGG GCAGACGAGG

FCFb FCFb

ATTTATA TTCTAGTTTAT TTGTGTTTGGG GCAGACGAGG ATTTATA TTCTAGTTTAT TTGTGTTTGGG GCAGACGAGG

Clon A12-A (Crom. 12) Clone A12-A (Chrom. 12)

TCCTGTCTCA TTCAAGCCAC ATCAGTTACA TCTGCATTTT TCCTGTCTCA TTCAAGCCAC ATCAGTTACA TCTGCATTTT

5-Azacitidina 5-Azacitidine

TCCTGTCTCA TTCAAGCCAC ATCAGTTACA TCTGCATTTT TCCTGTCTCA TTCAAGCCAC ATCAGTTACA TCTGCATTTT

FCEV FCEV

TCCTGTCTCA TTCAAGCCAC ATCAGTTACA TCTGCATTTT TCCTGTCTCA TTCAAGCCAC ATCAGTTACA TCTGCATTTT

FCFb FCFb

TCCTGTCTCA TTCAAGCCAC ATCAGTTACA TCTGCATTTT TCCTGTCTCA TTCAAGCCAC ATCAGTTACA TCTGCATTTT

10 En la Tabla 3 se muestran los cebadores específicos diseñados para la LTR 3’ y para las secuencias genómicas adyacentes y utilizando PCR en tiempo real, se confirmó que el sitio de inserción retroviral era idéntico en células diferenciadas e indiferenciadas. Estos resultados prueban que la secuencia adyacente y que las secuencias de ADN de eGFP están presentes en cantidades similares. El clon A12 contuvo dos insertos retrovirales, localizados en los 10 Table 3 shows the specific primers designed for LTR 3 ’and for adjacent genomic sequences and using real-time PCR, it was confirmed that the retroviral insertion site was identical in differentiated and undifferentiated cells. These results prove that the adjacent sequence and that the eGFP DNA sequences are present in similar amounts. Clone A12 contained two retroviral inserts, located in the

15 cromosomas 1 y 7 respectivamente, y se pudieron detectar ambas secuencias adyacentes no solamente en CMAMh sino también en estirpes neuroectodérmicas, de endotelio y de músculo. Para determinar si esto representaba la progenie de una única célula con dos integrantes retrovirales o la progenie de dos células se empleó PCR en tiempo real para comparar la cantidad relativa de las secuencias adyacentes a eGFP en los cromosomas 1 y 7. Se observó que estaban presentes cantidades similares de ambas regiones adyacentes en las células neuroectodérmicas, de 15 chromosomes 1 and 7 respectively, and both adjacent sequences could be detected not only in CMAMh but also in neuroectodermal, endothelial and muscle lines. To determine whether this represented the progeny of a single cell with two retroviral members or the progeny of two cells, real-time PCR was used to compare the relative amount of sequences adjacent to eGFP on chromosomes 1 and 7. It was observed that they were present similar amounts of both adjacent regions in neuroectodermal cells, of

20 endotelio y de músculo lo que sugiere que una única célula con dos insertos retrovirales es probablemente responsable de las CMAMh y de su progenie que son positivas para eGFP. En las otras poblaciones que contenían 3 o más insertos retrovirales no fue posible determinar si los insertos se debían a múltiples sitios de inserción en células únicas o en varias células que contribuían a la fracción positiva para eGFP. Sin embargo, el hallazgo de que en 2 poblaciones, la progenie diferenciada en músculo, endotelio y neuroectodermo se deriva de una única célula 20 endothelium and muscle suggesting that a single cell with two retroviral inserts is probably responsible for the CMAMh and its progeny that are positive for eGFP. In the other populations that contained 3 or more retroviral inserts it was not possible to determine whether the inserts were due to multiple insertion sites in single cells or in several cells that contributed to the positive fraction for eGFP. However, the finding that in 2 populations, the differentiated progeny in muscle, endothelium and neuroectoderm is derived from a single cell

25 progenitora derivada de MO prueba por primera vez de manera definitiva que se pueden cultivar células primitivas a partir de MO que se diferencian en el nivel de única célula en células de estirpe mesodérmica así como las tres estirpes diferentes del neuroectodermo. 25 progenitor derived from MO proves for the first time definitively that primitive cells can be cultured from MO that differ in the level of single cell in mesodermal line cells as well as the three different strains of neuroectoderm.

Tabla 3: Regiones adyacentes y cebadores Table 3: Adjacent regions and primers

Clon Clone

Secuencia genómica Genomic sequence

Secuencia adyacente de rata Adjacent rat sequence

Secuencia adyacente de ratón Adjacent mouse sequence

Negrita: MSCV LTR; Negrita y subrayado: cebador de MSCV LTR utilizado para la Q-PCR cursiva y subrayado: Cebadores de la secuencia adyacente utilizados para la Q-PCR. Bold: MSCV LTR; Bold and underline: MSCV LTR primer used for cursive Q-PCR and underline: Adjacent sequence primers used for Q-PCR.

Ejemplo 6: Dirección e injerto de las CMAM de mamífero en numerosos órganos en el cuerpo Example 6: Direction and grafting of mammalian CMAMs in numerous organs in the body

Se evaluaron CMAMr para determinar si poseían la capacidad de injertarse y diferenciarse in vivo en células específicas del tejido. Se cultivaron las CMAMr tal como se describe en el Ejemplo 1 a partir de un ratón ROSA26, CMAMr were evaluated to determine if they possessed the ability to graft and differentiate in vivo in specific tissue cells. CMAMr were cultured as described in Example 1 from a ROSA26 mouse,

5 C57 negro 6 transgénico para LacZ. Se inyectaron i.v. 106 CMAMr del ratón LacZ en la vena de la cola de ratones NOD-SCID con o sin 250 rades de radiación corporal total 4-6 horas antes de la inyección. Se sacrificaron los animales por dislocación cervical 4-24 semanas después de las inyecciones. 5 C57 black 6 transgenic for LacZ. I.v. 106 CMAMr of the LacZ mouse in the tail vein of NOD-SCID mice with or without 250 rades of total body radiation 4-6 hours before injection. Animals were sacrificed by cervical dislocation 4-24 weeks after injections.

Recolección del tejido Tissue collection

10 Sangre y médula ósea: Se obtuvieron 0,5-1 mL de sangre en el momento en que se sacrificaron los animales. Se recogió la MO extrayéndola de fémures y tibias. Para el fenotipado, se eliminaron los eritrocitos de la sangre y médula ósea utilizando cloruro amónico enfriado con hielo (Stem Cell Technologies Inc., Vancouver, Canada) y se utilizaron 105 células para la centrifugación con una citospin. Para el trasplante en serie, se trasplantaron 5 x 107 10 Blood and bone marrow: 0.5-1 mL of blood was obtained at the time the animals were sacrificed. The MO was collected by extracting it from femurs and tibiae. For phenotyping, erythrocytes were removed from the blood and bone marrow using ice-cold ammonium chloride (Stem Cell Technologies Inc., Vancouver, Canada) and 105 cells were used for centrifugation with a cytospin. For the serial transplant, 5 x 107 were transplanted

15 células de 2 fémures y 2 tibias en receptores secundarios individuales a través de la inyección en la vena de la cola. Se sacrificaron los receptores secundarios tras 7-10 semanas. 15 cells of 2 femurs and 2 tibiae in individual secondary receptors through injection into the tail vein. Secondary receptors were sacrificed after 7-10 weeks.

Órganos sólidos: Se inflaron los pulmones con 1 mL de una dilución 1:4 del compuesto OCT (Sakura-Finetek Inc, EE. UU.) en PBS. Se recolectaron muestras de bazo, hígado, pulmón, intestino, músculo esquelético, miocardio, Solid organs: The lungs were inflated with 1 mL of a 1: 4 dilution of the OCT compound (Sakura-Finetek Inc, USA) in PBS. Spleen, liver, lung, intestine, skeletal muscle, myocardium samples were collected.

20 riñón y cerebro de los animales receptores y se congelaron en OCT a -80 ºC y en ARN Later (Ambion Inc., Austin, TX, EE. UU.) a -20 ºC para PCR cuantitativa. 20 kidney and brain of recipient animals and frozen in OCT at -80 ° C and in Later RNA (Ambion Inc., Austin, TX, USA) at -20 ° C for quantitative PCR.

CMAMr se injerta y diferencia en células específicas del tejido in vivo CMAMr is grafted and differentiated into specific tissue cells in vivo

25 Se evaluó el injerto de células que contenían el transgén �-gal/neomicina (NEO, por sus siglas en inglés) (Zambrowicz et al., 1997) mediante inmunohistoquímica para �-gal y mediante Q-PCR para NEO. La inmunohistoquímica y la Q-PCR se llevaron a cabo tal como se describe en los Ejemplos 5 y 1 respectivamente. Los cebadores se enumeran en la Tabla 1. 25 Grafting of cells containing the �-gal / neomycin transgene (NEO) (Zambrowicz et al., 1997) was evaluated by immunohistochemistry for �-gal and by Q-PCR for NEO. Immunohistochemistry and Q-PCR were carried out as described in Examples 5 and 1 respectively. The primers are listed in Table 1.

30 Se detectó el injerto, definido como detección de >1% de células anti-�-gal, en tejidos hematopoyéticos (sangre, MO y bazo) así como en epitelio pulmonar, hepático e intestinal de todos los animales receptores tal como se muestra en la Tabla 4 y Fig. 4. 30 The graft, defined as detection of> 1% of anti-�-gal cells, was detected in hematopoietic tissues (blood, MO and spleen) as well as in pulmonary, hepatic and intestinal epithelium of all recipient animals as shown in Table 4 and Fig. 4.

Tabla 4: Niveles de injerto en ratones NOD-SCID trasplantados con CMAM ROSA26. Table 4: Graft levels in NOD-SCID mice transplanted with CMAM ROSA26.

AnimalAnimal

Tiempo (Semanas) Niveles de injerto (%) determinados por inmunofluorescencia o (Q-PCR)  Time (Weeks) Graft levels (%) determined by immunofluorescence or (Q-PCR)

Radiación Radiation

Médula Sangre Bazo Hígado Pulmón Intestino Marrow Blood Spleen Liver  Lung Intestine

1 one

4 No 2 (1) 2 5 7 4 2 4 Do not twenty-one) 2 5 7 4 2

2 2

5 No 3 (4) 4 5 9 5 3 5 Do not 3. 4) 4 5 9 5 3

3 3

10 No 1 3 3 6 3 2 10 Do not one  3  3 6  3 2

4 4

16 No 4 2 3 4 3 4 (4,9) 16 Do not  4 2 3  4 3 4 (4.9)

5 5

24 No 3 2 3 6 4 1 24 Do not 3 2 3 6 4 one

6 6

8 Sí 8 (8) 6 4 5 2 (1,1) 7 8 Yes 8 (8)  6 4 5 2 (1,1) 7

7 7

8 Sí 10 8 7 (7,3) 4 6 8 8 Yes 10 8 7 (7.3) 4 6 8

8 8

8 8

Sí 5 8 3 5 5 6 Yes 5  8 3 5 5 6

9 9

8 Sí 7 5 5 6 4 6 8 Yes 7 5 5 6 4 6

10 10

10 10

Sí 5 (6) 7 9 (123) 5 2 8 Yes 5 (6) 7 9 (123) 5 2 8

11 eleven

11 eleven

Sí 8 8 6 5 3 10 (11,9) Yes 8 8 6 5 3 10 (11.9)

12 12

11 Sí 6 5 4 8 (6,2) 10 (12,3) 8 eleven Yes 6 5 4 8 (6.2) 10 (12.3) 8

SR-1SR-1

7 Sí 6 7 5 1 (1,7) 5 8  7 Yes 6 7 5 1 (1,7) 5 8

SR-2 SR-2

10 Sí 5 4 8 3 4 6 10 Yes 5 4 8 3 4 6

Células �-gal+ en MO (Figs. 4B-F) y bazo (Figs. 4H-I) marcadas conjuntamente con Abs anti-CD45, anti-CD19, anti-MacI, anti-Gr1 y anti-Ter119. Se observaron resultados similares en la sangre periférica. Cabe destacar que no se observaron linfocitos T �-gal+CD3+ en sangre, ni MO ni bazo aunque se observaron linfocitos T �-gal+CD3+ en �-gal + cells in MO (Figs. 4B-F) and spleen (Figs. 4H-I) marked together with Abs anti-CD45, anti-CD19, anti-MacI, anti-Gr1 and anti-Ter119. Similar results were observed in peripheral blood. It should be noted that no T �-gal + CD3 + lymphocytes were observed in blood, neither MO nor spleen although T �-gal + CD3 + lymphocytes were observed in

40 ratones quiméricos. En la actualidad se desconoce la razón de esto. 40 chimeric mice. The reason for this is currently unknown.

El injerto en el bazo tuvo lugar principalmente en forma de agregados de células del donante, coherente con la hipótesis de que cuando las CMAM se dirigen al bazo, proliferan localmente y se diferencian para formar una colonia de células del donante, similar a la CFU-S. No se cree que la diferenciación de CMAMr en células hematopoyéticas Graft in the spleen took place mainly in the form of donor cell aggregates, consistent with the hypothesis that when CMAMs are directed to the spleen, they proliferate locally and differentiate to form a colony of donor cells, similar to CFU- S. It is not believed that differentiation of CMAMr in hematopoietic cells

5 in vivo se pueda atribuir a la contaminación de las CMAMr con CMH. En primer lugar, se eliminan las células CD45 de las CMNMO mediante selección por columna antes de iniciar los cultivos de CMAMr. En segundo lugar, los factores de transcripción hematopoyéticos o mesodérmicos tempranos, incluidos la braquiuria (Robertson et al., 2000), GATA-2 y GATA-1 (Weiss et al., 1995), no se expresan en CMAMr indiferenciadas, tal como se muestra por análisis con matriz de ADNc. En tercer lugar, las condiciones de cultivo utilizadas para las CMAMr no promueven las CMH. En cuarto lugar, todos los intentos de inducir la diferenciación hematopoyética a partir de CMAMh in vitro, mediante el cultivo conjunto de CMAMh con citocinas y nutrientes promotores hematopoyéticos han fracasado (Reyes et al., 2001). 5 in vivo can be attributed to the contamination of CMAMr with CMH. First, the CD45 cells of the CMNMOs are removed by column selection before starting the cultures of CMAMr. Second, early hematopoietic or mesodermal transcription factors, including brachyuria (Robertson et al., 2000), GATA-2 and GATA-1 (Weiss et al., 1995), are not expressed in undifferentiated CMAMr, such as It is shown by cDNA matrix analysis. Third, the culture conditions used for the CMAMr do not promote the CMH. Fourth, all attempts to induce hematopoietic differentiation from CMAMh in vitro, through the joint culture of CMAMh with cytokines and hematopoietic promoter nutrients have failed (Reyes et al., 2001).

También se observaron niveles significativos de injerto de CMAMr en el hígado, intestino y pulmón. Se empleó Significant levels of CMAMr graft were also observed in the liver, intestine and lung. It was used

15 inmunohistoquímica con tres colores para identificar las células hematopoyéticas (CD45+) y epiteliales (CK+) en los mismos cortes de tejido de hígado, intestino y pulmón. En el hígado, las células �-gal+ derivadas del donante formaron cordones de hepatocitos (CK18+CD45+ o albúmina+) y ocuparon aproximadamente un 5-10% de una sección dada de 5 μm (Figs. 4K-M). Se identificaron claramente en las células epiteliales varias células hematopoyéticas CK18+CD45+ �-gal- originarias del receptor. Las células albúmina+ �-gal+ y CK18+ �-gal+ se injertaron en cordones de hepatocitos que rodeaban los espacios portal, una pauta observada en la regeneración hepática a partir de células madre hepáticas y células ovales (Alison et al., 1998; Petersen et al., 1999). Esto y el hecho de que únicamente 5/20 cortes contuvieran células del donante, es consistente con la idea de que las células madre se injertan en algunas áreas del hígado, donde proliferan y se diferencian en hepatocitos, pero no en todas. 15 immunohistochemistry with three colors to identify hematopoietic (CD45 +) and epithelial (CK +) cells in the same sections of liver, intestine and lung tissue. In the liver, donor-derived �-gal + cells formed hepatocyte cords (CK18 + CD45 + or albumin +) and occupied approximately 5-10% of a given 5 μm section (Figs. 4K-M). Several CK18 + CD45 + �-gal-hematopoietic cells originating from the receptor were clearly identified in the epithelial cells. Albumin + �-gal + and CK18 + �-gal + cells were grafted into hepatocyte cords that surrounded the portal spaces, a pattern observed in liver regeneration from liver stem cells and oval cells (Alison et al., 1998; Petersen et al ., 1999). This and the fact that only 5/20 cuts contained donor cells, is consistent with the idea that stem cells are grafted into some areas of the liver, where they proliferate and differentiate into hepatocytes, but not all.

25 El injerto en el intestino también fue consistente con lo que se conoce acerca de las células madre epiteliales intestinales. En el intestino, cada cripta contiene una población de 4-5 células madre de vida larga (Potten, 1998). La progenie de estas células madre puede experimentar varios ciclos de división en las porciones media y superior de las criptas y dar lugar a células epiteliales que migran de manera ascendente, fuera de la cripta, a las vellosidades adyacentes. Las células epiteliales �-gal+panCK+CD45- derivadas del donante cubrieron completamente varias vellosidades (Figs. 4O-P). En algunas vellosidades, las células �-gal+panCK+CD45- constituyeron únicamente un 50% de la circunferencia (flechas sólidas, Fig. 4P) lo que sugiere el injerto en una pero no en ambas criptas. Se observaron claramente varias células �-gal+panCK- en el núcleo de las vellosidades intestinales (flecha abierta, Fig. 4O). Estas células se tiñeron de manera conjunta para CD45 (Fig. 4P), lo que indica que son células hematopoyéticas derivadas del donante. En el pulmón, la mayoría de las células del donante dieron lugar a células 25 The graft in the intestine was also consistent with what is known about intestinal epithelial stem cells. In the intestine, each crypt contains a population of 4-5 long-lived stem cells (Potten, 1998). The progeny of these stem cells can undergo several cycles of division in the middle and upper portions of the crypts and give rise to epithelial cells that migrate upwards, outside the crypt, to adjacent villi. The donor-derived epithelial cells �-gal + panCK + CD45- completely covered several villi (Figs. 4O-P). In some villi, �-gal + panCK + CD45- cells constituted only 50% of the circumference (solid arrows, Fig. 4P) which suggests grafting in one but not in both crypts. Several �-gal + panCK- cells were clearly observed in the nucleus of the intestinal villi (open arrow, Fig. 4O). These cells were stained together for CD45 (Fig. 4P), indicating that they are hematopoietic cells derived from the donor. In the lung, most donor cells gave rise to cells

35 epiteliales alveolares �-gal+panCK+CD45-y en cambio la mayoría de las células hematopoyéticas fueron originarias del receptor (panCK-CD45+ �-gal-) (Fig. 4R). 35 alveolar epithelial �-gal + panCK + CD45-and instead most of the hematopoietic cells originated from the receptor (panCK-CD45 + �-gal-) (Fig. 4R).

Los niveles de injerto detectados por inmunohistoquímica fueron coherentes con los niveles determinados por Q-PCR para NEO (Tabla 4). Los niveles de injerto fueron similares en animales analizados tras 4-24 semanas tras la inyección i.v. de CMAM (Tabla 4). The graft levels detected by immunohistochemistry were consistent with the levels determined by Q-PCR for NEO (Table 4). Graft levels were similar in animals analyzed after 4-24 weeks after injection i.v. of CMAM (Table 4).

No se observó contribución al músculo cardíaco o esquelético. Al contrario que para los tejidos epiteliales y el sistema hematopoyético, se apreció muy poco recambio celular o ninguno en el músculo cardíaco o esquelético, en ausencia de herida en el tejido. Por tanto, no se puede esperar una contribución significativa de las células madre a 45 estos tejidos. Sin embargo, no se detectó injerto en la piel y riñón, dos órganos en los cuales las células epiteliales experimentan un recambio celular rápido. En los experimentos con inyección de blastocistos (Ejemplo 8) se muestra que las CMAMr se pueden diferenciar en esos tipos celulares; una explicación posible para la ausencia de injerto en estos órganos en receptores que ya han nacido es que las CMAMr no se dirigen a estos órganos, una hipótesis que se está evaluando en la actualidad. Aunque las CMAMr se diferenciaron en células similares al neuroectodermo ex vivo, no se apreció un injerto significativo de CMAMr en el cerebro y las pocas células del donante observadas en el cerebro no se marcaron conjuntamente con los marcadores neuroectodérmicos. Dos publicaciones recientes han demostrado que se pueden detectar células derivadas del donante con características neuroectodérmicas en el cerebro de animales que han sido objeto de un trasplante de médula ósea. Sin embargo, se empleó un régimen preparativo totalmente ablativo anterior al trasplante o el trasplante en animales recién nacidos, condiciones No contribution to the heart or skeletal muscle was observed. In contrast to epithelial tissues and the hematopoietic system, very little or no cell turnover was seen in the cardiac or skeletal muscle, in the absence of tissue injury. Therefore, a significant contribution of the stem cells to these tissues cannot be expected. However, no graft was detected in the skin and kidney, two organs in which epithelial cells undergo rapid cell turnover. In experiments with blastocyst injection (Example 8) it is shown that CMAMr can be differentiated into these cell types; A possible explanation for the absence of grafting in these organs in recipients that have already been born is that CMAMr does not target these organs, a hypothesis that is currently being evaluated. Although CMAMr differentiated into cells similar to ex vivo neuroectoderm, a significant graft of CMAMr was not seen in the brain and the few donor cells observed in the brain were not labeled in conjunction with neuroectodermal markers. Two recent publications have shown that donor-derived cells with neuroectodermal characteristics can be detected in the brain of animals that have undergone a bone marrow transplant. However, a fully ablative preparatory regimen prior to transplantation or transplantation in newborn animals was used, conditions

55 asociadas con daños en la barrera hematoencefálica. Se infundieron las células en animales adultos no irradiados o animales tratados con dosis de radiación bajas, donde la barrera hematoencefálica está intacta o dañada solamente en un grado mínimo. Esto puede explicar la falta de injerto de CMAMr en el SNC. 55 associated with damage to the blood brain barrier. Cells were infused into non-irradiated adult animals or animals treated with low radiation doses, where the blood-brain barrier is intact or damaged only to a minimum extent. This may explain the lack of CMAMr grafting in the CNS.

Las CMAM confluentes no se diferencian in vivo Confluent CMAMs do not differ in vivo

Como control, se infundieron ROSA26-CMAM y se cultivaron hasta alcanzar la confluencia antes de la inyección. Las CMAM a las que se les permitió llegar a la confluencia perdieron su capacidad de diferenciarse ex vivo en células fuera del mesodermo y se comportaron como CMM clásicas (Reyes, M. et al. 2001). La infusión de 106 CMAMr confluentes no dio lugar a niveles significativos de injerto de células del donante. Aunque se observaron 65 algunas células �-gal+ en la MO, estas células no se marcaron conjuntamente con Abs anti-CD45, lo que indica que As a control, ROSA26-CMAM was infused and cultured until it reached confluence before injection. The CMAMs that were allowed to reach the confluence lost their ability to differentiate ex vivo into cells outside the mesoderm and behaved like classical CMMs (Reyes, M. et al. 2001). Infusion of 106 confluent CMAMr did not result in significant levels of donor cell grafting. Although 65 �-gal + cells were observed in the MO, these cells were not labeled together with anti-CD45 Abs, indicating that

las CMM pueden injertarse en los tejidos pero pierden su capacidad de diferenciarse en células específicas de los tejidos en respuesta a estímulos locales. CMMs can be grafted into tissues but lose their ability to differentiate into specific tissue cells in response to local stimuli.

Las células derivadas de CMAM en médula ósea de ratón se pueden transferir en serie CMAM derived cells in mouse bone marrow can be transferred in series

5 Se evaluó la MO de ratón injertada con CMAM ROSA26 para determinar si contenían células que se pudieran injertar en receptores secundarios. 1,5 x 107 células de MO, recuperadas de los receptores primarios 11 semanas después de la infusión i.v. de CMAMr, se transfirieron a los receptores NOD-SCID irradiados secundarios (Tabla 4: animales SR-1 y SR-2). Después de 7 y 10 semanas, se sacrificaron los receptores secundarios y se analizaron la sangre, MO, bazo, hígado, pulmón e intestinos del animal receptor para detectar el injerto de células ROSA26 del donante por inmunohistoquímica y por Q-PCR para detectar el gen NEO. En los receptores secundarios se observó una pauta de injerto similar a la de los receptores primarios. Un 4-8% de las células de MO, de bazo y células PB fueron �-gal+CD45+, un 6 y 8% de las células epiteliales intestinales fueron �-gal+pan-CK+ y un 4 y 5% de las células epiteliales pulmonares fueron �-gal+pan-CK+. Los niveles de injerto en el hígado de los receptores secundarios fue 5 Mouse MO grafted with CMAM ROSA26 was evaluated to determine if they contained cells that could be grafted into secondary receptors. 1.5 x 107 MO cells, recovered from primary receptors 11 weeks after infusion i.v. of CMAMr, were transferred to secondary irradiated NOD-SCID receptors (Table 4: SR-1 and SR-2 animals). After 7 and 10 weeks, the secondary receptors were sacrificed and the blood, MO, spleen, liver, lung and intestines of the recipient animal were analyzed to detect graft of donor ROSA26 cells by immunohistochemistry and by Q-PCR to detect the gene NEO A graft pattern similar to that of the primary receptors was observed in the secondary recipients. 4-8% of the MO, spleen and PB cells were �-gal + CD45 +, 6 and 8% of the intestinal epithelial cells were �-gal + pan-CK + and 4 and 5% of the cells Pulmonary epithelials were �-gal + pan-CK +. The graft levels in the liver of the secondary receptors was

15 menor que en los receptores primarios (un 1 y 3% vs. a un 5 y 8% de -gal+CK18+). Esto sugiere que las CMAMr pueden persistir en la MO del receptor primario y diferenciarse en células hematopoyéticas así como en células epiteliales cuando se transfieren a un receptor secundario. 15 lower than in primary recipients (1 and 3% vs. 5 and 8% of -gal + CK18 +). This suggests that CMAMr can persist in the MO of the primary receptor and differentiate into hematopoietic cells as well as epithelial cells when transferred to a secondary receptor.

Las células derivadas de CMAM pueden producir insulina in vivo. Las CMAM de ratones ROSA26 se inyectaron en ratones NOD-SCID irradiados tal como se ha descrito en la presente. Las células derivadas de CMAM resultantes se tiñeron conjuntamente para LacZ e insulina en un modelo de diabetes inducida por estreptozotocina. CMAM derived cells can produce insulin in vivo. CMAMs of ROSA26 mice were injected into irradiated NOD-SCID mice as described herein. The resulting CMAM derived cells were stained together for LacZ and insulin in a streptozotocin-induced diabetes model.

Resumen Summary

25 Una de las preguntas clave en la “plasticidad de las células madre” es si las CMAMr del donante diferenciadas e injertadas son funcionales. Los resultados descritos en la presente muestran que un animal desarrolló un linfoma en el timo y bazo tras 16 semanas, como se observa comúnmente en ratones NOD-SCID de edad avanzada (Prochazka et al., 1992). El análisis fenotípico mostró que este linfoma de linfocitos B se derivó del receptor: las células CD19+ fueron �-gal-. Aproximadamente un 40% de las células CD45-vWF+ en el sistema vascular del tumor se tiñó con Abs anti-�-gal, lo que indica que la neoangiogénesis en el tumor se derivó en parte de CMAMr del donante (Fig. 4T). Esto sugiere que las CMAM dan lugar a una progenie funcional in vivo. Del mismo modo, niveles elevados de injerto y diferenciación de CMAMr en órganos radiosensibles, tales como el sistema hematopoyético y el epitelio intestinal (Tabla 4, p<0,001), tras una dosis baja de radiación sugiere que las CMAMr pueden contribuir funcionalmente a los tejidos del receptor. 25 One of the key questions in “stem cell plasticity” is whether differentiated and grafted donor CMAMr are functional. The results described herein show that an animal developed a lymphoma in the thymus and spleen after 16 weeks, as is commonly observed in elderly NOD-SCID mice (Prochazka et al., 1992). Phenotypic analysis showed that this B-cell lymphoma was derived from the receptor: CD19 + cells were �-gal-. Approximately 40% of the CD45-vWF + cells in the tumor vascular system were stained with anti-�-gal Abs, indicating that the neoangiogenesis in the tumor was derived in part from the donor's CMAMr (Fig. 4T). This suggests that CMAMs give rise to a functional progeny in vivo. Similarly, high levels of grafting and differentiation of CMAMr in radiosensitive organs, such as the hematopoietic system and intestinal epithelium (Table 4, p <0.001), after a low dose of radiation suggests that CMAMr can functionally contribute to tissues of the receiver.

35 Estos resultados muestran que las CMAM de mamíferos se pueden purificar, expandir ex vivo, e infundir i.v., dirigirse a varios sitios del cuerpo, injertarse en numerosos órganos y que las células están vivas en estos diferentes órganos un mes o más. Tales células del donante indiferenciadas y la progenie diferenciada se encuentran, en virtud del marcador fluorescente, en órganos que incluyen, sin carácter limitante, la MO, bazo, hígado y pulmón. Estas células se pueden emplear para repoblar uno o más compartimentos para aumentar o restaurar la función del órgano o célula. 35 These results show that mammalian CMAMs can be purified, expanded ex vivo, and infused i.v., directed to various sites in the body, grafted into numerous organs and that cells are alive in these different organs a month or more. Such undifferentiated donor cells and differentiated progeny are found, by virtue of the fluorescent marker, in organs that include, without limitation, the MO, spleen, liver and lung. These cells can be used to repopulate one or more compartments to increase or restore the function of the organ or cell.

