ES2420405T3 - Inhibidores de la señalización de PDK-1/AKT - Google Patents

Abstract

Un compuesto de fórmula I: **Fórmula** en la que X se elige de entre alquilo y haloalquilo; Ar se elige del grupo que consiste en fenilo, bifenilo, naftilo, antrilo, fenantrenilo y fluorenilo; opcionalmente sustituido en cualquier posición sustituible con uno o más radicales; R se elige del grupo que consiste en -CH2CN, -CH2CH2CN, -CH2CH2CH2CN **Fórmula** o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

Description

Inhibidores de la senalizacion de PDK-1/AKT 5 Antecedentes de la invención

[0001] La cascada de senalizacion de fosfoinositidos (PI) 3-cinasa/PDK-1/Akt representa un punto de convergencia para una diversidad de cinasas de tirosina y vias mediadas por citocinas que regulan la proliferacion y la supervivencia celular, y ofrece un marco para explicar la capacidad de muchos factores troficos extracelulares de 10 mantener la supervivencia celular. La desregulacion de esta cascada de senalizacion debido a la activacion de receptores del factor de crecimiento constitutivos y/o a limitaciones de la PTEN, dan como resultado una regulacion por incremento en la Akt, que subsiguientemente promueve la invasividad, la angiogenesis y la progresion tumorales. Por lo tanto, los inhibidores de la senalizacion de PDK-1/Akt tienen una relevancia traduccional para el desarrollo de agentes quimioterapeuticos o quimiopreventivos utiles. Existe una necesidad de desarrollar nuevos

15 compuestos que sean potentes inhibidores de la senalizacion de PDK-1/Akt. Existe finalmente una necesidad de desarrollar agentes quimioterapeuticos y agentes quimiopreventivos basados en la inhibicion de la senalizacion de PDK-1/Akt. El documento EP-A-0.554.829 concierne a derivados de pirazol con una actividad antiinflamatoria, analgesica y

20 antitrombotica. Los compuestos desvelados incluyen 1-(4-cianofenil)-3-(difluorometil)-5-[4-metilsulfoni)fenil] pirazol.

Zhu y col., J. Nat. Cancer Inst., 94 (23), 1745 - 1757 concierne a compuestos inductores de la apoptosis. Desvelan compuestos que serian segun la formula I, a continuacion, excepto porque R es (por ejemplo) -CONH2 o -SO2NH2. El documento WO03/086287 desvela compuestos inductores de la apoptosis similares en los que R es -CONH2.

Resumen de la invención

[0002] Se proporcionan compuestos de formula I:

30 en la que X se elige de entre alquilo y haloalquilo; Ar se elige del grupo que consiste en fenilo, bifenilo, naftilo, antrilo, fenantrenilo y fluorenilo; R se elige del grupo que consiste en CN, -CH2CN, -CH2CH2CN, -CH2CH2CH2CN -CONH2

La formula I tambien incluye sales farmaceuticamente aceptables de los mismos. Ar puede estar sustituido con uno o mas radicales.

10 Breve descripción de las figuras

[0003] La Figura 1 muestra los efectos dependientes de la dosis de los compuestos 34 (paneles de la izquierda) y 35 (paneles de la derecha) sobre la viabilidad celular de celulas PC-3 y sobre el crecimiento celular en nueve lineas celulares tumorales humanas representativas.

15 [0004] La Figura 2 muestra la sintesis de los compuestos 25 - 36 usando la 1,1,1-trifluoro-4-hidroxi-4fenantren-2-il-but-3-en-2-ona como precursor comun.

Descripción detallada de la invención

20 [0005] Se proporciona una nueva clase de inhibidores de la senalizacion de PDK-1/Akt. Los compuestos descritos en este documento son utiles para inducir la apoptosis en celulas en proliferacion no deseable, tales como celulas cancerosas. Los compuestos descritos en este documento tambien son utiles para promover la curacion de heridas y evitar la formacion de cicatrices. Los compuestos descritos en este documento tienen una aplicacion

25 adicional en la prevencion de la reestenosis. Los compuestos descritos en este documento tienen una aplicacion adicional en el trasplante de organos.

[0006] Los compuestos descritos en este documento pueden mostrarse en la formula general I: en la que X se elige de entre alquilo y haloalquilo; Ar se elige del grupo que consiste en fenilo, bifenilo, naftilo, antrilo, fenantrenilo y fluorenilo; R se elige del grupo que consiste en -CH2CN, -CH2CH2CN, -CH2CH2CH2CN

y

10 Dicho de otro modo, R se elige de entre grupos correspondientes a acetonitrilo, etilnitiilo, propilnitrilo, amidina, pirazol, oxima, hidrazona, acetamidina, acetamida, guanidina y urea. La Formula I tambien incluye sales farmaceuticamente aceptables de los mismos. Ar puede estar sustituido con uno o mas radicales.

15 [0007] En algunas formas de realizacion, X es haloalquilo C1 a C4. En algunas formas de realizacion, X es CF3. En algunas formas de realizacion, Ar esta sustituido en cualquier posicion sustituible con uno o mas radicales, tales como, pero no limitados a, halo, alquilo C1-C4, haloalquilo C1-C4, azido, azidoalquilo C1-C4, arilo, aquilarilo, haloarilo, haloalquilarilo y combinaciones de los mismos. En algunas formas de realizacion, Ar se elige de entre 2naftilo, 4-bifenilo, 9-antrilo, 2-fluorenilo, 4-azidofenilo, 4-azidometilfenilo, 4-(2-azidoetil) fenilo, 4-(3-azidopropil) fenilo,

20 4-(4-azidobutil) fenilo, 4-(4-azidofenil) fenilo, 4-(4-azidometilfenil) fenilo, 4-metilfenilo, 4-etilfenilo, 4-propilfenilo, 4butilfenilo, 4-(2-bromoetil) fenilo, 4-(3-bromopropil) fenilo, 4-(4-bro-mobutil) fenilo, 4-(trifluorometil) fenilo, 4-(4metilfenil) fenilo, 4-(4-bromometilfenil) fenilo, 4-(4-butilfenil) fenilo, 4-(4-terc-butilfenil) fenilo, 2-clorofenilo, 4clorofenilo, 2,4-diclorofenilo, 3,4-diclorofenilo, 2,5-diclorofenilo, 2,4-dimetilfenilo, 2,5-dimetilfenilo, 3,4-dimetilfenilo, 3,5-dimetilfenilo, 4-(4-clorofenil) fenilo, 4-(3,5-diclorofenil) fenilo, 4-(2,3-diclorofenil) fenilo, 4-(3,5-dimetilfenil)fenilo, 4

25 (2,4,5-triclorofenil) fenilo, 4-(4-trifluorometilfenil) fenilo, 2-fenantrenilo, 3-indolilo, 2-pirrolilo, 4-(bencil) fenilo, 4-tbutilfenilo y 9-fenantrenilo. En algunas formas de realizacion, Ar es 2-fenantrenilo. En algunas formas de realizacion, R es tal que RH es aminoacetamida o guanidina.

[0008] Otra forma de realizacion descrita en este documento es aquella de formula II: 30

en la que X se elige de entre alquilo y haloalquilo; R se elige de entre-CN, -CH2CN, -CH2CH2CN, -CH2CH2CH2CN,

En algunas formas de realizacion, X es haloalquilo C1 a C4, y en algunas formas de realizacion, X es CF3. En algunas formas de realizacion, R es tal que RH es aminoacetamida o guanidina. La formula II tambien incluye sales farmaceuticamente aceptables de los mismos.

10 [0009] En otra forma de realizacion, los compuestos son aquellos de formula III o IV:

15 [0010] Los compuestos anteriores pueden usarse para inducir la apoptosis en celulas en proliferacion no deseable en sujetos en necesidad de dicho tratamiento. El procedimiento implica tratar el sujeto en necesidad de dicho tratamiento con una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto de las formulas I -IV o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.

20 [0011] Los compuestos descritos en este documento son utiles para, pero no se limitan a, el tratamiento, la inhibicion o el retraso de la aparicion de los canceres. Los compuestos y los procedimientos tambien son utiles en el tratamiento de precanceres y otros incidentes de proliferacion celular no deseable. Los compuestos de formula I, II, III o IV, o combinaciones de los mismos, se administran a un sujeto que ha sido diagnosticado de, o esta en riesgo de desarrollar, una alteracion caracterizada por una proliferacion celular no deseable. Los compuestos y los procedimientos son utiles para tratar canceres que incluyen, pero no se limitan a, leucemia, melanoma, cancer de pulmon no microcitico, cancer de colon, canceres del sistema nervioso central, cancer de ovario, cancer de mama,

5 cancer de rinon y cancer de prostata. Adicionalmente, son utiles para ralentizar el crecimiento de estos canceres en individuos con precanceres, asi como en individuos con tendencia o con predisposicion genetica a estas alteraciones.

[0012] Los compuestos son utiles en procedimientos para inducir la apoptosis en celulas en proliferacion

10 rapida no deseada, comprendiendo el procedimiento la introduccion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto en las celulas en proliferacion rapida no deseada. Segun este procedimiento, las celulas en proliferacion rapida no deseada pueden ser celulas cancerosas. Las celulas cancerosas pueden elegirse del grupo que consiste en leucemia, melanoma, cancer de pulmon no microcitico, cancer de colon, canceres del sistema nervioso central, cancer de ovario, cancer de mama, cancer de rinon y cancer de prostata.

15 [0013] Los compuestos son adicionalmente utiles para evitar la reestenosis en un sujeto que ha experimentado un procedimiento de angioplastia o de endoprotesis vascular, que comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto, o combinaciones de los mismos, o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, al sujeto que ha experimentado un procedimiento de angioplastia o de endoprotesis

20 vascular.

[0014] Los siguientes terminos, usados en este documento incluyen, pero no se limitan a, las siguientes definiciones.

25 [0015] El termino "inhibidor de la senalizacion de PDK-1/Akt" significa que un compuesto especifico o una combinacion de compuestos es capaz de perturbar la via de senalizacion de PDK-1/Akt, medido frente a un blanco, independientemente de si es in vivo o in vitro. Un procedimiento se establece en los ejemplos, a continuacion, aunque tambien pueden usarse otros procedimientos conocidos ahora o desarrollados posteriormente.

30 [0016] El termino "tratamiento", segun se usa en este documento, engloba la administracion y/o la aplicacion de uno o mas compuestos descritos en este documento, a un sujeto, con el proposito de proporcionar la prevencion

o el cuidado y/o el remedio de una dolencia. El "tratamiento" para el proposito de esta desvelacion, puede, aunque no tiene por que, proporcionar una cura; mas bien, el "tratamiento" puede estar en forma del cuidado de la dolencia. Cuando los compuestos descritos en este documento se usan para tratar las celulas en proliferacion no deseada,

35 incluyendo canceres, el "tratamiento" incluye la destruccion parcial o total de las celulas en proliferacion no deseable con unos efectos destructores minimos sobre las celulas normales. Un mecanismo deseado de tratamiento de celulas en proliferacion rapida no deseable, incluyendo celulas cancerosas, a nivel celular, es la apoptosis.

[0017] El termino "prevencion" segun se usa en este documento incluye tanto la prevencion como la

40 ralentizacion de la aparicion de una proliferacion celular no deseada clinicamente evidente junto con la prevencion o la ralentizacion de la aparicion de una etapa preclinicamente evidente de una proliferacion celular rapida no deseada en individuos en riesgo. Tambien se pretende englobar con esta definicion la prevencion o la ralentizacion de la metastasis de celulas malignas o detener o revertir la progresion de las celulas malignas. Esto incluye el tratamiento profilactico de aquellos en riesgo de desarrollar precanceres y canceres. Tambien estan englobadas por esta

45 definicion la prevencion o la ralentizacion de la reestenosis en sujetos que han experimentado un procedimiento de angioplastia o de endoprotesis vascular.

[0018] Los terminos "terapeuticamente eficaz" y "farmacologicamente eficaz" pretenden calificar la cantidad de cada agente que conseguira el objetivo de la mejora en la gravedad de la enfermedad y la frecuencia de incidencia

50 con respecto al tratamiento con los compuestos descritos en este documento. Las cantidades terapeuticamente eficaces o farmacologicamente eficaces pueden ser determinadas facilmente por los expertos en la tecnica.

[0019] El termino "sujeto", con el proposito de tratamiento, incluye cualquier sujeto humano o animal que ha sido diagnosticado, tiene sintomas o muestra un riesgo de desarrollar una alteracion caracterizada por una 55 proliferacion celular rapida no deseada. Dichas alteraciones incluyen, pero no se limitan a, canceres y precanceres. Para los procedimientos de prevencion, el sujeto es cualquier sujeto humano o animal. Como ilustracion, con el proposito de prevencion, un sujeto puede ser un sujeto humano que esta en riesgo de, o esta geneticamente predispuesto a, obtener una alteracion caracterizada por una proliferacion celular rapida no deseada, tal como el cancer. El sujeto puede estar en riesgo debido a la exposicion a agentes carcinogenos, por estar geneticamente

predispuesto a alteraciones caracterizadas por una proliferacion celular rapida no deseada, y similares. Aparte de ser utiles para el tratamiento de seres humanos, los compuestos descritos en este documento tambien son utiles para el tratamiento veterinario de mamiferos, incluyendo animales de compania y animales de granja, tales como, pero no limitados a, perros, gatos, caballos, vacas, ovejas y cerdos.

[0020] Dosis y administración

[0021] Los estudios preliminares con animales han demostrado que estos compuestos pueden absorberse por via oral, pueden generar unas concentraciones sericas medias varias veces mayores que la TGI, y lo mas

10 importante, producen poca toxicidad a los animales tras la administracion oral diaria durante un mes (datos no mostrados).

