ES2428358T3 - Terapia de combinación - Google Patents

Abstract

Una combinación que comprende IL-21 y un agente quimioterapéutico, en la que el agentequimioterapéutico es un agente alquilante seleccionado del grupo que consiste en Melfalan, Busulfán, Cisplatino,Carboplatino, Ifosfamida, Dacarbazina, Procarbazina, Tiotepa, Lomustina y Temozolamida.

Description

Terapia de combinación

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a IL-21 en combinación con otros compuestos farmacéuticos en el tratamiento del 5 cáncer, tal como se define en las reivindicaciones.

En general, las citocinas estimulan la proliferación o diferenciación de células de la línea hematopoyética o participan en los mecanismos de respuesta inmunitaria inflamatoria del cuerpo. Las interleucinas son una familia de citocinas que median las respuestas inmunológicas al producir muchas citocinas y efectúan la inmunidad adaptativa hacia antígenos. Las células T maduras pueden ser activadas, por ejemplo, por un antígeno u otros estímulos, para producir,

10 por ejemplo, citocinas, moléculas de señalización bioquímica o receptores además influyen en el destino de la población de células T.

Las citocinas producidas por las células T se han clasificado como tipo 1 y tipo 2 (Kelso, A. Immun. Cell Biol. 76: 300-317, 1998). Las citocinas tipo 1 incluyen IL-2, IFN-y, LT-a, y están implicadas en respuestas inflamatorias, la inmunidad viral, la inmunidad contra parásitos intracelulares y el rechazo de injertos. Las citocinas tipo 2 incluyen IL-4,

15 IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13, y están implicadas en las respuestas humorales, la inmunidad hacia helmintos y la respuesta alérgica. Las citocinas compartidas entré el tipo 1 y el tipo 2 incluyen 1L-3, GM-CSF y TNF-a. Existe alguna evidencia que sugiere que las poblaciones de células T productoras del tipo 1 y del tipo 2 migran preferentemente hacia diferentes tipos de tejido inflamado.

Las células T maduras pueden ser activadas, por ejemplo, por un antígeno u otro estímulo para producir, por ejemplo,

20 citocinas, moléculas de señalización bioquímicas, receptores que influyen además en el destino de la población de células T.

Las células T pueden ser activadas por los receptores sobre la superficie celular incluyendo el receptor de células B y otras moléculas accesorias para desempeñar las funciones de las células accesorias, tales como la producción de citocinas y anticuerpos.

25 Los linfocitos citolíticos naturales (NK, por sus siglas en inglés) tienen una célula progenitora común con las células T y las células B, y desempeñan una función en la supervivencia inmunitaria. Las células NK, los cuales comprenden hasta un 15 % de linfocitos sanguíneos, no expresan los receptores de antígeno y, por lo tanto, no usan el reconocimiento de MHC como requerimiento para la unión a una célula diana. Las células NK están implicadas en el reconocimiento y muerte de ciertas células tumorales y las células infectadas con virus. In vivo, se cree que las células

30 NK requieren la activación, sin embargo, in vitro, las células NK han mostrado que matan algunos tipos de células tumorales mediante la activación dependiente del ligando KIR.

La inmunología implicada en enfermedad de cáncer incluye diferentes células derivadas del sistema inmunitario. Los compuestos que estimulan tales respuestas se pueden usar en combinación para proporcionar una respuesta mejorada para el tratamiento de tumores.

35 IL-21 ha mostrado que afecta a un número de diferentes células del sistema inmunitario. De particular interés es la activación observada de los linfocitos T citolíticos (CTL, por sus siglas en inglés) y las células NK. Se sabe que ambos tipos celulares están críticamente implicados en el combate de tumores. Así, la presencia de linfocitos T intratumorales está relacionada con el resultado clínico mejorado para una serie de diferentes cánceres (Zhang et al. 2003). Sin embargo, los linfocitos que infiltran tumores (TIL), no son siempre suficientemente activados para controlar el

40 crecimiento tumoral (Dunn et al. 2002; Kataki et al. 2002; Blohm et al. 2002; Khong and Restifo 2002). Por tanto, existe una necesidad de pautas terapéuticas mejoradas para el tratamiento, gestión y prevención de cánceres. Otro aspecto importante del efecto de los IL-21 en el sistema inmunitario es el efecto sobre las células B, las cuales pueden conducir a una respuesta mejorada de anticuerpos contra las células tumorales y células infectadas por virus. La presente invención se refiere al uso combinado de IL-21 y otras realizaciones para el tratamiento y gestión del cáncer y las

45 infecciones víricas.

Aunque las vacunas terapéuticas sintéticas que consisten en uno o solo unos pocos antígenos definidos han mostrado cierta utilidad en el tratamiento del cáncer, existe una fuerte necesidad de mejora. La presente invención también se refiere a una combinación oportuna de (i) la liberación de antígenos tumorales que conducen a una respuesta inmunitaria dirigida hacia estos antígenos tumorales y (ii) la capacidad única de IL-21 de inducir una respuesta de 50 células T citolíticas (CTL) sostenida. La liberación de antígenos tumorales se puede obtener con una serie de técnicas diferentes que incluyen los siguientes ejemplos no limitantes: (i) quimioterapia convencional, (ii) inducción de apoptosis; (iii) inducción de muerte de células tumorales, a través de la interferencia con el aporte sanguíneo al tumor;

(iv) interferencia con la estimulación del factor de crecimiento y la transducción de señales.

El documento WO 03/082212 describe un procedimiento de tratamiento y/o prevención de cáncer en un sujeto

55 mamífero tal como un ser humano mediante la coadministrción de IL-21 con un agente inmunoterapéutico y/o quimioterapéutico.

La invención proporciona una combinación que comprende IL-21 y un agente quimioterapéutico, siendo el agente quimioterapéutico un agente alquilante seleccionado del grupo que consiste en melfalán, busulfán, cisplatino, carboplatino, ifosfamida, dacarbazina, procarbazina, tiotepa, lomustina y temozolamida.

La memoria descriptiva describe IL-21, análogos y derivados del mismo en combinación con uno o más de los siguientes:

I. Agentes que inducen la muerte de las células tumorales o la muerte de las células infectadas por virus a) quimioterapia convencional b) radioterapia c) anticuerpos monoclonales d) reguladores del control del ciclo celular/apoptosis e) moduladores del factor de crecimiento y de la transducción de señales f) inhibidores de la vascularización tumoral (inhibidores de angiogénesis, fármacos anti-angiogénesis) g) direccionamiento viral (el uso de un virus recombinante para destruir células tumorales) h) agentes anti-víricas i) agentes hormonales

II. Agentes que potencian la respuesta inmunitaria contra las células tumorales o las células infectadas con virus j) activadores del sistema inmunitario k) inhibidores del sistema inmunitario (por ejemplo, agentes que inhiben las señales inmunitarias que regulan a

niveles inferiores la respuesta inmunitaria), incluyendo agentes anti-anérgicos l) vacunas terapéuticas

III. Agentes que interfieren con el crecimiento tumoral, metástasis o dispersión de las células infectadas con virus m) integrinas, moduladores de las moléculas de adhesión celular n) antimetastásicos o) moduladores de la célula endotelial

IV.

Vacunación interna

V.

Antagonistas del factor tisular y otros factores que influyen en la cascada de la coagulación p) agentes anti factor Xa, inhibidores anti factor IIa, agentes antifibrinógeno q) pentasacáridos, etc.

VI. Agentes inmunosupresores/inmunomoduladores r) agentes que influyen en el alojamiento de linfocitos T, por ejemplo, FTY-720 s) inhibidores de calcineurina t) inhibidores de TOR

La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende IL-21 en combinación con uno o más de los

compuestos definidos en las reivindicaciones. La invención proporciona el uso de IL-21 en combinación con uno o más de los compuestos definidos en las reivindicaciones para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

La memoria descriptiva describe tratar un sujeto que lo necesita, con una cantidad terapéuticamente eficaz de una combinación de IL-21, un análogo y un derivado del mismo, junto con uno o más de los compuestos seleccionados de los grupos I-IV y a)-t) que se describieron anteriormente.

En una realización de la invención, las enfermedades que se van a tratar son trastornos neoplásicos tales como melanoma maligno metastásico, carcinoma de células renales, cáncer de ovario, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón amicrocítico, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer de vejiga, cáncer esofágico, cáncer cervical, cáncer endometrial, linfoma y leucemia.

En aspectos más específicos de la invención, se entenderá que los términos “trastornos neoplásicos”, “cáncer”, “crecimiento tumoral” hacen referencia a todas las formas de crecimiento de células neoplásicas, incluyendo los 5 tumores quísticos y sólidos, tumores de tejido óseo y blando, incluyendo tumores benignos y malignos, incluyendo tumores en el tejido anal, en el conducto biliar, en la vejiga, las células sanguíneas, hueso, hueso (secundario), intestino (colon y recto), cerebro, cerebro (secundario), mama, mama (secundario), carcinoide, cérvix, cánceres pediátricos, de ojo, de garganta (esófago), de cabeza y cuello, sarcoma de Kaposi, de riñón, de laringe, leucemia (linfoblástica aguda), leucemia (mieloide aguda), leucemia (linfocítica crónica), leucemia (mieloide crónica), leucemia

10 (otra), hígado, hígado (secundario), pulmón, pulmón (secundario), nódulos linfáticos (secundario), linfoma (de Hodkins), linfoma (no Hodkins), melanoma, mesotelioma, mieloma, ovario, páncreas, pene, próstata, piel, sarcomas de tejido blando, estómago, testículos, tiroides, tumor primario desconocido, vagina, vulva, matriz (útero).

Los tumores de tejidos blandos incluyen la monosomía de schwanoma benigno, tumor desmoide, lipoblastoma, lipoma, lioma uterino, sarcoma de células claras, dermatofibrosarcoma, sarcoma de Ewing, condrosarcoma mixoide 15 extraesquelético, liposarcoma mixoide, liposarcoma, bien diferenciado, rabdomiosarcoma alveolar y sarcoma sinovial.

Los tumores específicos del hueso incluyen fibroma no osificante, quiste de hueso unicameral, encondroma, quiste de hueso aneurismal, osteoblastoma, condroblastoma, condromixofibroma, fibroma osificante y adamantinoma, tumor de células gigantes, displasia fibrosa, sarcoma de Ewing, granuloma eosinofílico, osteosarcoma, condroma, condrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno y carcinoma metastásico.

20 Las leucemias se refieren a cánceres de los glóbulos blancos que son producidas por la médula ósea. Estos incluyen pero sin limitación, los cuatro tipos principales de leucemia; linfoblástica aguda (ALL), mieloblástica aguda (AML), linfocítica crónica (CLL) y mieloide crónica (CML).

En otro aspecto descrito en el presente documento, las enfermedades que se van a tratar son infecciones víricas tales como virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus de la inmunodeficiencia humana, virus sincitial respiratorio,

25 virus de Eppstein-Barr, virus de la gripe, citomegalovirus, herpes virus y síndrome respiratorio agudo grave.

DEFINICIONES

Antes de la discusión de las realizaciones detalladas de la invención, se proporciona una definición de los términos específicos relacionados con los aspectos principales de la invención.

En el contexto de la presente invención, IL-21 se define como la secuencia descrita en el documento WO 00/53761

30 como SEQ ID N.º: 2. Se describen en el presente documento las secuencias de ADN que codifican el péptido como la SEQ ID N.º: 1, derivados funcionales y fragmentos del mismo. La presente solicitud también describe análogos de IL-21 y derivados de la misma. En el contexto de la presente invención, el término “IL-21” significa, de este modo, IL-21 como se describe en el documento WO 00/53761, mientras que “IL-21 y derivados de la misma” abarca también, en consecuencia, IL-21 como variantes, análogos y derivados de la misma.

35 De acuerdo con al presente invención, se pueden emplear técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, técnicas de ADN recombinante, dentro de la experiencia de la técnica. Tales técnicas son explicadas con detalle en la literatura. Véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (en la presente “Sambrook et al., 1989”), DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes I y II/D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide

40 Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds (1985); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. (1986)); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, (1986)); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984).

Una “cantidad eficaz” significa una cantidad que es suficiente para proporcionar un efecto clínico. Esta dependerá del medio de administración, del sitio objetivo, del estado del paciente, si el tratamiento tiene lugar en el sujeto o sobre

45 células aisladas, la frecuencia del tratamiento, etc. Los intervalos de dosis podría esperarse que sean normalmente de 0,1 microgramos a 3000 microgramos por kilogramo de peso corporal por día. Para una discusión completa de las formulaciones de fármacos y los intervalos de dosis véase Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., (Mack Publishing Co., Easton, Penn., 1996).

Se debe entender que esta invención está limitada a la metodología particular, protocolos y reactivos descritos, ya que

50 estos pueden variar. Se entiende también que la terminología usada en el presente documento es únicamente con el fin de describir las realizaciones particulares, y no se pretende que limiten el alcance de la presente invención.

Los expertos apreciarán fácilmente que los niveles de dosis pueden variar como una función del compuesto específico, la gravedad de los síntomas y la susceptibilidad del sujeto a los efectos secundarios. Las dosis preferentes para un compuesto dado son fácilmente determinables por los expertos en la técnica por diversos medios. Un medio

55 preferente es medir la potencia fisiológica de un compuesto dado.

En el contexto de la presente invención “administración”, “administración combinada” o “terapia de combinación” se refiere a un tratamiento de cáncer usando IL-21 y cualquier agente o combinación de agentes que induzcan la muerte celular y/o cualquier agente o combinación de agentes que potencien la respuesta inmunitaria y/o cualquier agente o combinación de agentes que interfieran con el crecimiento tumoral, la metástasis o la diseminación del cáncer como se 5 define en las reivindicaciones. Dicha terapia de combinación se puede llevar a cabo administrando IL-21 antes de dichos agentes o combinación de agentes y/o por administración simultánea de IL-21 y dichos agentes o combinación de agentes y/o por administración de IL-21 después de la administración de dichos agentes o combinación de agentes.

En el contexto de la presente invención “tratamiento” o “tratar” se refiere a la prevención, el alivio, la gestión, la curación o la reducción de la enfermedad.

10 En el contexto de la presente invención “cáncer” se refiere a cualquier trastorno neoplásico, incluyendo trastornos celulares tales como sarcoma, carcinoma, melanoma, leucemia, linfoma, cánceres de mama, de cabeza y cuello, de ovarios, de vejiga, de pulmón, de faringe, de laringe, de esófago, de estómago, de intestino delgado, de hígado, de páncreas, de colon, del tracto reproductor femenino, del tracto reproductor masculino, de próstata, de los riñones y del sistema nervioso central.

15 En el contexto de la presente invención las combinaciones proporcionan una “cantidad eficaz” como se aplica a IL-21, un análogo o un derivado del mismo, o a cualquiera de las combinaciones, y se refiere a la cantidad de cada componente en la mezcla, que es efectivo para la supervivencia del huésped.

La sinergia se puede ser medir en términos de la dosis, la supervivencia, el tiempo para la progresión, el periodo libre de enfermedad, la carga tumoral reducida y otros parámetros adecuados para la enfermedad.

20 DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

“IL-21” se describe en la solicitud de patente de los Estados Unidos N.º WO 00/53761, publicada el 14 de septiembre del 2000, que divulga IL-21 (como ligando de “Zalfa11”) como SEQ ID N.º: 2, así como los procedimientos para producirla y los anticuerpos para la misma, y una secuencia polinucleotídica que codifica la IL-21 como la SEQ ID N.º: 1 en la solicitud anteriormente mencionada. La memoria descriptiva describe ortólogos que comprenden al menos el 25 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, o más del 95 % de identidad de secuencia. La presente memoria descriptiva describe el uso de los polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que tienen al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, o más del 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de residuos de aminoácidos 1 al 162, los residuos 41(Gln) a 148(Ile) de la SEQ ID N.º: 2. Los procedimientos para determinar la identidad porcentual se describen más adelante. Los polipéptidos IL-21 de la

30 presente invención han conservado toda o parte de la actividad biológica de la IL-21 que hace a IL-21 útil para el tratamiento, por ejemplo, de infecciones y cáncer. Algunos de los polipéptidos pueden tener también una actividad biológica que es mayor que la actividad biológica de IL-21.

La presente memoria descriptiva describe las proteínas homólogas y los polinucleótidos de otras especies (“ortólogos”). De interés particular son los polipéptidos de IL-21 provenientes de otras especies de mamíferos,

35 incluyendo roedores, porcino, ovino, bovino, canino, felino, equino y otros primates. Los ortólogos de especies de la proteína IL-21 humana se pueden clonar usando información y composiciones proporcionadas por la presente memoria descriptiva en combinación con técnicas de clonación convencionales. Tal como se usa y se reivindica, la expresión “un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido, estando definido dicho polipéptido por la SEQ ID N.º: 2” incluye las variantes alélicas y los ortólogos de especies de este polipéptido.