Ejemplo 7. Demostración de la eritropoyesis y hematopoyesis in vitro Example 7. Demonstration of erythropoiesis and hematopoiesis in vitro

45 Las CMAM de MO humana se diferencian en el nivel de única célula en estirpes neuroectodérmicas, endodérmicas y muchas estirpes mesodérmicas, incluidas las células endoteliales. Debido a que el endotelio y la sangre están relacionados en la ontogenia de una manera muy estrecha, se puede suponer que las CMAM se pueden diferenciar en células hematopoyéticas. CMAM humanas transducidas con eGFP, que carecen de GlyA, CD45 y CD34 (n = 20), se cultivaron junto con la línea celular mesodérmica del saco vitelino de ratón, YSM5, como suspensión de agregados celulares durante 6 días en medio exento de suero suplementado con 10 ng/mL de FCFb y FCEV. Tras seis días, únicamente permanecían las células eGFP+ (es decir, la progenie de CMAM) y las células YSM5 habían perecido. 45 The CMAM of human MO differ in the level of single cell in neuroectodermal, endodermal and many mesodermal lines, including endothelial cells. Because the endothelium and blood are closely related to ontogeny, it can be assumed that CMAMs can be differentiated into hematopoietic cells. Human CMAM transduced with eGFP, lacking GlyA, CD45 and CD34 (n = 20), were grown together with the mesodermal cell line of the mouse yolk sac, YSM5, as a suspension of cell aggregates for 6 days in serum-free medium supplemented with 10 ng / mL of FCFb and FCEV. After six days, only the eGFP + cells (i.e., the progeny of CMAM) remained and the YSM5 cells had perished.

Se transfirieron las células restantes a cultivos de metilcelulosa que contenían un 10% de suero bovino fetal The remaining cells were transferred to methylcellulose cultures containing 10% fetal bovine serum

55 suplementado con 10 ng/mL de proteína morfogénica de hueso (PMH)4, FCEV, FCFb, factor de células madre (FCM), Flt3L, hiper IL6, trombopoyetina (TPO) y eritropoyetina (EPO) durante 2 semanas. En estos cultivos se detectaron tanto las células eGFP+ adherentes como células pequeñas, redondas y no adherentes, las cuales formaron muchas colonias uniéndose a las células adherentes. Se recogieron de manera separada las fracciones adherente y no adherente y se cultivaron en medio que contenía un 10% de FCS con 10 ng/mL de FCEV y FCFb durante 7 días. Las células adherentes presentaron una tinción positiva para vWF, formaron tubos vasculares cuando se colocaron en placas en MEC y fueron capaces de incorporar a-LDL, lo que indica su naturaleza endotelial. Un 5-50% de las células no adherentes presentaron una tinción positiva para el HLA de clase I y GlyA específica humana por citometría de flujo. Se seleccionaron las células Gly-A+/(HLA de clase I)+ por FACS. En la tinción Wright-Giemsa, estas células exhibieron la pauta de tinción y morfología características de los eritroblastos 55 supplemented with 10 ng / mL of bone morphogenic protein (PMH) 4, FCEV, FCFb, stem cell factor (FCM), Flt3L, hyper IL6, thrombopoietin (TPO) and erythropoietin (EPO) for 2 weeks. In these cultures both adherent eGFP + cells and small, round and non-adherent cells were detected, which formed many colonies joining the adherent cells. The adherent and non-adherent fractions were collected separately and grown in medium containing 10% FCS with 10 ng / mL FCEV and FCFb for 7 days. Adherent cells showed a positive staining for vWF, formed vascular tubes when plated in MEC and were able to incorporate a-LDL, indicating their endothelial nature. 5-50% of the non-adherent cells had a positive staining for HLA class I and human-specific GlyA by flow cytometry. Gly-A + / (HLA class I) + cells were selected by FACS. In Wright-Giemsa staining, these cells exhibited the staining pattern and morphology characteristic of erythroblasts

65 primitivos. Las células fueron benzidina+ y (Hb humana)+ en la detección con inmunoperoxidasa. Por RT-PCR estas células expresaron la Hb-e específica humana, pero no la Hb-a. 65 primitives. The cells were benzidine + and (human Hb) + on immunoperoxidase detection. By RT-PCR these cells expressed human specific Hb-e, but not Hb-a.

Cuando se colocaron de nuevo en placas para el ensayo en metilcelulosa con un 20% de FCS y EPO, se observaron pequeñas colonias eritroides tras 10 días y un 100% de estas colonias presentaron una tinción positiva para la Hb y GlyA específicas humanas. Como la selección de las CMAM depende de la eliminación de las células When they were placed back on plates for testing in methylcellulose with 20% FCS and EPO, small erythroid colonies were observed after 10 days and 100% of these colonies showed a positive staining for specific human Hb and GlyA. How the selection of CMAMs depends on the elimination of cells

5 CD45+ y GlyA+ de la MO y las células CMAM cultivadas fueron CD45- y GlyA-en todas las ocasiones en que se examinaron utilizando tanto el análisis con matriz de ADNc como FACS, la contaminación de CMAM con células hematopoyéticas es muy improbable. 5 CD45 + and GlyA + of the MO and the cultured CMAM cells were CD45- and GlyA- on all occasions when they were examined using both cDNA matrix analysis and FACS, contamination of CMAM with hematopoietic cells is very unlikely.

Ejemplo 8. Prueba in vivo de la naturaleza multipotente de las CMAM tal como lo muestra el quimerismo de 10 múltiples órganos tras la inyección de las células con blastocistos Example 8. In vivo test of the multipotent nature of CMAMs as shown by the multiple organ chimerism after injection of blastocyst cells

La capacidad de las CMAM para proliferar y diferenciarse in vivo en los tipos celulares apropiados es importante para las aplicaciones terapéuticas de estas células. Hasta este punto, las únicas células que deberían ser capaces de contribuir a todo el conjunto de tejidos y órganos en el cuerpo son las células ME. Con el fin de analizar si las The ability of CMAMs to proliferate and differentiate in vivo in appropriate cell types is important for the therapeutic applications of these cells. Up to this point, the only cells that should be able to contribute to the whole set of tissues and organs in the body are ME cells. In order to analyze if the

15 CMAM podían mostrar la plena capacidad de las células ME, se sometieron a ensayo para determinar su contribución a la formación de varios tejidos introduciéndolas en los blastocistos tempranos y observando el destino de su progenie. 15 CMAM could show the full capacity of the ME cells, they were tested to determine their contribution to the formation of several tissues by introducing them into the early blastocysts and observing the fate of their progeny.

Se generaron CMAM a partir de médula de ratones ROSA26 que son transgénicos para el gen de la �-galactosidasa CMAMs were generated from the marrow of ROSA26 mice that are transgenic for the �-galactosidase gene

20 (�-gal) (Rafii, S., et al., 1994, Blood. 84:10-13) y se expandieron tal como se describe en el Ejemplo 1. Una o 10-12 CMAM ROSA26 obtenidas tras 55-65 DP se microinyectaron en 88 y 40 blastocistos C57BL/6 de 3,5 días, respectivamente. Los blastocistos (8/madre) se transfirieron a 16 madres subrogadas y se permitió que los ratones se desarrollaran y nacieran tal como se muestra en la Tabla 5. 20 (�-gal) (Rafii, S., et al., 1994, Blood. 84: 10-13) and expanded as described in Example 1. One or 10-12 CMAM ROSA26 obtained after 55-65 DP were microinjected in 88 and 40 C57BL / 6 blastocysts of 3.5 days, respectively. The blastocysts (8 / mother) were transferred to 16 surrogate mothers and the mice were allowed to develop and be born as shown in Table 5.

25 Tabla 5. Grado de quimerismo tras la inyección de CMAM en el blastocisto 25 Table 5. Degree of chimerism after CMAM injection in the blastocyst

CMAM/ blastocisto CMAM / blastocyst

Camadas nacidas N°. de cachorros nacidos Positivo para NEO por Q-PCR Litters born No. of puppies born Positive for NEO by Q-PCR

0%0%

1-10% 10-20% 20-40% >40%  1-10% 10-20% 20-40% > 40%

10-1210-12

4/11 22 5/22 (23%) 13/22 (59%) 2/22 (9%) 1/22 (4,5%) 1/22 (4,5%)  4/11 22 5/22 (23%) 13/22 (59%) 2/22 (9%) 1/22 (4.5%) 1/22 (4.5%)

1 one

3/5 15 8/15 (53%) 5/15 (33%) 0/15 (0%) 0/15 (0%) 2/15 (13%) 3/5 fifteen 8/15 (53%) 5/15 (33%) 0/15 (0%) 0/15 (0%) 2/15 (13%)

Nacieron siete camadas, en consonancia con la tasa de nacimiento observada en otros estudios durante este período. El número de ratones por camada varió entre 1 y 8, con un total de 37 ratones. Los animales que nacieron Seven litters were born, consistent with the birth rate observed in other studies during this period. The number of mice per litter varied between 1 and 8, with a total of 37 mice. The animals that were born

30 a partir de blastocistos microinyectados fueron de un tamaño similar a los animales normales y no presentaron ninguna anomalía patente. 30 from microinjected blastocysts were similar in size to normal animals and did not show any patent anomaly.

Tras cuatro semanas, se evaluaron los animales para determinar su quimerismo recortando sus colas y evaluando la contribución de las células que contenían el transgén �-gal/NEO a las colas mediante Q-PCR para determinar NEO. 35 Se determinó el porcentaje de quimerismo comparando el número de copias de NEO en las muestras de ensayo con aquellas del tejido de ratones ROSA26 de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (7700 ABI PRISM Detector Software 1.6). Se pudo detectar quimerismo en un 70% de los ratones derivados de blastocistos en los cuales se habían inyectado de 10 a 12 CMAM y en un 50% de los ratones derivados de blastocistos microinyectados con 1 CMAM (Tabla 5). El grado de quimerismo estuvo comprendido entre un 0,1% y >45%. Después de 6 a 20 40 semanas, se sacrificaron los animales. Se congelaron algunos ratones en nitrógeno líquido y se realizaron cortes finos tal como se describe. Los cortes de los ratones completos se tiñeron con X-Gal. A continuación se ensamblaron mil conjuntos de imágenes digitales que cubrían completamente cada corte para crear una imagen compuesta de cada corte de ratón completo. En un animal no quimérico representativo (mediante Q-PCR para NEO) derivado a partir de un blastocisto en el cual se inyectó una única CMAM, no se apreció tinción para X-Gal. En 45 cambio, se determinó que el animal era quimérico en un 45% por R-PCR para NEO mediante el análisis por el corte de la cola y que hubo contribución en todos los tejidos somáticos de una única CMAM derivada de ratones ROSA26. After four weeks, the animals were evaluated to determine their chimerism by trimming their tails and evaluating the contribution of the cells containing the �-gal / NEO transgene to the tails by Q-PCR to determine NEO. 35 The percentage of chimerism was determined by comparing the number of copies of NEO in the test samples with those from the tissue of ROSA26 mice according to the manufacturer's recommendations (7700 ABI PRISM Detector Software 1.6). Chimerism could be detected in 70% of blastocyst derived mice in which 10-12 CMAM had been injected and in 50% of blastocyst derived mice microinjected with 1 CMAM (Table 5). The degree of chimerism was between 0.1% and> 45%. After 6 to 20 weeks, the animals were sacrificed. Some mice were frozen in liquid nitrogen and fine cuts were made as described. The cuts of the complete mice were stained with X-Gal. A thousand sets of digital images were then assembled that completely covered each cut to create a composite image of each complete mouse cut. In a representative non-chimeric animal (by Q-PCR for NEO) derived from a blastocyst in which a single CMAM was injected, no staining was observed for X-Gal. On the other hand, it was determined that the animal was 45% chimeric by R-PCR for NEO by tail cut analysis and that there was a contribution in all somatic tissues of a single CMAM derived from ROSA26 mice.

Para otros animales, se recolectaron múltiples órganos y se analizaron para detectar la presencia de células derivadas de CMAM por tinción con X-GAL, tinción con un anticuerpo anti-�-gal-FITC y Q-PCR para NEO. Los For other animals, multiple organs were collected and analyzed for the presence of CMAM-derived cells by staining with X-GAL, staining with an anti-�-gal-FITC antibody and Q-PCR for NEO. The

50 animales que presentaron células NEO+ en los corte de la cola presentaron contribución de las CMAM derivadas de ROSA26 en todos los tejidos, incluidos el cerebro, retina, pulmón, músculo esquelético y cardíaco, hígado, intestino, riñón, bazo, MO, sangre y piel tal como muestra la tinción con X-GAL y la tinción con un anticuerpo anti-�-gal-FITC. 50 animals that presented NEO + cells in the tail section presented contribution of CMAM derived from ROSA26 in all tissues, including the brain, retina, lung, skeletal and cardiac muscle, liver, intestine, kidney, spleen, MO, blood and skin as shown by staining with X-GAL and staining with an anti-�-gal-FITC antibody.

Se detectó quimerismo por tinción con X-Gal y tinción con anti-�-gal en los animales generados a partir de Chimerism was detected by staining with X-Gal and staining with anti-�-gal in animals generated from

55 blastocistos microinyectados con CMAM ROSA26. Las células �-gal+ expresaron marcadores típicos del tejido en el cual se habían incorporado. Las células �-gal+ se tiñeron conjuntamente con anti-�-gal+ FITC y anti-NF200 o GFAP y TOPRO3 (examinado con una amplificación 20X) para NF200 y GFAP en el sistema nervioso central y para distrofina en el músculo esquelético. Se tiñó el tejido pulmonar con anti-�-gal-FITC y pan-CK en los alveolos y bronquios (también TOPRO3) (examinado con una amplificación 20X). El músculo esquelético teñido con anti-�-gal-FITC, distrofina-PE y TOPRO3 se examinó con una amplificación 20X. El corazón se tiñó con anti-p-gal-FITC y troponina cardíaca-I-Cy3, TOPRO3 y se examinó con una amplificación 20X. El hígado se tiñó con anti--gal-FITC y pan-CK-PE y TOPRO3 (se examinó con una amplificación 40X y una amplificación 10X). Se tiñó el intestino con anti55 blastocysts microinjected with CMAM ROSA26. �-Gal + cells expressed typical markers of the tissue in which they had been incorporated. The �-gal + cells were stained together with anti-�-gal + FITC and anti-NF200 or GFAP and TOPRO3 (examined with a 20X amplification) for NF200 and GFAP in the central nervous system and for dystrophin in skeletal muscle. Pulmonary tissue was stained with anti-�-gal-FITC and pan-CK in the alveoli and bronchi (also TOPRO3) (examined with a 20X amplification). Skeletal muscle stained with anti-�-gal-FITC, dystrophin-PE and TOPRO3 was examined with a 20X amplification. The heart was stained with anti-p-gal-FITC and cardiac troponin-I-Cy3, TOPRO3 and examined with a 20X amplification. The liver was stained with anti-gal-FITC and pan-CK-PE and TOPRO3 (examined with a 40X amplification and a 10X amplification). The intestine was stained with anti

5 �-gal-FITC, pan-CK-PE y TOPRO3 y se examinó con una amplificación 20X. Se tiñó el riñón con anti-�-gal-FITC (glomérulos, túbulos) y se examinó con una amplificación 20X. La tinción de la médula se examinó con anti-�-gal-FITC y CD45-PE, GRI-PE y MACI-PE. La tinción del bazo se examinó con anti-�-gal-FITC y CD45-PE, CD3-PE y CD19-PE. Los niveles de injerto por Q-PCR para NEO fueron coherentes con aquellos estimados por tinción con X-GAL y anti-�-gal-FITC. 5 �-gal-FITC, pan-CK-PE and TOPRO3 and examined with a 20X amplification. The kidney was stained with anti-�-gal-FITC (glomeruli, tubules) and examined with a 20X amplification. Marrow staining was examined with anti-�-gal-FITC and CD45-PE, GRI-PE and MACI-PE. Staining of the spleen was examined with anti-�-gal-FITC and CD45-PE, CD3-PE and CD19-PE. Graft levels by Q-PCR for NEO were consistent with those estimated by staining with X-GAL and anti-�-gal-FITC.

Resumen Summary

Estos datos demuestran por primera vez que las CMAM únicas derivadas de MO se integran en el ratón en desarrollo, dan lugar a células con varios destinos y contribuyen a la generación de todos los tejidos y órganos de These data demonstrate for the first time that the unique CMAMs derived from MO are integrated into the developing mouse, give rise to cells with various destinations and contribute to the generation of all tissues and organs of

15 las tres capas germinales del ratón. Como todos los animales vivos, independientemente del grado de quimerismo, presentaron órganos con un funcionamiento normal, estos estudios también sugieren que las CMAM se pueden diferenciar in vivo en células funcionales de las tres capas germinales. Aún no ha evaluado si las CMAM contribuyen a las células germinales cuando se inyectan en un blastocisto o cuando se inyectan después del nacimiento. 15 the three germ layers of the mouse. As all living animals, regardless of the degree of chimerism, presented organs with normal functioning, these studies also suggest that CMAMs can be differentiated in vivo into functional cells of the three germ layers. He has not yet evaluated whether CMAMs contribute to germ cells when injected into a blastocyst or when injected after birth.

Ejemplo 9. Origen de los progenitores endoteliales Example 9. Origin of endothelial parents

La vasculogénesis, la diferenciación in situ de los progenitores endoteliales primitivos, denominados angioblastos, en células endoteliales que se agregan en un plexus capilar primario es responsable del desarrollo del sistema vascular durante la embriogénesis (Hirashima et al., 1999). En cambio, la angiogénesis, definida como la formación de Vasculogenesis, the differentiation in situ of the primitive endothelial progenitors, called angioblasts, in endothelial cells that are added in a primary capillary plexus is responsible for the development of the vascular system during embryogenesis (Hirashima et al., 1999). Instead, angiogenesis, defined as the formation of

25 nuevos vasos sanguíneos por un proceso de brote a partir de los vasos preexistentes, ocurre tanto durante el desarrollo como en la vida posterior al nacimiento (Holash et al., 1999; Yang et al., 2001). Hasta recientemente, se pensaba que la formación de vasos sanguíneos en la vida posterior al nacimiento estaba mediada por el brote de células endoteliales a partir de vasos existentes. Sin embargo, estudios recientes han sugerido que las “células madre” endoteliales pueden mantenerse en la vida adulta, donde contribuyen a la formación de nuevos vasos sanguíneos (Peichev et al., 2000; Lin et al., 2000; Gehling et al., 2000; Asahara et al., 1997; Shi et al., 1998), lo que sugiere que durante el desarrollo la neoangiogénesis en el adulto puede depender, al menos en parte, de un proceso de vasculogénesis. Se han aislado precursores de células endoteliales de MO y sangre periférica (Peichev et al., 2000; Watt et al., 1995). Se desconoce la ontogenia de estos progenitores endoteliales. 25 new blood vessels by an outbreak process from the preexisting vessels, occurs both during development and in life after birth (Holash et al., 1999; Yang et al., 2001). Until recently, it was thought that the formation of blood vessels in post-birth life was mediated by the outbreak of endothelial cells from existing vessels. However, recent studies have suggested that endothelial "stem cells" can be maintained in adulthood, where they contribute to the formation of new blood vessels (Peichev et al., 2000; Lin et al., 2000; Gehling et al., 2000; Asahara et al., 1997; Shi et al., 1998), which suggests that during development, neoangiogenesis in adults may depend, at least in part, on a process of vasculogenesis. Endothelial cells of MO and peripheral blood have been isolated (Peichev et al., 2000; Watt et al., 1995). The ontogeny of these endothelial progenitors is unknown.

35 Durante el desarrollo, las células endoteliales se derivan del mesodermo. El receptor 2 de FCEV, Flk1, caracteriza los hemangioblastos, una célula madre bipotente que se encuentra en la región aorta-gónada-mesonefros (Medvinsky et al., 1996; Fong et al., 1999; Peault, 1996) y en el hígado fetal (Fong et al., 1999) y el compromiso de los cuerpos embrioides en la formación de los hemangioblastos está acompañada por la expresión de Flkl (Choi et al., 1998; Choi, 1998). Se desconoce si los hemangioblastos se mantienen en la vida adulta y únicamente se han documentado CMH y los progenitores endoteliales. Como los hemangioblastos, los progenitores endoteliales expresan Flkl (Peichev et al., 2000) y un informe sugiere que las CMH en la vida posterior al nacimiento expresan Flk1 (Ziegler et al., 1999). Durante la embriología, el compromiso de los hemangioblastos en la generación de la estirpe endotelial se caracteriza por la expresión secuencial de la VE-cadherina, CD31 y poco después CD34 (Nishikawa et al., 1998; Yamashita et al., 2000). En la vida posterior al nacimiento, se han seleccionado progenitores 35 During development, endothelial cells are derived from the mesoderm. The FCEV receptor 2, Flk1, characterizes hemangioblasts, a bipotent stem cell found in the aorta-gonad-mesonephros region (Medvinsky et al., 1996; Fong et al., 1999; Peault, 1996) and in the liver Fetal (Fong et al., 1999) and the involvement of embryoid bodies in the formation of hemangioblasts is accompanied by the expression of Flkl (Choi et al., 1998; Choi, 1998). It is unknown whether hemangioblasts are maintained in adulthood and only CMH and endothelial progenitors have been documented. Like hemangioblasts, endothelial progenitors express Flkl (Peichev et al., 2000) and a report suggests that CMH in life after birth express Flk1 (Ziegler et al., 1999). During embryology, the involvement of hemangioblasts in the generation of endothelial lineage is characterized by the sequential expression of VE-cadherin, CD31 and shortly after CD34 (Nishikawa et al., 1998; Yamashita et al., 2000). In the post-birth life, parents have been selected

45 endoteliales a partir de MO y sangre utilizando Abs contra AC133, Flk1, CD34 y el Ab H1P12 (Peichev et al., 2000; Lin et al., 2000; Gehling et al., 2000). También se ha detectado AC133 en otras células, incluidas CMN (Uchida et al., 2000) y células epiteliales gastrointestinales (Corbeil et al., 2000). Tras la diferenciación en un endotelio maduro, se pierde rápidamente el receptor AC133 (Peichev et al., 2000; Gehling et al., 2000). Otro receptor detectado en las células endoteliales circulantes es una mucina, MUC18, reconocida por el Ab H1P12 (Lin et al., 2000). MUC18 se pierde tras la diferenciación de los progenitores endoteliales en endotelio. Se expresa CD34 en los progenitores endoteliales, así como en los progenitores hematopoyéticos (Peichev et al., 2000; Baumhueter et al., 1994) y células ovales hepáticas (Crosby et al., 2001). Este antígeno también se pierde tras la diferenciación de los progenitores endoteliales en endotelio. La mayoría de las células endoteliales maduras, excepto las células endoteliales microvasculares, ya no expresan CD34. 45 endothelials from MO and blood using Abs against AC133, Flk1, CD34 and Ab H1P12 (Peichev et al., 2000; Lin et al., 2000; Gehling et al., 2000). AC133 has also been detected in other cells, including CMN (Uchida et al., 2000) and gastrointestinal epithelial cells (Corbeil et al., 2000). After differentiation into a mature endothelium, the AC133 receptor is rapidly lost (Peichev et al., 2000; Gehling et al., 2000). Another receptor detected in circulating endothelial cells is a mucin, MUC18, recognized by Ab H1P12 (Lin et al., 2000). MUC18 is lost after differentiation of endothelial progenitors in endothelium. CD34 is expressed in endothelial progenitors, as well as in hematopoietic progenitors (Peichev et al., 2000; Baumhueter et al., 1994) and oval liver cells (Crosby et al., 2001). This antigen is also lost after differentiation of endothelial progenitors in endothelium. Most mature endothelial cells, except microvascular endothelial cells, no longer express CD34.

55 Se describe aquí por primera vez, la generación in vitro de un amplio número de células endoteliales que se injertan in vivo y contribuyen a la neoangiogénesis a partir de una CMAM. Las CMAM se pueden expandir en cultivo durante >80 DP y las células endoteliales generadas a partir de CMAM se pueden expandir durante al menos 20 DP adicionales. Las CMAM pueden, por tanto, se una fuente ideal de células endoteliales para terapias clínicas. Además, ya que las CMAM son ontogénicamente menos maduras que el “angioblasto”, este modelo debería ser útil para caracterizar el compromiso endotelial y la diferenciación. Las CMAMh se diferencian en células con características fenotípicas del endotelio. 55 The in vitro generation of a large number of endothelial cells that are grafted in vivo and contribute to neoangiogenesis from a CMAM is described here for the first time. CMAMs can be expanded in culture for> 80 DP and endothelial cells generated from CMAM can be expanded for at least 20 additional DPs. CMAMs can therefore be an ideal source of endothelial cells for clinical therapies. In addition, since CMAMs are ontogenetically less mature than "angioblast," this model should be useful for characterizing endothelial compromise and differentiation. CMAMh differ in cells with phenotypic characteristics of the endothelium.

Se obtuvieron y cultivaron las CMAM tal como se describe en el Ejemplo 3. Para inducir la diferenciación endotelial, CMAMs were obtained and cultured as described in Example 3. To induce endothelial differentiation,

65 se colocaron de nuevo las CMAM en placas con una concentración de 2 x 104 células/cm2 en pocillos recubiertos con FN en medio de expansión exento de suero sin FCE ni FCDP-BB pero con 10 ng/mL de FCEV. En algunos casos se añadió FCS. Se mantuvieron los cultivos renovando el medio cada 4-5 días. En algunos casos, se subcultivaron las células tras el 9.º día con una dilución 1:4 en las mismas condiciones de cultivo que para los 20+ DP. 65 CMAMs were again placed on plates with a concentration of 2 x 104 cells / cm2 in FN-coated wells in serum-free expansion medium without FCE or FCDP-BB but with 10 ng / mL of FCEV. In some cases FCS was added. The cultures were maintained by renewing the medium every 4-5 days. In some cases, the cells were subcultured after the 9th day with a 1: 4 dilution under the same culture conditions as for the 20+ DP.

5 Con el fin de definir más ampliamente la diferenciación endotelial a partir de las CMAM, se llevaron a cabo análisis inmunohistoquímicos y FACS de las células tras 3-18 días. La expresión de Flk1 y Flt1 en CMAM indiferenciadas fue baja, fue máxima el 9.º día y se mantuvo hasta el 18.º día. La VE-cadherina, presente en MO o progenitores endoteliales sanguíneos (Peichev et al., 2000; Nishikawa et al., 1998) no se expresó en CMAM indiferenciadas pero se expresó tras 3 días de cultivo con FCEV y se mantuvo hasta el 18.º día. Las CMAM expresaron niveles bajos de AC133, detectado tanto en progenitores hematopoyéticos como endoteliales (Peichev et al., 2000; Gehling et al., 2000) pero dejó de ser detectable después del 3.er día. CD34, presente en progenitores hematopoyéticos y endoteliales (Peichev et al., 2000; Asahara et al., 1997¸Rafii et al., 1994) no estuvo presente en CMAM indiferenciadas (Fig. 4A) pero se expresó desde el 9.º día hasta el 18.º día. La mucina, MUC18, reconocida por el Ab H1P12 se ha utilizado para purificar los progenitores endoteliales de la sangre (Lin et al., 2000). Aunque las CMAM 5 In order to further define endothelial differentiation from CMAMs, immunohistochemical and FACS analyzes of the cells were carried out after 3-18 days. The expression of Flk1 and Flt1 in undifferentiated CMAM was low, was maximum on the 9th day and remained until the 18th day. VE-cadherin, present in MO or blood endothelial progenitors (Peichev et al., 2000; Nishikawa et al., 1998) was not expressed in undifferentiated CMAM but was expressed after 3 days of culture with FCEV and remained until 18. Th day. CMAMs expressed low levels of AC133, detected in both hematopoietic and endothelial progenitors (Peichev et al., 2000; Gehling et al., 2000) but ceased to be detectable after the 3rd day. CD34, present in hematopoietic and endothelial progenitors (Peichev et al., 2000; Asahara et al., 1997¸Rafii et al., 1994) was not present in undifferentiated CMAM (Fig. 4A) but was expressed from the 9th day until the 18th day. Mucin, MUC18, recognized by Ab H1P12 has been used to purify endothelial blood progenitors (Lin et al., 2000). Although CMAM

15 no se tiñeron con H1P12, las CMAM tratadas con FCEV durante 9 días presentaron una tinción positiva, pero el día 18.º la expresión se había perdido. 15 did not stain with H1P12, the CMAM treated with FCEV for 9 days had a positive staining, but on the 18th day the expression was lost.