[0022] Los compuestos de la presente invencion pueden formularse en preparaciones farmaceuticas adecuadas tales como comprimidos, capsulas o elixires para su administracion oral, o en disoluciones o 15 suspensiones esteriles para su administracion parenteral. Los agentes terapeuticos descritos en este documento pueden formularse en composiciones farmaceuticas usando tecnicas y procedimientos bien conocidos en la tecnica.

[0023] El inhibidor de la senalizacion de PDK-1/Akt descrito en este documento se combina con un vehiculo, portador, excipiente, ligante, conservante, estabilizante, sabor, etc., farmaceuticamente aceptable en una forma de 20 dosificacion unitaria asi denominada por la practica farmaceutica aceptada. La cantidad de sustancia activa en aquellas composiciones o preparaciones es tal que se obtiene una dosis adecuada en el intervalo indicado. En algunas formas de realizacion, la dosis puede ser de entre 0,1 y 1.000 mg del inhibidor de la senalizacion de PDK1/Aft. En algunas formas de realizacion, las composiciones pueden formularse en una forma de dosificacion unitaria, conteniendo cada dosis entre 1 y 500 mg. En otras formas de realizacion, la dosis puede ser desde 10 hasta 100 mg 25 del principio activo. El termino "forma de dosificacion unitaria" se refiere unidades fisicamente independientes adecuadas como dosis unitarias para sujetos humanos y otros mamiferos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado, en asociacion con un excipiente farmaceutico adecuado. La dosis puede depender de muchos factores, tales como la edad y el tamano del sujeto, la dolencia que se va a tratar, la gravedad de la dolencia y otros factores conocidos por los expertos en la

30 tecnica. Teniendo en cuenta esos factores, las dosis pueden ser determinadas por los expertos en la tecnica.

[0024] Para preparar las composiciones, se mezclan uno o mas de los agentes terapeuticos de la invencion con un portador farmaceuticamente aceptable. Despues de la mezcla o la adicion del (los) agente(s) terapeuticos(s), la mezcla resultante puede ser una disolucion, una suspension o una emulsion. Estas pueden prepararse segun

35 procedimientos conocidos por los expertos en la tecnica. La forma de la mezcla resultante depende de diversos factores, incluyendo el modo de administracion previsto y la solubilidad del compuesto en el portador o el vehiculo seleccionado. La concentracion eficaz es suficiente para inducir una apoptosis en las celulas no deseadas, tales como las celulas cancerosas, y puede ser determinada empiricamente.

40 [0025] Los portadores o los vehiculos farmaceuticos adecuados para la administracion de los presentes agentes terapeuticos incluyen cualquiera de dichos portadores adecuados para el modo de administracion en particular. Ademas, los materiales activos tambien pueden mezclarse con otros materiales activos que no deterioren la accion deseada, o con materiales que complementen la accion deseada, o que tengan otra accion. Los presentes agentes terapeuticos pueden formularse como el unico principio farmaceuticamente activo en la composicion o

45 pueden combinarse con otros principios activos. Tambien pueden usarse las sales de los presentes agentes terapeuticos para formular composiciones farmaceuticas eficaces.

[0026] Los presentes agentes terapeuticos pueden prepararse con portadores que los protejan frente a una rapida eliminacion del cuerpo, tales como en formulaciones de liberacion retardada o con recubrimientos. Dichos

50 portadores incluyen formulaciones de liberacion controlada tales como, pero no limitadas a, sistemas de administracion microencapsulados. El compuesto activo puede incluirse en el portador farmaceuticamente aceptable en una cantidad suficiente para que ejerza un efecto terapeutico util en ausencia de efectos secundarios indeseables en el paciente tratado.

55 [0027] El principio activo puede administrarse de una vez, o puede dividirse en varias dosis menores para ser administrado a intervalos temporales. Se entiende que la dosis y la duracion precisa del tratamiento son funcion de la enfermedad que se va a tratar, y pueden ser determinadas empiricamente usando protocolos de ensayo conocidos, o mediante la extrapolacion a partir de datos de ensayos in vivo o in vitro. Debe mencionarse que los valores de las concentraciones y las dosis tambien pueden variar segun la gravedad de la dolencia que se va a aliviar. Adicionalmente, debe entenderse que para cualquier sujeto en particular, deberian ajustarse los regimenes de dosificacion especificos con el tiempo segun las necesidades individuales y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administracion de las composiciones, y que los intervalos de concentracion establecidos en este documento son unicamente ejemplares y no pretenden limitar el ambito o la practica de las composiciones

5 reivindicadas.

[0028] Las composiciones orales incluiran generalmente un diluyente inerte o un portador comestible, y pueden comprimirse en comprimidos o introducirse en capsulas de gelatina. Con el proposito de una administracion terapeutica oral, el compuesto o los compuestos activos pueden incorporarse con excipientes y usarse en forma de

10 comprimidos, capsulas o pastillas. Pueden incluirse agentes ligantes y materiales coadyuvantes farmaceuticamente compatibles como parte de la composicion.

[0029] Las composiciones, por ejemplo en forma de comprimidos, pildoras, capsulas o pastillas, pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes o compuestos de una naturaleza similar: un ligante tal como, pero

15 no limitado a, goma de tragatanto, goma arabiga, almidon de maiz o gelatina; un excipiente tal como celulosa microcristalina, almidon o lactosa; un agente disgregante tal como, pero no limitado a, acido alginico y almidon de maiz; un lubricante tal como, pero no limitado a, estearato magnesico; un deslizante, tal como, pero no limitado a, dioxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; y un agente saborizante tal como menta, salicilato de metilo o saborizante de fruta.

20 [0030] Los compuestos de las formulas I -IV pueden desencadenar la muerte celular mediante diversos mecanismos diferentes, sin embargo, en la mayoria de las formas de realizacion, los compuestos son capaces de inducir una apoptosis en celulas en proliferacion no deseada. El termino "apoptosis" se refiere al proceso de la muerte celular programada. En todas las personas mueren cada dia cientos de miles de celulas viejas o danadas

25 mediante el proceso de apoptosis, y son sustituidas en un movimiento fluctuante para mantener un numero constante de celulas vivas en el cuerpo. Las celulas viejas y las danadas mueren en respuesta a una senal desencadenada en la superficie celular de las celulas objetivo para que se autodestruyan. La apoptosis se distingue de otros mecanismos de muerte celular, tales como la necrosis, que da como resultado una inflamacion que incluye hinchamiento, enrojecimiento, dolor y sensibilidad. La apoptosis no estimula dichas reacciones. En la apoptosis, las

30 celulas se resecan, se rompen en trozos y su contenido es discretamente eliminado mediante procedimientos que no inducen inflamacion. Por estas razones, es altamente deseable inducir la apoptosis, en lugar de la necrosis, en celulas en rapida proliferacion, tales como las celulas cancerosas. Sin embargo, las mutaciones en algunas celulas cancerosas confieren resistencia a la apoptosis a estas celulas. Se ha averiguado que los compuestos de las formulas I -IV inducen la apoptosis incluso en celulas cancerosas que, debido las mutaciones, son de otro modo

35 resistentes a la apoptosis. La apoptosis pueden distinguirse de otros mecanismos de tratamiento mediante procedimientos tales como la microscopia, que son conocidos en la tecnica.

[0031] Los terminos tales como "celulas proliferativas", "celulas en proliferacion", "celulas en rapida proliferacion", "celulas en proliferacion no deseable", "celulas en proliferacion rapida no deseable" y "celulas en

40 proliferacion rapida no deseada", se refieren a celulas cancerosas, a celulas precancerosas y a otras celulas en division rapida no deseada en un sujeto.

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS

45 [0032] Materiales Se extrajo 4-[5-(4-metilfenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il] bencensulfonamida de las capsulas obtenidas en Amerisource Health (Malvem, PA, EE.UU.) con acetato de etilo, seguido de una recristalizacion en una mezcla de acetato de etilo y hexano. El kit de deteccion de muerte celular mediante ELISA se adquirio en Roche Diagnostics (Mannheim, Alemania). Los anticuerpos policlonales de conejo frente a Akt y fosfo473 Ser Akt se obtuvieron en Cell Signaling Technologies (Beverly, MA, EE.UU.). El anticuerpo monoclonal de raton

50 antipolimerasa de poli(ADPribosa) (PARP) fue suministrado por Phanningen (Sari Diego, CA, EE.UU.). El kit de ensayo de la cinasa PDK-1 se adquirio en Upstate (Lake Placid, Ny, EE.UU.). Otros productos quimicos y bioquimicos se obtuvieron en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU,) salvo que se indique de otro modo. Los espectros de resonancia magnetica nuclear (RMN-1H) se midieron con un Bruker 250 MHz. Los desplazamientos quimicos (5) se indican en partes por millon (ppm) relativos al pico de TMS con CDCl3 como disolvente, salvo que se

55 mencione de otro modo. Los analisis por espectrometria de masas de ionizacion por electronebulizacion de alta resolucion se realizaron con un espectrometro de masas de Transformada de Fourier de 3 Tesla Finnigan FTMS2000.

Síntesis de compuestos químicos

[0033] Los compuestos enumerados en la Tabla 1 se prepararon y se ensayaron segun se indica a continuacion. Los nombres quimicos, los datos de resonancia magnetica nuclear de proton (RMN-1H) y de espectrometria de masas de alta resolucion (HRMS) se resumen a continuacion. Los procedimientos usados para

5 sintetizar los compuestos 1 -36 se describen en los ejemplos, a continuacion. Nota: los compuestos 1 -24 no son segun la invencion.

Tabla 1 Nomenclaturas, caracterizaciones mediante RMN-1H (resonancia magnética nuclear de protón) y HRMS (espectrometría de masas de alta resolución) de los compuestos 1 - 36.

Compuesto

Descripción

1

4-[5-(4-(2-bromoetil)fenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il] bencensulfonamida

RMN-1H 53,16 (t, J = 6,4, 2,0 Hz, 2H), ,3,60 (t, J = 6,4, 2,0 Hz, 2H), 4,90 (s, 2H), 6,75 (s, 1H), 7,13 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,20 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,47 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 7,91 (d, J = 8,5 Hz, 2H)

C18H15BrF3N3O2S: HRMS (M + Na+): masa teorica, 495,9913; masa real, 495,9943

2

4-[5-(4-(3-bromopropil)fenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1il] bencensulfonamida

RMN-1H 5 2,16 (m, 2H), 2,81 (t, J = 7,1 Hz, 2H), 3,41 (t, J = 6,4 Hz, 2H), 5,08 (s, 2H), 6,76 (s, 1H), 7,15 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,25 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,47 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 7,90 (d, J = 8,5 Hz, 2H)

C19H17BrF3N3O2S; HRMS (M + Na+): masa teorica, 510,0069; masa real, 510,0042

3

4-[5-(4-(2-azidoetil)fenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il] bencensulfonamida

RMN-1H 5 2,90 (t, J = 6,8 Hz, 2H), 3,51 (t, J = 6,8 Hz, 2H), 5,49 (s, 2H), 6,76 (s, 1H), 7,17 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,24 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,42 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 7,85 (d, J = 8,7, 2,0 Hz, 2H)

C18H15F3N6O2S; HRMS (M + Na+): masa teorica, 459,0821; masa real, 459,0817

4

4-[5-(4-(3-azidopropil)fenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1il] bencensulfonamida

RMN-1H 5 1,83 (m, 2H), 2,64 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 3,20 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 5,3 (s a, 2H), 6,67 (s, 1H), 7,07 (m, 4H), 7,35 (dd, J = 7,5, 2,0 Hz, 2H), 7,79 (d, J = 7,5, 2,0 Hz, 2H)

C19H17F3N6O2S; HRMS (M + Na+): masa teorica, 473,0978; masa real, 473,0946

5

4-[5-(4-butilfenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il] bencensulfonamida

RMN-1H 5 0,93 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 1,36 (m, 2H), 1,64 (m, 2H), 2,63 (t, J = 7,6 Hz, 2H), 5,54 *sm 2H), 6,76 (s, 1H), 7,15 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,20 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,45 (dt, J = 8,8, 2,0 Hz, 2H), 7,88 (dt, J = 8,8, 2,0 Hz, 2H)

C20H20F3N3O2S; HRMS (M + Na+): masa teorica, 446,1120; masa real, 446,1149

6

4-[5-(4-t-butilfenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il] bencensulfonamida

RMN-1H 5 1,33 (s, 9H), 4,90 (s, 2H), 6,53 (s, 1H), 7,32 (dd, J = 9,7 Hz, 4H), 7,42 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 8,02 (d, J = 8,8 Hz, 2H)

C20H20F3N3O2S; HRMS (M + Na+): masa teorica, 446,1120; masa real, 446,1118

7

4-[5-(2-naftalenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il] bencensulfonamida

RMN-1H 5 5,47 (s, 2H), 6,89 (s, 1H), 7,18 (dd, J = 8,6, 1,6 Hz, 1H), 7,42 (d a, J = 8,6 Hz, 2H), 7,51 - 7,55 (m, 2H), 7,78 - 7,83 (m, 6H)

C20H14F3N3O2S; HRMS (M + Na+): masa teorica, 440,0651; masa real, 440,0657

8

4-[5-(3-indolil)-3(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il] bencensulfonamida

RMN-1H 5 (acetona-d6) 6,69 (s a, 1H), 7,03-7,08 (m, 2H), 7,19 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 7,40 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,50 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,67 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 7,92 (d, J = 8,7 Hz, 2H)