40 La presente memoria descriptiva describe los polipéptidos de proteína aislados, que son sustancialmente idénticos al polipéptido de la proteína de la SEQ ID N.º: 2 y sus ortólogos de especie. “Aislado” se refiere a una proteína o polipéptido que se encuentra en una condición diferente de su ambiente natural, tal como alejado de la sangre y el tejido animal. En una forma preferente, el polipéptido aislado está sustancialmente exento de otros polipéptidos, particularmente otros polipéptidos de origen animal. Se prefiere proporcionar los polipéptidos en una forma altamente

45 purificada, por ejemplo, más del 95 % de purera, más preferentemente, más del 99 % de pureza. El término “sustancialmente idéntico” se usa en el presente documento, para indicar los polipéptidos que tienen más del 50 %, preferentemente más del 60 %, más del 70 %, o preferentemente al menos el 80 %, de identidad de secuencia con la secuencia mostrada en la SEQ ID N.º: 2 del documento WO 00/53761 u ortólogos de especies. Tales polipéptidos más preferentemente serán al menos el 90 % idénticos, y lo más preferentemente al menos el 95 % o más idénticos a IL21,

50 o sus ortólogos de especies. La identidad de secuencia porcentual se proporciona por procedimientos convencionales. Véase, por ejemplo, Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-616 (1986) y Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919 (1992). La identidad de secuencia de las moléculas polinucleotídicas se determina por procedimientos similares usando una proporción como se ha descrito anteriormente.

Los polipéptidos de la variante de IL-21 o como también se usa en el presente documento, los análogos de IL-21, son

55 proteínas y polipéptidos sustancialmente idénticos y están caracterizados por poseer una o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos. Estos cambios son preferentemente de una naturaleza menor, es decir sustituciones conservantes de aminoácidos (véase la Tabla 1) y otras sustituciones que no afectan significativamente el plegamiento o la actividad de la proteína o polipéptido; pequeñas deleciones, normalmente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; y pequeñas extensiones del extremo amino- o carboxilo-terminal tales como un residuo de metionina amino-terminal, un pequeño péptido enlazador de a aproximadamente 20-25 residuos, o una pequeña extensión que facilita la purificación (un marcador de afinidad), tal como un tramo de poli-histidina, una proteína A, Nilsson et al., EMBO J. 4: 1075 (1985); Nilsson et al., Methods Enzymol. 198: 3 (1991), glutathione S

5 transferase, Smith and Johnson, Gene 67: 31 (1988), u otro epítopo antigénico o dominio de unión. Véase, en general, Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107 (1991) . Los ADN que codifican los marcadores de afinidad están disponibles de suministradores comerciales (por ejemplo, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Tabla 1

Sustituciones de aminoácidos conservativas

Básicos: arginina

lisina

histidina

Ácidos: ácido glutámico

ácido aspártico

Polares: glutamina

asparragina

Hidrófobos: leucina

isoleucina

valina

Aromáticos: fenilalanina

triptófano

tirosina

Pequeños: glicina

alanina

serina

treonina

metionina

10 Las proteínas descritas en el presente documento también pueden comprender residuos de aminoácidos de origen no natural. Los aminoácidos de origen no natural, incluyen sin limitación, trans-3-metilprolina, 2,4-metanoprolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, N-metilglicina, addo-treonina, metiltreonina, hidroxietilcisteína, hidroxietilhomocisteína, nitroglutamina, homoglutamina, ácido pipecólico, ácido tiazolidincarboxílico, deshidroprolina, 3-y 4-metilprolina, 3,3-dimetilprolina, terc-leucina, norvalina, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina y

15 4-fluorofenilalanina. Se conocen varios procedimientos en la técnica para incorporar residuos de aminoácidos de origen no natural en las proteínas. Por ejemplo, se puede emplear un sistema in vitro, en el que se suprimen mutaciones antisentido usando ARNt supresores químicamente aminoacilados. Los procedimientos para sintetizar aminoácidos y aminoacilar ARNt son conocidos en la técnica. Los aminoácidos esenciales en polipéptidos se pueden identificar de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica, tales como la mutagénesis dirigida al sitio o la

20 mutagénesis de barrido de alanina [Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085 (1989)]; Bass et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 88: 4498-4502 (1991) . En la última técnica, se introducen mutaciones de alanina simple en cada residuo en la molécula y las moléculas mutantes resultantes se ensayan para determinar la actividad biológica (por ejemplo, unión del ligando y transducción de señal) para identificar los residuos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Los sitios de interacción ligando-proteína también se pueden determinar por análisis de la

25 estructura cristalina, como se determina por técnicas tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía y marcado por fotoafinidad.

Se pueden realizar y ensayar múltiples sustituciones de aminoácidos usando procedimientos conocidos de mutagénesis y rastreo, tales como los descritos por Reidhaar-Olson and Sauer, Science 241: 53-57 (1988) o Bowie and Sauer Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156 (1989). En resumen, estos autores divulgan procedimientos para 30 distribuir al azar de manera simultánea dos o más posiciones en un polipéptido, seleccionando el polipéptido funcional,

y luego secuenciando los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de sustituciones permisibles en cada posición. Otros procedimientos que se pueden usar incluyen presentación de fagos (por ejemplo, Lowman et al., Biochem. 30: 10832-10837 (1991); Ladner et al., patente de los Estados Unidos N.º 5,223, 409; Huse, publicación WIPO WO 92/06204) y mutagénesis dirigida al sitio, Derbyshire et al., Gene 46: 145 (1986); Ner et al., DNA 7: 127

5 (1988).

Las variantes de IL-21 son, por ejemplo, péptidos IL-21, como se ha descrito anteriormente, sin la secuencia N-terminal. La secuencia N-terminal puede comprender 1-28 aminoácidos iniciales. Además o, de forma alternativa, una variante es por ejemplo IL-21 o variantes de IL-21 sin la Met N-terminal, que con frecuencia se incluye a partir de la expresión en un huésped bacteriano.

10 Los procedimientos de mutagénesis que se han divulgado antes se pueden combinar con procedimientos de rastreo de alto rendimiento para detectar la actividad de las proteínas mutagenizadas, clonadas en las células huésped. Los ensayos preferentes a este respecto incluyen ensayos de proliferación celular y ensayos de unión a ligando, basados en biosensores, que se describen más adelante. Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican proteínas activas o porciones de las mismas (por ejemplo, fragmentos de unión a ligando) se pueden recuperar de las células

15 huésped y secuenciarse rápidamente usando equipo moderno. Estos procedimientos permiten la determinación rápida de la importancia de los residuos de aminoácidos individuales en un polipéptido de interés, y se pueden aplicar a polipéptidos de estructura desconocida.

La presente memoria descriptiva describe otras diversas fusiones polipeptídicas y proteínas multiméricas relacionadas que comprenden una o más fusiones polipeptídicas. Por ejemplo, el polipéptido IL-21 se puede preparar como una 20 fusión con una molécula de dimerización como se describe en las patentes de los Estados Unidos números. 5,155,027 y 5,567,584. Las proteínas de dimerización preferentes a este respecto incluyen los dominios de región constante de inmunoglobulina. Las fusiones polipeptídicas de inmunoglobulina-IL-21 se pueden ser expresar en células manipuladas mediante ingeniería genética. Los dominios auxiliares se pueden fusionar con los polipéptidos IL-21 para dirigirlos a las células específicas, tejidos o moléculas específicas (por ejemplo, colágeno). Por ejemplo, el polipéptido 25 o la proteína IL-21 podrían ser dirigidos a un tipo celular predeterminado, mediante fusión de un polipéptido a un ligando que se une específicamente a un receptor sobre la superficie de la célula objetivo. De esta manera, los polipéptidos y las proteínas se pueden dirigir con fines terapéuticos o de diagnóstico. Un polipéptido IL-21 se puede fusionar con dos ó más porciones, tal como un marcador de afinidad para la purificación y un dominio de dirección al objetivo. Las fusiones polipeptídicas también pueden comprender uno o más sitios de escisión, particularmente entre

30 los dominios. Véase Tuan et al., Connective Tissue Research 34: 1-9 (1996).

“Derivados de IL-21” comprenden la derivatización o enlace a otra molécula funcional. El enlace puede ser acoplamiento clínico, fusión genética, asociación no covalente o similares, con otras entidades moleculares tales como anticuerpos, toxinas, radioisótopos, agentes citotóxicos o citostáticos o moléculas poliméricas o grupos lipófilos. Ejemplos no limitantes incluyen grupos poliméricos, tales como por ejemplo, dendrímeros como los que se divulgan 35 en el documento PCT/DK2004/000531, poli(óxido de etileno) (PAO), polialquilenglicol (PAG), polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol (PPG), PEG ramificados, poli(alcohol vinílico) (PVA), policarboxilato, polivinilpirrolidona, polietileno–co–anhídrido de ácido maleico, poliestireno–co–anhídrido de ácido maleico, dextrano, carboximetil–dextrano; ligandos de unión a proteínas séricas, tales como compuestos que se unen a la albúmina, como ácidos grasos, ácido graso C5 a C24, diácido alifático (por ejemplo C5 a C24). Los aglutinantes de alúmina se

40 descritos en la solicitud de patente danesa PCT/DK04/000625. Los aglutinantes de albúmina son también compuestos de la fórmula siguiente:

Otros ejemplos de grupos de extensión incluyen moléculas orgánicas pequeñas que contienen restos que, bajo condiciones fisiológicas, alteran las propiedades de carga, tales como ácidos carboxílicos o aminas, o sustituyentes 45 neutros que previenen el reconocimiento específico del glicano (también llamado glucano) tales como sustituyentes alquilo más pequeños (por ejemplo, alquilo de C1 a C5).

El término “molécula polimérica” o “grupo polimérico” o “porción polimérica” o “molécula polimérica”, abarca las moléculas formadas por enlace covalente de dos o más monómeros, en las que ninguno de los monómeros es un residuo de aminoácido. Los polímeros preferentes son moléculas poliméricas seleccionadas del grupo que consiste en 50 dendrímeros que se divulgan en el documento PCT/DK2004/000531, poli(óxido de alquileno) (PAO), incluyendo

polialquilenglicol (PAG), tal como polietilenglicol (PEG) y polipropilenglicol (PPG), PEG ramificados, poli(alcohol vinílico) (PVA), policarboxilato, polivinilpirrolidona, polietileno–co–anhídrido de ácido maleico, poliestilreno–co–anhídrido de ácido maleico, y dextrano, incluyendo carboximetildextrano, siendo particularmente preferente PEG.

5 El término “IL-21 PEGilado” significa IL-21, que tiene una o más moléculas de PEG conjugadas con un polipéptido IL-21 humano. Debe entenderse que la molécula de PEG puede estar unida a cualquier parte del polipéptido IL-21, incluyendo cualquier residuo de aminoácido o resto carbohidrato del polipéptido IL-21. El término “cisteína-IL-21 PEGilado” significa IL-21 que tiene una molécula de PEG conjugada con un grupo sulfhidrilo de una cisteína introducida en IL-21.

10 El término “polietilenglicol” o “PEG” significa un compuesto de polietilenglicol o un derivado del mismo, con o sin agentes de acoplamiento, restos de acoplamiento o de activación (por ejemplo, con tiol, triflato, tresilato, azirdina, oxirano, o preferentemente con una porción maleimida). Compuestos tales como el maleimido monometoxi PEG son ejemplos de los compuestos de PEG activados de la invención. El término “PEG” pretende indicar polietilenglicol de un peso molecular que varía de 500 a 150.000 DA, incluyendo análogos de los mismos, en los que, por ejemplo, el grupo

15 OH terminal ha sido reemplazado por un grupo metoxi (al que se hace referencia como mPEG).

El PEG es una molécula polimérica adecuada, ya que esta tiene únicamente pocos grupos reactivos capaces de reticularse en comparación con los polisacáridos talas como dextrano. En particular, el PEG monofuncional, por ejemplo, metoxipolietilenglicol (mPEG), es de interés ya que su química de acoplamiento es relativamente simple (únicamente un grupo reactivo está disponible para la conjugación de los grupos de enlace en el polipéptido). Por

20 consiguiente, se elimina el riesgo de reticulación, los conjugados polipeptídicos resultantes son más homogéneos y la reacción de las moléculas poliméricas con el polipéptido es más fácil de controlar.

Para efectuar el enlace covalente de molécula o moléculas poliméricas con polipéptido, los grupos hidroxilo terminales de la molécula polimérica son proporcionados en forma activada, por ejemplo, con grupos funcionales reactivos. Las moléculas poliméricas activadas adecuadas están disponibles de forma comercial, por ejemplo, de Shearwater Corp., 25 Huntsville, Ala., USA, o de PolyMASC Pharmaceuticals pie, Reino Unido. De forma alternativa, las moléculas poliméricas se pueden activar por procedimientos convencionales conocidos en la técnica, como se divulga, por ejemplo, en el documento WO 90/13540. Ejemplos específicos de moléculas poliméricas lineales o ramificadas activadas para su uso en la presente invención se describen en los catálogos de 1997 y 2000 de Shearwater Corp. (Polímeros Biocompatibles Funcionalizados para la Investigación y Productos Farmacéuticos, Polietilenglicol y 30 Derivados). Ejemplos específicos de polímeros de PEG activados incluyen los siguientes PEG lineales: NHS-PEG (por ejemplo SPA-PEG, SSPA-PEG, SBA-PEG, SS-PEG, SSA-PEG, SC-PEG, SG-PEG y SCM-PEG) y NOR-PEG), BTC-PEG, EPOX-PEG, NCO-PEG, NPC-PEG, CDI-PEG, ALD-PEG, TRES-PEG, VS-PEG, IODO-PEG y MAL-PEG, y PEG ramificados tales como PEG2-NHS y los divulgados en las patentes de los Estados Unidos números 5,932,462 y 5,643,575. Por otro lado, las siguientes publicaciones divulgan moléculas poliméricas útiles y/o las químicas de 35 PEGilación: patente de los Estados Unidos N.º 5,824,778, patente de los Estados Unidos N.º 5,476,653, WO 97/32607, EP-229,108, EP 402 378, patente de los Estados Unidos N.º 4,902,502, patente de los Estados Unidos N.º 5,281,698, patente de los Estados Unidos N.º 5,122,614, patente de los Estados Unidos N.º 5,219,564, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, WO 95/13090, WO 95/33490; WO 96/-0Q080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837,

40 WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131, patente de los Estados Unidos N.º 5,736,625, WO 98/05363, EP 809 996, patente de los Estados Unidos N.º 5,629,384, WO 96/41813, WO 96/07670, patentes de los Estados Unidos Nos. 5,473,034, 5,516,673, EP 605 963, patente de los Estados Unidos N.º 5,382,657, EP 510 356, EP 400 472, EP 183 503 y EP 154 316.

45 La conjugación del polipéptido y las moléculas poliméricas activadas se lleva a cabo mediante el uso de cualquier procedimiento convencional, por ejemplo como se describe en las siguientes referencias (que también describen los procedimientos adecuados para la activación de las moléculas poliméricas): R.F. Taylor (1991), “Protein immobilisation. Fundamental and applications”, Marcel Dekker, N.Y.; S.S. Wong (1992), “Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking”, CRC Press, Boca Ratón; G.T. Hermanson et al., (1993), “Immobilized Affinity Ligand

50 Techniques”, Academic Press, N.Y.). El experto en la técnica conocerá que el procedimiento de activación y/o la química de conjugación que se van a usar, dependen del o de los grupos de enlace del polipéptido (ejemplos de los cuales se han dado antes), así como los grupos funcionales del polímero (por ejemplo amina, hidroxilo, carboxilo, aldehído, sulfhidrilo, succinimidilo, maleimida, vinilsulfona o haloacetato). La PEGilación puede estar dirigida a la conjugación con todos los grupos de enlace disponibles sobre el polipéptido (es decir, los grupos de enlace que están

55 expuestos en la superficie del polipéptido) o pueden estar dirigida a uno o más grupos de enlace específicos, por ejemplo, el grupo amino N-terminal (patente de los Estados Unidos N.º 5,985,265). Además, la conjugación se puede conseguir en una única etapa o en varias etapas (por ejemplo, como se describe en el documento WO 99/55377) .