La integrina específica del endotelio, av� 3 (Eliceiri et al., 2000) no estuvo presente en CMAM indiferenciadas, mientras que av�5 se expresó con unos niveles muy bajos. La expresión de las integrinas se incrementó progresivamente durante la diferenciación y el día 14.º había alcanzado su grado máximo (Fig. 5). Los receptores de la tirosina-cinasa, Tie y Tek, importantes para la angiogénesis pero no para la diferenciación celular endotelial (Partanen et al., 1999) no se expresaron en las CMAM. Se pudo apreciar la expresión de Tek después del 3.er día y de Tie después del 7.º día (fig. 6). Las CMAM tampoco expresan vWF, pero se expresó vWF a partir del 9.º día (Rosenberg et al., 1998; Wagner et al., 1982). Más marcadores endoteliales maduros, incluidos CD31, CD36, CD62Endothelium specific integrin, av� 3 (Eliceiri et al., 2000) was not present in undifferentiated CMAM, while av�5 was expressed with very low levels. Integrin expression increased progressively during differentiation and on the 14th day it had reached its maximum level (Fig. 5). Tyrosine kinase receptors, Tie and Tek, important for angiogenesis but not for endothelial cell differentiation (Partanen et al., 1999) were not expressed in CMAM. Tek's expression could be seen after the 3rd day and Tie after the 7th day (fig. 6). CMAMs also do not express vWF, but vWF was expressed from the 9th day (Rosenberg et al., 1998; Wagner et al., 1982). More mature endothelial markers, including CD31, CD36, CD62

25 P (Tedder et al., 1995) (Fig. 7) y las proteínas de las uniones de adhesión ZO-1, catenina-� y catenina-y (Fig. 5) se detectaron después del 14.º día (Li et al., 1990; Van Rijen et al., 1997; Petzelbauer et al., 2000). Ni MACV ni CD62-E mostraron un nivel alto de expresión en ningún momento de la diferenciación, a menos que se activara el endotelio con la IL-1a, tal como se describe posteriormente. La diferenciación en endotelio se asoció con la adquisición de la microglobulina-�2 y niveles bajos de los antígenos de clase I de HLA, pero no los de clase II. 25 P (Tedder et al., 1995) (Fig. 7) and the adhesion junction proteins ZO-1, catenin-� and catenin-y (Fig. 5) were detected after the 14th day (Li et al., 1990; Van Rijen et al., 1997; Petzelbauer et al., 2000). Neither MACV nor CD62-E showed a high level of expression at any time of differentiation, unless the endothelium was activated with IL-1a, as described below. Differentiation in endothelium was associated with the acquisition of microglobulin-�2 and low levels of HLA class I antigens, but not those of class II.

Se ha publicado anteriormente que la diferenciación endotelial únicamente se puede obtener a partir de CMAM expandidas con una cantidad de FCS del 2% o menor, pero no cuando se expanden con un 10% de FCS (Reyes et al., 2001) ya que concentraciones más elevadas de FCS promueven el crecimiento de CMM clásicas que se diferencian solamente en osteoblastos, condroblastos y adipocitos (Reyes et al., 2001; Pittenger et al., 1999). It has been previously published that endothelial differentiation can only be obtained from expanded CMAM with an amount of FCS of 2% or less, but not when expanded with 10% of FCS (Reyes et al., 2001) since concentrations Higher FCS promote the growth of classical CMMs that differ only in osteoblasts, chondroblasts and adipocytes (Reyes et al., 2001; Pittenger et al., 1999).

35 Cuando FCS estuvo presente durante los 7 primeros días de la diferenciación, no se pudo inducir la diferenciación endotelial. Cuando se indujo la diferenciación de CMAM no confluentes (:1x104 células/cm2) no se apreció endotelio. Cuando se subcultivaron las CMAM 9 días después de la exposición a FCEV utilizando medio exento de suero con 10 ng/mL de FCEV, las células fueron capaces de experimentar al menos 12 DP adicionales. Cuando se añadieron un 10% de FCS y 10 ng/mL de FCEV al medio para el subcultivo, las células endoteliales derivadas de CMAM fueron capaces de experimentar 20+ DP adicionales, independientemente del número de DP que las CMAM habían experimentado. 35 When FCS was present during the first 7 days of differentiation, endothelial differentiation could not be induced. When non-confluent CMAM differentiation was induced (: 1x104 cells / cm2) no endothelium was seen. When CMAMs were subcultured 9 days after exposure to FCEV using serum-free medium with 10 ng / mL of FCEV, the cells were able to experience at least 12 additional DP. When 10% FCS and 10 ng / mL of FCEV were added to the medium for subculture, the CMAM-derived endothelial cells were able to experience an additional 20+ DP, regardless of the number of DPs that the CMAM had experienced.

En comparación con las CMAM indiferenciadas, las células endoteliales fueron mayores y presentaron una relación núcleo/citoplasma menor. Los resultados fueron similares cuando se utilizaron CMAM de cultivos que habían Compared to undifferentiated CMAMs, the endothelial cells were larger and had a lower nucleus / cytoplasm ratio. The results were similar when CMAM of crops that had been used were used.

45 experimentado 20 (n=30) o 50+ (n=25) DP. 45 experienced 20 (n = 30) or 50+ (n = 25) DP.

Características funcionales de endotelio derivado de CMAM Functional characteristics of CMAM derived endothelium

Se estudió si la progenie diferenciada de CMAMh inducida con FCEV poseía las características funcionales de las células endoteliales. Las células endoteliales responden a la hipoxia aumentando de manera regulada la expresión del FCEV así como la de los receptores de FCEV, Flkl y los receptores de la angiogénesis, Tie-1 y Tek (Kourembanas et al., 1998). Se incubaron CMAMh y células endoteliales derivadas de CMAMh a 37 ºC con un 20% It was studied whether the differentiated progeny of CMAMh induced with FCEV possessed the functional characteristics of endothelial cells. Endothelial cells respond to hypoxia by regulating the expression of FCEV in a regulated manner as well as that of FCEV, Flkl and angiogenesis receptors, Tie-1 and Tek (Kourembanas et al., 1998). CMAMh and endothelial cells derived from CMAMh were incubated at 37 ° C with 20%

o 10% de O2 durante 24 h. Se tiñeron las células con Abs contra Flk1, Flt1, Tek e IgG como control, se fijaron en paraformaldehído al 2% y se analizaron por citometría de flujo. Además, se midieron las concentraciones de FCEV or 10% O2 for 24 h. Cells were stained with Abs against Flk1, Flt1, Tek and IgG as control, fixed in 2% paraformaldehyde and analyzed by flow cytometry. In addition, FCEV concentrations were measured

55 en los sobrenadantes del cultivo utilizando un kit de ELISA (AP biothech, Piscataway, NJ). Se sometieron células endoteliales derivadas de CMAM y CMAM indiferenciadas a condiciones hipóxicas durante 24 h. 55 in the culture supernatants using an ELISA kit (AP biothech, Piscataway, NJ). Endothelial cells derived from CMAM and undifferentiated CMAM were subjected to hypoxic conditions for 24 h.

La expresión de Flk1 y Tek aumentó de manera significativa en células endoteliales derivadas de CMAM sometidas a hipoxia (Fig. 7), mientras que los niveles de estos receptores permanecieron inalterados en las CMAM indiferenciadas. Además, los niveles de FCEV en los sobrenadantes del cultivo de cultivos endoteliales hipóxicos se multiplicó por 4 (Fig. 7B) mientras que los niveles de FCEV en los cultivos de CMAM sometidas a hipoxia permanecieron inalterados. The expression of Flk1 and Tek increased significantly in endothelial cells derived from hypoxic CMAM (Fig. 7), while the levels of these receptors remained unchanged in undifferentiated CMAMs. In addition, the FCEV levels in the supernatants of the culture of hypoxic endothelial cultures were multiplied by 4 (Fig. 7B) while the FCEV levels in the CMAM cultures subjected to hypoxia remained unchanged.

A continuación se estudió si las células endoteliales derivadas de CMAM aumentarían de manera regulada la Next, it was studied whether CMAM-derived endothelial cells would increase in a regulated manner the

65 expresión de antígenos del HLA y de ligandos de adhesión celular en respuesta a citocinas inflamatorias tales como la IL-1a (Meager, 1999; Steeber et al., 2001). Se incubaron 106 CMAM y células endoteliales derivadas de CMAM con 75 ng/mL de IL-1a (R&D Systems) en medio exento de suero durante 24 h. Se fijaron las células en paraformaldehído al 2% y se tiñeron con Abs contra el HLA de clase I y clase II, microglobulina-�2, vWF, CD31, MACV, CD62E y CD62P o Abs de control y se analizaron utilizando un FACScalibur (Becton Dickinson). 65 expression of HLA antigens and cell adhesion ligands in response to inflammatory cytokines such as IL-1a (Meager, 1999; Steeber et al., 2001). 106 CMAM and CMAM-derived endothelial cells were incubated with 75 ng / mL of IL-1a (R&D Systems) in serum-free medium for 24 h. Cells were fixed in 2% paraformaldehyde and stained with Abs against HLA class I and class II, microglobulin-�2, vWF, CD31, MACV, CD62E and CD62P or control Abs and analyzed using a FACScalibur (Becton Dickinson)

5 Se observaron niveles significativamente aumentados de HLA de clase I y de clase II, microglobulina-�2, MACV, MACE, CD62E, CD62P mediante el análisis FACS (Fig. 7C) en células endoteliales. En cambio, en las CMAM indiferenciadas solo se observó aumento regulado de Flk. 5 Significantly increased levels of HLA class I and class II, microglobulin-2, MACV, MACE, CD62E, CD62P were observed by FACS analysis (Fig. 7C) in endothelial cells. In contrast, in undifferentiated CMAMs only a regulated increase in Flk was observed.

Otra característica de las células endoteliales es que incorporan LDL (Steinberg et al., 1985). Esto se estudió incubando CMAM en las que se había inducido la diferenciación con FCEV durante 2, 3, 5, 7, 9, 12, 15 y 21 con dilacil-LDL. El kit de tinción de dil-Ac-LDL se adquirió de Biomedical Technologies (Stoughton, MA). Se llevó a cabo el ensayo siguiendo las recomendaciones del fabricante. Se marcaron conjuntamente las células con Abs anti-Tek, Tie-1 o –vWF. Al cabo de 3 días, se detectó la expresión de Tek pero no la incorporación de a-LDL. Al cabo de 7 días, las células expresaron Tie-1 pero no incorporaron cantidades significativas de a-LDL. Sin embargo, la Another characteristic of endothelial cells is that they incorporate LDL (Steinberg et al., 1985). This was studied by incubating CMAM in which differentiation with FCEV had been induced for 2, 3, 5, 7, 9, 12, 15 and 21 with dilacil-LDL. The dil-Ac-LDL staining kit was purchased from Biomedical Technologies (Stoughton, MA). The test was carried out following the manufacturer's recommendations. The cells were labeled together with anti-Tek Abs, Tie-1 or -vWF. After 3 days, Tek expression was detected but not the incorporation of a-LDL. After 7 days, the cells expressed Tie-1 but did not incorporate significant amounts of a-LDL. However, the

15 adquisición de la expresión de vWF el 9.º día se asoció con la incorporación de aLDL (Fig. 6B). The acquisition of the vWF expression on the 9th day was associated with the incorporation of aLDL (Fig. 6B).

Las células endoteliales contienen vWF acumulado en los cuerpos de Weibel-Pallade que se libera in vivo cuando se activa el endotelio (Wagner et al., 1982). Esto se puede inducir in vitro estimulando las células con histamina (Rosenberg et al., 1998), lo cual da como resultado también la activación de la célula citoesquelética (Vischer et al., 2000). Se colocaron en placas células endoteliales derivadas de CMAM con una confluencia elevada (104 células/cm2) en portaobjetos con pocillos recubiertos de FN. Después de 24 h, se trataron las células con histamina 10 μM (Sigma) en medio exento de suero durante 25 min y se tiñeron con Abs contra vWF y miosina. Se fijaron las células tratadas y sin tratar con metanol a -20 ºC durante 2 min, se tiñeron con Abs contra vWF y miosina y se analizaron utilizando microscopía confocal y/o de fluorescencia. El vWF estuvo presente a través del citoplasma de Endothelial cells contain accumulated vWF in Weibel-Pallade bodies that is released in vivo when the endothelium is activated (Wagner et al., 1982). This can be induced in vitro by stimulating the cells with histamine (Rosenberg et al., 1998), which also results in the activation of the cytoskeletal cell (Vischer et al., 2000). Endothelial cells derived from CMAM with high confluence (104 cells / cm2) were placed on slides with FN coated wells. After 24 h, the cells were treated with 10 µM histamine (Sigma) in serum-free medium for 25 min and stained with Abs against vWF and myosin. The treated and untreated cells were fixed with methanol at -20 ° C for 2 min, stained with Abs against vWF and myosin and analyzed using confocal and / or fluorescence microscopy. The vWF was present through the cytoplasm of

25 las células endoteliales no tratadas. El citoplasma de las células endoteliales tratadas con histamina contuvo una cantidad significativamente menor de vWF y vWF únicamente fue detectable en la región perinuclear, lo que probablemente representa el vWF presente en el retículo plasmático (Fig. 6A). El tratamiento con histamina provocó un ensanchamiento de las uniones de abertura y cambios citoesqueléticos con un número mayor de fibras de estrés de miosina (Fig. 6A). 25 untreated endothelial cells. The cytoplasm of endothelial cells treated with histamine contained a significantly lower amount of vWF and vWF was only detectable in the perinuclear region, which probably represents the vWF present in the plasma reticulum (Fig. 6A). The histamine treatment caused a widening of the opening junctions and cytoskeletal changes with a greater number of myosin stress fibers (Fig. 6A).

Finalmente, se estudiaron las células endoteliales para determinar si podían formar “tubos vasculares” cuando se colocaron en placas en Matrigel™ o en matriz extracelular (MEC) (Haralabopoulos et al., 1997). Se añadieron 0,5 mL de matriz extracelular (Sigma) por pocillo a una placa de 24 pocillos y se incubaron durante 3 h a 37 ºC. Se añadieron 104 CMAM y células endoteliales derivadas de CMAM por pocillo en 0.5 mL de medio exento de suero y Finally, endothelial cells were studied to determine if they could form "vascular tubes" when placed on plates in Matrigel ™ or extracellular matrix (ECM) (Haralabopoulos et al., 1997). 0.5 mL of extracellular matrix (Sigma) per well was added to a 24-well plate and incubated for 3 h at 37 ° C. 104 CMAM and CMAM-derived endothelial cells were added per well in 0.5 mL of serum-free medium and

35 con FCEV y se incubaron a 37 ºC. Tal como se muestra en la Fig. 6C, el cultivo de células endoteliales derivadas de CMAM en MEC dio como resultado la formación de tubos vasculares en 6 horas o menos. 35 with FCEV and incubated at 37 ° C. As shown in Fig. 6C, culture of endothelial cells derived from CMAM in MEC resulted in the formation of vascular tubes in 6 hours or less.

Las células endoteliales derivadas de CMAMh contribuyen a la angiogénesis tumoral in vivo Endothelial cells derived from CMAMh contribute to tumor angiogenesis in vivo

Se estableció una colonia reproductora de ratones NOD-SCID a partir de ratones obtenidos de los Laboratorios Jackson (Bar Harbor, ME). Se mantuvieron los ratones en condiciones exentas de patógenos específicos y se mantuvieron con agua acidificada y comida esterilizada en autoclave. Se les suministró dos veces por semana 60 mg de trimetoprima y 300 mg de sulfametoxazol (Hoffmann-La Roche Inc., Nutley, NJ) por 100 mL de agua. A breeding colony of NOD-SCID mice was established from mice obtained from Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Mice were kept in conditions free of specific pathogens and kept with acidified water and autoclaved food. They were given twice a week 60 mg of trimethoprim and 300 mg of sulfamethoxazole (Hoffmann-La Roche Inc., Nutley, NJ) per 100 mL of water.

45 Se les implantaron tres carcinomas pulmonares de Lewis subcutáneamente en el hombro. 3 y 5 días después del implante del tumor, se inyectaron a los ratones 0,25x106 células endoteliales derivadas de CMAM humanas o fibroblastos de prepucio humanos a través de una inyección en la vena de la cola. Tras 14 días, se sacrificaron los animales, se recuperaron los tumores y se congelaron utilizando el compuesto OCT (Santura Finetek USA Inc, Torrance, CA) a -80 ºC. Además, las orejas que se perforaron para etiquetar a los ratones también se recogieron y congelaron utilizando el compuesto OCT a -80 ºC. Se dispusieron cortes de cinco μm de grosor sobre portaobjetos de vidrio y se fijaron y tiñeron como se describe a continuación. 45 Three Lewis lung carcinomas were implanted subcutaneously in the shoulder. 3 and 5 days after tumor implantation, mice were injected with 0.25x106 endothelial cells derived from human CMAM or human foreskin fibroblasts through an injection into the tail vein. After 14 days, the animals were sacrificed, the tumors were recovered and frozen using the compound OCT (Santura Finetek USA Inc, Torrance, CA) at -80 ° C. In addition, the ears that were pierced to label the mice were also collected and frozen using the OCT compound at -80 ° C. Five μm thick cuts were placed on glass slides and fixed and stained as described below.

El análisis asistido por ordenador de la longitud y número de ramificaciones cuyo recuento se llevó a cabo en cinco cortes de cada tumor mostraron que los tumores en los ratones que recibieron células endoteliales derivadas de Computer-assisted analysis of the length and number of branches whose count was carried out in five sections of each tumor showed that tumors in mice that received endothelial cells derived from

55 CMAM humanas poseían una masa vascular mayor en una proporción 1,45±0,04 respecto a los tumores en ratones de control que lo hecho con Abs anti-microglobulina-2 humana o HLA de clase I, combinados con Abs anti-ratón-anti-CD31 y Abs anti-vWF, anti-Tek o anti-Tie-1, lo cuales reconocen células endoteliales tanto humanas como de ratón. Estos estudios iniciales mostraron que algunos vasos sanguíneos en el tumor contenían células positivas para HLA de clase I o anti-microglobulina-�2 humana que marcaban conjuntamente vWF, Tie o Tek pero no CD31 de ratón, lo que indica que las células endoteliales derivadas de CMAM contribuían a la neoangiogénesis tumoral in vivo. 55 human CMAMs had a greater vascular mass at a rate of 1.45 ± 0.04 compared to tumors in control mice than with human anti-microglobulin-2 Abs or HLA class I, combined with anti-mouse Abs. anti-CD31 and anti-vWF, anti-Tek or anti-Tie-1 Abs, which recognize both human and mouse endothelial cells. These initial studies showed that some blood vessels in the tumor contained HLA class I or human anti-microglobulin-�2 positive cells that jointly labeled vWF, Tie or Tek but not mouse CD31, indicating that endothelial cells derived from CMAM contributed to tumor neoangiogenesis in vivo.

Para estudiar mejor el grado de contribución, se obtuvieron 35 preparaciones secuenciales de 5 μm y se tiñeron de manera alternativa bien con anti-microglobulina-2 humana-FITC bien con anti-CD31 de ratón-Cy5 y anti-vWF-Cy3. 65 Se examinaron todas las preparaciones por microscopía confocal. A continuación se ensamblaron las diferentes figuras en 3D para determinar la contribución relativa de células endoteliales murinas y humanas a los vasos To better study the degree of contribution, 35 sequential preparations of 5 μm were obtained and stained alternately with either human anti-microglobulin-2-FITC or with anti-mouse CD31-Cy5 and anti-vWF-Cy3. 65 All preparations were examined by confocal microscopy. The different 3D figures were then assembled to determine the relative contribution of murine and human endothelial cells to the vessels

tumorales. Cuando se analizaron los tumores obtenidos a partir de animales inyectados con células endoteliales derivadas de CMAM humanas, aproximadamente un 35% de los vasos tumorales fueron positivos para antimicroglobulina-2 humana así como para vWF mientras que aproximadamente un 40% de las células endoteliales presentaron una tinción positiva con Abs anti-CD31 de ratón (Figs. 8A-G). Los tumores en animales que no Tumor When tumors obtained from animals injected with endothelial cells derived from human CMAM were analyzed, approximately 35% of the tumor vessels were positive for human antimicroglobulin-2 as well as for vWF while approximately 40% of the endothelial cells presented a positive staining with mouse anti-CD31 Abs (Figs. 8A-G). Tumors in animals that do not

5 recibieron células endoteliales ni recibieron fibroblastos humanos no contuvieron células endoteliales que presentaran una tinción positiva con los Abs anti-microglobulina-2 o anti-HLA de clase I. 5 received endothelial cells or received human fibroblasts did not contain endothelial cells that were positively stained with anti-microglobulin-2 or anti-HLA class I Abs.

También se analizó si las células endoteliales derivadas de CMAM contribuían a la angiogénesis de la curación de una herida. A continuación el área de la oreja que había sido perforada para etiquetar al ratón se examinó. La neoangiogénesis en las heridas de la oreja se debió en parte a las células endoteliales derivadas de CMAM. El porcentaje de células endoteliales humanas presentes en la herida de la piel curada fue del 30-45% (Fig. 9H) y similar al de los vasos sanguíneos en el tumor. It was also analyzed whether endothelial cells derived from CMAM contributed to the angiogenesis of wound healing. Next the area of the ear that had been pierced to label the mouse was examined. The neoangiogenesis in the wounds of the ear was partly due to the endothelial cells derived from CMAM. The percentage of human endothelial cells present in the wound of the cured skin was 30-45% (Fig. 9H) and similar to that of the blood vessels in the tumor.

Las CMAMh indiferenciadas se diferencian en células endoteliales in vivo Undifferentiated CMAMh differentiate into endothelial cells in vivo

15 Se inyectaron i.v. 106 CMAM indiferenciadas en ratones NOD-SCID de 6 semanas de edad. Se mantuvieron los animales durante 12 semanas y a continuación se sacrificaron. En un animal se detectó un tumor tímico, el cual se observa comúnmente en ratones NOD-SCID de edad avanzada (Prochazka et al., 1992). Se extrajo el timo y se congeló en compuesto OCT a -80 ºC. Se prepararon cortes de diez μm de grosor de los tejidos sobre portaobjetos de vidrio y se fijaron y tiñeron como se describe a continuación. 15 Injected i.v. 106 undifferentiated CMAMs in 6-week-old NOD-SCID mice. The animals were kept for 12 weeks and then sacrificed. A thymic tumor was detected in an animal, which is commonly observed in elderly NOD-SCID mice (Prochazka et al., 1992). The thymus was removed and frozen in OCT compound at -80 ° C. Ten µm thick sections of the tissues were prepared on glass slides and fixed and stained as described below.

Todas las células hematopoyéticas presentaron una tinción positiva para CD45 de ratón pero no para CD45 humano, lo que indica su origen murino. A continuación se tiñó el tumor con un Ab anti-microglobulina-2 humana-FITC y un Ab anti-vWF-Cy3 que reconoce tanto las células endoteliales de ratón como las humanas. All hematopoietic cells had a positive staining for mouse CD45 but not for human CD45, indicating their murine origin. The tumor was then stained with a human anti-microglobulin-2 Ab-FITC and an anti-vWF-Cy3 Ab that recognizes both mouse and human endothelial cells.

25 Aproximadamente un 12% del sistema vascular se derivó de CMAMh (Fig. 9I). Estos estudios además confirman que los elementos hematopoyéticos no son de origen humano, ya que no se detectó microglobulina-2 humana fuera de las estructuras vasculares. Approximately 12% of the vascular system was derived from CMAMh (Fig. 9I). These studies also confirm that the hematopoietic elements are not of human origin, since no human microglobulin-2 was detected outside the vascular structures.

Inmunohistoquímica y análisis de los datos Immunohistochemistry and data analysis

Cultivos in vitro: CMAM indiferenciadas o CMAM inducidas a diferenciarse en endotelio durante 2-18 días, colocadas en portaobjetos con pocillos recubiertos con FN se fijaron con paraformaldehído al 2% (Sigma) durante 4 minutos a temperatura ambiente. Para la tinción del citoesqueleto se fijaron portaobjetos con pocillos con metanol durante 2 min. a -20 ºC. Para los ligandos intracelulares, se permeabilizaron las células con Tritón-X 0,1 (Sigma) durante 10 35 min. y se incubaron de manera secuencial durante 30 h de cada vez con un anticuerpo primario (Ab) y con un Ab anti-IgG de conejo, cabra o ratón conjugado con FITC, PE o Cy5. Entre cada paso, las preparaciones se lavaron con PBS+1% de BSA. Los Abs primarios contra CD31, CD34, CD36, CD44, HLA de clase I y II, microglobulina-�2 se utilizaron con una dilución 1:50. Los Abs primarios contra MACV, MAIC, VE-cadherina, selectinas, HIP12, ZO-1, conexina-40, conexina-43, MUC18, avb3, avb5, catenina-�y catenina-y (Chemicon) y Tek, Tie, vWF (Santa Cruz) se utilizaron con una dilución 1:50. Las fibras de estrés se tiñeron con Abs contra miosina (cadena ligera 20 kD, clon n.º MY-21; 1:200). Los Abs secundarios se adquirieron de Sigma y se utilizaron con las siguientes diluciones: anti-IgG de cabra-Cy-3 (1:40), anti-IgG de cabra-FITC (1:160), anti-IgG de ratón-Cy-3 (1:150) y anti-IgG de ratón-FITC (1:320), anti-conejo-FITC (1:160) y anti-conejo-Cy-3 (1:30). TOPRO-3 se adquirió de Sigma. Las células se examinaron por microscopía de fluorescencia utilizando una mira Zeiss Axiovert (Carl Zeiss, Inc., Thomwood, NY) In vitro cultures: undifferentiated CMAM or CMAM induced to differentiate in endothelium for 2-18 days, placed on slides with FN-coated wells were fixed with 2% paraformaldehyde (Sigma) for 4 minutes at room temperature. For staining the cytoskeleton, slides were fixed with wells with methanol for 2 min. at -20 ° C. For intracellular ligands, cells were permeabilized with 0.1 Triton-X (Sigma) for 10 min. and incubated sequentially for 30 h each time with a primary antibody (Ab) and with a rabbit, goat or mouse anti-IgG Ab conjugated to FITC, PE or Cy5. Between each step, the preparations were washed with PBS + 1% BSA. The primary Abs against CD31, CD34, CD36, CD44, HLA class I and II, microglobulin-�2 were used with a 1:50 dilution. Primary Abs against MACV, MAIC, VE-cadherin, selectins, HIP12, ZO-1, connexin-40, connexin-43, MUC18, avb3, avb5, catenin-� and catenin-y (Chemicon) and Tek, Tie, vWF (Santa Cruz) were used with a 1:50 dilution. The stress fibers were stained with Abs against myosin (20 kD light chain, clone # MY-21; 1: 200). The secondary Abs were purchased from Sigma and were used with the following dilutions: goat anti-IgG-Cy-3 (1:40), goat anti-IgG-FITC (1: 160), anti-mouse Ig-Cy- -3 (1: 150) and anti-mouse IgG-FITC (1: 320), anti-rabbit-FITC (1: 160) and anti-rabbit-Cy-3 (1:30). TOPRO-3 was purchased from Sigma. Cells were examined by fluorescence microscopy using a Zeiss Axiovert sight (Carl Zeiss, Inc., Thomwood, NY)

45 así como por microscopía de fluorescencia confocal utilizando un microscopio confocal 1024 (Olympus AX70, Olympus Optical Co. LTD, Japón). 45 as well as by confocal fluorescence microscopy using a 1024 confocal microscope (Olympus AX70, Olympus Optical Co. LTD, Japan).

Tumores o tejido normal: Se cortó el tejido en cortes de 5-10 μm de grosor utilizando un criostato. Se fijaron los cortes con acetona durante 10 min a temperatura ambiente y se permeabilizaron con Tritón X 0,1 durante 5 min. Se incubaron las preparaciones durante toda la noche para vWF, Tie o Tek, seguido de una segunda incubación con Abs anti-IgG de conejo, cabra o ratón conjugados con FITC, PE o Cy5 y una incubación secuencial con Abs contra CD45 de ratón-PE o CD45 humano-FITC, microglobulina-2 humana-FITC, CD31 de ratón-FITC o TOPRO-3 durante 60 minutos. Entre cada paso las preparaciones se lavaron con PBS + BSA al 1%. Se examinaron las preparaciones por microscopía de fluorescencia utilizando una mira Zeiss Axiovert así como por microscopía de fluorescencia Tumors or normal tissue: The tissue was cut in 5-10 μm thick cuts using a cryostat. The cuts were fixed with acetone for 10 min at room temperature and permeabilized with Triton X 0.1 for 5 min. Preparations were incubated overnight for vWF, Tie or Tek, followed by a second incubation with rabbit, goat or mouse anti-IgG conjugated with FITC, PE or Cy5 and a sequential incubation with CD45 mouse-PE Abs or human CD45-FITC, human microglobulin-2-FITC, mouse CD31-FITC or TOPRO-3 for 60 minutes. Between each step the preparations were washed with PBS + 1% BSA. Preparations were examined by fluorescence microscopy using a Zeiss Axiovert sight as well as by fluorescence microscopy

55 confocal utilizando un microscopio confocal 1024. La reconstrucción 3D consistió en la recogida de fotos confocales de 0,5 μm secuenciales de 35 preparaciones de 5 μm de grosor hasta un total de 350 fotos. Las preparaciones se tiñeron con vWF-Cy3 y de manera alternativa se tiñeron dos veces con microglobulina-2 humana-FITC o CD31 de ratón-FITC. Se alinearon las fotos de cada preparación con las de la siguiente prepración con el software Metamorph (Universal Imaging Corp) y la reconstrucción 3D se llevó a cabo con el software 3D Doctor (Able software Corp). 55 confocal using a 1024 confocal microscope. 3D reconstruction consisted of the collection of sequential 0.5 μm confocal photos from 35 preparations 5 μm thick up to a total of 350 photos. The preparations were stained with vWF-Cy3 and alternatively stained twice with human microglobulin-2-FITC or mouse CD31-FITC. The photos of each preparation were aligned with those of the following preparation with Metamorph software (Universal Imaging Corp) and 3D reconstruction was carried out with 3D Doctor software (Able software Corp).

Se calculó el volumen de contribución relativa de células endoteliales murinas (coloreadas falsamente de azul) y humanas (verde) al vaso 3D en forma de píxeles cúbicos de cada color. También se calculó el área de cada color en forma de píxeles cuadrados en 4 vasos a lo largo de las 35 preparaciones para obtener un porcentaje preciso de la The relative contribution volume of murine endothelial cells (falsely colored blue) and human (green) to the 3D vessel in the form of cubic pixels of each color was calculated. The area of each color in the form of square pixels in 4 glasses along the 35 preparations was also calculated to obtain an accurate percentage of the

65 contribución. También se calculó el área de cada color en preparaciones alternadas de cuatro tumores diferentes. 65 contribution. The area of each color was also calculated in alternate preparations of four different tumors.