C18H13F3N4O2S; HRMS (M + Na+): masa teorica, 429,0603; masa real, 429,0606

9

4-[5-4-bifenilil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il] bencensulfonamida

RMN-1H 5 4,81 (s, 2H), 6,75 (s, 1H), 7,23 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 7,34 - 7,56 (m, 5H), 7,56 (m, 4H), 7,86 (d, J = 8,5 Hz, 2H)

C22H16F3N3O2S; HRMS (M + Na+): masa teorica, 466,0807; masa real, 466,0811

10

4-[5-(4'-cloro[1,1'-bifenil]-4-il)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol1-il] bencensulfonamida

RMN-1H 5 6,42 (s, 2H), 6,83 (s, 1H), 7,30 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,40 - 7,59 (m, 8H), 7,92 (d, J = 8,2 Hz, 2H)

C22H15ClF3N3O2S; HRMS (M + Na+): masa teorica, 500,0418; masa real, 500,0432

11

4-[5-(3',5'-dicloro[1,1'-bifenil]-4-il)-3-(trifluorometil)-1Hpirazol-1-il] bencensulfonamida

RMN-1H 5 4,85 (s, 2H), 6,82 (s, 1H), 7,30 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,36 (s, 1H), 7,37 - 7,57 (m, 6H), 7,93 (d, J = 8,8 Hz, 2H)

C22H14Cl2F3N3O2S; HRMS (M + Na+): masa teorica, 534,0028; masa real, 534,0016

12

4-[5-(2',3'-dicloro[1,1'-bifenil]-4-il)-3-(trifluorometil)-1Hpirazol-1-il] bencensulfonamida

RMN-1H 5 4,85 (s, 2H), 6,76 (s, 1H), 7,18 - 7,25 (m, 3H), 7,35 - 7,49 (m, 6H), 7,88 (d, J = 8,6 Hz, 2H)

C22H14Cl2F3N3O2S; HRMS (M + Na+): masa teorica, 534,0028; masa real, 533,9999

13

4-[5-(2',4',5'-tricloro[1,1'-bifenil]-4-il)-3 (trifluorometil)-1Hpirazol-1-il] bencensulfonamida

RMN-1H 5 4,86 (s, 2H), 6,77 (s, 1H), 7,25 (dt, J = 8,6, 2,0 Hz, 2H), 7,37 (dt, J = 8,6, s,0 Hz, 2H), 7,39 (s, 1H), 7,46 (dt, J = 8,8, 2,0 Hz, 2H), 7,54 (s, 1H), 7,88 (dt, J = 8,9, 1,2 Hz, 2H)

C22H13Cl3F3N3O2S; HRMS (M + Na+): masa teorica, 567,9638; masa real, 567,9679

14

4-[5-(4'-metil[1,1'-bifenil]4-il)-3-(trifluorometil)-1H-1-il] bencensulfonamida

RMN-1H 5 2,32 (s, 3H), 4,57 (s, 2H), 6,72 (s, 1H), 7,18 - 7,21 (m, 4H), 7,39 - 7,52 (m, 6H), 7,84 (d, J = 8,9 Hz, 2H)

C23H18F3N3O2S; HRMS (M + Na+): masa teorica, 480,0964; masa real, 480,0961

15

4-[5-(4'triflourometil[1,1'-bifenil]-4-il)-3-(trifluorometil)-1H1-il] bencensulfonanude

RMN-1H 5 5,19 (s, 2H), 6,86 (s, 1H), 7,36 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,53 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 7,65 (m, 6H), 7,92 (d, J = 8,5 Hz, 2H)

C23H15F6N3O2S; HRMS (M + Na+): masa teorica, 534,0681; masa real, 534,0677

16

4-[5-(4'-bromometil(1,1'-bifenil]-4-il)-3-(trifluorometil)-1H-1il] bencensulfonamida

RMN-1H 5 3,92 (s, 2H), 4,93 (s, 2H), 6,66 (s, 1H), 7,037,26 (m, 8H), 7,38 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,82 (d, J = 8,6 Hz, 2H)

C23H17BrF3N3O2S; HRMS (M + Na+): masa teorica, 558,0069; masa real, 558,0112

17

4-[5-(3',5'-dimetil[1,1;-bifenil]-4-il)-3-(trifluorometil)-1H-1-il] bencensulfonamida

RMN-1H 5 2,40 (s, 6H), 5,38 (s a, 2H), 6,83 (s, 1H), 7,05 (s, 1H), 7,25 (m, 4H), 7,50 (dd, J = 6,7, 1,7 Hz, 2H), 7,59 (dd, J = 6,7, 1,7 Hz, 2H), 7,92 (dd, J = 6,7, 1,7 Hz, 2H)

C24H20F3N3O2S; HRMS (M + Na+): masa teorica, 494,1120; masa real, 494,1119

18

4-[5-(4'-butil[1,1'-bifenil]-4-il)-3-(trifluorometil)-1H-1-il] bencensulfonamida

RMN-1H 5 0,96 (t, J = 7,5 Hz, 3H), 1,41 (m, 2H), 1,66 9m, wH), 2,68 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 5,20 (s a, 2H), 6,84 (s, 1H), 7,29 (dd, J = 8,2, 2,0 Hz, 4H), 7,53 (dt, J = 8,2, 2,0 Hz, 4H), 7,62 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 7,93 (d, J = 8,5 Hz, 2H)

C26H24F3N3O2S; HRMS (M + Na+): masa teorica, 522,1433; masa real, 522,1466

19

4-[5-(4'-terc-buti[1,1'-bifenil]-4-il)-3-(trifluorometil)-1H-1-il] bencensulfonamida

RMN-1H 5 1,35 (s, 9H), 4,87 (s, 2H), 6,59 (s, 1H), 7,44 - 7,57 (m, 6H), 7,58 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,92 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 8,12 (d, J = 7,5 Hz, 2H)

C26H24F3N3O2S; HRMS (M + Na+): masa teorica, 522,1433; masa real, 522,1401

20

4-[5-(4-(fenilmetil)fenil)-3-(trifluorometil)-1H-1-il] bencensulfonamida

RMN-1H 5 3,71 (s, 2H), 4,74 (s, 2H), 6,52 (s, 1H), 6,917,11 (m, 9H), 7,27 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 7,69 (d, J = 8,9 Hz, 2H)

C23H18F3N3O2S; HRMS (M + Na+): masa teorica, 480,0964; masa real, 580,0938

21

4-[5-(9H-fluoren-2-il)-3-(trifluorometil)-1H-1-il] bencensulfonamida

RMN-1H 5 3,88 (s, 2H), 4,64 (s, 2H), 6,68 (s, 1H), 7,26 - 7,38 (m, 4H), 7,56 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 7,74 - 7,81 (m, 3H), 7,90 (d, J = 8,7 Hz, 2H) C23H16F3N3O2S; HRMS (M + Na+): masa teorica, 478,0807; masa real, 478,0771

22

4-[5-(9-antracenil)-3-(trifluorometil)-1H-1-il] bencensulfonamida

RMN-1H 6 4,63 (s, 2H), 6,93 (s, 1H), 7,33 (d, J = 6,8 Hz, 2H), 7,45 - 7,55 (m, 8H), 8,04 (d, J = 6,8 Hz, 2H), 8,60 (s, 1H)

C24H16F3N3O2S; HRMS (M + Na+): masa teorica, 490,0807; masa real 490,0769

23

4-[5-(2-fenantrenil)-3-(trifluorometliil)-1H-1-il] bencensulfonaniide

RMN-1H 5 (600 MHz) 4,89 (s, 2H), 6,92 (s, 1H), 7,37 (d, J = 8,5, 1,4 Hz, 1H), 7,51 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,54 -7,69 (m, 3H), 7,80 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,86 -7,92 (m, 4H), 8,64 (d, J = 8,4 Hz, 2H)

C24H16F3N3O2S; HRMS (M + Na+): masa teorica, 490,0807; masa real, 490,0805

24

4-[5-(9-fenantrenil)-3-(trifluorometil)-1H-1-il] bencensulfonamida

RMN-1H 5 4,76 (s, 2H), 6,90 (s, 1H), 7,43 -7,84 (m, 11H), 8,72 (t, J = 7,8 Hz, 2H)

C24H16F3N3O2S; HRMS (M + Na+): masa teorica, 490,0807; masa real, 490,0833

25

4-[5 (2-fenantrenil)-3-(trifluorometil)-1H-1-il] bencencarboxamida

RMN-1H 5 5,75 - 6,05 (d a, 2H), 7,0 (s, 1H), 7,50 (dd, J = 8,5, 1,4 Hz, 1H), 7,55 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 7,77 (m, 3H), 7,88 (m, 3H), 7,90 (m, 2H), 8,72 (m, 2H)

C25H16F3N3O; HRMS (M + Na+): masa teorica, 454,0038; masa real, 454,1142

26

4-[5-(2-fenantrenil)-3-(trifluorometil)-1H-1-il] benzonitrilo

RMN-1H 5 6,91 (s, 1H), 7,46 (s, 1H), 7,50 (d, J = 2,0 Hz, 2H), 7,63 - 7,79 (m, 5H), 7,83 (d, J = 2,0 Hz, 2H), 7,92 (m, 1H), 8,64 (d, J = 8,4 Hz, 2H)

C25H14F3N3 ; HRMS (M + Na+): masa teorica, 436,1032; masa real, 436,1032

27

4-[5-(2-fenantrenil)-3-(trifluorometil)-1H-1-il]-N-hidroxibenzamidina

RMN-1H 5 7,10 (s, 1H), 7,34 (dd, J = 4,0,0,9 Hz, 1H), 7,36 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 7,37 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 7,42 - 7,45 (m, 3H), 7,46 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 7,51 -7,52 (m, 2H), 7,53 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 7,57 (s, 1H), 7,89 (s, 1H), 7,91 (s, 1H)

C25H17F3N3O; HRMS (M + Na+): masa teorica, 469,1220; masa real, 469,1247

28

5-(2-fenantrenil)-3-(trifluorometil)-4-(1H-1-tetrazol-5ilfenil)-1H-pirazol

RMN-1H 5 6,82 (s, 1H), 7,28 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 7,38 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 7,48 - 7,74 (m, 5H), 7,74 (d, J = 2,5 Hz, 2H), 7,95 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 8,47 (d, J = 8,7 Hz, 2H)

C25H15F3N6; HRMS (M + Na+): masa teorica, 479,1202; masa real, 479,1225

29

4-[5-(2-fenantrenil)-3-(trifluorometil)-1H-1-pirazol-1-il]benzaldehido oxima

RMN-1H 5 6,81 (s, 1H), 7,27 -7,30 (m, 3H), 7,47 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 7,52 - 7,57 (m, 4H), 76,8 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,75-7,79 (m, 2H), 8,48 - 8,53 (m, 2H)

C25H16F3N3O; HRMS (M + Na+): masa teorica, 454,1137; masa real, 454,1106

30

4-[5-(2-fenantrenil)-3-(trifluorometil)-1H-1-pirazol-1-il)benzaldehido hidrazona

RMN-1H 5 6,81 (s, 1H), 7,27 -7,30 (m, 2H), 7,33 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 7,42 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,53 -7,55 (m, 2H), 7,57 - 7,60 (m, 2H), 7,68 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 7,75 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 7,80 (s, 1H), 8,48 - 8,55 (m, 2H)

C25H17F3N4; HRMS (M + Na+): masa teorica, 453,1297; masa real, 453,1302

31

4-[5-(2-fenantrenil)-3-(trifluorometil)-1H-1-pirazol-1-il]fienil}-acetonitrilo

RMN-1H 5 3,77 (S, 2h), 6,93 (S, 1h), 7,29 -7,43 (M, 4h), 7,66 - 7,86 (M, 6h), 8,65 (T, J = 7,0 Hz, 3H)

C26H16F3N3; HRMS (M + Na+): masa teorica, 450,1151; masa real, 450,1188

32

2-{4-[5-(2-fenantrenil)-3-(trifluorometil)-1H-1-pirazol-1-il]fenil}-N-hidroxi-acetamidina

RMN-1H 5 3,30 (s, 1H), 3,38 (s, 1H), 6,83 (s, 1H), 7,20 - 7,41 (m, 4H), 7,59 - 7,89 (m, 6H), 8,55 -8,60 (m, 3H)

C26H19F3N4O; HRMS (M + Na+): masa teorica, 461,1580; masa real, 461,1584

33

5-(2-fenantrenil)-3-(trifluorometil)-4-(1H-tetrazol-5ilmetilfenil)-1H-pirazol

RMN-1H 5 4,45 (s, 2H), 7,15 (s, 1H), 7,42 (s, 4H), 7,53 (d, J = 6,9 Hz, 1H), 7,66 - 7,76 (m, 3H), 7,89 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 8,01 (m, 2H), 8,78 (t, J = 6,9 Hz, 2H)

C26H17F3N6; HRMS (M + Na+): masa teorica, 493,1335; masa real, 493,1359

34

2-amino-N-{4-[5-(2-fenantrenil)-3-(trifluorometil)-1Hpirazol-1-il]-fenil} acetamida

RMN-1H 5 3,48 (s, 2H), 6,92 (s, 1H), 7,35 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,42 (dd, J = 8,6, 1,7 Hz, 1H),7,62 - 7,72 (m, 5H), 7,79 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,85 -7,94 (m, 2H), 8,62 (t, J = 8,5 Hz, 2H), 9,56 (br s 1H)

C26H19F3N4O; HRMS (M + Na+): masa teorica, 483,1403; masa real, 483,1389

35

4-[5-(2-fenantrenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il]-fenilguanidina

RMN-1H 5 6,90 (s, 1H), 7,19 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 7,34 (dd, J = 8,7, 2,0 Hz, 1H), 7,39 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 7,61 - 7,67 (m, 3H), 7,79 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 7,84 -7,91 (m, 3H), 8,62 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 9,95 (s, 1H)

C25H18F3N5; HRMS (M + H): masa teorica, 446,1587 (M + H); masa real, 446,1596 (M + H)

36

4-[5-(2-fenantrenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il]-fenilurea

RMN-1H 5 6,98 (s, 1H), 7,19 (dt, J = 8,9, 2,1 Hz, 2H), 7,34 - 7,42 (m, 3H), 7,51 - 7,62 (m, 4H), 7,70 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 7,81 - 7,85 (m, 2H), 8,59 - 8,64 (m, 2H)

C25H17F3N4O; HRMS (M + Na+): masa teorica, 469,1252; masa real, 469,1199

[0034] Las celulas humanas PC-3 (p53-/-) de cancer de prostata no sensibles a androgenos para el cultivo celular se adquirieron en la American Type Tissue Collection (Manassas, VA, EE.UU.). Las celulas se cultivaron en medio RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, Ny, EE.UU.), complementado con suero bovino fetal al 10� (FBS; Gibco) a

5 37�C en una estufa de incubacion humidificada que contiene un 5� de CO2.