Se entenderá que la PEGilación está diseñada para producir la molécula óptima con respecto al número de moléculas de PEG enlazadas, el tamaño y la forma de tales moléculas (por ejemplo si estas son lineales o ramificadas), y dónde 60 están enlazadas tales moléculas en el polipéptido. El peso molecular del polímero que se va a usar se elegirá tomando en consideración el efecto deseado que se quiere conseguir. Por ejemplo, si el propósito principal de la conjugación es obtener un conjugado que tenga un alto peso molecular y un tamaño más grande (por ejemplo, para reducir el aclaramiento renal), se puede elegir conjugar una o unas pocas moléculas poliméricas de alto peso molecular, o un número de moléculas poliméricas con un peso molecular más pequeño, para obtener el efecto deseado. De preferencia, sin embargo, se usarán varias moléculas poliméricas con un peso molecular más bajo. Este es también el 5 caso en el que desee un alto grado de protección de epítopo. En tales casos, se pueden usar, por ejemplo, 2 a 8 polímeros con un peso molecular de, por ejemplo, aproximadamente 5.000 Da, tal como 3 a 6 de tales polímeros. Como se ilustra en los ejemplos siguientes, puede ser ventajoso tener un número más grande de moléculas poliméricas con un menor peso molecular (por ejemplo, 4 a 6 con un peso molecular de 5.000) en comparación con un número más pequeño de moléculas poliméricas con un peso molecular más alto (por ejemplo, 1 a 3 con un peso molecular de 12.000 a 20.000) en términos de mejorar la vida media funcional in vivo del conjugado polipeptídico, incluso cuando el peso molecular total de las moléculas poliméricas enlazadas en los dos casos sea el mismo o similar. Se cree que la presencia de un mayor número de moléculas poliméricas más pequeñas proporciona el polipéptido con un diámetro más grande o tamaño aparente más grande que, por ejemplo, una única molécula polimérica aún más grande, al menos cuando las moléculas poliméricas están distribuidas de manera relativamente

15 uniforme sobre la superficie del polipéptido. Se ha encontrado además que se obtienen resultados ventajosos cuando el tamaño aparente (también denominado como “peso molecular aparente” o “masa aparente”) de al menos una porción importante del conjugado de la invención, es al menos aproximadamente 50 kDa, tal como de al menos aproximadamente 55 kDa, tal como al menos de aproximadamente 60 kDa, por ejemplo al menos aproximadamente 66 kDa. Se cree que esto es debido a que el aclaramiento renal se elimina sustancialmente para conjugados que tienen un tamaño aparente lo suficientemente grande. En el presente contexto, el “tamaño aparente” de un conjugado de IL-21 o polipéptido de IL-21 se determina mediante el procedimiento de SDS-PAGE.

En una realización de la invención, PEG se conjuga con un péptido de acuerdo con la presente invención y puede ser de cualquier peso molecular. En particular, el peso molecular puede variar de 500 a 100.000 Da, tal como de 500 a

60.000 Da, tal como de 1000 a 40.000 Da, tal como de 5.000 a 40.000 Da. En particular, en la presente invención se

25 pueden usar PEG con pesos moleculares de 10.000 Da, 20.000 Da o 40.000 Da. En todos los casos, los PEG pueden ser lineales o ramificados. En una realización de la invención, los grupos PEG son de 5 kDa, 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa, 40 kDa o 60 kDa.

En una realización de la invención, se añaden una o más moléculas poliméricas a IL-21 o un análogo del mismo.

El término “grupo lipófilo” está caracterizado porque comprende 4-40 átomos de carbono, y porque tiene una solubilidad en agua a 20 °C en el intervalo de aproximadamente 0,1 mg/100 ml de agua a aproximadamente 250 mg/100 ml de agua, tal como en el intervalo de aproximadamente 0,3 mg/100 ml de agua a aproximadamente 75 mg/100 ml de agua. Por ejemplo, el ácido octanoico (8 átomos de carbono) tiene una solubilidad en agua a 20 °C de 68 mg/100 ml, ácido decanoico (10 átomos de carbono) tiene una solubilidad en agua a 20 °C de 15 mg/100 ml, y el ácido octadecanoico (18. átomos de carbono) tiene una solubilidad en agua a 20 °C de 0,3 mg/100 ml.

35 Para obtener un perfil de acción prolongada satisfactorio del derivado de IL-21, el sustituyente lipófilo enlazado en la porción IL-21, como ejemplo, comprende 4 a 40 átomos de carbono, tal como 8 a 25 átomos de carbono. El sustituyente lipófilo puede estar enlazado a un grupo amino de una porción IL-21 por medio de un grupo carboxilo del sustituyente lipófilo que forma un enlace amida con un grupo amino del aminoácido al cual está enlazado. Como alternativa, el sustituyente lipófilo puede estar enlazado con dicho aminoácido de una manera tal que un grupo amino del sustituyente lipófilo forme un enlace amida con un enlace carboxilo del aminoácido. Como opción adicional, el sustituyente lipófilo puede estar enlazado al resto de IL-21 a través de un enlace éster. Formalmente, el éster puede estar formado, bien por reacción entre un grupo carboxilo de una porción IL-21 y un grupo hidroxilo del que va a ser sustituyente, o por reacción entre un grupo hidroxilo del resto de IL-21 y un grupo carboxilo del que va a ser sustituyente. Como alternativa adicional, el sustituyente lipófilo puede ser un grupo alquilo que se introduce dentro de

45 un grupo amino primario dentro de la porción IL-21.

En una realización de la invención, el derivado de IL-21 únicamente tiene un sustituyente lipófilo enlazado al polipéptido IL-21.

En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo comprende de 4 a 40 átomos de carbono.

En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo comprende de 8 a 25 átomos de carbono.

En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo comprende de 12 a 20 átomos de carbono.

En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo está enlazado a un residuo de aminoácido, de una manera tal que un grupo carboxilo del sustituyente lipófilo forma un enlace amida con un grupo amino del residuo de aminoácido.

En otras realizaciones preferentes, las lisinas adicionales están sustituidas, insertadas dentro de la secuencia o 55 agregadas en el extremo N o en el extremo C, y luego opcionalmente derivatizadas.

Las regiones preferentes de inserciones se dan donde la actividad total de la proteína no se ve afectada de manera adversa.

En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo está enlazado a un residuo de aminoácido, de manera tal que un grupo” amino del sustituyente lipófilo forme un enlace amida con un grupo carboxilo del residuo de aminoácido.

En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo es enlazado al péptido IL-21 por medio de un espaciador.

En una realización de la invención, el espaciador es un grupo ácido alcano a,w-dicarboxílico no ramificado que tiene 5 de 1 a 7 grupos metileno, tal como dos grupos metileno cuyo espaciador forma un puente entre un grupo amino del péptido IL-21 y un grupo amino del sustituyente lipófilo.

En una realización de la invención, el espaciador es un residuo de aminoácido, excepto un residuo de Cys, o un dipéptido. Ejemplos de espaciadores adecuados incluyen �-alanina, ácido gamma-aminobutírico (GABA), ácido y-glutámico, ácido succínico, Lys, Glu o Asp, o un dipéptido tal como Gly-Lys. Cuando el espaciador es ácido 10 succínico, un grupo carboxilo del mismo puede formar un enlace amida con un grupo amino del residuo de aminoácido, y el otro grupo carboxilo del mismo puede formar un enlace amida con un grupo amino del sustituyente lipófilo. Cuando el espaciador es Lys, Glu o Asp, el grupo carboxilo del mismo puede formar un enlace amina con un grupo amino del residuo de aminoácido, y el grupo amino del mismo puede formar un enlace amida, con un grupo carboxilo del sustituyente lipófilo. Cuando se usa Lys como el espaciador, un espaciador adicional puede en algunos casos

15 insertarse entre el grupo £-amino de Lys y el sustituyente lipófilo. En una realización, dicho espaciador adicional es ácido succínico que forma un enlace amida con el grupo £-amino de Lys, y con un grupo amino presente en el sustituyente lipófilo. En una realización, dicho espaciador adicional es Glu o Asp que forma un enlace amida con el grupo £-amina de Lys y otro enlace amida con un grupo carboxilo presente en el sustituyente lipófilo, es decir, el sustituyente lipófilo es un residuo de lisina N£-acilada.

20 En una realización de la invención, el espaciador se selecciona de la lista que consiste en �-alanina, ácido gamma-aminobutírico (GABA), ácido y-glutámico, Lys, Asp, Glu, un dipéptido que contiene Asp, un dipéptido que contiene Glu, o un dipéptido que contiene Lys. En una realización de la invención, el espaciador es �-alanina. En una realización de la invención, el espaciador es ácido gamma-aminobutírico (GABA). En una realización de la invención el espaciador es ácido y-glutámico.

25 En una realización de la invención, un grupo carboxilo del péptido de IL-21 progenitor forma un enlace amida con un grupo amino de un espaciador, y el grupo carboxilo del aminoácido o el espaciador dipéptido forma un enlace amida con un grupo amino del sustituyente lipófilo.

En una realización de la invención, un grupo amino del péptido de IL-21 progenitor forma un enlace amida con un grupo carboxílico de un espaciador, y el grupo amino del espaciador forma un enlace amida con un grupo carboxilo del

30 sustituyente lipófilo.

En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo comprende una estructura de ciclopentanofenantreno parcial

o completamente hidrogenado.

En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo es un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada. En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo es el grupo acilo de un ácido graso de cadena lineal o ramificada.

35 En una realización de la invención, el grupo acilo de un sustituyente lipófilo se selecciona del grupo que comprende CH3(CH2)nCO-, en el que n es 4 a 38, tal como CH3(CH2)6CO-, CH3(CH2)8CO-, CH3(CH2)10CO-, CH3(CH2)12CO-, CH3(CH2)14CO-, CH3(CH2)16CO-, CH3(CH2)18CO-, CH3 (CH2)20CO- y CH3(CH2)22CO-.

En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo es un grupo acilo de un ácido alcano a,w-dicarboxílico de cadena lineal o ramificada.

40 En una realización de la invención, el grupo acilo del sustituyente lipófilo se selecciona del grupo que comprende HOOC(CH2)mCO-, en el que m es 4 a 38, tal como HOOC(CH2)14CO-, HOOC(CH2)16CO-, HOOC(CH2)18CO-, HOOC(CH2)20CO- y HOOC(CH2)22CO-.

En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo es un grupo de la fórmula CH3(CH2)P((CH2)qCOOH)CHNH-CO(CH2)2CO-, en el que p y q son número enteros y p+q es un número entero de 8 a

45 40, tal como de 12 a 35.

En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo es un grupo de la fórmula CH3(CH2)rCO-NHCH(COOH)(CH2)2CO-, en el que r es un número entero de 10 a 24.

En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo es un grupo de la fórmula CH3(CH2)sCO-NHCH((CH2)2COOH)CO-, en el que s es un número entero de 8 a 24.

50 En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo es un grupo de la fórmula COOH(CH2)tCO-, en el que t es un número entero de 8 a 24.

En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo es un grupo de la fórmula -NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)uCH3, en el que u es un número entero de 8 a 18.

En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo es un grupo de la fórmula -NHCH(COOH)(CH2)4NH-COCH((CH2)2COOH)NH-CO(CH2)wCH3, en el que w es un número entero de 10 a 16.

En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo es un grupo de la fórmula -NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO-(CH2)2CH(COOH)NH-CO(CH2)XCH3, en el que x es un-número entero de 10 a 16.

5 En una realización de la invención, el sustituyente lipófilo es un grupo de la fórmula -NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)2CH(COOH)NHCO(CH2)yCH3, en el que y es cero o un número entero de 1 a 22.

En una realización de la invención el sustituyente lipófilo es N-litocoloilo.

En una realización de la invención el sustituyente lipófilo es N-coloilo.

En una realización de la invención, el derivado de IL-21 tiene un sustituyente lipófilo. En una realización de la invención

10 el derivado de IL-21 tiene dos sustituyentes lipófilos. En una realización de la invención, el derivado de IL-21 tiene tres sustituyentes lipófilos. En una realización de la invención, el derivado de IL-21 tiene cuatro sustituyentes lipófilos.

En el presente contexto, las palabras “péptido” y “polipéptido” y “proteína” se usan de forma indistinta y pretenden indicar lo mismo.

IL-21 y variantes de la misma pueden ser expresados en E-coli como se describe en el documento WO 04/55168.

15 Opcionalmente, las variantes de la IL-21 pueden ser producidas mediante técnicas de ADN recombinante en otros organismos. Para este fin, las secuencias de ADN que codifican los polipéptidos relacionados con IL-21 -humano, o las variantes de IL-21, pueden ser aislados mediante preparación de una biblioteca genómica o de ADNc y rastreando las secuencias de ADN que codifican toda o parte de la proteína mediante hibridación, usando sondas oligonucleotídicas sintéticas de acuerdo con las técnicas convencionales. Para el presente propósito, la secuencia de ADN que codifica la

20 proteína es preferentemente de origen humano, por ejemplo, derivada de un ADN genómico humano o biblioteca de ADNc.

Los polipéptidos proteicos descritos en el presente documento, incluyendo las proteínas de longitud completa, los fragmentos de proteína (por ejemplo fragmentos de unión a ligando), y polipéptidos de fusión, se pueden producir en células huésped manipuladas por ingeniería genética, de acuerdo con técnicas convencionales. Las células huésped 25 adecuadas son aquellos tipos de células que pueden ser transformadas o transfectadas con el ADN exógeno y desarrolladas en cultivo, e incluyen bacterias, células fúngicas y células eucarióticas superiores cultivadas. Se prefieren las células eucarióticas, particularmente células cultivadas de organismos multicelulares. Las técnicas para manipular las moléculas de ADN clonadas e introducir ADN exógeno en diversas células huésped se describen por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring 30 Harbor, NY, 1989), y Ausubel et al., ibid. Se debe reconocer que cuando un ADNc se ha descrito antes, se entiende que lo que se describe son la hebra de polaridad positiva, la hebra de polaridad negativa y el ADN de doble hebra que tiene la hebra de polaridad positiva y negativa recocidas juntas por sus respectivos puentes de hidrógeno. También se describe un ARN mensajero (ARNm) que codifica los polipéptidos, y cuyo ARN es codificado por el ADNc anteriormente descrito. Un ARN mensajero (ARNm) codificará un polipéptido usando los mismos codones que los que

35 se han definido anteriormente, con la excepción de que cada nucleótido de timina (T) es reemplazado por un nucleótido de uracilo (U).

Para dirigir un polipéptido de IL-21 a la vía secretora de una célula huésped, se proporciona una secuencia de señal secretora (también conocida como una secuencia guía, secuencia prepro o secuencia pre) en el vector de expresión. La secuencia de señal secretora puede ser la de la proteína, o puede estar derivada de otra proteína secretada, por

40 ejemplo, o sintetizada de novo. La secuencia de señal secretada está unida a la secuencia de ADN de IL-21 en el marco de lectura correcto. Las secuencias de señal secretoras se sitúan comúnmente 5' respecto a la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de interés, aunque ciertas secuencias de señal pueden estar situadas en cualquier otro sitio en la secuencia de ADN de interés (véase por ejemplo, Welch et al., patente de los Estados Unidos N.º 5,037, 743; Holland et al., patente de los Estados Unidos N.º 5,143, 830).

45 La identidad porcentual de secuencia entre las dos secuencias de aminoácidos se determina por una alineación de Needelman-Wunsch, útil para alineaciones de proteínas y de ADN. Para alineaciones de proteínas, la matriz de calificación por defecto usada es BLOSUM50, y la penalidad para el primer residuo en un espacio vacío es -12, mientras que la penalidad para los residuos adicionales en un espacio vacío es -2. La alineación se puede realizar con el software Align del paquete FASTA versión v20u6 (W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), “Improved Tools for

50 Biological Sequence Analysis”, PNAS 85: 2444- 2448; y W. R. Pearson (1990) “Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA”, Methods in Enzymology, 183: 63-98).

El polipéptido descrito en el presente documento puede ser un polipéptido aislado. El polinucleótido descrito en el presente documento puede ser un polinucleótido aislado.

Se prefiere purificar los polipéptidos de la presente invención hasta una pureza > 80 %, más preferentemente hasta

55 una pureza >90 %, incluso más preferentemente una pureza > 95 % con respecto a las macromoléculas contaminantes, en particular otras proteínas y ácidos nucléicos, y exentos de agentes infecciosos y pirógenos, y de forma particular se prefiere un estado farmacéuticamente puro, que es más del 98 % puro o preferentemente mayor del 99,9 % puro con respecto a las macromoléculas contaminantes, particularmente otras proteínas y ácidos nucléicos, y exento de agentes infecciosos y pirógenos. Preferentemente, un polipéptido purificado está sustancialmente exento de estos polipéptidos, particularmente otros polipéptidos de origen animal.

5 La memoria descriptiva proporciona la siguiente lista de componentes o agentes que se pueden ser usar junto con IL-21en terapia de combinación del cáncer.

I.

a) Agentes quimioterapéuticos convencionales

La terapia de combinación se puede llevar a cabo administrando IL-21, análogos o derivados del mismo y agentes

10 quimioterapéuticos convencionales. Los agentes quimioterapéuticos tienen diferentes modos de acción tales como los influenciados

a) a nivel de ADN

b) a nivel de ARN

Ejemplos no limitantes de agentes quimioterapéuticos convencionales a nivel de ADN o a nivel de ARN son

15 anti-metabolitos (tales como azatioprina, citarabina, fosfato de fludarabina, fludarabina, gemcitabina, citarabina, cladribina, capecitabina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, metotrexato, 5-fluouracilo, e hidroxiurea), agentes alquilantes (tales como melfalán, busulfán, cisplatino, carboplatino, ciclofosfamida, ifosfamida, dacarbazina, procarbazina, clorambucilo, tiotepa, lomustina, temozolamida), agentes anti-mitóticos (tales como vinorelbina, vincristina, vinblastina, docetaxel, paclitaxel), inhibidores de la topoisomerasa (tales como doxorrubicina, amsacrina,

20 irinotecan, daunorrubicina, epirrubicina, mitomicina, mitoxantrona, idarrubicina, teniposido, etoposido, topotecan), antibióticos (tales como actinomicina y bleomicina), asparaginasa o las antraciclinas o los taxanos.