Resumen Summary

El hallazgo central de este estudio es que las células que se purifican conjuntamente con CMM de MO poseen la capacidad de diferenciarse en células endoteliales que poseen características funcionales in vitro indistinguibles de The central finding of this study is that cells that are purified in conjunction with CMM of MO have the ability to differentiate into endothelial cells that have in vitro functional characteristics indistinguishable from

5 las características de las células endoteliales maduras. También se muestra que tales células endoteliales contribuyen a la neoangiogénesis in vivo en el establecimiento de la curación de la herida y la tumorogénesis, y que CMAM indiferenciadas pueden responder a estímulos locales in vivo para diferenciarse en células endoteliales que contribuyen a la angiogénesis tumoral. Como la misma célula que se diferencia en endotelio también se diferencia en otros tipos celulares mesodérmicos, así como células de origen no mesodérmico, la célula definida aquí precede al angioblasto e incluso el hemangioblasto en la ontogenia. 5 the characteristics of mature endothelial cells. It is also shown that such endothelial cells contribute to neoangiogenesis in vivo in the establishment of wound healing and tumorigenesis, and that undifferentiated CMAMs can respond to local stimuli in vivo to differentiate into endothelial cells that contribute to tumor angiogenesis. As the same cell that differs in endothelium also differs in other mesodermal cell types, as well as cells of non-mesodermal origin, the cell defined here precedes angioblast and even hemangioblast in ontogeny.

También se ha demostrado que las CMAM se diferencian en células que expresan marcadores de células endoteliales, pero se prueba que las CMAM inducidas por el FCEV funcionan como células endoteliales. Las células endoteliales modifican lipoproteínas durante el transporte en la pared arterial (Adams et al., 2000). Las células It has also been shown that CMAMs differ in cells that express markers of endothelial cells, but it is proven that CMAM-induced CMAMs function as endothelial cells. Endothelial cells modify lipoproteins during transport in the arterial wall (Adams et al., 2000). The cells

15 endoteliales mantienen una barrera de permeabilidad a lo largo de las uniones intercelulares que se ensancha cuando se exponen a fuerzas hemodinámicas o agentes vasoactivos, tales como la histamina (Rosenberg et al., 1998; Li et al., 1990; Van Rijen et al., 1997; Vischer et al., 2000). Las células endoteliales liberan moléculas protrombóticas tales como vWF, factor tisular y el inhibidor del activador del plasminógeno para prevenir la hemorragia (Vischer et al., 2000) y regular la salida de leucocitos cambiando los niveles de expresión de moléculas de adhesión en respuesta a la inflamación (Meager, 1999; Steeber et al., 2001). El endotelio también reacciona a la hipoxia produciendo FCEV y expresando el receptor del FCEV con el propósito de incrementar la densidad vascular (Kourembanas et al., 1998). Por tanto, se ha demostrado que las células endoteliales generadas a partir de CMAM pueden llevar a cabo todas estas tareas cuando se han estudiado in vitro. Endothelials maintain a permeability barrier along the intercellular junctions that widens when exposed to hemodynamic forces or vasoactive agents, such as histamine (Rosenberg et al., 1998; Li et al., 1990; Van Rijen et al ., 1997; Vischer et al., 2000). Endothelial cells release prothrombotic molecules such as vWF, tissue factor and plasminogen activator inhibitor to prevent bleeding (Vischer et al., 2000) and regulate leukocyte output by changing the expression levels of adhesion molecules in response to inflammation (Meager, 1999; Steeber et al., 2001). The endothelium also reacts to hypoxia producing FCEV and expressing the FCEV receptor in order to increase vascular density (Kourembanas et al., 1998). Therefore, it has been shown that endothelial cells generated from CMAM can carry out all these tasks when they have been studied in vitro.

25 Finalmente, se ha probado que las células endoteliales derivadas de CMAM generadas in vitro responden a estímulos angiogénicos migrando al sitio del tumor y contribuyendo a la vascularización del tumor así como a la curación de la herida in vivo. Este hallazgo confirma que las células endoteliales generadas a partir de CMAM poseen todas las características funcionales del endotelio maduro. El grado de contribución de las células endoteliales a la neoangiogénesis y angiogénesis tumoral fue de un 35-45%, niveles similares a lo que se ha descrito para otras fuentes de células endoteliales (Conway et al., 2001; Ribatti et al., 2001). Además, se ha descubierto que los estímulos angiogénicos in vivo proporcionados en un microambiente tumoral son suficientes para reclutar CMAM al lecho tumoral e inducir su diferenciación en células endoteliales que contribuyen al sistema vascular tumoral. Estos estudios por tanto amplían los estudios publicados por otros grupos que demuestran que las células presentes en la médula pueden contribuir a la formación de nuevos vasos sanguíneos (Peichev et al., 2000; Finally, it has been proven that CMAM-derived endothelial cells generated in vitro respond to angiogenic stimuli by migrating to the tumor site and contributing to tumor vascularization as well as wound healing in vivo. This finding confirms that endothelial cells generated from CMAM possess all the functional characteristics of the mature endothelium. The degree of contribution of endothelial cells to neoangiogenesis and tumor angiogenesis was 35-45%, levels similar to what has been described for other sources of endothelial cells (Conway et al., 2001; Ribatti et al., 2001 ). In addition, it has been found that in vivo angiogenic stimuli provided in a tumor microenvironment are sufficient to recruit CMAM to the tumor bed and induce its differentiation into endothelial cells that contribute to the tumor vascular system. These studies therefore extend studies published by other groups that demonstrate that cells present in the marrow can contribute to the formation of new blood vessels (Peichev et al., 2000;

35 Lin et al., 2000; Gehling et al., 2000; Asahara et al., 1997), en un proceso similar a la vasculogénesis y se ha identificado el precursor responsable de este proceso. Según el conocimiento de los autores, esta es la primera publicación que identifica una célula presente en la MO después del nacimiento en forma de un progenitor muy temprano de células endoteliales. 35 Lin et al., 2000; Gehling et al., 2000; Asahara et al., 1997), in a process similar to vasculogenesis and the precursor responsible for this process has been identified. According to the authors' knowledge, this is the first publication that identifies a cell present in the MO after birth in the form of a very early progenitor of endothelial cells.

Ejemplo 10. Derivación de neuronas Example 10. Derivation of neurons

Se evaluaron CMAMr o CMAMh derivadas de MO adultas únicas para determinar si eran capaces de diferenciarse ex vivo en neuronas funcionales, así como en astrocitos y oligodendrocitos aparte de tipos celulares mesodérmicos. Se seleccionaron y se expandieron en cultivo CMAMh y CMAMr tal como se ha descrito previamente en los CMAMr or CMAMh derived from single adult MOs were evaluated to determine if they were able to differentiate ex vivo in functional neurons, as well as in astrocytes and oligodendrocytes apart from mesodermal cell types. CMAMh and CMAMr were selected and expanded in culture as previously described in the

45 Ejemplos 1 y 3 respectivamente. Se adquirieron células progenitoras neurales humanas (CPNh) de Clonetics (San Diego, CA). Se cultivaron y diferenciaron CPNh siguiendo las recomendaciones del fabricante. 45 Examples 1 and 3 respectively. Human neural progenitor cells (CPNh) were acquired from Clonetics (San Diego, CA). CPNh were cultured and differentiated following the manufacturer's recommendations.

Electrofisiología: Se empleó un registro estándar de pinzamiento zonal de membrana de células enteras para examinar las propiedades fisiológicas de neuronas derivadas de CMAM. Se obtuvieron los registros del pinzamiento de voltaje y el pinzamiento de la corriente utilizando un amplificador de pinzamiento zonal de membrana Dagan 3900A (Dagan Corporation, Mineápolis) el cual se mejoró acoplándolo a una unidad de expansión Dagan 3911. Las pipetas para el pinzamiento, hechas de vidrio borosilicatado, se obtuvieron por estiramiento con un estirador de pipetas Narishige (modelo PP-83) y se pulieron utilizando una microforja Narishige (modelo MF-83). Las pipetas para el pinzamiento se rellenaron con una solución salina intracelular constituida por (en mM) KF 142,0, Na2SO4 7,0, 55 MgSO4 3,0, CaCl2 1,0, HEPES 5,0, EGTA 11,0, glutatión 1,0, glucosa 2,0, ATP 1,0 (sal magnésica) y GTP 0,5 (sal sódica). Para la mayoría de los registros, también se añadió el colorante fluorescente 5,6-carboxifluoresceína (0,5 mm; Eastman Kodak Chemicals) a la solución de la pipeta para confirmar visualmente, utilizando microscopía de fluorescencia, que se había conseguido la configuración del registro de la zona de la célula entera. Las resistencias de las pipetas estuvieron comprendidas entre 11 y 24 Mohm. La solución salina estándar de registro extracelular comprendió los siguientes componentes (en mM): NaCl 155, KCl 5,0, CaCl2, MgCl2 1,0, HEPES 10 y glucosa 5. Para algunos experimentos se añadió TTX 1 μM a la solución de control estándar. Se ajustó el pH de las soluciones de registro intracelular y extracelular a 7,4 y 7,8 respectivamente, utilizando NaOH. Todos los reactivos químicos se adquirieron de Sigma. Se utilizó un PClamp 8.0 (Axon Instruments, Foster City) para llevar a cabo los experimentos y para adquirir y almacenar los datos. Se corrigieron los datos presentados en función de un potencial de unión de 65 líquidos de 8.4 mV, el cual se calculó utilizando el paquete de software JPCALC. Se obtuvieron los análisis fuera de Electrophysiology: A standard zonal clamp register of whole cell membrane was used to examine the physiological properties of neurons derived from CMAM. Records of the voltage clamp and current clamp were obtained using a Dagan 3900A membrane zone clamp amplifier (Dagan Corporation, Minneapolis) which was improved by attaching it to a Dagan 3911 expansion unit. The pipettes for clamping, made of borosilicate glass, were obtained by stretching with a Narishige pipette stretcher (model PP-83) and polished using a Narishige microforja (model MF-83). The pipettes for clamping were filled with an intracellular saline solution consisting of (in mM) KF 142.0, Na2SO4 7.0, 55 MgSO4 3.0, CaCl2 1.0, HEPES 5.0, EGTA 11.0, glutathione 1.0, glucose 2.0, ATP 1.0 (magnesium salt) and GTP 0.5 (sodium salt). For most records, the 5,6-carboxyfluorescein (0.5 mm; Eastman Kodak Chemicals) fluorescent dye was also added to the pipette solution to visually confirm, using fluorescence microscopy, that the configuration of the fluorescence had been achieved. registration of the entire cell area. The pipette resistances were between 11 and 24 Mohm. The standard extracellular registration saline solution comprised the following components (in mM): NaCl 155, KCl 5.0, CaCl2, MgCl2 1.0, HEPES 10 and glucose 5. For some experiments 1 µM TTX was added to the control solution standard. The pH of the intracellular and extracellular recording solutions was adjusted to 7.4 and 7.8 respectively, using NaOH. All chemical reagents were purchased from Sigma. A PClamp 8.0 (Axon Instruments, Foster City) was used to carry out the experiments and to acquire and store the data. The data presented were corrected based on a binding potential of 65 liquids of 8.4 mV, which was calculated using the JPCALC software package. The analyzes were obtained outside

línea y las representaciones gráficas de los datos utilizando un Clampfit 8.0 (Axon Instruments, Foster City) y Prism (Graphpad, San Diego). line and graphical representations of the data using a Clampfit 8.0 (Axon Instruments, Foster City) and Prism (Graphpad, San Diego).

Transducción: Se produjo el sobrenadante retroviral incubando células PG13 que contenían MGF-eGFP, Transduction: The retroviral supernatant was produced by incubating PG13 cells containing MGF-eGFP,

5 proporcionadas por el Dr. G. Wagemaker, U. de Rotterdam, Países Bajos (Bierhuizen et al., 1997), en medio de expansión de CMAM durante 48 horas, se filtró y se congeló a -80 ºC. Se incubaron las CMAM con sobrenadantes retrovirales y 8 μg/mL de protamina (Sigma) durante 6 h. Esto se repitió 24 horas más tarde. Se analizó por FACS la eficiencia de la transducción. 5 provided by Dr. G. Wagemaker, U. of Rotterdam, The Netherlands (Bierhuizen et al., 1997), in the middle of CMAM expansion for 48 hours, was filtered and frozen at -80 ° C. CMAMs were incubated with retroviral supernatants and 8 μg / mL protamine (Sigma) for 6 h. This was repeated 24 hours later. The efficiency of transduction was analyzed by FACS.

Análisis por micromatriz génica: Se aisló ARN a partir de células inducidas con FCF-8b + FCE, FCFb o CMAMh utilizando el minikit RNeasy (Qiagene), se digirió con desoxirribonucleasa I (Promega) a 37 ºC durante 1 h y se purificó de nuevo utilizando el RNeasy. La sonda de ADNc marcada con [32P] dATP, producida de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes, se hibridó con una matriz del atlas de neurobiología humana (Clonetech #77361, Clonetech Laboratories, Palo Alto, CA, EE. UU.) a 68 ºC durante 18-20 h, seguido de 4 lavados con 2x SSC, SDS Gene microarray analysis: RNA was isolated from cells induced with FCF-8b + FCE, FCFb or CMAMh using the RNeasy minikit (Qiagene), digested with deoxyribonuclease I (Promega) at 37 ° C for 1 h and purified again using the RNeasy. The cDNA probe labeled with [32P] dATP, produced according to the manufacturer's recommendations, was hybridized with a matrix of the human neurobiology atlas (Clonetech # 77361, Clonetech Laboratories, Palo Alto, CA, USA) a 68 ° C for 18-20 h, followed by 4 washes with 2x SSC, SDS

15 al 1% a 68 ºC durante 30 min cada uno, 0,1x SSC, SDS al 0.5% a 68 ºC durante 30 min y una vez con 2x SSC a temperatura ambiente durante 5 min. Se leyeron las matrices mediante un dispositivo por imagen fosforescente con escáner de pantalla (Molecular Dynamics, Storm 860) y se analizó utilizando un Atlas Image 1.0 (Clontech). Se consideraron significativas las diferencias entre células diferenciadas e indiferenciadas mayores a un factor de 2. 1 to 15% at 68 ° C for 30 min each, 0.1x SSC, 0.5% SDS at 68 ° C for 30 min and once with 2x SSC at room temperature for 5 min. The matrices were read by a phosphorescent imaging device with a screen scanner (Molecular Dynamics, Storm 860) and analyzed using an Atlas Image 1.0 (Clontech). Differences between differentiated and undifferentiated cells greater than a factor of 2 were considered significant.

Análisis por PCR del inserto retroviral: Se empleó PCR para amplificar la secuencia adyacente en dirección 3’ de la LTR 3’ del vector MGF en el ADN genómico humano. Se preparó ADN a partir de 106 CMAM o de progenie diferenciada neuroectodérmica, endotelial o de mioblasto mediante métodos estándar. Se digirieron 300 ng de ADN genómico con AscI y se unió un conector splinkerette al extremo 5’ (Devon R. S. et al., 1995). Los dos oligonucleótidos utilizados para el conector splinkerette fueron los siguientes: 25 aattTAGCGGCCGCITGAATItttttttgcaaaaa, (la secuencia que forma el bucle en horquilla está en minúsculas y la cadena complementaria inversa del segundo oligo splinkerette está en mayúsculas), y agtgtgagtcacagtagtctcgcgttc gAATTAAGCGGCCGCTA (la secuencia subrayada es también la secuencia del cebador específico del conector (Cebador LS) utilizado para los pasos de PCR y RT). Se utilizó un cebador conjugado con 5’-biotina-T7 que reconoce una secuencia en el gen eGFP [Biotina-ggc-cag-tga-att-gta-ata-cga-ctc-act-ata-ggc-tgg-CAC-ATG-GTCCTG-CTG-GAG-TTC-GTG-AC; la porción subrayada muestra la secuencia promotora mínima necesaria para una transcripción in vitro eficaz y la región específica del eGFP está en mayúsculas] y el cebador LS para amplificar las regiones adyacentes durante 10 ciclos utilizando la polimerasa Advantage 2 (Clontech). Se capturó el producto amplificado marcado con biotina utilizando microesferas magnéticas con estreptavidina (Streptavidin Magnetic Particles; Roche) y el producto resultante se amplificó adicionalmente en una proporción de aproximadamente 1000 PCR analysis of the retroviral insert: PCR was used to amplify the adjacent sequence in the 3 'direction of the 3' LTR of the MGF vector in human genomic DNA. DNA was prepared from 106 CMAM or neuroectodermal, endothelial or myoblast differentiated progeny by standard methods. 300 ng of genomic DNA were digested with AscI and a splinkerette linker was attached to the 5 ′ end (Devon R. S. et al., 1995). The two oligonucleotides used for the splinkerette connector were the following: aattTAGCGGCCGCITGAATItttttttgcaaaaa, (the sequence that forms the hairpin loop is in lowercase and the reverse complementary chain of the second oligo splinkerette is in uppercase), and agtgtgagtcacagTAGTAGTAGCGAGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG the sequence of the specific primer of the connector (LS primer) used for the PCR and RT steps). A 5'-biotin-T7 conjugate primer that recognizes a sequence in the eGFP gene was used [Biotin-ggc-cag-tga-att-gta-ata-cga-ctc-act-ata-ggc-tgg-CAC-ATG -GTCCTG-CTG-GAG-TTC-GTG-AC; the underlined portion shows the minimum promoter sequence necessary for effective in vitro transcription and the specific region of the eGFP is in uppercase] and the LS primer to amplify adjacent regions for 10 cycles using Advantage 2 polymerase (Clontech). The biotin-labeled amplified product was captured using magnetic microspheres with streptavidin (Streptavidin Magnetic Particles; Roche) and the resulting product was further amplified in a proportion of approximately 1000

35 utilizando la ARN-polimerasa T7 y a continuación se trató con ADNasa 1. El producto resultante se transcribió de manera inversa utilizando el cebador splinkerette agtgtgagtcacagtagtctcgcgttc de acuerdo con el protocolo Superscript II (Gibco) y a continuación se amplificó con 30 ciclos de PCR con cebadores internos utilizando el cebador para la LTR3’ [ggc caa gaa cag atg gaa cag ctg aat atg]. Se secuenció la región adyacente en el genoma humano de células diferenciadas neuroectodérmicas, musculares y endoteliales y CMAM indiferenciadas. 35 using T7 RNA polymerase and then treated with DNase 1. The resulting product was reverse transcribed using the splinkerette agtgtgagtcacagtagtctcgcgttc primer according to the Superscript II (Gibco) protocol and then amplified with 30 PCR cycles with internal primers using the primer for the LTR3 '[ggc caa gaa cag atg gaa cag ctg aat atg]. The adjacent region in the human genome was sequenced from undifferentiated neuroectodermal, muscular and endothelial cells and undifferentiated CMAM.

Para demostrar que el mismo sitio de inserción estaba presente en múltiples progenies diferenciadas, se generaron cebadores específicos en el genoma adyacente del receptor. Se empleó amplificación por PCR en tiempo real (ABI PRISM 7700, Perkin Elmer/Applied Biosystems) para cuantificar la secuencia adyacente respecto a la secuencia eGFP. Las condiciones de reacción para la amplificación fueron las siguientes: 40 ciclos de una PCR de dos pasos 45 (95 ºC durante 15 s, 60 ºC durante 60 s) tras la desnaturalización inicial (95 ºC durante 10 min) con 2 μL de solución de ADN, tampón de reacción de PCR TaqMan SYBR GreenUniversal Mix 1X (Perkin Elmer/Applied Biosystems). Se utilizaron los siguientes cebadores: Clon A 16: cebador para la LTR = CCA-ATA-AAC-CCT-CTT-GCA-GTT-G; Secuencia adyacente del cromosoma 7 = TCC-TGC-CAC-CAG-AAA-TAA-CC; Clon A 12 secuencia del cromosoma To demonstrate that the same insertion site was present in multiple differentiated progenies, specific primers were generated in the adjacent genome of the recipient. Real-time PCR amplification (ABI PRISM 7700, Perkin Elmer / Applied Biosystems) was used to quantify the adjacent sequence with respect to the eGFP sequence. The reaction conditions for the amplification were as follows: 40 cycles of a two-step PCR 45 (95 ° C for 15 s, 60 ° C for 60 s) after initial denaturation (95 ° C for 10 min) with 2 μL of solution DNA, TaqMan SYBR GreenUniversal Mix 1X PCR reaction buffer (Perkin Elmer / Applied Biosystems). The following primers were used: Clone A 16: LTR primer = CCA-ATA-AAC-CCT-CTT-GCA-GTT-G; Adjacent sequence of chromosome 7 = TCC-TGC-CAC-CAG-AAA-TAA-CC; Clone A 12 chromosome sequence

7: cebador para la LTR = GGA-GGG-TCT-CCT-CTG-AGT-GAT-T, Secuencia adyacente = CAG-TGG-CCA-GAT-CTC-ATC-TCA-C; Clon A12 secuencia del cromosoma 1: LTR = GGA-GGG-TCT-CCT-CTG-AGT-GAT-T; Secuencia adyacente = GCA-GAC-GAG-GTA-GGC-ACT-TG. Se calculó la cantidad relativa de la secuencia adyacente respecto a la secuencia eGFP de acuerdo con las recomendaciones del fabricante utilizando el 7700 ABI PRISM Detector Software 1.6. 7: LTR primer = GGA-GGG-TCT-CCT-CTG-AGT-GAT-T, Adjacent sequence = CAG-TGG-CCA-GAT-CTC-ATC-TCA-C; Clone A12 chromosome 1 sequence: LTR = GGA-GGG-TCT-CCT-CTG-AGT-GAT-T; Adjacent sequence = GCA-GAC-GAG-GTA-GGC-ACT-TG. The relative amount of the adjacent sequence with respect to the eGFP sequence was calculated according to the manufacturer's recommendations using the 7700 ABI PRISM Detector Software 1.6.

55 Trasplante neural: En este estudio se utilizaron ratas macho Sprague Dawley recién nacidas (P1-P3) (Charles River Laboratories). Las ratas se anestesiaron por crioanestesia. Se inmovilizó el cráneo utilizando un soporte para la cabeza estereotáctico modificado y se retiró el cuero cabelludo para dejar el cráneo al descubierto. Se recolectaron las CMAMh con tripsina al 0,25%/EDTA, se lavaron dos veces y se resuspendieron en PBS. La viabilidad de las CMAMh fue superior al 85%. Se llevó a cabo una inyección intracerebroventricular de manera estereotáctica de un volumen de 2 μL de CMAMh suspendidas en solución salina tamponada con fosfatos con una concentración de 0,7x104 células/μL mediante una micropipeta de vidrio reducida unida a una jeringa Hamilton utilizando las siguientes coordenadas (mm desde el punto bregma): AP -0,6, ML 0,8, DV 2,1, la barra dentada se fijó a -1. Tras las inyecciones, se suturó el cuero cabelludo y se permitió que las crías se recuperaran. 55 Neural transplantation: In this study, newborn Sprague Dawley male rats (P1-P3) (Charles River Laboratories) were used. The rats were anesthetized by cryoanesthesia. The skull was immobilized using a modified stereotactic head support and the scalp was removed to expose the skull. CMAMh were collected with 0.25% trypsin / EDTA, washed twice and resuspended in PBS. The viability of the CMAMh was greater than 85%. An intracerebroventricular injection of a volume of 2 μL of CMAMh suspended in phosphate buffered saline solution with a concentration of 0.7x104 cells / μL was carried out by means of a reduced glass micropipette attached to a Hamilton syringe using the following coordinates (mm from the bregma point): AP -0.6, ML 0.8, DV 2.1, the toothed bar was set to -1. After the injections, the scalp was sutured and the offspring were allowed to recover.

65 Cuatro y 12 semanas tras el trasplante, se anestesiaron las ratas con hidrato de cloral (350 mg/kg, i.p.), se decapitaron, se extrajeron los cerebros, se congelaron en hielo seco pulverizado y se almacenaron a -80 ºC. Se 65 Four and 12 weeks after transplantation, the rats were anesthetized with chloral hydrate (350 mg / kg, i.p.), decapitated, brains were removed, frozen in dry powdered ice and stored at -80 ° C. Be

obtuvieron cortes de cerebros congelados en fresco utilizando un criostato y se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 20 min inmediatamente antes de la tinción. Se incubaron los cortes durante una hora a temperatura ambiente con una solución de bloqueo/permeabilización constituida por suero de mono normal al 2% (Jackson Immuno Labs) y tritón X al 3%. Se diluyeron los anticuerpos primarios y secundarios en la misma solución de 5 bloqueo/permeabilización para los pasos posteriores. Los anticuerpos primarios (de ratón anti-núcleo humano (1:25), anti-membrana nuclear humana (1:25) y anti-NeuN (1:200) de Chemicon; de conejo anti-GFAP (1:250) de DAKO, de conejo anti-NF200 (1:300) de Sigma se incubaron toda la noche a 4 ºC, se lavaron 3x10 minutos cada vez con PBS y a continuación se añadieron anticuerpos secundarios FITC (1:100) y anti Cy3 (1:200) (todos de Jackson Immuno Labs) durante 2 horas a temperatura ambiente. Se examinaron los cortes por microscopía de fluorescencia they obtained fresh frozen brain sections using a cryostat and were fixed with 4% paraformaldehyde for 20 min immediately before staining. The cuts were incubated for one hour at room temperature with a blocking / permeabilization solution consisting of 2% normal monkey serum (Jackson Immuno Labs) and 3% triton X. The primary and secondary antibodies were diluted in the same blocking / permeabilization solution for subsequent steps. Primary antibodies (mouse anti-human nucleus (1:25), anti-human nuclear membrane (1:25) and anti-NeuN (1: 200) from Chemicon; rabbit anti-GFAP (1: 250) from DAKO , from Sigma anti-NF200 rabbit (1: 300) were incubated overnight at 4 ° C, washed 3x10 minutes each time with PBS and then FITC (1: 100) and anti Cy3 (1: 200) secondary antibodies were added (all from Jackson Immuno Labs) for 2 hours at room temperature The sections were examined by fluorescence microscopy

10 utilizando una mira Zeiss Axiovert así como por microscopía de fluorescencia confocal utilizando un microscopio Confocal 1024. 10 using a Zeiss Axiovert sight as well as confocal fluorescence microscopy using a Confocal 1024 microscope.

Las CMAMh adquieren fenotipo de oligodendrocito, astrocito y neurona cuando se cultivan con FCFb CMAMh acquire oligodendrocyte, astrocyte and neuron phenotype when grown with FCFb

15 Se llevó a cabo la diferenciación neuroectodérmica tal como se ha descrito en el Ejemplo 5. Resumiendo, se cultivaron las células en portaobjetos con pocillos recubiertos con FN o placas de cultivo con medio exento de suero constituido por un 60% de DMEM-LG, 40% de MCDB-201 (Sigma Chemical Co, San Luis, MO), suplementado con ITS 1X, LA-BSA 1X, dexametasona 10-8 M, 2-fosfato del ácido ascórbico (AA) 10-4 M (todos de Sigma), 100 U de penicilina y 1000 U de estreptomicina (Gibco). En algunos cultivos se añadieron 100 ng/mL de FCFb mientras que 15 Neuroectodermal differentiation was carried out as described in Example 5. In summary, the cells were grown on slides with FN-coated wells or culture plates with serum-free medium consisting of 60% DMEM-LG, 40% of MCDB-201 (Sigma Chemical Co, San Luis, MO), supplemented with ITS 1X, LA-BSA 1X, 10-8 M dexamethasone, 10-4 M ascorbic acid (AA) 2-phosphate (all from Sigma ), 100 U of penicillin and 1000 U of streptomycin (Gibco). In some cultures 100 ng / mL of FCFb was added while

20 en otros cultivos se añadieron 10 ng/mL de FCE + 10 ng/mL FCF-8b (todos de R&D Systems). Las células no se subcultivaron, sino que se renovó el medio cada 3-5 días. In other cultures, 10 ng / mL of FCE + 10 ng / mL FCF-8b (all from R&D Systems) were added. The cells were not subcultured, but the medium was renewed every 3-5 days.

Dos semanas después de volverlas a colocar en placas con FCFb, un 26 ± 4% de las células expresaron marcadores de astrocitos (GFAP+), 28 ± 3% de oligodendrocitos (MBP+) y 46 ± 5% de neuronas (NF200+), tal como 25 se muestra en la Tabla 6. Two weeks after replacing them with FCFb plates, 26 ± 4% of the cells expressed astrocyte markers (GFAP +), 28 ± 3% oligodendrocytes (MBP +) and 46 ± 5% neurons (NF200 +), such as 25 is shown in Table 6.