[0035] Análisis de la viabilidad celular Se evaluo el efecto de la 4-[5-(4-metilfenil)-3-(trifluorometil)-1Hpirazol-1-il] bencensulfonamida y sus derivados sobre la viabilidad de las celulas PC-3 mediante el uso de un ensayo con MTT {bromuro de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-2H-tetrazolio]} en seis replicados. Las celulas se hicieron 10 crecer en medio RPMI 1640 complementado con FBS al 10� en placas de fondo redondo de 96 pocillos durante 24 h, y se expusieron a varias concentraciones de los compuestos 1 -36 disueltos en DMSO (concentracion final � 0,1�) en medio RPMI 1640 que contenia un 1� de suero durante diferentes intervalos de tiempo. Los controles recibieron vehiculo de DMSO a una concentracion igual a la de las celulas tratadas con el farmaco. El medio se elimino y se sustituyo por 200 ml de MTT de 0,5 mg/ ml en medio RPMI 1640 que contenia FBS al 10�, y las celulas

15 se incubaron en la estufa de incubacion de CO2 a 37�C durante 2 h. Los sobrenadantes se eliminaron de los pocillos, y el pigmento MTT reducido se solubilizo en 200 ml/pocillo de DMSO. La absorbencia a 570 nm se determino con un lector de placas.

[0036] Proliferación celular Las celulas PC-3 se sembraron en placas de seis pocillos a 50.000

20 celulas/pocillo en medio RPMI 1640 que contenia FBS al 10�. Despues de un periodo de union de 24 h, las celulas se trataron por triplicado con la concentracion indicada de los compuestos 1 -36 o con vehiculo de DMSO en medio RPMI 1640 que contenia FBS al 10�. Las celulas se recogieron en diferentes intervalos temporales mediante tripsinizacion, y se contaron usando un contador Coulter modelo Z1 D/T (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EE.UU,).

25 [0037] Análisis de la apoptosis Se usaron dos procedimientos para evaluar la muerte celular apoptotica inducida por el farmaco: la deteccion de la fragmentacion del ADN mediante el kit de deteccion de muerte celular mediante ELISA (Roche Diagnostics. Mannheim, Alemania) y mediante un analisis por inmunotransferencia Western de la escision de polimerasa de poli-(ADP-ribosa) (PARP). El ELISA se realizo segun las instrucciones del fabricante, y se basa en la determinacion cuantitativa de los fragmentos de ADN citoplasmaticos asociados a histonas en forma

30 de mononucleosomas u oligonucleosomas generados despues de la muerte apoptotica inducida. En resumen, se cultivaron 4 x 105 celulas PC-3 en un matraz T-25 durante 24 h antes del tratamiento. Las celulas se trataron con el vehiculo de DMSO o con el agente de prueba a las concentraciones indicadas durante 6 -24 h, se recogieron y se usaron los lisados equivalentes a 2 x 103 celulas PC-3 en el ELISA. Para el ensayo de escision de la PARP, las celulas tratadas con el farmaco se recogieron 4 -8 h despues del tratamiento, se lavaron con PBS enfriado en hielo

35 y se resuspendieron en tampon de lisis que contenia Tris-HCl 20 mM, pH 8, NaCl 137 mM, CaCl2 1 mM, 10� de glicerol, 1� de Nonidet P-40, 0,5� de desoxicolato, 0,1� de SDS, fluoruro de 4-(2-aminoetil) bencensulfonilo 100 µM, leupeptina a 10 µg/ml y aprotinina a 10 µg/ml. Los lisados celulares solubles se recogieron despues de una centrifugacion a 10.000 g durante 5 min. Se resolvieron cantidades equivalentes de proteinas (60 -100 µg) de cada lisado en geles de SDS-poliacrilamida al 8�. Las bandas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se analizaron mediante inmunotransferencia con un anticuerpo anti-PARP.

[0038] Inmunotransferencia. El procedimiento general para el analisis mediante inmunotransferencia

5 Western de la Akt y la fosfo-Akt se describe como sigue. Las celulas se lavaron en PBS, se resuspendieron en tampon de muestra de SDS sonicadas con un sonicador ultrasonico durante 5 s, y se hirvieron durante 5 min. Despues de una breve centrifugacion, se resolvieron las concentraciones equivalentes de proteinas procedentes de las fracciones solubles en geles de SDS-poliacrilamida al 10� en un aparato Minigel, y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa usando una celda de transferencia semiseca. La membrana inmunotransferida se lavo

10 tres veces con TBS que contenia un 0,05� de Tween 20 (TBST). Despues de bloquear con TBST que contenia un 5� de leche desnatada durante 60 min, la membrana se incubo con el anticuerpo primario a una dilucion de 1:1.000 en TBST-5� de leche semidesnatada a 4�C durante 12 h, y despues se lavo tres veces con TBST. La membrana se sondeo con conjugados de IgG-HRP de cabra anti-conejo (1:1.000) durante 1 h a temperatura ambiente, y se lavo tres veces con TBST. Los inmunotransferidos se visualizaron mediante quimioluminiscencia mejorada.

15 [0039] Actividad de la cinasa PDK-1 Este ensayo in vitro se realizo usando un kit de ensayo de la cinasa PDK-1 (Upstate Lake Placid, Ny, EE.UU.) segun las instrucciones del vendedor. Este ensayo exento de celulas se basa en la capacidad de la PDK-1 recombinante de activar, en presencia de vehiculo de DMSO o del agente de prueba, su cinasa regulada por suero y glucocorticoides cascada abajo (SGK), que a su vez, fosforila el sustrato

20 peptidico especifico de Akt/SGK RPRAATF con [�-32]-ATP. El sustrato peptidico fosforilado con [32P] se separa entonces del [�-32P]-ATP residual usando papel de fosfocelulosa P81 y se cuantifica con un contador de centelleo despues de tres lavados con acido fosforico al 0,75�. Los valores referidos representan las medias de dos determinaciones independientes.

25 [0040] Ensayo de la cinasa Akt inmunoprecipitada La inmunoprecipitacion de la Akt se realizo segun un procedimiento publicado modificado. Las celulas PC-3 se trataron con vehiculo de DMSO o con los agentes de prueba a las concentraciones indicadas durante 2 h y despues se lisaron a 4�C durante 1 h en tampon A que contenia Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, 1� de Triton X-100, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, fluoruro sodico 50 mM, �glicerofosfato sodico 10 mM, 0,1� de 2-mercaptoetanol, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,1 mM y 1 µg/ml de cada una

30 de aprotinina, pepstatina y leupeptina. Los lisados celulares se centrifugaron a 10.000 g durante 5 min, y el sobrenadante se trato con anti-Akt a 4�C durante 60 min, seguido de microesferas de proteina G-agarosa durante 60 min adicionales. El inmunoprecipitado se uso para analizar la actividad de la cinasa Akt mediante el uso del sustrato peptidico especifico de Akt/SGK RPRAATF como se ha descrito anteriormente. Los valores representaban las medias de dos determinaciones independientes.

35 [0041] Análisis estadístico Cada experimento se realizo por triplicado, salvo que se indique de otro modo. Todos los experimentos se realizaron al menos dos veces en diferentes ocasiones. Cuando sea apropiado, los datos se presentan como la media + un intervalo de confianza del 95�.

40 [0042] La estructura y la potencia en la inhibicion de la actividad de la cinasa PDK-1 y del crecimiento de las celulas PC-3 de los compuestos 1 - 24 (que no son compuestos de la invencion) se resumen en la Tabla 2.

Tabla 2 Estructuras y potencia para inhibir la actividad de la cinasa PDK-1 recombinante y para inducir la muerte apoptotica en celulas PC-3 de la 4-[5-(4-metilfenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il] bencensulfonamida y de los

45 compuestos 1 � 24

Número

Ar CI50 ( M)

PDK-1

PC-3

Compuesto comparativo

48 30

1

42 18

2

38 17

3

32 17

4

34 18

5

20 9

6

34 18

7

24 11

8

65 31

9

21 11

10

22 9

11

18 10

12

23 10

13

9 5

14

15 8

15

18 8

16

20 11

17

17 9

18

32 15

19

32 15

20

15 8

21

16 9

22

12 7

23

9 5

24

42 23

[0043] Estos compuestos, excepto el derivado de indol 8, mostraron unas actividades inhibidoras de la PDK-1 y antiproliferativas mejoradas con respecto a la 4-[5-(4-metilfenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il] bencensulfonamida. Adicionalmente, ninguno de estos compuestos mostro una actividad inhibidora de la COX-2 5 mensurable (datos no mostrados). Se aprecio un incremento general en la actividad inhibidora de la PDK-1 segun aumentaba el volumen del anillo aromatico, es decir, anillos aromaticos triciclicos (21 -23) � bifenilo sustituido (9 19) � fenilo sustituido (1 -6). Estos datos sugieren que el sistema aromatico se une a una gran region hidrofoba del bolsillo de la enzima. De entre los 24 analogos examinados, el compuesto 23 representaba el derivado optimo, con unos valores de CI50 de 9 µM y 5 µM para inhibir la actividad de la PDK-1 y la viabilidad de las celulas PC-3, 10 respectivamente, segun se refiere en laTabla2. Estosvalores de CI50 secorrespondian con una mejorade entre 5y 6 veces con respecto a las actividades de la 4-[5-(4-metilfenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il] bencensulfonamida

(48 µM y 30 µM, respectivamente). Sin embargo, el compuesto 24 mostro una disminucion, en comparacion con el compuesto 59, de la actividad inhibidora de la PDK-1, que podria ser atribuible a impedimentos estericos impuestos por una orientacion desfavorable del anillo aromatico triciclico.

5 [0044] Existia una correlacion entre la PDK-1 y la inhibicion del crecimiento de las PC-3 en todos los compuestos examinados, lo que sugiere la relevancia mecanistica de la inhibicion de la PDK-1 sobre el efecto antiproliferativo. Globalmente, el valor de la CI50 para la inhibicion de la proliferacion de las celulas PC-3 era aproximadamente la mitad del de la inhibicion de la PDK-1. Esta discrepancia podria surgir de una sinergia mecanistica entre la inhibicion de la PDK-1 y la concomitante desfosforilacion de la Akt por la fosfatasa de proteinas

10 2A (PP2A) en celulas tratadas con Aug, dando como resultado un aumento en la desactivacion de la Akt. Para examinar esta premisa, se trataron celulas PC-3 con diferentes concentraciones del compuesto 23 durante 2 h, y se evaluo el consiguiente efecto sobre AM mediante dos ensayos independientes: la actividad de la cinasa Akt inmunoprecipitada y el estado de fosforilacion de la Akt. Ambos ensayos dieron resultados coherentes.

15 [0045] Segun el ensayo de la cinasa, la CI50 del compuesto 23 para inhibir la activacion intracelular de la kt era de 5 µM. Ni el compuesto 23 ni ningun otro de los compuestos mostraron un efecto inhibidor directo sobre la actividad de la Akt inmunoprecipitada. Mientras tanto, el analisis por inmunotransferencia Western muestra que el tratamiento de las celulas PC-3 con el compuesto 23 a 5 µM y superior condujo a una significativa desfosforilacion de la Akt.

20 [0046] La inhibicion de la senalizacion de PDK-1/Akt condujo a la muerte apoptotica en celulas PC-3 en medio RPMI 1640 que contenia FBS al 1� de una forma dependiente de la dosis, segun se evidencio por la fragmentacion del ADN y la escision de la PARP. La dosis del compuesto 23 que se requirio para la induccion de la muerte del 50� de las celulas PC-3 a las 24 h era de 5 µM. Los valores de la CI50 del compuesto 23 para inducir la muerte de las

25 celulas PC-3 eran coherentes con los de la inhibicion de la activacion de la Akt en celulas tratadas con el farmaco. Adicionalmente, se examino el efecto del compuesto 23 sobre la proliferacion de las celulas PC-3 en medio RPMI 1640 complementado con FBS al 10�. El compuesto 23 a 1 µM mostro una sustancial actividad antiproliferativa. En conjunto, estos datos indicaban claramente la eficacia in vitro del compuesto 23 en la inhibicion del crecimiento de las PC-3.