En una realización de la invención, la terapia de combinación se lleva a cabo mediante usando IL-21 y dacarbazina (DTIC).

b) Radioterapia:

25 Ciertos tumores se pueden tratar con radiación o productos radiofarmacéuticos. La fuente de radiación puede ser externa o interna para el paciente que se trata. Cuando la fuente es externa para el paciente, la terapia se conoce como terapia de radiación de haz externo (EBRT). Cuando la fuente de radiación es interna al paciente, el tratamiento se denomina braquiterapia (BT). Los átomos radioactivos típicos que se han usado incluyen radio, cesio-137, iridio-192, americio-241, oro-198, cobalto-47, cobre-67, tecnecio-99, yodo-123, yodo-131 e indio-111.

30 La radioterapia es el tratamiento convencional para controlar tumores no resecables o inoperables y/o metástasis tumorales. Se han observado resultados mejorados cuando la radioterapia se ha combinado con otros tratamientos.

Se puede administrar IL-21, un análogo o derivado del mismo en combinación con radioterapia, como se define en las reivindicaciones.

Los anticuerpos monoclonales (mAb) se han desarrollado para el tratamiento de leucemia y linfoma, así como de

35 tumores sólidos, y este principio tiene cada vez más interés. Estos anticuerpos funcionan inhibiendo funciones que son vitales para la supervivencia de las células tumorales, suministrando una carga tóxica, interrumpiendo eventos de señalización claves, o mediante inducción de citotoxicidad mediada por células dependientes del anticuerpo (ADCC) o citotoxicidad dirigida al complemento (CDC) contra las células tumorales. La muerte de las células tumorales podría conducir a la liberación de antígenos tumorales que “vacunen” el sistema inmunitario y lo estimulen para producir una

40 respuesta secundaria que se dirige luego a la célula tumoral (por ejemplo “vacuna interna” como se describe más adelante). Los oncogenes sobre-expresados y los antígenos específicos de tumor son objetivos clave para muchos mAb en desarrollo.

Se describen antígenos tumorales, por ejemplo, en Stauss H, Kawakami Y and Parmiani G: Tumor antigens recognized by T cells and antibodies. Taylor and Frances (2003). La memoria descriptiva describe anticuerpos

45 producidos contra estas dianas y anticuerpos producidos contra antígenos víricos.

Se puede combinar IL-21 con anticuerpos tales como Rituximab, Alemtuzumab, Trastuzumab, Gemtuzumab, Gemtuzumab-ozogamicina (Myelotarg®, Wyeth) Cetuximab (Erbitux™), Bevacizumab, HuMax-CD20, HuMax-EGFr, Zamyl y Pertuzumab, como se define en las reivindicaciones.

Se puede combinar IL-21 con Rituximab, como se define en las reivindicaciones.

50 Se puede combinar IL-21 con Cetuximab, como se define en las reivindicaciones.

Se puede combinar IL-21 con un anticuerpo contra el factor tisular, receptores del tipo Ig citolítica (KIR), laminina-5, EGF-R, VEGF-R, PDGF-R, HER-2/neu, o un anticuerpo contra un antígeno tumoral tal como PSA, PSCA, CEA, CA125, KSA, etc.

Se puede combinar IL-21 con un anticuerpo terapéutico, tales como los citados antes, y combinar además con otros compuestos que potencian ADCC, por ejemplo, anticuerpos anti-KIR de bloqueo, agonistas de NKG2D, antagonistas 5 de NKG2A, IL-2, IL-12, IL-15 o IL-21.

Se puede combinar IL-21 con anticuerpos contra los antígenos víricos.

d) Reguladores del control del ciclo celular/apoptosis

Una serie de reguladores están implicados en el mantenimiento del ciclo celular normal. Los compuestos, que se dirigen a los reguladores tales como (i) cdc-25 (con NSC 663284 como ejemplo no limitante (Pu et al. (2003) J Biol 10 Chem 278, 46877)), (ii) cinasas dependientes de ciclina que sobreestimulan el ciclo celular (con los siguientes ejemplos no limitantes: flavopiridol (L868275, HMR1275; Aventis), 7-hidroxitaurosporina (UCN-01, KW-2401; Kyowa Hakko Kogyo) y roscovitina (R-roscovitina, CYC202; Cyclacel) como se revisa por Fischer & Gianella-Borradori (2003) Exp Op Invest Drugs 12, 955-970), y (iii) telomerasa, la enzima que ayuda a las células cancerosas a reconstruir sus telómeros están dentro de la presente invención, tales como los siguientes ejemplos no limitantes BIBR1532 (Damm 15 et al. (2001) EMBO J 20, 6958-6968) y SOT-095 (Tauchi et al. (2003) Oncogene 22, 5338-5347). Además, están dentro de la presente invención los fármacos que interfieren con las vías apoptóticas, tales como los siguientes ejemplos no limitantes: el ligando que induce apoptosis relacionado con TNF (TRAIL)/ligando de apoptosis 2 (Apo-2L), anticuerpos que activan los receptores de TRAIL, IFNa y Bcl-2 anti-sentido (véase Igney and Krammer (2002) Nature Rev. Cancer 2, 277-288; Makin and Dive (2003) Trends Mol Med 9, 2519; Smyth. et al. (2003) Immunity

20 18, 1-6; Panaretakis et al. (2003) Oncogene 22, 4543-4556 y referencias en los mismos) . Se puede combinar IL-21 con uno o más reguladores del ciclo celular y/o agentes inductores de apoptosis en el que los compuestos se seleccionan del grupo que comprende cdc-25, NSC 663284, flavopiridol, 7-hidroxitaurosporina, roscovitina, BIBR1532 SOT-095, ligando que induce apoptosis relacionado con TNF (TRAIL)/ligando de apoptosis-2 (Apo-2L), anticuerpos que activan los receptores de TRAIL, IFNa y-Bcl-2 anti-sentido, como se define en las reivindicaciones.

25 e) Inhibidores del factor de crecimiento

Están en desarrollo una serie de anticuerpos monoclonales mAb contra factores de crecimiento y receptores del factor de crecimiento para el tratamiento del cáncer. De este modo, como ejemplo no limitante, los miembros de la familia del receptor del crecimiento epidérmico (EGF-R) están activados de modo anómalo en muchos tumores epiteliales, que frecuentemente se relacionan con un curso clínico más agresivo. Los anticuerpos dirigidos contra el dominio de unión

30 a ligando extracelular de estos receptores, y las moléculas de bajo peso molecular que inhiben sus dominios de tirosina-cinasa están en la última fase de desarrollo clínico o aprobados para el tratamiento del cáncer, ya sea como agentes aislados o en combinación con otros fármacos para el cáncer. Ejemplos no limitantes son herceptina (anticuerpo monoclonal), cetuximab (anticuerpo monoclonal), tarceva (inhibidor de bajo peso molecular), e iressa (inhibidor de bajo peso molecular). Además, el ligando puede ser neutralizado antes del enlace al receptor.

35 Se puede combinar IL-21 con inhibidores del factor de crecimiento como se define en las reivindicaciones.

Los inhibidores del factor de crecimiento se pueden seleccionar del grupo que comprende herceptina (anticuerpo monoclonal), cetuximab (anticuerpo monoclonal), tarceva (inhibidor de bajo peso molecular), e iressa (inhibidor de bajo peso molecular).

Se puede combinar IL-21 con herceptina como se define en las reivindicaciones.

40 f) Inhibidores de la vascularización tumoral (fármacos anti-angiogénesis y anti-metastásicos)

El crecimiento tumoral es dependiente de un suministro suficiente de sangre y, por tanto, del desarrollo de nuevos vasos sanguíneos. Esta característica general de los tumores sólidos parece atractiva desde un punto de vista terapéutico, por ejemplo, se esperan el crecimiento reducido del tumor y la regresión del tumor cuando se tratan pacientes con cáncer con fármacos anti-angiogénesis. En la actualidad, más de 60 fármacos anti-angiogénicos están 45 en ensayos clínicos, incluyendo la endostatina y angiostatina de origen natural (revisado en Marx (2003) Science 301, 452-454). Pero también los fármacos quimioterapéuticos más antiguos, otras medicinas y radioterapia tienen efectos anti-angiogénicos. En las reivindicaciones se definen la terapia de combinación con IL-21 y uno o más agentes anti-angiogénicos, tales como los siguientes ejemplos no limitantes, endostatina, angiostatina, anticuerpos que bloquean los factores que inician la angiogénesis (por ejemplo, anti-VEGF, avastina), compuestos de bajo peso 50 molecular que inhiben la angiogénesis al inhibir los elementos clave en las vías de transducción de señales relevantes.

Atacar la vasculatura del tumor y la matriz extracelular ha despertado un interés creciente. Los siguientes principios han sido desarrollados hasta ahora. El bloqueo de las células endoteliales, la administración de angiostatina y endostatina, la dirección de VEGF y la matriz extracelular. Se puede combinar IL-21 con un fármaco anti-angiogénesis, como se define en las reivindicaciones.

55 El fármaco anti-angiogénesis se puede seleccionar del grupo que comprende: avastina, neovastat, talidomida, PTK787, ZK222584, ZD-6474, SU6668, PD547, 632, VEGF-Trap, CEP-7055, NM-3, SU11248.

g) Dirección a objetivos víricos

La dirección a objetivos víricos usa un virus recombinante -normalmente incompetentes en la replicación- para destruir un tumor directamente. En la práctica, se produce al menos una ronda de replicación antes de que el virus sea

5 incapacitado. Por ello, el tumor se lisa, lo cual frecuentemente conduce a inmunización sistémica con la protección resultante. Esta técnica se ha refinado más usando modificación genética para aumentar la respuesta inmunitaria. Por ejemplo, la inserción genética de un gen GM-GSF humano en un vector del virus de herpes simple tipo 2 se ha usado para mejorar la eficacia de la vacuna. La terapia de combinación se puede llevar a cabo administrando IL-21 y la dirección al objetivo viral.

10 h) Agentes hormonales

Los agentes hormonales son conocidos principalmente en el tratamiento de cánceres dependientes de hormonas tales como cáncer de ovario, cáncer de mama y cáncer de próstata, tales como la terapia antiandrógeno y anti-estrógenos. Las hormonas y anti-hormonas son compuestos tales como fosfato de estramustina, fosfato de poliestradiol, estradiol, anastrozol, exemestano, letrozol, tamoxifeno, acetato de megestrol, acetato de

15 medroxiprogesterona, octreotida, acetato de ciproterona, bicaltumida, flutamida, tritorelina, leuprorelina, buserelina o goserelina.

Se puede combinar IL-21 con terapia hormonal, como se define en las reivindicaciones.

II. Agentes que aumentan la respuesta inmunitaria contra células tumorales o células infectadas con el virus

J) La siguiente lista de componentes o agentes que se pueden usar junto con IL-21, análogos o derivados del mismo 20 en terapia de combinación del cáncer, mejorando la eficacia del sistema inmunitario.

Adyuvantes:

La inmunoterapia consiste en modalidades específicas y no específicas. Como ejemplos de inmunoterapia no específica están los adyuvantes que actúan principalmente como catalizadores para iniciar una respuesta inmunitaria. Ejemplos no limitantes de tales adyuvantes de vacuna son QS21, GM-CSF y CpG, oligodesoxinucleótidos,

25 lipopolisacárido y ácido poliinosínico : policitidílico.

Se puede combinar IL-21 con uno o más adyuvantes, como se define en las reivindicaciones.

Los adyuvantes se pueden seleccionar del grupo que comprende: QS21, GM-CSF y CpG, oligodesoxinucleótidos, lipopolisacárido y ácido poliinosínico : policitidílico, a-galactosilceramida o análogos de la misma, diclorhidrato de histamina o hidróxido de aluminio.

30 Citocinas

Ejemplos no limitantes de citocinas son IFN-a, IFN-, IFN-y, IL-2, PEG-IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, GM-CSF, ligando o factor de células madre.

Se puede combinar IL-21 con una o más citocinas, como se define en las reivindicaciones.

Se puede combinar IL-21 con uno o más de los compuestos seleccionados del grupo que comprende: IFN-a, IFN-,

35 IFN-y, IL-2, PEG-IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, GM-CSF, ligando Flt3 o factor de células madre, como se define en las reivindicaciones.

En una realización de la invención, los compuestos se seleccionan del grupo que comprende: IFN-a, IFN-, IFN-y, PEG-IL-2, IL-18, IL-23, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29. Se puede combinar IL-21 con uno de los siguientes: IL-2, PEG-IL-2, IL-7, IL-12, IL-15 e IFN-a. Se puede combinar IL-21 con IL-12. Se puede combinar IL-21 con IFN-a, como

40 se define en las reivindicaciones. Se puede combinar IL-21 con IFN-a, como se define en las reivindicaciones. Se puede combinar IL-21 con PEG-IL-2.

Se puede combinar IL-21 con más de uno de los siguientes: IL-2, PEG-IL-2, IL-7, IL-12, IL-15 e IFN-a. Se puede combinar IL-21 con al menos uno de los siguientes: IL-2, PEG-IL-2, IL-7, IL-12, IL-15 e IFN-a y un componente activo adicional. Se puede combinar IL-21 con al menos uno de los siguientes: IL-2, PEG-IL-2, IL-7, IL-1 2, IL-15 e IFN-a y al

45 menos una citocina adicional de la lista anterior. Se puede combinar IL-21 con IFN-a a y GM-CSF.

Se puede combinar IL-21 con IFN-a y timopentina.

Se puede combinar IL-21 con IFN-y.

Se puede combinar IL-21 con TiLs autólogos e IFN-a.

Se puede combinar IL-21 con IFN-a e IL-12.

Se puede combinar IL-21 con Cisplatino e IFN-a. Se puede combinar IL-21 con Cisplatino, tamoxifeno e IFN-a. Se puede combinar IL-21 con Cisplatino, DTIC, tamoxifeno e IFN-a. Se puede combinar IL-21 con Cisplatino, DTIC, tamoxifeno y GM-CSF.

5 Se puede combinar IL-21 con Cisplatino, Carmustina, DTIC e IFN-a. Se puede combinar IL-21 con Cisplatino, Carmustina, DTIC, tamoxifeno e IFN-a. Se puede combinar IL-21 con Cisplatino, Carmustina, DTIC, carboplatino, tamoxifeno e IFN-a. Se puede combinar IL-21 con Cisplatino, DTIC, Vinblastina, tamoxifeno e IFN-a. Se puede combinar IL-21 con Cisplatino, Vinblastina, temozolomida e IFN-a.

10 Se puede combinar IL-21 con Cisplatino, Carmustina, DTIC, Vindesina, tamoxifeno e IFN-a. Se puede combinar IL-21 con Cisplatino, tamoxifeno e IFN-a. Se puede combinar IL-21 con Cisplatino, Vinblastina, DTIC e IFN-a. Se puede combinar IL-21 con DTIC e IFN-a. Se puede combinar IL-21 con DTIC, GM-CSF e IFN-a.

15 Se puede combinar IL-21 con DTIC, timosina-a e IFN-a. Se puede combinar IL-21 con Vinblastina e IFN-a. Se puede combinar IL-21 con 5-fluorouracilo e IFN-a. Se puede combinar IL-21 con Fotemustina e IFN-a. Se puede combinar IL-21 con DTIC y células LAK autólogas.

20 Se puede combinar IL-21 con Gemcitabina e IFN-a. Se puede además cualquiera de las combinaciones anteriores con IL-2.

Inmunoterapia celular

Ejemplos de inmunoterapia celular (o inmunoterapia adoptiva) incluyen la reinfusión de células T que se infiltran en tumores, expandidas ex vivo, o células T genéticamente modificadas.

25 La terapia de combinación puede combinar la administración de IL-21, un análogo o derivado del mismo e inmunoterapia celular.

La inmunoterapia celular puede incluir el aislamiento de células que pueden estimular o ejercer una respuesta anticancerosa de los pacientes, expandir estas a grandes números, y reintroducir las mismas en el mismo o en otro paciente. En otro aspecto, estas pueden ser células T CD4+ o CD8+ que reconocen antígenos específicos del tumor o 30 antígenos asociados a tumor. En otro aspecto más, estas pueden ser células B que expresan anticuerpos específicos para los antígenos específicos del tumor o antígenos asociados a tumor. En otro aspecto más, estas pueden ser células NK que son capaces de matar las células tumorales. En un aspecto preferente, estas pueden ser células dendríticas (DC) que se cultivan ex vivo con un agente de expansión de DC (por ejemplo GM-CSF o Flt3-L), cargadas con antígenos específicos del tumor o antígenos asociados a tumor y reinfundidas dentro de un paciente que lo 35 necesite. La terapia de combinación puede combinar IL-21 y terapia adoptiva, como se define en las reivindicaciones.

La terapia celular adoptiva puede comprender células CD4+ o CD8+ que reconocen antígenos específicos de tumor o antígenos asociados a tumor, como se define en las reivindicaciones.

La terapia celular adoptiva puede comprender células B que expresan anticuerpos específicos para los antígenos específicos del tumor o antígenos asociados a tumor, como se define en las reivindicaciones.

40 La terapia celular adoptiva puede comprender células NK que son capaces de matar las células tumorales, como se define en las reivindicaciones.

La terapia celular adoptiva puede comprender células dendríticas (DC) , como se define en las reivindicaciones.

Las células dendríticas se pueden cultivar in vivo con un agente de expansión DC (por ejemplo GM-CSF o Flt3-L), cargado con antígenos específicos del tumor o antígenos asociados a tumor y reintroducidas in vivo.

k) Agentes que bloquean la señalización inhibidora en el sistema inmunitario

Las respuestas inmunitarias, incluyendo las respuestas antitumorales y antivíricas, están reguladas por un equilibrio

5 en señalización mediante receptores estimuladores e inhibidores en células del sistema inmunitario. Un cambio hacia una señalización abundante a través de receptores activadores puede conducir a respuestas inmunitarias más eficaces, mientras que una señalización aumentada a través de receptores inhibidores puede conducir a respuestas menos productivas, o incluso puede deteriorar la inmunidad. Con el fin de aumentar las respuestas antitumorales o antivíricas, es útil bloquear terapéuticamente la señalización a través de receptores inhibidores, con el fin de desplazar

10 el equilibrio hacia la activación. Por tanto, los agentes que bloquean los receptores inhibidores, o las vías de señalización inhibidoras, son agentes preferentes para el tratamiento de combinación, junto con IL-21, un análogo o derivado del mismo. Los ejemplos no limitantes de tales agentes que bloquean los receptores inhibidores son mAb específicos para CTLA-4 (anti-CTLA-4), mAb específicos para KIR (anti-KIR), mAb específicos para LIR (anti-LIR), mAb específicos para CD94 (anti-CD94), o mAb específicos para NKG2A (anti-NKG2A).

15 Los agentes antianérgicos son compuestos pequeños, proteínas, glucoproteínas o anticuerpos que pueden romper la tolerancia a los antígenos tumorales y cancerosos.

Aunque la presencia de linfocitos que se infiltran en tumores (TIL) se relaciona con el resultado clínico mejorado en una serie de diferentes formas de cáncer, existe claramente la necesidad de mejorar la actividad de estos TIL debido a la anergia o tolerancia a antígenos tumorales. La condición anérgica puede, en un número considerable de casos, ser 20 contraatacada por anticuerpos monoclonales que previenen la anergia o tolerancia inducida por CTLA-4. El bloqueo de CTLA-4 ha mostrado en modelos animales, y en pacientes humanos con cáncer, que mejora la efectividad de la terapia contra el cáncer, sugiriendo que el bloqueo de CTLA-4 se puede usar para romper la tolerancia a los antígenos cancerosos o tumorales. Un ejemplo no limitante de un anticuerpo monoclonal que se puede usar para la inducción de la actividad de TIL es MDX-010 (Phan et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 8372). La terapia de combinación

25 se puede llevar a cabo administrando IL-21 y uno o más agentes que rompen la tolerancia hacia el cáncer o hacia los antígenos tumorales, en la que el agente es MDX-010 o anticuerpos contra CTLA-4, como se define en las reivindicaciones.

Se puede combinar IL-21 con anticuerpos contra KIR.

Se puede combinar IL-21 con anticuerpos contra CD94.

30 Se puede combinar IL-21 con anticuerpos contra NKG2A.

Se puede combinar IL-21 con anticuerpos contra un receptor inhibidor expresado sobre una célula NK, una célula T o una célula NKT.

Se puede combinar IL-21 con un antagonista de un receptor inhibidor.

Se puede combinar IL-21 con un antagonista de una proteína de señalización implicada en la transmisión de señales 35 inhibidoras.

l) Vacunas terapéuticas

El desarrollo de casi todos los cánceres humanos implica alteraciones genéticas, y esto puede conducir a la expresión de moléculas alteradas en células tumorales y la sobrexpresión de moléculas normales, respectivamente. En principio, estos cambios deben conducir a una respuesta inmunitaria del huésped (supervivencia inmunitaria). Obviamente, esta

40 activación teórica del sistema inmunitario conduce únicamente a regresión espontanea del tumor en muy pocos casos excepcionales. Esto puede, entre otros factores, ser debido a la falta de “señales de peligro”, un fenómeno que atrae un interés cada vez mayor.

Los antígenos específicos del tumor se han identificado, y la vacunación con tales antígenos puede estimular el sistema inmunitario para erradicar el tumor. Los antígenos específicos del tumor (TSA) son un grupo relativamente

45 pequeño de antígenos ejemplificados por los antígenos de cáncer de testículo. Estos genes son silenciosos en el tejido normal pero son expresados por células cancerosas. Estos son marcadores altamente específicos de la enfermedad e incluyen el gen del antígeno de melanoma (MAGE) encontrado en el melanoma.

Los antígenos asociados a tumor (TAA) son usualmente antígenos de diferenciación expresados por células normales pero sobrexpresados masivamente en tejido canceroso. Los objetivos inicialmente pensados para ser 50 específicos para un cáncer particular son eficazmente muy comunes en muchos tumores, tales como los gangliósidos y los antígenos de mucina. Los antígenos de diferenciación clásicos incluyen MART-1 (antígeno del melanoma reconocido por las células T) y gp 100, ambos del melanoma, tirosinasa, antígeno carcinoembrionario (CEA) y gp 75.

Antígenos mutacionales: Las mutaciones puntuales son comunes en muchos cánceres, y frecuentemente se producen en un sitio similar, tal como la mutación común de los oncogenes P53 o ras. Se ha descrito la inducción in vitro de las respuestas de linfocitos T citotóxicos humanos (CTL) contra los péptidos de tipos mutante y de tipo silvestre p53. En un modelo de ratón, las células dendríticas pulsadas con p53 mutante fueron capaces de inducir CTL específicos de p53 e inhibir el crecimiento de tumores establecidos.

Antígenos víricos: Ciertos virus son oncogénicos y productos génicos codificados por estos virus pueden promover.

5 respuestas inmunitarias y, de este modo, servir como antígenos del cáncer. Un ejemplo son las proteínas E6 y E7 provenientes del virus de papiloma humano tipo 16, que han mostrado que inducen respuestas de linfocitos T citotóxicos, in vitro.

Los antígenos específicos del tumor, antígenos asociados a tumor y/o antígenos mutacionales y antígenos víricos, se pueden usar ya sea como péptidos, antígenos de un único agente purificados, recombinantes, combinaciones de 10 antígenos purificados recombinantes y/o purificados o combinados de antígeno aislados de células cancerosas o células tumorales, como una vacuna para promover una respuesta inmunitaria antitumoral. De igual forma, los péptidos, los antígenos de un único agente, purificados, recombinantes, combinaciones de antígenos recombinantes y/o purificados o combinados de antígeno aislados de células infectadas con virus se pueden usar en una vacuna para promover una respuesta contra las células infectadas con el virus. Las vacunas terapéuticas pueden también estar en 15 la forma de liados o extractos de células tumorales autólogas, o lisados o extractos de líneas celulares tumorales alogénicas. Las vacunas terapéuticas también pueden estar en la forma de una vacuna de ADN para promover la respuesta inmunitaria contra el cáncer y las células infectadas con el virus. Dicha vacuna de ADN puede consistir en un vector de expresión que codifica el antígeno solo, que codifica el antígeno junto con una citocina (por ejemplo GM-CSF, IL-2, IL-12 o IL-21) que puede mejorar la respuesta inmunitaria contra el cáncer y células infectadas con el 20 virus. Dicha vacuna de ADN puede también consistir en un virus modificado (por ejemplo virus de la viruela aviar, virus de la vaccinia o adenovirus) que contiene una secuencia de ADN que codifica el antígeno solo o que codifica el antígeno junto con una citocina. Las vacunas terapéuticas también pueden estar en la forma de anticuerpos anti-idiotípicos para promover la respuesta inmunitaria contra el cáncer y las células infectadas con el virus. Las vacunas terapéuticas también pueden estar en la forma de células dendríticas autólogas cargadas con antígenos o

25 péptidos derivados de los mismos, junto con un agente modificador de DC, tales como citocinas, agonistas del receptor del tipo toll (TLR), oligodesoxinucleótidos CpG, GM-SS-F y proteínas de choque térmico.

La obtención mediada por vacuna de una respuesta antitumoral o una respuesta contra las células infectadas con el virus se puede potenciar administrando adyuvantes, citocinas, agonistas del receptor similar a toll (TLR), oligodesoxinucleótidos CpG, células dendríticas, GM-CSF o proteínas de choque térmico.

30 La terapia de combinación se puede llevar a cabo usando IL-21 y una o más vacunas terapéuticas con o sin adyuvantes, citocinas, agonistas del receptor similar a toll (TLR), oligodesoxinucleótidos CpG, células dendríticas, GM-CSF o proteínas de choque térmico, como se define en las reivindicaciones.

Agentes que interfieren con el crecimiento tumoral, la metástasis o la dispersión de las células infectadas con virus

35 n) Las células cancerosas metastásicas penetran en la matriz extracelular (ECM) y la membrana basal de los vasos sanguíneos para metastatizarse hacia un órgano objetivo (sitio ectópico). Las EMC consisten en proteínas incrustadas en un complejo de carbohidrato (peptidoglucanos de sulfato de heparan), y las proteasas que rodean el tumor son activas en la descomposición del tejido del huésped. Los agentes antimetastásicos antagonizan el efecto de tales proteasas (por ejemplo, inhibidores de metaloproteinasa) (Coussens et al. Science 2002; 295: 2387-2392). La terapia

40 de combinación con IL-21 y uno o más agentes antimetastásicos, tales como inhibidores de metaloproteinasa se define en las reivindicaciones.

IV. Vacunación interna

IV. “Vacunación interna” y “terapia de vacunación interna” se refieren a la muerte celular inducida por fármacos o por radiación de células tumorales, que conduce a la promoción de una respuesta inmunitaria dirigida hacia (i) dichas 45 células tumorales en conjunto o (ii) partes de las células tumorales incluyendo (a) proteínas secretadas, glucoproteínas u otros productos, (b) proteínas asociadas a la membrana o glucoproteínas u otros componentes asociados con, o insertados en, membranas y (c) proteínas intracelulares u otros componentes intracelulares. La respuesta inmunitaria puede ser humoral (por ejemplo mediada por el anticuerpo - complemento) o mediada por células, incluyendo pero sin quedar limitada al desarrollo de linfocitos T citotóxicos que reconocieron células tumorales o partes de las mismas. La 50 vacunación interna tiene muchas similitudes con otros procedimientos de vacunación e implica muchos o todos de los mismos componentes celulares del sistema hematopoyético e inmunitario, con la ventaja de que los inmunógenos o componentes antigénicos son endógenos y, de este modo, representativos para el repertorio antigénico de las células tumorales. La vacunación interna puede ser considerada de este modo como la vacunación personalizada, la cual es promovida por el uso de procedimientos generales para el tratamiento del cáncer, que conduce a la muerte de las

55 células tumorales. Además de la radioterapia, ejemplos no limitantes de fármacos y agentes que pueden ser usados para inducir la muerte de las células tumorales y la vacunación interna son agentes quimioterapéuticos convencionales, inhibidores del ciclo celular, fármacos antiangiogénesis, anticuerpos monoclonales, agentes inductores de la apoptosis e inhibidores de la transducción de señales.

“IL-21 y terapia de combinación de vacunación interna” se refiere a la terapia de combinación en la que IL-21, un análogo o derivado del mismo se administra a pacientes con cáncer que son tratados con vacunación interna. IL-21, un análogo o derivado se pueden administrar antes de, de forma concomitante con, o después de, llevar a cabo la vacunación interna.

5 Se puede incluir IL en una terapia de vacunación interna.

La terapia génica incluye la transferencia de material genético en una célula para alterar de forma transitoria o permanente el fenotipo celular. Se investigan diferentes procedimientos para la distribución de citocinas, antígenos tumorales y moléculas estimuladoras adicionales. IL-21 puede ser el agente distribuido o coadministrado. Se puede administrar IL-21 como un polinucleótido. El polinucleótido es descrito en el documento WO 00/53761.

10 VI. Agentes inmunosupresores/inmunomoduladores

r) Agentes con influencia sobre el alojamiento de linfocitos T, por ejemplo FTY-720.

s) Los inhibidores de calcineurina tales como valspodar, PSC 833, son activos en la prevención del desarrollo de resistencia a agentes citotóxicos debido a los efectos inhibidores sobre MDR-1 y p-glucoproteína.

t) Los inhibidores de TOR actúan bloqueando la cinasa serina-treonina de mamíferos TOR (mTOR). Los compuestos

15 tales como sirolimus, everolimus y rapmicina son agentes antiproliferativos. Estos están implicados en las cascadas de la señalización corriente abajo y son, por tanto, relevantes en el tratamiento de todo tipo de tumores (por ejemplo propiedades antiangiogénicas).

COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS

IL-21 junto con el agente de combinación, como se define en las reivindicaciones, para su uso en tratamiento del

20 cáncer de acuerdo con la presente invención se puede administrar solo o en combinación con vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables, ya sea como monodosis o dosis múltiples. La formulación de la combinación puede estar en forma de monodosis que combina los compuestos, o puede ser formulada como dosis separadas. Las composiciones farmacéuticas que comprenden IL-21 junto con el agente de combinación para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la presente invención, pueden ser formulados con vehículos o diluyentes

25 farmacéuticamente aceptables así como con cualquier otro adyuvante y excipiente conocido de acuerdo con las técnicas convencionales tales como las descritas en Remington: The Science, and Practice of Pharmacy, 19ª Edición, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co. Easton, PA, 1995. Las composiciones pueden presentarse en formas convencionales, por ejemplo cápsulas, comprimidos, aerosoles, soluciones o suspensiones.

Las composiciones farmacéuticas se pueden formular específicamente para la administración por cualquier vía

30 adecuada tales como las vías oral, rectal, nasal, pulmonar, tópica (incluyendo bucal y sublingual), transdérmica, intracisternal, intraperitoneal, vaginal y parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intratumoral, intratecal, intravenosa e intradérmica). Se apreciará que la vía preferente dependerá de la condición general y la edad del sujeto que se trate, de la naturaleza del trastorno que se trate y del ingrediente activo elegido. La vía de administración puede ser cualquier vía que transporte eficazmente el compuesto activo hacia el sitio de acción apropiado o deseado.

35 Las composiciones farmacéuticas para la administración oral incluyen formas de dosificación sólida tales como cápsulas duras o blandas, comprimidos, trociscos, grageas, píldoras, pastillas, polvos y gránulos. Cuando sea apropiado, estas se pueden preparar con recubrimientos tales como recubrimientos entéricos o se pueden formular para proporcionar liberación controlada del ingrediente activo, tal como la liberación sostenida o prolongada de acuerdo con los procedimientos bien conocidos en la técnica.

40 Las formas de dosificación líquida para la administración oral incluyen soluciones, emulsiones, suspensiones acuosas

o aceitosas, jarabes y elíxires.

Las composiciones farmacéuticas para la administración parenteral incluyen soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones estériles acuosas, y no acuosas, inyectables, así como polvos estériles para ser reconstituidos en soluciones o dispersiones estériles inyectables, antes del uso. También se contempla en el alcance de la presente

45 invención las formulaciones inyectables de liberación en depósito.

Otras formas de administración adecuadas incluyen supositorios, pulverizaciones, pomadas, cremas, geles, inhalantes, parches dérmicos, implantes y similares.

Una dosis oral típica varía en el intervalo de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal por día, tal como de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal por día, por ejemplo de

50 aproximadamente 0,05 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal por día, administrados en una o más dosis tales como 1 a 3 dosis. La dosis exacta dependerá de la naturaleza de IL-21 o del mimético de IL-21, junto con el agente de combinación elegido, la frecuencia y el modo de administración, el sexo, la edad, el peso y el estado general del sujeto que se trate, la naturaleza y la intensidad del trastorno tratado o cualquiera enfermedad concomitante que se van a tratar, y otros factores evidentes para los expertos en la técnica.

Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de monodosis por procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Una forma de monodosis típica para la administración oral una o más veces al día, tal como 1 a 3 veces, al día, puede contener de 0,05 a aproximadamente 1000 mg, por ejemplo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 500 mg, tal como de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 200 mg.

5 Para las vías parenterales tales como la administración intravenosa, intratecal, intramuscular, subcutánea y similares, las dosis típicas están en el orden de aproximadamente la mitad de la dosis empleada para la administración oral.

Las sales de los polipéptidos de IL-21 son especialmente relevantes cuando la proteína está en forma sólida o cristalina.

Para administración parenteral, se pueden emplear soluciones de IL-21 o el mimético de IL-21, opcionalmente junto

10 con el agente de combinación en solución acuosa estéril, propilenglicol acuoso o aceite de cacahuate o de sésamo. Tales soluciones acuosas deben ser adecuadamente amortiguadas si es necesario, y el diluyente líquido hacerse primero isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Las soluciones acuosas son particularmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. Los medios acuosos estériles empleados están todos fácilmente disponibles por técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica.

15 Los vehículos farmacéuticos adecuados, incluyen diluyentes o cargas sólidas inertes, solución acuosa estéril y diversos disolventes orgánicos. Ejemplos de vehículos sólidos son lactosa, tierra de diatomeas, sacarosa, ciclodextrina, talco, gelatina, agar, pectina, goma arábiga, estearato de magnesio, ácido esteárico y éteres de alquilo inferior de celulosa. Ejemplos de vehículos líquidos son jarabe, aceite de cacahuate, aceite de oliva, fosfolípidos, ácidos grasos, aminas de ácido graso, polioxietileno y agua. De igual modo, el vehículo o diluyente puede incluir

20 cualquier material de liberación sostenida conocido en la técnica, tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, solo o mezclado con una cera. Las composiciones farmacéuticas formadas combinando IL-21 o el mimético de IL-21, opcionalmente junto con el agente de combinación para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la presente invención, y los vehículos farmacéuticamente aceptables se administran fácilmente en diversas formas de dosis, adecuadas para las vías de administración descritas. Las formulaciones pueden presentarse convenientemente

25 en forma de monodosis por procedimientos conocidos en la técnica de la farmacia.

Para administración nasal, la preparación puede contener un polipéptido de IL-21 o mimético de IL-21 disuelto o suspendido en un vehículo líquido, en particular un vehículo acuoso, para la aplicación en aerosol. El vehículo puede contener aditivos tales como agentes solubilizadores, por ejemplo propilenglicol, tensioactivos, potenciadores de la absorción, tales corno lecitina (fosfatidilcolina) o ciclodextrina, o conservantes tales como parabenos.

30 Las formulaciones de IL-21 o del mimético de IL-21, opcionalmente junto con el agente de combinación para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la presente invención, adecuadas para la administración oral, pueden presentarse como unidades discretas tales como cápsulas o comprimidos, cada una conteniendo una cantidad predeterminada del ingrediente activo, y que pueden incluir un excipiente adecuado. Además, las formulaciones oralmente disponibles pueden estar en la forma de un polvo o de gránulos, una solución o suspensión en líquido

35 acuoso o no acuoso, o una emulsión líquida aceite en agua o agua en aceite.

Las composiciones destinadas para uso oral se pueden preparar de acuerdo con cualquier procedimiento conocido, y tales composiciones pueden contener uno o más agentes seleccionados del grupo que consiste en agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes y agentes conservantes con el fin de proporcionar preparaciones farmacéuticamente elegantes y agradables al paladar. Los comprimidos pueden contener el ingrediente 40 activo mezclado con excipientes no tóxicos farmacéuticamente aceptables, los cuales son adecuados para la fabricación de comprimidos. Estos excipientes pueden ser por ejemplo, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de sodio; agentes de granulación y de disgregación, por ejemplo, almidón de maíz o ácido algínico; agentes aglutinantes, por ejemplo, almidón, gelatina o goma arábiga; y agentes lubricantes, por ejemplo estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Los comprimidos pueden estar no 45 recubiertos o estos pueden estar recubiertos por técnicas conocidas para retrasar la disgregación y absorción en el tracto gastrointestinal, y con esto proporcionar una acción sostenida en un periodo más prolongado. Por ejemplo, se puede emplear un material de retraso de tiempo tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo. Estos, pueden estar recubiertos también mediante las técnicas descritas en las patentes de los Estados Unidas números 4,356,108; 4,166,452; y 4,265,874, incorporadas en el presente documento por referencia, para formar comprimidos

50 terapéuticos osmóticos para la liberación controlada.

Las formulaciones para el uso oral pueden también presentarse como cápsulas de gelatina dura en las que el ingrediente activo está mezclado con un diluyente sólido inerte, por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín, o cápsulas de gelatina blanda en las que el ingrediente activo está mezclado con agua o un medio oleoso, por ejemplo aceite de cacahuate, parafina líquida o aceite de oliva.

55 Las suspensiones acuosas pueden contener IL-21 o el mimético de IL-21, opcionalmente junto con el agente de combinación mezclado con los excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. Tales excipientes son agentes de suspensión, por ejemplo carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma arábiga; agentes dispersantes o humectantes pueden ser fosfatina de origen natural tal como lecitina, o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo estearato de polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo, heptadecaetil-enoxicetanol, o productos de condensación de óxido de etileno con esteres parciales de ácidos grasos y un hexitol tal como monooleato de polioxietilensorbitol, o productos de

5 condensación de óxido de etileno con esteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo monooleato de polietilensorbitan. Las suspensiones acuosas también pueden contener uno o más agentes colorantes, uno o más agentes aromatizantes, y uno o más agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina.

Las suspensiones oleosas se pueden formular mediante la suspensión del ingrediente activo en un aceite vegetal, por ejemplo aceite de cacahuate, aceite de oliva o aceite de coco, o en un aceite mineral tal como una parafina líquida. Las

10 suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante, por ejemplo cera de abejas, parafina dura o alcohol cetílico. Se pueden añadir agentes edulcorantes tales como los descritos anteriormente, y agentes saborizantes para proporcionar una preparación oral agradable al paladar. Estas composiciones pueden ser conservadas mediante la adición de un antioxidante tal como ácido ascórbico.

Los polvos y gránulos dispersables adecuados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de

15 agua proporcionan el compuesto activo mezclado con un agente dispersante o humectante, agente de suspensión y uno o más conservantes. Los agentes dispersantes o humectantes adecuados y los agentes de suspensión están ejemplificados por los ya mencionaos antes. También pueden estar presentes otros excipientes, por ejemplo, agentes edulcorantes, aromatizantes y colorantes. Las composiciones farmacéuticas de IL-21 o del mimético de IL-21, opcionalmente junto con el agente de combinación para el uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la presente

20 invención también pueden estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal, por ejemplo, aceite de oliva o aceite de cacahuate, o un aceite mineral, por ejemplo una parafina líquida, o una mezcla de los mismos. Los agentes emulsionantes adecuados pueden ser gomas de origen natural, por ejemplo goma arábiga o goma de tragacanto, fosfatidas de origen natural, por ejemplo semilla de soja, lecitina y esteres o esteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo monooleato de sorbitan, y productos de

25 condensación de dichos esteres parciales con óxido de etileno, por ejemplo monooleato de polioxietilensorbitan. Las emulsiones también pueden contener agentes edulcorantes y aromatizantes.

Los jarabes y elíxires se pueden formular con agentes edulcorantes, por ejemplo glicerol, propilenglicol, sorbitol o sacarosa. Tales formulaciones también pueden contener un demulcente, conservantes y agentes aromatizantes y colorantes. Las composiciones farmacéuticas pueden estar en la forma de una suspensión acuosa u oleaginosa 30 inyectable estéril. Esta suspensión se puede formular de acuerdo con procedimientos conocidos usando agentes dispersantes o humectantes adecuados y agentes de suspensión descritos antes. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril, en un diluyente o disolvente no tóxico, parenteralmente aceptable, por ejemplo como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear están el agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro de sodio. Además,

35 los aceites fijos estériles se emplean convenientemente como disolvente o medio de suspensión. Para este propósito, se puede emplear cualquier aceite fijo blando usando mono- o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos tales como el ácido oleico encuentran uso en la preparación de inyectables.

Las composiciones también pueden estar en la forma de supositorios para la administración rectal de los compuestos de la invención. Estas composiciones se pueden preparar mezclando el fármaco con un excipiente no irritante

40 adecuado, que es sólido a temperaturas ordinarias pero líquido a la temperatura rectal, y se fundirán de este modo en el recto liberando el fármaco. Tales materiales incluyen, por ejemplo, manteca de cacao y polietilenglicoles.

Para el uso tópico, se contempladas las cremas, pomadas, jaleas, soluciones o suspensiones, etc., que contienen los compuestos de la invención. Para el propósito de esta solicitud, las aplicaciones tópicas incluirán enjuagues bucales y gargarismos.

45 El IL-21 junto con el agente de combinación como se define en las reivindicaciones para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la presente invención, también se puede administrar en la forma de sistemas de liberación de liposomas, tales como vesículas unilaminares pequeñas, vesículas unilaminares grandes y vesículas multilaminares. Los liposomas se pueden formar a partir de diversos fosfolípidos, tales como colesterol, estearilamina o fosfatidilcolinas.

50 IL-21 junto con el agente de combinación para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la presente invención puede formar solvatos con agua o disolventes orgánicos comunes. Tales solvatos se describen en el presente documento.

Si se usa un vehículo sólido para la administración oral, la preparación puede ser en comprimidos, disponerse en una cápsula de gelatina dura en polvo o forma de pellas, o puede estar en la forma de un trocisco o pastilla. La cantidad de 55 vehículo sólido variará ampliamente, pero normalmente será de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 1 g. Si se usa un vehículo líquido, la preparación puede estar en la forma de un jarabe, emulsión, cápsula de gelatina blanda,

o líquido inyectable estéril, tal como una suspensión o solución líquida acuosa o no acuosa.

IL-21 junto con el agente de combinación como se define en las reivindicaciones para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la presente invención, pueden ser para administración a un mamífero, especialmente a un ser humano, que necesite dicho tratamiento. Tales mamíferos incluyen también animales, animales domésticos, por ejemplo mascotas domésticas y animales no domésticos tales como fauna salvaje.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención se pueden administrar una o más veces al día o a la

5 semana, convenientemente administradas a las horas de las comidas. Una cantidad eficaz de dicha composición farmacéutica es la cantidad que proporciona un efecto clínicamente significativo. Tales cantidades dependerán, en parte, del trastorno particular que se trate, de la edad, del peso y de la salud general del paciente, y de otros factores evidentes para los expertos en la técnica.

La memoria descriptiva describe una formulación farmacéutica que comprende IL-21, análogos o derivados del

10 mismo, opcionalmente junto con cualquier otro compuesto mencionado en la presente solicitud, que esté presente en una concentración de 0,1 mg/ml a 100 mg/ml, y en el que la formulación tiene un pH de 2,0 a 10,0. La formulación puede comprender además un sistema amortiguador, conservante(es), agente(s) de la tonicidad, agente(s) quelantes, estabilizadores y tensioactivos. En una realización de la invención, la formulación farmacéutica es una formulación acuosa, por ejemplo, la formulación que comprende agua. Dicha formulación es, de forma típica, una solución o una

15 suspensión. El término “formulación acuosa” se define como una formulación que comprende al menos del 50 % p/p de agua. De igual modo, el término “solución acuosa” se define como una solución que comprende al menos del 50 % p/p de agua, y el término “suspensión acuosa” se define como una suspensión que comprende al menos del 50 % p/p de agua.

La formulación farmacéutica puede ser una formulación liofilizada, a la que el médico o el paciente añade disolventes 20 y/o diluyentes antes del uso.

La formulación farmacéutica puede ser una formulación seca (por ejemplo, liofilizada o secada por aspersión) lista para su uso sin disolución previa.

La memoria descriptiva describe una formulación farmacéutica que comprende una solución acuosa de IL-21 o cualquier otro compuesto que se ha citado antes, y un amortiguador, en el que el compuesto está presente en una

25 concentración de 0,1 mg/ml o como se ha citado antes, preferentemente de 0,5 mg/ml - 50 mg/ml y en la que la formulación tiene un pH de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 10,0. El pH preferente varía de 3,0 a aproximadamente 8,0. El intervalo particular preferente varía de 4,0 - 6,0, tal como por ejemplo los intervalos 4,0 - 4,5, 4,5 - 5,0, 5,0 - 5,5 y 5,5 - 6,0.

El pH de la formulación se puede seleccionar de la lista que consiste en 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,5, 2,7, 2,8, 2,9,

30 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 y 10,0.

El amortiguador se puede seleccionar del grupo que consiste en acetato de sodio, carbonato de sodio, citrato, glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, fosfato diácido de sodio, fosfato ácido de disodio, fosfato de sodio y

35 tris(hidroximetil)-aminometano, bicina, tricina, ácido málico, succinato, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido aspártico o mezclas de los mismos.

La formulación puede comprender además un conservante antimicrobiano farmacéuticamente aceptable que se puede seleccionar del grupo que consiste en fenol, o-cresol, m-cresol, p-cresol, p-hidroxibenzoato de metilo, p-hidroxibenzoato de propilo, 2-fenoxietanol, p-hidroxibenzoato de butilo, 2-feniletanol, alcohol bencílico, clorobutanol, 40 y tiomersal, bronopol, ácido benzoico, imidurea, clorohexidina, deshidroacetato de sodio, clorocresol, p-hidroxibenzoato de etilo, cloruro de bencetonio, clorfenesina (3p-clorfenoxipropan-1,2-diol) o mezclas de los mismos. El conservante puede estar presente en una concentración de 0,1 mg/ml a 20 mg/ml, tal como una concentración de 0,1 mg/ml a 5 mg/ml, de 5 mg/ml a 10 mg/ml o de 10 mg/ml a 20 mg/ml. El uso de un conservante en las composiciones farmacéuticas es bien conocido para el experto en la técnica. Por conveniencia se hace referencia

45 a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª edición, 1995.

La formulación puede comprender además un agente isotónico. El agente isotónico se puede seleccionar del grupo que consiste en una sal (por ejemplo, cloruro de sodio), un azúcar o alcohol de azúcar, un aminoácido (por ejemplo, L-glicina, L-histidina, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptofano, treonina), un alditol (por ejemplo, glicerol (glicerina), 1,2-propanodiol (propilenglicol), 1,3-propanodiol, 1,3-butanodiol) polietilenglicol (por ejemplo PEG400) o 50 mezclas de los mismos. Se puede usar cualquier azúcar tal como mono-, di- o polisacáridos, o glucanos solubles en agua, incluyendo por ejemplo fructosa, glucosa, mannosa, sorbosa, xilosa, maltosa, lactosa, sacarosa, trehalosa, dextrano, pululano, dextrina, ciclodextrina, almidón soluble, hidroxietilalmidón y carboximetilcelulosa-Na. En una realización, el aditivo de azúcar es sacarosa. El alcohol.de azúcar se define como un hidrocarburo de 4 a 8 átomos de carbono que tiene al menos un grupo -OH e incluye, por ejemplo, manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol y 55 arabitol. En una realización, el aditivo de alcohol de azúcar es manitol. Los azucares o alcoholes de azúcar citados anteriormente se pueden usar individualmente o en combinación. No existe límite fijo para la cantidad usada, siempre y cuando el azúcar o el alcohol de azúcar sea soluble en la preparación líquida, y no afecte de manera adversa los efectos estabilizadores conseguidos usando los procedimientos de la invención. La concentración del azúcar o del

alcohol de azúcar puede variar de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 150 mg/ml, tal como en una concentración de 1 mg/ml a 50-mg/ml, o de 1 mg/ml a 7 mg/ml, o en una concentración de 8 mg/ml a 24 mg/ml, o en una concentración de 25 mg/ml a 50 mg/ml. El uso de un agente isotónico en composiciones farmacéuticas, es bien conocido por los expertos en la técnica. Por conveniencia, se hace referencia a Remington: The Science and Practice

5 of Pharmacy, 19ª edición, 1995.

La formulación puede comprender además un agente quelante. El agente quelante se puede seleccionar de sales de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido cítrico, y ácido aspártico y mezclas de los mismos. El agente quelante puede estar presente en una concentración de 0,1 mg/ml a 5 mg/ml, de 0,1 mg/ml a 2 mg/ml, de 2 mg/ml a 5 mg/ml. El uso de un agente quelante en las composiciones farmacéuticas es bien conocido por el experto en la técnica. Por

10 conveniencia se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª edición, 1995.

La formulación puede comprender además un estabilizador. El uso de un estabilizador en las composiciones farmacéuticas es bien conocido por el experto en la técnica. Por conveniencia se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª edición, 1995.

Más particularmente, las composiciones de la invención pueden ser composiciones farmacéuticas líquidas

15 estabilizadas cuyos componentes terapéuticamente activos incluyen un polipéptido que posiblemente muestra formación de agregados durante el almacenamiento en formulaciones farmacéuticas líquidas. Por “formación de agregados” se entiende una interacción física entre las moléculas del polipéptido, que da como resultado la formación de oligómeros que pueden permanecer solubles, o grandes agregados visibles que precipitan en la solución. Por “durante el almacenamiento” se entiende una composición farmacéutica líquida o una formulación que una vez

20 preparada no se administra de forma inmediata a un sujeto. En lugar de ello, después de la preparación, esta se envasa para su almacenamiento, ya sea en una forma líquida, en un estado congelado o en una forma deshidratada para la reconstitución posterior en una forma líquida u otra forma adecuada para la administración a un sujeto. Por “forma seca o anhidra” se entiende la composición farmacéutica líquida o formulación que se seca, bien por secado por congelamiento (por ejemplo, liofilización; véase, por ejemplo, Williams and Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38:

25 48-59), secado por pulverización (véase Masters (1991) en Spray-Drying Handbook (5ª ed.; Longman Scientific and Technical, Essez, Reino Unido), páginas 491-676; Broadhead et al. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18: 1169-1206; y Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11: .12-20), o secado por aire (Carpenter and Crowe (1988) Cryobiology 25: 459-470; y Roser (1991) Biopharm 4: 47-53). La formación de agregados por un polipéptido durante el almacenamiento de una composición farmacéutica líquida puede afectar de manera adversa a la actividad biológica de

30 ese polipéptido, dando como resultado la pérdida de eficacia terapéutica de la composición farmacéutica. Además, la formación de agregados puede provocar otros problemas tales como bloqueo de tuberías, membranas o bombas, cuando la composición farmacéutica que contiene el polipéptido se administra usando un sistema de infusión.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender además una cantidad de una base de aminoácidos suficiente para disminuir la formación de agregados por el polipéptido durante el almacenamiento de la 35 composición. Por “base de aminoácidos” se entiende un aminoácido o una combinación de aminoácidos, en la que cualquier aminoácido dado está presente ya sea en su forma de base libre o en su forma de sal. Cuando se usa una combinación de aminoácidos, todos los aminoácidos pueden estar presentes en su forma de base libre, todos pueden estar presentes en sus formas de sal, o algunos pueden estar presentes en sus formas de base libre mientras, que otros están presentes en sus formas de sal. En una realización, los aminoácidos para su uso en la preparación de 40 composiciones de la invención son los que tienen una cadena lateral cargada, tales como arginina, lisina, ácido aspártico y ácido glutámico. En las composiciones farmacéuticas de la invención puede estar presente cualquier estereoisómero (por ejemplo, isómero L, D o DL) de un aminoácido particular (por ejemplo, glicina, metionina, histidina, imidazol, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptofano, treonina y mezclas de los mismos) o combinaciones de estos estereoisómeros, siempre y cuando el aminoácido particular esté presente en su forma de base libre o en su 45 forma de sal. En una realización, se usa el estereoisomero L. Las composiciones de la invención también pueden formularse con análogos de estos aminoácidos. Por “análogo de aminoácido” se entiende un derivado del aminoácido de origen natural que origina el efecto deseado de disminuir la formación de agregados por el polipéptido durante el almacenamiento de las composiciones farmacéuticas líquidas de la invención. Los análogos de arginina adecuados incluyen, por ejemplo, aminoguanidina, ornitina y N-monoetil-L-arginina, los análogos adecuados de metionina

50 incluyen etionina y butionina, y los análogos adecuados de cisterna incluyen S-metil-L-cisteína. Como con los otros aminoácidos, los análogos de aminoácidos se incorporan en las composiciones en su forma de base libre o en su forma de sal. Los aminoácidos o análogos de aminoácidos se pueden usar en una concentración suficiente para prevenir o retrasar la agregación de la proteína.

Se puede añadir metionina (u otros aminoácidos sulfúricos o análogos de aminoácidos) para inhibir la oxidación de los

55 residuos de metionina al sulfóxido de metionina, cuando el polipéptido que actúa como agente terapéutico es un polipéptido que comprende al menos un residuo de metionina sensible a la oxidación. Por “inhibir” se entiende la acumulación mínima de especies oxidadas de metionina con el tiempo. La inhibición de la oxidación de la metionina da como resultado mayor retención del polipéptido en su forma molecular apropiada. Se puede usar cualquier estereoisómero de metionina (isómero L, D o DL) o combinaciones de los mismos. La cantidad que se va a añadir debe

60 ser una cantidad suficiente para inhibir la oxidación de los residuos de metionina, tal que la cantidad de sulfóxido de metionina es aceptable para las agencias reguladoras. De forma típica, esto significa que la composición no contiene más de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 30 % de sulfóxido de metionina. En general, esto se puede conseguir mediante la adición de metionina tal que la proporción de metionina añadida a los residuos de metionina varíe en el intervalo de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 100:1, tal como 10:1 a aproximadamente 100:1.

La formulación puede comprender además un estabilizador seleccionado del grupo de polímeros de alto peso molecular o compuestos de bajo peso molecular. En una realización adicional de la invención, el estabilizador se

5 selecciona de polietilenglicol (por ejemplo PEG 3350), poli(alcohol vinílico) (PVA), polivinilpirrolidona, carboxi/hidroxicelulosa o derivados de la misma (por ejemplo, HPC, HPC-SL, HPC-L y HPMC), ciclodextrinas, sustancias que contienen azufre como monotioglicerol, ácido tioglicólico y 2-metiltioetanol, y diferentes sales (por ejemplo, cloruro de sodio).

Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender agentes estabilizadores adicionales que aumentan

10 adicionalmente la estabilidad de un polipéptido terapéuticamente activo en las mismas. Los agentes estabilizadores de interés particular de la presente invención incluyen, pero sin quedar limitados a los mismos, metionina y EDTA, que protegen al polipéptido contra la oxidación de la metionina, y un tensioactivo no iónico, que protege al polipéptido contra la agregación asociada con la congelación/descongelación o el esfuerzo cortante mecánico.

La formulación puede comprender además un tensioactivo. El tensioactivo se puede seleccionar de un detergente, 15 aceite de ricino etoxilado, glicéridos poliglicolisados, monoglicéridos acetilados, esteres de ácido graso de sorbitan, polímeros de bloque de polioxipropileno-polioxietileno (por ejemplo, poloxámeros tales como Pluronic® F68, poloxámero 188 y 407, Tritón X-100) , esteres de ácido graso de polioxietilensorbitan, derivados de polioxietileno y polietileno tales como derivados alquilados y alcoxilados (Tweens, por ejemplo Tween 20, Tween 40, Tween 80 y Brij-35), monoglicéridos o derivados etoxilados de los mismos, diglicéridos o derivados de polioxietileno de los mismos, 20 alcoholes, glicerol, lecitinas y fosfolípidos (por ejemplo fosfatidilserina, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, difosfatidilglicerol y esfingomielina), derivados de fosfolípidos (por ejemplo ácido dipalmitoilfosfatídico) y lisofosfolípidos (por ejemplo, palmitoil-lisofosfatidil-L-serina y esteres de 1-acil-sn-glicero-3-fosfato de etanolamina, colina, serina o treonina) y derivados de alquilo, alcoxilo (éster de alquilo), alcoxi (éter de alquilo) de lisofosfatidilo y fosfatidilcolinas, por ejemplo derivados de lauroilo y miristoilo de lisofosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina, y 25 modificaciones del grupo de cabeza polar, es decir colinas, etanolaminas, ácido fosfatídico, serinas, treoninas, glicerol, inositol y los compuestos DODAC, DOTMA, DCP, BISHOP, lisofosfatidilserina y lisofosfatidiltreonina cargados positivamente, y glicerofosfolípidos (por ejemplo cefalinas), gliceroglicolípidos (por ejemplo galactopiranósido), esfingoglucolípidos (por ejemplo ceramidas gangliósidos), dodecilfosfocolina, lisolecitina de huevo de gallina, derivados de ácido fusídico (por ejemplo, . tauro-dihidrofusidato de sodio, etc.), ácidos grasos de cadena larga y sales 30 de los mismos de 6 a 12 átomos de carbono (por ejemplo, ácido oleico y ácido caprílico), acilcarnitinas y derivados, derivados N-acilados de lisina, arginina o histidina, o derivados acilados de cadena lateral de lisina o arginina, derivados Na-acilados de dipéptidos que comprenden cualquier combinación de lisina, arginina o histidina y un aminoácido neutro o ácido, derivado Na-acilado de un tripéptido que comprende cualquier combinación de un aminoácido neutro y dos aminoácidos cargados, DSS (docusato de sodio, número de registro CAS [577-11-7]), 35 docusato de calcio, número de registro CAS [128-49-4]), docusato de potasio, número de registro CAS [7491-09-0]), SDS (dodecil-sulfato de sodio o lauril sulfato de sodio), caprilato de sodio, ácido cólico o derivados de los mismos, ácidos biliares y sales de los mismos, y conjugados de glicina o taurina, ácido ursodesoxicólico, colato de sodio, desoxicolato de sodio, taurocolato de sodio, glicocolato de sodio, N-hexadecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propanosulfonato, tensioactivos monovalentes aniónicos (alquil-aril-sulfonatos), 40 tensioactivos anfóteros (por ejemplo, N-alquil-N,N-dimetilamonio-1-propansulfonatos, 3-colamido-1-propildimetilamonio-1-propanosulfonato, tensioactivos catiónicos (bases de amonio cuaternario) (por ejemplo bromuro de cetil-trimetilamonio, cloruro de cetilpiridinio), tensioactivos no iónicos (por ejemplo -D-glucopiranósido de dodecilo), poloxaminas (por ejemplo Tetronic's), que son copolímeros de bloque tetrafuncionales derivados de la adición secuencial de óxido de propileno y óxido de etileno a etilendiamina, o se puede 45 seleccionar el tensioactivo del grupo de derivados de imidazolina, o mezclas de los mismos. Cada uno de estos

tensioactivos específicos constituye una realización alternativa de la invención.

El uso de un tensioactivo en las composiciones farmacéuticas es bien conocido por el experto en la técnica. Por conveniencia, se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª edición, 1995.

Es posible que otros ingredientes puedan estar presentes en la formulación farmacéutica del péptido de la presente

50 invención. Tales ingredientes adicionales pueden incluir agentes humectantes, emulsionantes, antioxidantes, agentes de carga, modificadores de la tonicidad, agentes quelantes, iones metálicos, vehículos oleosos, proteínas (por ejemplo, albúmina sérica humana, gelatina o proteínas) y un bipolar (por ejemplo, un aminoácido tal como betaína, taurina, arginina, glicina, usina e histidina). Tales ingredientes adicionales, por supuesto, no deben afectar de manera adversa la estabilidad general de la formulación farmacéutica de la presente invención.

55 Las composiciones farmacéuticas que contienen IL-21 o cualquier otro compuesto como se ha mencionado antes de acuerdo con la presente invención se pueden administrar a un paciente que necesite dicho tratamiento en diversos sitios, por ejemplo, en sitios tópicos, por ejemplo, la piel y los sitios de mucosas, en sitios que desvían la absorción, por ejemplo, la administración en una arteria, en una vena, en el corazón, y en sitios que implican absorción, por ejemplo, administración en la piel, bajo la piel, en un músculo o en el abdomen.

60 La administración de las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención puede ser a través de varias vías

de administración, por ejemplo, lingual, sublingual, bucal, en la boca, oral, en el estómago y el intestino, nasal, pulmonar, por ejemplo, a través de los bronquiolos y los alvéolos o una combinación de los mismos, epidérmica, dérmica, transdérmica, vaginal, rectal, ocular, por ejemplo a través de la conjuntiva, uretral y parenteral a pacientes que necesiten dicho tratamiento.

5 Las composiciones de la presente invención se pueden administrar en varias formas de dosificación, por ejemplo, como soluciones, suspensiones, emulsiones, microemulsiones, emulsión múltiple, espumas, pomadas, pastas, emplastos, ungüentos, comprimidos, comprimidos recubiertos, enjuagues, cápsulas, por ejemplo, cápsulas de gelatina dura y cápsulas de gelatina blanda, supositorios, cápsulas rectales, gotas, geles, pulverizaciones, polvos, aerosoles, inhalantes, gotas oculares, ungüentos oftálmicos, enjuagues oftálmicos, pesarios vaginales, anillos vaginales,

10 ungüentos vaginales, solución de inyección, soluciones de transformación in situ, por ejemplo gelificación in situ, endurecimiento in situ, precipitación in situ, cristalización in situ, solución de infusión e implantes.

Las composiciones de la invención pueden estar también compuestas en, o unidas a, por ejemplo, por medio de interacciones covalentes, hidrófobas y electrostáticas, un vehículo farmacéutico, sistema de distribución de fármaco, y sistema avanzado de distribución de fármaco, con el fin de aumentar adicionalmente la estabilidad de IL-21 o cualquier 15 otro compuesto que se ha citado antes, para incrementar la biodisponibilidad, incrementar la solubilidad, disminuir los efectos adversos, lograr la cronoterapia bien conocida por los expertos en la técnica, e incrementar el cumplimiento del paciente o cualquier combinación de los mismos. Los ejemplos de vehículos, sistemas de administración de fármacos y sistemas avanzados de administración de fármacos incluyen, pero no quedan limitados a los mismos, polímeros, por ejemplo, celulosa y derivados, polisacáridos, por ejemplo dextrano y derivados, almidón y derivados, 20 poli(alcohol vinílico), polímeros de acrilato y metacrilato, ácidos poliláctico y poliglicólico y copolímeros de bloque de los mismos, polietilenglicoles, proteínas vehículo, por ejemplo albúmina, geles, por ejemplo, sistemas de termogelificación, por ejemplo sistemas de copolímero de bloque bien conocidos por los expertos en la técnica, micelas, liposomas, microesferas, nanoparticulados, cristales líquidos y dispersiones de los mismos, fase L2 y dispersiones de los mismos, bien conocidos por los expertos en la técnica del comportamiento de fases en los

25 sistemas lípido-agua, micelas poliméricas, emulsiones múltiples, autoemulsifión, automicroemulsión, ciclodextrinas y derivados de los mismos, y dendrímeros.

Las composiciones de la presente invención son útiles en la formulación de sólidos, semisólidos, polvo y soluciones para la administración pulmonar de IL-21 o cualquier otro compuesto que se ha citado antes usando, por ejemplo, un inhalador de dosis medida, inhalador de polvo seco y un nebulizador, siendo todos dispositivos bien conocidos por los

30 expertos en la técnica.

Las composiciones de la presente invención son útiles específicamente en la formulación de sistemas de distribución de fármacos de liberación controlada, sostenida, en intervalos, retardada y lenta. Más específicamente, pero sin quedar limitada a estas, las composiciones son útiles en la formulación de sistemas de liberación controlada y de liberación sostenida parenterales (ambos sistemas conducen a una reducción múltiple en el número de

35 administraciones), bien conocidos por los expertos en la técnica. Aún más preferentemente, son sistemas de liberación controlada y liberación sostenida administrados subcutáneamente. Sin limitar el alcance de la invención, los ejemplos de sistema de liberación controlada útiles y composiciones son hidrogeles, geles oleosos, cristales líquidos, micelas poliméricas, microesferas, nanopartículas.

Los procedimientos para producir los sistemas de liberación controlada útiles para las composiciones de la presente

40 invención incluyen, pero sin quedar limitados los mismos, a cristalización, condensación, cocristalización, precipitación, coprecipitación, emulsión, dispersión, homogeneización de alta presión, encapsulación, secado por pulverización, microencapsulación, coacervación, separación de fases, evaporación de disolvente para producir microesferas, extrusión y procesos de fluidos supercríticos. Se hace referencia general a Handbook of Pharmaceutical Controlled Release (Wise, D.L., ed. Marcel Dekker, New York, 2000) y Drug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99:

45 Protein Formulation and Delivery (MacMally, E.J. ed. Marcel Dekker, New York, 2000).

La administración parenteral se puede llevar a cabo por inyección subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa por medio de una jeringa, opcionalmente una jeringa en forma de pluma. De forma alternativa, la administración parenteral se puede llevar a cabo por medio de una bomba de infusión. Una opción adicional es una composición que puede tener una solución o suspensión para la administración de IL-21 o cualquier otro compuesto

50 que se ha citado antes, en la forma de una pulverización nasal o pulmonar. Como una opción adicional, las composiciones farmacéuticas que contienen IL-21 o cualquier otro compuesto que se ha citado antes, pueden ser también adaptadas para la administración transdérmica, por ejemplo mediante inyección exenta de aguja o desde un parche, opcionalmente un parche iontoforético, o transmucosal, por ejemplo administración bucal.

El término “formulación estabilizada” se refiere a una formulación con mayor estabilidad física, mayor estabilidad 55 química o mayores estabilidad física y química.

El término, “estabilidad física” de la formulación de proteína como se usa en el presente documento, se refiere a la tendencia de la proteína a formar agregados biológicamente inactivos y/o insolubles de la proteína, como resultado de la exposición de la proteína a las tensiones termomecánicas y/o interacción con interfases y superficies que son desestabilizantes, tales como las superficies y las interfases hidrófobas, la estabilidad física en las formulaciones

acuosas de proteína se evalúa por medio de inspección visual y/o medición de turbidez después de la exposición de la formulación rellena en envases adecuados (por ejemplo cartuchos o frascos) a la tensión mecánica/física (por ejemplo agitación) a diferentes temperaturas durante diversos periodos de tiempo. La inspección visual de las formulaciones se lleva a cabo en una luz enfocada aguda con un fondo oscuro. La turbidez de la formulación se caracteriza por una 5 valoración visual que clasifica el grado de turbidez, por ejemplo en una escala de 0 a 3 (una formulación que no muestra turbidez corresponde a una calificación visual de 0, y una formulación que muestra turbidez visual en luz diurna, corresponde a calificación visual de 3). Se clasifica una formulación como físicamente inestable con respecto a la agregación de las proteínas cuando esta muestra turbidez visual en luz diurna. De forma alternativa, la turbidez de la formulación se puede evaluar mediante mediciones de turbidez simples bien conocidas para el experto. La estabilidad 10 física de las formulaciones de proteína acuosa puede también ser evaluada mediante el uso de un agente espectroscópico o sonda del estado conformacional de la proteína. La sonda es preferentemente una molécula pequeña que se enlaza preferentemente a un conformador no nativo de la proteína. Un ejemplo de una sonda espectroscópica molecular pequeña de estructura proteica es Tioflavina T. Tioflavina T es un colorante fluorescente que se ha usado ampliamente para la detección de fibrillas amiloides. En la presencia de fibrillas, y también quizás de

15 otras configuraciones proteicas, la Tioflavina T da lugar a un nuevo máximo de excitación a aproximadamente 450 nm y emisión aumentada a aproximadamente 482 nm cuando se enlaza a una forma de proteína fibrilar. La Tioflavina T no enlazada es esencialmente no fluorescente a las longitudes de onda.

Se pueden usar otras moléculas pequeñas como sondas de los cambios en la estructura de las proteínas de los estados nativo a los no nativos. Por ejemplo, las sondas “de parche hidrófobo” que se unen preferentemente a los 20 parches hidrófobos expuestos de una proteína. Los parches hidrófobos están en general inmersos en la estructura terciaria de una proteína en su estado nativo, pero quedan expuestos a medida que una proteína comienza a desplegarse o a desnaturalizarse. Ejemplos de estas moléculas pequeñas, las sondas espectroscópicas, son colorantes hidrófobos, aromáticos, tales como antraceno, acridina, fenantrolina o similares. Otras sondas espectroscópicas son complejos de metal-aminoácido, tales como complejos de metal cobalto de aminoácidos

25 hidrófobos, tales como fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina y valina o similares.

El término “estabilidad química” de la formulación de proteína tal como se usa en el presente documento, se refiere a los cambios químicos covalentes en la estructura de la proteína, que conduce a la formación de productos de degradación química con pérdida potencial de la potencia biológica y/o propiedades inmunogénicas potencialmente incrementadas, en comparación con la estructura proteica nativa. Los diversos productos de degradación química se 30 pueden formar dependiendo del tipo y naturaleza de la proteína nativa y del ambiente al cual se exponga la proteína. La eliminación de la degradación química puede, lo más probablemente, no ser completamente evitada, y el incremento de las cantidades de los productos de degradación química se observa frecuentemente durante el almacenamiento y uso de la formulación de proteína, como es bien conocido por un experto en la técnica. La mayoría de las proteínas son propensas a la desamidación, un proceso en el cual el grupo amida de cadena lateral en los 35 residuos de glutaminilo o asparaginilo es hidrolizado para formar un ácido carboxílico libre. Otras vías de degradación implican la formación de productos de transformación de alto peso molecular, donde dos o más moléculas de proteína se unen covalentemente una a la otra a través de transamidación y/o interacciones disulfuro que conducen a la formación de un dímero unido covalentemente, productos de degradación de oligómeros y polímeros (Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahem. T. J. & Manning M.C., Plenum Press, New York, 1992). La oxidación (por ejemplo de 40 los residuos de metionina) se puede citar como otra variante más de la degradación química. La estabilidad química de la formulación de proteína se puede evaluar mediante la medición de la cantidad de productos de degradación química en diversos puntos de tiempo después de la exposición a diferentes condiciones ambientales (la formación de productos de degradación se puede acelerar frecuentemente, por ejemplo, por el incremento de la temperatura). La cantidad de cada producto de degradación individual se determina con frecuencia por la separación de los productos

45 de degradación, dependiendo del tamaño molecular y/o de la carga usando diversas técnicas cromatográficas (por ejemplo SEC-HPLC y/o RP-HPLC).

Por ello, como se ha descrito antes, una “formulación estabilizada” se refiere a una formulación con mayor estabilidad física, mayor estabilidad química o mayores estabilidad física y química. En general, una formulación debe ser estable durante su uso y almacenamiento (de acuerdo con el uso recomendado y las condiciones de almacenamiento) hasta

50 que se alcanza la fecha de caducidad.

La formulación que comprende IL-21 y cualquier otro compuesto como se define en las reivindicaciones puede ser estable durante más de 6 semanas de uso y durante más de 3 años de almacenamiento, o durante más de 4 semanas de uso y durante más de 3 años de almacenamiento, o durante más de 4 semanas de uso y durante más de 2 años de almacenamiento, o durante más de 2 semanas de uso y durante más de 2 años de almacenamiento, o durante más de

55 1 semana de uso y durante más de 18 meses de almacenamiento, o durante más de 1 día de uso y durante más de 18 meses de almacenamiento.

EJEMPLOS

PROCEDIMIENTOS FARMACOLÓGICOS

El siguiente es un procedimiento in vitro usado para investigar el aumento de ADCC: Se incuban células diana que expresan el antígeno diana con el anticuerpo contra el antígeno diana y células mononucleares de sangre periférica, células NK, neutrófilos, macrófagos, monocitos o DC como células efectoras. Las células efectoras se pueden pre-incubar durante 1 a 10 días con IL-21, o se puede añadir IL-21 puede ser al cultivo que contiene las células efectoras y diana. Otros compuestos que pueden aumentar ADCC se pueden incluir en el cultivo o

5 en el cultivo pre-incubación. La eficiencia de ADCC se medirá como la liberación específica de 51Cr de las células diana, o como la actividad de LDH como se ha descrito anteriormente (Golay et al., Haematologica 88: 1002-1012, 1003 o Liu et al., Cancer Immun 2: 13, 2002 o Watanabe et al., Breast Cancer Res Treat 53: 199-207, 1999).

La determinación de ADCC usando un ensayo basado en citometría de flujo como se ha descrito anteriormente (Flieger et al., J Immunother 23: 480-486, 2000 o Flieger et al., J Immunol Methods 180: 1-13, 1995 o Flieger et al.,

10 Hybridoma 18: 63-68, 1999).

La determinación de ADCP a través del ensayo de fluorescencia de dos colores como se describe en Watanabe et al., Breast Cancer Res Treat 53: 199-207, 1999 o Akewanlop et al., Cancer Res 61: 4061-4065, 2001.

Un procedimiento in vivo para determinar el aumento de ADCC se describe a continuación:

Se inyectan células de leucemia o células transformadas intravenosamente, intraperitonealmente o subcutáneamente

15 en animales singénicos, seguido por tratamiento con el anticuerpo terapéutico que reconoce un antígeno expresado por las células de leucemia o las células transformadas, con o sin la terapia con IL-21. Los puntos finales son la carga tumoral y la supervivencia. Se puede confirmar la implicación de ADCC por el uso de los anticuerpos de bloqueo FcγRI

o por el uso de los ratones deficientes en FcγRI.

Un procedimiento in vivo para investigar el aumento de ADCC hacia las células diana de origen humano se describe

20 previamente en Zhang et .al., Blood 102: 284-288, 2003 o Flavell et al., Cancer Res 58: 5787-5794, 1998. De acuerdo con estos modelos, se inyectan células de leucemia humanas o células transformadas i.v, i.p. o s.c. en ratones SCID, seguido por tratamiento con el anticuerpo terapéutico que reconoce un antígeno expresado por células de leucemia o células transformadas, con o sin la terapia con IL-21.

Se implantan subcutáneamente en ratones transgénicos líneas celulares tumorales, por ejemplo Células de

25 Carcinoma de Pulmón de Lewis (LLC) o células de melanoma B16-F10 o células de carcinoma de células renales renca, o células de carcinoma de mama 4T1. Cuando los tumores se vuelven palpables, se tratan los ratones con IL-21 en combinación con otros agentes anti-cancerosos como se describe en esta solicitud. La metodología se describe en Palumbo et al., Cancer Res. 62: 6966-6972 (2002); Bove et al., Biochem Biophys Res Commun 291: 1001-1005 (2002); Wigginton et al., J Immunol 169: 4467-4474 (2002).

30 Se implantan líneas subcutáneamente en ratones transgénicos celulares tumorales, por ejemplo Células de Carcinoma de Pulmón de Lewis (LLC) o células de melanoma B16-F-10. El tumor primario se extirpa después de 1 a 4 semanas, y se tratan los ratones con IL-21 en combinación con otros agentes anti-cancerosos como se describe en esta solicitud. La metodología se describe en Palumbo et al., Cancer Res. 62: 6966-6972 (2002).

Se inyectan intravenosamente en ratones singénicos líneas celulares tumorales, por ejemplo Células de Carcinoma

35 de Pulmón de Lewis (LLC) o células de melanoma B16-F10 o células de carcinoma de células renales renca, y se tratan los ratones con IL-21 en combinación con otros agentes anti-cancerosos, como se describe en esta solicitud. La metodología se describe en Amirkhosravi et al., Thromb. Haemost. 87: 930-936 (2002); Osaka et al., Cancer Lett 161: 231-240 (2000); Maini et al., In vivo 17: 119-123 (2003).

Se inyectan intrarrenalmente en un riñón en ratones singénicos células de carcinoma de células renales renca. El

40 tumor primario se extirpa después de 1 a 4 semanas, y se tratan los ratones con IL-21 en combinación con otros agentes anti-cancerosos como se describe en esta solicitud. La metodología se describe en Murphy et al., J Immunol

170: 2727-2733 (2003).

Claims (32)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una combinación que comprende IL-21 y un agente quimioterapéutico, en la que el agente

   quimioterapéutico es un agente alquilante seleccionado del grupo que consiste en Melfalan, Busulfán, Cisplatino, 5 Carboplatino, Ifosfamida, Dacarbazina, Procarbazina, Tiotepa, Lomustina y Temozolamida.

2. 2.

   Una combinación de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la IL-21 es IL-21 humana.

3. 3.

   Una combinación de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en la que el agente quimioterapéutico es carboplatino.

4. 4. Una combinación de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en la que el agente quimioterapéutico es 10 cisplatino.

5. 5.

   Una combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la combinación comprende además radioterapia.

6. 6.

   Una combinación de acuerdo con la reivindicación 5, en la que la radioterapia usa átomos radiactivos

   seleccionados del grupo que consiste en radio, cesio-137, iridio-192, americio-241, oro-198, cobalto-57, cobre-67, 15 tecnecio-99, yodo-123, yodo-131 e indio-111.
7. 7. Una combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la combinación comprende además anticuerpos seleccionados del grupo que consiste en Rituximab, Alemtuzumab, Trastuzumab, Gemtuzumab, Gemtuzumozogamicina (Myelotarg®, Wyeth), Cetuximab (Erbitux™), Bevacizumab, HuMax-CD20, HuMax-EGFr, Zamyl, Pertuzumab, anticuerpos contra factor tisular, receptores del tipo Ig citolíticos (KIR) y laminina

   20 5.

8. 8.

   Una combinación de acuerdo con la reivindicación 7, en la que la combinación comprende Rituximab.

9. 9.

   Una combinación de acuerdo con la reivindicación 7, en la que la combinación comprende Cetuximab.

10. 10.

    Una combinación de acuerdo con la reivindicación 7, en la que el anticuerpo terapéutico se combina además

    con otros compuestos que potencian ADCC seleccionados del grupo que consiste en anticuerpos anti-KIR de 25 bloqueo, anticuerpos NKG2A activadores e IL-2.

11. 11.

    Una combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la combinación comprende además uno o más reguladores del ciclo celular y/o agentes que inducen apoptosis.

12. 12.

    Una combinación de acuerdo con la reivindicación 11, en la que el regulador o reguladores del ciclo celular y/o agentes que inducen apoptosis se seleccionan del grupo que comprende cdc25, NSC 663284, flavopiridol,

    30 7-hidroxistaurosporina, 25 roscovitina, BIBR1532, SOT-095, ligando que induce apoptosis relacionado con TNF (TRAIL)/ligando de apoptosis 2 (Apo-2L), anticuerpos que activan los receptores de TRAIL, IFNa y Bcl-2 anti-sentido.

13. 13.

    Una combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la combinación comprende además inhibidores del factor de crecimiento.

14. 14.

    Una combinación de acuerdo con la reivindicación 13, en la que los inhibidores del factor de crecimiento se

    35 seleccionan del grupo que comprende Herceptin® (anticuerpo monoclonal), cetuximab (anticuerpo monoclonal), Tarceva® (inhibidor de bajo peso molecular) e Iressa® (inhibidor de bajo peso molecular).

15. 15.

    Una combinación de acuerdo con la reivindicación 14, en la que la combinación comprende Herceptin®.

16. 16.

    Una combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la combinación comprende además un fármaco antiangiogénesis.

    40 17. Una combinación de acuerdo con la reivindicación 16, en la que el fármaco antiangiogénesis se selecciona del grupo que comprende: avastina, neovastat, talidomida, PTK787, ZKZ22584, ZD-6474, SU6668, PD547632, VEGF-Trap, CEP-7055, NM-3, SU11248.
17. 18. Una combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la combinación comprende además terapia hormonal.

    45 19. Una combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la combinación comprende además uno o más adyuvantes.

18. 20.

    Una combinación de acuerdo con la reivindicación 19, en la que los adyuvantes se seleccionan del grupo que comprende: QS21, GM-CSF y oligodesoxinucleótidos CpG, lipopolisacáridos y poliinosínico: ácido policitidílico.

19. 21.

    Una combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la combinación comprende además una o más citocinas.

20. 22.

    Una combinación de acuerdo con la reivindicación 21, en la que la citocina o citocinas se seleccionan del

    grupo que comprende: IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-2, PEG-IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23, IL-27, 5 IL-28a, IL-28b, IL-29, GM-CSF, ligando Flt3 o factor de células madre.

21. 23.

    Una combinación de acuerdo con la reivindicación 22, en la que la citocina o citocinas se seleccionan del grupo que comprende IFN-α, IFN-β, IFN-γ, PEG-IL-2, IL-18, IL-23, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29.

22. 24.

    Una combinación de acuerdo con la reivindicación 21, en la que la combinación comprende IFN-α.

23. 25. Una combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-24, en la que la combinación 10 comprende además terapia celular adoptiva.

24. 26.

    Una combinación de acuerdo con la reivindicación 25, en la que la terapia celular adoptiva consiste en células T CD4+ o CD8+ T que reconocen antígenos específicos de tumor o antígenos asociados a tumor.

25. 27.

    Una combinación de acuerdo con la reivindicación 25, en la que la terapia celular adoptiva consiste en células B que expresan anticuerpos específicos para antígenos específicos de tumor o antígenos asociados a tumor.

    15 28. Una combinación de acuerdo con la reivindicación 25, en la que la terapia celular adoptiva consiste en células NK que son capaces de matar las células tumorales.

26. 29.

    Una combinación de acuerdo con la reivindicación 25, en la que la terapia celular adoptiva consiste en células dendríticas (DC).

27. 30.

    Una combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la combinación

    20 comprende además uno o más agentes que rompen la tolerancia al cáncer o antígenos tumorales, donde el agente es MDX-010 o anticuerpos contra CTLA-4.
28. 31. Una combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la combinación comprende además una o más vacunas terapéuticas con o sin adyuvantes, citocinas, oligodesoxinucleótidos CpG, células dendríticas, GM-CSF o proteínas de choque térmico.

    25 32. Una combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la combinación comprende además uno o más agentes antimetastásicos.
29. 33. Una composición farmacéutica que comprende una combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32, junto con aditivos farmacéuticamente aceptables.
30. 34. Uso de una combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32, para la preparación de un 30 medicamento para el tratamiento de cáncer.

31. 35.

    Una combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32, para su uso en el tratamiento de cáncer.

32. 36.

    Uso de una combinación para la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer de acuerdo con la reivindicación 34, o una combinación para su uso en el tratamiento de cáncer de acuerdo con la reivindicación

    35 35, en el que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en melanoma maligno metastásico, carcinoma de células renales, cáncer de ovario, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón amicrocítico, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer de vejiga, cáncer esofágico, cáncer cervical, cáncer endometrial, linfoma y leucemia.