Tabla 6. Marcadores de diferenciación de CMMh inducidas con FCFb y FCF-8b Table 6. CMMh differentiation markers induced with FCFb and FCF-8b

FCFb (7.º día)  FCFb (7th day)

FCFb (14.º día) FCFb (21.er día) FCF-8b (7.º día) FCF-8b (14.º día) FCF-8b (21.er día) FCFb (14th day) FCFb (21st day) FCF-8b (7th day) FCF-8b (14th day) FCF-8b (21st day)

GFAP GFAP

36±4% 26±4% 0 0 0 0 36 ± 4%  26 ± 4% 0 0 0 0

MBP MBP

35±3% 28±3% 4±2% 0 0 0 35 ± 3%  28 ± 3% 4 ± 2% 0 0 0

GalC Galc

30+x% 26±5% 8±3% 0 0 0 30 + x%  26 ± 5% 8 ± 3% 0 0 0

Nestina Nestina

35±6% 6±3% No ensayado 90±10% 10±6% No ensayado 35 ± 6% 6 ± 3% Not rehearsed 90 ± 10% 10 ± 6% Not rehearsed

Neuro-D Neuro-D

20±2% 0% No ensayado 50±6% No ensayado No ensayado 20 ± 2% 0% Not rehearsed 50 ± 6% Not rehearsed Not rehearsed

Tuji Tuji

30±3% 23±5% 23±2% 88±5% 92±3% 98±2% 30 ± 3%  23 ± 5% 23 ± 2% 88 ± 5% 92 ± 3% 98 ± 2%

PSA-NCAM PSA-NCAM

33±2% 16±3% No ensayado 40±7% No ensayado No ensayado 33 ± 2% 16 ± 3% Not rehearsed 40 ± 7% Not rehearsed Not rehearsed

NF68 NF68

0 26±7% 22±3% 0 20±3% No ensayado 0 26 ± 7% 22 ± 3% 0 20 ± 3% Not rehearsed

NF160 NF160

0 46±5% 50±3% 0 65±3% No ensayado 0 46 ± 5% 50 ± 3% 0 65 ± 3% Not rehearsed

NF200 NF200

0 15±2% 22±5% 0 75±8% 92±6% 0 15 ± 2% 22 ± 5% 0 75 ± 8% 92 ± 6%

NSE NSE

0 40±4% 82±5% 0 78±3% 80±8% 0 40 ± 4% 82 ± 5% 0 78 ± 3% 80 ± 8%

MAP2-AB MAP2-AB

0 40±6% 80+2% 0 95±4% 95±3% 0 40 ± 6% 80 + 2% 0 95 ± 4% 95 ± 3%

Tau Tau

0 28±2% 78±7% 0 93±2% 92±4% 0 28 ± 2% 78 ± 7% 0 93 ± 2% 92 ± 4%

GABA GABA

0 0 0 0 39±4% 40±2% 0 0 0 0 39 ± 4% 40 ± 2%

Parvalbúmina Parvalbumin

0 0 0 0 28±6% 35±3% 0 0 0 0 28 ± 6% 35 ± 3%

TH TH

0 0 0 20±5% 23±5% 25±6% 0 0 0 20 ± 5% 23 ± 5% 25 ± 6%

DCC DCC

0 0 0 0 25±6% 28±2% 0 0 0 0 25 ± 6% 28 ± 2%

DTP DTP

0 0 0 0 35±7% 38±3% 0 0 0 0 35 ± 7% 38 ± 3%

TrH Trh

0 0 0 0 26±6% 25±4% 0 0 0 0 26 ± 6% 25 ± 4%

Serotonina Serotonin

0 0 0 0 30±5% 35±3% 0 0 0 0 30 ± 5% 35 ± 3%

Nurrl Nurrl

0 0 0 0 20±4% 23±2% 0 0 0 0 20 ± 4% 23 ± 2%

c-ret c-ret

0 0 0 0 33±3% 35±5% 0 0 0 0 33 ± 3% 35 ± 5%

Cuando se colocaron en placas de nuevo CMAMh con densidades celulares mayores (2 x 104 células/cm2) para inducir la diferenciación, no pudo detectarse ninguna célula con fenotipo neuroectodérmico, lo que sugiere que las interacciones célula-célula impiden la diferenciación neuroectodérmica inducida por FCFb. When CMAMh were plated again with higher cell densities (2 x 104 cells / cm2) to induce differentiation, no cell with neuroectodermal phenotype could be detected, suggesting that cell-cell interactions prevent neuroectodermal differentiation induced by FCFb .

5 La distribución de células similares a neuronas, oligodendrocitos y astrocitos no varió cuando se indujo la diferenciación con CMAMh que habían experimentado 20 o 60 DP. Sin embargo, cuando se cultivaron CMAMh expandidas durante más de 20 DP con FCFb, >50% de las células murieron mientras que >70% de las CMAMh expandidas en cultivo durante >30 DP sobrevivieron y adquirieron un fenotipo similar al de los oligodendrocitos, astrocitos o neuronas. Esto sugiere que no se puede inducir la adquisición de características neurales en todas las CMAMh, pero es posible que la subpoblación de CMAMh que sobrevive a largo plazo in vitro sea la responsable de la diferenciación neuronal. Se ha demostrado que el cariotipo de las CMAMh es normal independientemente de la duración del cultivo (Reyes et al., 2001). La diferenciación de CMAMh en células similares a las neuroectodérmicas, por tanto, no es probable que se deba a la transformación de CMAM tras un cultivo a largo plazo. 5 The distribution of cells similar to neurons, oligodendrocytes and astrocytes did not vary when differentiation was induced with CMAMh that had undergone 20 or 60 DP. However, when expanded CMAMh were grown for more than 20 DP with FCFb,> 50% of the cells died while> 70% of the expanded CMAMh in culture during> 30 DP survived and acquired a phenotype similar to oligodendrocytes, astrocytes or neurons This suggests that the acquisition of neural characteristics cannot be induced in all CMAMh, but it is possible that the subpopulation of CMAMh that survives in the long term in vitro is responsible for neuronal differentiation. It has been shown that the karyotype of the CMAMh is normal regardless of the duration of the culture (Reyes et al., 2001). The differentiation of CMAMh into cells similar to neuroectodermal cells, therefore, is not likely to be due to the transformation of CMAM after a long-term culture.

15 La mayoría de las células similares a oligodendrocitos y astrocitos murieron tras 3 semanas. Se observó la maduración progresiva de células similares a las neuronas a través de todo el cultivo. Después de 1 semana, las CMAMh tratadas con FCFb presentaron una tinción positiva para NeuroD, Nestina, la molécula de adhesión celular neural polisialilada (PSA-NCAM, por su siglas en inglés) y tubulina-�-III (TuJI) (Tabla 6). Después de 2 semanas, las células tratadas con FCFb presentaron una tinción positiva para NF68, -160 y -200, NSE, MAP2-AB y Tau. Las neuronas inducidas con FCFb no expresaron marcadores de neuronas dopaminérgicas, serotonérgicas o GABAérgicas, pero expresaron glutamato así como los receptores 5, 6 y 7 de glutamato, el receptor de N-metil-Daspartato (NMDA) y canales de voltaje dependientes de Na+. 15 Most oligodendrocyte and astrocyte-like cells died after 3 weeks. Progressive maturation of neuron-like cells was observed throughout the culture. After 1 week, the CMAMh treated with FCFb had a positive staining for NeuroD, Nestin, the polysyallylated neural cell adhesion molecule (PSA-NCAM) and tubulin-�-III (TuJI) (Table 6) . After 2 weeks, cells treated with FCFb had a positive staining for NF68, -160 and -200, NSE, MAP2-AB and Tau. FCFb-induced neurons did not express markers of dopaminergic, serotonergic or GABAergic neurons, but expressed glutamate as well as 5, 6 and 7 glutamate receptors, the N-methyl-Daspartate (NMDA) receptor and Na + dependent voltage channels.

25 Se obtuvo una confirmación adicional de la diferenciación neuroectodérmica a partir del análisis en matriz de ADNc de dos poblaciones de CMAMh independientes inducidas a diferenciarse durante 14 días con 100 ng/mL de FCFb. Niveles de expresión de nestina, otx I y otx1. De manera coherente con la caracterización inmunohistoquímica, se detectó un aumento en una proporción >2 en el ARNm de nestina, GFAP, receptores 4, 5 y 6 de glutamato, y glutamato y varios canales de voltaje dependientes de sodio, pero no se detectaron aumentos en los niveles de ARNm de TH o TrH. También se observó un aumento en una proporción >2 en los niveles de ARNm del ARNm del homólogo 1 achaete-scute de mamíferos (MASH 1, por sus siglas en inglés), un factor de transcripción encontrado únicamente en el cerebro (Franco Del Amo et al., 1993) y en el ARNm de efrina-A5 (O’Leary y Wilkinson, 1999). El ARNm de un precursor proteico priónico de gran importancia, de los marcadores específicos de astrocitos GFAP y S100A5, y de los marcadores específicos de oligodendrocitos, el precursor de la glucoproteína de la mielina de los An additional confirmation of neuroectodermal differentiation was obtained from the cDNA matrix analysis of two independent populations of CMAMh induced to differentiate for 14 days with 100 ng / mL of FCFb. Expression levels of nestina, otx I and otx1. Consistent with immunohistochemical characterization, an increase was detected in a> 2 ratio in nestin mRNA, GFAP, glutamate receptors 4, 5 and 6, and glutamate and various sodium dependent voltage channels, but no increases were detected in levels of mRNA of TH or TrH. An increase was also observed in a> 2 proportion in mRNA levels of the mammalian homolog 1 achaete-scute mRNA (MASH 1), a transcription factor found only in the brain (Franco Del Amo et al., 1993) and in the mRNA of efrina-A5 (O'Leary and Wilkinson, 1999). The mRNA of a prion protein precursor of great importance, of the specific markers of astrocytes GFAP and S100A5, and of the specific markers of oligodendrocytes, the precursor of the myelin glycoprotein of the

35 oligodendrocitos y la proteína cero de la mielina (PMZ, por sus siglas en inglés), así como la Huntingtina se expresaron en una cantidad mayor en una proporción >2 tras la exposición a FCFb. También se observó un aumento superior a una proporción de 2 para varios receptores de glicina, receptores de GABA, el receptor A del hidroxitriptófano y el receptor de la acetilcolina neuronal, proteínas del transportador de glicina, sinaptobrevina y proteína asociada al sinaptosoma (SNAP)25. Finalmente, la expresión de FNDC inducida por FCFb y el factor neurotrófico derivado de la neuroglia (FNDN). 35 oligodendrocytes and myelin zero protein (PMZ), as well as Huntingtin, were expressed in a greater amount in a proportion> 2 after exposure to FCFb. An increase of 2 was also observed for several glycine receptors, GABA receptors, hydroxytryptophan receptor A and neuronal acetylcholine receptor, glycine transporter proteins, synaptobrevin and synaptosome-associated protein (SNAP) 25 . Finally, the expression of FNDC induced by FCFb and the neurotrophic factor derived from neuroglia (FNDN).

Al igual que las CMAMh, las CMAMr adquieren fenotipo de oligodendrocito, astrocito y neurona cuando se cultivan con FCFb Like CMAMh, CMAMr acquire oligodendrocyte, astrocyte and neuron phenotype when grown with FCFb

45 Se evaluaron CMAM derivadas de otras especies para determinar si se podían obtener resultados similares. Se colocaron en placas de nuevo CMAMr expandidas durante 40-90 DP con una concentración de 104 células/cm2 en condiciones idénticas a las empleadas para las CMAMh. Después de 14 días las CMAMr adquirieron características morfológicas y fenotípicas de astrocitos (GFAP+), oligodendrocitos (MBP+) y neuronas (NF-200+, NSE+ y Tau). En ningún momento se detectaron NF200 y GFAP o MBP en la misma célula. Al contrario que las CMAMr indiferenciadas, las CMAMr tratadas con FCFb fueron significativamente mayores y extendieron los procesos durante >40 !m. 45 CMAM derived from other species were evaluated to determine if similar results could be obtained. Expanded CMAMr plates were plated during 40-90 DP with a concentration of 104 cells / cm2 under conditions identical to those used for CMAMh. After 14 days the CMAMr acquired morphological and phenotypic characteristics of astrocytes (GFAP +), oligodendrocytes (MBP +) and neurons (NF-200 +, NSE + and Tau). At no time were NF200 and GFAP or MBP detected in the same cell. In contrast to undifferentiated CMAMr, CMAMr treated with FCFb were significantly larger and extended the processes for> 40 µm.

Para determinar si las células similares a las neuronas presentaban características funcionales de neuronas, y si las células inducidas por FCFb mostraban evidencia de corrientes de Na+ dependientes de voltaje se empleó la técnica To determine if neuron-like cells had functional characteristics of neurons, and if FCFb-induced cells showed evidence of voltage-dependent Na + currents, the technique was used.

55 del pinzamiento zonal de membrana. No se observaron corrientes de sodio ni un comportamiento de espiga rápida en ninguna de las células similares a neuronas derivadas de CMAMr (n=59), aunque algunas células expresaron corrientes de calcio y se apreció evidencia de un comportamiento de espiga mediado por corrientes de calcio en 4 células. Por tanto, las células inducidas por FCFb no poseen corrientes de Na+ dependientes de voltaje funcionales, a pesar de la expresión del ARNm y proteína del canal de voltaje dependiente de sodio. 55 of the membrane zone clamp. No sodium currents or rapid spike behavior were observed in any of the neuron-like cells derived from CMAMr (n = 59), although some cells expressed calcium currents and evidence of a spike behavior mediated by calcium currents was noted. in 4 cells Therefore, FCFb-induced cells do not possess functional voltage-dependent Na + currents, despite the expression of the mRNA and sodium-dependent voltage channel protein.

Las CMAMh adquieren un fenotipo GABAérgico, serotonérgico y dopaminérgico mesencefálico cuando se cultivan con FCE y FCF-8b. CMAMh acquire a GABAergic, serotonergic, and mesencephalic dopaminergic phenotype when grown with FCE and FCF-8b.

El FCF-8b, expresado en la frontera del rombencéfalo medio y por el presencéfalo rostral, induce la diferenciación de 65 neuronas dopaminérgicas en el mesencéfalo y presencéfalo y de neuronas serotonérgicas en el rombencéfalo (Ye et al., 1998). El FCF-8b se ha utilizado in vitro para inducir neuronas serotonérgicas y dopaminérgicas a partir de células ME murinas (Lee et al., 2000). FCF-8b, expressed on the border of the middle rhombencephalon and by the rostral presencephalon, induces the differentiation of 65 dopaminergic neurons in the midbrain and presencephalon and serotonergic neurons in the rhombencephalon (Ye et al., 1998). FCF-8b has been used in vitro to induce serotonergic and dopaminergic neurons from murine ME cells (Lee et al., 2000).

Las CMAMh (n=8), expandidas durante 20-60 DP, se colocaron de nuevo en placas con una concentración de 2x104 The CMAMh (n = 8), expanded during 20-60 DP, were placed back on plates with a concentration of 2x104

5 células/cm2 en FN en medio exento de suero con ITS y AA y con 10 ng/mL de FCF-8b y 1 ng/mL de FCE. Más de un 80% de las células sobrevivieron durante 3 semanas. FCF-8b y FCE indujeron difrerenciación en células que presentaron una tinción positiva para marcadores neuronales (Tabla 6) (7.º día: PSA-NCAM, nestina y TuJ1; 14.º: NF-68, NF-160, NF-200; y 21.er día: MAP2-AB, NSE, Tau y canales de voltaje dependientes de Na+) pero no en oligodendrocitos ni astrocitos. A diferencia de la observación por parte de los autores de la diferenciación inducida por FCFb, las células colocadas en placas con una concentración de 104 células/cm2 con FCE y FCF-8b no experimentaron diferenciación. Después de 2-3 semanas, las células presentaron características de neuronas serotonérgicas (TrH+ y serotonina+), dopaminérgicas (TH+, DCC+ y DTP+) y GABAérgicas (GABA+, parvalbúmina+) (Tabla 6). Las células también expresaron el receptor GABA-A y receptores de glutamato. Las células con un fenotipo dopaminérgico también presentaron una tinción positiva con Abs contra el factor de trascripción nuclear, 5 cells / cm2 in FN in serum-free medium with STIs and AA and with 10 ng / mL of FCF-8b and 1 ng / mL of FCE. More than 80% of the cells survived for 3 weeks. FCF-8b and FCE induced differentiation in cells that showed positive staining for neuronal markers (Table 6) (7th day: PSA-NCAM, nestina and TuJ1; 14th: NF-68, NF-160, NF-200 ; and 21st day: MAP2-AB, NSE, Tau and Na + dependent voltage channels) but not in oligodendrocytes or astrocytes. In contrast to the observation by the authors of FCFb-induced differentiation, plaque cells with a concentration of 104 cells / cm2 with FCE and FCF-8b did not undergo differentiation. After 2-3 weeks, the cells showed characteristics of serotonergic neurons (TrH + and serotonin +), dopaminergic (TH +, DCC + and DTP +) and GABAergic (GABA +, parvalbumin +) (Table 6). The cells also expressed the GABA-A receptor and glutamate receptors. Cells with a dopaminergic phenotype also had a positive staining with Abs against the nuclear transcription factor,

15 NurrI, expresado únicamente en las neuronas dopaminérgicas mesencefálicas (Saucedo-Cardenas et al., 1998) así como el protooncogén cRet, un receptor asociado a la membrana que es una proteína tirosina-cinasa, el cual es un componente del complejo receptor del factor neurotrófico derivado de la línea celular neuroglial (FNDN) expresado en las neuronas dopaminérgicas (Trupp et al., 1996). Esto sugiere que FCF-8b induce un fenotipo congruente con las neuronas dopaminérgicas mesencefálicas. 15 NurrI, expressed only in the mesencephalic dopaminergic neurons (Saucedo-Cardenas et al., 1998) as well as the protooncogene cRet, a membrane-associated receptor that is a tyrosine kinase protein, which is a component of the factor receptor complex neurotrophic derived from the neuroglial cell line (FNDN) expressed in dopaminergic neurons (Trupp et al., 1996). This suggests that FCF-8b induces a congruent phenotype with mesencephalic dopaminergic neurons.

De nuevo, se confirmaron los resultados de los estudios inmunohistoquímicos mediante análisis con una matriz de ADNc en CMAMh inducidas a diferenciarse durante 14 días con FCF-8b+FCE. De manera consistente con la caracterizacion inmunohistoquímica, se detectó un aumento en una proporción >2 en el ARNm de TH, TrH, glutamato, varios receptores de glutamato y canales de voltaje dependientes de sodio. Ya que la parvalbúmina y el Again, the results of immunohistochemical studies were confirmed by analysis with a cDNA matrix in CMAMh induced to differentiate for 14 days with FCF-8b + FCE. Consistent with immunohistochemical characterization, an increase was detected in a> 2 ratio in the mRNA of TH, TrH, glutamate, various glutamate receptors and sodium dependent voltage channels. Since the parvalbumin and the

25 GABA no estaban presentes en la matriz, su expresión no pudo confirmarse mediante el análisis del ARNm. De manera consistente con la diferenciación neural prácticamente exclusiva observada por inmunohistoquímica, no hubo un aumento en la expresión del ARNm de S100A5, GFAP ni en el ARNm del marcador específico de oligodendrocitos, PMZ. Las células inducidas con FCF-8b+FCE expresaron varias proteínas sinápticas, varios receptores de glicina, GABA e hidroxitriptamina, FNDN y FNDC y el receptor tirosina-cinasa (Trk)A en una proporción >2. 25 GABA were not present in the matrix, its expression could not be confirmed by mRNA analysis. Consistent with the practically exclusive neural differentiation observed by immunohistochemistry, there was no increase in the expression of the S100A5 mRNA, GFAP or in the mRNA of the oligodendrocyte specific marker, PMZ. Cells induced with FCF-8b + FCE expressed several synaptic proteins, several glycine, GABA and hydroxytryptamine, FNDN and FNDC receptors and the tyrosine kinase (Trk) A receptor in a proportion> 2.

El cultivo conjunto con la línea celular de glioblastoma U87 estimula la maduración neuronal. The joint culture with the U87 glioblastoma cell line stimulates neuronal maturation.

Independientemente de las condiciones de cultivo empleadas, las neuronas derivadas de CMAMh no sobrevivieron Regardless of the culture conditions used, the neurons derived from CMAMh did not survive

35 más de 3-4 semanas en cultivo. Ya que ninguno de los cultivos contuvieron células neurogliales después de 3 semanas, es posible que las células neuronales que expresan tanto glutamato como los receptores de glutamato murieran debido a la toxicidad del glutamato (Anderson y Swanson, 2000). De manera alternativa, los factores requeridos para la supervivencia, diferenciación y maduración de las células neurales proporcionados por las células neurogliales puede que no estuvieran presentes en los cultivos (Blondel et al., 2000; Daadi y Weiss, 1999; Wagner et al., 1999). Para comprobar esta hipótesis, se cultivaron células obtenidas de cultivos de 3 semanas con FCF-8b+FCE junto con la línea celular de glioblastoma U87 en medio exento de suero suplementado con FCF-8b+FCE durante 2 semanas más. 35 more than 3-4 weeks in culture. Since none of the cultures contained neuroglia cells after 3 weeks, it is possible that neuronal cells expressing both glutamate and glutamate receptors died due to glutamate toxicity (Anderson and Swanson, 2000). Alternatively, the factors required for the survival, differentiation and maturation of the neural cells provided by the neuroglial cells may not be present in the cultures (Blondel et al., 2000; Daadi and Weiss, 1999; Wagner et al., 1999). To test this hypothesis, cells obtained from 3-week cultures were cultured with FCF-8b + FCE along with the U87 glioblastoma cell line in serum-free medium supplemented with FCF-8b + FCE for 2 more weeks.

Se mantuvo la línea celular de glioma U-87 [American Tissue Cell Collection (Rockville, MD)] en DMEM+FCS al 10% U-87 glioma cell line [American Tissue Cell Collection (Rockville, MD)] was maintained in DMEM + 10% FCS

45 (Hyclone Laboratories, Logan, UT). Las células obtenidas de cultivos de 3 semanas que contenían FCF-8b+FCE se marcaron con el colorante lipofílico PKH26 (Sigma) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Se colocaron de nuevo las células marcadas en portaobjetos con pocillos recubiertos con FN en medio exento de suero que contenía FCF-8b+FCE junto con 1000 células U-87 y se mantuvieron durante 2-3 semanas más renovando el medio cada 3-5 días. Para garantizar que el PKH26 presente en las células derivadas de CMAM no se transfería a la línea celular U87, se cultivaron las células U-87 en medio que contenía BSA y 20 μL del colorante PKH26 durante 7 días. No se detectaron células de glioma marcadas. 45 (Hyclone Laboratories, Logan, UT). Cells obtained from 3-week cultures containing FCF-8b + FCE were labeled with lipophilic dye PKH26 (Sigma) following the manufacturer's recommendations. The labeled cells were repositioned on slides with FN-coated wells in serum-free medium containing FCF-8b + FCE together with 1000 U-87 cells and kept for 2-3 more weeks renewing the medium every 3-5 days . To ensure that the PKH26 present in the CMAM-derived cells was not transferred to the U87 cell line, the U-87 cells were cultured in medium containing BSA and 20 µL of the PKH26 dye for 7 days. No labeled glioma cells were detected.

En estas condiciones exentas de suero, las células U-87 cesaron de proliferar pero sobrevivieron. Las neuronas derivadas de CMAMh se marcaron con el colorante de membrana, PKH26, antes del cultivo conjunto con células UIn these serum-free conditions, U-87 cells ceased to proliferate but survived. The neurons derived from CMAMh were labeled with the membrane dye, PKH26, before joint culture with U cells

55 87 para permitir la identificación de células derivadas de CMAMh por microscopía de fluorescencia. Las neuronas inducidas con FCF-8b+FCE cultivadas conjuntamente después de 3 semanas con células U-87 y las mismas citocinas sobrevivieron al menos durante 2 semanas adicionales. Las neuronas adquirieron una morfología más madura con un mayor tamaño celular así como un mayor número, longitud y complejidad de las neuritas. 55 87 to allow identification of cells derived from CMAMh by fluorescence microscopy. FCF-8b + FCE-induced neurons cultured together after 3 weeks with U-87 cells and the cytokines themselves survived for at least 2 additional weeks. Neurons acquired a more mature morphology with a larger cell size as well as a greater number, length and complexity of neurites.

Se evaluaron las características electrofisiológicas de las células neurales marcadas con PKH26 derivadas de CMAMh tras el cultivo conjunto con células U-87 mediante un pinzamiento de corriente en células enteras y un pinzamiento de voltaje tras una inyección de corriente (Fig. 9B). El pinzamiento de corriente mostró un comportamiento en espigas en respuesta a la corriente inyectada en 4/8 de las células derivadas de CMAMh marcadas con PKH26 presentes en los cultivos FCF-8b+FCE/U-87. El potencial de membrana de reposo de células 65 con espigas y sin espigas fue de -64,9±5,5 mV y -29,7±12,4 mV respectivamente. Para cada célula estudiada, la resistencia de entrada de las células con espigas y sin espigas fue de 194,3 (37.3) y 216,3 (52.5) Mohm respectivamente. En la Fig. 9B se muestra un ejemplo de una de las células en las cuales se observó un comportamiento en espigas. El panel superior muestra una familia de trazas de voltaje la cual se obtuvo a partir de una célula con espigas en condiciones de control. En primer lugar se inyectó una corriente CC en la célula para mantenerla en el intervalo comprendido entre -100 y -120 mV. A continuación se utilizó un protocolo de inyección de 5 corriente, tal como se muestra en el panel central, para conducir los potenciales de membrana a diferentes niveles. Tal como se muestra en este ejemplo, los pasos de corriente despolarizadora con una magnitud suficiente para llevar a las células al umbral del potencial de acción, provocaron una espiga única. El panel inferior muestra que el comportamiento en espigas de las células se puede bloquear mediante TTX 1 μM, lo que sugiere que los potenciales de acción están mediados por canales de voltaje dependientes de Na. Los registros de corrientes a los que se les 10 habían sustraído las fugas, obtenidos en modo de pinzamiento de voltaje a partir de las mismas células (Fig. 9C), mostraron una corriente hacia el interior que fue transitoria en la evolución temporal y activada con voltajes más positivos que -58 mV, así como corrientes hacia el exterior. La corriente transitoria hacia el interior se bloqueó de manera reversible con TTX 1 μM. Esta farmacología, junto con la evolución temporal transitoria y la activación dependiente de voltaje de la corriente hacia el interior es típica de las corrientes de Na+ dependientes de voltaje, The electrophysiological characteristics of PKH26-labeled neural cells derived from CMAMh after joint culture with U-87 cells were evaluated by means of a current clamp in whole cells and a voltage clamp after a current injection (Fig. 9B). The current clamp showed a behavior in spikes in response to the current injected in 4/8 of the CMAMh derived cells labeled with PKH26 present in the FCF-8b + FCE / U-87 cultures. The resting membrane potential of 65 cells with spikes and without spikes was -64.9 ± 5.5 mV and -29.7 ± 12.4 mV respectively. For each cell studied, the input resistance of the cells with spikes and without spikes was 194.3 (37.3) and 216.3 (52.5) Mohm respectively. An example of one of the cells in which a spike behavior was observed is shown in Fig. 9B. The top panel shows a family of voltage traces which was obtained from a cell with spikes under control conditions. First, a DC current was injected into the cell to keep it in the range between -100 and -120 mV. Next, a 5-current injection protocol, as shown in the central panel, was used to drive the membrane potentials to different levels. As shown in this example, the depolarizing current passages with a magnitude sufficient to bring the cells to the threshold of the action potential, caused a single spike. The bottom panel shows that the spike behavior of the cells can be blocked by 1 μM TTX, suggesting that the action potentials are mediated by Na-dependent voltage channels. The current registers to which the leaks had been subtracted, obtained in voltage clamp mode from the same cells (Fig. 9C), showed an inward current that was transient in temporal evolution and activated with voltages more positive than -58 mV, as well as outward currents. The transient inward current was reversibly blocked with 1 μM TTX. This pharmacology, together with the temporary temporal evolution and the voltage-dependent activation of the inward current is typical of the voltage-dependent Na + currents,

15 detectadas únicamente en las células del músculo esquelético y de neuronas maduras (Sah et al., 1997; Whittemore et al., 1999). No se detectaron marcadores de músculo esquelético en estas células similares a las neuronas. Estos estudios sugieren que el tratamiento con FCF-8b+FCE y el cultivo conjunto con células de glioblastoma dieron como resultado la maduración en células con las características fundamentales de las neuronas excitables, corrientes de Na+ dependientes de voltaje sensibles a TTX. 15 detected only in skeletal muscle cells and mature neurons (Sah et al., 1997; Whittemore et al., 1999). No skeletal muscle markers were detected in these cells similar to neurons. These studies suggest that treatment with FCF-8b + FCE and joint culture with glioblastoma cells resulted in maturation in cells with the fundamental characteristics of excitable neurons, voltage-dependent Na + currents sensitive to TTX.

20 Las CMAMh trasplantadas en ventrículos de ratas recién nacidas se diferencian en células que expresan marcadores neuronales y de astrocitos 20 CMAMh transplanted into ventricles of newborn rats differ in cells that express neuronal and astrocyte markers

Se inyectaron 1,4x104 CMAMh estereotácticamente en los ventrículos laterales de ratas Sprague Dawley PI-P3. 1.4x104 CMAMh were injected stereotactically into the lateral ventricles of Sprague Dawley PI-P3 rats.