30 [0047] El modelo mostro que el compuesto 23 se anclaba en el dominio de union al ATP, que esta ubicado en una profunda hendidura entre los dos lobulos de la PDK-1. Aunque el compuesto 23 competia con el ATP por la union, se encontro que el modo de union del compuesto 23 era de algun modo diferente al del ATP. Mientras que la fraccion de bencensulfonamida ocupaba el motivo de union adenina, la fraccion de pirazol planar era perpendicular

35 al anillo ribosa. Esta disposicion posicionaba el anillo de fenantreno adyacente por detras del bolsillo de union al trisfosfato. El anillo de fenantreno formaba interacciones hidrofobas con una region apolar formada por los residuos 88 - 96 que engloban parte de las dos laminas � adyacentes unidas por un bucle rico en glicina.

[0048] En la Tabla 3 se resumen las estructuras de doce derivados representativos, su potencia frente a la

40 PDK-1 y su capacidad para provocar la muerte apoptotica en celulas PC-3 (el compuesto 25 no es un compuesto de la invencion).

Tabla 3 Estructuras y potencia para la inhibicion de la actividad de la cinasa PDK-1 recombinante y para inducir una muerte apoptotica celulas PC-3 para los compuestos 25 - 36. Las estructuras generales de estos compuestos se

45 muestran en la parte superior.

Número

R CI50 ( M)

PDK-1

PC-3

25

-CONH2 12 7

26

-CN 45 30

27

40 25

28

52 32

29

25 14

30

16 10

31

-CH2CN 42 25

32

15 8

33

45 27

34

5 5

35

2 3

36

40 24

[0049] De entre en estos derivados, los compuestos 34 y 35 mostraron unos valores de la CI50 para la inhibicion de la PDK-1 de 5 µM y2 µM, respectivamente, que representaban unos incrementos de 2 y 5 veces en la potencia con respecto al compuesto 23. Los compuestos 34 y 35 contenian cadenas laterales de 2-aminoacetamida 5 (-NHC(O)CH2NH2) y guanidina (-NHC(=NM)NH2), respectivamente. Al igual que el compuesto 23, no mostraron una inhibicion directa apreciable sobre la actividad de la cinasa Akt inmunoprecipitada, ni habia una actividad inhibidora de la COX-2 mensurable detectada a unas concentraciones de hasta 50 µM. La exposicion de las celulas PC-3 a cualquiera de los agentes, incluso a 1 µM, dio como resultado una disminucion sustancial en el nivel de fosfo-Akt. Esta mejora en la potencia reflejaba un fortalecimiento de los puentes de hidrogeno en las interacciones proteina

10 ligando para estos derivados. Esta premisa estaba apoyada por el anclaje modelado del compuesto 35 en el sitio de union al ATP. El grupo guanidino del compuesto 35 se asemejaba a la estructura parcial del anillo de purina del ATP, lo que permitia la formacion de los puentes de hidrogeno, con las Ser160 y Ala162 segun se representa en el modelo de anclaje.

15 [0050] Efectos celulares de los inhibidores de la senalizacion de PDK-1/Akt Ambos compuestos 34 y 35 inducian una muerte apoptotica en celulas PC-3 en medio que contenia FBS al 1� de una forma dependiente de la dosis, como se demostro por la fragmentacion del ADN y la escision de la PARP. Estos agentes mostraron una potencia mayor que el compuesto 23 en la induccion de apoptosis a unas concentraciones mayores de 2,5 µM. Ademas, estos derivados se remitieron al Developmental Therapeutic Program (DTP) del National Cancer Institute

20 (NCI) para un cribado frente a 60 lineas celulares tumorales humanas, que representan leucemia, melanoma y canceres de pulmon, de colon, de cerebro, de ovario, de mama, de prostata y de rinon. Los datos de respuesta frente a la dosis de una linea celula representativa de cada clase de celulas tumorales despues de dos dias de exposicion en medio que contenia FBS al 5� se muestran en la Fig. 1C, que incluyen: 1, RPMI-celulas de leucemia 8226; 2, NCI-celulas de cancer de pulmon no microcitrico H322M; 3, celulas HT29 de cancer de colon; 4, celulas

25 U251 de cancer del SNC; 5, celulas cancerosas SK-MEL-28 de melanoma; 6, celulas SK-OV-3 de cancer de ovario; 7, celulas RXF 393 de cancer de rinon; 8, celulas PC-3 de cancer de prostata; 9, celulas MDA-MB-231 de cancer de mama. Muchas de estas lineas celulares respondian al efecto inhibidor del crecimiento de ambos agentes a unas concentraciones tan bajas como 0,1 µM.

30 [0051] En el ensayo con las 60 lineas celulares, se calcularon tres parametros de respuesta frente a la dosis para cada linea celular basandose en las curvas de inhibicion del crecimiento. Estos parametros incluyen G150 (concentracion que da como resultado una inhibicion del crecimiento del 50�), TGI (concentracion que da como resultado una herramienta de inhibicion del crecimiento), y LC50 (concentracion que da como resultado una reduccion del 50� en el nivel de proteinas medido al final del tratamiento con el farmaco en comparacion con el

35 inicial). Las medias de estos parametros de las 60 lineas celulares diferentes para los compuestos 34 y 35 despues de un tratamiento de dos dias fueron como sigue, respectivamente, G150: 1,1 y 1,2 µM; TGI: 3,2 y 2,9 µM; LC50: 24 y 8,5 µM. Estos datos demuestran claramente la eficacia in vitro de los compuestos 34 y 35. Ambos agentes fueron capaces de suprimir completamente el crecimiento celular en un diverso abanico de lineas celulares tumorales en el intervalo terapeutico de 3 - 5 µM.

40 [0052] A la luz del papel conservado de la senalizacion de PDK-1/Akt en la supervivencia y la proliferacion de las celulas cancerosas, esta via representa un objetivo terapeuticamente relevante para el desarrollo de pequenas moleculas inhibidoras biodisponibles por via oral.

45 [0053] El anclaje in silico del compuesto 23 en el bolsillo de union al ATP mostro que la molecula se anclaba en el dominio de union al ATP, en parte, a traves de puentes de hidrogeno entre la sulfonamida y la amida de la Ala162. Tambien se ha informado de que la Ala162 juega un papel clave en el anclaje de otros ligandos tales como ATP17 y UCN-01 a la PDK-1. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que la fraccion de sulfonamida del compuesto 23 podria ser susceptible de alteraciones para optimizar su potencia.

50 [0054] Consecuentemente, la sustitucion de la funcion sulfonamida por 2-aminoacetamida (-NHC(O)CH2NH2) y guanidina (-NHC(=NM)NH2) condujo a los compuestos 34 y 35, ambos de los cuales mostraron una inhibicion mejorada de la PDK-1, con unos valores de CI50 de 5 y 2 mM, respectivamente. El anclaje del compuesto 35 en el sitio de union al ATP revelo la existencia de un puente de hidrogeno adicional entre la fraccion de guanidina y el oxigeno del esqueleto de la Ser160, lo que sugiere que la mejora de la potencia podria ser atribuible a un aumento en los puentes de hidrogeno. El efecto de estas cadenas laterales sobre la union con el ligando es, sin embargo, sutil, segun se ilustra por la relacion entre estructura y actividad resumida en la Tabla 3.

5 [0055] La elevada potencia de los compuestos 34 y 35 en la inhibicion de la PDK-1 estaba reflejada en sus capacidades para bloquear eficazmente la activacion de la Akt e inducir una muerte celular apoptotica en las celulas PC-3 a bajas concentraciones µM (Figs. 1A, B). Aun mas importante, debido al papel conservado de la senalizacion de PDK-1/Akt en la proliferacion y la supervivencia celulares, estos agentes eran potentes inhibidores del crecimiento celular en un medio que contenia suero en las 60 lineas celulares tumorales humanas examinadas, con

10 unos valores medios de GI50 (inhibicion del 50� del crecimiento celular) de 1,2 µM y 1,3 µM, respectivamente, unos valores aridos de la TGI (inhibicion total del crecimiento) de 3,2 µM y 2,9 µM, respectivamente. Nuestros estudios preliminares con animales han mostrado que estos compuestos pueden absorberse por via oral, pueden generar unas concentraciones sericas medias varias veces superiores a la TGI, y mas importante, producir poca toxicidad a los animales tras su administracion oral diaria durante un mes (datos no mostrados).

15 [0056] Las pruebas de eficacia in vivo frente a diferentes xenoinjertos tumorales en ratones no tratados esta actualmente en marcha en este laboratorio. Ademas, las pruebas toxicologicas y farmacologicas de estos agentes seran llevadas a cabo dentro del programa Rapid Access to Intervention Development (RAID) del NCI.

20 Procedimientos sintéticos generales para los compuestos 1 - 24

[0057] Todos los reactivos quimicos y los disolventes organicos se adquirieron en Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.) salvo que se indique de otro modo. Los compuestos 1 -24 se sintetizaron segun un procedimiento general en dos etapas descrito en el Esquema 1, en el que Ar representa las respectivas estructuras del anillo aromatico.

El compuesto 23 se usa aqui como un ejemplo para ilustrar la sintesis del grupo de compuestos (Esquema 2). Otros compuestos siguieron los mismos procedimientos a traves de precursores y los respectivos intermedios con 30 diferentes estructuras del anillo aromatico (compuestos I y II).

[0058] EJEMPLO 1 Síntesis del precursor de la 1,1,1-trifluoro-4-hidroxi-4-fenantren-2-il-but-3-en-2-ona

35 (etapa 1). A una suspension de hidruro sodico (NaH; 0,13 g, 5,4 mmol) en 5 ml de tetrahidrofurano anhidro (THF) se anadio trifluoracetato de etilo (CF3COOEt; 0,64 g, 4,5 mmol) en una atmosfera de argon. Despues de agitar a 25�C durante 10 minutos, se anadio gota a gota 2-acetil-fenantreno (1 g, 4,5 mmol) en 5 ml de THF a la disolucion. La mezcla se volvio transparente, y de color naranja a los 30 minutos, y despues de agitar durante 2 horas adicionales, se concentro a vacio. El residuo se suspendio en agua, y se extrajo con acetato de etilo (15 ml) dos veces. La fase organica se separo, se seco sobre sulfato sodico y se concentro a sequedad a vacio para dar el producto (solido de color amarillo; 1,29 g, rendimiento del 90�). El producto se uso directamente sin purificacion adicional.

5 [0059] EJEMPLO 2 Síntesis del Compuesto 23 (etapa 2). Se anadio clorhidrato de 4-hidracinbencen-1sulfonamida (1,1 g; 4,9 mmol) a una disolucion agitada de 1,1,1,-trifluoro-4-hidroxi-4-fenantren-2-il-but-3-en-2-ona (1,29 g, 4,1 mmol) en 40 ml de etanol. La mezcla se calento a reflujo durante 12 horas, se enfrio hasta la temperatura ambiente y se concentro a sequedad a vacio. El residuo se disolvio en acetato de etilo y se lavo con agua. La capa organica se seco sobre sulfato sodico y se concentro a vacio. El producto en bruto se purifico

10 mediante cromatografia ultrarrapida en gel de silice para producir 59 (1,52 g, rendimiento del 80�).

[0060] EJEMPLOS 3 - 14 Síntesis of los Compuestos 25 - 36 Los compuestos 25 - 36 se sintetizaron usando 1,1,1-trifluoro-4-hidroxi-4-fenantren-2-il-but-3-en-2-ona, producto de la anteriormente mencionada etapa 1, como precursor comun, segun se resume en la Fig. 2.

[0061] EJEMPLO 3 4-[5-(2-Fenantracenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il]-bencencarboxamida (25)

(etapa 3). Se anadio clorhidrato de (4-carbamoilfenil)-hidracina (0,92 g, 4,9 mmol) a una disolucion agitada de 1,1,1hifluoro-4-hidroxi-4-fenantren-2-il-but-3-en-2-ona (1,29 g, 4,1 mmol) en 40 ml de etanol a 25�C. La mezcla se calento a reflujo durante 12 horas, se enfrio hasta la temperatura ambiente y se concentro a sequedad a vacio. El residuo se

20 disolvio en acetato de etilo y se lavo con agua. La capa organica se seco sobre sulfato sodico y se concentro a vacio. El producto en bruto se purifico mediante cromatografia ultrarrapida en gel de silice (acetato de etilo -hexano, 1:1), - produciendo el compuesto 25 (1 g, rendimiento del 60�).

[0062] EJEMPLO 4 4-[5-(2-Fenantrenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il]-benzonitrilo (26) (etapa 4). A una

25 disolucion agitada de 1,1,1-trifluoro-4-hidroxi-4-fenantren-2-il-but-3-en-2-ona (2,45 g, 7,7 mmol) en 60 ml de etanol se anadio clorhidrato de 4-cianofenilhidracina (2,53 g, 15 mmol) a 25�C. La mezcla se agito a la temperatura de reflujo durante 12 horas, se enfrio hasta la temperatura ambiente y se concentro a sequedad a vacio. El residuo se disolvio en cloruro de metileno y se lavo con agua. La capa organica se seco sobre sulfato sodico y se concentro a vacio. El producto en bruto se purifico mediante cromatografia ultrarrapida en gel de silice (acetato de etilo -hexano,

30 1:4) para proporcionar el compuesto 26 (2,7 g, rendimiento del 85�).

