ES2413482T3 - Organismos hiperfotosintéticos - Google Patents

Abstract

Una célula cianobacteriana modificada por ingeniería que comprende un ácido nucleico modificado por ingenieríaque codifica una proteína 5-metiltetrahidropteroiltriglutamato-homocisteína metiltransferasa independiente devitamina B12 que comprende una secuencia que es al menos un 95% idéntica a la secuencia mostrada en la Figura4.

Description

Organismos hiperfotosintéticos

5 Remisión a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica prioridad de las solicitudes provisionales de Estados Unidos 60/987.046, presentada el 10 de noviembre de 2007; 61/032.169 presentada el 28 de febrero de 2008; y 61/090.933, presentada el 22 de agosto de 2008.

Campo

La presente invención se refiere al campo de biología sintética, y más particularmente a organismos fotoautotróficos industrializados diseñados para convertir de forma eficaz el dióxido de carbono y luz en biomasa y productos de

15 interés basados en carbono.

Antecedentes

La fotosíntesis es un proceso por el cual las entidades biológicas utilizan la luz solar y el CO2 para producir azúcares

20 para la energía. Los organismos fotoautotróficos existentes (es decir, plantas, algas, y bacterias fotosintéticas) son poco adecuadas para el bioprocesamiento industrial. En particular, la mayoría de los organismos tienen lentos tiempos de duplicación (10-72 horas) en comparación con los organismos heterotróficos industrializados tales como Escherichia coli (20 minutos). Además, los organismos fotoautotróficos a menudo son susceptibles a variaciones moderadas en estrés ambiental común incluyendo pH, temperatura y tolerancia salina. Dichas susceptibilidades

25 hacen de las aplicaciones industriales de los fotoautótrofos ineficaces. Además, crecientemente factores ambientales tóxicos (por ejemplo, contaminantes tóxicos incluyendo metales pesados, subproductos industriales basados en nitrógeno y azufre) pueden además limitar las aplicaciones de los fotoautótrofos a usos industriales particulares.

30 Los productos deseables que pueden producirse potencialmente en microorganismos (por ejemplo, etanol y otros alcoholes superiores de cadena ramificada producidos en E. coli modificada por ingeniería (Atsumi, et al. Nature (2008) vol. 451: 86-90)) se han hallado difíciles de procesar en fotoautótrofos a causa de vías metabólicas incompatibles o ineficaces de producción o la ausencia completa de biocatalizadores necesarios basados en células.

35 Por tanto, existe la necesidad en la técnica de organismos fotoautotróficos mejorados que sean más adecuados para bioprocesamiento industrial.

Nomura et al. (1995) Plant Physiology: 107; 703-708 describe la transformación de Synechococcus sp. PCC7942 con un plásmido lanzadera que codifica un fragmento de 9 kb que codifica el grupo génico bet de E. coli.

40 La entrada en la base de datos UniProt con número de acceso P25665 y Gonzalez et al (1992) Biochemistry: 31;6045-6056 describen 5-metiltetrahidropteroiltriglutamato -homocisteína metiltransferasa (Met E.).

Sumario

45 En este documento se describen métodos y composiciones para diseñar por ingeniería vías que utilicen de forma estable organismos fotosintéticos por, por ejemplo, mejora genética de sus eficacias de captura de la luz y fijación del carbono y por optimización de sus propiedades de crecimiento para la propagación en fotobiorreactores. También se describen las células "hiperfotosintéticas" modificadas por ingeniería resultantes y organismos que

50 posibilitan la conversión eficaz de dióxido de carbono y luz en productos de interés basados en carbono.

La presente invención proporciona una célula cianobacteriana modificada por ingeniería que comprende un ácido nucleico modificado por ingeniería que codifica una proteína 5-metiltetrahidropteroiltriglutamato -homocisteína metiltransferasa independiente de vitamina B12 (metE) que comprende una secuencia que es al menos un 95%

55 idéntica a la secuencia mostrada en la Figura 4. Esta secuencia es la secuencia de la proteína metE de Escherichia coli K12 (número de acceso NP_418273.1).

La presente invención también proporciona el uso de una proteína 5-metiltetrahidropteroiltriglutamato -homocisteína metiltransferasa independiente de vitamina B12 que comprende una secuencia que es al menos un 95% idéntica a la

60 secuencia mostrada en la Figura 4 para producir una célula cianobacteriana independiente de vitamina B12.

La presente invención también proporciona un método para producir un producto de interés basado en carbono, que comprende cultivar una célula cianobacteriana modificada por ingeniería como se ha descrito anteriormente en presencia de CO2 y luz en condiciones adecuadas para producir el producto de interés basado en carbono.

Figuras

La Figura 1 proporciona la Tabla 1 que identifica los genes que pueden expresarse o regularse positivamente.

5 La Figura 2 proporciona la Tabla 2 que identifica los genes que pueden regularse negativamente o eliminarse.

La Figura 3 representa la viabilidad de Synechococcus sp. PCC 7002 de tipo silvestre y modificada por ingeniería genética en placas de agarosa de medio A+ sin B12.

La Figura 4 muestra la secuencia de la proteína metE de Escherichia coli K12 (número de acceso NP_418273.1).

Abreviaturas y términos

Las siguientes explicaciones de términos y métodos se proporcionan para describir mejor la presente descripción y

15 guiar a los especialistas en la técnica en la práctica de la presente descripción. Como se usa en este documento, "que comprende" significa "que incluye" y las formas singulares "un" o "una" o "el/la" incluyen referencias plurales salvo que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, referencia a "que comprende una célula" incluye una o una pluralidad de dichas células, y referencia a "que comprende una tioesterasa" incluye referencia a uno o más péptidos tioesterasa y equivalentes de los mismos conocidos para los especialistas en la técnica, y similares. El término "o" se refiere a un elemento individual de elementos alternativos indicados o una combinación de dos o más elementos, salvo que el contexto indique claramente lo contrario.

Salvo que se explique de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el habitualmente comprendido para los especialistas en la técnica a la que pertenece esta

25 descripción. Aunque métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento pueden usarse en la práctica o ensayo de la presente descripción, a continuación se describen los métodos y materiales adecuados. Los materiales, métodos, y ejemplos son solamente ilustrativos y no pretenden ser limitantes. Otras características de la descripción son evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y las reivindicaciones.

Números de acceso: Los números de acceso durante toda esta descripción corresponden a los hallados en las siguientes bases de datos: NCBI (National Center for Biotechnology Information), TIGR (The Institute for Genomic Research), y KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). Los números de acceso son los proporcionados en las bases de datos a 10 de noviembre de 2007.

35 Números de clasificación de enzimas (EC): Los números EC proporcionados durante toda esta descripción se obtienen de la base de datos de ligandos de KEGG, mantenida por la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, patrocinada en parte por la Universidad de Tokio. Los números EC son los proporcionados en la base de datos a 10 de noviembre de 2007.

ADN: Ácido desoxirribonucleico. El ADN es un polímero de cadena larga que incluye el material genético de la mayoría de los organismos vivos (algunos virus tienen genes que incluyen ácido ribonucleico, ARN). Las unidades repetidas en polímeros de ADN son cuatro nucleótidos diferentes, cada uno de los cuales incluye una de las cuatro bases adenina, guanina, citosina y timina unida a un azúcar desoxirribosa al cual está adherido un grupo fosfato.

45 Codón: Tripletes de nucleótidos, mencionados como codones, en moléculas de ADN codifican aminoácidos en un péptido. El término codón también se usa para las secuencias correspondientes (y complementarias) de tres nucleótidos en el ARNm en el cual se transcribe el ADN.

Endógeno: Como se usa en este documento con referencia a una molécula de ácido nucleico y una célula particular

o microorganismo se refiere a una secuencia de ácido nucleico o péptido que está en la célula y no se introdujo en la célula usando técnicas de ingeniería recombinante. Por ejemplo, un gen que estaba presente en la célula cuando la célula se aisló originalmente de la naturaleza se considera que es endógeno. Un gen aún se considera endógeno si las secuencias de control, tales como un promotor o secuencias potenciadoras que activan la transcripción o traducción se han alterado a través de técnicas recombinantes.

55 Exógeno: Como se usa en este documento con referencia a una molécula de ácido nucleico y una célula particular

o microorganismo se refiere a una secuencia de ácido nucleico o péptido que no estaba presente en la célula cuando la célula se aisló originalmente de la naturaleza. Por ejemplo, un ácido nucleico que se originó en un microorganismo diferente y se modificó por ingeniería en una célula alternativa usando técnicas de ADN recombinante u otros métodos para suministrar dicho ácido nucleico se considera que es exógeno.

Expresión: El proceso por el cual la información codificada de un gen se convierte en las moléculas que soportan las estructuras y funciones de una célula, tal como una proteína, ARN transferente, o ARN ribosómico. Los genes expresados incluyen aquellos que se transcriben en ARNm y después se traducen en proteína y aquellos que se

65 transcriben en ARN pero no se traducen en proteína (por ejemplo, ARN transferentes y ribosómicos).

Sobre-expresión: La sobre-expresión se refiere a cualquier estado en el cual se causa que un gen se transcriba a una velocidad elevada en comparación con la velocidad de transcripción endógena para ese gen. En algunos ejemplos, la sobre-expresión incluye adicionalmente una velocidad elevada de traducción del gen en comparación con la velocidad de traducción endógena para ese gen. Los métodos para ensayar la sobre-expresión son bien

5 conocidos en la técnica, por ejemplo los niveles de ARN transcrito pueden evaluarse usando reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) y los niveles de proteína pueden evaluarse usando análisis de electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE). Además, se considera que un gen se sobre-expresa cuando muestra actividad elevada en comparación con su actividad endógena, que puede ocurrir, por ejemplo, a través de la reducción en la concentración o actividad de su inhibidor, o mediante la expresión de una versión mutante con actividad elevada. En realizaciones preferidas, cuando la célula hospedadora codifica un gen endógeno con una actividad bioquímica deseada, es útil para sobre-expresar un gen exógeno, que permite un control regulador más explícito en el bioprocesamiento y un medio para mitigar potencialmente los efectos de la regulación del metabolismo central, que se centra alrededor de los genes nativos explícitamente.

15 Regulación negativa: La regulación negativa se refiere a cualquier estado en el cual se causa que un gen se transcriba a una velocidad reducida en comparación con la velocidad de transcripción génica endógena para ese gen. En ciertas realizaciones, la expresión génica está regulada negativamente mediante la expresión de ácidos nucleicos, tales como oligonucleótidos antisentido, ARN bicatenario, ARN interferente pequeño, ARN de horquilla pequeño, microARN, ribozimas, y similares. En algunos ejemplos, la regulación negativa incluye adicionalmente un nivel reducido de traducción del gen en comparación con la velocidad de traducción endógena para ese gen. Además, un gen se considera que está regulado negativamente cuando muestra actividad disminuida en comparación con su actividad endógena, que puede suceder, por ejemplo, a través de un aumento en la concentración o actividad de su inhibidor, o mediante la expresión de una versión mutante con actividad reducida. Los métodos para ensayar la regulación negativa son bien conocidos para los especialistas en la técnica, por

25 ejemplo, los niveles de ARN transcrito pueden evaluarse usando RT-PCR y los niveles de proteínas pueden evaluarse usando análisis SDS-PAGE.

Eliminación: Un gen cuyo nivel de expresión o actividad se ha reducido a cero. En algunos ejemplos, un gen se elimina mediante deleción o remplazo de algo de o toda su secuencia codificante. En otros ejemplos, un gen se elimina mediante la introducción o retirada de uno o más nucleótidos en su fase de lectura abierta, que provoca la traducción de un producto proteico sin sentido o no funcional de otro modo.

Autótrofo: Los autótrofos (u organismos autotróficos) son organismos que producen compuestos orgánicos complejos a partir de moléculas inorgánicas simples y una fuente de energía externa, tal como luz (fotoautótrofos) o

35 reacciones químicas de compuestos inorgánicos.

Heterótrofo: Los heterótrofos (u organismos heterotróficos) son organismos que, a diferencia de los autótrofos, no pueden obtener la energía directamente de la luz o de compuestos químicos inorgánicos, y por tanto deben alimentarse de substratos de carbono orgánico. Obtienen energía química descomponiendo las moléculas orgánicas que consumen. Los heterótrofos incluyen animales, hongos, y numerosos tipos de bacterias.

Hiperfotosintético: Una célula u organismo que expresa proteínas fotosintéticas que a través de técnicas de ADN recombinante se han modificado por ingeniería específicamente para expresar ácidos nucleicos endógenos y/o exógenos que provocan una o más mejoras funcionales relacionadas con el bioprocesamiento industrial y la

45 conversión de dióxido de carbono y luz en productos de carbono reducido o masa celular. Una célula hiperfotosintética también abarca una célula u organismo modificado por ingeniería como se ha descrito anteriormente que se ha evolucionado o mutagenizado para conseguir una o más mejoras funcionales.

Hidrocarburo: Generalmente se refiere a un compuesto químico que consta de los elementos carbono (C), opcionalmente oxígeno (O), e hidrógeno (H).

Vía biosintética: También mencionada como "vía metabólica", se refiere a una serie de reacciones bioquímicas anabólicas o catabólicas para convertir (transmutar) una especie química en otra. Por ejemplo, una vía biosintética de hidrocarburo se refiere a una serie de reacciones bioquímicas que convierten aportaciones y/o metabolitos en

55 intermedios tipo producto de hidrocarburo y después en hidrocarburos o productos de hidrocarburo. Las vías anabólicas implican construir una molécula más grande a partir de moléculas más pequeñas, un proceso que requiere energía. Las vías catabólicas implican descomponer moléculas más grandes, a menudo liberando energía.

Celulosa: La celulosa [(C6H10O5)n] es un carbohidrato polisacárido polimérico de cadena larga, de beta-glucosa. Forma el componente estructural principal de las plantas y no es digerible por seres humanos. La celulosa es un material común en paredes celulares vegetales y se apreció por primera vez como tal en 1838. Existe de forma natural en forma casi pura solamente en fibra de algodón; en combinación con lignina y cualquier hemicelulosa, se halla en todo el material vegetal.

65 Tensioactivos: Los tensioactivos son sustancias capaces de reducir la tensión superficial de un líquido en el cual se disuelven. Están típicamente compuestos de una cabeza soluble en agua y una cadena o cola de hidrocarburo. El grupo soluble en agua es hidrófilo y puede ser iónico o no iónico, y la cadena de hidrocarburo es hidrófoba.

Biocombustible: Un biocombustible es cualquier combustible que se obtiene de una fuente biológica.

5 Ácido nucleico modificado por ingeniería: Un "ácido nucleico modificado por ingeniería" es una molécula de ácido nucleico que incluye al menos una diferencia a partir de la molécula de ácido nucleico de origen natural. El ácido nucleico modificado por ingeniería incluye todas las secuencias heterólogas modificadas y no modificadas exógenas (es decir, secuencias obtenidas de un organismo o célula diferente al que alberga el ácido nucleico modificado por ingeniería) así como genes endógenos, operones, secuencias codificantes, o secuencias no codificantes, que se han modificado, mutado o que incluyen deleciones o inserciones en comparación con una secuencia de origen natural. Los ácidos nucleicos modificados por ingeniería también incluyen todas las secuencias, independientemente del origen, que están ligadas a un promotor inducible o a otra secuencia de control con la cual no están asociados de forma natural. Los ácidos nucleicos modificados por ingeniería incluyen adicionalmente todas las secuencias que pueden usarse para regular negativamente o eliminar la expresión de un gen endógeno. Estos incluyen moléculas

15 antisentido, moléculas de ARN y, construcciones para producir recombinación homóloga, construcciones cre-lox, y similares.

Ácido nucleico de captura de luz: Un "ácido nucleico de captura de luz" se refiere a un ácido nucleico que solo o en combinación con otro ácido nucleico codifica una o más proteínas que convierten la energía de la luz (es decir, fotones) en energía química tal como un gradiente de protones, energía reductora, o una molécula que contiene al menos un enlace fosfato de alta energía tal como ATP o GTP. Los ácido nucleicos de captura de luz ejemplares incluyen aquellos que codifican bombas de protones activadas por luz tales como rodopsina, xantorrodopsina, proteorrodopsina y bacteriorrodopsina, así como ácidos nucleicos que codifican proteínas que modulan directamente (complejos recolectores de luz, LHC I y LHC II) o indirectamente (antena de recolección de luz truncada, tlα1) las

25 eficacias de captura recolectora de la luz. Un ácido nucleico de captura de luz incluye adicionalmente un ácido nucleico usado para reducir la expresión de o eliminar uno o más genes endógenos cuya expresión reduce la captura de luz.

Ácido nucleico de la vía de fijación de dióxido de carbono: Un "ácido nucleico de la vía de fijación de dióxido de carbono" se refiere a un ácido nucleico que solo o en combinación con otro ácido nucleico codifica una proteína que posibilita la fijación autotrófica del carbono. Un ácido nucleico de la vía de fijación de dióxido de carbono también incluye ácidos nucleicos que dirigen el flujo de carbono a intermedios celulares clave requeridos para el crecimientoeficaz o la formación de productos basados en carbono, tales como acetil-CoA. Ácidos nucleicos de la vía de fijación de dióxido de carbono ejemplares incluyen aquellos que codifican la propionil-CoA carboxilasa, piruvato sintasa,

35 formiato deshidrogenasa, y ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa/oxigenasa (RuBisCO). Un ácido nucleico de la vía de fijación de dióxido de carbono incluye adicionalmente un ácido nucleico usado para reducir la expresión de o eliminar uno o más genes endógenos cuya expresión reduce la fijación del dióxido de carbono.

Ácido nucleico de la vía NADH: Un "ácido nucleico de la vía NADH" se refiere a un ácido nucleico que solo o en combinación con otro ácido nucleico codifica una proteína para mantener un suministro apropiadamente equilibradode NAD reducido para realizar la fijación del carbono. Ácidos nucleicos de la vía NADH ejemplares incluyen aquellos que codifican una isocitrato deshidrogenasa dependiente de NAD+ y malato deshidrogenasa. Un ácido nucleico de la vía NADH incluye adicionalmente un ácido nucleico usado para reducir la expresión de o eliminar uno o más genes endógenos cuya expresión afecta al mantenimiento de un suministro apropiadamente equilibrado de NAD reducido

45 para realizar la fijación del carbono y otros procesos biológicos necesarios.

Ácido nucleico de la vía NADPH: Un "ácido nucleico de la vía NADPH" se refiere a un ácido nucleico que solo o en combinación con otro ácido nucleico codifica una proteína para mantener un suministro apropiadamente equilibradode NADPH reducido para realizar la fijación del carbono. Ácidos nucleicos de la vía NADPH ejemplares incluyen aquellos que codifican la fosfogluconolactonasa y la piridina nucleótido transhidrogenasa soluble. Un ácido nucleico de la vía NADPH incluye adicionalmente un ácido nucleico usado para reducir la expresión de o eliminar uno o más genes endógenos cuya expresión afecta al mantenimiento de un suministro apropiadamente equilibrado de NADP reducido para realizar la fijación del carbono y otros procesos biológicos necesarios.

55 Ácido nucleico de tolerancia térmica: Un "ácido nucleico de tolerancia térmica" se refiere a un ácido nucleico que solo o en combinación con otro ácido nucleico codifica una proteína cuya sobre-expresión, regulación negativa, o inhibición provoca un aumento en la tolerancia térmica. Ácidos nucleicos de tolerancia térmica ejemplares incluyen aquellos que codifican ClpC/Hsp100, groESL1, HspA, y PsbU. Un ácido nucleico de tolerancia térmica incluye adicionalmente un ácido nucleico usado para reducir la expresión de o eliminar uno o más genes endógenos cuya expresión altera la tolerancia térmica.

Ácido nucleico de tolerancia al pH: Un "ácido nucleico de tolerancia al pH" se refiere a un ácido nucleico que solo o en combinación con otro ácido nucleico codifica una proteína cuya sobre-expresión, regulación negativa, o inhibición posibilita el crecimiento a un pH elevado o reducido. Ácidos nucleicos de tolerancia al pH ejemplares 65 incluyen aquellos que codifican glutamato descarboxilasa y superóxido dismutasa. Un ácido nucleico de tolerancia al pH incluye adicionalmente un ácido nucleico usado para reducir la expresión de o eliminar uno o más genes

endógenos cuya expresión altera la tolerancia al pH.

Tolerancia a gases de combustión: Un "ácido nucleico de tolerancia a gases de combustión" se refiere a un ácido nucleico que solo o en combinación con otro ácido nucleico codifica una proteína cuya sobre-expresión, regulación

5 negativa, o inhibición posibilita el crecimiento en presencia de componentes de gases de combustión incluyendo dióxido de carbono, SOx, NOx, y N2. Ácidos nucleicos de tolerancia a gases de combustión ejemplares incluyen aquellos que codifican la superóxido dismutasa, catalasa, cisteína sintasa, y NirK. Un ácido nucleico de tolerancia a gases de combustión incluye adicionalmente un ácido nucleico usado para reducir la expresión de o eliminar uno o más genes endógenos cuya expresión altera la tolerancia a gases de combustión.

10 Ácido nucleico de independencia de nutrientes: Un "ácido nucleico de independencia de nutrientes" se refiere a un ácido nucleico que solo o en combinación con otro ácido nucleico codifica una proteína cuya sobre-expresión, regulación negativa, o inhibición posibilita la propagación en ausencia de, o en concentraciones reducidas de, unnutriente exógeno. Ácidos nucleicos de independencia de nutrientes ejemplares incluyen aquellos que codifican

15 MetE y NrdB. Un gen de independencia de nutrientes incluye adicionalmente un ácido nucleico usado para reducir la expresión de o eliminar uno o más genes endógenos cuya expresión altera la propagación en ausencia de, o en concentraciones reducidas de, un nutriente exógeno.

Ácido nucleico de tolerancia salina: Un "ácido nucleico de tolerancia salina" se refiere a un ácido nucleico que

20 solo o en combinación con otro ácido nucleico codifica una proteína cuya sobre-expresión, regulación negativa, o inhibición posibilita la propagación en condiciones de elevada salinidad, tal como agua de mar. Ácidos nucleicos de tolerancia salina ejemplares incluyen aquellos que codifican el antiportador Na+/H+, y conservación básica de mama.

25 Ácido nucleico del flujo de acetil-CoA: Un "ácido nucleico del flujo de acetil-CoA" se refiere a un ácido nucleico que solo o en combinación con otro ácido nucleico codifica una proteína cuya sobre-expresión, regulación negativa,

o inhibición provoca un aumento en la acetil-CoA producida sobre una unidad de tiempo. Ácidos nucleicos ejemplares que pueden sobre-expresarse incluyen pantotenato quinasa y piruvato deshidrogenasa. Los ácidos nucleicos que pueden regularse negativamente, inhibirse, o eliminarse incluyen acil coenzima A deshidrogenasa,

30 glicerol 3-fosfato deshidrogenasa biosintética, y lactato deshidrogenasa.

Ácido nucleico de clorofila d: Un "ácido nucleico de clorofila d" se refiere a un ácido nucleico que solo o en combinación con otro ácido nucleico codifica una proteína cuya sobre-expresión, regulación negativa, o inhibición provoca la biosíntesis de clorofila d y su incorporación en centros de reacción, el fotosistema (PS)I y PSII. Un ácido 35 nucleico de clorofila d posibilita la propagación en, por ejemplo, condiciones en las que la radiación fotosintéticamente disponible se usa probablemente de forma completa por organismos que absorben luz usando clorofila α y/o clorofila b de modo que el entorno tiene baja intensidad de luz visible pero elevada intensidad cercana a los infrarrojos donde ningún otro organismo fotosintético absorbe fuertemente de modo que un organismo que usa la clorofila d para la captura de la luz puede prosperar. Como alternativa, un ácido nucleico de clorofila d posibilita la

40 propagación en condiciones en las que la longitud de onda de la luz artificial usada por la iluminación se selecciona para permitir la propagación de un organismo que usa clorofila d para la captura de la luz.

Identidad de secuencia: Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias polipeptídicas, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen 45 un porcentaje especificado de restos aminoacídicos o nucleótidos que son iguales (es decir, aproximadamente el 60% de identidad, preferiblemente el 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o mayor identidad sobre una región especificada, cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima sobre una ventana de comparación o región designada) medida usando algoritmos de comparación de secuencia BLAST o BLAST 2.0 con parámetros por defecto descritos a continuación, o por 50 alineación manual e inspección visual (véase, por ejemplo, el sitio web NCBI o similares). Dichas secuencias entonces se dice que son "sustancialmente idénticas". Esta definición también se refiere a, o puede aplicarse a, el complementario de una secuencia de ensayo. La definición también incluye secuencias que tienen deleciones y/o adiciones, así como aquellas que tienen sustituciones. Como se describe a continuación, los algoritmos preferidos pueden tener en cuenta huecos y similares. Preferiblemente, existe identidad sobre una región que es al menos de

55 aproximadamente 25 aminoácidos o nucleótidos de longitud, o más preferiblemente sobre una región que es de 50100 aminoácidos o nucleótidos de longitud.

Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la cual se compara las secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de

60 ensayo y de referencia se introducen en un ordenador, se designan las coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencia. Preferiblemente, pueden usarse los parámetros por defecto del programa, o pueden designarse parámetros alternativos. El algoritmo de comparación de secuencia entonces calcula el porcentaje de identidad de secuencia para las secuencias de ensayo con relación a la secuencia de referencia, en base a los parámetros del programa.

65 Ventana de comparación: Una "ventana de comparación", como se usa en este documento, incluye la referencia a un segmento de una cualquiera de varias posiciones contiguas seleccionadas entre el grupo compuesto por 20 a 600, habitualmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más habitualmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 en que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia de la misma

5 cantidad de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se hayan alineado de forma óptima. Los métodos de alineación de secuencias para la comparación son bien conocidos en la técnica. La alineación óptima de secuencias para comparación puede realizarse, por ejemplo, por el algoritmo de homología local de Smith Y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), por el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), por el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l, Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), por implementaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA del paquete de software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o por alineación manual e inspección visual (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y col., eds. suplemento 1995)).

15 Un ejemplo preferido de algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul y col., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977) y Altschul y col., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990), respectivamente. BLAST y BLAST 2.0 se usan, con los parámetros descritos en este documento, para determinar el porcentaje de identidad de secuencia para los ácidos nucleicos y proteínas de la invención. El software para realizar análisis BLAST está disponible al público a través del sitio web del National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo implica identificar primero pares de secuencias con alta valoración (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia en cuestión, que coinciden o satisfacen algún valor umbral T de valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se menciona como el umbral del valor de palabra vecina (Altschul y col., supra). Estos aciertos de palabra vecina inicial actúan como semillas para iniciar búsquedas para

25 hallar HSP más largos que los contengan. Los aciertos de palabra se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia lo más lejos para que pueda aumentarse el valor de alineación cumulativo. Los valores cumulativos se calculan usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (valor de bonificación para un par de restos apareados; siempre >0) y N (valor de penalización para restos desapareados; siempre <0). Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de valoración para calcular el valor cumulativo. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detienen cuando: el valor de alineación cumulativo queda fuera por la cantidad X desde su valor máximo conseguido; el valor cumulativo llega a cero o por debajo, debido a la acumulación de una o más alineaciones de restos de valoración negativa; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M=5, N=-4

35 y una comparación de ambas hebras. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa por defecto una longitud de palabra de 3, una expectativa (E) de 10, y la matriz de valoración BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)) alineaciones (B) de 50, expectativas (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambas hebras.

Descripción detallada de la invención

Organismos

La presente invención posibilita la conversión de una cianobacteria fotoautotrófica en un organismo 45 hiperfotosintético.

Las algas y cianobacterias incluyen, aunque sin limitación, los siguientes géneros: Acanthoceras, Acanthococcus, Acaryocloris, Achnanthes, Achnanthidium, Actinastrum, Actinocloris, Actinociclus, Actinotaenium, Amphichrysis, Amphidinium, Amphikrikos, Amphipleura, Amphiprora, Amphithrix, Amphora, Anabaena, Anabaenopsis, Aneumastus, Ankistrodesmus, Ankyra, Anomoeoneis, Apatococcus, Aphanizomenon, Aphanocapsa, Aphanochaete, Aphanothece, Apiocystis, Apistonema, Arthrodesmus, Artherospira, Ascocloris, Asterionella, Asterococcus, Audouinella, Aulacoseira, Bacillaria, Balbiania, Bambusina, Bangia, Basichlamys, Batrachospermum, Binuclearia, Bitrichia, Blidingia, Botrdiopsis, Botrydium, Botryococcus, Botryosphaerella, Brachiomonas, Brachysira, Brachytrichia, Brebissonia, Bulbochaete, Bumilleria, Bumilleriopsis, Caloneis, Calothrix, Campylodiscus, Capsosiphon, Carteria, 55 Catena, Cavinula, Centritractus, Centronella, Ceratium, Chaetoceros, Chaetocloris, Chaetomorpha, Chaetonella, Chaetonema, Chaetopeltis, Chaetophora, Chaetosphaeridium, Chamaesiphon, Chara, Characiochloris, Characiopsis, Characium, Charales, Chilomonas, Chlainomonas, Chlamydoblepharis, Chlamydocapsa, Chlamydomonas, Chlamydomonopsis, Chlamydomyxa, Chlamydonephris, Chlorangiella, Chlorangiopsis, Chlorella, Chlorobotrys, Chlorobrachis, Chlorochytrium, Chlorococcum, Chlorogloea, Chlorogonium, Chlorolobion, Chloromonas, Chlorophysema, Chlorophyta, Chlorosaccus, Chlorosarcina, Choricystis, Chromophyton, Chromulina, Chroococcidiopsis, Chroococcus, Chroodactylon, Chroomonas, Chroothece, Chrysamoeba, Chrysapsis, Chrysidiastrum, Chrysocapsa, Chrysocapsella, Chrysochaete, Chrysochromulina, Chrysococcus, Chrysocrinus, Chrysolepidomonas, Chrysolykos, Chrysonebula, Chrysophyta, Chrysopyxis, Chrysosaccus, Chrysophaerella, Chrysostephanosphaera, Clodophora, Clastidium, Closteriopsis, Closterium, Coccomyxa, Cocconeis, Coelastrella, 65 Coelastrum, Coelosphaerium, Coenocloris, Coenococcus, Coenocystis, Colacium, Coleochaete, Collodictyon, Compsogonopsis, Compsopogon, Conjugatophyta, Conochaete, Coronastrum, Cosmarium, Cosmioneis, Cosmocladium, Crateriportula, Craticula, Crinalium, Crucigenia, Crucigeniella, Cryptoaulax, Cryptomonas, Cryptophyta, Ctenophora, Cyanodictyon, Cyanonephron, Cyanophora, Cyanophyta, Cyanothece, Cyanothomonas, Ciclonexis, Ciclostephanos, Ciclotella, Cylindrocapsa, Cylindrocystis, Cylindrospermum, Cylindrotheca, Cymatopleura, Cymbella, Cymbellonitzschia, Cystodinium Dactylococcopsis, Debarya, Denticula, Dermatochrysis, 5 Dermocarpa, Dermocarpella, Desmatractum, Desmidium, Desmococcus, Desmonema, Desmosiphon, Diacanthos, Diacronema, Diadesmis, Diatoma, Diatomella, Dicellula, Dichothrix, Dichotomococcus, Dicranochaete, Dictyochloris, Dictyococcus, Dictyosphaerium, Didymocystis, Didymogenes, Didymosphenia, Dilabifilum, Dimorfococcus, Dinobryon, Dinococcus, Diplocloris, Diploneis, Diplostauron, Distrionella, Docidium, Draparnaldia, Dunaliella, Dysmorfococcus, Ecballocystis, Elakatothrix, Ellerbeckia, Encyonema, Enteromorpha, Entocladia, Entomoneis, Entophysalis, Epichrysis, Epipyxis, Epithemia, Eremosphaera, Euastropsis, Euastrum, Eucapsis, Eucocconeis, Eudorina, Euglena, Euglenophyta, Eunotia, Eustigmatophyta, Eutreptia, Fallacia, Fischerella, Fragilaria, Fragilariforma, Franceia, Frustulia, Curcilla, Geminella, Genicularia, Glaucocystis, Glaucophyta, Glenodiniopsis, Glenodinium, Gloeocapsa, Gloeochaete, Gloeochrysis, Gloeococcus, Gloeocystis, Gloeodendron, Gloeomonas, Gloeoplax, Gloeothece, Gloeotila, Gloeotrichia, Gloiodictyon, Golenkinia, Golenkiniopsis, Gomontia, 15 Gomphocymbella, Gomphonema, Gomphosphaeria, Gonatozygon, Gongrosia, Gongrosira, Goniocloris, Gonium, Gonyostomum, Granulocloris, Granulocystopsis, Groenbladia, Gymnodinium, Gymnozyga, Gyrosigma, Haematococcus, Hafniomonas, Hallassia, Hammatoidea, Hannaea, Hantzschia, Hapalosiphon, Haplotaenium, Haptophyta, Haslea, Hemidinium, Hemitonia, Heribaudiella, Heteromastix, Heterothrix, Hibberdia, Hildenbrandia, Hillea, Holopedium, Homoeothrix, Hormanthonema, Hormotila, Hyalobrachion, Hyalocardium, Hyalodiscus, Hyalogonium, Hyalotheca, Hydrianum, Hydrococcus, Hydrocoleum, Hydrocoryne, Hydrodictyon, Hydrosera, Hydrurus, Hyella, Hymenomonas, Isthmocloron, Johannesbaptistia, Juranyiella, Karayevia, Kathablepharis, Katodinium, Kephyrion, Keratococcus, Kirchneriella, Klebsormidium, Kolbesia, Koliella, Komarekia, Korshikoviella, Kraskella Lagerheimia Lagynion Lamprothamnium, Lemanea, Lepocinclis, Leptosira, Lobococcus, Lobocystis, Lobomonas, Luticola, Lyngbya, Malleocloris, Mallomonas, Mantoniella, Marssoniella, Martyana, Mastigocoleus, 25 Gastogloia, Melosira, Merismopedia, Mesostigma, Mesotaenium, Micractinium, Micrasterias, Microchaete, Microcoleus, Microcystis, Microglena, Micromonas, Microspora, Microthamnion, Mischococcus, Monochrysis, Monodus, Monomastix, Monoraphidium, Monostroma, Mougeotia, Mougeotiopsis, Myocloris, Myromecia, Myxosarcina, Naegeliella, Nannocloris, Nautococcus, Navicula, Neglectella, Neidium, Nephroclamys, Nephrocytium, Nephrodiella, Nephroselmis, Netrium, Nitella, Nitellopsis, Nitzschia, Nodularia, Nostoc, Ochromonas, Oedogonium, Oligochaetophora, Onychonema, Oocardium, Oocystis, Opephora, Ophiocytium, Orthoseira, Oscillatoria, Oxyneis, Pachycladella, Palmella, Palmodictyon, Pnadorina, Pannus, Paralia, Pascherina, Paulschulzia, Pediastrum, Pedinella, Pedinomonas, Pedinopera, Pelagodictyon, Penium, Peranema, Peridiniopsis, Peridinium, Peronia, Petroneis, Phacotus, Phacus, Phaeaster, Phaeodermatium, Phaeophyta, Phaeosphaera, Phaeothamnion, Phormidium, Phycopeltis, Phyllariocloris, Phyllocardium, Phyllomitas, Pinnularia, Pitophora, Placoneis, Planctonema, 35 Planktosphaeria, Planothidium, Plectonema, Pleodorina, Pleurastrum, Pleurocapsa, Pleurocladia, Pleurodiscus, Pleurosigma, Pleurosira, Pleurotaenium, Pocillomonas, Podohedra, Polyblepharides, Polychaetophora, Polyedriella, Polyedriopsis, Polygoniocloris, Polyepidomonas, Polytaenia, Polytoma, Polytomella, Porphyridium, Posteriochromonas, Prasinocloris, Prasinocladus, Prasinophyta, Prasiola, Proclorphyta, Proclorothrix, Protoderma, Protosiphon, Provasoliella, Prymnesium, Psammodictyon, Psammothidium, Pseudanabaena, Pseudenoclonium, Psuedocarteria, Pseudochate, Pseudocharacium, Pseudococcomyxa, Pseudodictyosphaerium, Pseudokephyrion, Pseudoncobyrsa, Pseudoquadrigula, Pseudosphaerocystis, Pseudostaurastrum, Pseudostaurosira, Pseudotetrastrum, Pteromonas, Punctastruata, Piramichlamys, Piramimonas, Pirrophyta, Quadricloris, Quadricoccus, Quadrigula, Radiococcus, Radiofilum, Raphidiopsis, Raphidoceiis, Raphidonema, Raphidophyta, Peimeria, Rhabdoderma, Rhabdomonas, Rhizoclonium, Rhodomonas, Rhodophyta, Rhoicosphenia, Rhopalodia, Rivularia, 45 Rosenvingiella, Rossithidium, Roya, Scenedesmus, Scherffelia, Schizochlamydella, Schizochlamys, Schizomeris, Schizothrix, Schroederia, Scolioneis, Scotiella, Scotiellopsis, Scourfieldia, Scytonema, Selenastrum, Selenocloris, Sellaphora, Semiorbis, Siderocelis, Diderocystopsis, Dimonsenia, Siphononema, Sirocladium, Sirogonium, Skeletonema, Sorastrum, Spermatozopsis, Sphaerellocystis, Sphaerellopsis, Sphaerodinium, Sphaeroplea, Sphaerozosma, Spiniferomonas, Spirogyra, Spirotaenia, Spirulina, Spondylomorum, Spondylosium, Sporotetras, Spumella, Staurastrum, Stauerodesmus, Stauroneis, Staurosira, Staurosirella, Stenopterobia, Stephanocostis, Stephanodiscus, Stephanoporos, Stephanosphaera, Stichococcus, Stichogloea, Stigeoclonium, Stigonema, Stipitococcus, Stokesiella, Strombomonas, Stylochrysalis, Stylodinium, Styloyxis, Stylosphaeridium, Surirella, Sykidion, Symploca, Synechococcus, Synechocystis, Synedra, Synochromonas, Synura, Tabellaria, Tabularia, Teilingia, Temnogametum, Tetmemorus, Tetraclorella, Tetracyclus, Tetradesmus, Tetraedriella, Tetraedron,

55 Tetraselmis, Tetraspora, Tetrastrum, Thalassiosira, Thamniochaete, Thorakocloris, Thorea, Tolypella, Tolypothrix, Trachelomonas, Trachydiscus, Trebouxia, Trentepholia, Treubaria, Tribonema, Trichodesmium, Trichodiscus, Trochiscia, Tryblionella, Ulothrix, Uroglena, Uronema, Urosolenia, Urospora, Uva, Vacuolaria, Vaucheria, Volvox, Volvulina, Westella, Woloszynskia, Xanthidium, Xanthophyta, Xenococcus, Zygnema, Zygnemopsis, y Zygonium.

La conversión hiperfotosintética requiere modificación genética extensiva (Tablas 1 y 2); por tanto, el organismo fotoautotrófico precursor se transforma con ADN exógeno.

Los organismos preferidos para conversión hiperfotosintética incluyen Synechococcus sp PCC 7002 y, Synechococcus sp. PCC 7942; Synechocystis sp. PCC 6803, y Thermosynechococcus elongatus BP-1

65 (cianobacteria).

Propagación

Los métodos para el cultivo de organismos fotosintéticos en medio líquido y en placas que contienen agarosa son bien conocidos para los especialistas en la técnica (véanse, por ejemplo, los sitios web asociados con la ATCC, y

5 con el Instituto Pasteur). Por ejemplo, las células de Synechococcus sp. PCC 7002 (disponibles en la Pasteur Culture Collection of Cyanobacteria) se cultivan en medio BG-11 (NaNO3 17,65 mM, K2HPO4 0,18 mM, MgSO4 0,3 mM, CaCI2 0,25 mM, ácido cítrico 0,03 mM, citrato de amonio férrico 0,03 mM, EDTA 0,003 mM, Na2CO3 0,19 mM, 2,86 mg/l de H3BO3, 1,81 mg/l de MnCI2, 0,222 mg/l de ZnSO4, 0,390 mg/l de Na2MoO4, 0,079 mg/l de CuSO4, y 0,049 mg/l de Co(NO3)2, pH 7,4) suplementado con 16 μg/l de biotina, MgSO4 20 mM, KCI 8 mM, y NaCI 300 mM (véase, por ejemplo, el sitio web asociado con el Instituto Pasteur, y Price GD, Woodger FJ, Badger MR, Howitt SM, Tucker L. "Identification of a SulP-type bicarbonate transporter in marine cyanobacteria. Proc Natl. Acad. Sci USA (2004). 101 (52): 18228-33). Típicamente, los cultivos se mantienen a 28ºC y se burbujean de forma continua con CO2 al 5% a una intensidad de luz de 120 μmol de fotones/m2/s.

15 Thermosynechococcus elongatus BP-1 (disponible en el Kazusa DNA Research Institute, Japón) se propaga en medio BG11 suplementado con TES-KOH 20 mM (pH 8,2) como se ha descrito [Iwai M, Katoh H, Katayama M, Ikeuchi M. "Improved genetic transformation of the thermophilic cyanobacterium, Thermosynechococcus elongatus BP-1," Plant Cell Physiol (2004). 45(2):171-175)]. Típicamente, los cultivos se mantienen a 50ºC y se burbujean de forma continua con CO2 al 5% a una intensidad de luz de 38 μmol de fotones/m2/s.

Lo anterior define condiciones de propagación típicas. Según sea apropiado, las incubaciones se realizan usando medios alternativos o composiciones gaseosas, temperaturas alternativas (5-75ºC), y/o flujos de luz (0-5500 μmol de fotones/m2/s).

25 La luz se suministra a través de una diversidad de mecanismos, incluyendo iluminación natural (luz solar), incandescencia convencional, fluorescencia, o bombillas halógenas, o mediante propagación en cámaras de crecimiento iluminadas especialmente diseñadas (por ejemplo, cámara de crecimiento iluminada modelo LI15 (Sheldon Manufacturing, Inc. Cornelius, OR). Para experimentos que requieren longitudes de onda y/o intensidades específicas, la luz se distribuye mediante diodos emisores de luz (LED), en los cuales pueden controlarse cuidadosamente los espectros de longitud de onda y la intensidad (Philips).

El dióxido de carbono se suministra mediante inclusión de suplementos de medio sólido (es decir, bicarbonato sódico) o en forma de un gas mediante su distribución en la incubadora de crecimiento o medio. La mayoría de los experimentos se realizan usando dióxido de carbono gaseoso concentrado, a concentraciones entre el 1 y el 30%,

35 que se burbujea directamente en el medio de cultivo a velocidades suficientes para proporcionar la mezcla para los organismos. Cuando se utiliza dióxido de carbono gaseoso concentrado, el gas se origina en forma pura a partir de cilindros disponibles en el mercado, o preferentemente a partir de fuentes concentradas que incluyen gases residuales o gases de combustión de plantas carboníferas, refinerías, instalaciones de producción de cemento, instalaciones de gas natural, destilerías, y similares.

Plásmidos

Los plásmidos relevantes para ingeniería genética típicamente incluyen al menos dos elementos funcionales 1) un origen de replicación que posibilita la propagación de la secuencia de ADN en el organismo hospedador, y 2) un 45 marcador de selección (por ejemplo, un marcador de resistencia a antibióticos que confiere resistencia a ampicilina, kanamicina, zoecina, cloranfenicol, tetraciclina, espectinomicina, y similares). Los plásmidos a menudo se mencionan como "vectores de clonación" cuando su propósito principal es posibilitar la propagación de un inserto de ADN heterólogo deseado. Los plásmidos también pueden incluir secuencias reguladoras de acción en cis para dirigir la transcripción y la traducción de insertos de ADN heterólogo (por ejemplo, promotores, terminadores de la transcripción, sitios de unión al ribosoma); dichos plásmidos se mencionan frecuentemente como "vectores de expresión". Cuando los plásmidos contienen elementos funcionales que permiten la propagación en más de una especie, dichos plásmidos se mencionan como "vectores lanzadera". Los vectores lanzadera son bien conocidos para los especialistas en la técnica. Por ejemplo, pSE4 es un vector lanzadera que permite la propagación en E. coli y Synechococcus [Maeda S, Kawaguchi Y, Ohy T, y Omata T. J. Bacteriol. (1998). 180:4080-4088]. Los vectores

55 lanzadera son particularmente útiles en la presente invención para permitir la fácil manipulación de genes y secuencias reguladoras en E. coli antes de la transformación en el organismo fotoautotrófico de interés.

Técnicas de transformación

Los métodos convencionales para la transformación de procariotas son bien conocidos para los especialistas en la técnica [Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volumen 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning--A Laboratory Manual (2ª ed.) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; y Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel y col., eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley y Sons,

65 Inc., (hasta e incluyendo el suplemento 1997)].

Muchos organismos procariotas son competentes de forma natural; otros pueden volverse competentes por tratamientos químicos. Ejemplos no limitantes de técnicas de transformación incluyen incubación directa en presencia de ADN exógeno, transformación por choque térmico, transformación por electroporación, transformación por bombardeo con partículas biolísticas, transformación mediante adición de lípidos o agentes fusogénicos (es

5 decir, polietilenglicol), conjugación con un microorganismo heterólogo, o transducción mediante partículas víricas.

Las células de Synechococcus sp. PCC 7002 se transforman de acuerdo con el protocolo optimizado descrito previamente [Essich ES, Stevens Jr E, Porter RD "Chromosomal Transformation in the Cyanobacterium Agmenellum quadruplicatum". J Bacteriol (1990). 172 (4): 1916-1922]. Las células se cultivan en medio A (18 g/l de NaCl, 5 g/l de MgSO4 · 7 H2O, 30 mg/l de Na2EDTA, 600 mg/l de KCI, 370 mg/l de CaCI2· 2 H2O, 1 g/l de NaNO3, 50 mg/l de KH2PO4,1 g/l de Trizma base pH 8,2, 4 μg/l de vitamina B 12, 3,89 mg/l de FeCI3· 6 H2O, 34,3 mg/l de H3BO3, 4,3 mg/l de MnCI2 · 4 H2O, 315 μg/l de ZinCI2, 30 μg/l de MoO3, 3 μg/l de CuSO4 · 5 H2O, 12,2 μg/l de CoCI2 · 6 H2O) [Stevens SE, Patterson COP, y Myers J. "The production of hydrogen peroxide by green algae: a survey." J. Phycology (1973). 9:427-430] más 5 g/l de NaNO3, a aproximadamente 108 células/ml. Se mezclan nueve

15 volúmenes de células con un volumen de 1-10 μg/ml de ADN en NaCl 0,15 M/citrato Na3 0,015 M y se incuban a 2730ºC durante 3 horas antes de la adición de un volumen de DNasa 1 a una concentración final de 10 μg/ml. Las células se siembran en placas en 2,5 ml de agar recubierto con medio A al 0,6% que se templó a 45ºC y se incuban. Las células se estimulan con antibiótico por refuerzo de 2,0 ml de agar con medio A al 0,6% que contiene una concentración apropiada de antibiótico con una pipeta Pasteur estéril. Los transformantes se pican 3-4 días después. Las selecciones se realizan típicamente usando 200 μg/ml de kanamicina, 8 μg/ml de cloranfenicol, 10 μg/ml de espectinomicina en medio sólido, mientras que se emplean 150 μg/ml de kanamicina, 7 μg/ml de cloranfenicol, y 5 μg/ml de espectinomicina en medio líquido.

Las células Thermosynechococcus elongatus BP-1 se transforman de acuerdo con el protocolo optimizado

25 previamente descrito [Iwai M, Katoh H, Katayama M, y Ikeuchi M. "Improved genetic transformation of the thermophilic cyanobacterium Thermosynechococcus elongatus BP-1, Plant Cell Physiol (2004). 45(2):171-175]. Se incuban cultivos en fase semi-exponencial con ADN exógeno (típicamente 3-20 μg) y se someten a electroporación en una fuerza de campo de 10 kV/cm usando un BioRad Gene Pulsur Xcell (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Después de la electroporación, las células se recuperan en 1 ml de medio BG11 durante 24 horas a 45ºC. Las células se siembran directamente en placas BG11 que contienen el antibiótico apropiado u opcionalmente se premezclan con medio BG11 que contiene agar fundido al 0,35% (p/v) (Difco, Estados Unidos).

La transformación típicamente implica la incubación de las células receptoras con ADN plasmídico purificado aislado de E. coli. En contraste, la conjugación bacteriana proporciona un medio alternativo para transferir directamente

35 ADN de una especie bacteriana a otra. Por ejemplo, se han descrito técnicas que posibilitan la conjugación entre E. coli y cianobacterias incluyendo Synechocystic PCC 6803 y PCC 6714 y Synechococcus PCC 7942 y PCC 6301, así como Synechococcus elongatus termófilo [Marraccini P, Bulteau S, Cassier-Chauvat C, Mermet-Bouvier P, y Chauvat F. "A conjugative plasmid vector for promoter analysis in several cyanobacteria of the genera Synechococcus and Synechocystis." Plant Molecular Biology (1993). 23(4):905-909; Muhlenhoff U y Chauvat; "Gene transfer and manipulation in the thermophilic cyanobacterium Synechococcus elongatus." Molecular and General Genetics MGG (1996). 252(1-2):93-100].

Las Tablas 1 y 2 definen genes preferidos para transmitir las propiedades hiperfotosintéticas a un organismo fotoautotrófico existente.

45 La Tabla 1 enumera genes que se sobre-expresan para potenciar las tasas de fijación del carbono, la tolerancia térmica, la tolerancia al pH, la tolerancia a gases de combustión, la tolerancia salina, las eficacias de recolección de la luz, la generación de energía reductora, y la independencia de nutrientes, junto con información sobre vías asociadas, números de la Comisión de Enzimas (EC), nombres de genes ejemplares, organismo fuente, número de acceso a GenBank, y homólogos de fuentes alternativas. Cuando el organismo precursor codifica un gen con la actividad enzimática indicada, no obstante es útil sobre-expresar estos componentes para mejorar la fijación del CO2. En algunas circunstancias, la secuencia enzimática nativa puede sobre-expresarse. En otras circunstancias, es útil sobre-expresar un gen exógeno, que permita un control regulador más explícito en el bioproceso y un medio para mitigar potencialmente los efectos de la regulación del metabolismo central, que se centra alrededor de los genes

55 nativos explícitamente.

Las secuencias de nucleótidos para los genes indicados (o secuencias de ADN que codifican los polipéptidos idénticos u homólogos, pero que abarcan sustituciones de nucleótidos para 1) alterar los niveles de expresión en base a la tabla de uso de codones del organismo hospedador; 2) añadir o eliminar estructuras secundarias; 3) añadir

o eliminar secuencias de reconocimiento de endonucleasas de restricción; y/o 4) facilitar la síntesis y ensamblaje de genes) se ensamblan por Codon Devices Inc (Cambridge, MA). Se usan, según se ha indicado, proveedores alternativos incluyendo DNA2.0 (Menlo Park, CA), Blue Heron Biotechnology (Bothell, WA), y Geneart (Regensburg, Alemania). Las secuencias insostenibles por fuentes comerciales pueden prepararse usando reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de muestras de ADN o ADNc, o bibliotecas de ADNc/BAC. Los insertos se propagan

65 inicialmente y se secuencian en un vector de clonación, tal como pUC19. De forma importante, la síntesis primaria y la verificación de secuencia del gen de interés en pUC19 proporciona flexibilidad para transferir cada unidad en diversas combinaciones para que vectores de destino alternativos dirijan la transcripción y traducción de las enzimas deseadas. Se incluyen sitios de clonación específicos y/o únicos en los extremos 5' y 3' de las fases de lectura abierta (ORF) para facilitar las transferencias moleculares.

5 Las vías metabólicas necesarias se codifican inicialmente en casetes de expresión dirigidos por promotores constitutivos que están siempre "activados". Muchos de estos promotores son conocidos, por ejemplo, el operón de la proteína ribosómica spc (Pspc), el promotor del gen de la beta-lactamasa de pBR322 (Pbla), el promotor del bacteriófago lambda PL, los promotor de control de la replicación del plásmido pBR322 (PRNAI o PRNAII), o los promotores P1 o P2 del operón de ARN ribosómico rrnB [Liang ST, Bipatnath M, Xu YC, Chen SL, Dennis P, Ehrenber M, Bremer H. Activities of Constitutive Promoters in Escherichia coli. J. Mol Biol (1999). Vol. 292, Número 1, pág. 19-37], los promotores del virus Chlorella descritos en la patente de Estados Unidos 5.846.744 ["Chlorella virus promoters"], el promotor del virus del mosaico de la coliflor 35S [Zheng X, Deng W, Luo K, Duan H, Chen Y, McAvoy R, Song S, Pei Y, Li Y. "The cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter sequence alters the level and

15 patterns of activity of adjacent tissue-and organ-specific gene promoters." Plant Cell Rep (2007). 26(8): 11195-1203], el promotor constitutivo petH de Anabaena [Valladares A, Muro-Pastor AM, Fillat MF, Herrero A, Flores E. "Constitutive and nitrogen-regulated promoters of the petH gene encoding ferredoxin:NADP+ reductase in the heterocyst-forming cyanobacterium Anabaena sp." FEBS Lett (1999). 449(2-3): 159-64], el promotor RbcS2 de Chlamydomonas [Leon R, Couso I, Fernandez E. "Metabolic engineering of ketocarotenoids biosynthesis in the unicellular microalgae Chlamydomonas reinhardtii." J Biotechnol (2007). 130(2): 143-152], y la secuencia promotora central de psbA de Microcystis aeruginosa K-81 [Shibato J, Asayama M, Shirai M. "Specific recognition of the cyanobacterial psbA promoter by RNA polimerases containing principal sigma factors." Biochim. Biophys Acta (1998). 1442(2-3): 296-303].

25 Según sea necesario, tras diseñar y ensayar las vías, se "afina" la potencia de los promotores constitutivos para aumentar o disminuir los niveles de transcripción para optimizar una red, por ejemplo, modificando los elementos conservados -35 y -10 o el espaciado entre estos elementos [Alper H, Fischer C, Nevoigt E, Stephanopoulus G. "Tuning genetic control through promoter engineering." PNAS (2005). 102(36):12678-12783; Jensen PR y Hammer

K. "The sequence of spacers between the consensus sequences modulates the strength of prokaryotic promoters." Appl Environ Microbiol (1998). 64(l):82-87; Mijakovic I, Petranovic D, Jensen PR. Tunable promoters in system biology. Curr Opin Biotechnol (2005). 16: 329-335; De Mey M, Maertens J, Lequeux GJ, Soetaert WK, Vandamme EJ. "Construction and model-based analysis of a promoter library from E. coli: an indispensable tool for metabolic engineering." BMC Biotechnology (2007) 7:34].

35 Cuando se demuestra una expresión constitutiva no óptima (es decir, tiene efectos perjudiciales, está desincronizada con la red, etc.) se usan promotores inducibles. Los promotores Inducibles están "inactivados" (no transcritos) antes de la adición de un agente inductor, frecuentemente una molécula pequeña o metabolito. Ejemplos de sistemas promotores inducibles adecuados incluyen el promotor inducible de arabinosa Pbad [Khlebnikov A, Datsenko KA, Skaug T, Wanner BL, Keasling JD. "Homogeneous expression of the P(BAD) promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter." Microbiology (2001). 147 (Pt 12): 3241-7], el promotor inducible de ramnosa rhaPBAD [Haldimann A, Daniels L, Wanner B. J Bacteriol (1998). "Use of new methods for construction of tightly regulated arabinose and rhamnose promoter fusions in studies of the Escherichia coli phosphate regulon." 180: 1277-1286], el promotor inducible de propionato pPRO [Lee SK y Keasling JD. "A propionate-inducible expression system for enteric bacteria." Appl Environ Microbiol (2005). 71 (11):6856-62)],

45 el promotor lac inducible por IPTG [Gronenborn. Mol Gen Genet (1976). "Overproduction of phage lambda repressor under control of the lac promoter of Escherichia coli."148:243-250], el promotor sintético tac [De Boer HA, Comstock LJ, Vasser M. "The tac promoter: a functional hybrid derived from the trp and lac promoters." PNAS (1983). 80:2125], el promotor sintético trc [Brosius J, Erfle M, Storella J. "Spacing of the -10 y -35 regions in the tac promoter. Effect on its in vivo activity." J Biol Chem (1985). 260:3539-3541], o el sistema de la ARN polimerasa T7 [Studier FW y Moffatt BA. "Use of bacteriophage T7 RNA polimerase to direct selective high-level expression of cloned genes." J Mol Biol (1986). 189:113-130], el sistema promotor/operador tetA inducible por tetraciclina o anhidrotetraciclina [Skerra A. "Use of the tetracicline promoter for the tightly regulated production of a murine antibody fragment in Escherichia coli" Gene (1994). 151:131-135], los promotores Cpx1 y Cyc6 inducibles por níquel de Chlamydomonas reinhardtii [Quinn JM, Kropat J, Merchant S. "Copper response element and Crr1-dependent nickel-responsive

55 promoter for induced, reversible gene expression in Chlamydomonas reinhardtii." Eukaryotic Cell (2003). 2 (5):9951002], el promotor nirA inducible por nitrito de Synechococcus [Qi Q, Hao M, Ng W, Slater SC, Baszis SR, Weiss JD, y Valentin HE. "Application of the Synechococcus nirA promoter to establish an inducible expression system for engineering the Synechocystis tocopherol pathway." Appl. Environ. Microb (2005) 71(10): 5678-5684], el promotor de la arilsulfatasa sensible a azufre de Volvox [Hallman A y Sumper M. "Reporter genes and highly regulated promoters as tools for transformation experiments in Volvox carteri." Proc Natl Acad Sci (1994). 91 (24):11562-11566]. Se emplean éstos y otros promotores inducibles de origen natural u obtenidos sintéticamente (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 7.235.385; Methods for enhancing expression of recombinant proteins).

Se seleccionan orígenes de replicación alternativos para proporcionar capas adicionales de control de la expresión.

65 La cantidad de copias por célula contribuye al "efecto de dosificación génica." Por ejemplo, se usan los orígenes de elevadas copias pMB1 o colE1 para generar 300-1000 copias de cada plásmido por célula, lo que contribuye a un elevado nivel de expresión génica. En contraste, los plásmidos que codifican orígenes de bajas copias, tales como pSC101 o p15A, se aprovechan para restringir la cantidad de copias a aproximadamente 1-20 copias por célula. Las técnicas y secuencias para modular adicionalmente la cantidad de copias de plásmidos son conocidas (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 5.565.333, Plasmid replication origin increasing the copy number of

5 plasmid containing said origin; la patente de Estados Unidos Nº 6.806.066, Expression vectors with modified ColE1 origin of replication for control of plasmid copy number). Ciertos organismos, incluyendo Synechococcus sp. PCC 7002, codifican plásmidos endógenos con cantidades variables de copias [Yano S, Kawata Y, Kojima H. "Salinitydependent copy number changes of endogenous plasmids in Synechococcus sp. PCC 7002]; por tanto, la dosificación génica puede modificarse dirigiendo los casetes de expresión a distintos plásmidos endógenos.

Los niveles de expresión también se optimizan por modulación de la eficacia de traducción. En E. coli, una secuencia de Shine-Dalgarno (SD) [Shine J y Dalgarno L. Nature (1975) "Determination of cistron specificity in bacterial ribosomes." 254(5495):34-8] es un secuencia consenso que dirige el ribosoma al ARNm y facilita el inicio de la traducción alineando el ribosoma con el codón de inicio. La modulación de la secuencia SD se usa para 15 aumentar o disminuir la eficacia de traducción según sea apropiado [de Boer HA, Comstock LJ, Hui A, Wong E, Vasser M. Gene Amplif Anal (1983). "Portable Shine-Dalgarno regions; nucleotides between the Shine-Dalgarno sequence and the start codon effect the translation efficiency." 3:103-16; Mattanovich D, Weik R, Thim S, Kramer W, Bayer K, Katinger H. Ann NY Acad Sci (1996). "Optimization of recombinant gene expression in Escherichia coli." 782:182-90.]. Es de señalar que puede observarse un elevado nivel de traducción en ciertos contextos en ausencia de una secuencia SD [Mutsuda M y Sugiura M. "Translation initiation of cyanobacterial rbcS mRNAs requires the 38kDa ribosomal protein S1 but not the Shine-Dalgarno sequence." J Biol Chem (2006). 281(50):38314-38321; Xu J, Mironova R, Ivanov IG, Abouhaidar MG. J Basic Microbiol (1999). "A polilinker-derived sequence, PL, highly increased translation efficiency in Escherichia coli." 39 (1):51-60]. La estructura secundaria del ARNm se modifica por ingeniería dentro o fuera de los genes de interés para modular los niveles de expresión [Klinkert B, Elles I, 25 Nickelsen J. "Translation of chloroplast psbD mRNA in Chlamydomonas is controlled by a secondary structure blocking the AUG start codon." Nucleic Acids Res (2006). 34(1):384-94; Cebe R y Geiser M. Protein Expr Purif (2006). "Rapid and easy thermodynamic optimization of 5'-end of mRNA dramatically increases the level of wild type protein expression in Escherichia coli." 45(2):374-80; Zhang W, Xiao W, Wei H, Zhang J, Tian Z. Biochem Biophys Res Commun (2006). "mRNA secondary structure at start AUG codon is a key limiting factor for human protein expression in Escherichia coli." 349(1):69-78; Voges D, Watzele M, Nemetz C, Wizemann S, Buchberger B. Biochem Biophys Res Commun (2004). "Analyzing and enhancing mRNA translational efficiency in an Escherichia coli in vitro expression system." 318(2):601-14]. El uso de codones también se manipula para aumentar o disminuir los niveles de traducción [Deng T. FEBS Lett (1997). "Bacterial expression and purification of biologically active mouse c-Fos proteins by selective codon optimization." 409(2): 269-72; Hale RS y Thompson G. Protein Expr Purif (1998). "Codon

35 optimization of the gene encoding a domain from human type 1 neurofibromin protein results in a threefold improvement in expression level in Escherichia coli." 12(2): 185-8].

En algunas realizaciones, cada gen de interés se expresa en un plásmido único. En realizaciones preferidas, las vías biosintéticas deseadas se codifican en vectores plasmídicos multi-cistrónicos. Los vectores de expresión útiles se diseñan internamente y se sintetizan por proveedores externos de síntesis génica.

Optimizaciones

Las siguientes vías biosintéticas y módulos se ensayan primero y se optimizan usando plásmidos episómicos

45 descritos anteriormente. Optimizaciones no limitantes incluyen intercambio y afinado del promotor, manipulación del sitio de unión al ribosoma, alteración del orden génico (por ejemplo, gen ABC frente a BAC, CBA, CAB, BCA), coexpresión de chaperonas moleculares, mutagénesis aleatoria o dirigida de secuencias génicas para aumentar o disminuir la actividad, el plegamiento, o la regulación alostérica, expresión de secuencias génicas a partir de especies alternativas, manipulación de codones, adición o eliminación de secuencias de dirección intracelular tales como secuencias señal, y similares.

Cada gen o módulo se optimiza individualmente, o como alternativa, en paralelo. El promotor funcional y las secuencias génicas se integran posteriormente en el cromosoma del hospedador fotoautotrófico para posibilita la propagación estable en ausencia de presión selectiva (es decir, inclusión de antibióticos) usando técnicas

55 convencionales conocidas para los especialistas en la técnica.

La Tabla 2 enumera los genes que pueden regularse negativamente o eliminarse para potenciar las tasas de fijación del carbono, tolerancia térmica, tolerancia al pH, tolerancia de gases de combustión, tolerancia salina, eficacias de recolección de la luz, generación de energía reductora, e independencia de nutrientes, junto con información sobre las vías asociadas, los números de la Comisión de Enzimas (EC), los nombres de genes ejemplares, el organismo fuente, y los números de acceso a GenBank (no de la invención).

Selecciones y ensayos

65 La presión selectiva proporciona un medio valioso para ensayar y optimizar los organismos hiperfotosintéticos. La capacidad de sobrevivir y replicarse en medios que carecen de vitamina B12 como suplemento del medio confirma la

aplicación satisfactoria del módulo de vitamina B12.

Si se desea, puede introducirse una variación genética adicional antes de la presión selectiva por tratamiento con mutágenos, tales como luz ultra-violeta, alquilantes [por ejemplo, metanosulfonato de etilo (EMS), metano sulfonato 5 de metilo (MMS), dietilsulfato (DES), y nitrosoguanidina (NTG, NG, MMG)], intercaladotes de ADN (por ejemplo, bromuro de etidio), ácido nitroso, análogos de bases, bromouracilo, transposones, y similares.

Como alternativa o además de la presión selectiva, la actividad de la vía puede controlarse siguiendo el crecimiento en condiciones permisivas (es decir, no selectivas) midiendo el rendimiento de producto específico mediante diversos estudios de marcaje metabólico (incluyendo radiactividad), análisis bioquímicos (Michaelis-Menten), espectrometría de masas por cromatografía de gases (GC/MS), espectrometría de masas, espectrometría de masas por desorción e ionización por láser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF), electroforesis capilar (CE), y cromatografía líquida a alta presión (HPLC).

15 Métodos de fermentación

La producción y aislamiento de productos a partir de organismos hiperfotosintéticos puede potenciarse empleando técnicas de fermentación específicas. Un elemento esencial para maximizar la producción reduciendo al mismo tiempo los costes, es aumentando el porcentaje de la fuente de carbono que se convierte en dichos productos. Los átomos de carbono, durante ciclos de vida celulares normales, van a funciones celulares incluyendo producción de lípidos, sacáridos, proteínas, y ácido nucleicos. Reduciendo la cantidad de carbono necesaria para actividades no relacionadas con productos, se puede aumentar la eficacia de la producción saliente. Esto se consigue cultivando primero los microorganismos hasta una densidad deseada. Una densidad preferida sería la conseguida en el pico de la fase log de crecimiento. En dicho punto, pueden aprovecharse genes de control de la replicación para detener el 25 crecimiento de las células. Específicamente, pueden usarse mecanismos que detectan los requisitos (revisado en Camilli, A. y Bassler, B.L Science 311:1113; Venturi, V. FEMS Microbio Rev 30: 274; y Reading, N.C. y Sperandio,

V. FEMS Microbiol Lett 254:1) para activar genes tales como p53, p21, u otros genes de control. Los genes que pueden activarse para detener la replicación y crecimiento celular en E. coli incluyen genes umuDC, cuya sobreexpresión detiene el progreso de la fase exponencial en crecimiento estacionario (Murli, S., Opperman, T., Smith, B.T., y Walker, G.C. 2000 Journal of Bacteriology 182: 1127.). UmuC es una ADN polimerasa que puede realizar la síntesis translesión sobre lesiones no codificantes -la base mecanística de la mayoría de las mutagénesis por UV y químicas. Los productos del gen umuDC son necesarios para el proceso de síntesis translesión y también sirven como control del daño al ADN. Los productos del gen UmuDC incluyen UmuC, UmuD, umuD', UmuD'2C, UmuD'2 y UmuD2. Simultáneamente, se activan los genes de síntesis de producto, minimizando de este modo la necesidad de

35 usar vías críticas de replicación y mantenimiento mientras se está produciendo el producto.

Como alternativa, el crecimiento celular y la producción de producto pueden conseguirse simultáneamente. En este método, las células se cultivan en biorreactores con un suministro continuo de aportaciones y retirada continua de producto. Las fermentaciones discontinuas, semicontinuas, y continuas son habituales y bien conocidas en la técnica y pueden hallarse ejemplos en Thomas D. Brock en Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Segunda Edición (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Mass., o Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol (1992), 36:227.

En todos los métodos de producción, las aportaciones incluyen dióxido de carbono, agua, y luz. El dióxido de

45 carbono puede ser de la atmósfera o de fuentes concentradas incluyendo gas residual o gases de combustión de plantas carboníferas, refinerías, instalaciones de producción de cemento, instalaciones de gas natural, destilerías, y similares. El agua puede ser no salina, de bajo contenido salino, marina, o de alto contenido salino. La luz puede ser solar o de fuentes artificiales incluyendo luces incandescentes, LED, fibra óptica, y luces fluorescentes.

Los organismos recolectores de luz están limitados en su productividad a los momentos en que la radiación solar es suficiente para actividad sus fotosistemas. En un bioprocesos preferido con organismo recolector de luz, se facilita que las células crezcan y produzcan producto con luz como impulsor energético. Cuando hay ausencia de luz suficiente, puede inducirse a las células a minimizar su tasa metabólica central. Para este fin, los promotores inducibles específicos para la producción de productos pueden estimularse fuertemente para dirigir a la célula a

55 procesar sus almacenes energéticos en el producto de elección. Con suficiente fuerza de inducción, la célula minimizará sus esfuerzos de crecimiento, y usa sus reservas de recolección de luz específicamente para la producción de producto. No obstante, se espera que la productividad neta sea mínima durante periodos en que se carece de luz suficiente ya que se capturan ninguno a pocos fotones.

En una realización preferida, la célula se modifica por ingeniería de tal modo que el producto final se libere de la célula. En realizaciones en que el producto final se libera de la célula, puede emplearse un proceso continuo. En este enfoque, puede ensamblarse un reactor con organismos productores de productos deseables en múltiples formas. En una realización, el reactor se hace funcionar en bloque de forma continua, con una parte del medio retirado y mantenido en un entorno menos agitado de modo que el producto acuoso se autoseparará con el producto 65 retirado y el resto vuelve a la cámara de fermentación. En realizaciones en las que el producto no se separa en una fase acuosa, el medio se retira y se emplean técnicas de separación apropiadas (por ejemplo, cromatografía,

destilación, etc.).

En una realización alternativa, el producto no se secreta por las células. En esta realización, se emplea un enfoque de fermentación semicontinua. En dichos casos, las células se cultivan en exposición continuada a las aportaciones

5 (luz, agua, y dióxido de carbono) como se ha especificado anteriormente hasta que la cámara de reacción se satura con células y producto. Una parte significativa de la totalidad del culture se retira, se lisan las células, y se aíslan los productos por técnicas apropiadas de separación (por ejemplo, cromatografía, destilación, filtración, centrifugación, etc.).

En una realización preferida, la cámara de fermentación encerrará una fermentación que está experimentando una fermentación reductora continua. En este caso, se crea un entorno reductor estable. El equilibrio de electrones se mantiene por la liberación de dióxido de carbono (en forma gaseosa). Aumentar el equilibrio NAD/H y NADP/H, como se ha descrito anteriormente, también puede ser de ayuda para estabilizar el equilibrio de electrones.

15 Detección y análisis de productos génicos y celulares

Cualquiera de los métodos analíticos convencionales, tales como espectrometría de masas por cromatografía de gases, y espectrometría de masas por cromatografía líquida, HPLC, electroforesis capilar, espectrometría de masas por desorción e ionización por láser asistida por matriz-tiempo de vuelo, etc., puede usarse para analizar los niveles y la identidad del producto producido por los organismos modificados de la presente invención.

La capacidad para detectar la formación de una nueva vía bioquímica funcional en la célula hiperfotosintética es importante para la práctica de los presentes métodos. En general, los ensayos se realizan para detectar reacciones de transformación bioquímica heterólogas de la célula hospedadora que producen, por ejemplo, moléculas orgánicas 25 pequeñas y similares como parte de una vía de síntesis de novo, o por modificación química de moléculas de forma ectópica proporcionadas en el entorno de la célula hospedadora. La generación de dichas moléculas por la célula hospedadora puede detectarse en "extractos de ensayo", que pueden ser medios condicionados, lisados celulares, membranas celulares, o productos de fraccionamiento semi-purificados o purificados de los mismos. Lo último puede prepararse, como se ha descrito anteriormente, por técnicas clásicas de fraccionamiento/purificación, incluyendo separación de fases, separación cromatográfica, o fraccionamiento de en disolvente (por ejemplo, metanol etanol, acetona, acetato de etilo, tetrahidrofurano (THF), acetonitrilo, benceno, éter, sales de bicarbonato, diclorometano, cloroformo, éter de petróleo, hexano, ciclohexano, éter dietílico y similares). Cuando el ensayo se establece con una célula respondedora para ensayar el efecto de una actividad producida por la célula hospedadora sobre una célula completa en lugar de un fragmento celular, la célula hospedadora y la célula de ensayo pueden co-cultivarse juntas

35 (opcionalmente separadas por un inserto de cultivo, por ejemplo Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA, nº de Catálogo 40446).

En ciertas realizaciones, el ensayo se establece para detectar directamente, por técnicas químicas o fotométricas, una especie molecular que se produce (o destruye) por una vía biosintética de la célula hospedadora recombinante. Dicha producción o degradación de la especie molecular debe depender, al menos en parte, de la expresión del ADN genómico heterólogo. En otras realizaciones, la etapa de detección del presente método implica la caracterización de medios fraccionados/lisados celulares (el extracto de ensayo), o la aplicación del extracto de ensayo a un sistema de detección bioquímico o biológico. En otras realizaciones, el ensayo detectar indirectamente la formación de productos de una vía heteróloga observando un cambio fenotípico en la célula hospedadora, por

45 ejemplo, de un modo autocrino, que depende del establecimiento de una vía biosintética heteróloga en la célula hospedadora.

En ciertas realizaciones, se buscan análogos relacionados con una clase conocida de compuestos, como por ejemplo análogos de alcaloides, aminoglucósidos, ansamacrólidos, beta-lactamas (incluyendo penicilinas y cefalosporinas), carbapenems, terpinoides, hormonas prostanoides, azúcares, ácidos grasos, lincosaminidas, macrólidos, nitrofuranos, nucleósidos, oligosacáridos, oxazolidinonas, péptidos y polipéptidos, fenazinas, polienos, poliéteres, quinolonas, tetraciclinas, estreptograminas, sulfonamidas, esteroides, vitaminas y xantinas. En dichas realizaciones, si existe un ensayo disponible para identificar directamente y/o aislar el producto natural, y se espera que los análogos se comporten de forma similar en esas condiciones, la etapa de detección del presente método

55 puede ser tan sencilla como la detección directa de análogos de interés en el medio de cultivo celular o la preparación de la célula. Por ejemplo, puede realizarse separación cromatográfica u otra separación bioquímica de un extracto de ensayo, y detectarse la presencia o ausencia de un análogo, por ejemplo, espectrofotométricamente, en la fracción en que existirían los compuestos conocidos en condiciones similares. En ciertas realizaciones, dichos compuestos pueden tener una fluorescencia característica o una fosforescencia que puede detectarse sin ninguna necesidad de fraccionar el medio y/o la célula recombinante.

En realizaciones relacionadas, puede ensayarse el medio de cultivo o lisado completo o fraccionado procedente de una célula hospedadora recombinante poniendo en contacto la muestra de ensayo con una célula heteróloga ("célula de ensayo") o componentes de la misma. Por ejemplo, una célula de ensayo, que puede ser procariota o 65 eucariota, se pone en contacto con medio condicionado (completo o fraccionado) procedente de una célula hospedadora recombinante, y se ensaya la capacidad del medio condicionado de inducir una respuesta biológica o

bioquímica procedente de la célula de ensayo. Por ejemplo, el ensayo puede detectar un cambio fenotípico en la célula de ensayo, como por ejemplo un cambio en: la velocidad de transcripción o traducción o el patrón de corte y ayuste de un gen; la capacidad de una proteína; la fosforilación, prenilación, metilación, glucosilación u otra modificación post-traduccional de una proteína, ácido nucleico o lípido; la producción de segundos mensajeros, tales

5 como AMPc, inositol fosfatos y similares. Dichos efectos pueden medirse directamente, por ejemplo, aislando y estudiando un componente particular de la célula, o indirectamente tal como por expresión de un gen indicador, la detección de marcadores fenotípicos, y actividad citotóxica o citostática en la célula de ensayo.

Cuando se explora la bioactividad de compuestos de ensayo producidos por las células hospedadoras recombinantes, puede medirse directamente la generación de de segundo mensajero intracelular. Se ha identificado una diversidad de efectores intracelulares. Por ejemplo, para exploraciones pretendidas para aislar compuestos, o los genes que codifican los compuestos, que son inhibidores o potenciadores de eventos regulados por receptor o canal de iones, puede detectarse el nivel de producción de segundo mensajero a partir de las proteínas de señalización corriente abajo, tales como adenilil ciclasa, fosfodiesterasas, fosfoinositidasas, fosfoinositol quinasas, y

15 fosfolipasas, como también los niveles intracelulares de una diversidad de iones.

En otras realizaciones más, la señal detectable puede producirse por el uso de enzimas o sondas cromogénicas/fluorescentes cuyas actividades son dependientes de la concentración de un segundo mensajero, por ejemplo, tal como calcio, productos de la hidrólisis de inositol fosfato, AMPc, etc.

Muchos genes indicadores y elementos reguladores de la transcripción son conocidos para los especialistas en la técnica y otros pueden identificarse o sintetizarse por métodos conocidos para los especialistas en la técnica. Ejemplos de genes indicadores incluyen, aunque sin limitación, CAT (cloranfenicol acetil transferasa) (Alton y Vapnek (1979), Nature 282: 864-869) luciferasa, y otros sistemas de detección enzimáticos, tales como beta

25 galactosidasa; luciferasa de luciérnaga (de Wet et al. (1987), Mol. Cell. Biol. 7:725-737); luciferasa bacteriana (Engebrecht y Silverman (1984), PNAS 1: 4154-4158; Baldwin et al. (1984), Biochemistry 23: 3663-3667); fosfatasa alcalina (Toh et al. (1989) Eur. J. Biochem. 182:231-238, Hall et al. (1983) J. Mol. Appl. Gen. 2: 101), fosfatasa alcalina secretada placentaria humana (Cullen y Malim (1992) Methods in Enzymol. 216:362-368); β-lactamasa o GST.

Los elementos de control de la transcripción para su uso en las construcciones génicas indicadoras, o para modificar el locus genómico de un gene indicador incluyen, aunque sin limitación, promotores, potenciadores, y sitios de unión represores y activadores. Los elementos reguladores de la transcripción adecuados pueden obtenerse de las regiones reguladoras de la transcripción de genes cuya expresión se induce rápidamente, generalmente en minutos, 35 del contacto entre la proteína de la superficie celular y la proteína efectora que modula la actividad de la proteína de superficie celular. Ejemplos de dichos genes incluyen, aunque sin limitación, los genes tempranos inmediatos (véase, Sheng et al. (1990) Neuron 4: 477-485), tal como c-fos. Los genes tempranos inmediatos son genes que se inducen rápidamente tras la unión de un ligando a una proteína de superficie celular. Los elementos de control de la transcripción que se prefieren para su uso en las construcciones génicas incluyen elementos de control de la transcripción de genes tempranos inmediatos, elementos obtenidos de otros genes que muestran alguna o todas las características de los genes tempranos inmediatos, o elementos sintéticos que se construyen de modo que genes en unión funcional con los mismos muestren dichas características. Las características de genes preferidos a partir de los cuales se obtiene los elementos de control de la transcripción incluyen, aunque sin limitación, expresión baja o indetectable en células quiescentes, inducción rápida a nivel transcripcional en minutos de estimulación extracelular,

45 inducción que es transitoria e independiente de nueva síntesis proteica, la posterior desactivación de la transcripción requiere nueva síntesis proteica, y los ARNm transcriptos a partir de estos genes tienen una corta semi-vida. No es necesario que estén presentes todas estas propiedades.

En otras realizaciones más, la etapa de detección se proporciona en forma de un sistema sin células, por ejemplo, una preparación de lisado celular o de proteína o ácido nucleico purificada o semi-purificada. Las muestras obtenidas de las células hospedadoras recombinantes pueden ensayarse para actividades tales como inhibición o potenciación de dichos complejos por pares (el "complejo diana") que implican interacciones proteína-proteína, interacciones proteína-ácido nucleico, interacciones proteína-ligando, interacciones ácido nucleico-ácido nucleico, y similares. El ensayo puede detectar la ganancia o pérdida de los complejos diana, por ejemplo, por actividades

55 endógenas o heterólogas asociadas con una o ambas moléculas del complejo.

A menudo se prefieren ensayos que se realizan en sistemas sin células, tales como los que se pueden obtener con proteínas purificadas o semi-purificadas, como exploraciones "primarias" porque pueden generarse para permitir un rápido desarrollo y una detección relativamente fácil de una alteración en una diana molecular cuando se pone en contacto con una muestra de ensayo. Además, los efectos de toxicidad celular y/o biodisponibilidad de la muestra de ensayo pueden ignorarse generalmente en el sistema in vitro, centrándose principalmente el ensayo, en cambio, en el efecto de la muestra sobre al diana molecular ya que puede manifestarse en una alteración de la afinidad de unión con otras moléculas o cambios en las propiedades enzimáticas (si fuera aplicable) de la diana molecular. La detección y cuantificación de los complejos por pares proporciona un medio para determinar la eficacia de las 65 muestras de ensayo en la inhibición (o potenciación) de la formación de complejos. La eficacia del compuesto puede valorarse generando curvas de respuesta a dosis a partir de datos obtenidos usando diversas concentraciones de la

muestra de ensayo. Además, también puede realizarse un ensayo de control para proporcionar una medida inicial para la comparación. Por ejemplo, en el ensayo de control puede añadirse medio condicionado de las células hospedadoras no transformadas.

5 La cantidad de complejo diana puede detectarse por una diversidad de técnicas. Por ejemplo, la modulación en la formación de complejos puede cuantificarse usando, por ejemplo, proteínas marcadas de forma detectable o similares (por ejemplo, radiomarcadas, marcadas de forma fluorescente, o marcadas enzimáticamente), por inmunoensayo, o por detección cromatográfica.

En otras realizaciones más, puede usarse una enzima purificada o semi-purificada para ensayar las muestras de ensayo. La capacidad de una muestra de ensayo de inhibir o potenciar la actividad de la enzima puede detectarse convenientemente siguiendo la velocidad de conversión de un sustrato para la enzima.

En otras realizaciones más, la etapa de detección puede diseñarse para detectar un cambio fenotípico en la célula

15 hospedadora que se induce por productos de la expresión de las secuencias genómicas heterólogas. Muchos de los formatos de ensayo basados en células mencionados anteriormente también pueden usarse en la célula hospedadora, por ejemplo, de un modo tipo autocrino.

Además de proporcionar una base para aislar moléculas biológicamente activas producidas por las células hospedadoras recombinantes, la etapa de detección también puede usarse para identificar clones genómicos que incluyen genes que codifican vías biosintéticas de interés. Además, por métodos de subclonación iterativa y/o combinatoria que dependen de dichas etapas de detección, pueden clonarse los genes individuales que confieren la vía detectada a partir del fragmento genómico más grande.

25 Los presentes métodos de exploración pueden realizarse en un formato diferencial, por ejemplo, comparando la eficacia de una muestra de ensayo en un ensayo de detección obtenido con componentes humanos con aquellos obtenidos de, por ejemplo, componentes fúngicos o bacterianos. Por tanto, la selectividad como bactericida o fungicida puede ser un criterio en el protocolo de selección.

La cepa hospedadora no tiene que producir elevados niveles de los nuevos compuestos para que el método sea satisfactorio. La expresión de los genes puede no ser óptima, pueden no estar presentes factores reguladores globales, o las combinaciones de metabolitos pueden no soportar la producción máxima del producto. La capacidad de detectar el metabolito a menudo no requerirá los niveles máximos de producción, particularmente cuando el bioensayo es sensible a pequeñas cantidades de productos naturales. Por tanto, la producción submáxima inicial de

35 compuestos no tiene que ser una limitación para el éxito del presente método.

Finalmente, como se ha indicado anteriormente, la muestra de ensayo puede obtenerse de, por ejemplo, medios condicionados o lisados celulares. Con respecto a los últimos, se anticipa que en ciertos casos puede haber compuestos expresados de forma heteróloga que pueden no exportarse apropiadamente desde la célula hospedadora. Existe una diversidad de técnicas disponible en la técnica para lisar células. Un enfoque preferido es el uso de un agente de lisis específico de célula hospedadora. Por ejemplo puede usarse un fago (por ejemplo, P1, λ, ϕ80) para lisar selectivamente E. coli. Asimismo, pueden usarse cianófagos para lisar selectivamente cianobacterias, tales como Synechococcus y Prochlorococcus. La adición dicho fago a cultivos de crecimiento de células hospedadoras puede maximizar el acceso a los productos heterólogos de nuevas vías biosintéticas en la

45 célula. Además, dichos agentes no interfieren con el crecimiento de un organismo de ensayo, por ejemplo, una célula humana, que puede co-cultivarse con la biblioteca de células hospedadoras.

Optimización metabólica

Como parte del proceso de optimización, se proporcionan etapas para eliminar reacciones secundarias indeseables, si las hay, que puedan consumir el carbono y la energía pero que no produzcan productos útiles (tales como hidrocarburos, ésteres de cera, tensioactivos y otros productos de hidrocarburo). Estas etapas pueden ser útiles porque pueden ayudar a mejorar los rendimientos de los productos deseados.

55 Puede usarse una combinación de diferentes enfoques. Dichos enfoques incluyen, por ejemplo, metabolómica (que puede usarse para identificar productos indeseables e intermedios metabólicos que se acumulan en el interior de la célula), modelado metabólico y marcaje isotópico (para determinar el flujo a través de reacciones metabólicas que contribuyen a la producción de hidrocarburos), y técnicas genéticas convencionales (para eliminar o inutilizar sustancialmente reacciones metabólicas indeseadas). Por ejemplo, el modelado metabólico proporciona un medio para cuantificar los flujos a través de las vías metabólicas de la célula y determinar el efecto de la eliminación de etapas metabólicas clave. Además, la metabolómica y el modelado metabólico posibilitan una mejor comprensión del efecto de la eliminación de etapas metabólicas clave sobre la producción de productos deseados.

Para predecir cómo una manipulación particular del metabolismo afecta al metabolismo celular y la síntesis del

65 producto deseado, se desarrolló un marco teórico para describir los flujos molares a través de todas las vías metabólicas conocidas de la célula. Varios aspectos importantes de este marco teórico incluyen: (i) una base de datos relativamente completa de vías conocidas, (ii) la incorporación de la dependencia en la tasa de crecimiento de la composición celular y los requisitos energéticos, (iii) las mediciones experimentales de la composición de aminoácidos de las proteínas y la composición de ácidos grasos de las membranas a diferentes tasas de crecimiento y tasas de dilución y (iv) las mediciones experimentales de las reacciones secundarias que se sabe que

5 suceden como resultado de la manipulación del metabolismo. Estos nuevos desarrollos permiten una predicción significativamente más precisa de los flujos en las vías metabólicas clave y la regulación de la actividad enzimática. (Keasling, J. D. et al., "New tools for metabolic engineering of Escherichia coli", en Metabolic Engineering, Publisher Marcel Dekker, Nueva York, Nym 1999; Keasling, J.D, "Gene-expression tools for the metabolic engineering of bacteria", Trends in Biotechnology, 17, 452-460, 1999; Martin, V. J. J., et al., "Redesigning cells for production of complex organic molecules", ASM News 68, 336-343 2002; Henry, C. S., et al., "Genome-Scale Thermodynamic Analysis of Escherichia coli Metabolism", Biophys. J., 90, 1453-1461, 2006.)

Dichos tipos de modelos se han aplicado, por ejemplo, para analizar los flujos metabólicos en organismos responsables de la eliminación potenciada de fósforo biológico en reactores de tratamiento de aguas residuales y en

15 hongos filamentosos productores de policétidos. Véase, por ejemplo, Pramanik, et al., "A stoichiometric model of Escherichia coli metabolism: incorporation of growth-rate dependent biomass composition and mechanistic energy requirements." Biotechnol. Bioeng. 56, 398-421, 1997; Pramanik, et al., "Effect of carbon source and growth rate on biomass composition and metabolic flux predictions of a stoichiometric model." Biotechnol. Bioeng. 60, 230-238, 1998; Pramanik et al., "A flux-based stoichiometric model of enhanced biological fosforus removal metabolism." Wat. Sci. Tech. 37, 609-613,1998; Pramanik et al., "Development and validation of a flux-based stoichiometric model for enhanced biological fosforus removal metabolism." Water Res. 33, 462-476, 1998.

Productos

25 Los organismos hiperfotosintéticos de la presente invención pueden modificarse por ingeniería para producir categorías de productos, incluyendo aunque sin limitación, azúcares biológicos, productos de hidrocarburo, formas sólidas, y agentes farmacéuticos.

Los azúcares biológicos incluyen aunque sin limitación, glucosa, almidón, celulosa, hemicelulosa, glucógeno, xilosa, dextrosa, fructosa, lactosa, fructosa, galactosa, ácido urónico, maltosa, y policétidos. En realizaciones preferidas, el azúcar biológico puede ser glucógeno, almidón, o celulosa.

La celulosa es la forma más abundante de biomasa terrestre viva (Crawford, R. L. 1981, Lignin biodegradation and transformation, John Wiley y Sons, Nueva York.). La celulosa, especialmente las pelusas de algodón, se usa en la 35 fabricación de nitrocelulosa. La celulosa es también el constituyente principal del papel. Los monómeros de celulosa (beta-glucosa) se unen juntos a través de enlaces 1,4 glucosídicos. La celulosa es una cadena recta (no existen espirales). En microfibrillas, los múltiples grupos hidróxido se unen por hidrógeno entre sí, manteniendo las cadenas firmemente juntas y contribuyendo a su elevada resistencia a tracción. Dado un material de celulosa, la parte que no se disuelva en una solución al 17,5% de hidróxido sódico a 20ºC es alfa celulosa, que es celulosa verdadera; la parte que se disuelve y después precipita tras la acidificación es beta celulosa, y la proporción que se disuelve pero no precipita es gamma celulosa. La hemicelulosa es una clase de polisacárido de pared celular vegetal que puedeser cualquier de varios heteropolímeros. Éstos incluyen xilano, xiloglucano, arabinoxilano, arabinogalactano, glucuronoxilano, glucomanano, y galactomanano. Esta clase de polisacáridos se halla en casi todas las paredes celulares junto con la celulosa. La hemicelulosa es de menor peso que la celulosa, y no puede extraerse por agua

45 caliente o agentes quelantes, pero puede extraerse por álcalis acuoso. Las cadenas poliméricas se unen a pectina y celulosa, formando una red de fibras entrecruzadas.

Hay esencialmente tres tipos de productos de hidrocarburo: (1) productos de hidrocarburo aromático, que tiene al menos un anillo aromático; (2) productos de hidrocarburo saturado, que carecen de enlaces dobles, triples o aromáticos; y (3) productos de hidrocarburo insaturado, que tienen uno o más dobles o triples enlaces entre los átomos de carbono. Un "producto de hidrocarburo" puede definirse adicionalmente como un compuesto químico que consta de C, H, y opcionalmente O, con un esqueleto de carbono y átomos de hidrógeno y oxígeno, unidos al mismo. El oxígeno puede unirse de forma sencilla o doble al esqueleto y puede unirse por hidrógeno. En el caso de éteres y ésteres, el oxígeno puede incorporarse en el esqueleto, y unirse por dos enlaces sencillo, a las cadenas de

55 carbono. Un único átomo de carbono puede unirse a uno o más átomos de oxígeno. Los productos de hidrocarburo también pueden incluir los anteriores compuestos unidos a agentes biológicos incluyendo proteínas, coenzima A y acetil coenzima A. Los productos de hidrocarburo incluyen, aunque sin limitación, hidrocarburos, alcoholes, aldehídos, ácido carboxílicos, éteres, ésteres, carotenoides, y cetonas.

Los productos de hidrocarburo también incluyen alcanos, alquenos, alquinos, dienos, isoprenos, alcoholes, aldehídos, ácidos carboxílicos, tensioactivos, ésteres de cera, agentes químicos poliméricos [poliftalato carbonato (PPC), poliéster carbonato (PEC), polietileno, polipropileno, poliestireno, polihidroxialcanoatos (PHA), poli-betahidroxibutirato (PHB), polilactida (PLA), y policaprolactona (PCL)], agentes químicos monoméricos [propilenglicol, etilenglicol, y 1,3-propanodiol, etileno, ácido acético, ácido butírico, ácido 3-hidroxipropanoico (3-HPA), ácido acrílico, 65 y ácido malónico], y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones preferidas, los productos de hidrocarburo son alcanos, alcoholes, tensioactivos, ésteres de cera y combinaciones de los mismos. Otros productos

de hidrocarburo incluyen ácidos grasos, hidrocarburos unidos a acetil-CoA, carbohidratos unidos a acetil-CoA, e intermedios policétidos.

Los organismos recombinantes pueden modificarse por ingeniería para producir productos de hidrocarburo e

5 intermedios sobre un amplio intervalo de tamaños. Alcanos específicos que pueden producirse incluyen, por ejemplo, etano, propano, butano, pentano, hexano, heptano, octano, nonano, decano, undecano, dodecano, tridecano, tetradecano, pentadecano, hexadecano, heptadecano, y octadecano. En realizaciones preferidas, los productos de hidrocarburo son octano, decano, dodecano, tetradecano, y hexadecano. Precursores de hidrocarburo tales como alcoholes que pueden producirse incluyen, por ejemplo, etanol, propanol, butanol, pentanol, hexanol, heptanol, octanol, nonanol, decanol, undecanol, dodecanol, tridecanol, tetradecanol, pentadecanol, hexadecanol, heptadecanol, y octadecanol. En realizaciones más preferidas, el alcohol se selecciona entre etanol, propanol, butanol, pentanol, hexanol, heptanol, octanol, nonanol, y decanol.

Se usan tensioactivos en una diversidad de productos, incluyendo detergentes y limpiadores, y también se usan

15 como auxiliares para textiles, cuero y papel, en procesos químicos, en cosméticos y agentes farmacéuticos, en la industria alimentaria y en agricultura. Además, pueden usarse para ayudar en la extracción y aislamiento de petróleo crudo que resulta fuerte para los entornos de acceso o como emulsiones acuosas. Hay cuatro tipos de tensioactivos caracterizados por usos variados. Los tensioactivos aniónicos tienen actividad tipo detergente y generalmente se usan para aplicaciones de limpieza. Los tensioactivos catiónicos contienen hidrocarburos de cadena larga y a menudo se usan para tratar proteínas y polímeros sintéticos o son componentes de suavizantes textiles y acondicionadores capilares. Los tensioactivos anfotéricos también contienen hidrocarburos de cadena larga y se usan típicamente en champúes. Los tensioactivos no iónicos se usan generalmente en productos de limpieza.

Los hidrocarburos pueden producirse adicionalmente como biocombustibles. Un biocombustibles es cualquier

25 combustible que se obtenga de una fuente biológica -recientemente organismos vivos o sus sub-productos metabólicos, tales como estiércol de vacas. Un biocombustible puede definirse adicionalmente como combustible obtenido de un producto metabólico de un organismo vivo. Los biocombustibles preferidos incluyen, aunque sin limitación, biodiesel, biocrudo, etanol, "petróleo renovable", butanol, y propano.

Las formas sólidas de carbono incluyen, por ejemplo, carbón, grafito, grafeno, cemento, nanotubos de carbono, negro de carbono, diamantes, y perlas. Los sólidos de carbono puro tales como carbono y diamante son las formas sólidas preferidas.

Pueden producirse agentes farmacéuticos incluyendo, por ejemplo, taxol basado en isoprenoide y artemisinina, u 35 oseltamivir.

Construcciones plasmídicas

Construcción del plásmido base pJB5

El plásmidos base pJB5 se diseñó como un vector de expresión vacío para recombinación en Synechococcus sp. PCC 7002. Se diseñaron dos regiones de homología, la región de homología corriente arriba (UHR) y la región de homología corriente abajo (DHR) para flanquear el gen o genes clonados de interés. Estas regiones de homología de 500 pb corresponden a las posiciones 3301-3800 y 3801-4300 en el plásmido natural pAQ1 (acceso a Genbank

45 NC_005025) para UHR y DHR respectivamente. El promotor aadA, la secuencia génica, y el terminador se diseñaron para conferir resistencia a espectinomicina y estreptomicina a la construcción integrada. Para la expresión, se diseño pJB5 con el promotor del casete de resistencia a kanamicina aph2 y el sitio de unión al ribosoma (RBS). Corriente abajo de este promotor y RBS, se diseñó e insertó el sitio de reconocimiento para endonucleasa de restricción para Ndel y EcoRI, así como los sitios para Xhol, BamHI, Spel y Pad. Después del sitio EcoRI, se incluyó el terminador natural del gen de la alcohol deshidrogenasa de Zymomonas mobilis (adhll). Sitios de restricción Xbal convenientes flanquean la UHR y la DHR permitiendo la escisión del ADN pretendido para recombinación del resto del vector. Se construyeron pJB5, pJB6 y pJB7 por DNA2.0 (Menlo Park, CA).

Ejemplos

Ejemplo 1: Independencia de nutrientes

Además de CO2 y luz, los organismos fotoautotróficos típicamente requieren fuentes inorgánicas de nutrientes y vitaminas. Los nutrientes requeridos se suplementan generalmente al medio de cultivo durante propagación a escala experimental de dichos organismos. Sin embargo, dichos nutrientes son prohibitivamente caros en el contexto de bioprocesamiento a escala industrial.

El nitrógeno es un constituyente clave de una diversidad de macromoléculas celulares, incluyendo aminoácidos y nucleótidos. La modificación por ingeniería de fotoautótrofos para utilizar de forma eficaz fuentes económicas

65 proporciona significativas ventajas económicas y prácticas.

Los fotoautótrofos pueden modificarse por ingeniería para fijar N2, que se halla presente en concentraciones de casi el 80% (v/v) en el aire y los gases de combustión. En este escenario, se sobre-expresan los genes necesarios para la fijación el nitrógeno, además de los genes necesarios para la síntesis de los cofactores necesarios y la proteína accesoria [Herrero A, Muro-Pastor AM, Flores E. J Bacteriol (2001) "Nitrogen Control in Cyanobacteria." 183(2): 4115 425]. Dieciocho de dichos genes ejemplares se hallan en Nostoc sp PCC 7120: proteína de biosíntesis del cofactor FeMo (NifB), locus NP_485557; [4Fe-4S]ferredoxina (FdxN), locus BAB77882; L-cisteína desulfurasa (NifS), EC 2.8.1.7, locus NP_485499; proteína accesoria del grupo Fe (NifU), locus NP_485498; nitrogenasa -subunidad Fe (NifH), EC 1.18.6.1, locus NP_485497; nitrogenasa-subunidad alfa (NifD), EC 1.18.6.1, locus NP_485484; nitrogenasa -subunidad beta (NifK), EC 1.18.6.1, locus NP_485483; proteína de biosíntesis del cofactor FeMo (NifE), locus NP_485481; proteína de biosíntesis del cofactor FeMo (NifN), locus NP_485480; proteína accesoria del grupo FeS (NifX), locus NP_485479; proteína accesoria del cofactor FeMo (NifW), locus NP_485476; proteína accesoria del cofactor FeMo (HesA), locus NP_485475; proteína accesoria del cofactor FeS (HesB), locus NP_485474; ferredoxina específica de fijación de nitrógeno (FdxH), locus NP_485473; piruvato-flavodoxina oxidoreductasa (NifJ), EC 1.2.7.1, locus NP_486843; homocitrato sintasa (NifV), EC 2.3.3.14, locus NP_485450; proteína

15 accesoria del cofactor FeMo (NifZ), locus NP_485451; y proteína accesoria del cofactor FeMo (NifT), locus NP_485452). La sobre-expresión de los anteriores genes facilita que los organismos fotoautotróficos crezcan con N2 gaseoso como única fuente de nitrógeno.

Además o como alternativa, los fotoautótrofos se modifican por ingeniería para asimilar nitrito, que es un componente traza de los gases de combustión. Las células deben modificarse por ingeniería para expresar un transportador de nitrito/nitrato y transmitirse con la capacidad de convertir nitrito en amoniaco. Secuencias génicas ejemplares que codifican transportadores activos de nitrato/nitrato se hallan en Synechococcus sp. PCC 6301 [Herrero A, Muro-Pastor AM, Flores E. J Bacteriol (2001) "Nitrogen Control in Cyanobacteria." 183(2): 411-425] y se sobre-expresan en células para importar nitratos y nitrito, por ejemplo: proteína de unión al sustrato del sistema de

25 transporte de nitrato/nitrito tipo ABC (NrtA), locus YP_171021; proteína permeasa del sistema de transporte de nitrato/nitrito tipo ABC (NrtB), locus YP_171022; proteína de unión a ATP del sistema de transporte de nitrato/nitrito tipo ABC (NrtC), locus YP_ 171023; proteína de unión a ATP del sistema de transporte de nitrato/nitrito tipo ABC (NrtD), locus YPJ71024). Como alternativa, se sobre-expresa individualmente el polipéptido del gen del transportador de nitrato/nitrito (NrtP) de Synechococcus sp. PCC 7002 [Sakamoto T, Inoue-Sakamoto K, Bryant DA. J Bacteriol (1999). "A Novel Nitrate/Nitrite Permease in the Marine Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002." 181(23):7363-7372], permeasa de nitrito/nitrato (NrtP), locus AAD45941.

A concentraciones elevadas, el nitrito es tóxico para la mayoría de las células. Para aliviar la toxicidad por nitrito, las células fotoautotróficas se modifican por ingeniería para sobre-expresar genes dentro del operón de tolerancia a

35 nitrito hallado en Nitrosomonas europaea ATCC 19718 [Beaumont HJE, Lens SI, Westerhoff HV, van Spanning RJM. "Novel nirK Cluster Genes in Nitrosomonas europaea Are Required for NirK-Dependent Tolerance to Nitrite." J Bacteriol (2005). 187(19): 6849-6851], multicobre oxidasa tipo 1 (NirK), locus NP_840998; citocromo c, clase IC (NcgA), locus NP_ 841001; citocromo c, clase I (NcgB), locus NP_841000; citocromo c, clase IC (NcgC), locus NP_840999.

Además o como alternativa, las células fotoautotróficas se modifican por ingeniería para asimilar el amoniaco. En este escenario, las células se modifican por ingeniería para sobre-expresar una amonio permeasa. Una amonio permeasa ejemplar hallada en Synechocystis sp. PCC 6803 [Montesinos ML, Muro-Pastor AM, Herrero A, Flores E. "Ammonium/Methilamonio Permeases of a Cyanobacterium. Identification and analysis of three nitrogen-regulated

45 amt genes in Synechocystis sp. PCC 6803." J Biol Chem (1998). 273(47):31463-31470] que se sobre-expresa es amonio/metilamonio permeasa de alta afinidad (Amt1), locus NP_442561; amonio/metilamonio permeasa (Amt2), locus NP_440272; amonio/metilamonio permeasa (Amt3), locus NP_442793.

Además o como alternativa, las células fotoautotróficas se modifican por ingeniería para asimilar urea. En este escenario, las células deben modificarse por ingeniería para sobre-expresar un transportador de urea para posibilitar la captación eficaz de urea en la célula. Se sobre-expresa un transportador de urea ejemplar hallado en Nostoc sp. PCC 7120 [Valladares A, Montesinos ML, Herrero A, Flores E. "An ABC-type, high-affinity urea permease identified in cyanobacteria." Molecular Microbiology (2002). 43(3): 703-715] que comprende el transportador tipo ABC de cinco genes para la captación de urea de alta afinidad, por ejemplo, urea permeasa de alta afinidad, tipo ABC, dominio

55 periplásmico (UrtA), locus CAB70948.1; urea permeasa de alta afinidad, tipo ABC, dominio de membrana (UrtB), locus CAB70949.1; urea permeasa de alta afinidad, tipo ABC, dominio de membrana (UrtC), locus CAB70950.1; urea permeasa de alta afinidad, tipo ABC, dominio de unión a ATP (UrtD), locus CAB70951.1 y urea permeasa de alta afinidad, tipo ABC, dominio de unión a ATP (UrtE), locus CAB70952.1.

Además, se sobre-expresa la urea amidohidrolasa (EC 3.5.1.5) ("ureasa") y sus proteínas accesorias asociadas, que catalizan la conversión de urea en amoniaco y dióxido de carbono. Se sobre-expresa una ureasa ejemplar hallada en Synechococcus sp. WH 7805 [Collier J, Brahamsha B, Palenik B. "The marine cyanobacterium Synechococcus sp. WH7805 requires urease to utilize urea as a nitrogen source: molecular-genetic and biochemical analysis of the enzyme" Microbiology (1999). 145(2): 447-459] que comprende los genes de ureasa ureABC: urea amidohidrolasa, 65 subunidad gamma (UreA), locus AAC61500; urea amidohidrolasa, subunidad beta (UreB), locus AAC61501; urea amidohidrolasa, subunidad alfa (UreC), locus AAC61502; y los genes ureDE-FG que codifican las proteínas

accesorias proteína accesoria de ureasa (UreD), locus AAC61499; proteína accesoria de ureasa (UreE), locus AAC61498; proteína accesoria de ureasa (UreF), locus AAC61497; y proteína accesoria de ureasa (UreG), locus AAC61496.

5 La vitamina B 12 es un cofactor vitamínico que facilita la canalización de reacciones basadas en radicales. Muchos organismos, incluyendo al menos la mitad de todas las microalgas estudiadas, tales como Synechococcus sp. PCC 7002, requieren fuentes externas de vitamina B12 para el crecimiento, lo que es prohibitivamente caro en bioprocesamiento industrial a gran escala [Croft MT, Warren MJ, Smith AG. "Algae Need Their Vitamins", Eukaryotic Cell (2006) 5(8): 1175-1183]. La necesidad de vitamina B12 puede obviarse por modificación por ingeniería de células fotoautotróficas para que expresen la vía de biosíntesis de la vitamina B12. Se sobre-expresa una vía de biosíntesis ejemplar hallada en Salmonella typhimurium (no de la invención), incluyendo, aunque sin limitación, los siguientes 20 genes: uroporfirina-lll C-metiltransferasa (CysG), EC 2.1.1.107, locus NP_462380; sirohidroclorocobalto-quelatasa (CbiK), EC 4.99.1.3, locus NP_460970; precorrina-2 C20-metiltransferasa (CbiL), EC 2.1.1.130, locus NP_460969; precorrina-3B metilasa (CbiH), EC 2.1.1.131, locus NP_460972; CbiG/precorrina

15 metiltransferasa bifuncional (CbiG), locus NP_460973; precorrina-4 C11-metiltransferasa (CbiF), EC 2.1.1.133, locus NP_460974; proteína de biosíntesis de cobalamina (CbiD), locus NP_460977; precorrina-6A reductasa NADPHdependiente (CbiJ), EC 1.3.1.54, locus NP_460971; precorrina-6B C5,15-metiltransferasa (CbiE), EC 2.1.1.132, locus NP_460976; precorrina-6B C12 descarboxilasa (CbiT), EC 2.1.1.132, locus NP_460975; precorrina-8Xmetilmutasa (CbiC), EC 5.4.1.2, locus NP_460978; ácido cobirínico A,C-diamida sintasa (CbiA), EC 6.3.1,-, locus NP_460980; ácido cob(l)irínico a,c-diamida adenosiltransferasa (BtuR), EC 2.5.1.17, locus NP_460677; ácido cobirínico sintasa (CbiP), EC 6.3.5.10, locus NP_460964; ácido cobírico descarboxilasa (CobD), EC 4.1.1.81, locus NP_459636; adenosilcobinamida-fosfato sintasa (CbiB), EC 6.3.1.10, locus NP_460979; alfa ribazol-5'-P fosfatasa (CobC), EC 3.1.3.73, locus NP_459635; cobalamina(5'-fosfato) sintasa (CobS), EC 2.7.8.26, locus NP_460962; cobinamida fosfato guanilil transferasa (CobU), EC 2.7.7.62, locus NP_460963; y nicotinato-nucleótido

25 dimetilbencimidazol-P foforribosil transferasa (CobT), EC 2.4.2.21, locus NP_460961).

Además, para permitir la captación de cobalto y su incorporación en la vitamina B12, se sobre-expresan los genes que codifican el transportador de cobalto. Se sobre-expresa la proteína transportadora de cobalto ejemplar hallada en Salmonella typhimurium sistema de transporte de Co2+ tipo ABC, componente permeasa (CbiM), locus NP_460968; sistema de transporte de cobalto tipo ABC, componente periplásmico (CbiN), locus NP_460967; y sistema de transporte de cobalto tipo ABC, componente permeasa (CbiQ), locus NP_461989.

En la invención, los organismos fotoautotróficos se modifican por ingeniería para sobre-expresar la enzima independiente de vitamina B12 para obviar la necesidad de este cofactor completamente. En la mayoría de los

35 organismos fotoautotróficos, solamente la metionina sintasa (EC 2.1.1.13) y las ribonucleótido reductasas de clase II requieren vitamina B12. Por lo tanto se sobre-expresa una metionina sintasa ejemplar independiente de vitamina B12 (EC 2.1.1.14) de Thermotoga maritima: 5-metiltetrahidropteroiltriglutamato-homocisteína metiltransferasa (MetE), locus NP_229090 (no de la invención).

Además se contempla que la independencia de nutrientes (por ejemplo, vitamina B12) de células hospedadoras puede realizarse por expresión de diversas proteínas que codifican 5-metiltetrahidropteroiltriglutamato-homocisteína metiltransferasa (metE) que comprenden secuencias que son al menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idénticas a metE.

45 Construcción de cepas

El vector de expresión, pJB5, contiene dos regiones de ADN de 500 pb homólogas a secuencias en el plásmido natural pAQ1 de Synechococcus sp. PCC 7002. Entre las dos regiones de homología hay un promotor y un sitio de unión al ribosoma, sitios para la inserción de la secuencia de ADN, y un casete de resistencia, aadA1, que confiere resistencia a espectinomicina. Los genes metE de E. coli (NP_ 418273) y Thermosynechococcus elongatus BP-1 (NP_681881) se codificaron en pJB6 y pJB7 respectivamente. Todos los plásmidos se digirieron con Ndel (New England Biolabs) y EcoRI (New England Biolabs), y el fragmento de ~1 kb de pJB6 y pJB7, y el fragmento grande de pJB5, se aislaron en gel y se purificaron usando técnicas convencionales (Qiagen). Los fragmentos de pJB6 y pJB7 se ligaron y transformaron en pJB5 usando técnicas convencionales para formar pJB5-6 y pJB5-7.

55 Synechococcus sp. PCC 7002 se transformó con pJB5-6 y pJB5-7 del siguiente modo. Se digirieron pJB5-6 y pJB57 y se inactivaron con Sbfl (New England Biolabs) durante 1 hora y se inactivaron por calor. El ADN se incubó con células frescas a OD730 de 1 durante 4 horas en una incubadora en la oscuridad a 37ºC en A+. Las células después se dejaron diluir en 20 ml de medio A+ fresco con luz moderada y se burbujearon con aire con CO2 al 1% durante 24 horas. Las células después se diluyeron 1 en 20 en medio A+ fresco que contenía 10 ug/ml de espectinomicina y se dejaron crecer durante 5 días en las mismas condiciones. Las células se diluyeron de nuevo 1 en 20 en 25 ml de medio A+ que carecía de vitamina B12, y esto se repitió una segunda vez después de que las células crecieran a alta densidad. Después de la segunda extensión, las células se sembraron en placas A+ que carecían de vitamina B12.

65 Las Fig. 3A-D muestran Synechococcus sp. PCC 7002 de tipo silvestre y células que expresan de forma transgénica MetE de E. coli y MetE de Thermosynechococcus elongatus BP-1 diluidas y cultivadas durante una noche en medio A+ que carecía de vitamina B12. Las células se diluyeron, después se sembraron y se dejaron crecer 1 semana a 37ºC en una incubadora iluminada en placas tanto con suficiente vitamina B12 como deficientes en la misma. La Fig. 3A ilustra Synechococcus de tipo silvestre en placa con suficiente B 12 mientras que la Fig. 3B muestra la placa B12 deficiente. La Fig. 3C representa una cepa transgénica de Synechococcus con MetE de E. coli en la placa vitamina B 12 deficiente y la Fig. 3D muestra MetE de Thermosynechococcus elongatus en la placa vitamina B12 deficiente. Los resultados muestran la capacidad de la metionina sintasa expresada de forma transgénica de rescatar los requisitos de vitamina B12 de las cianobacterias.

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una célula cianobacteriana modificada por ingeniería que comprende un ácido nucleico modificado por ingeniería

   que codifica una proteína 5-metiltetrahidropteroiltriglutamato-homocisteína metiltransferasa independiente de 5 vitamina B12 que comprende una secuencia que es al menos un 95% idéntica a la secuencia mostrada en la Figura
2. 4.
3. 2. La célula cianobacteriana modificada por ingeniería de la reivindicación 1, donde dicha proteína 5

   metiltetrahidropteroiltriglutamato-homocisteína metiltransferasa independiente de vitamina B12 tiene una secuencia 10 de aminoácidos idéntica a la mostrada en la Figura 4.
4. 3. La célula cianobacteriana modificada por ingeniería de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde dicha célula cianobacteriana es una especie de Synechococcus.

   15 4. La célula cianobacteriana modificada por ingeniería de la reivindicación 3, donde dicha especie de Synechococcus es Synechococcus sp. PCC 7002.
5. 5. Uso de una proteína 5-metiltetrahidropteroiltriglutamato-homocisteína metiltransferasa independiente de vitamina

   B12 que comprende una secuencia que es al menos un 95% idéntica a la secuencia mostrada en la Figura 4 para 20 producir una célula cianobacteriana independiente de vitamina B12.
6. 6. El uso de la reivindicación 5, done dicha proteína 5-metiltetrahidropteroiltriglutamato-homocisteína metiltransferasa independiente de vitamina B12 tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia mostrada en la Figura 4.

7. 7.

   El uso de la reivindicación 5 ó 6, donde dicha célula cianobacteriana es una especie de Synechococcus.

8. 8.

   El uso de la reivindicación 7, donde dicha especie de Synechococcus es Synechococcus sp. PCC 7002.

   30 9. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, donde una capacidad de sobrevivir y replicarse en medio que carece de vitamina B12 como suplemento del medio confirma la aplicación satisfactoria de independencia de vitamina B12.
9. 10. Un método para producir un producto de interés basado en carbono, que comprende cultivar una célula

   35 cianobacteriana modificada por ingeniería de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en presencia de CO2 y luz en condiciones adecuadas para producir el producto de interés basado en carbono.