25 Después de 4 y 12 semanas, se sacrificaron los animales y se analizaron para detectar la presencia de células humanas y evidencia de diferenciación de CMAMh en neuroectodermo. Se pudieron apreciar células humanas, identificadas por tinción con anticuerpos contra núcleos humanos o membranas nucleares humanas en la ZSV hasta a 400 μm de distancia del ventrículo en animales analizados después de 4 semanas, y después de 12 semanas, también se pudieron apreciar células humanas situadas más profundamente en el parénquima cerebral tal como en 25 After 4 and 12 weeks, the animals were sacrificed and analyzed for the presence of human cells and evidence of CMAMh differentiation in neuroectoderm. Human cells were identified, identified by staining with antibodies against human nuclei or human nuclear membranes in the ZSV up to 400 μm away from the ventricle in animals analyzed after 4 weeks, and after 12 weeks, human cells located more deeply in the cerebral parenchyma as in

30 el hipocampo y a lo largo del trígono cerebral. Algunas células humanas presentaron una morfología típica de los astrocitos y una tinción positiva con anticuerpos anti-GFAP, mientras que otras células presentaron una tinción positiva con anticuerpos anti-Neu-N, NF-200 y anticuerpos anti-membranas nucleares humanas. La tinción triple mostró que células positivas para Neu-N y positivas para el antígeno nuclear humano no coexpresaban GFAP. 30 the hippocampus and along the cerebral trigone. Some human cells had a typical astrocyte morphology and a positive staining with anti-GFAP antibodies, while other cells had a positive staining with anti-Neu-N, NF-200 antibodies and human nuclear anti-membrane antibodies. Triple staining showed that Neu-N positive and human nuclear antigen positive cells did not coexpress GFAP.

35 Resumen 35 Summary

El hallazgo principal de este trabajo es que se puede inducir la diferenciación de una CMAM única derivada de MO después del nacimiento no solo en tipos celulares mesodérmicos sino también en células con características neuronales maduras, así como con características de oligodendrocitos y astrocitos. Se ha demostrado la maduración 40 dependiente del tiempo, así como la dependiente del método de cultivo, de CMAM en células con características neuroectodérmicas. La tinción doble demostró de manera concluyente que las células neurogliales o neuronales eran auténticas y que los resultados no se debían a marcadores neurogliales o neuronales expresados de manera inapropiada. Estos resultados se confirmaron al nivel del ARNm. Se emplearon estudios de marcaje retroviral para demostrar que las neuronas, astrocitos y oligodendrocitos se derivaban de una CMAM única que también se The main finding of this work is that differentiation of a single CMAM derived from MO can be induced after birth not only in mesodermal cell types but also in cells with mature neuronal characteristics, as well as with oligodendrocyte and astrocyte characteristics. The time-dependent maturation, as well as the culture-dependent method, of CMAM has been demonstrated in cells with neuroectodermal characteristics. The double staining conclusively demonstrated that the neuroglial or neuronal cells were authentic and that the results were not due to neuronal or neuronal markers expressed inappropriately. These results were confirmed at the mRNA level. Retroviral labeling studies were used to demonstrate that neurons, astrocytes and oligodendrocytes were derived from a single CMAM that also

45 diferencia en músculo y endotelio, ya que la secuencia de la región genómica de la célula receptora adyacente al vector retroviral fue idéntica en todas las estirpes. Las CMAMh no solo adquirieron el fenotipo, sino también las características electrofisiológicas de las neuronas maduras, en concreto las corrientes de Na+ dependientes de voltaje y sensibles a TTX. Finalmente, también se ha demostrado que las CMAM se pueden diferenciar in vivo en células que expresan marcadores neuronales y de astrocitos. Difference in muscle and endothelium, since the sequence of the genomic region of the recipient cell adjacent to the retroviral vector was identical in all strains. The CMAMh not only acquired the phenotype, but also the electrophysiological characteristics of mature neurons, specifically the voltage-dependent and TTX-sensitive Na + currents. Finally, it has also been shown that CMAMs can be differentiated in vivo in cells that express neuronal and astrocyte markers.

50 Utilizando el marcaje retroviral de CMAMh combinado con la secuenciación basada en PCR de la secuencia genómica adyacente a la LTR 3’ de inserto retroviral, se demostró que las neuronas se derivan de la misma CMAMh que se diferencia en astrocitos y oligodendrocitos, así como en endotelio y músculo (Jordan et al., 1990). Esto demuestra de manera concluyente que las CMAM pueden, en el nivel de célula única, diferenciarse en células de 50 Using the retroviral labeling of CMAMh combined with the PCR-based sequencing of the genomic sequence adjacent to the 3 'LTR of retroviral insertion, it was demonstrated that neurons are derived from the same CMAMh that differs in astrocytes and oligodendrocytes, as well as in endothelium and muscle (Jordan et al., 1990). This conclusively demonstrates that CMAMs can, at the single cell level, differentiate into cells of

55 estirpes neuroectodérmicas y mesodérmicas. Se dio un nuevo nombre a las células con la capacidad de diferenciarse no solamente en tipos celulares mesodérmicos sino también en tipos celulares neuroectodérmicos, células madre adultas multipotentes o CMAM. Sanchez-Ramos et al. (Sanchez-Ramos et al., 2000) y Woodbury et al. (Woodbury et al., 2000) demostraron que las poblaciones de CMM de roedores o humanos pueden expresar marcadores de astrocitos y neuronas, pero no de oligodendrocitos in vitro. Sin embargo, ningún estudio proporcionó 55 neuroectodermal and mesodermal lines. Cells were renamed with the ability to differentiate not only in mesodermal cell types but also in neuroectodermal cell types, multipotent adult stem cells or CMAM. Sanchez-Ramos et al. (Sanchez-Ramos et al., 2000) and Woodbury et al. (Woodbury et al., 2000) demonstrated that CMM populations of rodents or humans can express markers of astrocytes and neurons, but not oligodendrocytes in vitro. However, no study provided

60 ninguna evidencia de que la misma célula que adquirió los marcadores neuroectodérmicos también pudiera diferenciarse en células mesodérmicas. Además, ningún estudio demostró que las células que expresaban marcadores neuronales también adquirieran características neuronales funcionales. Por tanto, aunque sugieren diferenciación neural, estos artículos no demuestran de manera concluyente la diferenciación neuroglial y neural a partir de CMM. 60 no evidence that the same cell that acquired neuroectodermal markers could also differentiate into mesodermal cells. In addition, no study showed that cells expressing neuronal markers also acquired functional neuronal characteristics. Therefore, although they suggest neural differentiation, these articles do not conclusively demonstrate neuroglial and neural differentiation from CMM.

65 También se ha demostrado que las CMAMh trasplantadas en el ventrículo de ratas recién nacidas pueden migrar en la zona subventricular neurogénica y dentro del hipocampo donde responden a estímulos locales para diferenciarse en células que expresan marcadores neuronales y de astrocitos. Se escogió este modelo debido a que la migración y diferenciación de CMN en fenotipos neuronales específicos ocurre en una extensión mucho mayor cuando el 65 It has also been shown that CMAMh transplanted in the ventricle of newborn rats can migrate in the neurogenic subventricular zone and within the hippocampus where they respond to local stimuli to differentiate into cells expressing neuronal and astrocyte markers. This model was chosen because the migration and differentiation of CMN into specific neuronal phenotypes occurs to a much greater extent when the

5 trasplante se lleva a cabo en áreas germinales del cerebro que en áreas no neurogénicas, y cuando los trasplantes se llevan a cabo en animales recién nacidos en comparación con animales adultos (Bjorklund y Lindvall, 2000; Svendsen y Caldwell, 2000). Aunque las CMAMh son multipotentes y se diferencian en células fuera del neuroectodermo, las CMAMh no formaron teratomas. El número de células que habían migrado fuera de la zona subventricular después de 4 semanas fue bajo, pero se incrementó tras 12 semanas. 5 transplantation is carried out in germinal areas of the brain than in non-neurogenic areas, and when transplants are carried out in newborn animals compared to adult animals (Bjorklund and Lindvall, 2000; Svendsen and Caldwell, 2000). Although CMAMh are multipotent and differentiate in cells outside the neuroectoderm, CMAMh did not form teratomas. The number of cells that had migrated outside the subventricular area after 4 weeks was low, but increased after 12 weeks.

La facilidad con la que se pueden aislar CMAM de MO después del nacimiento, expandir e inducir su diferenciación in vitro en tipos celulares neuronales, de oligodendrocitos o astrocitos puede sortear uno de los problemas clave en el trasplante de CMN, en concreto la disponibilidad de un donante de tejido adecuado. The ease with which CMAM can be isolated from MO after birth, expanding and inducing its differentiation in vitro into neuronal cell types, oligodendrocytes or astrocytes can circumvent one of the key problems in CMN transplantation, specifically the availability of a Adequate tissue donor.

15 Ejemplo 11. Diferenciación de CMAM en células similares a hepatocitos 15 Example 11. Differentiation of CMAM in hepatocyte-like cells

Durante la embriogénesis, la primera señal de morfogénesis hepática es el engrosamiento del epitelio endodérmico ventral, el cual ocurre entre las e7,5 y e8,5 en el ratón (Zaret K.S., 2001). Se sabe poco sobre las señales implicadas en la formación del endodermo inicial y la posterior especialización del endodermo. En la etapa temprana de la gastrulación (e6-e7) el endodermo no está especializado, ni tan siquiera en una dirección anterior/posterior (Melton D., 1997). Sin embargo, estudios recientes han demostrado que la exposición ex vivo del endodermo a FCF4 posterioriza el endodermo temprano, el cual se vuelve competente para expresar marcadores hepáticos (Wells J.M. et al., 1999). En la e8.5 en el ratón, el endodermo definitivo ha formado el tubo intestinal y expresa HNF3� (Zaret K.S., 2000). Se induce el endodermo del intestino anterior hacia una estirpe hepatocítica mediante FCFb y FCFa During embryogenesis, the first sign of hepatic morphogenesis is the thickening of the ventral endodermal epithelium, which occurs between e7.5 and e8.5 in the mouse (Zaret K.S., 2001). Little is known about the signals involved in the formation of the initial endoderm and the subsequent specialization of the endoderm. In the early stage of gastrulation (e6-e7) the endoderm is not specialized, even in an anterior / posterior direction (Melton D., 1997). However, recent studies have shown that ex vivo exposure of the endoderm to FCF4 postpone the early endoderm, which becomes competent to express hepatic markers (Wells J.M. et al., 1999). In e8.5 in the mouse, the definitive endoderm has formed the intestinal tube and expresses HNF3� (Zaret K.S., 2000). The endoderm of the anterior intestine is induced into a hepatocyte lineage by FCFb and FCFa

25 (ácido), ambos producidos por el mesodermo cardíaco adyacente (Zaret K.S., 2001), los cuales son necesarios para inducir el destino hepático y no el destino pancreático predeterminado (Zaret K.S., 2001). También se requieren proteínas morfogenéticas básicas (PMB) producidas por la mesénquima transversal ya que aumentan los niveles del factor de transcripción GATA4 el cual promueve la capacidad del endodermo para responder a los FCF (Zaret K.S., 2001). Se requieren GATA4 y HNF3� para la especialización hepática y son importantes efectores de eventos posteriores que dan lugar a la diferenciación hepatocítica, ya que aumentan de manera regulada los marcadores de la expresión específica hepatocítica tales como la albúmina, entre otros. 25 (acid), both produced by the adjacent cardiac mesoderm (Zaret K.S., 2001), which are necessary to induce hepatic fate and not the predetermined pancreatic fate (Zaret K.S., 2001). Basic morphogenetic proteins (PMB) produced by the transverse mesenchyme are also required as they increase the levels of the transcription factor GATA4 which promotes the ability of the endoderm to respond to FCF (Zaret K.S., 2001). GATA4 and HNF3� are required for hepatic specialization and are important effectors of subsequent events that lead to hepatocytic differentiation, since they increase in a regulated manner the markers of hepatocytic specific expression such as albumin, among others.

En la mayoría de los casos, los hepatocitos maduros pueden experimentar varias divisiones celulares y son responsables del reemplazamiento celular hepático. Como resultado, ha habido una gran controversia acerca de la 35 existencia y función de una célula madre hepática. Durante la amplia necrosis hepática debida a una herida química In most cases, mature hepatocytes can undergo several cell divisions and are responsible for liver cell replacement. As a result, there has been great controversy about the existence and function of a liver stem cell. During extensive liver necrosis due to a chemical wound

o cuando se tratan los hepatocitos con compuestos químicos que bloquean su proliferación, una población de células más pequeñas con forma oval, denominadas células ovales, emergen y proliferan (Petersen, B.E., 2001). Estas células ovales pueden constituir la reserva de “células madre” en el hígado. Las células ovales residen en las unidades más pequeñas del árbol biliar, denominadas los canales de Herring, desde donde migran con dirección al parénquima hepático (Theise N.D. et al., 1999). Las células ovales son bipotenciales, dan lugar in vitro e in vivo tanto a los hepatocitos como al epitelio de la vía biliar. Las células ovales expresan varios marcadores hematopoyéticos tales como Thy1.1, CD34, receptor Flt-3 y c-Kit y también expresan aFP, CK19, y-glutamil-transferasa y OV-6. No se conoce el origen de las células ovales (Petersen, B.E., 2001; Kim T.H. et al., 1997; Petersen, B.E., 2001). or when hepatocytes are treated with chemical compounds that block their proliferation, a population of smaller oval-shaped cells, called oval cells, emerge and proliferate (Petersen, B.E., 2001). These oval cells may constitute the reserve of "stem cells" in the liver. The oval cells reside in the smallest units of the biliary tree, called the Herring canals, from where they migrate to the hepatic parenchyma (Theise N.D. et al., 1999). Oval cells are bipotential, giving rise to both hepatocytes and bile duct epithelium in vitro and in vivo. Oval cells express several hematopoietic markers such as Thy1.1, CD34, Flt-3 receptor and c-Kit and also express aFP, CK19, and -glutamyl transferase and OV-6. The origin of the oval cells is unknown (Petersen, B.E., 2001; Kim T.H. et al., 1997; Petersen, B.E., 2001).

45 Hasta hace poco, se creía que los hepatocitos solo podían derivarse de células de origen endodérmico y de sus progenitores. Sin embargo, estudios recientes sugieren que las células no endodérmicas también pueden formar hepatocitos in vivo e in vitro (Petersen, B.E., 2001; Pittenger M.F. et al., 1999). Tras el trasplante de médula ósea (MO), las células ovales se derivan de la MO del donante (Theise N.D. et al., 1999). El trasplante de células madre hematopoyéticas (CMH) enriquecidas en ratones FAH-/-, un modelo en animales de la tirosinemia de tipo I, dio como resultado la proliferación de un gran número de hepatocitos LacZ+ del donante y los animales presentaron una función bioquímica hepática restaurada (Lagasse E. et al., 2000). Además, las CMH únicas no solo repueblan el sistema hematopoyético sino que también contribuyen al epitelio del pulmón, de la piel, del hígado y del intestino (Krause D.S. et al., 2001). Las células tumorales pancreáticas exocrinas tratadas in vitro con dexametasona (Dex) con o sin oncostatina M (OSM) pueden adquirir un fenotipo hepatocítico (Shen C.N. et al., 2000). Finalmente, las 45 Until recently, it was believed that hepatocytes could only be derived from cells of endodermal origin and their progenitors. However, recent studies suggest that non-endodermal cells can also form hepatocytes in vivo and in vitro (Petersen, B.E., 2001; Pittenger M.F. et al., 1999). After bone marrow transplantation (MO), the oval cells are derived from the donor's MO (Theise N.D. et al., 1999). Transplantation of hematopoietic stem cells (CMH) enriched in FAH - / - mice, a model in type I tyrosinemia animals, resulted in the proliferation of a large number of donor LacZ + hepatocytes and the animals had a liver biochemical function restored (Lagasse E. et al., 2000). In addition, unique CMHs not only repopulate the hematopoietic system but also contribute to the epithelium of the lung, skin, liver and intestine (Krause D.S. et al., 2001). Exocrine pancreatic tumor cells treated in vitro with dexamethasone (Dex) with or without M oncostatin (OSM) can acquire a hepatocytic phenotype (Shen C.N. et al., 2000). Finally, the

55 células madre embrionarias (ME) de ratón adquieren espontáneamente un fenotipo hepatocítico, un proceso que se ve favorecido por el tratamiento con FCFa, FCH, OSM y Dex (Hamazaki T. et al., 2001). 55 mouse embryonic stem cells (ME) spontaneously acquire a hepatocytic phenotype, a process that is favored by treatment with FCFa, FCH, OSM and Dex (Hamazaki T. et al., 2001).

Se ha demostrado que las CMAM únicas no solo se diferencian en células neuroectodérmicas y mesodérmicas, sino también en células con características funcionales, fenotípicas y morfológicas de los hepatocitos in vitro. Las CMAMr, CMAMrata y CMAMh adquieren un fenotipo similar al de los hepatocitos cuando se cultivan con FCF4 y/o FCH. It has been shown that single CMAMs differ not only in neuroectodermal and mesodermal cells, but also in cells with functional, phenotypic and morphological characteristics of hepatocytes in vitro. CMAMr, CMAMrata and CMAMh acquire a phenotype similar to that of hepatocytes when cultured with FCF4 and / or FCH.

Se seleccionaron y cultivaron CMAMr, CMAMrata y CMAMh tal como se ha descrito. Para determinar las condiciones óptimas para la diferenciación de las CMAM en células similares a los hepatocitos, se evaluó el efecto 65 de diferentes componentes de la matriz extracelular (MEC) y de citocinas de las cuales se sabe que inducen diferenciación en hepatocitos in vivo o a partir de células ME (Zaret K.S., 2001), en la diferenciación de CMAMr o CMAMr, CMAMrata and CMAMh were selected and cultured as described. To determine the optimal conditions for the differentiation of CMAMs in hepatocyte-like cells, the effect of different components of the extracellular matrix (MEC) and cytokines of which it is known to induce differentiation in hepatocytes in vivo or from was evaluated of ME cells (Zaret KS, 2001), in the differentiation of CMAMr or

CMAMrata en hepatocitos. Ya que la diferenciación requiere la interrupción del ciclo celular, también se evaluó el efecto de la densidad celular. Para demostrar la diferenciación en células similares a los hepatocitos, se tiñeron las células después de 14 días con Abs contra albúmina, CK18 y HNF3�. CMAMrata in hepatocytes. Since differentiation requires disruption of the cell cycle, the effect of cell density was also evaluated. To demonstrate differentiation into hepatocyte-like cells, cells were stained after 14 days with Abs against albumin, CK18 and HNF3�.

5 Se observó la diferenciación óptima de CMAMr o CMAMrata en células epitelioides positivas para HNF3�, CK18 y albúmina cuando se colocaron las CMAM en placas con una concentración de 21,5x103 células/cm2 en presencia de 10 ng/mL de FCF4 y 20 ng/mL de FCH en Matrigel™ tal como se muestra en la Tabla 7A. Después de 14 días, el porcentaje de células epitelioides positivas para HNF3 , CK18 y albúmina fue de un 61,4±4,7% y un 17,3% de las células fueron binucleadas. Cuando se colocaron en placas en FN, también se apreció diferenciación en células 5 Optimal differentiation of CMAMr or CMAMrata was observed in epithelioid cells positive for HNF3�, CK18 and albumin when CMAMs were placed on plates with a concentration of 21.5x103 cells / cm2 in the presence of 10 ng / mL of FCF4 and 20 ng / mL of FCH in Matrigel ™ as shown in Table 7A. After 14 days, the percentage of epithelioid cells positive for HNF3, CK18 and albumin was 61.4 ± 4.7% and 17.3% of the cells were binucleated. When placed on plates in FN, differentiation was also observed in cells

10 epiteloides positivas para HNF3� y CK18, aunque tan solo un 53,1±6,3% de las células se tiñeron y se observó una cantidad aún menor de células binucleadas (10,9%). 10 epiteloids positive for HNF3� and CK18, although only 53.1 ± 6.3% of the cells were stained and an even smaller amount of binucleated cells was observed (10.9%).

El cultivo con FCF4 o FCH dio lugar a células epitelioides positivas para HNF3�, CK18 y albúmina, pero el porcentaje de células positivas para HNF3 , CK18 y albúmina fue mayor cuando se trataron CMAMr o CMAMrata Culture with FCF4 or FCH resulted in epithelioid cells positive for HNF3�, CK18 and albumin, but the percentage of cells positive for HNF3, CK18 and albumin was higher when CMAMr or CMAMrata were treated

15 tanto con FCF4 como con FCH, tal como se muestra en la Tabla 7A. La adición de FCFa, FCFb, FCF7, PMB u OSM no incrementaron el porcentaje de células positivas para los marcadores hepatocíticos, mientras que DMSO al 1% y butirato de sodio 0,1 mM-10 mM no promovieron la diferenciación de CMAMr o CMAMrata en células positivas para los marcadores hepatocíticos. 15 with both FCF4 and FCH, as shown in Table 7A. The addition of FCFa, FCFb, FCF7, PMB or OSM did not increase the percentage of positive cells for hepatocytic markers, while 1% DMSO and 0.1 mM-10 mM sodium butyrate did not promote differentiation of CMAMr or CMAMrata in positive cells for hepatocyte markers.

20 Cuando se evaluaron densidades celulares comprendidas entre 2,5 y 25x103 células/cm2, se detectó el porcentaje más elevado de células con marcadores hepatocíticos en cultivos sembrados con 21.5x103 células/cm2. No se observó diferenciación en hepatocitos cuando las células se colocaron en placas con una concentración <12.5x103 células/cm2. 20 When cell densities between 2.5 and 25x103 cells / cm2 were evaluated, the highest percentage of cells with hepatocytic markers was detected in cultures seeded with 21.5x103 cells / cm2. No differentiation in hepatocytes was observed when the cells were plated with a concentration <12.5x103 cells / cm2.

25 Se colocaron CMAMh en placas con una concentración de 3-30x103 células/cm2 en 10 ng/mL de FN o un 1% de Matrigel™ con FCFa, FCFb, FCF7, 1% de DMSO, FCH y/o FCF4. Únicamente las células tratadas solo con 10 ng/mL de FCF4, solo con 20 ng/mL de FCH o una combinación de ambos se diferenciaron en células epitelioides que expresaban albúmina, CK18 y HNF3 �. Las CMAMh que se colocaron en placas con una concentración de 1530x103 células/cm2 se diferenciaron en células epitelioides mientras que las CMAMh que se colocaron en placas con 25 CMAMh were placed on plates with a concentration of 3-30x103 cells / cm2 in 10 ng / mL of FN or 1% Matrigel ™ with FCFa, FCFb, FCF7, 1% DMSO, FCH and / or FCF4. Only cells treated with only 10 ng / mL of FCF4, only with 20 ng / mL of FCH or a combination of both were differentiated into epithelioid cells expressing albumin, CK18 and HNF3. The CMAMh that were placed in plates with a concentration of 1530x103 cells / cm2 differed in epithelioid cells while the CMAMh that were placed in plates with

30 una concentración de 3x103 células/cm2 murieron. Al igual que las CMAMr o CMAMrata, el porcentaje de células epitelioides positivas para HNF3�, CK18 y albúmina fue mayor cuando las CMAMh se cultivaron en Matrigel™ (91,3% ± 4,4) que en FN (89,5% ± 5,4) y el porcentaje de células binucleadas fue mayor en Matrigel™ (31,3%) que en FN (28,7%) tal como se muestra en la Tabla 7B. 30 a concentration of 3x103 cells / cm2 died. Like CMAMr or CMAMrata, the percentage of epithelioid cells positive for HNF3�, CK18 and albumin was higher when CMAMh were grown in Matrigel ™ (91.3% ± 4.4) than in FN (89.5% ± 5.4) and the percentage of binucleated cells was higher in Matrigel ™ (31.3%) than in FN (28.7%) as shown in Table 7B.

35 Tabla 7: Optimización de la diferenciación de CMAM en células similares a los hepatocitos. 35 Table 7: Optimization of CMAM differentiation in hepatocyte-like cells.

A: de Ratón y Rata B: de Humanos A: Mouse and Rat B: from Humans

FCF-4 FCF-4

FCH FCF4 +FCH FCF-4 FCH FCF-4+FCH FCH FCF4 + FCH  FCF-4 FCH FCF-4 + FCH

FN FN

Albúmina Albumin

++/++ ++/+ ++/++ +++++ +++++ +++++ ++ / ++  ++ / + ++ / ++ +++++ +++++ +++++

CK18 CK18

++/++ ++/+ +++/++ +++++ +++++ +++++ ++ / ++  ++ / + +++ / ++ +++++ +++++ +++++

HNF31 HNF31

+++/+++ +++/+ ++++/+++ +++++ NE +++++ +++ / +++  +++ / + ++++ / +++ +++++ NE +++++

Matrigel™ Matrigel ™

Albúmina Albumin

++/++ +/+ +++/+++ +++++ NE +++++ ++ / ++  + / + +++ / +++ +++++ NE +++++

CK18 CK18

++/++ ++/+ +++/+++ +++++ NE +++++ ++ / ++  ++ / + +++ / +++ +++++ NE +++++

HNF31 HNF31

+++/+++ +++/++ ++++/++++ +++++ NE +++++ +++ / +++  +++ / ++ ++++ / ++++ +++++ NE +++++

Colágeno Collagen

Albúmina Albumin

- - - NE NE NE - - - NE NE NE

CK18 CK18

- - - NE NE NE - - - NE NE NE

HNF31 HNF31

- - - NE NE NE - - - NE NE NE

- = 0% + = 20%, ++ = 30%, ++++ = 40%, ++++ = 60%, +++++ = 80% de las células presentaron una tinción positiva para marcadores específicos y NE = no evaluado. - = 0% + = 20%, ++ = 30%, ++++ = 40%, ++++ = 60%, +++++ = 80% of the cells stained positive for specific markers and NE = not evaluated.

Caracterización fenotípica de la diferenciación de CMAM en células similares a los hepatocitos Phenotypic characterization of CMAM differentiation in hepatocyte-like cells

40 Se evaluó adicionalmente la diferenciación en hepatocitos respecto al tiempo por microscopía confocal y de inmunofluorescencia para los marcadores tempranos (HNF3� , GATA4, CK19, aFP) y tardíos (CK18, albúmina, 40 The differentiation in hepatocytes with respect to time by confocal and immunofluorescence microscopy for early (HNF3�, GATA4, CK19, aFP) and late markers (CK18, albumin,) was further evaluated.

HNF1a) de la diferenciación en hepatocitos. Se colocaron en placas CMAMr o CMAMrata en Matrigel™ con FCF4 y FCH alargados desde un diámetro de 8 μm hasta 15 μm tal como se muestra en la Tabla 8A. En d21-d28, aproximadamente un 60% de las células fueron epitelioides y estuvieron rodeadas por células con forma de huso o redondeadas menores. Las CMAMr o CMAMrata indiferenciadas no expresaron ninguno de los marcadores 5 citoplasmáticos o factores de transcripción hepáticos específicos. Después de 4 días, las células expresaron HNF3� , GATA4 y aFP, niveles bajos de CK19 y muy pocas células presentaron una tinción positiva para HNF1a, albúmina o CK18. A los siete días, las células epitelioides mayores presentaron una tinción positiva para HNF3�, GATA4, HNF1a con una tinción creciente para albúmina y CK18. Únicamente unas pocas células expresaron aFP. Después de 14, 21 y 28 días, las células epitelioides mayores presentaron una tinción positiva para GATA4, HNF3 , HNF1a, HNF1a) of hepatocyte differentiation. They were placed on CMAMr or CMAMrata plates in Matrigel ™ with elongated FCF4 and FCH from a diameter of 8 μm to 15 μm as shown in Table 8A. In d21-d28, approximately 60% of the cells were epithelioids and were surrounded by spindle-shaped or smaller rounded cells. The undifferentiated CMAMr or CMAMrata did not express any of the cytoplasmic markers or specific hepatic transcription factors. After 4 days, the cells expressed HNF3�, GATA4 and aFP, low levels of CK19 and very few cells had a positive staining for HNF1a, albumin or CK18. At seven days, the major epithelioid cells had a positive staining for HNF3�, GATA4, HNF1a with an increasing staining for albumin and CK18. Only a few cells expressed aFP. After 14, 21 and 28 days, the major epithelioid cells showed a positive staining for GATA4, HNF3, HNF1a,

10 CK18 y albúmina, pero no para aFP o CK19. Las células menores que rodeaban los nódulos de células epitelioides presentaron una tinción positiva para CK19 y aFP. 10 CK18 and albumin, but not for aFP or CK19. The minor cells surrounding the nodules of epithelioid cells had a positive staining for CK19 and aFP.

Las CMAMh colocadas en placas en Matrigel™ con FCF4 y FCH o únicamente con FCF4 experimentaron un alargamiento desde 10-12 μm hasta 20-30 μm a día 21.º. Después de 7 días, las células expresaron HNF3 �, GATA4 The CMAMh placed on plates in Matrigel ™ with FCF4 and FCH or only with FCF4 experienced an elongation from 10-12 μm to 20-30 μm on the 21st day. After 7 days, the cells expressed HNF3 �, GATA4

15 y niveles bajos de CK19, mientras que pocas células presentaron una tinción positiva para albúmina o CK18. Después de 14 y 21 días, >90% de las células epitelioides presentaron una tinción positiva para GATA4, HNF3 , HNF1a, HNF4, CK18 y albúmina, mientras que únicamente muy pocas células presentaron una tinción positiva para aFP o CK19 tal como se muestra en la Figura 10B. 15 and low levels of CK19, while few cells had a positive staining for albumin or CK18. After 14 and 21 days,> 90% of epithelioid cells showed a positive staining for GATA4, HNF3, HNF1a, HNF4, CK18 and albumin, while only very few cells had a positive staining for aFP or CK19 as shown in Figure 10B.