[0063] EJEMPLO 5 4-[5-(2-Fenantrenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il]-N-hidroxibenzamidina (27)

(etapa 5). Se anadio clorhidrato de hidroxilamina (25 mg, 0,36 mmol a una suspension de Na metalico (8,3 mg, 0,36 mmol) en metanol (3 ml). La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 10 minutos y se anadio el compuesto

35 (26 (1224 mg, 0,3 mmol). La mezcla se calento a reflujo durante 2 horas, despues se agito a 25�C durante 16 horas adicionales y se concentro a vacio. El residuo se purifico mediante cromatografia ultrarrapida en gel de silice (acetato de etilo - hexano, desde 1:4 hasta 1:1) para dar el compuesto 27 (120 mg, rendimiento del 76�).

[0064] EJEMPLO 6 5-(2-Fenantrenil)-3-(trifluorometil)-4-(1H-tetrazol-5-ilfenil)-1H-pirazol (28) (etapa 6). A

40 una mezcla que contenia el compuesto 26 (125 mg, 0,3 mmol), se anadio NH4Cl (123,7 mg), y NaN3 (58,5 mg, 0,9 mmol) en 5 ml de HCl al 10�, y se extrajo con 20 ml de cloruro de metileno, dos veces. La fase organica se seco sobre sulfato sodico y se concentro a sequedad a vacio. El producto en bruto se purifico mediante cromatografia ultrarrapida en gel de silice (acetato de etilo - hexano 1:4) para dar el compuesto 28 (96 mg, rendimiento del 70�).

45 [0065] EJEMPLO 7 4-5[-(2-Fenantrenil)-3-(trifluorometil)-1H-piraxol-1-il]-benzaldehído oxima (29) (etapa 7). Se anadio gota a gota DIBAL-H (3,1 ml, 3,1 mmol, 1,0 M en hexano) a una disolucion del compuesto 26 (0,417 g, 1,1 mmol) en 5 ml de THF a -40�C. La mezcla se agito durante 8 horas, se vertio en 5 ml de acido acetico al 10� y se agito durante 30 minutos. La capa organica se seco sobre sulfato sodico y se concentro a sequedad a vacio. El producto en bruto se purifico mediante cromatografia ultrarrapida en gel de silice (acetato de etilo - hexano, 1:4) para

50 dar un aldehido intermedio (141 mg, 0,34 mmol) que fue inmediatamente anadido a una disolucion que contenia clorhidrato de hidroxilamida (211 mg) y K2CO3 en 5 ml de etanol. La mezcla se agito a la temperatura de reflujo durante 16 horas. Despues de eliminar el disolvente, el residuo se extrajo con CH2Cl2 y se lavo con agua.

[0066] EJEMPLO 8 4-[5-(2-Fenantrenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il]-benzaldehído hidrazona (30)

55 (etapa 8). El compuesto 30 (124 mg, rendimiento del 85�) se sintetizo de la misma forma que el compuesto 29, excepto porque se uso hidracina monohidratada (153 mg, 3,1 mmol) en lugar de clorhidrato de hidroxilamina.

[0067] EJEMPLO 9 {4-[5-(2-Fenantrenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il]-fenil}-acetonitrilo (31) (etapa 9).

(a) Preparacion del clorhidrato de (4-hidracinofenil) acetonitrilo. Una disolucion de nitrito sodico (3,15 g, 45,7 mmol)

en agua (20 ml) se anadio gota a gota a una disolucion enfriada (-15�C) y agitada de 4-aminobenzonitrilo (5 g, 42,3 mmol) en una disolucion concentrada de cloruro de hidrogeno (55 ml) a una velocidad tal que se mantuviera la temperatura por debajo de -10�C. Una vez finalizada la adicion, la mezcla de reaccion se filtro rapidamente para eliminar los solidos y el filtrado se anadio en porciones a una disolucion enfriada (-20�C) y agitada de SnCl2 � 2 H2O 5 (47,7 g, 0,21 mol) en una disolucion concentrada de cloruro de hidrogeno (37 ml) a una velocidad tal que se mantuviera la temperatura por debajo de -10�C. Despues de agitar la disolucion durante 1 5 minutos adicionales, el solido se recogio, se lavo con eter dietilico (4 x 25 ml) y se seco para dar clorhidrato de (4-hidracinofenil) acetonitrilo (5,6 g, 78�). (b) Compuesto 31. Una mezcla de clorhidrato de (4-hidracinofenil) acetonitrilo (0,32 g, 1 mmol) y 1,1,1trifluoro-4-hidroxi-4-fenantren-2-il-but-3-en-2-ona (0,18 g, 1,1 mmol) en etanol (20 ml) se agito a la temperatura de

10 reflujo durante 24 horas, se enfrio hasta la temperatura ambiente, se concentro a sequedad a vacio y se disolvio en acetato de etilo. La capa organica se seco sobre sulfato de magnesio y se concentro a sequedad a vacio. El producto en bruto se purifico mediante cromatografia en columna en gel de silice (hexano - acetato de etilo, 2:1) para dar el compuesto 31 (0,35 g, rendimiento del 81�).

15 [0068] EJEMPLO 10 2-{4-[5-(2-Fenantrenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il]-fenil}-N-hidroxiacetamidina

(32) (etapa 10). Una disolucion del compuesto 31 (0,43 g, 1 mmol) y clorhidrato de hidroxiamina (0,075 g, 1,1 mmol) en etanol (10 ml) se agito a la temperatura de reflujo durante 8 horas y se concentro a sequedad a vacio. El residuo se disolvio en agua, se llevo a pH 8 -9 mediante la adicion de una disolucion saturada de NaHCO3 y se extrajo con acetato de etilo. La capa organica se seco sobre sulfato de magnesio y se concentro a sequedad a vacio. El

20 producto en bruto se recristalizo en eter dietilico -hexano para dar el compuesto (0,32 g, rendimiento del 71�).

[0069] EJEMPLO 11 5-(2-Fenautrenil)-3-(trifluorometil)-4-(1H-tetrazol-5-ilmetilfenil)-1H-pirazol (33) (etapa 11). Se agito una mezcla que contenia el compuesto 31 (0,43 g, 1 mmol), azida sodica (0,08 g, 1,2 mmol) y clorhidrato de trietilamina (0,12 g, 1,2 mmol) en tolueno (5 ml) a 100 C durante 5 horas, se enfrio hasta la

25 temperatura ambiente y se extrajo con agua (10 ml). A la fase acuosa se anadio gota a gota una disolucion de cloruro de hidrogeno al 36� para provocar la precipitacion salina del tetrazol resultante 33. Despues de la filtracion, el solido se seco a vacio, produciendo el compuesto 33 (0,39 g, rendimiento del 84�).

[0070] EJEMPLOS 12 - 14 1-(4-Nitrofenil)-5-fenil-3-(trifluorometil)-1H-pirazol (III) (etapa 12). A una

30 disolucion de 1,1,1-trifluoro-4-hidroxi-4-fenantren-2-il-but-3-en-2-ona (1,29 g, 4,1 mmol) en 40 ml de etanol se anadio clorhidrato de 4-nitrofenilhidracina (0,93 g, 4,9 mmol) con agitacion, se puso a reflujo durante 1 hora, se enfrio hasta la temperatura ambiente y se concentro a sequedad a vacio. El residuo se disolvio en acetato de etilo y se lavo con agua. La fase organica se seco sobre sulfato de magnesio y se concentro a sequedad a vacio. El producto en bruto se purifico mediante cromatografia en columna en gel de silice para proporcionar el compuesto III (0,88 g,

35 rendimiento del 50�).

[0071] 4-[5-(2-Fenantrenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirozol-1-il] fenilamina (IV) (etapa 13). A una disolucion del compuesto III (0,88 g, 2 mmol) en 20 ml de etanol se anadio oxido de platino (27 mg, 0,12 mmol), se agito en H2 a 55 psi durante 12 horas, se filtro para eliminar el catalizador y se concentro a sequedad a vacio. El producto en bruto se

40 purifico mediante cromatografia en gel de silice para producir el compuesto IV (0,57 g, rendimiento del 70�).

[0072] EJEMPLO 12 2-Amino-N-{4-[5-(2-fenantrenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il]-fenil}-acetamida

(34) (etapas 14 y 15). A una disolucion de t-butiloxicarbonil (tBOC)-glicina (0,25 g, 1,4 mmol) y el compuesto IV (0,57 g, 1,4 mmol) en 10 ml de tetrahidrofurano se anadio clorhidrato de 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida (0,41 45 g, 2,1 mmol), se agito a 25�C durante 12 horas y se concentro a sequedad a vacio en un evaporador rotatorio. El residuo se suspendio en agua y el producto se extrajo con acetato de etilo. La fase organica se seco sobre sulfato de magnesio y se concentro a sequedad a vacio para dar el compuesto V (0,67 g, rendimiento del 85�). El compuesto V (0,67 g, 1,2 mmol) se disolvio en 8 ml de acetato de etilo que contenian 0,7 ml de una disolucion concentrada de HCl, se agito a temperatura ambiente durante 2 horas y se concentro a sequedad a vacio. El

50 producto en bruto se purifico mediante cromatografia en columna en gel de silice para producir el compuesto 34 en forma de un polvo de color blanco (0,49 g, 90�).

[0073] EJEMPLO 13 4-[5-(2-Fenantrenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il]-fenil-guanidina (35) (etapa 16). A una disolucion del compuesto IV (0,57 g, 1,4 mmol) en 7 ml de etanol se anadio cianamida (89 mg, 2,1 mmol) y 1,5

55 ml de HCl 1 N. La mezcla se calento a reflujo durante 24 horas y se concentro a sequedad a vacio. El producto se purifico mediante cromatografia en columna en gel de silice para dar el compuesto 35 en forma de un solido de color blanco (0,25 g, rendimiento del 40�).

[0074] EJEMPLO 14 4-[5-(2-Fenantrenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il] fenilurea (36) (etapa 17). En un

matraz de fondo redondo de 250 ml que contenia acido acetico (50 ml), agua (12 ml) y etanol (20 ml) se anadio el compuesto IV (2,25 g, 5,6 mmol), seguido de isocianato sodico (0,74 g, 11,2 mmol). La reaccion se agito durante 1,5 horas y despues se neutralizo con la adicion de hidroxido sodico 1 N seguido de pellas de hidroxido sodico hasta que el pH habia cambiado hasta 7,0. El producto se separo y despues se lavo con 100 ml de agua, se seco con

5 sulfato de magnesio y despues se elimino el disolvente para obtener el producto en bruto. La purificacion se realizo mediante cromatografia en gel de silice con (desde hexano -acetato de etilo, 3:2 hasta hexano -acetona, 1:3) para proporcionar el compuesto 36.

[0075] EJEMPLO 15 Cribado de los compuestos 34 y 35 frente a varias líneas celulares cancerosas Las

10 lineas celulares tumorales humanas del grupo de cribado tumoral se hacen crecer en medio RPMI 1640 que contiene suero bovino fetal al 5� L-glutamina y 2 mM. Para un experimento tipico de cribado, las celulas se inocularon en placas de microtitulacion de 96 pocillos en 100 µl a una densidad por placa que varia entre 5.000 y

40.000 celulas/pocillo, dependiendo del tiempo de duplicacion de las lineas celulares individuales. Despues de

inocular las celulas, las placas de microtitulacion se incuban a 37�C, un 5� de CO2, un 95� de aire y un 100� de 15 humedad relativa durante 24 h antes de la adicion de los farmacos experimentales.

[0076] Despues de 24 h, se fijan in situ dos placas de cada linea celular con TCA, para representar una medicion de la poblacion celular de cada linea celular en el momento de la adicion del farmaco (Tz). Los farmacos experimentales se solubilizan en dimetilsulfoxido a 400 veces la concentracion de prueba maxima final deseada y se 20 almacenan congelados antes de su uso. En el momento de la adicion del farmaco, se descongela una alicuota del concentrado congelado y se diluye hasta dos veces la concentracion de prueba maxima final deseada con medio completo que contiene 50 µg/ml de gentamicina. Se realizan diluciones en serie adicionales de cuatro, 10 veces o semilogaritmicas para proporcionar un total de cinco concentraciones de farmaco mas el control. Las alicuotas de 100 µl de estas diferentes diluciones de farmacos se anaden a las placas de microtitulacion apropiadas que ya

25 contienen 100 µl de medio, dando como resultado las concentraciones finales de farmaco requeridas.

[0077] Tras la adicion de los farmacos, las placas se incuban durante 48 h adicionales a 37�C, un 5� de CO2, un 95� de aire y un 100� de humedad relativa. Para celulas adherentes, el ensayo se termina mediante la adicion de TCA frio. Las celulas se fijan in situ mediante la adicion suave de 50 µl de TCA al 50� (p/v) frio (concentracion 30 final de TCA, 10�) y se incuban durante 60 minutos a 4�C. El sobrenadante se desecha y las placas se lavan cinco veces con agua del grifo y se secan al aire. Se anade a cada pocillo una disolucion de sulforrodamina B (SRB) (100 µl) al 0,4� (p/v) en acido acetico al 1�, y las placas se incuban durante 10 minutos a temperatura ambiente. Despues de la tincion, se elimina el pigmento no unido lavando cinco veces con acido acetico al 1� y las placas se secan al aire. El pigmento unido se solubiliza subsiguientemente con trizma base10 mM, y se lee la absorbencia en 35 un lector de placas automatico a una longitud de onda de 515 nm. Para las celulas en suspension, la metodologia es la misma excepto porque el ensayo se termina fijando las celulas sedimentadas en el fondo de los pocillos mediante la suave adicion de 50 µl de TCA al 80� (concentracion final final de TCA, 16�). Usando las siete mediciones de absorbencia [tiempo cero, (Tz), crecimiento de control, (C), y crecimiento de prueba en presencia de farmaco a cinco niveles de concentracion (Ti)], se calculo el porcentaje de crecimiento a cada uno de los niveles de concentracion de

40 farmaco. El porcentaje de inhibicion del crecimiento se calcula como:

[(Ti-Tz)/(C-Tz)] x 100 para las concentraciones para las que Ti�/=Tz

[(Ti-Tz)/Tz] x 100 para las concentraciones para las que Ti�Tz

45 [0078] Se calculan tres parametros de respuesta frente a la dosis para cada agente experimental. Se calcula el crecimiento de inhibicion al 50� (GI50) a partir de [(Ti-Tz)/(C-Tz)] x 100 = 50, que es la concentracion del farmaco que da como resultado una reduccion del 50� en el incremento neto en proteinas (medido mediante la tincion con SRB) en las celulas de control durante la incubacion con el farmaco. La concentracion del farmaco que da como

50 resultado una inhibicion total del crecimiento (TGI) se calcula a partir de Ti = Tz. La LC50 (concentracion de farmaco que da como resultado una reduccion del 50� en la proteina medida al final del tratamiento con farmaco en comparacion con la inicial), que indica una perdida neta de celulas tras el tratamiento, se calcula a partir de [(Ti-Tz)/Tz] x 100 = -50. Se calculan los valores para cada uno de estos tres parametros si se alcanza el nivel de actividad; sin embargo, si no se alcanza el efecto o si se supera, el valor para ese parametro se expresa como

55 mayor o menor que la concentracion maxima o minima ensayada.

[0079] Los procedimientos descritos se usaron para ensayar los compuestos 34 y 35 en un grupo de 60 lineas celulares en un servicio de cribado proporcionado por el Developmental Therapeutics Program del National Institutes of Health. En la Figura 1C se muestran 1, RPMI-celulas de leucemia 8226; 2, NCI-celulas de cancer de pulmon no microcitrico H322M; 3, celulas HT29 de cancer de colon; 4, celulas U251 de cancer del SNC; 5, celulas cancerosas SK-MEL-28 de melanoma; 6, celulas SK-OV-3 de cancer de ovario; 7, celulas RXF 393 de cancer de rinon; 8, celulas PC-3 de cancer de prostata; 9, celulas MDA-MB-231 de cancer de mama.

5 [0080] Los resultados de los ensayos de los compuestos 34 y 35 frente a las 60 lineas celulares completas se muestran en las tablas, a continuacion. Los ensayos se realizaron en el National Cancer Institute Developmental Therapeutics Program. Los resultados mostrados son resultados de los ensayos in vitro.

Tabla 5. Resultados de los ensayos del Compuesto 34 frente a 60 lineas celulares cancerosas. 10

Log10 de la concentracion

Grupo/Linea celular

Tiempo cero Con trol Densidades opticas medias Porcentaje de crecimiento

-8,0

-7,0 -6,0 -5,0 -4,0 -8,0 -7,0 -6,0 -5,0 -4,0 GI50 TGI LC50

Leucemia

CCRF-CEM

0,295 1,099 0,893 0,945 0,523 0,168 0,194 74 81 28 -43 -34 3,87E-07 2,49E-06 �1,00E-04

K-562

0,297 1,407 1,435 1,022 0,681 0,209 0,247 97 62 33 -30 -17 2,57E-07 3,34E-06 �1,00E-04

MOLT-4

0,313 1,048 0,964 0,951 0,614 0,180 0,295 89 87 41 -42 -6 6,36E-07 3,10E-06 �1,00E-04

RPMI-8226

0,332 0,845 0,766 0,701 0,547 0,164 0,229 85 72 42 -51 -31 5,37E-07 2,84E-06

SR

0,364 0,902 0,816 0,706 0,605 0,265 0,363 84 80 45 -27 7,11E-07 4,17E-06 �1,00E-04

Cancer de pulmon no microcitrico

A549 / ATCC

0,363 1,279 1,294 1,149 0,832 0,155 0,252 102 86 52 -57 -31 1,02E-06 2,968-06

EKVX

0,557 0,860 0,891 0,860 0,786 0,155 0,193 110 100 75 -72 -65 1,49E-06 3,25E-06 7,08E-06

HOP-62

0,510 1,395 1,310 1,330 1,075 0,155 0,217 90 93 64 -70 -57 1,27E-06 3,01E-06 7,13E-06

HOP-92

1,070 1,526 1,509 1,474 1,465 0,095 0,267 96 89 87 -51 -75 1,61E-06 3,07E-06 5,87E-06

NCI-H226

1,190 1,594 1,593 1,586 1,429 0,505 0,614 100 98 59 -58 -48 1,20E-06 3,21E-06

NCI-H23

0,457 1,655 1,672 1,673 1,255 0,097 0,156 101 102 67 -79 -66 1,30E-06 2,87E-06 6,33E-06

NCI-H322H

0,626 2,465 1,363 1,562 1,420 0,100 0,269 40 51 43 -84 -57 2,18E-06 5,40E-06

NCI-H460

0,319 1,843 1,799 1,499 0,830 0,173 0,213 97 77 34 -46 -33 4,21E-07 2,64E-06 �1,00E-04

NCI-H522

0,766 1,549 1,626 1,718 1,528 0,260 0,486 110 122 97 -66 -37 1,95E-06 3,94E-06

Cancer de colon

COLO 205

0,221 1,412 1,286 1,252 0,916 0,104 0,239 89 87 58 -53 1 1,19E-06

HCT-116

0,114 0,708 0,751 0,665 0,452 0,104 0,146 107 93 57 -9 5 1,27E-05 �1,00E-04

HCT-15

0,279 0,875 0,760 0,599 0,561 0,149 0,278 83 54 47 -47 3,65E-07 3,19E-06 �1,00E-04

HT29

0,215 1,453 1,355 1,299 0,801 0,075 0,159 92 88 47 -65 -26 8,58E-07 2,64E-06

KH12

0,535 2,184 2,151 2,044 1,425 0,146 0,264 98 91 54 -73 -51 1,07E-06 2,67E-06 6,62E-06

SW-620

0,187 1,202 1,197 1,198 0,736 0,127 0,136 100 100 54 -32 -28 1,12E-06 4,23E-06 �1,00E-04

Cancer del SNC

SP-268

0,376 1,142 1,016 0,930 0,789 0,252 0,280 84 72 54 -33 -26 1,11E-06 4,16E-06 �1,00E-04

SF-299

0,421 1,224 1,173 1,190 0,515 0,225 0,287 94 96 62 -47 -32 1,28E-06 3,71E-06 �1,00E-04

SNB-19

0,532 1,721 1,562 1,655 1,230 0,219 0,324 87 94 59 -59 -39 1,18E-06 3,15E-06

U251

0,391 1,301 1,298 1,139 0,810 0,144 0,320 100 82 46 -63 -18 7,75E-07 2,64E-06

Melanoma

LOX IMVI

0,353 1,166 1,204 0,974 0,742 0,176 0,352 105 76 48 -50 8.36E-07 3,07E-06

MALME-3H

0,666 1,165 1,123 1,128 1,202 0,218 0,290 92 93 87 -67 -56 1,74E-06 3,67E-06 7,73E-04

M14

0,315 0,986 0,975 0,974 0,916 0,211 0,256 98 98 90 -33 -19 2,10E-06 5,37E-06 �1,00E-04

SK-MEL-2

0,456 0,883 0,943 0,956 0,885 0,289 0,330 114 117 100 -37 -28 2,33E-06 5,40E-06 �1,00E-04

SK-MEL-28

0,530 1,482 1,426 1,320 1,130 0,071 0,218 94 83 63 -87 -59 1,22E-06 2,64E-06

SK-MEL-5

0,549 2,147 1,995 1,958 1,659 0,136 0,364 91 88 69 -75 -34 1,36E-06 3,02E-06

UACC-62

0,675 1,600 1,649 1,546 1,407 0,137 0,364 105 94 79 -80 -46 1,53E-06 3,15E-06

Cancer de ovario

IGROV1

0,462 1,060 1,044 1,103 0,902 0,235 0,302 97 107 74 -49 -35 1,56E-06 3,97E-06 �1,00E-04

OVCAR-3

0,460 0,529 0,879 0,849 0,816 0,140 0,301 89 83 76 -70 -35 1,51E-06 3,32E-06

OVCAR-4

0,530 1,121 1,114 1,073 1,086 0,093 0,172 99 92 94 -82 -68 1,78E-06 3,41E-06 6,55E-06

OVCAR-5

0,512 1,507 1,480 1,540 1,412 0,087 0,149 97 103 90 -83 -71 1,71E-06 3,32E-06 6,45E-06

OVCAR-8

0,400 1,101 1,078 1,114 0,755 0,269 0,306 97 102 51 -33 -24 1,02E-06 4,05E-06 �1,00E-04

SK-OV-3

0,399 1,623 1,514 1,597 1,262 0,083 0,302 91 98 71 -79 -24 1.37E-06 2,96E-06

Cancer de rinon

786-0

0,652 1,958 2,012 1,897 1,400 0,181 0,299 104 95 60 -72 -54 1,20E-06 2,85E-06 6,79E-06

A498

0,945 2,261 2,230 2,598 2,201 0,660 0,433 98 126 95 -30 -54 2,30E-06 5,75E-06 6,69E-05

ACHN

0,374 1,026 0,985 1,037 0,829 0,150 0,313 94 102 70 -60 -16 1,42E-06 3,45E-06

CAKI-1

0,597 1,862 1,692 1,802 1,126 0,147 0,335 87 95 42 -75 -44 7,03E-07 2,27E-06

RXP 393

0,403 0,801 0,766 0,700 0,625 0,177 0,441 91 75 56 -56 10 1,14E-06

SN12C

0,584 1,233 1,209 1,194 1,093 0,203 0,308 96 94 78 -55 -47 1,58E-06 3,51E-06

TK-10

0,672 1,496 1,512 1,492 1,304 0,138 0,200 102 100 77 -80 -70 1,48E-06 3,10E-06 6,7E-06

UO-31

0,443 1,782 1,572 1,563 1,356 0,161 0,289 84 84 68 -64 -36 1,37E-06 3,29E-06

Cancer de prostata

PC-3

0,242 0,996 0,910 0,763 0,593 0,055 0,108 89 69 47 -77 -55 7,05E-07 2,38E-06 6,02E-06

DJ-145

0,327 0,961 0,993 1,018 0,895 0,078 0,132 105 109 90 -76 -60 1,73E-06 3,47E-06 6,95E-06

Cancer de mama

MCP7

0,452 1,672 1,566 1,541 0,982 0,196 0,255 91 89 43 -57 -44 7,18E-07 2,72E-06

NCI / ADN-REG

0,556 1,904 1,883 1,878 1,217 0,229 0,212 98 98 49 -59 -62 9,54E-07 2,85E-06 8,28E-06

MDA-MB-231 / ATCC

0,642 0,988 0,988 0,889 0,843 0,173 0,306 100 71 58 -73 -52 1,15E-06 2,77E-06 6,67E-06

HS 57BT

0,534 1,186 1,221 1,179 1,110 0,351 0,333 105 99 88 -34 -38 2,05E-06 5,25E-06 �1,00E-04

MDA-MB-435

0,404 1,469 1,502 1,447 1,125 0,127 0,347 103 98 68 -69 -14 1,35E-06 3,14E-06

BT-549

0,492 0,957 0,912 0,891 0,785 0,143 0,195 90 86 63 -71 -50 1,25E-06 2,05E-06 6,98E-06

T-47D

0,423 1,019 0,921 1,071 0,935 0,205 0,238 84 109 86 -52 -44 1,82E-06 4,21E-06

Tabla 6. Resultados de los ensayos del Compuesto 35 frente a 60 lineas celulares cancerosas.