20 Tabla 8: Patrón inmunohistoquímico de la expresión de marcadores de hepatocitos 20 Table 8: Immunohistochemical pattern of hepatocyte marker expression

A: de Ratón y Rata B: de Humanos A: Mouse and Rat B: from Humans

D4 D7 D10 D14 D21 D4 D7 D10 D14 D21 D4 D7 D10 D14  D21 D4 D7 D10  D14  D21

HNF31 HNF31

+/+ +/+ +/+ NE + NE + + + / + + / + + / + NE + NE + +

Gata4 Cat4

+/+ +/+ +/+ +/+ +/+ NE + NE + + + / +  + / + + / + + / + + / + NE + NE + +

a-FP a-FP

+/+ +/+ NE/NE -/- -/- NE + NE - - + / + + / + BABY - / - - / - NE + NE - -

HNF1a HNF1a

-/- +/+ NE/NE +/+ +/+ NE - NE + + - / - + / + BABY + / + + / + NE - NE + +

Albúmina Albumin

-/- +/+ +/+ +/+ +/+ NE + NE + + - / - + / + + / + + / + + / + NE + NE + +

CK18 CK18

-/- +/+ +/+ +/+ +/+ NE - NE + + - / - + / + + / + + / + + / + NE - NE + +

+ = se expresa el marcador, - = no se expresa el marcador y NE = no evaluado + = the marker is expressed, - = the marker is not expressed and NE = not evaluated

Las células similares a los hepatocitos se derivan de la misma CMAMh única que se diferencia en neuroectodermo y endodermo Hepatocyte-like cells are derived from the same single CMAMh that differs in neuroectoderm and endoderm.

25 Se ha demostrado que una CMAMr o CMAMrata única se diferencia en endotelio, neuroectodermo y células endodérmicas positivas para albúmina y CK18. También se ha demostrado que una CMAMh única se diferencia en mesodermo y neuroectodermo. Se evaluó la misma CMAMh única para determinar si se podían diferenciar en células similares a los hepatocitos. Se obtuvieron, cultivaron y expandieron CMAM tal como se ha descrito. Para la 25 It has been shown that a single CMAMr or CMAMrata differs in endothelium, neuroectoderm and endodermal cells positive for albumin and CK18. It has also been shown that a single CMAMh differs in mesoderm and neuroectoderm. The same single CMAMh was evaluated to determine if they could differentiate into hepatocyte-like cells. CMAM were obtained, cultured and expanded as described. For the

30 diferenciación, se colocaron en placas CMAMr o CMAMrata con una concentración de 5-25x103 células/cm2 en 0,0110 μg/mL de fibropectina (FN), 0,01-8 μg/mL de colágeno (Sigma Chemical Co., San Luis, MO) o 1% de Matrigel™ (Becton-Dickinson) en medio exento de suero [60% de DMEM bajo en glucosa (DMEM-LG; Gibco-BRL, Grand Island, NY), 40% de MCDB-201 (Sigma), suplementado con insulina/transferrina/selenio 1X, 4,7 pg/mL de ácido linoleico, 1 mg/mL de albúmina sérica bovina (BSA, por sus siglas en inglés), dexametasona 10-8 M, 2-fosfato del 30 differentiation, were placed in CMAMr or CMAMrata plates with a concentration of 5-25x103 cells / cm2 in 0.0110 μg / mL of fibropectin (FN), 0.01-8 μg / mL of collagen (Sigma Chemical Co., San Luis, MO) or 1% Matrigel ™ (Becton-Dickinson) in serum-free medium [60% low DMEM DMEM (DMEM-LG; Gibco-BRL, Grand Island, NY), 40% MCDB-201 ( Sigma), supplemented with 1X insulin / transferrin / selenium, 4.7 pg / mL linoleic acid, 1 mg / mL bovine serum albumin (BSA), 10-8 M dexamethasone, 2-phosphate

35 ácido ascórbico 104 M (todos de Sigma), 100 U/mL de penicilina, 100 U/mL de estreptomicina (Gibco)], con 2% de FCS (Hyclone, Logan Utah) y 10 ng/mL de cada factor de crecimiento epidérmico (FCE) (Sigma), factor inhibidor de la leucemia (FIL; Chemicon, Temecula, CA) y el factor de crecimiento derivado de plaquetas (FCDP-BB; R&D Systems, Mineápolis, MN). Se colocaron en placas las CMAMh con una concentración de 15-30x103 células/cm2 en 0,1 μg/mL de FN o 1% de Matrigel™ en el mismo medio sin FIL (Reyes M., 2002). Después de 8-12 h, se eliminó el 35 ascorbic acid 104 M (all from Sigma), 100 U / mL penicillin, 100 U / mL streptomycin (Gibco)], with 2% FCS (Hyclone, Logan Utah) and 10 ng / mL of each growth factor epidermal (FCE) (Sigma), leukemia inhibitor factor (FIL; Chemicon, Temecula, CA) and platelet-derived growth factor (FCDP-BB; R&D Systems, Minneapolis, MN). The CMAMh were plated with a concentration of 15-30x103 cells / cm2 in 0.1 μg / mL of FN or 1% Matrigel ™ in the same medium without FIL (Reyes M., 2002). After 8-12 h, the

40 medio, se lavaron las células dos veces con solución salina tamponada con fosfatos (PBS) (Fischer) y se cultivaron en medio exento de suero suplementado con 5-50 ng/mL de FCH, FCFa, FCFb, FCF4, FCF7 u OSM; o 10 mg/mL de sulfóxido de dimetilo (DMSO) o butirato de sodio 0,1-1 mM. On medium, the cells were washed twice with phosphate buffered saline (PBS) (Fischer) and grown in serum-free medium supplemented with 5-50 ng / mL of FCH, FCFa, FCFb, FCF4, FCF7 or OSM; or 10 mg / mL dimethyl sulfoxide (DMSO) or 0.1-1 mM sodium butyrate.

La transducción de CMAMh con eGFP se llevó a cabo utilizando un retrovirus que contenía un eGFP-ADNc y se The transduction of CMAMh with eGFP was carried out using a retrovirus that contained an eGFP-cDNA and was

45 expandió hasta >5x106 células. Se indujo la diferenciación en músculo, endotelio, neuroectodermo y endodermo de un veinte por ciento. En el caso del clon A16, las CMAM indiferenciadas presentaron un único sitio de inserción retroviral al igual que las células diferenciadas neuroectodérmicas y mesodérmicas y las CMAM eGFP+ del clon A16 se diferenciaron en células positivas para albúmina y CK18. Las CMAM tratadas con FCF-4 generadas a partir de la misma población celular presentaron el mismo sitio de inserción (5'-TAG 45 expanded to> 5x106 cells. Twenty percent differentiation in muscle, endothelium, neuroectoderm and endoderm was induced. In the case of clone A16, undifferentiated CMAMs presented a single retroviral insertion site as well as differentiated neuroectodermal and mesodermal cells and the eGFP + CMAMs of clone A16 differentiated into albumin and CK18 positive cells. CMAM treated with FCF-4 generated from the same cell population had the same insertion site (5'-TAG

50 CGGCCGCTTGAATTCGAACGCGAGACTACTGTGACT CACACT-3', cromosoma 7) lo que prueba que una única CMAMh se diferencia en endodermo además de mesodermo y neuroectodermo. 50 CGGCCGCTTGAATTCGAACGCGAGACTACTGTGACT CACACT-3 ', chromosome 7) which proves that a single CMAMh differs in endoderm in addition to mesoderm and neuroectoderm.

La RT-PCR cuantitativa demuestra que FCF4 y FCH inducen la diferenciación y especialización en hepatocitos Quantitative RT-PCR demonstrates that FCF4 and FCH induce differentiation and specialization in hepatocytes

Se confirmó por RT-PCR cuantitativa la diferenciación en hepatocitos en función de los marcadores tempranos The differentiation in hepatocytes was confirmed by quantitative RT-PCR based on the early markers

5 (HNF3�, GATA4, CK19, aFP) y tardíos (CK18, albúmina, HNF1a, citocromo P450) de la diferenciación en hepatocitos. Se extrajo el ARN a partir de 3x105 CMAM o CMAM inducidas a diferenciarse en hepatocitos. Se transcribió de manera inversa el ARNm y se amplificó el ADNc tal como sigue: 40 ciclos de una PCR de dos pasos (95 ºC durante 15’’, 60 ºC durante 60’’) después de la desnaturalización inicial (95 ºC durante 10’) con 2 μL de una solución de ADN, tampón de reacción de PCR Taqman SYBR Green Universal Mix 1X utilizando un ABI PRISM 5 (HNF3�, GATA4, CK19, aFP) and late (CK18, albumin, HNF1a, cytochrome P450) of hepatocyte differentiation. RNA was extracted from 3x105 CMAM or CMAM induced to differentiate into hepatocytes. The mRNA was reverse transcribed and the cDNA was amplified as follows: 40 cycles of a two-step PCR (95 ° C for 15 '', 60 ° C for 60 '') after initial denaturation (95 ° C for 10 ' ) with 2 μL of a DNA solution, PCR reaction buffer Taqman SYBR Green Universal Mix 1X using an ABI PRISM

10 7700 (Perkin Elmer/Applied Biosystems). Los cebadores utilizados para la amplificación se enumeran en la Tabla 9. 10 7700 (Perkin Elmer / Applied Biosystems). The primers used for amplification are listed in Table 9.

Tabla 9: Cebadores utilizados Table 9: Primers used

Nombre del cebadorPrimer Name

Cebadores  Primers

RATÓN MOUSE

HNF1a HNF1a

S: 5'-TTCTAAGCTGAGCCAGCTGCAGACG-3' S: 5'-TTCTAAGCTGAGCCAGCTGCAGACG-3 '

A: 5'-GCTGAGGTTCTCCGGCTCTTFCAGA-3'  A: 5'-GCTGAGGTTCTCCGGCTCTTFCAGA-3 '

HNF3�HNF3�

S: 5'-CCAACATAGGATCAGATG-3'  S: 5'-CCAACATAGGATCAGATG-3 '

A: 5'-ACTGGAGCAGCTACTACG-3'  A: 5'-ACTGGAGCAGCTACTACG-3 '

GATA4 CAT4

S: 5'-AGGCATTACATACAGGCTCACC-3' S: 5'-AGGCATTACATACAGGCTCACC-3 '

A: 5'-CrGTGGCCTCTATCACAAGATG-3'  A: 5'-CrGTGGCCTCTATCACAAGATG-3 '

CK18CK18

S: 5'-TGGTACTCTCCTCAATCTGCTG-3'  S: 5'-TGGTACTCTCCTCAATCTGCTG-3 '

A: 5'-CTCTGGATTGACTGTGGAAGTG-3'  A: 5'-CTCTGGATTGACTGTGGAAGTG-3 '

CK19 CK19

S: 5'- CATGGTTCTTCTTCAGGTAGGC-3' S: 5'- CATGGTTCTTCTTCAGGTAGGC-3 '

A: 5'- GCTGCAGATGACTTCAGAACC -3' A: 5'- GCTGCAGATGACTTCAGAACC -3 '

Albúmina Albumin

S: 5'-TCAACTGTCAGAGCAGAGAAGC-3' S: 5'-TCAACTGTCAGAGCAGAGAAGC-3 '

A: 5'-AGACTGCCTTGTGTGGAAGACT-3'  A: 5'-AGACTGCCTTGTGTGGAAGACT-3 '

aFPaFP

S: 5'-GTGAAACAGACTTCCTGGTCCT-3'  S: 5'-GTGAAACAGACTTCCTGGTCCT-3 '

A: 5'-GCCCTACAGACCATGAAACAAG-3'  A: 5'-GCCCTACAGACCATGAAACAAG-3 '

TTR TTR

S: 5'-TCTCTCAATTCTGGGGGTTG-3' S: 5'-TCTCTCAATTCTGGGGGTTG-3 '

A: 5'-TTTCACAGCCAACGACTCTG-3'  A: 5'-TTTCACAGCCAACGACTCTG-3 '

Cyp2b9Cyp2b9

S: 5'-GATGATGTTGGCTGTGATGC-3'  S: 5'-GATGATGTTGGCTGTGATGC-3 '

A: 5'-CTGGCCACCATGAAAGAGTT-3'  A: 5'-CTGGCCACCATGAAAGAGTT-3 '

Cyp2b13Cyp2b13

S. 5'-CTGCATCAGTGTATGGCATITT-3' A: 5'-TTTGCTGGAACTGAGACTACCA-3'  S. 5'-CTGCATCAGTGTATGGCATITT-3 'A: 5'-TTTGCTGGAACTGAGACTACCA-3'

HUMANO HUMAN

aFPaFP

S: 5'-TGCAGCCAAAGTGAAGAGGGAAGA-3'  S: 5'-TGCAGCCAAAGTGAAGAGGGAAGA-3 '

A: 5'-CATAGCGAGCAGCCCAAAGAAGAA-3'  A: 5'-CATAGCGAGCAGCCCAAAGAAGAA-3 '

Albúmina Albumin

S: 5'- TGC TTG AATGTGCTGATGACAGGG -3' S: 5'- TGC TTG AATGTGCTGATGACAGGG -3 '

A: 5'-AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC-3'  A: 5'-AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC-3 '

CK19 CK19

S: 5'-ATGGCCGAGCAGAACCGGAA-3' S: 5'-ATGGCCGAGCAGAACCGGAA-3 '

A: 5'-CCATGAGCCGCTGGTACTCC-3'  A: 5'-CCATGAGCCGCTGGTACTCC-3 '

CK18CK18

S: 5'-TGGTACTCTCCTCAATCTGCTG-3'  S: 5'-TGGTACTCTCCTCAATCTGCTG-3 '

A: 5'-CTCTGGATTGACTGTGGAAGT-3'  A: 5'-CTCTGGATTGACTGTGGAAGT-3 '

CYP1B1 CYP1B1

S: 5'-GAGAACGTACCGGCCACTATCACT-3' S: 5'-GAGAACGTACCGGCCACTATCACT-3 '

A: 5'-GTTAGGCCACTTCAGTGGGTCATGAT-3'  A: 5'-GTTAGGCCACTTCAGTGGGTCATGAT-3 '

CYP2B6 CYP2B6

S: 5'-GATCACACCATATCCCCGGA-3' S: 5'-GATCACACCATATCCCCGGA-3 '

Nombre del cebadorPrimer Name

Cebadores  Primers

RATÓNMOUSE

A: 5'-CACCCTACCACCCATGACCG-3'  A: 5'-CACCCTACCACCCATGACCG-3 '

RATA RAT

HNF1a HNF1a

S: 5'-AGCTGCTCCTCCATCATCAGA-3' S: 5'-AGCTGCTCCTCCATCATCAGA-3 '

A: 5'-TGTTCCAAGCATTAAGTTTTCTATTCTAA3'  A: 5'-TGTTCCAAGCATTAAGTTTTCTATTCTAA3 '

HNF3�HNF3�

S: 5'-CCTACTCGTACATCTCGCTCATCA-3'  S: 5'-CCTACTCGTACATCTCGCTCATCA-3 '

A: 5'-CGCTCAGCGTCAGCATCTT-3'  A: 5'-CGCTCAGCGTCAGCATCTT-3 '

CK18 CK18

S: 5'-GCCCTGGACTCCAGCAACT-3' S: 5'-GCCCTGGACTCCAGCAACT-3 '

A: 5'-ACTTTGCCATCCACGACCTT-3'  A: 5'-ACTTTGCCATCCACGACCTT-3 '

CK19 CK19

S. 5'-ACCATGCAGAACCTGAACGAT-3' S. 5'-ACCATGCAGAACCTGAACGAT-3 '

A: 5'-CACCTCCAGCTCGCCATTAG-3'  A: 5'-CACCTCCAGCTCGCCATTAG-3 '

Albúmina Albumin

S: 5'-CTGGGAGTGTGCAGATATCAGAGT-3' S: 5'-CTGGGAGTGTGCAGATATCAGAGT-3 '

A: 5'-GAGAAGGTCACCAAGTGCTGTAGT-3'  A: 5'-GAGAAGGTCACCAAGTGCTGTAGT-3 '

aFPaFP

S: 5'-GTCCTTTCTTCCTCCTGGAGAT-3'  S: 5'-GTCCTTTCTTCCTCCTGGAGAT-3 '

A. 5'-CTGTCACTGCTGATTTCTCTGG-3'  A. 5'-CTGTCACTGCTGATTTCTCTGG-3 '

TTRTTR

S: 5'-CAGCAGTGGTGCTGTAGGAGTA-3'  S: 5'-CAGCAGTGGTGCTGTAGGAGTA-3 '

A: 5'-GGGTAGAACTGGACACCAAATC-3'  A: 5'-GGGTAGAACTGGACACCAAATC-3 '

Cyp2b1Cyp2b1

S: 5'-GAGTTCTTCTCTGGGTTCCTG-3'  S: 5'-GAGTTCTTCTCTGGGTTCCTG-3 '

A: 5'- ACTGTGGGTCATGGAGAGCTG -3' A: 5'- ACTGTGGGTCATGGAGAGCTG -3 '

Se normalizaron los niveles de ARNm utilizando actina � (de ratón o de humanos) o 18S (de rata) como genes constitutivos y se compararon con los niveles de ARNm en hepatocitos recién aislados de rata o de ratón, 5 hepatocitos de rata cultivados durante 7 días o ARNm de ARN de hígado adulto humano adquirido de Clontech, Palo Alto, California. MRNA levels were normalized using actin � (mouse or human) or 18S (rat) as constitutive genes and compared to mRNA levels in newly isolated rat or mouse hepatocytes, 5 rat hepatocytes cultured for 7 days or mRNA of human adult liver RNA acquired from Clontech, Palo Alto, California.

En d0, las CMAMr y CMAMrata expresaron niveles bajos de ARNm de GATA4, albúmina, aFP, CK18, CK19, TTR, HNF3� y HNF1a pero no ARNm de CYP2B1 (rata) ni CYP2B9 y CYP2B13 (ratón) (Fig. 10). Tras el tratamiento de 10 las CMAMr o CMAMrata con FCF4 y FCH, se incrementó la expresión del ARNm de GATA4 y HNF3� en d2, se hizo máxima no más tarde de d4 y disminuyó ligeramente y se estabilizó no más tarde de d14. El ARNm de aFP y CK19 se incrementó después de d2, se hizo máximo no más tarde de d4 y disminuyó posteriormente. El ARNm de TTR se incrementó tras d4, se hizo máximo no más tarde de d7 y se estabilizó. El ARNm del enzima P450, CK18, albúmina y HNF1a se incrementó después de d7 y se hizo máxima en d14. Entre d14 y d21, las CMAM inducidas con FCF4 y In d0, CMAMr and CMAMrata expressed low levels of GATA4 mRNA, albumin, aFP, CK18, CK19, TTR, HNF3� and HNF1a but not mRNA of CYP2B1 (rat) or CYP2B9 and CYP2B13 (mouse) (Fig. 10). After the treatment of the CMAMr or CMAMrata with FCF4 and FCH, the expression of the GATA4 and HNF3� mRNA was increased in d2, became maximum no later than d4 and decreased slightly and stabilized no later than d14. The mRNA of aFP and CK19 was increased after d2, was maximized no later than d4 and subsequently decreased. TTR mRNA was increased after d4, maximized no later than d7 and stabilized. The mRNA of the enzyme P450, CK18, albumin and HNF1a was increased after d7 and maximized at d14. Between d14 and d21, CMAM induced with FCF4 and

15 FCH expresaron ARNm de albúmina, TTR, CK18, CYP2B9 y CYP2B13 (ratón) y CYP2B1 (rata). 15 FCH expressed albumin mRNA, TTR, CK18, CYP2B9 and CYP2B13 (mouse) and CYP2B1 (rat).

Las CMAMh indiferenciadas expresaron niveles bajos de ARNm de albúmina, CK18 y CK19, CYP1B1 pero no de aFP (Fig.10) ni CYP2B6. Los niveles de ARNm de albúmina, CK18, CK19, CYP1B1 se incrementaron significativamente en CMAMh cultivadas únicamente con FCF4 o con FCF4 y FCH durante 14 días en comparación 20 con cultivos (de CMAM) del día 0. Los niveles de ARNm de albúmina, CK18 y CYP1B1 continuaron incrementándose y fueron mayores en d28. Aunque CYP1B1 no es un marcador de hepatocitos específico, su aumento regulado sugiere el compromiso con hepatocitos y su maduración. Se pudieron apreciar niveles bajos de CYP2B6, entre un 0.5% y un 1,0% del ARNm de hígado fresco en d14 y d21 pero no en d0. Los niveles de ARNm de marcadores de hepatocitos inmaduros (CK19 y aFP) disminuyeron según avanzaba la diferenciación y fueron Undifferentiated CMAMh expressed low levels of albumin mRNA, CK18 and CK19, CYP1B1 but not aFP (Fig. 10) or CYP2B6. The levels of albumin mRNA, CK18, CK19, CYP1B1 were significantly increased in CMAMh cultured only with FCF4 or with FCF4 and FCH for 14 days compared to 20 with cultures (of CMAM) on day 0. Albumin mRNA levels, CK18 and CYP1B1 continued to increase and were higher in d28. Although CYP1B1 is not a specific hepatocyte marker, its regulated increase suggests commitment to hepatocytes and their maturation. Low levels of CYP2B6 were observed, between 0.5% and 1.0% of fresh liver mRNA in d14 and d21 but not in d0. The mRNA levels of immature hepatocyte markers (CK19 and aFP) decreased as differentiation progressed and were

25 mayores en cultivos inducidos únicamente con FCF4, mientras que los niveles de ARNm de hepatocitos maduros (CK18 y albúmina) fueron mayores en CMAM inducidas con FCF4 y FCH. 25 higher in cultures induced only with FCF4, while the levels of mature hepatocyte mRNA (CK18 and albumin) were higher in CMAM induced with FCF4 and FCH.

La inmunoelectrotransferencia demuestra que FCF4+FCH induce la diferenciación y especialización en hepatocitos Immunoelectrotransfer demonstrates that FCF4 + FCH induces differentiation and specialization in hepatocytes

30 También se confirmó la expresión de genes específicos de los hepatocitos por inmunoelectrotransferencia y se llevó a cabo tal como lo describen Reyes et al. (2000). Los Abs contra aFP, albúmina humana y CK18 se diluyeron en una proporción 1:1000 en tampón de bloqueo. El anticuerpo de cabra anti-actina (1:1000) provino de Santa Cruz. Los Abs secundarios fueron anticuerpos de cabra anti-ratón conjugados con HRP y de mono anti-cabra conjugados con HRP (Amersham, Arlington Heights). Se llevó a cabo la ECL de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Amersham). Las CMAMh indiferenciadas no expresaron proteína aFP, albúmina o CK18 (Fig. 10B). Después de 35 días de tratamiento únicamente con FCF4 o con FCF4 y FCH, las CMAMh expresaron albúmina y CK18, pero no aFP, lo que es consistente con los análisis histoquímicos. 30 The expression of hepatocyte-specific genes was also confirmed by immunoelectrotransfer and carried out as described by Reyes et al. (2000). Abs against aFP, human albumin and CK18 were diluted in a 1: 1000 ratio in blocking buffer. The goat anti-actin antibody (1: 1000) came from Santa Cruz. The secondary Abs were goat anti-mouse antibodies conjugated with HRP and monkey goat anti-goat conjugated with HRP (Amersham, Arlington Heights). The ECL was carried out according to the manufacturer's instructions (Amersham). Undifferentiated CMAMh did not express aFP protein, albumin or CK18 (Fig. 10B). After 35 days of treatment with only FCF4 or FCF4 and FCH, the CMAMh expressed albumin and CK18, but not aFP, which is consistent with histochemical analyzes.

5 Las CMAMh, CMAMr y CMAMrata adquieren actividad funcional de hepatocitos 5 CMAMh, CMAMr and CMAMrata acquire functional hepatocyte activity

Se emplearon cinco ensayos diferentes para determinar si las células con características fenotípicas y morfológicas de hepatocitos también poseían atributos de hepatocitos funcionales. Five different assays were used to determine whether cells with phenotypic and morphological characteristics of hepatocytes also possessed functional hepatocyte attributes.

Se cuantificó la producción y secreción de urea por parte de células similares a los hepatocitos en varios momentos de la diferenciación. Se determinaron las concentraciones de urea por medio de un ensayo colorimétrico (Sigma Cat. 640-1) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se cultivaron hepatocitos de rata en una monocapa y se utilizaron brotes de hígado fetal de ratón como controles positivos y medio de cultivo como control negativo. El ensayo puede The production and secretion of urea by hepatocyte-like cells was quantified at various times of differentiation. Urea concentrations were determined by means of a colorimetric assay (Sigma Cat. 640-1) following the manufacturer's instructions. Rat hepatocytes were cultured in a monolayer and mouse fetal liver sprouts were used as positive controls and culture medium as a negative control. The essay can

15 detectar concentraciones de urea de tan solo 10 mg/mL. Ya que el ensayo también cuantifica amoníaco, se evaluaron las muestras antes y después de la adición de ureasa. 15 detect urea concentrations of only 10 mg / mL. Since the test also quantifies ammonia, samples were evaluated before and after urease addition.

No se detectó ni urea ni amoníaco en el medio de cultivo solo. Las CMAM indiferenciadas no produjeron urea. Tras el tratamiento con FCF4 y FCH, la producción de urea por parte de las CMAM se incrementó en una manera dependiente del tiempo. La evolución temporal de la producción de urea en cultivos de rata y ratón fue similar. En el caso de las CMAMh tratadas con FCF4 y FCH, no se detectó urea en d4, se observó que era similar a los cultivos de rata y ratón en d12 y excedió la de los cultivos de rata o ratón en d21. Los niveles de urea producidos por hepatocitos derivados de CMAM fueron similares a los de los cultivos en monocapa de hepatocitos de rata primarios. En las tres especies, se produjo una cantidad de urea significativamente mayor por parte de las células No urea or ammonia was detected in the culture medium alone. Undifferentiated CMAMs did not produce urea. Following treatment with FCF4 and FCH, urea production by CMAMs increased in a time-dependent manner. The temporal evolution of urea production in rat and mouse cultures was similar. In the case of CMAMh treated with FCF4 and FCH, no urea was detected in d4, it was observed that it was similar to rat and mouse cultures in d12 and it exceeded that of rat or mouse cultures in d21. Urea levels produced by CMAM-derived hepatocytes were similar to those in monolayer cultures of primary rat hepatocytes. In all three species, a significantly larger amount of urea was produced by the cells

25 diferenciadas en Matrigel™ en comparación con FN. 25 differentiated in Matrigel ™ compared to FN.

Se cuantificó la producción de albúmina en varios momentos a lo largo de la diferenciación. Se determinaron las concentraciones de albúmina de rata mediante un ensayo de inmunoadsorción enzimática competitivo (ELISA) descrito previamente (Tzanakakis E.S. et al., 2001; Wells J.M. et al., 2000). Se determinaron las concentraciones de albúmina de ratón y humana utilizando un método similar al ELISA sustituyendo la albúmina de ratón o humana y los Abs anti-albúmina de ratón o humana por los componentes de rata según fuera necesario. La albúmina humana de referencia y la anti-albúmina humana conjugada con peroxidasa provinieron de Cappel. La albúmina de ratón de referencia y la anti-albúmina de ratón purificada por afinidad y conjugada con peroxidasa provinieron de Bethyl Laboratories (Montgomery, Texas). Para garantizar la especificidad del ELISA, los Abs de rata, ratón y humanos se Albumin production was quantified at various times throughout the differentiation. Rat albumin concentrations were determined by a competitive enzyme immunoadsorption assay (ELISA) described previously (Tzanakakis E.S. et al., 2001; Wells J.M. et al., 2000). The concentrations of mouse and human albumin were determined using a method similar to ELISA by replacing the mouse or human albumin and the mouse or human anti-albumin abs with the rat components as necessary. Reference human albumin and peroxidase-conjugated human anti-albumin came from Cappel. Reference mouse albumin and affinity purified and peroxidase-conjugated mouse anti-albumin came from Bethyl Laboratories (Montgomery, Texas). To ensure the specificity of ELISA, rat, mouse and human Abs are

35 incubaron durante 2 h a 37 ºC con BSA al 3% en agua destilada (dH2O). La sensibilidad del ELISA es de al menos 1 ng/mL. 35 incubated for 2 h at 37 ° C with 3% BSA in distilled water (dH2O). The sensitivity of ELISA is at least 1 ng / mL.

Las CMAM indiferenciadas no secretaron albúmina. Tras el tratamiento con FCF4 y FCH, las CMAMh, CMAMr y CMAMrata produjeron albúmina de manera dependiente del tiempo. Como se había observado para la producción de urea, las CMAM diferenciadas en Matrigel™ produjeron cantidades mayores de albúmina que las cultivadas en FN. Las células humanas, de rata y ratón secretaron niveles similares de albúmina, a pesar de que no se detectó albúmina en los cultivos humanos en d3. Los niveles de albúmina producidos por hepatocitos derivados de CMAM de ratón, de rata y humanas fueron similares a aquellos observados en los cultivos en monocapa de hepatocitos de rata primarios. Undifferentiated CMAMs did not secrete albumin. After treatment with FCF4 and FCH, CMAMh, CMAMr and CMAMrata produced albumin in a time-dependent manner. As observed for urea production, differentiated CMAMs in Matrigel ™ produced larger amounts of albumin than those grown in FN. Human, rat and mouse cells secreted similar levels of albumin, although no albumin was detected in human cultures in d3. The albumin levels produced by hepatocytes derived from mouse, rat and human CMAM were similar to those observed in monolayer cultures of primary rat hepatocytes.

45 A continuación se evaluó la actividad del citocromo P450 en agregados de hepatocitos derivados de CMAM y esferoides de hepatocitos hepáticos primarios de rata utilizando el ensayo PROD. Se formaron agregados de hepatocitos y CMAMr colocando en placas en d14 CMAM tratadas con FCF4 y FCH con una concentración de 5x104 células/cm2, en placas de cultivo no tisular, las cuales se situaron en un agitador a 10 revoluciones por minuto durante 5 h. Se transfirieron los agregados celulares a placas Primaria™ y se permitió que se compactaran durante 4 días en presencia o ausencia de fenobarbital 1 mM. Los agregados de hepatocitos y CMAMh se formaron mediante el método de la gota colgante. Resumiendo, se colocaron 103 CMAMh tratadas durante 24 días con FCF4 y FCH en gotas de 100 μL con o sin fenobarbital 1 mM. Tras 4 días, se recogieron los agregados y se evaluó la actividad del citocromo P450 mediante el ensayo PROD. El citocromo P450 O-desalquila la pentoxirresorufina 45 Next, the activity of cytochrome P450 in aggregates of hepatocytes derived from CMAM and spheroids of primary hepatic hepatocytes from rat was evaluated using the PROD assay. Hepatocyte and CMAMr aggregates were formed by placing in plates in d14 CMAM treated with FCF4 and FCH with a concentration of 5x104 cells / cm2, in non-tissue culture plates, which were placed on a shaker at 10 revolutions per minute for 5 h. Cellular aggregates were transferred to Primary ™ plates and allowed to be compacted for 4 days in the presence or absence of 1 mM phenobarbital. Hepatocyte and CMAMh aggregates were formed by the hanging drop method. In summary, 103 CMAMh treated for 24 days with FCF4 and FCH were placed in 100 μL drops with or without 1 mM phenobarbital. After 4 days, the aggregates were collected and cytochrome P450 activity was evaluated by the PROD assay. Cytochrome P450 O-disallows pentoxirresorufina

55 (PROD) (Molecular Probes, Eugene, Oregón) y transforma un compuesto no fluorescente en un compuesto fluorescente, la resorufina (Tzanakakis E.S. et al., 2001). Por consiguiente, la intensidad de la fluorescencia causada por el metabolismo de PROD estima la actividad del citocromo P450 (CYP). Se llevó a cabo la evaluación y detección de la resorufina in situ utilizando microscopía confocal tal como está descrito (Tzanakakis E.S. et al., 2001). 55 (PROD) (Molecular Probes, Eugene, Oregon) and transforms a non-fluorescent compound into a fluorescent compound, resorufin (Tzanakakis E.S. et al., 2001). Therefore, the intensity of fluorescence caused by the metabolism of PROD estimates the activity of cytochrome P450 (CYP). Resorufin evaluation and detection was carried out in situ using confocal microscopy as described (Tzanakakis E.S. et al., 2001).

No se apreció actividad PROD en los agregados de CMAMr o CMAMh indiferenciadas. Sin embargo, las CMAMr (18 días con FCF4 y FCH) y CMAMh (28 días, FCF4 solo) inducidas a formar agregados presentaron una actividad PROD significativa. La actividad PROD en agregados de hepatocitos derivados de CMAM fue similar a la de los agregados de hepatocitos primarios de rata. Varias células diferentes poseen actividad P450, pero el aumento No PROD activity was observed in undifferentiated CMAMr or CMAMh aggregates. However, CMAMr (18 days with FCF4 and FCH) and CMAMh (28 days, FCF4 alone) induced to form aggregates showed significant PROD activity. The PROD activity in CMAM-derived hepatocyte aggregates was similar to that of rat primary hepatocyte aggregates. Several different cells possess P450 activity, but the increase

65 regulado de la actividad de P450 por parte del fenobarbital solo se aprecia en los hepatocitos. Por tanto, también se evaluó P450 en presencia o ausencia de fenobarbital. Sin fenobarbital, varios enzimas P450 participan parcialmente en el metabolismo de PROD, lo que da lugar a un valor de fluorescencia mayor para esas muestras. Por el contrario, en los agregados inducidos por fenobarbital, la actividad de PROD es metabolizada prácticamente en su totalidad por los citocromos de ratón Cyp2b9, Cyp2b10 y Cyp2b13, el citocromo de rata Cyp2b1/2 (Tzanakakis E.S. et al., 2001) y por CYP2B6 en humanos. Por tanto, la actividad fluorescente aumentada es menor que el aumento real en 65 P450 activity regulated by phenobarbital can only be seen in hepatocytes. Therefore, P450 was also evaluated in the presence or absence of phenobarbital. Without phenobarbital, several P450 enzymes partially participate in the metabolism of PROD, which results in a higher fluorescence value for those samples. In contrast, in phenobarbital-induced aggregates, PROD activity is practically completely metabolized by mouse cytochromes Cyp2b9, Cyp2b10 and Cyp2b13, rat cytochrome Cyp2b1 / 2 (Tzanakakis ES et al., 2001) and by CYP2B6 in humans. Therefore, the increased fluorescent activity is less than the actual increase in

5 la expresión proteica de dichos enzimas del citocromo P450. Cuando se cultivaron los agregados durante 96 horas con fenobarbital, se observó un aumento en la actividad PROD comprendida entre un 32% y un 39%, lo que sugiere la presencia de los Cyp2b13, Cyp2b10 y Cyp2b9 específicos de hepatocitos funcionales en CMAMr y de CYP2B6 en hepatocitos derivados de CMAMh. 5 the protein expression of said cytochrome P450 enzymes. When the aggregates were cultured for 96 hours with phenobarbital, an increase in PROD activity between 32% and 39% was observed, suggesting the presence of the specific hepatocyte Cyp2b13, Cyp2b10 and Cyp2b9 in CMAMr and CYP2B6 in hepatocytes derived from CMAMh.

También se evaluó la capacidad de los hepatocitos derivados de CMAM de incorporar LDL incubando CMAMh tratadas con FCF4 con dil-acil-LDL. Las células se marcaron de manera conjunta con Abs anti-CK18 o anti-Pan-CK y HNF-3� o GATA4. Después de 7 días, se detectó un nivel bajo de incorporación de a-LDL, el cual se incrementó hasta llegar a su punto máximo en d21. The ability of CMAM-derived hepatocytes to incorporate LDL by incubating CMAMh treated with FCF4 with dil-acyl-LDL was also evaluated. The cells were labeled together with anti-CK18 or anti-Pan-CK Abs and HNF-3� or GATA4. After 7 days, a low level of incorporation of a-LDL was detected, which was increased to its peak in d21.

15 Otra función metabólica de los hepatocitos es la producción de glucógeno o la gluconeogénesis. Se analizaron los niveles de almacenamiento de glucógeno mediante la tinción con ácido peryódico de Schiff (PAS, por sus siglas en inglés) de CMAM de ratón inducidas con FCF4 y FCH y CMAMh inducidas con FCF en d3, d7, d14 y d21. Para llevar a cabo la PAS, se oxidaron las preparaciones con ácido peryódico al 1% durante 5’ y se lavaron 3 veces con dH2O. A continuación se trataron las preparaciones con el reactivo de Schiff durante 15’, se lavaron con dH2O durante 510’, se tiñeron con hematoxilina de Mayer durante 1’ y se lavaron con dH2O. Se detectó almacenamiento de glucógeno por primera vez en d14 y se detectaron los niveles máximos tras d21 (Fig. 11). 15 Another metabolic function of hepatocytes is glycogen production or gluconeogenesis. Glycogen storage levels were analyzed by staining with Schiff's periodic acid (PAS) of mouse CMAM induced with FCF4 and FCH and CMAMh induced with FCF on d3, d7, d14 and d21. To carry out the PAS, the preparations were oxidized with 1% periodic acid for 5 'and washed 3 times with dH2O. The preparations were then treated with Schiff's reagent for 15 ', washed with dH2O for 510', stained with Mayer's hematoxylin for 1 'and washed with dH2O. Glycogen storage was detected for the first time in d14 and maximum levels were detected after d21 (Fig. 11).

Aislamiento y cultivo de hepatocitos Isolation and culture of hepatocytes

25 Se recolectaron hepatocitos de ratas Sprague-Dawley macho de 4-6 semanas tal como está descrito (Seglen P.O., 1976). La viabilidad de los hepatocitos tras la recolección estuvo comprendida entre un 90-95%. Se cultivaron los hepatocitos tal como está descrito (Tzanakakis E.S. et al., 2001; Tzanakakis E.S. et al.., 2001). Para formar una monocapa, se cultivaron los hepatocitos en placas con cultivo de Fisher 35 mM (Fischer Scientific, Pittsburgh, PA) recubiertas con 8 μg/cm2 de colágeno (Cohesion Technologies, Palo Alto, CA). Para formar esferoides, se cultivaron los hepatocitos en placas Primaria™ de 35 mm (Becton Dickinson). En ambas condiciones, la densidad de sembrado fue de 5x104 células/cm2. 12 h después de la colocación inicial en placas, se renovó el medio para eliminar células muertas y no adheridas. Posteriormente, se renovó el medio cada 48 horas. 25 4-6 week male Sprague-Dawley rat hepatocytes were collected as described (Seglen P.O., 1976). The viability of hepatocytes after collection was between 90-95%. Hepatocytes were cultured as described (Tzanakakis E.S. et al., 2001; Tzanakakis E.S. et al., 2001). To form a monolayer, hepatocytes were cultured in plates with 35 mM Fisher culture (Fischer Scientific, Pittsburgh, PA) coated with 8 μg / cm 2 of collagen (Cohesion Technologies, Palo Alto, CA). To form spheroids, hepatocytes were cultured in 35 mm Primary ™ plates (Becton Dickinson). Under both conditions, the seeding density was 5x104 cells / cm2. 12 h after initial plating, the medium was renewed to remove dead and non-adherent cells. Subsequently, the medium was renewed every 48 hours.

Resumen Summary

35 Se ha demostrado que una única CMAM derivada de MO de ratón, rata o humano ya nacido se puede diferenciar in vitro en un tipo celular endodérmico con función y fenotipo de hepatocitos. Las CMAM, cultivadas en condiciones de diferenciación de hepatocitos, expresaron marcadores hepatocíticos primitivos y maduros en una manera dependiente del tiempo, tal como se observó mediante la microscopía de inmunofluorescencia de células marcadas de manera doble y triple. El perfil de expresión proteico fue específico de los hepatocitos y no espurio, ya que los marcadores no hepatocíticos no se expresan de manera conjunta con los antígenos hepatocíticos. Se confirmaron los resultados de la inmunohistoquímica mediante inmunoelectrotransferencia. Además, la RT-PCR corroboró el aumento regulado de los factores de transcripción HNF3� y GATA4 de importancia conocida en la especialización en endodermo y los factores de transcripción requeridos para la diferenciación posterior en hepatocitos, tales como 35 It has been shown that a single CMAM derived from mouse, rat or human MO already born can be differentiated in vitro into an endodermal cell type with hepatocyte function and phenotype. The CMAMs, grown under hepatocyte differentiation conditions, expressed primitive and mature hepatocytic markers in a time-dependent manner, as observed by immunofluorescence microscopy of double and triple labeled cells. The protein expression profile was specific to hepatocytes and not spurious, since non-hepatocyte markers are not expressed in conjunction with hepatocyte antigens. The results of immunohistochemistry were confirmed by immunoelectrotransference. In addition, RT-PCR confirmed the regulated increase in HNF3� and GATA4 transcription factors of known importance in endoderm specialization and the transcription factors required for subsequent differentiation into hepatocytes, such as

45 HNF3�, y proteínas citoplasmáticas tales como CK19, CK18, aFP y albúmina. HNF3�, and cytoplasmic proteins such as CK19, CK18, aFP and albumin.

Aunque se ha demostrado que FCF4 solo o FCF4 y FCH inducen el paso de CMAM a células con características fenotípicas y morfológicas de los hepatocitos, esto solo no prueba que las células se hayan diferenciado en hepatocitos a menos que se pueda demostrar la adquisición de características funcionales de los hepatocitos. Por tanto, se llevaron a cabo varios pruebas funcionales en combinación para identificar hepatocitos funcionales. Las CMAMr, CMAMrata o CMAMh produjeron urea y albúmina, poseyeron una actividad del citocromo P450 inducible por fenobarbital, fueron capaces de incorporar dil-acil-LDL y contuvieron gránulos de glucógeno. Aunque la producción de urea es característica de la actividad de los hepatocitos, el epitelio tubular renal también produce urea (Hedlund E. et al., 2001). Por el contrario, la producción de albúmina es una prueba específica para la presencia y 55 actividad metabólica de los hepatocitos (Hedlund E. et al., 2001). El citocromo P450, aunque se encuentra en los hepatocitos, también está presente en muchos otros tipos celulares (Jarukamjom K. et al., 1999). Sin embargo, se considera que la actividad de Cyp2b1 en ratas (Tzanakakis E.S. et al., 2001), Cyp2b9 y Cyp2b13 en ratones (Li-Masters T. et al., 2001; Zelko I. et al., 2000) y CYP2B6 en humanos es relativamente específica de los hepatocitos. La presencia de estas formas de P450 se demostró por RT-PCR. La especificidad respecto a los hepatocitos se intensifica aún más cuando la actividad de P450 es inducible por fenobarbital (Rader D.J. et al., 2000), tal como se demuestra. Aunque se aprecia incorporación de LDL en los hepatocitos (Oh S.H. et al., 2000), otras células tales como el endotelio poseen una capacidad similar (Avital I. et al, 2001). Finalmente, únicamente los hepatocitos pueden generar y almacenar glucógeno. Cuando se realizan juntos, estas pruebas funcionales demuestran que las CMAM de ratón, rata o humanos tratadas in vitro con FCF4 y FCH no solo expresan marcadores hepatocíticos sino Although it has been shown that FCF4 alone or FCF4 and FCH induce the passage of CMAM to cells with phenotypic and morphological characteristics of hepatocytes, this alone does not prove that the cells have differentiated into hepatocytes unless the acquisition of functional characteristics can be demonstrated of hepatocytes. Therefore, several functional tests were carried out in combination to identify functional hepatocytes. The CMAMr, CMAMrata or CMAMh produced urea and albumin, possessed a phenobarbital inducible cytochrome P450 activity, were able to incorporate dil-acyl-LDL and contained glycogen granules. Although urea production is characteristic of hepatocyte activity, the renal tubular epithelium also produces urea (Hedlund E. et al., 2001). In contrast, albumin production is a specific test for the presence and metabolic activity of hepatocytes (Hedlund E. et al., 2001). Cytochrome P450, although found in hepatocytes, is also present in many other cell types (Jarukamjom K. et al., 1999). However, it is considered that the activity of Cyp2b1 in rats (Tzanakakis ES et al., 2001), Cyp2b9 and Cyp2b13 in mice (Li-Masters T. et al., 2001; Zelko I. et al., 2000) and CYP2B6 in humans it is relatively specific for hepatocytes. The presence of these forms of P450 was demonstrated by RT-PCR. The specificity with respect to hepatocytes is further intensified when the activity of P450 is inducible by phenobarbital (Rader D.J. et al., 2000), as demonstrated. Although LDL incorporation in hepatocytes is appreciated (Oh S.H. et al., 2000), other cells such as the endothelium have a similar capacity (Avital I. et al, 2001). Finally, only hepatocytes can generate and store glycogen. When performed together, these functional tests demonstrate that mouse, rat or human CMAMs treated in vitro with FCF4 and FCH not only express hepatocytic markers but also

65 que también poseen características funcionales consistentes con actividades metabólicas de los hepatocitos. 65 that also have functional characteristics consistent with hepatocyte metabolic activities.

Varios estudios han demostrado que las células derivadas de MO se pueden diferenciar en células similares a los hepatocitos in vivo e in vitro (Petersen B.E. et al., 1999; Theise N.D. et al., 2000; Krause D.S. et al., 2001; Pittenger Several studies have shown that MO-derived cells can be differentiated into hepatocyte-like cells in vivo and in vitro (Petersen B.E. et al., 1999; Theise N.D. et al., 2000; Krause D.S. et al., 2001; Pittenger

M.F. et al., 1999; Wang S. et al., 2001; Lagasse E. et al., 2000). Sin embargo, la mayoría de las investigaciones no han estudiado el fenotipo de la célula de MO que se diferencia en células con fenotipo de hepatocitos. Se desconoce M.F. et al., 1999; Wang S. et al., 2001; Lagasse E. et al., 2000). However, most research has not studied the phenotype of the MO cell that differs in cells with hepatocyte phenotype. It is unknown

5 si las células que presentan una tinción positiva para los marcadores hepatocíticos poseen características funcionales de hepatocitos y si las células que se diferencian en hepatocitos también se pueden diferenciar en células mesodérmicas, tales como las células hematopoyéticas. Lagasse et al. demostraron que las células cKit+Thy1bajoScal+Lin+- presentes en la MO murina se diferencian en células no solo con un fenotipo de hepatocitos sino también con función de hepatocitos (Lagasse E. et al., 2000). A pesar de que se pudieron observar resultados de este tipo con un trasplante de tan solo 50 células, este estudio no prueba que la misma célula que se diferencia en células hematopoyéticas también se diferencie en hepatocitos. Krause et al. demostraron que una única célula puede repoblar el sistema hematopoyético y dar lugar a escasos hepatocitos. Sin embargo, no se llevó a cabo una evaluación funcional de los hepatocitos (Krause D.S. et al., 2001). Avital et al. publicaron recientemente que las 5 if cells that have a positive staining for hepatocyte markers have functional characteristics of hepatocytes and if cells that differ in hepatocytes can also be differentiated into mesodermal cells, such as hematopoietic cells. Lagasse et al. demonstrated that cKit + Thy1bajoScal + Lin + - cells present in murine MO differ in cells not only with a hepatocyte phenotype but also with hepatocyte function (Lagasse E. et al., 2000). Although results of this type could be observed with a transplant of only 50 cells, this study does not prove that the same cell that differs in hematopoietic cells also differs in hepatocytes. Krause et al. They demonstrated that a single cell can repopulate the hematopoietic system and give rise to scarce hepatocytes. However, a functional evaluation of hepatocytes was not carried out (Krause D.S. et al., 2001). Avital et al. recently published that

--

células Thy-1+, �2m en MO de ratón expresan albúmina, proteína y ARNm de citocromo P450 3A2, C/EBPa y HNF4 Thy-1 +, �2m cells in mouse MO express albumin, protein and cytochrome P450 3A2 mRNA, C / EBPa and HNF4

15 (Wilmut I. et al., 1997), un fenotipo de progenitores de hepatocitos que se encuentra normalmente en el hígado. Por tanto, la presencia de células progenitoras de hepatocitos de este tipo en la MO podría explicar la diferenciación in vivo de la médula ósea en hepatocitos detectada en estudios recientes (Krause D.S. et al., 2001; Lagasse E. et al., 2000). 15 (Wilmut I. et al., 1997), a phenotype of hepatocyte progenitors that is normally found in the liver. Therefore, the presence of hepatocyte progenitor cells of this type in the MO could explain the in vivo differentiation of the bone marrow into hepatocytes detected in recent studies (Krause DS et al., 2001; Lagasse E. et al., 2000) .

Para abordar la cuestión de si las células que dan lugar a células similares a hepatocitos funcionales también dan lugar a otros tipos celulares, se utilizó el marcaje retroviral (Reyes M. et al., 2001; Jiang Y., 2002). Se ha demostrado recientemente que las células que expresan albúmina, CK18 y HNF1a se pueden generar a partir de las mismas CMAMr y CMAMrata que se diferencian en células con un fenotipo neuroectodérmico y endotelial (Jiang Y., 2002). Se confirma que se han observado resultados similares para las CMAMh. En la presente se demuestra que la misma To address the question of whether cells that give rise to cells similar to functional hepatocytes also give rise to other cell types, retroviral labeling was used (Reyes M. et al., 2001; Jiang Y., 2002). It has recently been shown that cells expressing albumin, CK18 and HNF1a can be generated from the same CMAMr and CMAMrata that differentiate into cells with a neuroectodermal and endothelial phenotype (Jiang Y., 2002). It is confirmed that similar results have been observed for CMAMh. It is hereby demonstrated that the same

25 CMAMh única también se diferencia en células con fenotipo y morfología de hepatocitos, lo que amplía investigaciones publicadas recientemente que demuestran la derivación de células con función y fenotipo neuroectodérmicos y mesodérmicos a partir de una CMAMh única (Reyes M., 2002). Por tanto, se demuestra por primera vez que en la MO existen CMAM que no expresan marcadores hepatocíticos y no tienen una actividad de hepatocitos funcionales, las cuales dependiendo de las condiciones del cultivo, adquieren un fenotipo de hepatocitos y características funcionales de hepatocitos, o características funcionales y fenotípicas de células neuroectodérmicas y mesodérmicas. 25 CMAMh alone also differs in cells with hepatocyte phenotype and morphology, which expands recently published research that demonstrates the derivation of cells with neuroectodermal and mesodermal function and phenotype from a single CMAMh (Reyes M., 2002). Therefore, it is demonstrated for the first time that in the CMM there are CMAMs that do not express hepatocytic markers and do not have a functional hepatocyte activity, which depending on the culture conditions, acquire a hepatocyte phenotype and hepatocyte functional characteristics, or characteristics functional and phenotypic neuroectodermal and mesodermal cells.

Ejemplo 12. Trasplante de CMAM LacZ transgénicas para tratar ratones hemofílicos Example 12. Transplantation of transgenic LacZ CMAM to treat hemophilic mice

35 Se derivaron CMAM a partir de ratones ROSA26 que contenían el transgén �-gal/NEO (106 células/ratón) y se inyectaron i.v. en ratones hemofílicos (N=5) sin irradiación previa. Se sacrificaron los animales 1 (N=2) y 2 (N=3) meses después del trasplante de CMAM. Se tiñeron muestras de médula ósea procesadas con una citospin y cortes congelados de hígado, bazo, músculo esquelético, corazón, pulmón e intestino para detectar la presencia del antígeno �-gal utilizando un anticuerpo anti--gal conjugado con FITC y pan-citoqueratina o CD45. También se analizaron los tejidos por Q-PCR para detectar el gen �-gal tal como se describe en el Ejemplo 6. 35 CMAM was derived from ROSA26 mice containing the �-gal / NEO transgene (106 cells / mouse) and injected i.v. in hemophilic mice (N = 5) without prior irradiation. Animals 1 (N = 2) and 2 (N = 3) were sacrificed months after CMAM transplantation. Bone marrow samples processed with a cytospin and frozen cuts of liver, spleen, skeletal muscle, heart, lung and intestine were stained to detect the presence of the �-gal antigen using an anti-gal antibody conjugated to FITC and pan-cytokeratin or CD45 Tissues were also analyzed by Q-PCR to detect the �-gal gene as described in Example 6.

El análisis preliminar realizado por inmunohistoquímica y Q-PCR indica que uno de los tres animales (M3) analizados 2 meses después de la inyección presentaban un 0,1% de células epiteliales pulmonares derivadas de células del donante. La inmunohistoquímica también mostró que el animal M5 presentaba un injerto <1% de células The preliminary analysis performed by immunohistochemistry and Q-PCR indicates that one of the three animals (M3) analyzed 2 months after the injection presented 0.1% of pulmonary epithelial cells derived from donor cells. Immunohistochemistry also showed that the animal M5 had a graft <1% of cells.

45 CD45+ del donante en el bazo, médula e intestino. Los tejidos del animal M4 presentaron algunas células derivadas del donante por inmunohistoquímica; está pendiente la PCR de este animal. 45 CD45 + from the donor in the spleen, marrow and intestine. The tissues of the animal M4 presented some cells derived from the donor by immunohistochemistry; The PCR of this animal is pending.

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes se incorporan en la presente por referencia como si se hubieran incorporado de manera individual por referencia. Mientras que en la memoria descriptiva precedente se ha descrito esta invención en relación a ciertas realizaciones preferidas de la misma, y se han expuesto muchos detalles a efectos ilustrativos, será aparente para aquellos expertos en la técnica que la invención es susceptible de realizaciones adicionales y que algunos de los detalles descritos en la presente se pueden modificar considerablemente sin alejarse de los principios básicos de la invención. All publications, patents and patent applications are incorporated herein by reference as if they had been incorporated individually by reference. While this invention has been described in the preceding specification in relation to certain preferred embodiments thereof, and many details have been set forth for illustrative purposes, it will be apparent to those skilled in the art that the invention is susceptible to further embodiments and that Some of the details described herein can be modified considerably without departing from the basic principles of the invention.

55 REFERENCIAS 55 REFERENCES

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5 12:1745-57. Young, H. et al., Patente de los EE. UU. N.º 5.827.735 Zambrowicz, B. P., Imamoto, A., Hering, S., Herzenberg, L. A., Kerr, W. G. y Soriano, P. (1997). Disruption of overlapping transcripts in the ROSA beta geo 26 gene trap strain leads to widespread expression of betagalactosidase in mouse embryos and hematopoietic cells. Proc Natl Acad Sci USA. 94:3789-94. 5 12: 1745-57. Young, H. et al., U.S. Pat. UU. No. 5,827,735 Zambrowicz, B. P., Imamoto, A., Hering, S., Herzenberg, L.A., Kerr, W. G. and Soriano, P. (1997). Disruption of overlapping transcripts in the ROSA beta geo 26 gene trap strain leads to widespread expression of betagalactosidase in mouse embryos and hematopoietic cells. Proc Natl Acad Sci USA. 94: 3789-94.

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15 primary normal human CD34+ cells with a BCR/ABL containing retroviral vector. Blood. 97:2406-12. Ziegler, B., M. Valtieri, G. Porada, R. De Maria, R. Muller, B. Masella, M. Gabbianelli, I. Casella, E. Pelosi, T. Bock, E. Zanjani y C. Peschle. (1999). KDR Receptor: A Key Marker Defining HSCs. Science. 285:1553 1558. 15 primary normal human CD34 + cells with a BCR / ABL containing retroviral vector. Blood. 97: 2406-12. Ziegler, B., M. Valtieri, G. Porada, R. De Maria, R. Muller, B. Masella, M. Gabbianelli, I. Casella, E. Pelosi, T. Bock, E. Zanjani and C. Peschle. (1999). KDR Receiver: A Key Marker Defining HSCs. Science 285: 1553 1558.

Claims (5)

REIVINDICACIONES 1. Un método para obtener una población de células madre adultas multipotentes de mamíferos que no son células germinales ni embrionarias y que pueden ser inducidas a diferenciarse en al menos un tipo celular 1. A method to obtain a population of multipotent adult mammalian stem cells that are not germ cells or embryonic cells and that can be induced to differentiate into at least one cell type 5 diferenciado de cada una de las estirpes embrionarias mesodérmicas, ectodérmicas y endodérmicas, donde las células expresan oct4 y telomerasa, y donde el método comprende: 5 differentiated from each of the mesodermal, ectodermal and endodermal embryonic strains, where the cells express oct4 and telomerase, and where the method comprises: a) proporcionar una muestra de sangre del cordón umbilical o de la placenta b) establecer una población de células adherentes 10 c) eliminar la población de células CD45+ presentes en las células; d) recuperar las células CD45-y cultivar las células CD45- en un medio de cultivo que comprende FCE ya) provide a blood sample from the umbilical cord or placenta b) establish a population of adherent cells 10 c) eliminate the population of CD45 + cells present in the cells; d) recovering the CD45 cells - and culturing the CD45 cells - in a culture medium comprising FCE and FCDP; e) seleccionar las células que expresan oct4 y telomerasa; f) cultivar las células para formar una población y  FCDP; e) select the cells expressing oct4 and telomerase; f) cultivate the cells to form a population and 15 g) aislar la población de células madre adultas multipotentes de mamíferos. 15 g) isolate the population of multipotent adult stem cells from mammals. 2. El método de cual quiera de las reivindicaciones precedentes, que además comprende cultivar las células en presencia de un factor de diferenciación y de este modo generar una célula diferenciada. 2. The method of any of the preceding claims, further comprising culturing the cells in the presence of a differentiation factor and thereby generating a differentiated cell.

20 3. El método de la reivindicación 2, donde el factor de diferenciación se selecciona del grupo constituido por factor de crecimiento de fibroblastos básico (FCFb); factor de crecimiento endotelial vascular (FCEV); sulfóxido de dimetilo (DMSO) e isoproterenol; y factor de crecimiento de fibroblastos 4 (FCF4) y factor de crecimiento de hepatocitos (FCH). The method of claim 2, wherein the differentiation factor is selected from the group consisting of basic fibroblast growth factor (FCFb); vascular endothelial growth factor (FCEV); dimethyl sulfoxide (DMSO) and isoproterenol; and fibroblast growth factor 4 (FCF4) and hepatocyte growth factor (FCH).

25 4. El método de la reivindicación 1, que comprende el paso adicional de producir un medicamento para uso en el injerto de células multipotentes en un tejido. The method of claim 1, which comprises the additional step of producing a medicament for use in the grafting of multipotent cells in a tissue.

5. El método de cualquier reivindicación precedente, que además comprende producir un medicamento 5. The method of any preceding claim, further comprising producing a medicament farmacéutico que comprende mezclar las células y un portador farmacéuticamente aceptable. 30 Pharmacist comprising mixing the cells and a pharmaceutically acceptable carrier. 30 6. El método de cualquier reivindicación precedente, donde la célula posee la capacidad de ser inducida a diferenciarse para formar células seleccionadas del grupo constituido por tipos celulares oligodendrocíticos, neuronales, neurogliales, hematopoyéticos, pancreáticos, hepáticos, epiteliales, endoteliales, oculares, de músculo cardíaco, músculo liso, músculo esquelético, estroma medular, fibroblastos, adipocitos, condrocitos y osteoblastos. 6. The method of any preceding claim, wherein the cell has the ability to be induced to differentiate to form cells selected from the group consisting of oligodendrocytic, neuronal, neuroglial, hematopoietic, pancreatic, hepatic, epithelial, endothelial, ocular, muscle cell types cardiac, smooth muscle, skeletal muscle, spinal cord, fibroblasts, adipocytes, chondrocytes and osteoblasts. 7. El método de cualquier reivindicación precedente, donde las células no forman teratomas cuando se administran a un paciente. 7. The method of any preceding claim, wherein the cells do not form teratomas when administered to a patient.