Log10 de la concentracion

Grupo/Linea celular

Tiempo cero Con trol Densidades opticas medias Porcentaje de crecimiento

-8,0

-7,0 -6,0 -5,0 -4,0 -8,0 -7,0 -6,0 -5,0 -4,0 GI50 TGI LC50

Leucemia

CCRF-CEM

0,295 0,949 0,808 0,811 0,718 0,002 0,140 78 79 65 -99 -53 1,23E-06 2,48E-06 5,00E-06

K-562

0,297 1,401 1,338 1,283 0,438 0,126 0,119 94 89 13 -58 -60 3,26E-07 1,52E-06 7,77E-06

MDIT-4

0,313 0,957 0,833 0,736 0,461 0,103 0,143 81 66 23 -54 -54 2,33E-07 1,98E-06 8,75E-06

RPMI-8226

0,332 0,682 0,536 0,559 0,513 0,016 0,176 58 65 52 -95 -47 1,03E-06 2,25E-06

SR

0,364 0,888 0,680 0,583 0,254 0,234 0,287 62 42 -30 -36 -21 3,86E-06 3,79E-07 �1,00E-04

Cancer de pulmon no microcitrico

AS49 / ATCC

0,363 1,175 1,140 1,145 1,121 -0,032 0,135 96 96 93 -100 -63 1,68E-06 3,04E-06 5,51E-06

EKUX

0,557 0,841 0,713 0,737 0,711 -0,008 0,145 55 63 54 -100 -74 1,06E-06 2,24E-06 4,74E-06

HOP-62

0,510 1,288 1,285 1,267 1,255 0,011 0,329 100 97 96 -98 -36 1,72E-06 3,12E-06

HOP-92

1,070 1,647 1,567 1,541 1,361 0,089 0,767 86 82 50 -92 -28 1,01E-06 2,26E-06

NCI-H23

0,457 1,669 1,585 1,515 2,679 -0,041 0,151 93 87 101 -100 -67 1,79E-06 3,18E-06 5,64E-06

NCI-H322H

0,626 1,181 0,988 1,049 1,031 -0,052 0,257 65 76 73 -100 -59 1,36E-06 2,64E-06 5,14E-06

NCI-H460

0,319 1,792 1,654 1,658 1,650 0,011 0,257 91 91 90 -97 -20 1,64E-06 3,04E-06

NCI-H522

0,766 1,671 1,509 1,558 1,471 0,037 0,439 82 87 79 -95 -43 1,45E-06 2,82E-06

Cancer de colon

COLO 205

0,221 1,196 1,146 1,028 0,930 0,009 0,151 95 83 73 -96 -32 1,36E-06 2,69E-06

HCT-116

0,114 0,714 0,607 0,633 0,525 -0,022 0,058 82 86 68 -100 -49 1,29E-06 2,55E-06

HCT-15

0,279 0,893 0,669 0,779 0,797 -0,003 0,082 64 81 84 -100 -71 1,54E-06 2,87E-06 5,36E-06

HT29

0,215 1,333 1,276 1,238 1,135 -0,054 0,003 95 91 82 -100 -99 1,50E-06 2,83E-06 5,32E-06

KM12

0,535 1,957 1,867 1,832 2,777 0,013 0,307 94 91 87 -98 -43 1,59E-06 2,97E-06

SW-620

0,187 1,073 1,073 0,993 1,060 -0,048 0,015 83 91 98 -100 -92 1,75E-06 3,13E-06 5,60E-06

Cancer del SNC

SP-268

0,376 1,016 0,893 0,939 0,886 0,148 0,278 81 88 80 -61 -25 1,63E-06 3,69E-06

SF-285

0,421 1,107 1,033 0,981 0,997 -0,025 0,195 89 74 84 -100 -54 1,53E-06 2,86E-06 5,35E-06

SNB-19

0,532 1,483 1,385 1,385 1,351 0,063 0,317 90 90 85 -88 -40 1,61E-06 3,12E-06

U251

0,391 1,156 1,125 1,059 1,123 0,026 0,484 96 87 96 -93 12 1,74E-06

Melanoma

LOX IMVI

0,353 1,164 0,948 1,033 0,935 0,008 0,169 73 84 72 -98 -53 1,34E-06 2,65E-06 5,22E-06

MALME-3H

0,666 0,984 0,832 0,838 0,826 0,089 0,333 52 54 50 -87 -50 1,01E-06 2,33E-06 1,00E-04

M14

0,315 0,935 0,772 0,823 0,816 -0,004 0,210 74 82 81 -100 -33 1,48E-06 2,80E-06

SK-MEL-2

0,456 0,830 0,775 0,819 0,780 -0,010 0,324 85 97 87 -100 -29 1,57E-06 2,91E-06

SK-.MEL-28

0,530 1,508 1,439 1,408 1,367 -0,002 0,240 93 90 86 -100 -53 1,56E-06 2,89E-06 5,38E-06

SK-MEL-5

0,549 1,640 1,611 1,762 1,812 0,143 0,363 97 111 116 -74 -34 2,22E-06 4,07E-06

UACC-62

0,575 1,477 2,323 1,338 1,301 -0,001 0,272 81 83 78 -100 -60 1,44E-06 2,74E-06 5,24E-06

Cancer de ovario

IGROV1

0,462 1,091 0,997 0,983 0,806 -0,039 0,216 85 83 55 -100 -53 1,07E-06 2,26E-06 4,75E-06

OVCAR-3

0,460 0,868 0,833 0,792 0,770 -0,043 0,131 91 81 76 -100 -72 1,40E-06 2,70E-06 5,20E-06

OVCAR-4

0,530 1,123 1,011 0,999 0,945 -0,001 0,179 81 79 70 -100 -65 1,31E-06 2,58E-06 5,08E-06

OVCAR-5

0,512 1,592 1,538 1,437 1,559 -0,033 0,474 95 86 97 -100 -8 1,73E-06 3,11E-06

OVCAR-8

0,400 0,968 0,923 0,946 0,934 -0,001 0,126 92 96 94 -100 -69 1,69E-06 3,05E-06 5,52E-06

SK-OV-3

0,399 1,327 1,261 1,245 1,093 0,062 0,278 93 91 75 -85 -30 1,43E-06 2,94E-06

Cancer de rinon

786-0

0,652 1,912 1,862 1,860 1,663 0,046 0,458 96 96 80 -93 -30 1,49E-06 2,91E-06

A498

0,945 2,207 2,413 2,087 1,869 1,903 0,540 116 91 73 76 -43 1,65E-06 4,35E-05 �1,00E-04

ACHN

0,374 1,026 0,898 0,902 0,964 0,034 0,291 80 81 90 -91 -22 1,67E-06 3,15E-06

CAKI-1

0,597 1,767 1,735 1,642 1,804 -0,067 0,315 97 89 103 -100 -47 1,83E-06 3,22E-06

RXF 393

0,403 0,829 0,582 0,629 0,629 0,156 0,385 42 53 53 -61 -4 2,91E-06

SN12C

0,584 1,115 1,050 0,998 1,045 -0,014 0,224 88 78 87 -100 -42 1,57E-06 2,91E-06 5,40E-06

TK-10

0,672 1,134 1,032 1,087 0,998 -0,021 0,245 78 90 71 -100 -64 1,32E-06 2,59E-06 5,09E-06

UD-33

0,443 1,467 1,375 1,407 1,332 -0,030 0,288 91 94 87 -100 -35 1,57E-06 2,92E-06

Cancer de prostata

PC-3

0,202 1,068 0,862 0,846 0,857 -0,022 0,179 75 73 75 -100 -26 1,38E-06 2,67E-06

DU-145

0,327 0,835 0,694 0,767 0,760 -0.074 -0,019 72 87 85 -100 -100 1,55E-06 2,89E-06 5,37E-06

Cancer de mama

MCP7

0,452 1,540 1,467 1,340 1,507 0,073 0,229 93 82 97 -84 -49 1,82E-06 3,44E-06

MCI / ADE-RES

0,556 1,942 1,920 1,982 1,874 0,490 0,294 98 96 95 -12 -47 2,64E-06 7,73E-06 �1,00E-04

MDA-MB-231 / ATCC

0,642 0,884 0,756 0,830 0,709 0,015 0,389 47 78 27 -98 -39 1,66E-06

HS 57BT

0,534 1,167 1,099 1,165 1,127 0,160 0,333 89 100 94 -69 -38 1,86E-06 3,78E-06

MDA-MB-435

0,404 1,498 1,376 1,382 1,444 -0,073 0,395 89 89 95 -100 -27 1,70E-06 3,07E-06

T-470

0,423 0,750 0,541 0,570 0,529 0,100 0,198 36 47 32 -76 -53 �1,00E-08 1,98E-06 5,72E-06

[0081] Los ejemplos descritos en este documento pretenden ser ilustrativos de la sintesis en las aplicaciones de los compuestos descritos. Los ejemplos no pretenden limitar el ambito de la invencion descrita en este 5 documento.

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un compuesto de formula I:

   en la que

   X se elige de entre alquilo y haloalquilo;

   10 Ar se elige del grupo que consiste en fenilo, bifenilo, naftilo, antrilo, fenantrenilo y fluorenilo; opcionalmente sustituido en cualquier posicion sustituible con uno o mas radicales;

   R se elige del grupo que consiste en -CH2CN, -CH2CH2CN, -CH2CH2CH2CN 15

   o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos.

   20 2. El compuesto de la reivindicacion 1 en el que X es haloalquilo C1 a C4.

2. 3.

   El compuesto de la reivindicacion 2 en el que X es CF3.

3. 4.

   El compuesto de la reivindicacion 1, en el que Ar esta sustituido en cualquier posicion sustituible con

   25 uno o mas radicales elegidos del grupo que consiste en halo, alquilo C1-C4, haloalquilo C1-C4, azido, azidoalquilo C1-C4, arilo, alquilarilo, haloarilo, haloalquilarilo y combinaciones de los mismos.
4. 5. El compuesto de la reivindicacion 1 en el que Ar se elige del grupo que consiste en 2-naftilo, 4-bifenilo, 9-antrilo, 2-fluorenilo, 4-azidofenilo, 4-azidometilfenilo, 4-(2-azidoetil) fenilo, 4-(3-azidopropil) fenilo, 4-(4-azidobutil) 30 fenilo, 4-(4-azidofenil) fenilo, 4-(4-azidometilfenil) fenilo, 4-metilfenilo, 4-etilfenilo, 4-propilfenilo, 4-butilfenilo, 4-(2bromoetil) fenilo, 4-(3-bromopropil) fenilo, 4-(4-bro-mobutil) fenilo, 4-(trifluorometil) fenilo, 4-(4-metilfenil) fenilo, 4-(4bromometilfenil) fenilo, 4-(4-butilfenil) fenilo, 4-(4-terc-butilfenil) fenilo, 2-clorofenilo, 4-clorofenilo, 2,4-diclorofenilo, 3,4-diclorofenilo, 2,5-diclorofenilo, 2,4-dimetilfenilo, 2,5-dimetilfenilo, 3,4-dimetilfenilo, 3,5-dimetilfenilo, 4-(4-clorofenil) fenilo, 4-(3,5-diclorofenil) fenilo, 4-(2,3-diclorofenil) fenilo, 4-(3,5-dimetilfenil)fenilo, 4-(2,4,5-triclorofenil) fenilo, 4-(4

   35 trifluorometilfenil) fenilo, 2-fenantrenilo, 3-indolilo, 2-pirrolilo, 4-(bencil) fenilo, 4-t-butilfenilo y 9-fonantrenilo.
5. 6. El compuesto de la reivindicacion 5 en el que Ar es 2-fenantrenilo.
6. 7. El compuesto de la reivindicacion 1 en el que R se elige de forma que RH es aminoacetamida o 40 guanidina.
7. 8. El compuesto de la reivindicacion 1 en el que X es CF3, Ar es 2-fenantrenilo y R se elige de forma que RH es aminoacetamida o guanidina.

   5 9. Un compuesto de formula II

   en la que:

   X se elige del grupo que consiste en alquilo y haloalquilo; R se elige del grupo que consiste en -CN, -CH2CN, -CH2CH2CN, -CH2CH2CH2CN

   o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos.
8. 10. El compuesto de la reivindicacion 9 en el que X es haloalquilo C1 a C4. 20

9. 11.

   El compuesto de la reivindicacion 10 en el que X es CF3.

10. 12.

    El compuesto de la reivindicacion 9 en el que R se elige de forma que RH es aminoacetamida o

    guanidina, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo. 25
11. 13. Un compuesto de formula III:

    o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.

    5 14. Un compuesto de formula IV:

    o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo. 10

12. 15. Un compuesto de formula (I) para su uso en un procedimiento de tratamiento in vivo que implica la induccion de la apoptosis en celulas cancerosas en proliferacion rapida no deseada, mediante un procedimiento que comprende la etapa de poner en contacto dichas celulas con una cantidad terapeuticamente eficaz de dicho compuesto,

    en el que 20 X se elige del grupo que consiste en alquilo y haloalquilo; Ar se elige del grupo que consiste en fenilo, bifenilo, naftilo, antrilo, fenantrenilo y fluorenilo, opcionalmente sustituidos en cualquiera de las posiciones sustituibles con uno o mas radicales;

    R se elige del grupo que consiste en -CN, -CH2CN, -CH2CH2CN, -CH2CH2CH2CN

    o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos; en el que las celulas cancerosas se eligen del grupo que consiste en celulas de leucemia, de cancer de pulmon no microcitrico, de cancer de colon, de cancer del sistema nervioso central, de melanoma, de cancer de ovario, de cancer de rinon, de cancer de prostata y de cancer de mama.
13. 16. El compuesto de la reivindicacion 15 en el que el compuesto se elige de entre los compuestos III y IV:

    15 o una combinacion de los mismos, o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos.
14. 17. Un compuesto para su uso en un procedimiento de tratamiento que implica a tratar, inhibir o retrasar la aparicion del cancer, en el que el cancer se elige del grupo que consiste en leucemia, cancer de pulmon no microcitrico, cancer de colon, cancer del sistema nervioso central, melanoma, cancer de ovario, cancer de rinon,

    20 cancer de prostata y cancer de mama, en un sujeto en necesidad de dicho tratamiento, y dicho compuesto es un compuesto de formula I:

    25 en la que X se elige del grupo que consiste en alquilo y haloalquilo;

    Ar se elige del grupo que consiste en fenilo, bifenilo, naftilo, antrilo, fenantrenilo y fluorenilo, opcionalmente 5 sustituidos en cualquiera de las posiciones sustituibles con uno o mas radicales;

    R se elige del grupo que consiste en -CN, -CH2CN, -CH2CH2CN, -CH2CH2CH2CN

    o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos.
15. 18. El compuesto de la reivindicacion 17 que se elige de entre los compuestos III y IV 15

    o una combinacion de los mismos, o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos. 20 19. El compuesto de la reivindicacion 17 en el que el sujeto es un ser humano.
16. 20. Un compuesto para prevenir la reestenosis en un sujeto que ha experimentado un procedimiento de angioplastia o de endoprotesis vascular, en el que dicho compuesto es un compuesto de formula I:

    en la que 5 X se elige de entre alquilo y haloalquilo; Ar se elige del grupo que consiste en fenilo, bifenilo, naftilo, antrilo, fenantrenilo y fluorenilo; opcionalmente sustituidos en cualquiera de las posiciones sustituibles con uno o mas radicales; 10 R se elige del grupo que consiste en CN, -CH2CN, -CH2CH2CN, -CH2CH2CH2CN -CONH2

    o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos.