ES2397672T3 - Método de diagnóstico de cánceres de pulmón utilizando perfiles de expresión genética en células mononucleares de sangre periférica - Google Patents

Abstract

Una composición para evaluar la existencia de un cáncer de pulmón en un sujeto mamífero, consistiendo dichacomposición en: tres o más polinucleótidos u oligonucleóticos, en la que cada polinucleótido u oligonucleótidohibridiza un gen, fragmento de gen o transcripción de gen o producto de expresión diferente a partir de célulasmononucleares de sangre periférica (PBMC) o de sangre total del mamífero, y en la que cada uno de dichos gen, fragmento de gen, transcripción de gen o producto de expresión se elige a partirde los genes 1-29 de la Tabla V.

Description

Método de diagnóstico de cánceres de pulmón utilizando perfiles de expresión genética en células mononucleares de sangre periférica

Antecedentes de la invención

El cáncer de pulmón es la causa de mortalidad por cáncer más común en todo el mundo. En los Estados Unidos, el cáncer de pulmón es el segundo cáncer más común tanto en hombres como en mujeres, y asciende a más de

174.000 nuevos casos cada año y más de 162.000 muertes por cáncer. De hecho, el cáncer de pulmón ocasiona más muertes al año que los de pecho, próstata y colo-rectales juntos2.

La alta mortalidad (80-85% en cinco años), que no ha mostrado ninguna, o muy poca, mejora en los últimos 30 años, pone de relieve el hecho de que se necesitan herramientas nuevas y eficaces que faciliten un pronto diagnóstico con anterioridad a la metástasis en nodos locales o por más allá del pulmón.

Las poblaciones de alto riesgo incluyen los fumadores, los antiguos fumadores, y los individuos con marcadores asociados a predisposiciones genéticas91-93. Puesto que la extracción quirúrgica de tumores en fase temprana sigue siendo el tratamiento más eficaz para el cáncer de pulmón, se ha desarrollado un gran interés en proteger los pacientes de alto riesgo con CT espiral de baja dosis (LDCT)12,14,11,94. Esta estrategia identifica nódulos pulmonares no calcificados en aproximadamente un 30-70% de individuos de alto riesgo, pero solamente una pequeña proporción de nódulos detectados son finalmente diagnosticados como cánceres pulmonares (0,4 a 2,7%)16,95,96 . Normalmente, la única manera de distinguir sujetos con nódulos de pulmón de etiología benigna de los sujetos con nódulos malignos es una biopsia invasiva, cirugía u observación prolongada con exploración repetida. Incluso usando los mejores algoritmos clínicos, el 20-55% de los pacientes seleccionados para someterse a biopsia quirúrgica de pulmón para nódulos de pulmón indeterminados, se encuentra que tienen una enfermedad benigna15 y aquellos que no se someten a biopsia o resección inmediata requieren estudios secuenciales de obtención de imágenes. El uso de CT serie de este grupo de pacientes corre el riesgo de retrasar la potencial terapia curable, junto con los costes de repetición de exploraciones, las dosis de radiación nada despreciables, y la ansiedad del paciente.

Idealmente, una prueba diagnóstica podría ser fácilmente accesible, barata, demostrar una alta sensibilidad y especificidad, y dar como resultado consecuencias mejoradas del paciente (médica y financieramente). Se están realizando esfuerzos por desarrollar diagnósticos no invasivos usando saliva, sangre o suero y analizando sustancias de las células tumorales, ADN7,8 de tumor metilado, ARN10 mensajero expresado de polimorfismo de nucleótido simple (SNPs)9 o proteínas 11. Esta amplia batería de pruebas moleculares con potencial utilidad para un pronto diagnóstico del cáncer de pulmón, ha sido ya discutida en la literatura. Aunque cada una de estas alternativas tiene sus propios méritos, ninguna de ellas ha superado aún la fase exploratoria en cuanto al esfuerzo por detectar pacientes con cáncer de pulmón en fase temprana, incluso en grupos de riesgo, o pacientes que tienen un diagnóstico preliminar basado en factores radiológicos u otros factores12 clínicos. Una simple prueba sanguínea, un evento rutinario asociado a visitas regulares a ambulatorios, sería una prueba diagnóstica ideal.

Un método establecido para conseguir el objetivo de diagnóstico genético ha consistido en el uso de signaturas de micro-matriz procedentes de tejido tumoral20. Esta alternativa ha sido probada y validada por numerosos investigadores89. Un número creciente de estudios ha mostrado que se pueden usar perfiles de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) para diagnosticar y clasificar enfermedades sistémicas, incluyendo el cáncer, y para monitorizar la respuesta terapéutica21. La validez de usar perfiles de PBMC en pacientes con cáncer ha sido informada previamente en el uso de micro-matrices para comparar PBMC de pacientes con carcinoma de célula renal en fase tardía en comparación con controles normales20,42. Una publicación 43 más reciente describe el desarrollo de un clasificador de 37 genes para la detección temprana de un cáncer de pecho a partir de muestras de sangre periférica con un 82% de precisión. Otro estudio identificó perfiles de expresión genética en la PBMC de pacientes de cáncer colo-rectal que podían estar co-relacionados con respuesta a terapia44. Algunos de los presentes inventores sugirieron22 con anterioridad que las quimiocinas y las citocinas liberadas por células malignas podrían imponer una signatura específica de tumor sobre células inmunes de pacientes con cánceres no hematopoyéticos. Se han generado ahora perfiles de expresión genética a partir de PBMC que identifican signaturas asociadas a una diversidad de cánceres, incluyendo el melanoma metastático23, de pecho24, renal25,26 y el cáncer de vejiga27. La mayor parte de estos estudios fueron enfocados sobre cánceres en fase posterior o sobre respuesta a terapia y se utilizaron grupos de control sanos más jóvenes a efectos de comparación.

Mientras que el efecto de la enfermedad pulmonar de obstrucción crónica (COPD) sobre la expresión genética de PBMC permanece relativamente sin estudiar hasta la fecha, existen algunos informes limitados acerca del efecto del humo del cigarrillo33. La exposición de linfocitos de sangre periférica (PBL) ex vivo al humo del cigarrillo indujo muchos cambios en la expresión genética34. Los cambios pudieron ser detectados en el transcriptosoma de neutrófilos de la sangre en pacientes de COPD frente a los normales35. Un estudio distinguió “entre 85 individuos expuestos y no expuestos al humo del tabaco en base a expresión de mARN en leucocitos periféricos”36. No se

encuentra aparentemente ningún dato disponible en cuanto a cambios similares en la sangre que pueda estar presente en antiguos fumadores. Se ha comparado37 la expresión genética en los epitelios de las vías respiratorias de fumadores, ex-fumadores y no fumadores. Aunque muchas manifestaciones clínicas de fumar se volvieron rápidamente normales después de dejar de fumar, existió un subconjunto de genes cuya expresión permaneció alterada. La hipermetilación38 genética diferencial y la producción 33 de citocina macrófaga desregulada, han sido vinculadas al humo del cigarrillo. Existen informes de signatura o perfil de expresión genética útil en el diagnóstico del cáncer de pulmón111.

A pesar de los recientes avances, el reto del tratamiento del cáncer sigue siendo unos regímenes de tratamiento específico objetivo de tipos de tumor patológicamente distintos, y finalmente, personalizar el tratamiento del tumor con el fin de maximizar el resultado. Por ello, existe una necesidad de pruebas que proporcionen simultáneamente información predictiva acerca de respuestas de los pacientes a la diversidad de opciones de tratamiento. En particular, una vez que se diagnostica un cáncer, existe una gran necesidad de métodos que permitan al médico predecir el curso esperado de la enfermedad, incluyendo la probabilidad de recurrencia del cáncer, la supervivencia a largo plazo del paciente, y similares, y seleccionar la opción de tratamiento adecuadamente. También sigue existiendo una necesidad en el estado de la técnica de una prueba menos invasiva que pudiera determinar de manera más precisa el riesgo de enfermedad maligna en pacientes con nódulos pulmonares y que pudiera reducir la cirugía, las biopsias, las exploraciones PET, y/o las exploraciones CT repetidas, que sean innecesarias.

Sumario de la invención

Según un aspecto, se proporciona una composición para evaluar la existencia de un cáncer de pulmón en un mamífero. Esta composición consiste en tres o más polinucleótidos u oligonucleótidos, donde cada polinucleótido u oligonucleótido se hibridiza en un gen, fragmento de gen, transcripción o producto de expresión de gen diferente a partir de células mononucleares de sangre periférica de un mamífero (PMBC). El gen, fragmento de gen, transcripción o producto de expresión de gen se selecciona entre los primeros 29 genes de la Tabla V (mencionados en lo que sigue como “clasificador de 29 genes”, o en un subconjunto de los mismos. Esta realización es particularmente útil para el diagnóstico de un cáncer de pulmón, tal como un NSCLC, y para distinguir entre sujetos con cáncer y sujetos con una enfermedad de pulmón que no sea cáncer.

Según otro aspecto más, la invención se refiere al uso de dicha composición para el diagnóstico in vitro de la existencia de un cáncer de pulmón en un sujeto mamífero, que comprende identificar cambios en la expresión de tres o más genes procedentes de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o de la sangre total de dicho sujeto. Los niveles de expresión genética del sujeto de los genes o de la signatura genética seleccionados, se comparan con los niveles de los mismos genes o con el perfil según una referencia o control. Los cambios de expresión de estos genes entre el sujeto y el control están correlacionados con un diagnóstico de cáncer de pulmón.

Otros aspectos y ventajas de estas composiciones y métodos, van a ser descritos con mayor detalle en la descripción que sigue de las realizaciones preferidas de los mismos.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un gráfico de barras que muestra las puntuaciones para 44 muestras (barras oscuras) de pacientes de adenocarcinoma de fase temprana (AC T1T2) y 52 controles no sanos (NHC, indicados mediante barras más claras) que utilizan 15 genes seleccionados mediante SVM-RFE. Véanse los 15 genes de la Tabla IV, columna etiquetada como “AC/NHC”. Las puntuaciones de SVM han sido calculadas como valor promedio a través de todas las puntuaciones de SVM asignadas a una muestra cuando ésta se encuentra en un conjunto de prueba durante validación cruzada. Cada columna representa una muestra. Las barras de error representan la desviación estándar de las clasificaciones sobre los 100 re-muestreos. La curva de ROC para el rendimiento del clasificador de 15 genes produjo una AUC = área bajo curva de 0,92 (curva no representada).

La Figura 2 es un gráfico de barras que muestra la Clasificación SVM de AC + LSCC combinados (NSLC; barras oscuras) y NHC (barras más claras) utilizando los 15 genes seleccionados por medio de SVM-RFE (Tabla IV, columna etiquetada como ALL/NHC). Se han mostrado las puntuaciones discriminantes para las 77 muestras de NSCL y las 52 muestras de NHC. Las barras más claras con puntuaciones positivas son NHC no clasificados, y las barras más oscuras con puntuaciones negativas son muestras de estados no clasificados. La curva ROC para el clasificador de 15 genes produjo una AUC de 0,897 (curva no representada).

La Figura 3 es un gráfico de barras que muestra una comparación por parejas de puntuaciones discriminantes para muestras de pre-cirugía (barras oscuras) y muestras de post-cirugía (muestras claras). Los 15 genes seleccionados por SMV-RFE (véase la Tabla IV, columna etiquetada como “PRE/POST”) fueron usados para asignar puntuaciones discriminantes a las muestras de post-cirugía. Estas puntuaciones han sido mostradas con la puntuación para el mismo paciente dispuesta por parejas de pre-post. Un signo negativo indica que esta muestra es más similar a las muestras de NHC usadas para seleccionar el clasificador de 15 genes.

La Figura 4 es un gráfico de barras que muestra el análisis de SMV-RFE de muestras de pre-cirugía y de postcirugía. Las 16 muestras de pre-cirugía (barras oscuras) fueron indicadas como de clase positiva y las 16 muestras

de post-cirugía (barras claras) como de clase negativa. El SVM-RFE fue llevado a cabo empezando con los 1.000 genes superiores identificados mediante prueba-t y reducidos después a 1. La conformación clasificadora sobre seis genes (los 6 genes superiores de la Tabla IV, columna etiquetada como PRE/POST, en particular los TSC22D3, CECR4, DNCL1, RPS3, DDIT4, GZMB) dio una precisión global de un 93% y éstos fueron utilizados para generar puntuaciones SVM. La curva ROC para el clasificador de 6 genes produjo una AUC de 0,96 (curva no representada). Se proporcionó una puntuación discriminante a cada muestra (el positivo es indicativo de cáncer de pulmón; el negativo es indicativo de que no existe ningún cáncer). En todas las muestras menos en dos, la puntuación post es más baja que la muestra de pre-cirugía. Estos datos soportan la detección de una signatura de expresión genética relacionada con un tumor que disminuye después de la cirugía. La extensión de esos cambios refleja la posibilidad de recurrencia.

La Figuera 5 es un gráfico que muestra la aplicación del clasificador NSCLC de 29 genes a muestras de PBMC tomadas por resección pre- y post-quirúrgica en 18 pacientes de la Universidad de Pennsylvania.

La Figura 6 es un gráfico que muestra la clasificación de muestras de pre- y post-cirugía con el clasificador de 4 genes (CYUP2R1, MYO5B, DGUOK y DNCL1) ejercitado mediante SVM-RFE con validación cruzada por 10 veces.

Descripción detallada de la invención

Los métodos y composiciones que se describen en la presente memoria aplican tecnología de expresión genética a la selección de sangre para la detección, el diagnóstico y la monitorización de una respuesta al tratamiento del cáncer de pulmón. Las composiciones y los métodos que se describen en la presente memoria permiten el diagnóstico de una enfermedad o de su fase de desarrollo en general, y de cánceres de pulmón en particular, determinando un perfil de ARN característico de los genes de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o de los linfocitos de sangre periférica (PBL) de un mamífero, con preferencia un sujeto humano. El perfil se establece por comparación de los perfiles de numerosos sujetos de la misma clase (por ejemplo, pacientes con un cierto tipo y fase de desarrollo de cáncer de pulmón, o una mezcla de tipos y fases de desarrollo) con numerosos sujetos de una clase a partir de la cual estos individuos deben ser distinguidos por orden para proporcionar un diagnóstico útil.

Estos métodos de selección de cáncer de pulmón emplean composiciones adecuadas para llevar a cabo una prueba de sangre simple y de bajo coste y no invasiva utilizando un perfilado de expresión genética que podría alertar al paciente y al médico para realizar otros estudios adicionales, tal como una radiografía de pecho o una exploración de CT, de la misma manera que se utiliza el antígeno de próstata específico para ayudar a diagnosticar y seguir los progresos del cáncer de próstata. Los perfiles de expresión genética descritos en la presente memoria proporcionan las bases de una diversidad de clasificaciones relacionadas con este problema de diagnóstico. La aplicación de estos perfiles proporciona diagnósticos solapados y confirmatorios del tipo de la enfermedad de pulmón, empezando con la prueba inicial para enfermedad maligna frente a no maligna.

I. Definiciones

“Paciente” o “sujeto”, según se utilizan en la presente memoria, significan un animal mamífero, incluyendo a los humanos, un animal veterinario o de granja, un animal doméstico o una mascota, y los animales usados habitualmente para investigación clínica. En una realización, el sujeto de estos métodos y composiciones es un humano.

“Control” o “sujeto de control”, según se utilizan en la presente memoria, se refieren a la fuente de los perfiles de expresión genética de referencia, así como también al panel particular de sujetos de control identificados en los ejemplos que siguen. Por ejemplo, el sujeto de control de una realización puede consistir en controles con cáncer de pulmón, tal como un sujeto que sea un fumador actual o antiguo con enfermedad maligna, un sujeto con un tumor de pulmón sólido con anterioridad a la cirugía para la extracción del mismo; un sujeto con un tumor de pulmón sólido después de la extracción quirúrgica de dicho tumor; un sujeto con un tumor de pulmón sólido con anterioridad a la terapia respecto al mismo; y un sujeto con un tumor de pulmón sólido durante, o después de, la terapia para el mismo. En otras realizaciones, los controles a los efectos de las composiciones y métodos que se describen en la presente memoria, incluyen cualquiera de las clases siguientes de sujeto humano de referencia sin ningún cáncer de pulmón. Tales controles no sanos (NHC) incluyen las clases de fumador con enfermedad no maligna, antiguo fumador con enfermedad no maligna (incluyendo los pacientes con nódulos de pulmón), un no fumador que tiene una enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), y un antiguo fumador con COPD. En otras realizaciones más, el sujeto de control es un no fumador sano sin ninguna enfermedad o un fumador sano sin ninguna enfermedad. Todavía en otras realizaciones más, el control o referencia es el mismo sujeto en el que se averiguaron los genes o el perfil genético con anterioridad a la cirugía, o en otro momento anterior para determinar la evaluación de la eficacia quirúrgica o del tratamiento, o la prognosis o el progreso de la enfermedad. La selección de la clase particular de controles depende del uso que el cirujano disponga para los métodos de diagnóstico/monitorización y las composiciones.

En los ejemplos que siguen, el grupo de control seleccionado, con controles no sanos, se elige específicamente de modo que se empareje tan cercanamente como sea posible con los pacientes con enfermedad maligna. El

emparejamiento incluye tanto enfermedades relacionadas con fumar como las relacionadas con el estado del fumador, tal como COPD. Todos los sujetos de ambas clases fueron fumadores, ya sea actuales o ya sea pasados cuando presentaron síntomas de enfermedad. La mayor parte de los genes informativos identificados en lo que sigue pueden distinguir fumadores con enfermedad maligna de fumadores con enfermedad no maligna. Estos genes informativos no incluyen los encontrados previamente para distinguir los fumadores de los no fumadores, por ejemplo CYP1B1, HML2, CCR2, NRG136.

“Muestra”, según se utiliza en la presente memoria, significa cualquier fluido o tejido biológico que contenga células inmunes y/o células de cáncer. La muestra más adecuada para su uso en la presente invención incluye las células de sangre periférica, y más específicamente las células mononucleares de sangre periférica. Otras muestras biológicas útiles incluyen, sin limitación, la sangre en su conjunto, saliva, orina, fluido sinovial, médula ósea, fluido cerebro-espinal, mucosidad vaginal, mucosidad cervical, secreciones nasales, esputos, semen, fluido amniótico, fluido de lavado bronco-alveolar, y otros exudados celulares procedentes de un paciente que tenga cáncer. Tales ejemplos pueden ser además diluidos con solución salina, solución tampón o con un diluyente fisiológicamente aceptable. Alternativamente, tales muestras son concentradas con medios convencionales.

“Células inmunes”, según se utiliza en la presente memoria, significa linfocitos-B, linfocitos-T, células NK, macrófagos, mastocitos, monocitos y células dendríticas.

Según se utiliza en la presente memoria, el término “cáncer” se refiere a, o describe, la condición fisiológica en mamíferos que está típicamente caracterizada por un crecimiento celular no regulado. Más específicamente, el término “cáncer” significa cualquier cáncer de pulmón. En una realización, el cáncer de pulmón es un cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). En una realización específica, el cáncer de pulmón es un adenocarcinoma de pulmón (AC o LAC). En otra realización más específica, el cáncer de pulmón es carcinoma de células escamosas de pulmón (SCC o LSCC). En otra realización, el cáncer de pulmón es un NSCLC de fase I o fase II. En otra realización más, el cáncer de pulmón es una mezcla de fases temprana y tardía y de tipos de NSCLC.

El término ”tumor”, según se utiliza en la presente memoria, se refiere al crecimiento y la proliferación de células neoplásticas, tanto malignas como benignas, y a todas las células y tejidos pre-cancerosos y cancerosos.

Mediante “diagnosis” o “evaluación” se hace referencia a una diagnosis de cáncer de pulmón, una diagnosis de una fase de desarrollo de cáncer de pulmón, una diagnosis de un tipo o clasificación de un cáncer de pulmón, una diagnosis o detección de una recurrencia de un cáncer de pulmón, una diagnosis o detección de una regresión de un cáncer de pulmón, una prognosis de un cáncer de pulmón, o una evaluación de la respuesta de un cáncer de pulmón a una terapia quirúrgica o no quirúrgica.

Mediante “cambio de expresión” se indica una regulación positiva de uno o más genes seleccionados en comparación con la referencia o control; una regulación negativa de uno o más genes seleccionados en comparación con la referencia o control; o una combinación de ciertos genes de regulación positiva y de regulación negativa.

Mediante “reactivo terapéutico” se indica cualquier tipo de tratamiento empleado en el tratamiento de cánceres con o sin dichos tumores, incluyendo, aunque sin limitación, los productos farmacéuticos quimioterapéuticos, los modificadores de respuesta biológica, la radiación, dieta, terapia vitamínica, terapias hormonales, terapia genética, resección quirúrgica, etc.

Mediante “genes no tumorales”, según se utiliza en la presente memoria, se indican genes que están expresados normalmente en otras células, con preferencia células inmunes, de un mamífero sano, y que no son específicamente productos de células tumorales.

Mediante “genes informativos”, según se utiliza en la presente memoria, se indican aquellos genes cuya expresión cambia (ya sea de una manera con regulación positiva o ya sea de una manera con regulación negativa), característicamente en presencia de un cáncer de pulmón. Un número estadísticamente significativo de tales genes informativos forma de ese modo perfiles de expresión genética adecuados para su uso en los métodos y composiciones.

El término “número de genes estadísticamente significativo”, en el contexto de la presente invención, difiere dependiendo del grado de cambio observado en la expresión genética. El grado de cambio en la expresión genética varía con el tipo de cáncer y con el tamaño o la amplitud del cáncer o del tumor sólido. El grado de cambio varía también con la respuesta inmune del individuo y está sujeto a variación con cada individuo. Por ejemplo, en una realización de la presente invención, un cambio grande, por ejemplo, un incremento o una reducción de 2-3 veces un pequeño número de genes, por ejemplo de 3 a 8 genes característicos, es estadísticamente significativo. Esto es particularmente cierto para cánceres sin tumores sólidos. En otra realización, un cambio relativo más pequeño de alrededor de 10, 20, 24, 29 ó 30 o más genes, es estadísticamente significativo. Esto es particularmente cierto para cánceres con tumores sólidos. También alternativamente, si un gen simple se perfila como expresado o regulado positivamente de manera significativa en células que normalmente no expresan el gen, tal regulación positiva de un

gen simple puede ser por sí solo estadísticamente significativo. A la inversa, si un gen simple se perfila como regulado negativamente o no expresado de manera significativa en células que normalmente expresan el gen, tal regulación negativa de un gen simple puede ser por sí solo estadísticamente significativa. Como ejemplo, un gen simple, que se expresa en torno al mismo en todos los miembros de una población de pacientes, es regulado de forma negativa 4 veces solamente en un 1% de los individuos sin cáncer. Para tales genes regulados independientemente en un individuo, la totalidad de las 4 veces regulado de forma descendente, podría ocurrir con una probabilidad de solamente una vez en 100 millones. Por lo tanto, estos 4 genes son un número estadísticamente significativo de genes para ese cáncer. Alternativamente, si la varianza normal es más alta, por ejemplo una persona sana entre 10 tiene el gen regulado negativamente 4 veces, entonces se requiere un panel más grande para detectar la varianza para un cáncer particular.

De ese modo, los métodos y las composiciones que se describen en la presente memoria contemplan el examen del perfil de expresión de un “número de genes estadísticamente significativo” comprendido en la gama de 1 a alrededor de 100 genes en un perfil simple. En una realización, el perfil de gen se forma mediante un número estadísticamente significativo de 1 o más genes. En otra realización, el perfil de gen se forma mediante un número estadísticamente significativo de 3 o más genes. En otra realización más, el perfil de gen se forma mediante 4 o más genes. En otra realización más, el perfil de gen se forma mediante al menos 5 a 15 o más genes. En otra realización más, el perfil de gen se forma mediante 24 ó 29 o más genes. En otras realizaciones adicionales, los perfiles de gen examinados como parte de estos métodos, particularmente en casos en los que los cánceres están caracterizados por tumores sólidos, contienen, como números de genes estadísticamente significativos, desde 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ó 90 o más genes en un panel, y números cualesquiera entre ellos.

Las Tablas I a VII que siguen se refieren a colecciones de genes conocidos. Las Tablas I, II y III incluyen los 100 genes superiores de cada clasificación, identificada por los inventores como capaz de formar un perfil de expresión genética para tres clasificaciones de enfermedad distintas. La Tabla I identifica los 100 genes superiores que pueden ser usados en un perfil de expresión genética para identificar la presencia de un cáncer de pulmón, por ejemplo, cualquier NSCLC. La Tabla II identifica los 100 genes superiores que pueden ser usados en un perfil de expresión genética para distinguir la ocurrencia de un cáncer de pulmón, y en una realización son útiles para distinguir AC de cualquier otro NSCLC. La Tabla III identifica los 100 genes superiores que pueden ser usados en un perfil de expresión genética para identificar los cambios consecuentes con una mejora post-quirúrgica de, y/o el mantenimiento de una mejora post-quirúrgica de, un cáncer de pulmón, tal como un NSCLC. Se entiende que esta última colección de genes es útil para una mejora del rastreo durante o después de un tratamiento terapéutico de un cáncer de pulmón, tal como NSCLC (es decir, tomado a partir de la Tabla I), para identificar un AC (es decir, tomado a partir de la Tabla II), y para identificar el estado post-quirúrgico de un sujeto (es decir, tomado a partir de la Tabla III).

La Tabla V identifica 136 genes adicionales útiles para la formación de perfiles genéticos para su uso en el diagnóstico de pacientes con un cáncer de pulmón, tal como un NSCLC, a partir de un control, en particular controles no sanos. Los 29 genes de clasificación más alta en esta tabla, se ha referenciado como “el clasificador de 29 genes” en los Ejemplos 14-18 que siguen. La Tabla IV identifica otro conjunto de 50 genes útiles en un perfil de expresión de gen para identificar los cambios consecuentes con la mejora post-quirúrgica de, y/o con el mantenimiento de la mejora post-quirúrgica de, un cáncer de pulmón. De manera similar, estos genes son útiles como signatura genética para monitorizar la progresión o la regresión del cáncer en un paciente tratado de forma no quirúrgica respecto a un cáncer de pulmón. La Tabla VII identifica un conjunto de 24 genes útiles para la discriminación entre un sujeto que tiene un cáncer de pulmón, por ejemplo un NSCLC, y sujetos que tienen nódulos de pulmón benignos (no malignos).

Los genes identificados en las Tablas I a VII están disponibles públicamente. Un experto en la materia puede reproducir fácilmente los métodos y las composiciones que se describen en la presente memoria con el uso de las secuencias de genes, todas ellas disponibles públicamente a partir de fuentes convencionales, tal como GenBank.

El término “micro-matriz” se refiere a una disposición ordenada de elementos de matriz hibridizables, con preferencia sondas de polinucleótido o de oligonucleótido, sobre un substrato.

El término “polinucleótido” cuando se utiliza de una forma en singular o en plural, se refiere en general a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser un ARN o un ADN no modificado o un ARN o un ADN modificado. Así, por ejemplo, los polinucleótidos según se definen en la presente memoria incluyen, aunque sin limitación, ADN de simple y doble cadena, ADN que incluye regiones de simple y doble cadena, ARN de simple y doble cadena, y ARN que incluye regiones de simpe y doble cadena, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser de cadena simple o, más típicamente, de doble cadena o que incluyen regiones de simple y de doble cadena. Adicionalmente, el término “polinucleótido” según se utiliza en la presente memoria, se refiere a regiones de triple cadena que comprenden ARN o ADN o ambos ARN y ADN. Las cadenas de tales regiones pueden proceder de la misma molécula o de moléculas diferentes. Las regiones pueden incluir todas de entre una o más moléculas, pero típicamente incluyen solamente una región de algunas de las moléculas. Una de las moléculas de una región de triple hélice es con frecuencia un oligonucleótido. El término “polinucleótido” incluye específicamente cADNs. El término incluye ADNs (incluyendo los cADNs) y ARNs que contienen una o más bases

modificadas. Así, los ADNs o ARNs con esqueletos modificados por motivos de estabilidad o por otras razones, son “polinucleótidos” tal y como se entiende dicho término en la presente memoria. Además, los ADNs o los ARNs que comprenden bases inusuales, tal como la inosina, o bases modificadas, tal como las bases tritiadas, están incluidas dentro del término “polinucleótidos” según se define en la presente memoria. En general, el término “polinucleótido” abarca todas las formas modificadas química, enzimática y/o metabólicamente de polinucleótidos sin modificar, así como también las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células, incluyendo las células simples y las complejas.

El término oligonucleótido se refiere a un polinucleótido relativamente corto, incluyendo, aunque sin limitación, los desoxirribonucleótidos de cadena simple, los ribonucleótidos de cadena simple o doble, los híbridos de ARN:ADN y los ADNs de doble cadena. Los oligonucleótidos, tal como los oligonucleótidos de sonda de ADN de cadena simple, son sintetizados con frecuencia por medio de métodos químicos, por ejemplo utilizando sintetizadores de oligonucleótido automatizados que se encuentran comercialmente disponibles. Sin embargo, los oligonucleótidos pueden ser realizados mediante una diversidad de otros métodos, incluyendo técnicas mediadas por ADN recombinantes in vitro y mediante expresión de ADNs en células y organismos.

Los términos “gen expresado diferencialmente”, “expresión de gen diferencial” y sus sinónimos, que son utilizados intercambiablemente, se refieren a un gen cuya expresión está activada a un nivel más alto o más bajo en un sujeto que adolece de una enfermedad, específicamente cáncer, tal como cáncer de pulmón, en relación con su expresión en un sujeto de control. Los términos incluyen también genes cuya expresión es activada a un nivel más alto o más bajo en diferentes fases de desarrollo de la misma enfermedad. También se entiende que un gen expresado diferencialmente puede ser o bien activado o bien inhibido a nivel del ácido nucleico o a nivel de una proteína, o puede estar sujeto a partición alternativa para dar como resultado un producto polipéptido diferente. Tales diferencias pueden ser puestas en evidencia mediante un cambio en los niveles de mARN, en la expresión superficial, en la secreción o en otra partición de un polipéptido, por ejemplo. La expresión genética diferencial puede incluir una comparación de expresión entre dos o más genes o entre sus productos genéticos, o una comparación de las relaciones de la expresión entre dos o más genes o entre sus productos genéticos, o incluso una comparación de dos productos del mismo gen procesados de manera diferente, que difieran entre sujetos normales, controles no sanos y sujetos que sufran una enfermedad, específicamente cáncer, o entre varias fases de desarrollo de la misma enfermedad. La expresión diferencial incluye diferencias tanto cuantitativas como cualitativas en cuanto al patrón de expresión temporal o celular en un gen o en sus productos de expresión entre, por ejemplo, células normales y enfermas, o entre células que han sido sometidas a diferentes eventos de enfermedad o de etapas de desarrollo de enfermedad. A los efectos de esta invención, se considera que la “expresión genética diferencial” está presente cuando existe una diferencia estadísticamente significativa (p < 0,05) en expresión de gen entre el sujeto y las muestras de control.

El término “sobre-expresión” con relación a una transcripción de ARN, se utiliza para referirse al nivel de transcripción determinado por normalización respecto a los niveles de mARNs de referencia, que podría estar en todas las transcripciones medidas en la muestra o en un conjunto de referencia particular de mARNs.

La frase “amplificación genética” se refiere a un proceso mediante el que se forman múltiples copias de un gen o de un fragmento de gen en una célula o línea celular particular. La región duplicada (un tramo de ADN amplificado) se denomina con frecuencia como “amplicon”. Habitualmente, la cantidad de ARN mensajero (mARN) producida, es decir, el nivel de expresión genética, se incrementa también en la proporción del número de copias realizadas de un gen particular expresado.

El término “prognosis” se utiliza en la presente memoria para referirse a la predicción de la probabilidad de progresión o muerte atribuida a cáncer, incluyendo recurrencia, expansión metastática, y resistencia a los medicamentos, de una enfermedad neoplástica, tal como un cáncer de pulmón. El término “predicción” se utiliza en la presente memoria para referirse a la probabilidad de que un paciente responda ya sea favorablemente o ya sea desfavorablemente a un medicamento o conjunto de medicamentos, y también a la extensión de estas respuestas, o de que un paciente sobreviva, a continuación de la extracción quirúrgica del tumor principal y/o de la quimioterapia durante un cierto período de tiempo sin recurrencia del cáncer. Los métodos predictivos de la presente invención pueden ser usados clínicamente para tomar decisiones de tratamiento eligiendo las modalidades de tratamiento más apropiadas para cualquier paciente particular. Los métodos predictivos descritos en la presente memoria son herramientas valiosas para la predicción de si es probable que un paciente responda favorablemente a un régimen de tratamiento, tal como una intervención quirúrgica, quimioterapia con un medicamente dado o una combinación de medicamentos, y/o terapia de radiación, o de si es probable la supervivencia a largo plazo del paciente, a continuación de de la cirugía y/o de la terminación de la quimioterapia o de otras modalidades de tratamiento.

El término supervivencia “a largo plazo” se utiliza en la presente memoria para referirse a una supervivencia de al menos 1 año, más preferentemente al menos 3 años, más preferentemente al menos 7 años, después de la cirugía

o de otro tratamiento.

El “rigor” de las reacciones de hibridación es fácilmente determinable por un experto en la materia, y en general es un cálculo empírico dependiente de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado, y la concentración de sal. En general, cuanto más largas sean las sondas más altas son las temperaturas requeridas para una fijación por calor

apropiada, mientras que las sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La hibridación depende en general de la capacidad del ADN desnaturalizado para re-fijarse por calor cuando se encuentran presentes cadenas complementarias en un entorno por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto más alto sea el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia hibridizable, más alta es la temperatura relativa que puede ser usada. Como resultado, se deduce que las temperaturas relativas más altas podrían tender a hacer que las condiciones de reacción sean más rigurosas, mientras que las temperaturas más bajas lo son menos. Diversos textos publicados69,77 proporcionan detalles adicionales y una explicación de la rigurosidad de las reacciones de hibridación.

“Condiciones rigurosas” o “condiciones de alta rigurosidad”, según se definen en la presente memoria, típicamente:

(1) emplean una baja resistencia iónica y una alta temperatura para el lavado, por ejemplo cloruro de sodio 0,015 M/citrato de sodio 0,0015 M/0,1% de dodecil sulfato de sodio a 50 ºC; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizador, tal como formamida, por ejemplo, un 50% (v/v) de formamida con un 0,1% de albúmina de suero bovino/0,1% de Ficoll/0,1% de polivinilpirrolidona/50 mM de solución tampón de fosfato de sodio a un pH de 6,5 con 750 mM de cloruro de sodio, 75 mM de citrato de sodio a 42 ºC; o (3) emplean un 50% de formamida, 5XSCC (0,75 M NaCl, 0,075 M de citrato de sodio), 50 mM de fosfato de sodio (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato de sodio, 5X solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50.mu.g/ml), 0,1% de SDS y 10% de sulfato dextrano a 42 ºC, con lavados a 42 ºC en 0,2XSSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y 50% de formamida a 55 ºC, seguido de un lavado de alta rigurosidad consistente en 0,1XSSC que contenía EDTA a 55 ºC.

Las “condiciones moderadamente rigurosas” pueden ser identificadas convencionalmente70 e incluyen el uso de solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, resistencia iónica y % de SDS) menos rigurosas que las descritas en lo que antecede. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas consiste en incubación durante la noche a 137 ºC en una solución que comprende: 20% de formamida, 5XSSC (150 mM de NaCl, 15 mM de citrato de sodio), 50 mM de fosfato de sodio (pH 7,6), 5X solución de Denhardt, 10 % de sulfato dextrano, y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón cortador desnaturalizado, seguido de lavado de los filtros en 1XSSC a alrededor de 37-50 ºC. El experto reconocerá cómo ajustar la temperatura, la resistencia iónica, etc., según sea necesario para acomodar factores tales como longitud de la sonda y similares, mediante el uso de las instrucciones del fabricante (véase, por ejemplo, instrucciones del sistema Illumina).

En el contexto de las composiciones y métodos descritos en la presente memoria, la referencia a “tres o más”, “al menos cinco”, etc., de los genes listados en cualquier conjunto particular de genes (por ejemplo, Tablas I a VII) significa una cualquiera o cualquiera y todas las combinaciones de los genes listados. Por ejemplo, los perfiles de expresión genética adecuados incluyen perfiles que contienen cualquier número entre al menos 3 a 100 genes de esas Tablas. En una realización, los perfiles genéticos formados por genes seleccionados a partir de una tabla son utilizados preferentemente por orden jerárquico, por ejemplo los de la parte superior de la lista demostraron resultados discriminatorios más significativos en las pruebas, y de ese modo pueden ser más significativos en un perfil que los genes de orden más bajo. Sin embargo, en otras realizaciones, los genes que forman un perfil genético útil no tienen que estar en orden jerárquico y puede ser cualquier gen de la tabla respectiva.

Los términos "partición" y "partición de ARN" se utilizan de manera intercambiable y se refieren a procesamiento de ARN que extrae intrones y une exones para producir mARN maduro con secuencia de codificación continua que se mueve en el citoplasma de una célula eucariótica.

En teoría, el término "exón" se refiere a cualquier segmento de un gen interrumpido que esté representado en el producto de ARN maduro71. En teoría, el término "intrón" se refiere a cualquier segmento de ADN que esté transcrito pero extraído del interior de la transcripción mediante partición junto con los exones de cualquier lado del mismo. Operativamente, ocurren secuencias de exones en la secuencia de ARN de un gen. Operativamente, las secuencias de intrones son las secuencias intervinientes dentro del ADN genómico de un gen, encorchetado mediante secuencias de exones y que tienen secuencias de consenso de partición GT y AG en sus límites 5' y 3'.

Según se utiliza en la presente memoria, "etiquetas" o "moléculas informadoras" son porciones químicas o bioquímicas útiles para etiquetar un ácido nucleico (incluyendo un nucleótido simple), un polinucleótido, oligonucleótido, o ligando proteínico, por ejemplo un aminoácido o anticuerpo. Las "etiquetas" y los "moléculas informadoras" incluyen agentes fluorescentes, agentes quimioluminiscentes, agentes cromogénicos, agentes de extinción, radionucleótidos, enzimas, substratos, co-factores, inhibidores, partículas magnéticas y otras porciones conocidas en el estado de la técnica. Las "etiquetas" o "moléculas informadoras" son capaces de generar una señal medible y pueden estar unidas covalentemente o monovalentemente a un oligonucleótido o un nucleótido (por ejemplo, un nucleótido no natural) o un ligando.

A menos que se defina de otro modo en la presente descripción, los términos técnicos y científicos usados en la misma tienen el mismo significado que los entendidos habitualmente por un experto en la materia a la que pertenece la presente invención y con referencia a los textos publicados72,73, los cuales proporcionan a un experto en la materia una guía general respecto a muchos de los términos usados en la presente solicitud.

II. Los perfiles de expresión genética

Los inventores identificaron perfiles de expresión genética de diagnóstico en los linfocitos de sangre periférica de pacientes de cáncer de pulmón. Los inventores han descubierto que los perfiles de expresión genética de las PBMCs de pacientes de cáncer de pulmón difieren significativamente de los observados en controles apropiadamente emparejados (por ejemplo, por edad, sexo, historia de fumador). Por ejemplo, se pueden observar y detectar cambios en los productos de expresión genética de los genes de estos perfiles mediante los métodos de la presente invención en la PBMC circulante normal de pacientes con tumores de pulmón sólidos en fase temprana.

Los perfiles de expresión genética descritos en la presente solicitud proporcionan nuevos marcadores de diagnóstico para la pronta detección de cáncer de pulmón y podrían evitar que los pacientes sean sometidos innecesariamente a procedimientos (es decir, si se descubre un pequeño nódulo de pulmón) o ser usados potencialmente para proteger pacientes de alto riesgo. Puesto que los riesgos son muy bajos, la relación entre el beneficio y el riesgo es muy alta. Los métodos y las composiciones que se describen en la presente memoria pueden ser útiles también en otras poblaciones, es decir, para proteger a ciertas poblaciones de cáncer de pulmón de alto riesgo, tal como los fumadores expuestos a amianto. En otra realización más, los métodos y las composiciones que se describen en la presente memoria pueden ser usados junto con factores de riesgo clínico para ayudar a los médicos a tomar decisiones más precisas respecto a cómo manejar pacientes con nódulos de pulmón. Otra ventaja de la presente invención consiste en que la diagnosis puede realizarse tempranamente puesto que la diagnosis no es dependiente de la detección de células tumorales circulantes que estén presentes en sólo un pequeño número de canceres de pulmón en fase temprana de desarrollo.

Puesto que los efectos de las enfermedades pulmonares obstructivas del tabaco y/o crónicas sobre el perfil de PBMC tienen el potencial de obscurecer los resultados de los métodos de diagnóstico basados en perfiles genéticos, según se detalla en lo que sigue, los efectos de un fumador actual, un antiguo fumador, y una COPD, son direccionados específicamente en las composiciones y métodos de la presente invención mediante el uso de poblaciones apropiadas de controles de emparejamiento. En una realización, la clase de control apropiado para los estudios comparativos consiste en los fumadores de riesgo y en ex-fumadores con enfermedad pulmonar no maligna, de modo que las historias relacionadas con el tabaco de ambos sujeto paciente y sujetos de control, son muy similares. Los datos que se presentan en los ejemplos que siguen indican claramente que los inventores detectan una signatura de cáncer en presencia de una actividad de fumador y/o de COPD.

En una realización, un novedoso perfil o signatura de expresión genética puede identificar y distinguir pacientes en fase de desarrollo temprana (T1/T2 -principalmente Fase de desarrollo I/II) de canceres de células no pequeñas de pulmón (NSCLC) a partir del grupo de control adecuado de fumadores y ex-fumadores en alto riesgo respecto al desarrollo de cáncer de pulmón por la edad, el género y la raza. Véase, por ejemplo, los genes identificados en la Tabla I que pueden formar un perfil adecuado de expresión genética y los de la Tabla IV, columna "TODO/NHC". En otra realización, un novedoso perfil o signatura de expresión genética puede identificar pacientes con tumores de AC (principalmente, Fases de desarrollo I y II) en fase de desarrollo temprana (T1/T2), en comparación con el control de NHC relacionado de forma cercana. Véase la tabla II y la Tabla IV, columna "AC/NHC". La validez de estos métodos y de los perfiles de expresión genética, está soportada en datos experimentales que miden la "puntuación" del cáncer de pulmón en pacientes antes y después de la cirugía. En otra realización, las colecciones de genes de la Tabla III y la Tabla IV, columna PRE/POST, proporcionan un número discreto de genes que forman un perfil adecuado. Estas poblaciones de paciente/control se distinguieron generando una puntuación discriminante basada en diferencias en perfiles de expresión genética según se ha ejemplificado en lo que sigue. En una realización, un clasificador de 15 genes, es decir, un conjunto de genes que forman un perfil de expresión genética, puede distinguir entre tumores de AC en fase de desarrollo temprana y perfiles de control no sanos con una precisión de un 85%. Ese perfil de expresión genética ha sido identificado en la Tabla IV, columna "TODO/NHC", que sigue. Adicionalmente, los inventores han identificado un clasificador de perfil de expresión genética que distingue ambos pacientes de AC y de LSCC de los NHC con una precisión de un 83% necesitando también 15 genes para el perfil. Ese perfil de expresión genética se ha identificado en la Tabla IV, columna "AC/NHC" que sigue. Un perfil de expresión genética similar para distinguir pacientes de pre-cirugía de los de post-cirugía, se encuentra también en la Tabla IV, columna "PRE/POST" que sigue. Los datos mostrados en los ejemplos indican claramente que existe una signatura específica de cáncer en fase de desarrollo temprana compartida que se aparta del patrón que discrimina los tipos de cáncer (AC frente a LSCDC) y que discrimina las fases de desarrollo del cáncer (temprana frente a tardía).

Datos más recientes descritos en los Ejemplos 14-18 que siguen proporcionan una nueva signatura de expresión de 29 genes para diagnosticar sujetos con cáncer de pulmón a partir de controles sanos o no sanos (Tabla V, genes clasificados como 1-29), así como genes adicionales a partir de esa tabla que pueden formar otras signaturas. El panel relativamente pequeño de 29 genes puede distinguir NSCLC en fase de desarrollo temprana (Fase de desarrollo 1A - 1B) de un grupo de control altamente similar con una buena precisión. Adicionalmente, un conjunto de 4 genes procedentes de la selección de 50 genes de la Tabla VI, resulta útil para distinguir y rastrear una mejora post-quirúrgica. Además, un nuevo perfil de expresión de 24 genes para discriminar entre sujetos con cáncer de pulmón y sujetos con nódulos de pulmón benignos, ha sido proporcionado en la Tabla VII. Los datos mostrados en estos ejemplos muestran signaturas genéticas de cáncer de pulmón útiles tanto en diagnosis como en evaluación

del progreso del tratamiento.

Según se describe en detalle en los ejemplos que siguen, comparando expresión genética en PBMC de un grupo amplio de pacientes de NSCLC con un grupo comparable de pacientes con enfermedades de pulmón no malignas, se detectó una signatura tumoral inducida, en fumadores y no fumadores, que puede ser distinguida de los efectos de la enfermedad pulmonar no maligna inducida por fumar. Según se muestra en los ejemplos que siguen, se han identificado signaturas de diagnóstico en PBMC que distinguen pacientes con NSCLC en fase de desarrollo temprana frente a controles en riego con enfermedad de pulmón no maligna uniformizados en cuanto a fumar, la edad, el género, así como la incidencia de COPD. Existían también 14 pacientes de NSCLC en estos ejemplos que no tenían ninguna historia anterior como fumadores. El cáncer de pulmón en individuos que nunca habían fumado ha mostrado tener varias diferencias importantes con los tumores de pulmón asociados al tabaco, y algunos cambios moleculares que ocurrieron han sugerido ser únicos en no fumadores28,29. 11 de los 14 que nunca fumaron fueron clasificados correctamente como cáncer por medio del clasificador de 29 genes, sugiriendo que el efecto sobre la expresión genética de PBMC de cánceres de pulmón en fumadores y no fumadores es similar, al menos con respecto a las signaturas de gen de PBMC.

Catorce genes asociados al metabolismo de la nicotina y de la nicotinamida fueron estadísticamente pacientes de NSCLC significativamente más baja cuando se compararon con todos los controles o se compararon solamente con controles con nódulos de pulmón benignos sugiriendo que estas vías de acceso pueden ser suprimidas en pacientes de NSCLC. Las diferencias detectadas en la PBMC entre pacientes antes y después de la resección quirúrgica, fueron numerosas. Sin embargo, 2 de los 4 genes más informativos que distinguen las muestras de pre- frente a las de post- cirugía, tienen funciones mitocóndricas. Los genes mitocóndricos son en general de pre-cirugía más alta sugiriendo que los requisitos de energía incrementada descritos para los tumores están también reflejados en la PBMC cuando el tumor está presente. Las vías de acceso altamente significativas que eran más altas en muestras de pre-cirugía fueron asociadas a la función celular NK, y a la señalización de ceramida. [NK: 29 genes (p<2,08 x 10 8), caramida: 17 genes (p<8,83 x 10.-5)]. Las vías de acceso con regulación más significativamente descendente incluían genes receptores de apoptosis y de muerte (Apoptosis: 15 genes (p<1,74 x 10-2), receptor de muerte: patrones de 13 genes (p<1,37 x 10-3) también característicos de tumores31,32. La reducción observada de la signatura de cáncer de NSCLC y las diferencias comunes altamente significativas mostradas por post-cirugía de pacientes, soportan la conclusión de que las signaturas descritas en la presente memoria son inducidas por tumores.

Las interacciones específicas entre el tumor, los linfocitos y factores derivados de tumor, contribuyen a los cambios vistos en la expresión genética de PBMC y estos efectos se ven incrementados en la progresión tumoral, según se evidencia mediante la precisión incrementada de nuestro panel genético en la clasificación de NSCLC de fase de desarrollo tardía.

La validez de estas signaturas fue establecida sobre muestras recogidas en diferentes localizaciones por diferentes grupos y en un conjunto de pacientes con nódulos de pulmón sin diagnosticar. Los perfiles de expresión genética identificados en lo que sigue mediante el uso de matrices ILLUMINA proporcionan signaturas de pronóstico global para identificar pacientes con cáncer de pulmón de varios tipos de células, y proporcionan signaturas de diagnóstico específicas del tipo de célula. Además, los perfiles que tienen en cuenta la raza, el género y la historia del fumador. Los inventores han probado también muestras procedentes de un grupo de pacientes antes y después de la cirugía del cáncer, eliminando de ese modo la variabilidad de persona a persona en cuanto a la evaluación del efecto del tumor. La consistencia de la signatura del cáncer de pulmón disminuye o desaparece tras la extracción del tumor. Este resultado, según se discute en los ejemplos que siguen, soporta considerablemente la identificación de una signatura de PBMC para un cáncer de pulmón en fase de desarrollo temprana. Este dato (véase el Ejemplo 12) muestra una reducción consecuente en cada puntuación de cáncer de pulmón del paciente tras la eliminación quirúrgica del cáncer en comparación con esa puntuación con anterioridad a la cirugía.

Las signaturas de cáncer de pulmón o perfiles de expresión genética identificados en la presente memoria y mediante el uso de las colecciones de genes de las Tablas I-VII, pueden ser optimizados para reducir los números de productos de expresión genética necesarios e incrementar la precisión del diagnóstico.

Aunque no se pretende quedar limitados por la teoría, el uso por los inventores de estudios de expresión genética de PBMC en la enfermedad se basa en la proposición de que la PBMC circulante (células mononucleares de sangre periférica - principalmente monocitos y linfocitos) está afectada por procesos localizados que incluyen inflamación y/o tumores. Esto puede ocurrir mediante al menos dos mecanismos. En primer lugar, las células pueden interactuar directamente en los tejidos de la inflamación o tumor. De manera clara, una función clave de los linfocitos consiste en "patrullar" los tejidos del cuerpo, detenerse temporalmente en zonas anormales, salir de los tejidos, interactuar con los tejidos nodales linfoideos, volverse activos, y a continuación re-entrar en la circulación (re-entrando algo en los tejidos). Esta interacción cercana altera claramente su fenotipo. Un segundo proceso, y probablemente igual de importante, consiste en la respuesta de la PBMC a factores circulantes liberados por las células en la respuesta inflamatoria o los tumores. Muchos de esos factores han sido ya descritos, incluyendo factores de estimulación de colonias (tal como G-CSF, GM-CSF), citocinas (es decir, TNF, IL-2, IL-3, IL-4 e IL-, IL-7, IL-15, etc.), quimiocinas (MCP-1, SDF-1), factores de crecimiento (tales como el ligando Fit-3, VEGF), factores de inmunosupresión (tal como IL-10, COX-1, TGF-β), etc. Estos factores afectan a células inmaduras de la médula ósea que son liberadas después

a la circulación, así como también a células que están ya en el compartimento circulante. Este último mecanismo afecta asimismo tanto al fenotipo de células liberadas como al tipo de células liberadas (es decir, muy pronto después de la infección existe un flujo entrante de neutrófilos inmaduros en la circulación).

Aunque las lesiones inflamatorias y los tumores tienen algunas similitudes, existen muchas diferencias, de las que una muy importante es la bien conocida capacidad de los tumores de suprimir respuestas inmunes. Las signaturas del cáncer establecidas por los perfiles de expresión genética descritos en la presente memoria pueden ser diferenciadas de una signatura inflamatoria.

III. Métodos de obtención de perfil de expresión genética

Los métodos de obtención de perfil de expresión genética que se usaron para generar los perfiles útiles en las composiciones y métodos descritos en la presente memoria o en la realización de etapas de diagnóstico utilizando las composiciones descritas en la presente memoria, son conocidos y se encuentran resumidos en la Patente US núm. 7.081.340. Tales métodos de obtención de perfil de expresión genética incluyen métodos basados en análisis de hibridación de polinucleótidos, métodos basados en secuenciación de polinucleótidos, y métodos de base proteínica. Los métodos utilizados más comúnmente, conocidos en la técnica de la cuantificación de expresión de mARN en una muestra, incluyen el uso de la técnica northern blot y la hibridación in situ74; ensayos de protección de ARNs75; y métodos basados en PCR, tal como PCR76. Alternativamente, se pueden emplear anticuerpos que reconozcan dúplex específicos, incluyendo los dúplex de ADN, los dúplex de ARN, y los dúplex híbridos de ADN-ARN o los dúplex de ADN-proteína. Métodos representativos para análisis de expresión genética basada en secuenciación incluyen Análisis Serie de Expresión Genética (SAGE) y análisis de expresión genética por secuenciación de signatura masivamente paralela (MPSS).

A. Técnicas de reacción de cadena de polimerasa (PCR)

El método cuantitativo más sensible y más flexible es el RT-PCR, el cual puede ser usado para comparar niveles de mARN en diferentes poblaciones de muestra, en tejidos normales y tumorales, con o sin tratamiento con medicamentos, para caracterizar patrones de expresión de gen, para discriminar entre mARNs relacionados de manera cercana, y para analizar estructuras de ARN. La primera etapa consiste en el aislamiento de mARN a partir de una muestra objetivo (por ejemplo, típicamente el ARN total aislado a partir de PBMC humana en este caso). El mARN puede ser extraído, por ejemplo, a partir de muestras de tejido congeladas o incrustadas en parafina archivadas y fijadas (por ejemplo, fijadas en formalina).

Los métodos generales para la extracción de mARN son bien conocidos en el estado de la técnica, tal como en libros de texto de biología molecular77. Los métodos para extracción de ARN a partir de tejidos incrustados en parafina son también conocidos78,79. En particular, se puede realizar el aislamiento de ARN utilizando el kit de purificación, el conjunto tampón y proteasa procedente de fabricantes comerciales, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Ejemplos de productos comerciales incluyen TRI-REAGENT, Mini-columnas Qiagen RNeasy, Kit de Purificación de ADN y ARN Completa MASTERPURE (EPICENTRE®, Madison, Wis.), Kit de Aislamiento de Bloque de Parafina (Ambion, Inc.), y ARN Stat-60 (Tel-Ensayo). También se pueden emplear técnicas convencionales tales como centrifugación por gradiente de densidad de cloruro de cesio.

La primera etapa en la obtención de perfil de expresión genética mediante RT-PCR consiste en la transcripción reversa de la plantilla de ARN en cADN, seguido de su amplificación exponencial en una reacción de PCR. Las dos transcriptasas reversas utilizadas más habitualmente son la transcriptasa reversa de virus avilo mieloblastosis (AMN-RT) y la transcriptasa reversa de virus de leucemia murina de Moloney (MMLV-RT). La etapa de transcripción reversa es imprimada utilizando imprimadores específicos, hexámeros aleatorios, o imprimadores oligo-dT, dependiendo de las circunstancias y del objetivo de la obtención del perfil de expresión. Véase, por ejemplo, las instrucciones del fabricante que acompañan al producto kit GENEAMP RNA PCR (Perking Elmer, Calif., USA). El cADN derivado puede ser usado entonces como plantilla en la posterior reacción de RT-PCR.

La etapa de PCR utiliza por lo general una polimerasa de ADN dependiente de ADN termoestable, tal como la polimerasa de ADN Taq, la cual tiene actividad nucleasa 4’-3-, pero carece de actividad de endonucleasa de cotejo 3’-5’. De ese modo, la PCR TAQMAN® utiliza típicamente la actividad nucleasa 5’ de polimerasa Taq o Th para hidrolizar una sonda de hibridización vinculada a su amplicon objetivo, pero se podría usar cualquier enzima con nucleasa 5’ equivalente. Se utilizan dos imprimadores de oligonucleótido para generar un amplicon típico de una reacción de PCR. Un tercer oligonucleótido, o sonda, está diseñado para detectar una secuencia de nucleótido localizada entre los dos imprimadores de PCR. La sonda no es extensible por parte de la enzima de polimerasa de ADN Taq, y está etiquetada con un tinte fluorescente informador y un tinte fluorescente de extinción. Cualquier emisión inducida por láser procedente del tinte informador es extinguida por el tinte extinguidor cuando los dos tintes están situados próximos entre sí según están sobre la sonda. Durante la reacción de amplificación, la enzima de polimerasa de ADN Taq parte la sonda de una manera que depende de la plantilla. Los fragmentos de sonda resultantes se disocian en solución, y la señal procedente del tinte informador liberado está libre del efecto de extinción de segundo fluoróforo. Una molécula de tinte informador es liberada por cada nueva molécula sintetizada, y la detección del tinte informador no extinguido proporciona las bases para la interpretación cuantitativa de los datos.

La RT-PCR TaqMan® puede ser llevada a cabo utilizando un equipo comercialmente disponible. En una realización preferida, el procedimiento de nucleasa 5’ se ejecuta en un dispositivo de PCR cuantitativo en tiempo real tal como el ABI PRISM 7900® Sequence Detection System®. El sistema amplifica muestras en un formato de 96 pocillos en un termociclador. Durante la amplificación, la señal fluorescente inducida por láser es recogida en tiempo real por medio de cables de fibra óptica para la totalidad de los 96 pocillos, y detectada en el CCD. El sistema incluye software para hacer funcionar el instrumento y para analizar los dato. Los datos del ensayo de nucleasa 5’ son expresados inicialmente como Ct, o ciclo de umbral. Según se ha expuesto en lo que antecede, los valores de fluorescencia son registrados durante cada ciclo y representan la cantidad de producto amplificado en ese punto de la reacción de amplificación. El punto en que la señal fluorescente es registrada en primer lugar como estadísticamente significativa es el ciclo de umbral (C1).

Para minimizar errores y el efecto de la variación muestra a muestra, la RT-PCR se realiza normalmente utilizando un estándar interno. El estándar interno ideal se expresa a un nivel constante entre diferentes tejidos, y no se ve afectado por el tratamiento experimental. Los ARNs más frecuentemente utilizados para normalizar patrones de expresión genética son mARNs para los genes de limpieza gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAPDH) y βactina.

La PCR en tiempo real es comparable tanto con PCR competitiva cuantitativa, en la que se utiliza el competidor interno para cada secuencia objetivo a efectos de normalización, como con PCR comparativa cuantitativa que utiliza un gen de normalización contenido dentro de la muestra, o un gen de limpieza para RT-PCR110.

En otro método de PCR, es decir, el método de obtención de perfil de expresión genética basado en MassARRAY (Sequenom, Inc., San Diego, CA), a continuación del aislamiento de ARN y de transcripción reversa, el cADN obtenido es enriquecido con una molécula de ADN sintético (competidor), la cual empareja la región de cADN en todas las posiciones, salvo una base simple, y sirve como estándar interno. La mezcla de cADN/competidor es amplificada en PCR y se somete a un tratamiento de enzima de fosfatasa alcalina de camarón (SAP) post-PCR, lo que da como resultado la desfosforilación de los nucleótidos restantes. Tras la inactivación de la fosfatasa alcalina, los productos de PCR del competidor y el cADN son sometidos a una extensión de imprimador, lo que genera señales en serie distintas para los productos de PCR derivados del competidor y del cADN. Tras la purificación, estos productos son dispensados sobre una matriz de chip, la cual se ha pre-cargado con componentes necesarios para el análisis con análisis de espectrografía de masas de tiempo de vuelo de ionización de desorción de láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS). El cADN presente en la reacción es cuantificado a continuación analizando las relaciones de las áreas de pico en el espectro de masas generado82.

Otras realizaciones adicionales de técnicas basadas en PCR, que son conocidas en el estado de la técnica y que pueden ser usadas para obtención de perfil de expresión de gen incluyen, por ejemplo, visualización diferencial, polimorfismo de longitud de fragmento amplificado (iAFLP), y tecnología de BeadArray T(Illumina, San Diego, CA) utilizando el sistema Luminex100 LabMAP comercialmente disponible y múltiples microesferas codificadas en color (Luminex Dorp., Austin, Tex.) en un rápido ensayo para expresión genética; y análisis de obtención de perfil de expresión de alta cobertura (HiCEP).

Según se describe con mayor detalle en los ejemplos, en lo que sigue, los perfiles de expresión genética para clasificaciones de cáncer de pulmón fueron recogidas como sigue. Los perfiles de expresión de ARN se obtienen mediante purificación de PBMC a partir de la sangre de sujetos mediante centrifugación utilizando un tubo PCT, un gradiente de Ficoll o separación de densidad equivalente para extraer glóbulos rojos y granulocitos, y la posterior extracción del ARN utilizando el tri-reactivo TRIZOL, el reactivo RNALATER o un reactivo similar para obtener ARN de alta integridad. La cantidad de especies de ARN mensajero individual fue determinada utilizando micro-matrices y/o reacción de cadena de polimerasa cuantitativa.

Tras el análisis de la concentración de ARN, fueron transcritas de forma reversa las etapas de reparación y/o amplificación de ARN utilizando promotores específicos genéticos seguido de RT-PCR. Finalmente, los datos se analizaron para identificar el patrón de expresión genética característico identificado en la muestra de PBMC examinada. Las características de los perfiles de expresión de la enfermedad que va a ser diagnosticada fueron comparados y analizados por parejas con una algoritmo SVM (SV;-RCE)1 (descrito en los Ejemplos 4 y 5), y con una metodología alternativa descrita en el Ejemplo 14 que sigue. Estos métodos pueden ser demostrados también utilizando un algoritmo similar de aprendizaje de máquina, tal como SVM con Eliminación de Característica Recursiva (SVM-RFE) u otro algoritmo de clasificación tal como Análisis Discriminante Penalizado (PDA) (véase la publicación de la solicitud de Patente Internacional núm. WO 2004/105573, publicada el 9 de Diciembre de 2004) para obtener una función matemática cuyos coeficientes actúan sobre los valores de entrada de expresión genética de ARN y presentan a la salida una “PUNTUACIÓN” cuyo valor determina la clase de individuo y la confianza de la predicción. Al haber determinado esta función mediante análisis de numerosos sujetos que se sabe que son de las clases cuyos miembros han de ser distinguidos posteriormente, se utiliza para clasificar sujetos respecto a sus estados de enfermedad.

En la realización de los ensayos y métodos de la presente invención, se utilizan estas mismas técnicas, el perfil del paciente se compara con el perfil de referencia apropiado, y se selecciona el diagnóstico o la recomendación de

tratamiento en base a esta información.

B. Micro-matrices

La expresión genética diferencial puede ser también identificada, o confirmada, utilizando la técnica de micro-matriz. Así, el perfil de expresión de genes asociados a cáncer de pulmón puede ser medido ya sea en tejido fresco o ya sea incrustado en parafina, utilizando tecnología de micro-matriz. En este método, las secuencias de polinucleótido de interés (incluyendo los cADNs y los oligonucleótidos) son colocadas en placas, o desplegadas, sobre un substrato de microchip. Las secuencias desplegadas son hibridizadas a continuación con sondas de ADN específicas procedentes de células o tejidos de interés. Al igual que en la RT-PCR a los efectos de los métodos y composiciones de la presente invención, la fuente de mARN es el ARN total aislado a partir de la RMBC de los controles y de los pacientes.

En una realización de la técnica de micro-matrices, las inserciones amplificadas por PCR de clones de cADN son aplicadas a un substrato según una matriz densa. Con preferencia, se aplican al menos 10.000 secuencias de nucleótido al substrato. Los genes micro-desplegados, inmovilizados sobre el microchip a razón de 10.000 elementos en cada uno, son adecuados para la hibridación bajo condiciones rigurosas. Las sondas de cADN recién etiquetadas pueden ser generadas mediante incorporación de nucleótidos fluorescentes por transcripción reversa de ARN extraído de tejidos de interés. Las sondas de cADN etiquetadas aplicadas al chip se hibridizan con especificidad en cada mancha de ADN presente sobre la matriz. Tras un lavado riguroso para eliminar las sondas vinculadas de manera no específica, el chip es explorado mediante microscopía láser confocal o mediante otro método de detección, tal como con una cámara CCD. La cuantificación de la hibridación de cada elemento desplegado permite la evaluación de la correspondiente abundancia de mARN. Con fluorescencia de doble color, las sondas de cADN etiquetadas por separado generadas a partir de dos fuentes de ARN, son hibridizadas por parejas en la matriz. La abundancia relativa de las transcripciones a partir de las dos fuentes que corresponden a cada gen especificado, se determina así simultáneamente. La escala miniaturizada de la hibridización proporciona una evaluación conveniente y rápida del patrón de expresión para grandes cantidades de genes. Tales métodos han demostrado tener la sensibilidad necesaria para detectar transcripciones raras, que se expresan mediante unas pocas copias por célula, y para detectar reproduciblemente al menos de forma aproximada el doble de diferencias en los niveles de expresión. El análisis de micro-matriz puede ser llevado a cabo mediante un equipamiento comercialmente disponible, siguiendo los protocolos del fabricante.

Otros métodos útiles resumidos por la Patente US núm. 7.081.340 incluyen el Análisis Serie de Expresión de Gen (SAGE) y la Secuenciación de Signatura Masivamente Paralela (MPSS).

C. Inmunohistoquímica

Los métodos de inmunohistoquímica son también adecuados para detectar los niveles de expresión de los productos de expresión genética de los genes informativos descritos para su uso en los métodos y composiciones de la presente invención. Anticuerpos o antisueros, con preferencia antisueros policlonales, y con mayor preferencia los anticuerpos monoclonales, u otros ligandos de vinculación de proteína específicos para cada marcador, son utilizados para detectar expresión. Los anticuerpos pueden ser detectados por etiquetamiento directo de los propios anticuerpos, por ejemplo con etiquetas radiactivas, etiquetas fluorescentes, etiquetas de hapteno tales como biotina,

o una enzima tal como peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina. Alternativamente, se utiliza anticuerpo primario sin etiquetas junto con anticuerpo secundario etiquetado, comprendiendo antisueros, antisueros policlonales

o un anticuerpo monoclonal específico para el anticuerpo primario. Los protocolos y kits para análisis inmunohistoquimicos son bien conocidos en el estado e la técnica y se encuentran disponibles comercialmente.

D.

Proteómica

El término “proteoma” se define como la totalidad de las proteínas presentes en una muestra (por ejemplo, tejido, organismo o cultivo celular) en un cierto instante de tiempo. La proteómica incluye, entre otras cosas, el estudio de los cambios globales de expresión de proteína en una muestra (también mencionada como “proteómica de expresión”). La proteómica incluye típicamente las siguientes etapas: (1) separación de las proteínas individuales de una muestra mediante electroforesis de gel de 2-D (2-D PAGE); (2) identificación de las proteínas individuales recuperadas desde el gel, por ejemplo, mediante espectrometría de masas o secuenciación de terminal N, y (3) análisis de los datos usando bioinformática. Los métodos proteómicos son suplementos válidos para otros métodos de obtención de perfil de expresión genética, y pueden ser usados solos o en combinación con otros métodos, para detectar productos de expresión genética de los perfiles genéticos descritos en la presente memoria.

IY. Composiciones de la invención

Los métodos para el diagnóstico de cáncer de pulmón que utilizan perfiles definidos de expresión genética, permiten el desarrollo de herramientas de diagnóstico simplificado para el diagnóstico de cáncer de pulmón, por ejemplo, BSCLC o el diagnóstico de una fase de desarrollo específica (tempranamente, fase de desarrollo I, fase de desarrollo II o tardíamente) del cáncer de pulmón, diagnosticar un tipo específico de cáncer de pulmón (por ejemplo, AC frente a LSCC) o monitorizar el efecto de la intervención terapéutica o quirúrgica para la determinación del

tratamiento adicional o la evaluación de la probabilidad de recurrencia del cáncer.

De ese modo, una composición para el diagnóstico de cáncer de pulmón de célula no pequeña en un mamífero según se describe en la presente memoria puede ser un kit o un reactivo. Por ejemplo, una realización de una composición incluye un substrato sobre el que son inmovilizados dichos polinucleótidos u oligonucleótidos o ligandos. En otra realización, la composición es un kit que contiene los tres o más polinucleótidos u oligonucleótidos

o ligandos relevantes, etiquetas detectables opcionales, substratos de inmovilización, substratos opcionales para etiquetas enzimáticas, así como también otros artículos de laboratorio. En otra realización más, al menos un polinucleótido o un oligonucleótido o un ligando está asociado a una etiqueta detectable.

Una composición de ese tipo contiene, en una realización, tres o más polinucleótidos u oligonucleótidos, de los que cada polinucleótido u oligonucleótido hibridiza en un gen, fragmento de gen, transcripción de gen o producto de expresión diferente a partir de células mononucleares de sangre periférica de mamífero (PBMC), en el que dicho gen, fragmento de gen, transcripción de gen o producto de expresión se elige a partir de (i) los genes de la Tabla I;

(ii)

los genes de la tabla II; (iii) los genes de la Tabla III, y (iv) los genes de la Tabla IV. En otra realización, una composición de ese tipo contiene tres o más polinucleótidos u oligonucleótidos, en el que cada polinucleótido u oligonucleótido hibridiza en un gen, fragmento de gen, transcripción de gen o producto de expresión diferente procedente de células mononucleares de sangre periférica de mamífero (PBMC), en el que dicho gen, fragmento de gen, transcripción de gen o producto de expresión se elige a partir de (i) los genes de la Tabla V; (ii) los genes de la Tabla VI, o (iii) los genes de la Tabla VII.

En otra realización, una composición de ese tipo contiene tres o más ligandos, en la que cada ligando enlaza con un producto de expresión diferente de células mononucleares de sangre periférica de mamífero (PBMC), en el que el producto de expresión de gen es el producto de un gen seleccionado a partir de (i) los genes de la Tabla I; (ii) los genes de la Tabla II; (iii) los genes de la Tabla III; y (iv) los genes de la Tabla IV. En otra realización más, una composición de ese tipo contiene tres o más ligandos, de los que cada ligando enlaza con un producto de expresión de gen diferente de células mononucleares de sangre periférica de mamífero (PBMC), en el que el producto de expresión genética es el producto de un gen seleccionado a partir de (i) los genes de la Tabla V; (ii) los genes de la Tabla VI; o (iii) los genes de la Tabla VII.

En una realización, una composición para el diagnóstico de cáncer de pulmón en un mamífero incluye tres o más conjuntos de sonda de imprimador de PCR. Cada uno de los conjuntos de sonda de imprimador amplifica una secuencia de polinucleótido diferente procedente de un producto de expresión genética de tres o más genes encontrados en las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) del sujeto. Estos genes informativos se eligen de modo que formen un perfil o signatura de expresión genética que sea distinguible entre un sujeto que tiene cáncer de pulmón y un control de referencia seleccionado. Los cambios de expresión de los genes en el perfil de expresión genética con respecto al de un perfil de expresión genética de referencia, están correlacionados con un cáncer de pulmón, tal como un cáncer de pulmón de célula no pequeña (NSCLC).

En una realización de esta composición, los genes informativos se eligen entre los genes identificados en la Tabla I que sigue. La Tabla I contiene aproximadamente los 100 genes superiores identificados por los inventores como representativos de una signatura genómica indicativa de la presencia de algún cáncer de pulmón de NSCLC. Esta colección de genes comprende aquellos respecto a los que la expresión de producto de gen se ve alterada (es decir, incrementada o reducida) frente a la misma expresión de producto de gen en la PBMC de un control de referencia. En una realización, el polinucleótido o los oligonucleótidos, tal como imprimadores de PCR y sondas, son generados respecto a tres o más genes informativos de la Tabla I para su uso en la composición. Un ejemplo de tal composición contiene imprimadores y sondas en una porción objetivada de los tres primeros genes de esa Tabla. En otra realización, Los imprimadores y sondas de PCR son generados respecto a al menos seis genes informativos de la Tabla I para su uso en la composición. Un ejemplo de una composición de ese tipo contiene imprimadores y sondas respecto a una porción objetivada de los seis primeros genes de dicha Tabla. Todavía en otra realización, los imprimadores y sondas de PCR son generados respecto a al menos quince genes informativos de la Tabla I para su uso en la composición. Un ejemplo de composición de ese tipo contiene imprimadores y sondas respecto a una porción objetivadas de los quince primeros genes de dicha Tabla. Según otras realizaciones, se emplean imprimadores y sondas respecto a una porción objetivada de otras combinaciones de los genes de las Tablas. Los genes seleccionados a partir de la Tabla no necesitan estar por orden categórico; por el contrario, cualquier combinación que muestre claramente una diferencia de expresión entre el control de referencia y el paciente enfermo, resulta útil en tal composición.

En una realización específica, los genes informativos de la Tabla I comprenden tres o más genes seleccionados en el grupo consistente en IGSF6, HSPA8(A), LYN, DNCL1, HSPA1A, DPYSL2, HSPA8(I), NFKBIA, FGL2, CALM2, CCL5, RPS2, DDIT4 y Clorf63.

En otra realización de la presente composición, los genes informativos se seleccionan de entre los genes identificados en la Tabla II que sigue. La Tabla II contiene aproximadamente los 100 genes superiores identificados por los inventores como representativos de una signatura genómica indicativa de la presencia de un NSCLC específico, es decir, adenocarcinoma de pulmón. Esta colección de genes comprende aquellos para los que la expresión de producto de gen se ve alterada (es decir, aumentada o disminuida) frente a la misma expresión de

producto de gen de la PBMC de un control de referencia. En una realización, se generan imprimadores y sondas de PCR respecto a tres o más genes informativos de la Tabla II, para su uso en la composición. Un ejemplo de composición de ese tipo contiene imprimadores y sondas para una porción objetivada de los tres primeros genes de la Tabla II. En otra realización, los imprimadores y sondas de PCR son generados en al menos seis genes informativos de la Tabla II para su uso en la composición. Un ejemplo de composición de ese tipo contiene imprimadores y sondas para una porción objetivada de los seis primeros genes de la Tabla II. En otra realización más, los imprimadores y sondas de PCR son generados para al menos quince genes informativos de la Tabla II para su uso en la composición. Un ejemplo de composición de ese tipo contiene imprimadores y sondas respecto a una porción objetivada de los quince primeros genes de la Tabla II. Otras realizaciones emplean imprimadores y sondas respecto a una porción objetivada de otras combinaciones de genes de la Tabla II. Los genes seleccionados a partir de la Tabla II no necesitan estar por orden jerárquico; por el contrario, cualquier combinación que muestre claramente una diferencia de expresión entre el control de referencia y el paciente enfermo, es útil en una composición de ese tipo.

En una realización específica, los genes informativos de la Tabla II comprenden tres o más genes seleccionados a partir del grupo consistente en ETS1, CCL5, DDIT4, CXCR4, DNCL1, MS4ABA, ATP5B, HSPA8(A), ADM PTPN6, ARHGAP9, S100AB, DPYSL2, HSPA1A, y NFKBIA.

En otra realización de la presente composición, los genes informativos se eligen entre los genes identificados en la Tabla III. La Tabla III contiene los 100 genes superiores identificados por los inventores como representativos de una signatura genómica indicativa del efecto de resección quirúrgica del tumor de un paciente con NSCLC. Esta colección de genes contiene aquellos para los que la expresión de producto de gen se ve alterada (es decir, aumentada o disminuida) frente a la misma expresión de producto de gen de la PBMC de un paciente antes o después de la cirugía. En una realización, se generan imprimadores y sondas de PCR respecto a tres o más genes informativos de la Tabla III para su uso en la composición. Un ejemplo de composición de ese tipo contiene imprimadores y sondas respecto a una porción objetivada de los tres primeros genes de la Tabla III. En otra realización, los imprimadores y sondas de PCR son generados respecto a al menos seis genes informativos de la Tabla III para su uso en la composición. Un ejemplo de tal composición contiene imprimadores y sondas para una porción objetivada de los seis primeros genes de la Tabla III. En otra realización más, los imprimadores y sondas de PCR son generados para al menos quince genes informativos de la Tabla III, para su uso en la composición. Un ejemplo de una composición de ese tipo contiene imprimadores y sondas para una porción objetivada de los quince primeros genes de esa Tabla III. Los genes seleccionados a partir de la Tabla III no necesitan estar en orden jerárquico; por el contrario, cualquier combinación que muestre claramente una diferencia de expresión entre el paciente de NSCLC en pre-cirugía en comparación con el paciente de NSCLC en post-cirugía, es útil en la citada composición.

En otra realización de esta composición, los genes informativos se eligen de entre los genes identificados en la Tabla IV. La Tabla IV contiene realizaciones de 15 genes útiles como perfiles o signaturas genómicas representativas para tres usos diagnósticos, es decir, para distinguir entre NSCLC y todos los controles, para distinguir entre NSCLC en general y adenocarcinoma, y para distinguir entre, y con ello la progresión del rastreo de la enfermedad en, sujetos pre- y post-quirúrgicos. En una realización, se generan imprimadores y sondas de PCR para la totalidad de 15 genes informativos a partir de la Tabla IV, columna 1, para su uso en una composición de diagnóstico. En otra realización, se generan imprimadores y sondas de PCR para 15 genes informativos a partir de la Tabla IV, columna 2, para su uso en una composición de diagnóstico. En otra realización más, se generan imprimadores y sondas de PCR para quince genes informativos de la Tabla IV, columna 3, para su uso en una composición de diagnóstico. Otras realizaciones adicionales emplean imprimadores y sondas para una porción objetivada de otras combinaciones de genes de la Tabla IV. Los genes seleccionados a partir de la Tablas IV no necesitan estar en orden jerárquico; por el contrario, cualquier combinación que muestre claramente una diferencia entre el sujeto de prueba y los grupos comparados, resulta útil en tal composición.

En otra realización de la presente composición, los genes informativos se eligen a partir de los genes identificados en la Tabla V. La Tabla V contiene realizaciones de 136 genes útiles como signaturas o perfiles genómicos representativos, para distinguir entre NSCLC y todos los controles, principalmente controles no sanos. En una realización, se generan imprimadores y sondas de PCR respecto a los 29 genes informativos de orden superior de la Tabla V, formando con ello el clasificador de 29 genes de los ejemplos que siguen para su uso en una composición diagnóstica. En otra realización más, se generan imprimadores y sondas de PCR respecto a cualquier número deseado de genes informativos a partir de la Tabla V para su uso en una composición diagnóstica. Los genes seleccionados a partir de la Tabla V no necesitan estar por orden jerárquico; por el contrario, cualquier combinación que muestre claramente una diferencia entre el sujeto de prueba y los grupos comparados, es útil en dicha composición.

En otra realización de la presente composición, los genes informativos se seleccionan entre los genes identificados en la Tabla VI. La Tabla VI contiene realizaciones de 50 genes útiles como signaturas o perfiles genómicos representativos, para distinguir entre sujetos pre-quirúrgicos y post-quirúrgicos. En una realización, se generan imprimadores y sondas de PCR respecto a los 2 genes informativos de clasificación superior, es decir, los CYP2R1 y MYO5B, en la Tabla VI, para su uso en una composición diagnóstica. En otra realización más, se generan

imprimadores y sondas de OCR para los cuatro genes superiores, por ejemplo los CYP2R1, MYO5B, DGUOK y DYNLL1, a partir de la Tabla VI, para su uso en una composición diagnóstica. En una composición adicional, los oligonucleótidos o polinucleótidos, tales como imprimadores y sondas de PCR, que hibridizan o amplifican cualquier número deseado de genes informativos a partir de la Tabla VI, son útiles en una composición diagnóstica. Los genes seleccionados a partir de la Tabla VI no necesitan estar por orden jerárquico; por el contrario, cualquier combinación que muestre claramente una diferencia entre el sujeto de prueba y los grupos comparados, es útil en tal composición.

En otra realización de la presente composición, los genes informativos se seleccionan a partir de los genes identificados en la Tabla VII. La Tabla VII contiene realizaciones de 24 genes útiles como signaturas o perfiles genómicos representativos para distinguir ente sujetos con NSCLC y sujetos con nódulos de pulmón benignos. En una realización, se generan oligonucleótidos o polinucleótidos, tales como imprimadores o sondas de PCR, para la totalidad de los 24 genes informativos de la Tabla VII para su uso en una composición diagnóstica. En otra realización más, se generan imprimadores y sondas de PCR para un pequeño número de genes a partir de la Tabla VII para su uso en una composición diagnóstica. Los genes seleccionados a partir de la Tabla VII no necesitan estar por orden jerárquico; por el contrario, cualquier combinación que muestre claramente una diferencia entre el sujeto de la prueba y los grupos comparados, es útil en tal composición.

En una realización de las composiciones descritas en lo que antecede, el control de referencia es un control no sano (NHC) según se ha descrito con anterioridad. En otras realizaciones, el control de referencia puede ser cualquier clase de control según se ha descrito en lo que antecede en “Definiciones”. Una composición que contenga polinucleótidos u oligonucleótidos que hibridicen miembros del perfil de expresión genética seleccionado, preparados a partir de una selección de genes listados en estas tablas, resulta deseable no sólo a efectos de diagnóstico, sino también para monitorizar los efectos del tratamiento terapéutico quirúrgico o no quirúrgico para determinar si se mantienen los efectos positivos de la resección/quimioterapia durante un período largo después del tratamiento inicial. Estos perfiles permiten también una determinación de recurrencia o la probabilidad de recurrencia de un cáncer de pulmón, por ejemplo NSCLC, si los resultados demuestran un retorno a los perfiles de la pre-cirugía/prequimioterapia. De igual modo es probable que estas composiciones puedan ser también empleadas para su uso en la monitorización de la eficacia de las terapias no quirúrgicas para un cáncer de pulmón.

Las composiciones basadas en los genes seleccionados a partir de las Tablas I a VII descritas en la presente memoria, opcionalmente asociadas a etiquetas detectables, pueden ser representadas en formato de una tarjeta, un chip o una cámara microfluídica, o como un kit adaptado para su uso con técnicas de PCR, RT_PCR o QPCR descritas en lo que antecede. En un aspecto, un formato de ese tipo es un ensayo diagnóstico que utiliza matrices TAQMAN® Quantitative de baja densidad de PCR. Los resultados preliminares sugieren que el número de genes requeridos es compatible con estas plataformas. Cuando una muestra de PBMC procedente de un paciente seleccionado se pone en contacto con los imprimadores y sondas de la composición, la amplificación de PCR de los genes informativos objetivados del perfil de expresión genética del paciente permite la detección de cambios de expresión de los genes informativos en la PBMC del paciente a partir del perfil de expresión genética de referencia correlacionado con un diagnóstico de cáncer de pulmón cuando se utilizan composiciones dirigidas a los genes de la Tabla I o V, o de adenocarcinoma de pulmón cuando se utilizan composiciones dirigidas a los genes de la Tabla II. De forma similar, cuando una muestra de PBMC procedente de un paciente post-quirúrgico se pone en contacto con los imprimadores y las sondas de la composición, la amplificación de PCR de genes informativos objetivados elegidos entre los de las Tablas III o IV en el perfil de expresión genética del paciente, permite la detección de cambios de expresión en los genes, en el perfil de expresión genética frente a los del perfil de expresión genética de referencia. En estas circunstancias, el perfil de referencia preferido es el que se obtiene a partir del mismo paciente (o de un paciente similar) con anterioridad a la cirugía. Los cambios significativos en la expresión genética de los genes informativos de la PBMC del paciente frente al perfil de expresión genética de referencia, están correlacionados con el efecto de la cirugía, y/o con el mantenimiento del efecto positivo.

Las Tablas I a VII y la información identificadora de los genes listados en la presente memoria, se describen a continuación.

TABLA I

NOMBRE DEL GEN

Símbolo Puntuación Orden

Familia del dominio TSC22, miembro 3 (TSC22D3), variante de transcripción 2, mARN. (A)

TSC22D3 0,9522 1

quimiocina (motivo C-X-C) receptor 4 (CXCR4), variante de transcripción 1, mARN. (A)

CxCR4 0,0444 2

polipéptido claro 1, citoplásmico, de dineína, (DNCL1), mARN. (S)

DNCL1 0,8668 3

proteína ribosómica S3 (ROS3), mARN. (S)

RPS3 0,8556 4

transcripción inducible por daños de ADN 4 (DDIT4), mARN. (S)

DDIT4 08502 5

granzima B (granzima 2, estearasa de serina asociada a linfocito T

GZMB 0,8148 6

citotóxica 1) (GZMB), mARN. (S)

gen de translocación de célula B 1, anti-proliferativo (BTG1), mARN. (S)

BTG1 0,8 7

Proteína 8 de 70 kDa de choque térmico (HSPA8), variante de transcripción 1, mARN. (I)

HSPA8 0,793 8

proteína ribosómica L12 (RPL 12), mARN. (S)

RPL12 0,7564 9

adaptador a modo de Sr (SLA), mARN. (S)

SLA 0,7322 10

factor de transcripción relacionado con el tallo (RUNX3), variante de transcripción 2, mARN. (I)

RUNX3 0,7306 11

gen HGFL (MGC 17330), mARN. (S)

MGC17330 0,6982 12

Proteína 1A de 70 kDa de choque térmico (HSPA1A), mARN. (S)

HSPA1A 0,684 13

proteína accesoria receptora de interleuquina 18 (IL18RAP), mARN. (S)

IL18RAP 0,6728 14

proteína de enlace de ARN inducible por frío (CIRBP), mARN. (S)

CIRBP 0,67 15

adrenomedulina (ADM), mARN. (S)

ADM 0,662 16

proteína de enlace de CCAAT/potenciadora (E/EBP), beta (CEBPB), mARN. (S)

CEBPB 0,654 17

PREDICADO: similar a ribonucleoproteína A1 heterogénea nuclear (LOC 645385), mARN. (S)

LOC645385 0,654 18

proteína de enlace de CCAAT/potenciadora (C/EBP), delta (CEBPD), mARN. (S)

CEBDP 0,6416 19

Factor 9 de modo Kruppel (KLF9), mARN. (S)

KLF9 0,6392 20

PRONOSTICADO: proteína hipotética LOC440345, variante de transcripción 6 (LOC440345), mARN. (I)

LOC440345 0,6358 21

inhibidor de ligante de ADN 2, proteína hélice-bucle-hélice dominante (ID2), mARN. (S)

ID2 0,617 22

receptor similar a Ig de célula asesina, dos dominios, cola citoplásmica larga, 3 (KIR2DL3), variante de transcripción 2, mARN. (A)

KIR2DL3 0,6126 23

proteína de activación de araquidona 5-lipoxigenasa (ALOX5AP), mARN. (S)

ALOX5AP 0,6106 24

superfamilia de inmunoglobulina, miembro 6 (IGSF6), mARN. (S)

IGSF6 0,6068 25

Proteína 8 de 70 kDa de choque térmico (HSPA8), variante de transcripción 2, mARN. (A)

HSPA8 0,6032 27

Tubulina, alfa, ubicua (K-ALPHA-1), mARN. (S)

K-ALPHA-1 0,6002 28

proteína kinasa C, delta (PRKCD), variante de transcripción 2, mARN. (A)

PRKCD 0,5992 29

dominio de PR que contiene 1, con dominio de ZNF (PRDM1), variante de transcripción 1, mARN. (A)

PRDM1 0,594 30

antígeno CD55, factor de aceleración de decadencia para complemento (grupo sanguíneo Cromer) (CD55), mARN. (S)

CD55 0,5722 31

cistatina F (leucocistatina) (CST7), mARN. (S)

CST7 0,5698 32

marcador de diferenciación asociado a mieloide (MYADM), variante de transcripción 4, mARN. (A)

MYADM 0,568 33

complejo de histocompatibilidad mayor, clase I, F (HLA-F), mARN. (S)

HLA-F 0,568 34

proteína 2A de dominio SH2 (SH2D2A), mARN. (S)

SH2D2A 0,5656 35

dominio de tetramerización de canal de potasio que contiene 12 (KCDT12), mARN. (S)

KCDT12 0,5638 36

proteína de enlace de dominio SH3, proteína de activación de Ras-GRTPasa (G3BP), variante de transcripción 1, mARN. (A)

G3BP 0,5636 37

tipo fibrinógeno 2 (FGL2), mARN. (S)

FGL2 0,552 38

CCAAT/proteína ligante potenciadora (C/EBP), alfa (CDBPA), mARN. (S)

CEBPA 0,5368 39

homólogo DnaJ (Hsp40), subfamilia A, miembro 1 (ADN1A1), mARN. (S)

DNAJA1 0,5306 40

proteína de nivelación (filamento de actina) línea Z de músculo, alfa 2 (CAPZA2), mARN. (S)

CAPZA2 0,5244 41

Factor de transcripción general IIIA (GTF3A), mARN. (S)

GTF3A 0,523 42

dominio de IBR que contiene 2 (IBRDC2), mARN. (S)

IBRDC2 0,5228 43

gen de exonucleasa estimulado por interferón 20 kDa (ISG20), mARN. (S)

ISG20 0,5208 44

PRONOSTICADO: similar a proteína ribosómica L13a, variante de transcripción 4 (LOC649564), mARN. (A)

LOC649564 0,5134 45

receptor acoplado a proteína G 171 (GPR171), mARN. (S)

GPR171 0,5124 46

receptor similar a inmunoglobulina de célula asesina, dos dominios, cola citoplásmica larga, 4 (KIR2DL4), mARN. (S)

KIR2DL4 0,5044 47

polipéptido asociado a sin3, 30 kDA (SAP30), mARN. (S)

SAP30 0,4972 48

PRONOSTICADO: meteorina, similar a regulador de diferenciación de célula glial (METRNL), mARN. (I)

METRNL 0,4936 49

canal intracelular cloruro 3 (CLIC3), mARN. (S)

CLIC3 0,4926 50

factor 3 de iniciación de traslación eucariótica, subunidad 12 (EIF3S 12), mARN. (S)

EIF3S12 0,4912 51

Substrato 2 de receptor de insulina (IRS2), mARN. (S)

IRS2 0,4824 52

receptor celular 2 de virus de hepatitis A (HAVCR2), mARN. (S)

HAVCR2 0,4758 53

dominio de HD que contiene 2 (HDDC2), mARN. (S)

HDDC2 0,4754 54

factor 1 de exportación de ARN nuclear (NXF1), mARN. (S)

NXF1 0,468 55

perforina 1 (proteína de formación de poro) (PRF1), mARN. (S)

PRF1 0,4642 56

dominio SAM, dominio SH3 y señales de localización nuclear, 1 (SAMSN1), mARN. (S)

TSAMSN1 0,4614 57

TERF1 (TRF1)-factor de nuclear de interacción 2 (TINF2), mARN. (S)

TINF2 0,4604 58

compartimento intermedio de golgi-retículo endoplásmico (ERGIC) 1 (ERGIC 1), variante de transcriptasa 1, mARN. (I)

ERGIC1 0,4554 59

factor de necrosis tumoral, proteína inducida alfa 2 (TNFAIP2), mARN. (S)

TNFAIP2 0,455 60

factor de transcripción de gancho-AT (AKNA), mARN. (S)

AKNA 0,4548 61

proteína relacionada con diferenciación adiposa (ADFP), mARN. (S)

ADFP 0,4546 62

piruvato deshidrogenasa kinasa, isozima 4 (PDK4), mARN. (S)

PDK4 0,4538 63

factor de activación de peptidasa apoptótica (APAF1), variante de transcripción 5, mARN. (A)

APAF1 0,4486 64

transductor de señal y activador de transcripción 4. (STAT4), mARN. (S)

STAT4 0,4478 65

familia 1 de aldo-keto reductasa, miembro C3 (3-alfa hidroesteroide deshidrogenasa, tipo II), mARN. (S)

AKR1C3 0,4454 66

dominio SH2 que contiene 3C (SH2D3C), variante de transcripción 2, mARN. (I)

SH2D3C 0,4444 67

proteína 1 de 105 kDa/110 kDa de choque térmico (HSPH1), mARN. (S)

HSPH1 0,4396 68

fosfoinositida-3-kinasa, subunidad reguladora 1 (p85 alfa) (PIK3R1), variante de transcripción 2, mARN. (A)

PIK3R1 0,4312 69

presenilina asociada, similar a romboide (PSARL), mARN. (S)

PSARL 0,4284 70

desoxiguanosina kinasa, gen nuclear que codifica proteína mitocóndrica, variante de transcripción 1, mARN. (A)

DGUOK 0,4272 71

homología de pleckstrina, SEC7 y dominios arrollados en espiral, proteína ligante (PSCDBP), mARN. (S)

PSCDBP 0,4206 72

fosforilasa de uridina 1 (UPP1), variante de transcripción 2, mARN. (A)

UPP1 0,4188 73

familia portadora de soluto 35 (transportador de ácido siálico – CMP), miembro A1 (SLC35a!), mARN. (S)

SLC35A1 0,4176 74

proteína kinasa kinasa kinasa 8 activada por mitógeno (MAP3K8), mARN. (S)

MAP3K8 0,4162 75

cuadro 39 de lectura de cromosoma 15 abierto (C15orf39), mARN. (S)

C15orf39 0,411 76

proteína ribosómica L35 (RPL35), mARN. (S)

RPL35 0,4106 77

factor de intercambio de nucleótido de guanina rho/rac (GEF) 2 (ARHGEF2), mARN. (S)

ARHGEF2 0,4074 78

cuadro 37 de lectura de cromosoma 19 abierto (C19orf37), mARN. (S)

C19orf37 0,4072 79

proteína de motivo ligante de ARN 14 (RBM14), mARN. (S)

RBM14 0,4068 80

proteína hipotética MGC7036 (MGC7036), mARN. (S)

MGC7036 0,4056 81

poli(A) polimerasa alfa (PAPOLA), mARN. (S)

PAPOLA 0,4044 82

RAB 10, familia oncógena de miembro RAS (RAB10), mARN. (S)

RAB10 0,403 83

cuadro 28 de lectura de cromosoma 2 abierto (C2orf28), variante de transcripción 2, mARN. (A)

C2orf28 0,403 84

dominio LIM solamente 2 (similar a rombotina 1) (LMO2), mARN. (S)

LMO2 0,3972 85

polimerasa(ARN) III (ADN dirigido) polipéptido G (32 kDa) similar (POLR3GL), mARN. (S)

POLR3GL 0,3968 86

dedo de zinc y dominio BTB que contiene 16 (ZBTB16), variante de transcripción 1, ARN. (A)

ZBTB16 0,3948 87

factor de iniciación de traducción eucariótica 3, subunidad 5 épsilon, 47 kDa (EIF3S5), mARN. (S)

EIF3S5 0,3924 88

proteína HSCARG (HSCARG), mARN. (S)

HSCARG 0,3916 89

similar a sinaptotagmina 3 (SYTL3), mARN. (S)

SYTL3 0,3896 90

proteína hipotética FLJ32028 (FLJ32028), mARN. (S)

FLJ32028 0,3886 91

repetición rica en leucina que contiene 33 (LRRC33), mARN. (S)

LRRC33 0,3862 92

cuadro de lectura de cromosoma 1 abierto 162 (C1orf162), mARN. (S)

C1orf162 0,3846 93

citocromo P450, familia 2, subfamilia R, polipéptido 1 (CYP2R1), mARN. (S)

CYP2R1 0,3846 94

proto–oncógeno jun D (JUND), mARN. (S)

JUND 0,381 95

familia D de antígeno de melanoma, 1 (MAGED1), variante de transcripción 1, mARN. (A)

MAGED1 0,3806 96

susceptibilidad de autismo candidato 2 (AUTS2), mARN. (S)

AUTS2 0,3806 97

factor de transcripción de oligodendrocito 1 (OLIG1), mARN. (S)

OLIG1 0,379 98

factor de elongación de traducción eucariótica 1 delta (proteína de intercambio de nucleótido de guanina), variante de transcripción 1, mARN. (A)

EEF1D 0,3776 99

subfamilia K de receptor similar a lectina de célula asesina, miembro 1 (KLRK1), mARN. (S)

KLRK1 0,3736 100

TABLA II

NOMBRE DE GEN

Símbolo Puntuación Orden

homólogo 1 de oncogén E26 de virus de eritroblastosis v-ets (aviar) (ETS1), mARN. (S)

ETS1 0,9612 1

ligando 5 de quimiocina (motivo C-C) (CCL5), mARN. (S)

CCL5 0,9438 2

transcripción inducible por daños de ADN 4 (DDIT4), mARN. (S)

DDIT4 0,9024 3

receptor de quimiocina (motivo C-X-C) 4 (CXCR4), variante de transcripción 1, mARN. (A)

CXCR4 0,8098 4

polipéptido ligero, citoplásmico, de dineína 1 (DNCL1), mARN. (S)

DNCL1 0,8058 5

subfamilia A, de 4 dominios que abarca membrana, miembro 6A (MS4A6A), variante de transcripción 2, mARN. (I)

MS4A6A 0,796 6

polipéptido beta, complejo F1 mitocóndrico, transportador de H+, de ATP sintasa (ATP5B), proteína mitocóndrica de codificación de gen nuclear, mARN. (S)

ATP5B 0,7754 7

proteína de 70 kDa de choque térmico 8 (HSPA8), variante de transcripción 1, mARN. (I)

HSPA8 0,7718 8

adrenomedulina (ADM), mARN. (S)

ADM 0,7708 9

proteína tirosina fosfatasa, tipo no receptor 6 (PTPN6), variante de transcripción 3, mARN. (A).

PTPN6 0,7576 10

proteína de activación de GTPasa Rho 9 (ARHGAP9), mARN. (S)

ARHGAPg 0,7548 11

S100 proteína ligante de calcio A8 (calgranulina A) (S 100ª8), mARN. (S)

S100AB 0,7336 12

similar a dihidropirimidinasa 2 (DPYSL2), mARN. (S)

DPYSL2 0,724 13

proteína de 70 kDa de choque térmico 1A (HSPA1A). (S)

HSPA1A 0,7156 14

factor nuclear de potenciador genético de polipéptido ligero kappa en inhibidor de células B, alfa (NFKBIA), mARN. (S)

NFKBIA 0,7132 15

N-acetilglucosamina kinasa (NAGK(, mARN. (S)

NAGK 0,7098 16

superfamilia de inmunoglobulina, miembro 6 (IGSF6), mARN. (S)

IGSF6 0,7088 17

complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DM beta (HLA-DMB), mARN. (S)

HLA-DMB 0,704 18

familia con similitud de secuencia 100, miembro B (FAM100B), mARN. (S)

FAM100B 0,7016 19

miosina, polipéptido ligero 6, álcali, músculo liso y no músculo, variante de transcripción 1, mARN. (A)

MYL6 0,6962 20

familia portadora de soluto 2 (transportador de glucosa facilitado), miembro 3 (SLC2A3), mARN. (S)

SLC2A3 0,6738 21

Proteína de 70 kDa de choque térmico 8 (HSPA8), variante de transcripción 2, mARN. (A)

HSPA8 0,653 22

H2A familia de histona, miembro Z (HsAFZ), mARN. (S)

H2AFZ 0,6422 23

factor similar de Kruppel 9 (KLF9), mARN. (S)

KLF9 0,6354 24

factor de necrosis tumoral, proteína 3 alfa inducida (TNFAIP23), mARN. (S)

THFAIP3 0,6312 25

selenoproteína W, 1 (SEPW1), mARN. (S)

SEPW1 0,6164 26

nexina de clasificación 2 (SNX2), mARN. (S)

SNX2 0,609 27

fosfatasa de doble especificidad 1 (DUSP1), mARN. (S)

DUSP1 0,6076 28

cistatina F (leucocistatina) (CST7), mARN. (S)

CST7 0,5858 29

PRONOSTICADO: similar a proteína ribosómica acídica 60S P1, variante de transcripción 4 (LOC440927), mARN. (A)

LOC440927 0,5844 30

dominio PR que contiene 1, con dominio ZNF (PRDM1), variante de transcripción 1, mARN. (A)

PRDM1 0,581 31

proteína de enlace de ARN inducible por frío (CIRBP), mARN. (S)

CIRBP 0,5786 32

región de cromosoma de síndrome de ojo de gato, candidato 1 (CERC1), variante de transcripción 1, mARN. (A)

CECR1 0,575 33

complejo F1 mitocóndrico, transportador de H+, de ATP sintasa, subunidad alfa 1, músculo cardíaco (ATP5A1), proteína mitocóndrica de codificación genética nuclear, variante de transcripción 1, mARN. (A)

ATP5A1 0,5664 34

dominio LIM solamente 2 (similar a rombotina 1) (LMO2), mARN. (S)

LMO2 0,5608 35

simulador de disociación de nucleótido de guanina ral (RALGDS), mARN. (S)

RALGDS 0,5572 36

receptor acoplado a proteína G 171 (GOR171), mARN. (S)

GPR171 0,5536 37

proteína de motivo ligante de ARN 5 (RBM5), mARN. (S)

RBM5 0,5532 38

ITK

0,545 39

kinasa de célula T inducible de IL2 (ITK), mARN. (S)

CTDSP2 0,542 40

fosfatasa de CDT (dominio de terminal carboxi, polimerasa II de ARN, polipéptido A) pequeña 2, mARN. (S)

GTF3A 0,5394 41

Factor IIIA de transcripción general (GTF3A), mARN. (S)

MYADM 0,5394 42

marcador de diferenciación asociado a mieloide (MYADM), variante de transcripción 4, mARN. (A)

NALP1 0,5384 43

NACT, repetición rica en leucina y PYD (dominio de pirina) que contiene 1, variante de transcripción 4, mARN. (I)

DDX17 0,5304 44

MUERTE polipéptido de cuadro 17 (Asp-Glu-Ala-Asp) (DDX17), variante de transcripción 2, mARN. (A)

THBS1 0,5278 45

trombospondina 1 (THBS1), mARN. (S)

ALOX5 0,523 46

araquidonato 5-lipoxigenasa (ALOX5), mARN. (A)

SPOCK2 0,5186 47

proteiglicano de dominios similar a cwcv y kazal, sparc/osteonectina

MGC7036 0,5182 48

(testican) 2 (SPOCK2), mARN. (S)

Proteína hipotética MGC7036 (MGC7036), mARN. (S)

PIK3R1 0,5176 49

fosfoinositida-3-kinasa, subunidad reguladora 1 (p85 alfa) (PIK3R1) variante de transcripción 2, mARN. (A)

MNDA 0,5158 50

antígeno de diferenciación nuclear de célula de mieloide (MNDA), mARN. (S)

SLC35A1 0,5142 51

familia portadora de soluto 35 (CMP-transportador de ácido siálico), miembro A1 (SLC35A1), mARN. (S)

C19orf37 0,514 52

cuadro de lectura de cromosoma 19 abierto 37 (C19orf37), mARN. (S)

GZMM 0,5066 53

granzima M (linfocito met-ase 1), mARN. (S)

TRFC 0,5024 54

receptor de transferrina (p90, CD71) (TFRC), mARN. (S)

MLKL 0,501 55

similar a dominio de kinasa de linaje mixto (MLKL), mARN. (I)

COMMD3 0,4976 56

dominio COMM que contiene 3 (COMMD3), mARN. (S)

RAB24 0,497 57

RAB24, miembro RAS familia de oncogén (RAB24), variante de transcripción 2, mARN. (A)

LOC645385 0,4966 58

PRONOSTICADO: similar a ribonucleoproteína nuclear heterogénea A1 (LOC645385), mARN. (S)

RBM14 0,4948 59

proteína de motivo de enlace de ARN 14 (RBM14), mARN. (S)

PSCD4 0,4928 60

homología de pleckstrina, Sec7 y dominios arrollados en espiral 4 (PSCD4), mARN. (S)

ZDHHC7 0,489 61

dedo de zinc, tipo DHHC que contiene 7 (ZDHHC7), mARN. (S)

PRKCH 0,4886 62

proteína hipotética MGC11257 (MGC11257), mARN. (S)

MGC11257 0,4854 63

proteína de 105 kDa/110 kDa de choque térmico 1 (HSPH1), mARN. (S)

HSPH1 0,4812 64

receptor de retinoide X, alfa (RXRA), mARN. (S)

RXRA 0,481 65

homólogo de bicaudal D 2 (Drosofila) (BICD2), variante de transcripción 1, mARN. (A)

BICD2 0,4756 66

familia portadora de soluto 27 (transportador de ácido graso), miembro 3 (SLC27A3), mARN. (S)

SLC27A3 0,47 67

antígeno CD96 (CD96), variante de transcripción 1, mARN. (A)

CD96 0,4688 68

proteína ribosómica S2 (RPS2), mARN. (S)

RPS2 0,4662 69

substrato receptor de insulina 2 (IRS2), mARN. (S)

IRS2 0,4654 70

fosfatasa de tirosina de proteína, substrato de tipo no receptor I (PTPNS 1), mARN. (S)

PTPNS1 0,4612 71

similar a estimulador de disociación de nucleótido de guanina ral 2 (RGL2), mARN. (S)

RGL2 0,457 72

PRONOSTICADO: similar a proteína de tumor controlado traslacionalmente (TCTP) (p23) (factor de liberación de histamina) (HRF) (Fortilina) (LOC643870), mARN. (S)

LO643870 0,4566 73

MID1 proteína de interacción 1 (similar a G12 específica de gastrulación (pez cebra)) (MID1IP1), mARN. (S)

MID1IP1 0,454 74

familia portadora de soluto 7 (transportador de aminoácido catiónico, sistema y+), miembro 7 (SLC7A7), mARN. (S)

SLC7A7 0,4502 75

proteína de enlace FK506 11, 19 kDa (FKBP11), mARN. (S)

FKBP11 0,4492 76

dominio SH2 que contiene 3C (SHD3C), variante de transcripción 2, mARN. (S)

SH2D3C 0,4454 77

factor de intercambio de nucleótido de guanina rho/rac (GEF) 2 (ARHGEF2), mARN. (S)

ARHGEF2 0,4444 78

nucleoporina 62 kDa (NUP62), variante de transcripción 1, mARN. (A)

NUP62 0,4424 79

proteína hipotética FLJ20186 (FL120186), variante de transcripción 1, mARN. (I)

FLJ20186 0,438 80

ATPasa, transportador de H+, 56/58 kDa lisosómico, V1 subunidad B, isoforma 2 (ATP6V1B2), mARN. (S)

ATP6V1B2 0,436 81

homólogo de oncogén relacionado con sarcoma viral de Yamaguchi v-yes-

LYN 0,4358 82

1 (LYN), mARN. (S)

factor de necrosis tumoral, proteína inducida alfa 2 (TNFAIP2), mARN. (S)

TNFAIP2 0,433 83

ST3 beta-galactosida alfa-2,3-sialiltransferasa 1 (ST3GAL1), variante de transcripción 2, mARN. (A)

ST3GAL1 0,4318 84

similar a proteína asociada a receptor GABA(A) 1 (GABARAPL1), mARN. (S)

GABARAPL1 0,4276 85

homólogo de enzima descubierta DCP2 (S. cerevisiae) (DCP2), mARN. (S)

DCP2 0,4272 86

familia con similitud de secuencia 46, miembro A (FAM46A), mARN. (S)

FAM46A 0,4266 87

proteína ribosómica mitocóndrica L51 (MRPL51), proteína mitocóndrica que codifica gen nuclear, mARN. (S)

MRPL51 0,4256 89

similar a ligando 4 de quimiocina (motivo C-C) 1 (CCL4L1), mARN. (S)

CCL4L1 0,4208 90

proteína mitocóndrica que codifica gen nuclear, desoxiguanosina kinasa, variante e transcripción 1, mARN. (A)

DGUOK 0,4204 91

linfomas de célula T frecuentemente repetidos por adelantado 2 (FRAT2), mARN. (S)

FRAT2 0,4202 92

proteína ligante de kinasa de dominio SH3 1 (SH3KBP1), variante de transcripción 1, mARN. (I)

SH3KBP1 0,4172 93

fosfatasa de especificidad dual 2 (DUSP2), mARN. (S)

DUSP2 0,4172 94

factor de iniciación de traducción eucariótica 2B, subunidad 4 delta, 67 kDa, variante de transcripción 1, mARN. (A)

EIF2B4 0,4136 95

similar a fibrinógeno 2 (FGL2), mARN. (S)

FGL2 0,4126 96

glucosidasa, alfa; AB neutra (GANAB), variante de transcripción 2, mARN. (A)

GANAB 0,4112 97

proteína ligante de CCAAT/potenciador (C/EBP), alfa (CEBPA), mARN. (S)

CEBPA 0,41 98

policarboxipeptidasa (angiotensinasa C) (PRCP), variante de transcripción 2, mARN. (A)

PRCP 0,4046 99

succinato–CoA ligasa, formador de GDP, subunidad beta (SUCLG2), mARN. (S)

SUCLG2 0,4012 100

TABLA III

NOMBRE DE GEN

Símbolo Puntuación Orden

familia de dominio TSC22, miembro 3 (TSC22D3), variante de transcripción 2, mARN. (A)

TSC22D3 0,9522 1

receptor de quimiocina (motivo C-X-C) 4, variante de transcripción 1, mARN. (A)

CXCR4 0,9444 2

polipéptido ligero, citoplásmico, de dineína 1 (DNCL1), mARN. (S)

DNCL1 0,8668 3

proteína ribosómica S3 (RPS3), mARN. (S)

RPS3 0,8556 4

transcripción inducible por daños de ADN 4 (DDIT4), mARN. (S)

DDIT4 0,8502 5

granzima B (granzima 2, estearasa de serina asociada a linfocito T citotóxica 1) (GZMB), mARN. (S)

GZMB 0,8148 6

gen de traslocación de célula B, anti-proliferativa (BTG1), mARN. (S)

BTG1 0,8 7

proteína de 70 kDa de choque térmico 8 (HSPA8), variante de transcripción 1, mARN. (I)

HSPA8 0,793 8

proteína ribosómica L12 (RPL12), mARN. (S)

RPL12 0,7564 9

adaptador similar a Src (SLA), mARN. (S)

SLA 0,7322 10

factor de transcripción relacionado con runt 3 (RUNX3), variante de transcripción 2, mARN. (I)

RUNX3 0,7306 11

gen HGFL (MGC17330), mARN. (S)

MGC17330 0,6982 12

proteína de 70 kDa de choque térmico 1ª (HSPA1A), mARN. (S)

HSPA1A 0,684 13

proteína accesoria de receptor de interleukina 18 (IL18RAP), mARN. (S)

IL18RAP 0,6728 14

proteína de enlace de ARN inducible por frío (CIRBP), mARN. (S)

CIRBP 0,67 15

adrenomedulina (ADM), mARN. (S)

ADM 0,662 16

proteína de enlace de CCAAT/potenciador (E/EBP), beta (CEBPB), mARN. (S)

CEBPB 0,654 17

PRONOSTICADO: similar a ribonucleoproteína nuclear heterogénea A1 (LOC645385), mARN. (S)

LOC645385 0,654 18

Proteína de enlace de CCAAT/potenciador (C/EBP), delta (CEPBD), mARN. (S)

CEBPD 0,6416 19

factor similar de Kruppel 9 (KLF9), mARN. (S)

KLF9 0,6392 20

PRONOSTICADO: proteína hipotética (LOC440345), variante de transcripción 6 (LOC440345), mARN. (I)

LOC440345 0,6358 21

inhibidor de ligante de ADN 2, proteína de hélice-bucle-hélice negativa dominante (ID2), mARN. (S)

ID2 0,617 22

receptor similar a Ig de célula asesina, dos dominios, cola citoplásmica larga 3, variante de transcripción 2, mARN. (A)

KIR2DL3 0,6126 23

proteína de activación de araquidonato 5-lipoxigenasa (ALOX5AP), mARN. (S)

ALOX5AP 0,6106 24

superfamilia de inmunoglobulina, miembro 6 (IGSF6), mARN. (S)

IGSF6 0,6068 25

proteína de 70 kDa de choque térmico 8 (HSPA8), variante de transcripción 2, mARN (A)

HSPA8 0,6032 27

tubulina, alfa, ubicua (K-ALPHA-1), mARN. (S)

K-ALPHA-1 0,6002 28

proteína kinasa C, delta (PRKCD), variante de transcripción 2, mARN. (A)

PRKCD 0,5992 29

dominio de PR que contiene 1, con dominio de ZNF (PRDM1), variante de transcripción 1, mARN. (A)

PRDM1 0,594 30

antígeno CD55, factor de aceleración de decadencia para complemento (grupo sanguíneo de Cromer) (CD55), mARN. (S)

CD55 0,5722 31

cistatina F (leucocistatina) (CST7), mARN. (S)

CST7 0,5698 32

marcador de diferenciación asociado a mieloide (MYADM), variante de transcripción 4, mARN. (A)

MYADM 0,568 33

complejo de histocompatibilidad principal, clase I, F (HLA-F), mARN. (S)

HLA-F 0,568 34

proteína de dominio SH2 2ª (SH2D2A), mARN. (S)

SH2D2A 0,5656 35

dominio de tetramerización de canal de potasio que contiene 12 (KCTD12), mARN. (S)

KCTD12 0,5638 36

proteína de activación de Ras-GTPasa proteína ligante de dominio SH3 (G3BP), variante de transcripción 1, mARN. (A)

G3BP 0,5636 37

similar a fibrinógeno 2 (FGL2), mARN. (S)

FGL2 0,5552 38

proteína de enlace de CCAAT/potenciador (C/EBP), alfa (CEBPA), mARN. (S)

CEBPA 0,5368 39

homólogo de DnaJ (Hsp40), subfamilia A, miembro 1 (DNAJAI), mARN. (S)

DNAJA1 0,5306 40

proteína de nivelación (filamento de actina) línea músculo Z, alfa 2 (CAPZA2), mARN. (S)

CAPZA2 0,5244 41

factor de transcripción general IIIA (GTF3A), mARN. (S)

GTF3A 0,523 42

dominio de IBR que contiene 2 (IBRDC2), mARN. (S)

IBRDC2 0,5228 43

gen de exonucleasa estimada por interferon 20 kDa (ISG20), mARN. (S)

ISG20 0,5208 44

PRONOSTICADO: similar a proteína ribosómica L13a, variante de transcripción 4 (LOC649564), mARN. (A)

LOC649564 0,5134 45

receptor acoplado a proteína G 171 (GPR171), mARN. (S)

GPR171 0,5124 46

receptor similar a inmunoglobulina de célula asesina, dos dominios, cola citoplásmica larga, 4 (KIR2DL4), mARN. (S)

KIR2DL4 0,5044 47

Polipéptido asociado a sin3, 30 kDa (SAP30), mARN. (S)

SAP30 0,4972 48

PRONOSTICADO: similar a regulador de diferenciación de célula glial,

METRNL 0,4936 49

meteorina (METRNL), mARN. (I)

canal intracelular cloruro 3 (CLIC3), mARN. (S)

CLIC3 0,4926 50

factor de iniciación de traducción eucariótica 3, subunidad 12 (EIF3S12), mARN. (S)

EIF3S12 0,4912 51

substrato receptor de insulina (IRS2), mARN. (S)

IRS2 0,4824 52

receptor celular de virus de hepatitis A 2 (HAVCR2), mARN. (S)

HAVCR2 0,4758 53

dominio de HD que contiene 2 (HDDC2), mARN. (S)

HDDC2 0,4754 54

factor de exportación de ARN nuclear 1 (NXF1), mARN. (S)

NXF1 0,468 55

perforina 1 (proteína de formación de poro) (PRF1), mARN. (S)

PRF1 0,4642 56

señales de localización nuclear y de dominio SH3, de dominio SAM (SAMSN1), mARN. (S)

SAMSN1 0,4614 57

TERF1 (TRF1)-factor nuclear de interacción 2 (TINF2), mARN. (S)

TINF2 0,4604 58

retículo endoplásmico-compartimento intermedio de golgi (ERGIC) 1, variante de transcripción 1, mARN. (I)

ERGIC1 0,4554 59

factor de necrosis tumoral, proteína inducida alfa 2 (TNFAIP2), mARN. (S)

TNFAIP2 0,455 60

factor de transcripción de gancho AT (AKNA), mARN. (S)

AKNA 0,4548 61

proteína relacionada con diferenciación adiposa (ADFP), mARN. (S)

ADFP 0,4546 62

piruvato deshidrogenasa kinasa, isozoma 4 (PDK4), mARN. (S)

PDK4 0,4538 63

factor de activación de peptidasa apoptótica (APAF1), variante de transcripción 5, mARN. (A)

APAF1 0,4486 64

transductor de señal y activador de transcripción 4 (STAT4), mARN. (S)

STAT4 0,4478 65

familia de aldo-keto reductasa 1, miembro C3 (3-alfa hidroxiesteroide deshidrogenasa, tipo II), mARN. (S)

AKR1C3 0,4454 66

dominio SH2 que contiene 3C (SH2D3C), variante de transcripción 2, mARN. (I)

SH2D3C 0,4444 67

proteína de 105 kDa/110 kDa de choque térmico 1 (HSPH1), mARN. (S)

HSPH1 0,4396 68

fosfoinositida-3-kinasa, subunidad reguladora 1 (p85 alfa) (PIK3R1), variante de transcripción 2, mARN. (A)

PIK3R1 0,4312 69

presenilina asociada, similar a romboide (PSARL), mARN. (S)

PSARL 0,4284 70

desoxiguanosina kinasa. Proteína mitocóndrica que codifica un gen nuclear, variante de transcripción 1, mARN. (A)

DGUOK 0,4272 71

homología de pleckstrina, Sec7 y dominios arrollados en espiral, proteína de enlace (PSCDBP), mARN. (S)

PSCDBP 0,4206 72

uridina fosforilasa 1 (UPP1), variante de transcripción 2, mARN. (A)

UPP1 0,4188 73

familia portadora de soluto 35 (CMP-transportador de ácido siálico), miembro A1 (SLC35A1), mARN. (S)

SLC35A1 0,4176 74

proteína kinasa kinasa kinasa activada por mitógeno 8 (MAP3K8), mARN. (S)

MAP3K8 0,4162 75

cuando de lectura de cromosoma 15 abierto 39 (C15orf39), mARN. (S)

C15orf39 0,411 76

proteína ribosómica L35 (RPL35), mARN. (S)

RPL35 0,4106 77

factor de intercambio de nucleótido de guanina rho/rac (GEF) 2 (ARHGEF2), mARN. (S)

ARHGEF2 0,4074 78

cuadro de lectura de cromosoma 19 abierto 37 (C19orf37), mARN. (S)

C19orf37 0,4072 79

proteína de motivo de enlace de ARN 14 (RBM14), mARN. (S)

RBM14 0,4068 80

proteína hipotética MGC7036 (MGC7036), mARN. (S)

MGC7036 0,4056 81

poli(A) polimerasa alfa (PAPOLA), mARN. (S)

PAPOLA 0,4044 82

RAB 10, familia de oncogén de miembro RAS (RAB10), mARN. (S)

RAB10 0,403 83

cuadro de lectura de cromosoma 2 abierto 28 (C2orf28), variante de transcripción 2, mARN. (A)

C2orf28 0,403 84

dominio LIM solamente 2 (similar a rombotina 1) (LMO2), mARN. (S)

LMO2 0,3972 85

polimerasa (ARN) III (ADN dirigido) polipéptido G (32KD) similar (POLR3GL), mARN. (S)

POLR3GL 0,3968 86

dedo de zinc y dominio de BTB que contiene 16 (ZBTB16), variante de transcripción 1, mARN. (A)

ZBTB16 0,3948 87

factor 3 de traducción eucariótica, HSCARG subunidad 5 épsilon, 47 kDa (EIF3S5), mARN. (S)

EIF3S5 0,3924 88

proteína HSCARG (HSCARG), mARN. (S)

HSCARG 0,3916 89

similar a sinaptotagmina 3 (SYTL3), mARN. (S)

SYTL3 0,3896 90

proteína hipotética FLJ32028 (FLJ32028), mARN. (S)

FLJ32028 0,3886 91

repetición rica en leucina que contiene 33 (LRRC33), mARN. (S)

LRRC33 0,3862 92

cuadro de lectura de cromosoma 1 abierto 162 (Clorf162), mARN. (S)

Clorf162 0,3846 93

citocromo P450, familia 2, subfamilia R, polipéptido 1 (CYP2R1), mARN. (S)

CYP2R1 0,3846 94

proto–oncogén jun D (JUND), mARN. (S)

JUND 0,381 95

familia D de antígeno de melanoma, 1 (MAGED1), variante de transcripción 1, mARN. (A)

MAGED1 0,3806 96

candidato de susceptibilidad de autismo 2 (ATS2), mARN. (S)

AUTS2 0,3806 97

factor de transcripción de oligodendrocito 1 (OLIG1), mARN. (S)

OLIG1 0,379 98

factor de elongación de traducción eucariótica 1 delta (proteína de intercambio de nucleótido de guanina), variante de transcripción 1, mARN. (A)

EEF1D 0,3776 99

subfamilia K de receptor similar a lectina de célula asesina, miembro 1 (KLRK1)m mARN. (S)

KLRK1 0,3736 100

TABLA IV

Clasificadores superiores de 15 genes

Orden

TODOS/NHC AC/NHC PRE/POST

1

IGSF6 ETS1 TSC22D3

2

HSPA8(A) CCL5 CXCR4

3

LYN DDIT4 DNCL1

4

DNCL1 CSCR4 RPS3

5

HSPA1A DNCL1 DDIT4

6

DPYSL2 MS4A6A GZMB

7

NAGK ATP5B BTG1

8

HSPA8(I) HSPA8(A) HSPA8(I)

9

NFKBIA ADM RPL12

10

FGL2 PTPN6 SLA

11

CALM2 ARHGAP9 RUNX3

12

CCL5 S100AB MGC17330

13

RPS2 DPYSL2 HSPA1A

14

DDIT4 HSPA1A IL18RAP

15

C12orf63 NFKBIA CIRBP

TABLA V

ID mancha

Núm. Adhes. NOMBRE DE GEN Símbolo Orden Fold Chg

5490167

Nm_016578 proteína asociada a virus x de hepatitis B (HBXAP), mARN. (S); o alternativamente, denominado factor de remodelación y partición 1 HBXAP o RSF1 1 1,27

3890735

Num_003583 Kinasa 2 regulada por fosforilación de tirosina-(Y) de doble especificidad (DYRK2), variante de transcripción 1, mARN. (A) DYRK2 2 -1,34

3840377

NM_033430 factor de transcripción de YY1 (YY1), mARN. (S) YY1 3 -1,08

1470605

NM_001031726 lectura de cromosoma 19 abierto 12, variante de transcripción 1, mARN. (I) C19orf12 4 1,36

4230709

NM_018473 miembro 2 de superfamilia de tioesterasa (THEM2), mARN. (S) THEM2 5 -1,13

1430678

NM_007118 dominio funcional triple (interacción de PTRF) (TRIO), mARN. (S) TRIO 6 -1,16

1340086

NM_001020820 marcador de diferenciación asociado a mieloide, variante de transcripción 4, mARN. (A) MYADM 7 -1,34

2940370

NM_017450 proteína asociada a BAI1 2 (BAIAP2), variante de trascripción 1, mARN. (I) BAIAP2 8 -1,34

6400075

NM_024589 mARN de proteína de dominio de cremallera de leucina. (S); o alternativamente homólogo de Rogdi (Drosofila) FLJ22386 o ROGDI 9 -1,18

20196

NM_024920 Homólogo DnaJ (Hsp40), subfamilia B, miembro 14 (DNAJB14), variante de transcripción 2, mARN. (I) DNAJB14 10 -1,14

7330360

NM_199191 cerebro y órgano reproductivo expresado (modulador de TNFRSF1A) (BRE), variante de transcripción 3, mARN. (A) BRE 11 1,04

240280

NM_080652 proteína de transmembrana 41 A (TNMM41A), mARN. (S) TNEM41A 12 1,15

3940687

NM_032307 cuadro de lectura de cromosoma 9 abierto 64 (C9orf64), mARN. (S) Corf64 13 -1,14

4150253

NM_031424 cuadro de lectura de cromosoma 20 abierto 55, variante de transcripción 1, mARN. (A); o alternativamente, familia con similitud de secuencia 110, miembro A C20orf55 o FAM110A 14 -1,14

1660445

NM_014801 similar a pecanex 2 (Drosofila), variante de transcripción 1, mARN. (I) PCNXL2 15 1,21

4120187

NM_005612 factor de transcripción de silenciamiento de RE1 (REST), mARN. (S) REST 16 1,29

7610494

NM_014173 proteína HSPC142 (HSPC142), variante de transcripción 2, mARN. (A); o alternativamente, cuadro de lectura de cromosoma 19 abierto 62 HSPC142 o C19orf62 17 1,10

4250121

NM_138779 proteína hipotética BC015148 (LOC93081), mARN. (S); o alternativamente, cuadro de lectura de cromosoma 13 abierto 27 LOC93081 o C13orf27 18 -1,18

4810674

NM_022091 subunidad 3 compleja de co-integrador de señal de activación 1(ASCC3), variante de transcripción 2, mARN. (A) ASCC3 19 1,83

3460224

NM_005628 familia portadora de soluto 1 (transportador de aminoácido neutro), miembro 5 (SLC1A5), mARN. (S) SLC1A5 20 -1,16

1110110

NM_016395 dominio de fosfatasa-A de tirosina de proteína que contiene 1, mARN. (A) PTPLAD1 21 -1,22

2630397

NM_005590 homólogo A de recombinación meiótica 11 de MRE11 (S. cerevisiae) (MRE11A), variante de transcripción 2, mARN. (A) MRE11A 22 -1,18

1400541

NM_033107 proteína hipotética (DKFZP688A10121), mARN. (S); o alternativamente, proteína de enlace de GTP 10 (putativa), variante de transcripción 2 DKFZP686A 10121 o GTPBP10 23 -1,27

4390100

BX118737 cADN de hígado bazo fetal 1NFLS de Soares BX118737, clon IMACrp998K18127, secuencia de mARN (S) NaN 24 -1,40

1500246

NM_006217 inhibidor de peptidasa de serpina, subtipo I (pancpina), miembro 2 (SERPINI2), variante de transcripción 2, mARN. (S) SERPINI2 25 -1,41

6590377

AK 126342 FLJ44370 fis de cADN, clon TRACH3008902; o alternativamente, proteína de enlace de elemento de respuesta de CAMP 1 NaN o CREB1 26 -1,45

3710754

NM_016053 dominio arrollado en espiral que contiene 53 (CCDC53), mARN. (S) CCDC53 27 -1,07

990112

NM_032236 peptidasa específica de ubiquitina 48 (USP48), variante de transcripción 1, mARN. (I) USP48 28 -1,17

2640255

NM_001007072 dedo de zinc y dominio SCAN que contiene 2, variante de transcripción 3, mARN (I) ZSCAN2 29 1,18

2370482

NM_024754 dominio de repetición de pentatricopéptido 2 (PTCD2), mARN. (S) PTCD2 30

6380040

NM_025201 dominio de homología de pleckstrina que contiene familia Q miembro 1 mARN. (S) PLEKHQ1 31

6370338

AW191734 secuencia (S) de mARN, cADN de visualización diferencial de cADN de isleta humana de HIMC10.07.00 NaN 32

5340544

NM_002616 homólogo de período 1 (Drosofila) (PER1), mARN. (S) PER1 33

5910367

NM_012154 factor 2C de iniciación de traducción eurocariótica, 2 (EIF2C2), mARN. (S) EIF2C2 34

2570440

NM_022128 ribokinasa (RBKS), mARN. (S) RBKS 35

6100707

NM_002419 kinasa kinasa kinasa de proteína activada por mitogén, maRN. (S) MAP3K11 36

2490615

NM_207443 proteína FLJ45244 (FLJ5244), mARN. (S) FLJ5244 37

6580368

NM_006611 subfamilia A de receptor similar a lectina de célula asesina, mARN. (S) KLRA1 38

4570553

NM_016282 adenilato kinasa 3 (AK3), mARN. (S) AK3 39

5130500

BG741535 IMAGEN de clon de cADN 602635144F1 NCI_CGAP_Skn3: 4780090 5, secuencia de mARN. (S) NaN 40

1240026

NM_001003941 oxoglutarato (alfa-ketoglutarato) deshidrogenasa (lipoamida), proteína mitocóndrica de codificación de gen nuclear, variante de transcripción 2, mARN. (I) OGDH 41

2680593

NM_006582 proteína de enlace de elemento modulador de glucocorticoide 1 (GMEB1), variante de transcripción 1, mARN. (A) GMEB1 42

130403

NM_006567 fenilalanina–tARN sintetasa 2 (mitocóndrica) (FARS2), proteína mitocóndrica de codificación de gen nuclear, mARN. (S) FARS2 43

1710338

NM_170768 homólogo de proteína 91 de dedo de zinc (ratón), variante de transcripción 2, mARN. (A) ZFP91 44

150021

NM_013285 similar a proteína de enlace de nucleótido de guanina (nucleolar) (GNL2), mARN. (S) GNL2 45

4250703

XM_498909 PTRONOSTICADO: hipotética LOC440900 (LOC440900), mARN. (S) LOC440900 46

7000731

NM_020453 ATPasa, Clase V, tipo 10D (ATP10D), mARN, (S) ATP10D 47

4590563

XM_942240 PRONOSTICADO: similar a antígeno de histocompatibilidad HLA clase II, DQ (W1.1) precursor de cadena beta (DQB1 *0501), variante de transcripción 1 (LOC650557), mARN. (A) LOC650557 48

3310446

NM_018169 Cuadro de lectura de cromosoma 12 abierto 35 (C12orf35), mARN. (S) C12orf35 49

3460066

XM_932088 PRONOSTICADO: proteína hipotética LOC642788, variante de transcripción 2 (LOC642788), mARN. (A) LOC642788 50

160152

NM_003789 TNFRSF1A asociada a través de dominio de muerte, variante de transcripción 1, mARN. (A) TRADD 51

840379

NM_031212 familia portadora de soluto, miembro 28 (SLC25A28), mARN. (S) SLC25A28 52

405402

B459101 BX459101 cADN de placenta clon CSODE012YP17 5-PRIME, secuencia (S) de mARN NaN 53

3440441

AK124002 cADN FLJ42008 fis, clon SPLEN2031724 (S) NaN 54

5390504

NM_001165 IAP baculovírico repetición que contiene 3, variante de transcripción 1, maRN. (I) BIRC3 55

5490564

XM_940798 PRONOSTICADO: similar a factor 1 de transición asociado a Bcl-2 (Btf), variante de transcripción 1 (LOC650759), mARN. (I) LOC650759 56

1940220

XM_940538 PRONOSTICADO: similar a fosfatasa de tirosina de proteína, dominio A que contiene 1 (PTPLAD1), mARN. (A) PTPLAD1 57

770221

NM_005950 metalotioneína 1G (MTG1G), mARN. (S) MT1G 58

1500647

NM_005665 sitio 5 de integración vírica ecotrópica (EVI5), mARN. (S) EVI5 59

5900730

NM_005813 proteína kinasa D3 (PRKD3), mARN. (S) PRKD3 60

1980689

NM_024029 familia de dominio Yip1, miembro 2 (YIPF2), mARN. (S) YIPF2 61

770253

NM_024076 canal de potasio que contiene dominio KCTD15 62

de tetramerización 15, mARN. (S)

2260484

NM_022070 amplificado en cáncer de pecho 1 (ABC1), mARN. (S) ABC1 63

380561

NM_020773 familia de dominio TBC1, miembro 14 (TBC1D14), mARN (S) TBC1D14 64

780576

NM_014238 supresor de kinasa de ras I, mARN. (S) KSR1 65

240292

BG564169 clon de cADN 602590145F1 NIH_MGC_76, IMAGEN: 4724074 5, mARN secuencia (S) NaN 66

6590021

NM_024804 proteína de dedo de zinc 669 (ZNF669), mARN. (S) ZNF669 67

6330471

NM_005337 cuadro de lectura de cromosoma 8 abierto 1 (C8orf1), mARN. (S) C8orf1 68

3170398

NM_000747 receptor colinérgico, nicotínico, beta 1 (músculo) (CHRNB1), mARN. (S) CHRNB1 69

3170477

NM_001004489 receptor olfativo, familia 2, subfamilia AG, miembro 1, mARN. (S) OR2AG1 70

2510563

NM_024874 similar a KIAA0319 (KIAA0319L), variante de transcripción 1, mARN. (I) KIAA0319L 71

2510280

NM_015106 similar a RAD54 2 (S. cerevisiae) (RAD54L2), mARN. (S) RAD54L2 72

670685

NM_003557 fosfatidilinositol-4- fosfato 5-kinasa, tipo I, alfa, mARN. (S) PIP5K1A 73

4230736

NM_001329 proteína de enlace de terminal-C 2 (CTBP2), variante de transcripción 1, mARN. (I) CTBP2 74

7510164

XM_938545 PRONOSTICADO: similar a proteína 3 de enlace de formina 3 (proteína de enlace de formina 11) (FBP 11), variante de transcripción 1, (LOC648039), mARN. (I) LOC648039 75

4210576

NM_022490 factor asociado a polimerasa I (RNA) 1 (PRAF1), mARN. (S) PRAF1 76

5910376

NM_003246 trombospondina 1 (THBS 1), mARN. (S) THBS1 77

2480202

NM_006933 familia portadora de soluto 5 (transportadores de inositol), miembro 3, mARN. (S) SLC5A3 78

5960035

NM_170699 receptor de ácido biliar acoplado a proteína G 1 (GPBAR1), mARN. (S) GPBAR1 79

5290192

CR616845 clon de cADN de longitud completa CS0DF020Y de cerebro fetal de (humano) (S) NaN 80

1170301

NM_014572 LATS, supresor de tumor grande, homólogo 2 (Drosofila), mARN. (S) LATS2 81

2340224

NM_181724 proteína de transmembrana 119 (TMEM119), maRN. (S) TMEM119 82

4210008

NM_022168 interferón inducido con dominio de helicasa C 1 (IFIH1), mARN. (S) IFIH1 83

3060563

CD639673 clon de cADN AGENCOURT_14534956 NIH_MGC_191, IMAGEN: 30418908 5, mARN secuencia (S) NaN 84

7320600

AK123531 cADN FLJ41537 fis, clon BRTHA2017985 (S) NaN 85

520097

NM_003541 histona 1, H4k (HIST1H4K), mARN. (S) HIST1H4K 86

5270315

NM_001240 ciclina T1 (CCNT1), mARN. (S) CCNT1 87

2690008

BC025734 Homo sapiens, clon IMAGEN: 5204729, mARN. (S) NaN 88

110044

NM_001001795 similar a clon C030006K11 de RIKEN cADN (MGC70857), mARN. (S) MGC70857 89

2030487

BX118124 clon de cADN de BX118124 Soares_parathyroid_tumor_Nb HPA IMAGp998P234189, mARN secuencia (S) NaN 90

1170139

NM_033141 proteína activada por mitógeno kinasa kinasa kinasa 9 (MAP3K9, mARN. (S) MAP3K9 91

1190300

NM_15353 Canal potasio que contiene dominio de tetramerización 2, mARN. (I) KCTD2 92

4760543

NM_153719 nucleoporina 62 kDa (NUP62), variante de transcripción 1, mARN. (A) NUP62 93

7150564

NM_003171 Similar a supresor de var1, 3 (S. cerevisiae) 1 (SUPV3L1), mARN. (S) SUPV3L1 94

5820475

NM_002690 polimerasa (dirigida a ADN) beta (POLB), mARN. (S) POLB 95

870563

N_014710 proteína de clasificación de receptor acoplado a proteína G 1, mARN. (S) GPRASP1 96

4640202

AW962976 re-secuencias EST375049 MAGE, MAGH cADN, mARN secuencia (S) NaN 97

4250332

XM_932676 PRONOSTICADO: similar a Gammaglutamiltranspeptidasa 1 precursor (Gamma-glutamiltransferasa 1) (CD224 antígeno), variante de transcripción 3 (LOC645367), mARN. (I) LOC645367 98

2570017

NM_023034 similar a candidato I de síndrome de Wolf-Hirschhom 1 (WHSC1L1), variante de transcripción larga, mARN. (I) WHSCIL1 99

3390458

NM_002243 rectificación interior de canal de potasio, subfamilia J, miembro 15 (KCNJ15), variante de transcripción 1, mARN. (A) KCNJ15 100

5360053

XM_926644 PRONOSTICADO: similar a componente de 240 kDa de complejo de proteína asociado a receptor de hormona de tiroides (Trap240) (proteína asociada a receptor de hormona de tiroides 1) (componente DRIP250 complejo de proteína de interacción con receptor de vitamina D3) (DRIP 250) (co-factor reclutado por activador ... (LOC643296)), mARN. (S) LOC643298 101

6760653

XM_935750 PRONOSTICADO: similar a proteína Elk1 de dominio de ETS (LOC641976), mARN. (S) LOC641976 102

3800615

NM_080549 proteína tirosina fosfatasa, no-receptor tipo 6 (PTPN6), variante de transcripción 3, mARN. (I) PTPN6 103

5310452

NM_153645 Nucleoporina 50 kDa (NUP50), variante de transcripción 3, mARN. (A) NUP50 104

3850288

XM_934211 PRONOSTICADO: similar a homólogo proteína de biogénesis de ribosoma BMS 1, variante de transcripción 2 (LOC653471), mARN. (I) LOC653471 105

7560538

NM_153209 miembro 19 de familia de kinesina (KIF19), mARN. (S) KIF19 106

6250338

NM_152371 cuadro de lectura de cromosoma 1 abierto 93 (C1orf93), maRN. (S) C1orf93 107

3360382

NM_001625 adenilato kinasa 2 (AK2), variante de transcripción AK2A, maRN. (A) AK2 108

6960564

NM_030934 cuadro de lectura de cromosoma 1 abierto 25 (C1orf25), mARN. (S) C1orf25 109

1820131

XM_945571 PRONOSTICADO: familia de dominio 13 de repetición de anquirina, miembro D, variante de transcripción 7 (ANKRD13D), mARN. (I) ANKRD13D 110

3850255

NM_001238 ciclina E1 (CCNE1), variante de transcripción 1, mARN. (A) CCNE1 111

990523

NM_006799 proteasa, serina, 21 (testisina), variante de transcripción 1, mARN. (A) PRSS21 112

4280577

NM_006749 Familia portadora de soluto 20 (transportador de fosfato), miembro 2, mARN. (S) SCL20A2 113

7160368

BC039681 Homo sapiens, clon IMAGEN: 5218705, mARN. (S) NaN 114

6020500

NM_024923 nucleoporina 210 kDa (NUP210), mARN. (S) NUP210 115

2360253

NM_007041 arginiltransferasa 1 (ATE1), variante de transcripción 2, mARN. (I) ATE1 116

160372

NM_006761 proteína de activación de tirosina 3monooxigenasa/triptofan 5monooxigenasa, polipéptido épsilon (YWHAE), mARN. (I) YWHAE 117

3370170

BX093763 cADN BX093763 Soares_fetal_heart_NbHH 19 W, clon IMAGp998N10870, mARN secuencia (S) NaN 118

60546

AK057981 cADN FLJ25252 fis, clon STM03814 (S) NaN 119

1710411

XM_374029 PRONOSTICADO: LOC389089 hipotética (LOC389089), mARN (S) NaN 120

6900315

NM_017958 familia B (evectinas), que contiene dominio de homología de pleckstrina, miembro 2 (PLEKHB2), variante de transcripción 2, mARN. (I) PLEKHB2 121

1240603

NM_000887 integrina, alfa X (subunidad de componente 3 de complemento, receptor 4), mARN. (I) ITGAX 122

60707

NM_001119 aducina 1 (alfa) (ADD1), variante de transcripción 1, maRN. (A) ADD1 123

7160707

NM_198285 proteína hipotética LOC349136 (LOC349136), mARN. (S) LOC349136 124

2970332

NM_006328 proteína de motivo de enlace de ARN 14 (RBM14), mARN. (S) RBM14 125

2760433

NM_173564 proteína hipotética FLJ37538 (FLJ37538), mARN. (S) FLJ37538 126

580041

NM_001252 superfamilia de factor de necrosis de tumor (ligando), miembro 7, mARN. (S) TNFS7 127

4120133

NM_022827 espermatogénesis asociada 20 (SPATA20), mARN. (S) SPATA20 128

6560647

NM_018696 homólogo elaC, 1 (E. coli) (ELAC1), ELAC1 129

mARN. (S)

4180195

NM_001001520 proteína relacionada con factor de crecimiento derivado de hepatoma 2 (HDGF2), variante de transcripción 1, ARN. (A) HDGF2 130

6650020

NM_001124 adrenomedulina (ADM), mARN. (S) ADM 131

2570364

NM_020847 repetición de nucleótido que contiene 6A, variante de transcripción 2, mARN. (I) TNRC6A 132

1850682

NM_015530 proteína de apilamiento de montaje de golgi 2, 55 kDa (GORASP2), mARN. (S) GORASP2 133

50414

NM_006973 proteína de dedo de zinc 32 (KOX 30) /ZNF32), variante de transcripción 1, mARN. (A) ZNF32 134

7200373

NM_194310 proteína hipotética LOC284837 (LOC284837), mARN. (S) LOC284837 135

3940215

NM_015453 dominio que contiene THUMP 3 (THUMPD3), mARN. (S) THUMPD3 136

TABLA VI

Orden

ID-Mancha Illumina Núm. Acc. Nombre Símbolo valor-p POS/PRE fold chg

1

3370291 NM_024514 Citocromo P450, familia 2, subfamilia R, polipéptido 1 CYP2R1 0,00000 -1,39

2

6660437 NM_006111 Acetil-Coenzima A acetiltransferasa 2 MYO5B 0,00001 -1,34

3

6380402 NM_080915 desoxiguanosina kinasa (DGUOK), proteína mitocóndrica de codificación de gene nuclear, variante de transcripción 5, mARN. (I) DGUOK 0,00000 -1,82

4

1990500 NM_003746 Dineína, cadena ligera, tipo LC8 1 DYNLL1 0,00002 1,38

5

150048 NM_052873 Cuadro de lectura de cromosoma 14 abierto 179 C14orf179 0,00001 -1,30

6

2230731 NM 017745 co-represor BCL6 BCOR 0,00002 1,35

7

270070 BF448693 clon de cADN 7N93B04.X1 NCI.. CGAP_Ov18 IMAGEN:3571927 3, mARN secuencia (S) NaN 0,00001 -1,57

8

6560482 NM_001280 Proteína de enlace de ARN inducible en frío CIRBP 0,00000 -1,35

9

2970332 NM_006328 Proteína de motivo de enlace de ARN 14 RBM14 0,00006 1,25

10

3890682 NM_003975 Proteína de dominio de SH2 2A SH2D2A 0,00000 -1,66

11

6560349 NM_018425 Fosfatidilinositol 4-kinasa tipo 2 alfa P14K2A 0,00005 1,37

12

1710411 XM_374029 PRONOSTICADO: LOC389089 hipotética, mARN. (S) NaN 0,00007 -1.4.4

13

1660019 NM_001876 Palmitoiltransferasa de carnitina 1A (hígado) CPT1A 0,00003 -1,33

14

2680161 NM_006584 TCP1 que contiene chaperonina, subunidad 6B CCT6B 0,00002 -1,58

(zeta 2)

15

4060270 BC009563 Homo sapiens, clon IMAGEN: 3901628, mARN. (S) NaN 0,00006 -1,38

16

2650152 NM_020698 Transmembrana y dominio arrollado en espiral, familia 3 TMCC3 0,00014 -1,86

17

20451 NM_148976 Subunidad de proteasoma (prosoma, macropain), tipo alfa, 1 PSMA1 0,00040 -1,49

18

6220672 NM_001031711 Retículo endoplásmicocompartimento intermedio de golgi 1 ERGIC1 0,00055 -1,35

19

6840017 XM_941287 PRONOSTICADO: familia portadora de soluto 25 (carnitina/acilcarnitina translocasa), miembro 20 (SLC25A20), mARN. (A) SLC25A20 0,00159 -1,24

20

870709 NM_006133 Diacilglicerol lipasa, alfa DAGLA 0,00086 1,40

21

5860148 NM 007320 Proteína de enlace de ARN 3 RANBP3 0,00179 -1,38

22

20707 NM_207584 Receptor de interferón (alfa, beta y omega) 2 IFNAR2 0,00025 -1,25

23

5900156 NM 006082 Tubulina, alfa 1b TUBA1B 0,00268 1,13

24

6480170 NM_001005333 Familia D antígena de melanoma, 1 MAGED1 0,00001 -1,27

25

4010605 NM_001008739 Similar a RIKEN cADN 2310039H09 LOC441150 0,00007 -1,24

26

7210192 NM_003123 Sialoforina (leukosialina, CD43) SPN 0,00014 -1,89

27

4260148 X_371534 PRONOSTICADO: similar a CG10806-PB, isoforma B, mARN. (A) LOC389000 0,00075 -1,33

28

6560020 NM_017651 Sitio de integración asistente de Abelson 1 AHI1 0,00379 -1,33

29

6480661 NM_002255 Receptor similar a Ig de célula asesina, dos dominios, cola citoplásmica larga, 4 KIR2DL4 0,00117 -2,02

30

650753 NM_006712 Serina/treonina kinasa activada por Fas FASTK 0,00003 -1,40

31

1230528 NM_006644 Proteína de 105 kDa/110 kDa de choque térmico 1 HSPH1 0,00006 1,47

32

6420086 NM_001539 Homólogo de DnaJ(Hsp40), subfamilia A, miembro 1 DNAJA1 0,00009 1,26

33

4120092 NM_018244 Chaperona compleja de c reductasa de ubiquinolcitocromo, homólogo de CBP3 (levadura) UQCC 0,00286 -1,40

34

4250438 NM_M5267 Cuadro de lectura de cromosoma 6 abierto 57 6orf57 0,00188 -1,15

35

5860477 NM_005226 Receptor de espingosina-1fosfato 3 S1PR3 0,00017 1,69

36

5910037 NM_182757 Dedo anular 144B RNF144B 0,00000 -1,97

37

6020707 NM_003416 Proteína de dedo de zinc 7 ZNF7 0,00023 -1,14

38

4260497 NM_018179 Activación de proteína de interacción de factor 7 de transcripción ATF7IP 0,00092 1,40

39

2760068 NM_005489 Dominio SH2 que contiene 3C SH2D3C 0,00007 1,34

40

6250056 NM_152832 Familia con similitud de secuencia 89, miembro B FAM89B 0,00043 1,21

41

6040273 BX115698 Clon de cADN BX115698 Soares_testis_NHT IMAGo998M211829, mARN secuencia (S) NaN 0,00031 -1,37

42

1990100 XM_930024 PRONOSTICADO: proteína hipotética LOC132241, variante de transcripción 2 (LOC32241), mARN. (A) LOC 132241 0,00005 -1,21

43

264066 NM_001008910 Serina/treonina kinasa 16 STK16 0,00000 -1,90

44

770605 NM_145271 Proteína de dedo de zinc 688 ZNF688 0,00000 -1,56

45

7200356 NM 001008541 Interactor MAX 1 MXI1 0,00192 1,55

46

1690709 NM_024815 Motivo de tipo Nudix (difosfato nucleósido enlazado a porción X) 18 NUDE18 0,00167 -1,20

47

100743 NM_004089 Familia de dominio TSC22, miembro 3 TSC22D3 0,00003 -1,40

48

2100201 NM_015558 Gen de translocación de sarcoma sinovial sobre cromosoma 18 similar 1 (SS18L1), variante de transcripción 2, maRN. (A) SS18L1 0,00008 1,19

49

1820209 NM_001659 Factor de ribosilación de ADP 3 ARF3 0,00090 1,19

50

1780762 NM_032847 Cuadro de lectura de cromosoma 8 abierto 76 C8orf76 0,00037 -1,15

TABLA VII

#

Orden ID Núm. Acc. Descripción Nombre de Gen Símbolo Valor-p Fold Chg

1

4880431 NM_181738 Peroxirredoxina 2 PRDX2 0,00000 1,42

2

16 4120187 NM_005612 Factor de transcripción de silenciamiento de RE-1 REST 0,00034 1,40

3

4590563 XM_942240 PRONOSTICADO: similar a antígeno de histocompatibilidad clase II, DQ(W1.1) precursor de cadena beta (DQB1*0501), variante de transcripción 1 LOC650557 0,00042 -2,41

4

7210129 NM_178025 Similar a gammaglutamiltransferasa 3 (GGTL3), variante de transcripción 2 GGTL3 0,00018 1,35

5

19 4810674 NM_022091 Activar subunidad 3 compleja de cointegrador de señal 1 ASCC3 0,00274 1,73

6

4280722 NM_005481 Subunidad compleja de mediador 16 MED16 0,00027 1,22

7

23 1400541 NM_033107 Proteína de enlace de GTP 10 (putativa) GTPBP10 0,00559 -1,26

8

1190022 NM_176895 Fosfatasa de ácido fosfatídico tipo 2A PPAP2A 0,00355 1,20

9

3060692 NM_001010935 RAP1A, miembro de RAP1A 0,00018 -1,35

la familia de oncogén RAS

10

2570440 NM_022128 Cerebro y órgano reproductivo expresado (modulador de TNFRSF1A) BRE 0,00282 1,10

11

4060138 XM_941904 PRONOSTICADO: similar a regulador transcripcional ATRX (helicasa II con enlace X) (proteína nuclear con enlace X) (XNP) LOC652455 0,00029 1,47

12

6180296 NM_001017969 KIAA2026 KIAA2026 0,00028 -1,15

13

1430292 NM_000578 Familia portadora de soluto 11 (transportadores de ion de metal divalente acoplado a protón), miembro 1 SLC11A1 0,00006 -1,41

14

110112 NM_005701 Snurportin 1 SNUPN 0,00033 -1,17

15

6330471 NM_004337 Familia de inhibidor de crecimiento inducido de fatiga oxidativa, miembro 2 QSGIN2 0,00204 -1,09

16

5050019 XM_945607 PRONOSTICADO: paraplejia espástica 21 (recesiva autosómica, síndrome de Mast), variante de transcripción 3 (SPG21), mARN SPG21 0,2419 1,13

17

4 1470605 NM_001031726 Cuadro de lectura de cromosoma 19 abierto 12 C19orf12 0,00382 1,43

18

6620224 NM_001024662 Proteína ribosómica L6 RPL6 0,00350 -1,03

19

4250133 NM_005188 Secuencia de transformación retroviral ecotrópica de Cas-Br-M (murina) CBL 0,00001 -1,18

20

9 6400075 NM_024589 Homólogo de Rogdi (Drosofila) ROGDI 0,00023 1,32

21

6580419 NM_001015880 3’-fosfoadenosina 5’fosfosulfato sintasa 2 PAPSS2 0,00341 -1,34

22

8 2940370 NM_017450 Proteína asociada a BAI1, 2 BAIAP2 0,00046 -1,38

23

3360026 NM_017911 Familia con similitud de secuencia 118, miembro A FAM118A 0,01598 1,94

24

6 1430678 NM_007118 Dominio funcional triple (interacción de PTPRF) TRIO 0,00001 -1,31

Para su uso en las composiciones indicadas en lo que antecede, los imprimadores y sondas de PCR están preferentemente diseñados en base a secuencias de intrón presentes en el (los) gen(es) que va(n) a ser

35 10

amplificado(s), seleccionado(s) a partir del perfil de expresión genética. El diseño de las secuencias de imprimador y de sonda está dentro del alcance del experto en la materia una vez que ha sido seleccionado el objetivo genético particular. Los métodos particulares seleccionados para el diseño de imprimador y de sonda y las secuencias particulares de imprimador y de sonda no son características limitadoras de estas composiciones. Una explicación rápida de técnicas de diseño de imprimador y de sonda disponibles para los expertos en la materia está resumida en la Patente US núm. 7.081.340, con referencia a herramientas públicamente disponibles tales como el software DNA BLAST, el programa Repeat Masker (Colegio Baylor de Medicina), Primer Express (Biosistemas Aplicados); MGB assay-by-design (Biosistemas Aplicados); Primer3 (Steve Rozen y Helen J. Skaletsky (2000) Primer3 en la WWW para usuarios en general y para programadores biólogos85 y otras publicaciones86, 87, 88 .

En general, los imprimadores y sondas de PCR óptimos usados en las composiciones descritas en la presente memoria son en general de 17-30 bases de longitud, y contienen aproximadamente un 20-80%, tal como por ejemplo aproximadamente un 50-60%, de bases G+C. Las temperaturas de fusión de entre 50 y 80 ºC, por ejemplo de alrededor de 50 a 70 ºC, son típicamente las preferidas.

En un aspecto, una composición para el diagnóstico de cáncer de pulmón en un mamífero contiene una pluralidad de polinucleótidos inmovilizados sobre un substrato, en el que la pluralidad de sondas genómicas hibridizan a tres o más productos de expresión genética de tres o más genes informativos seleccionados a partir de un perfil de expresión genética de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) del sujeto, comprendiendo el perfil de expresión genética genes seleccionados a partir de la Tabla I hasta la Tabla VII. Este tipo de composición se basa en el reconocimiento de los mismos perfiles genéticos que se han descrito en lo que antecede para las composiciones de PCR, pero emplea las técnicas de una matriz de cADN. La hibridación de los polinucleótidos inmovilizados en la composición respecto a los productos de expresión de gen presentes en la PBMC del paciente, se emplea para cuantificar la expresión de los genes informativos seleccionados a partir de los genes identificados en las Tablas I a VII para generar un perfil de expresión genética para el paciente, el cual se compara a continuación con el de una muestra de referencia. Según se ha descrito en lo que antecede, dependiendo de la identificación del perfil (es decir, el de los genes de la Tabla I, II, III, IV, V, VI o VII o subconjuntos de los mismos), esta composición permite la diagnosis y la prognosis de cánceres de pulmón de NSCLC. De nuevo, la selección de las secuencias de polinucleótido, sus longitudes y etiquetas utilizadas en la composición, son determinaciones rutinarias realizadas por un experto en la materia a la vista de las enseñanzas de qué genes pueden formar los perfiles de expresión genética adecuados para la diagnosis y la prognosis de cánceres de pulmón.

La composición, que puede ser presentada en el formato de una tarjeta micro-fluídica, una micro-matriz, un chipo o una cámara, emplea las técnicas de hibridización de polinucleótido descritas en la presente memoria. Cuando una muestra de una PBMC procedente de un sujeto seleccionado se pone en contacto con las sondas de hibridización de las composiciones, la amplificación de PCR de los genes informativos objetivados en el perfil de expresión genética del paciente permite la detección y la cuantificación de cambios de expresión en los genes del perfil de expresión genética respecto a la de un perfil de expresión genética de referencia. Los cambios significativos en la expresión genética de los genes informativos en la PBMC del paciente respecto a los de un perfil de expresión genética de referencia, están correlacionados con una diagnosis de cáncer de pulmón de célula no pequeña (NSCLC).

Según otro aspecto más, una composición o un kit útiles en los métodos descritos en la presente memoria, contienen una pluralidad de ligandos que enlazan tres o más productos de expresión genética de tres o más genes informativos seleccionados a partir de un perfil de expresión genética en las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) del sujeto. El perfil de expresión genética contiene los genes de cualquiera de las Tablas I a VII, según se ha descrito en lo que antecede para las otras composiciones. Esta composición permite la detección de las proteínas expresadas por los genes en las Tablas indicadas. Aunque preferentemente los ligandos son anticuerpos para las proteínas codificadas por los genes en el perfil, puede resultar evidente para un experto en la materia que se pueden usar varias formas de anticuerpo, por ejemplo, policlonal, monoclonal, recombinante, quimérico, así como fragmentos y componentes (por ejemplo, CDRs, regiones variables de cadena simple, etc.), en lugar de los anticuerpos. Tales ligandos pueden estar inmovilizados sobre substratos adecuados para su contacto con la PBMC del paciente, y analizados de una forma convencional. En ciertas realizaciones, los ligandos están asociados a etiquetas detectables. Estas composiciones permiten también la detección de cambios en proteínas codificadas por los genes en el perfil de expresión genética respecto a los de un perfil de expresión genética de referencia. Tales cambios se correlacionan con cáncer de pulmón, por ejemplo NSCLC, o con la diagnosis de la fase de desarrollo o del tipo de cáncer, o con el estado y la prognosis pre/post quirúrgica, de una manera similar a la de la PCR y las composiciones que contienen nucleótido descritas en lo que antecede.

Según un aspecto adicional más, una composición útil puede contener una pluralidad de productos de expresión genética de tres o más genes informativos seleccionados a partir del perfil de expresión genética en las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) del sujeto inmovilizadas sobre un substrato para la detección o la cuantificación de anticuerpos en las proteínas codificadas por los genes de los perfiles en la PBMC de un sujeto. Los perfiles de expresión genética incluyen genes seleccionados a partir de cualquiera de las Tablas I a VII, o subconjuntos de los mismos, tal como el clasificador de 29 genes de la Tabla V (genes clasificados de 1-29). Este tipo de composición, dirigida a la detección de anticuerpos con respecto a los productos de los genes, es también útil

para identificar y detectar cuantitativamente cambios en la expresión de los genes en el perfil de expresión genética respecto a los de un perfil de expresión genética de referencia por las mismas razones identificadas en lo que antecede para las composiciones PCR/contenedoras de nucleótido. Al igual que con las otras composiciones, este tipo de composición correlaciona los niveles de expresión de las proteínas codificadas por los genes informativos de las PBMCs del paciente con los de un control de referencia. Los cambios significativos que son indicativos de una diagnosis de cáncer de pulmón, son útiles para la monitorización de una intervención quirúrgica/terapéutica en la enfermedad, y/o para proporcionar una diagnosis de la misma.

Para todas las formas anteriores de composiciones de diagnóstico/pronóstico, el perfil de expresión de gen puede, en una realización, incluir al menos los primeros 5 de los genes informativos de las Tablas I a VII o subconjuntos de los mismos. En otra realización para todas las formas anteriores de composiciones de diagnóstico/pronóstico, el perfil de expresión de gen puede incluir 10 o más de los genes informativos de cualquiera de las Tablas I a VII o subconjuntos de los mismos. En otra realización para todas las formas anteriores de composiciones de diagnóstico/pronóstico, el perfil de expresión genética puede incluir 15 o más de los genes informativos de cualquiera de las Tablas I a VII o subconjuntos de los mismos. En otra realización de todas las formas anteriores de composiciones de diagnóstico/pronóstico, el perfil de expresión de gen puede incluir 24 o más de los genes informativos de cualquiera de las Tablas I a III, y V-VII, o subconjuntos de los mismos. En otra realización para todas las formas de composiciones de diagnóstico/pronóstico, el perfil de expresión genética puede incluir de 30 a 50 o más de los genes informativos de cualquiera de las Tablas I-III, V y VII, o subconjuntos de los mismos.

Estas composiciones pueden ser utilizadas para diagnosticar cánceres de pulmón, tal como NSCLC en fase de desarrollo I o en fase de desarrollo II. Además, estas composiciones son útiles para proporcionar una diagnosis suplementaria u original en un sujeto que tenga nódulos de pulmón de etiología desconocida. Los perfiles de expresión genética formados por genes seleccionados a partir de cualquiera de las Tablas I-VII o por subconjuntos de los mismos, son distinguibles de un perfil de expresión genética inflamatoria. Además, varias realizaciones de estas composiciones pueden utilizar perfiles de expresión genética de referencia que incluyan tres o más genes informativos de cualquiera de las Tablas I-VII o subconjuntos de los mismos a partir de la PBMC de una, o de una combinación de clases de sujetos humanos de referencia. Las clases de los sujetos de referencia pueden incluir un fumador con enfermedad maligna, un fumador con una enfermedad no maligna, un antiguo fumador con una enfermedad no maligna, un no fumador sano sin ninguna enfermedad, un no fumador que tenga enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), un antiguo fumador con COPD, un sujeto con un tumor de pulmón sólido con anterioridad a la cirugía para la extracción del mismo; un sujeto con un tumor de pulmón sólido después de la extracción quirúrgica del tumor; un sujeto con un tumor de pulmón sólido con anterioridad a la terapia para el mismo; y un sujeto con un tumor de pulmón sólido durante o después de la terapia para el mismo. La selección de la clase apropiada depende del uso de la composición, es decir, para diagnosis original, para diagnosis posterior a la terapia

o cirugía, o para diagnosis específica del tipo de enfermedad, por ejemplo, AC frente a LSCC.

IV. Métodos de diagnóstico de la invención

Todas las composiciones descritas en lo que antecede proporcionan una diversidad de herramientas de diagnóstico que permiten una evaluación no invasiva, basada en sangre, de un estado de enfermedad en un sujeto. El uso de estas composiciones en pruebas diagnósticas, que pueden ser complementadas con otras pruebas de protección, tal como una exploración de CT o rayos X del pecho, incrementa la precisión del diagnóstico y/o direcciona pruebas adicionales. En otros aspectos, las composiciones y herramientas de diagnóstico descritas en la presente memoria permiten la prognosis de la enfermedad, monitorizando la respuesta a terapias específicas, y la evaluación regular del riesgo de recurrencia. Los métodos y el uso de las composiciones descritas en la presente memoria permiten la evaluación de cambios en signaturas de diagnóstico presentes en muestras pre-cirugía y post-cirugía, e identifica un perfil de expresión genética que refleja la presencia de tumor y que puede ser usado para evaluar la probabilidad de recurrencia. Los resultados sobre cáncer de pulmón post-cirugía identificados en los ejemplos que siguen, soportan un efecto detectable similar del tumor sobre expresión genética en PBMCs de pacientes.

De ese modo, según un aspecto, se proporciona un método para diagnosticar cáncer de pulmón en un mamífero. Este método incluye identificar un perfil de expresión genética en las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un mamífero, con preferencia un sujeto humano. El perfil de expresión genética incluye tres o más productos de expresión de tres o más genes informativos que tienen expresión incrementada o reducida en cáncer de pulmón. Los perfiles de expresión genética se forman mediante la selección de tres o más genes informativos a partir de los genes de cualquiera de las Tablas I-VII o de subconjuntos de los mismos. La comparación del perfil de expresión genética del sujeto con un perfil de expresión genética de referencia, permite la identificación de cambios en la expresión de los genes informativos que se correlacionan con un cáncer de pulmón (por ejemplo, NSCLC). Este método puede ser llevado a cabo utilizando cualquiera de las composiciones descritas en lo que antecede.

En una realización, el método permite la diagnosis de adenocarcinoma específicamente. A este efecto, el perfil de expresión genética se selecciona deseablemente a partir de genes de la Tabla II. En otra realización, el método permite la diagnosis de NSCLC en fase de desarrollo I o II. A este efecto, el perfil de expresión genética está formado deseablemente por tres o más genes de la Tabla I o de la Tabla V, incluyendo el clasificador de 29 genes.

Según se ha descrito en lo que antecede para las composiciones, los perfiles genéticos incluyen opcionalmente 5, 6,

10, 15, 25, y una cantidad mayor de 30 genes informativos procedentes de las tablas respectivas, y puede utilizar uno cualquiera de los formatos de método a los que se ha hecho referencia en la presente memoria.

Según otro aspecto más, se proporciona un método para pronosticar la probabilidad de recurrencia de cáncer de pulmón en un mamífero. Este método incluye identificar un perfil de expresión genética en las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) del sujeto después de la resección de un tumor sólido o de la quimioterapia. A este efecto, el perfil de expresión genética incluye tres o más productos de expresión de tres o más genes informativos de la Tabla II o la Tabla VI. En otra realización, los productos de expresión genética incluyen los 2 ó 4 genes de categoría superior de la Tabla VI. En una realización, los productos de expresión genética son los seis genes superiores de la Tabla III o VI. En otra realización, los productos de expresión genética incluyen al menos 10 ó 15 genes de categoría superior de la Tabla III o VI. Otras combinaciones de genes de la Tabla III o VI son útiles para la formación de un perfil de expresión genética para este propósito. El perfil de expresión genética postquirúrgica o post-terapéutica del sujeto se compara con el perfil de expresión genética pre-quirúrgica o preterapéutica del sujeto. Los cambios significativos en la expresión de dichos genes informativos están correlacionados con una probabilidad reducida de recurrencia. El mantenimiento de la expresión de perfil genético cambiado con el tiempo, es indicativo de una baja recurrencia post-cirugía o post-terapia. Según se indica en los ejemplos que siguen, este cambio es identificable en la PBMC de un sujeto que tenga un pasado de fumador y/o que tenga enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD). Según se ha expuesto anteriormente, este método puede ser llevado a cabo utilizando composiciones de diagnóstico y metodologías generales descritas a lo largo de la presente descripción.

Las composiciones y los métodos de diagnóstico descritos en la presente memoria proporcionan una diversidad de ventajas sobre los métodos de diagnóstico actuales. Entre tales ventajas se encuentran las que siguen. Según se ha ejemplificado en la presente memoria, los sujetos con adenocarcinoma o con carcinoma de célula escamosa del pulmón, los dos tipos más comunes de cáncer de pulmón, se distinguen de los sujetos con enfermedades de pulmón no malignas incluyendo la enfermedad de pulmón obstructiva crónica (COPD) o el granuloma u otros tumores benignos. Estos métodos y composiciones proporcionan una solución al problema práctico de diagnóstico sobre si un paciente que presenta una clínica pulmonar con un nódulo pequeño, puede tener una enfermedad maligna. Los pacientes con un nódulo de riesgo intermedio se podrán beneficiar claramente de una prueba no invasiva que puede llevar al paciente ya sea a una categoría de probabilidad muy baja o ya sea de probabilidad muy alta de riesgo de enfermedad. Una estimación precisa de la malignidad basada en un perfil genómico (es decir, estimación de que un paciente dado tenga una probabilidad de un 90% de tener cáncer frente a la estimación de que el paciente tenga solamente un 5% de probabilidad de tener cáncer) podría dar como resultado menor número de cirugías para enfermedad benigna, más tumores en fase temprana extraídos en una fase de desarrollo curable, un menor número de exploraciones de CT de seguimiento, y una reducción significativa de los costes sicológicos de la inquietud acerca de un nódulo. El impacto económico podría ser también igualmente significativo, tal como reduciendo el coste normal estimado de los cuidados adicionales de salud asociados con la protección de CT para el cáncer de pulmón, es decir, 116.000 $ por año de vida ganado con calidad añadida. Una prueba genómica de PBMC no invasiva que tenga una sensibilidad y una especificada suficientes, podría alterar significativamente la probabilidad de malignidad post-prueba, y de ese modo, los cuidados clínicos posteriores.

Una ventaja deseable de estos métodos sobre los métodos existentes consiste en que los mismos están capacitados para caracterizar el estado de enfermedad a partir de un procedimiento mínimamente invasivo, es decir, con la toma de una muestra de sangre. Por el contrario, la práctica actual para la clasificación de tumores cancerígenos a partir de perfiles de expresión genética depende de una muestra de tejido, normalmente una muestra procedente de un tumor. En el caso de tumores muy pequeños, una biopsia es problemática y, claramente, sino es un tumor conocido o visible, una muestra del mismo resulta imposible. No se requiere ninguna purificación del tumor, como en el caso en que se analizan las muestras del tumor. Un método recientemente publicado depende de recortar células epiteliales del pulmón durante una broncoscopia, un método que es también considerablemente más invasivo que el hecho de tomar una muestra de sangre, y solamente aplicable a cánceres de pulmón, mientras que los métodos descritos en la presente memoria son generalizables a cualquier cáncer. Las muestras de sangre tienen una ventaja adicional, que consiste en que el material es preparado y estabilizado fácilmente para análisis posteriores, lo que es importante cuando se va a analizar ARN mensajero.

En una realización de los métodos descritos en la presente memoria, es ventajoso el uso de nuevos algoritmos para analizar los perfiles de expresión genética, que son superiores en cuanto a clasificación respecto a los algoritmos existentes especialmente en el análisis de datos ruidosos o de baja relación señal/ruido. Cuando se compara una enfermedad generalizada con una no enfermedad generalizada, es probable que los datos sean ruidosos debido a que se están combinando en la comparación muchas subclases diferentes. Este método podría ser usado como un añadido a la diagnosis de enfermedad de pulmón existente, en cualquier clínica pulmonar.

V. Ejemplos

La invención va a ser descrita ahora con referencia a los ejemplos que siguen. Estos ejemplos se proporcionan con fines de ilustración solamente, y la invención no debe considerarse en modo alguno como limitada a estos ejemplos sino que por el contrario está construida de modo que abarca cualquiera y todas las variaciones que resulten

evidentes como resultados de las enseñanzas proporcionadas por la misma.

Ejemplo 1: Sujeto de paciente y sujetos de control para muestras de PBMC

Se recogieron muestras de PBMC e información clínica procedente de 300 pacientes de cáncer de pulmón y de 150 controles, incluyendo muestras procedentes de 16 pacientes recogidas en pre- y post- cirugía. Los sujetos de paciente y los sujetos de control tienen ambos el factor de riesgo clave para cáncer de pulmón, es decir, fumar, y muchos de los sujetos de paciente y de los controles no sanos (NHCs) tienen enfermedades relacionadas con fumar tal como la COPD. La diferencia principal entre las 2 clases es la presencia de un nódulo maligno en la clase de pacientes.

A. Sujetos de pacientes

Las poblaciones de pacientes útiles en la provisión de datos para el desarrollo de los perfiles de expresión genética descritos en la presente memoria incluyen pacientes machos y hembras recién diagnosticados con cáncer de pulmón en fase de desarrollo temprana. Los criterios de inclusión para la selección de estos pacientes fueron pacientes en un número significativo de pacientes Afro-Americanos (en torno al 15%), Hispánicos (el 5%) y ningún isleño del Pacífico. La gama de edad fue de 50-80 años. Éstos tenían una salud (ambulatoria) moderadamente buena. Aunque con enfermedad médica. De entre éstos fueron excluidos si habían tenido cánceres, quimioterapia, radiación o cirugía de cáncer con anterioridad. Éstos debían tener una diagnosis de cáncer de pulmón dentro de los 6 meses anteriores, confirmación histológica, y ninguna terapia sistémica, tal como quimioterapia, terapia de radiación o cirugía de cáncer puesto que los niveles de los biomarcadores pueden cambiar con la terapia. Así, la mayor parte de los pacientes de cáncer estaban en fase de desarrollo temprana (es decir, Fase de desarrollo I y Fase de desarrollo II).Otro grupo de pacientes era el de pacientes de cáncer en el que se obtuvo sangre con anterioridad a la cirugía y después de nuevo en un intervalo post-cirugía razonable (~ 2-6 meses) para asegurar que ninguno de los cambios quirúrgicos/inflamatorios se hubiera resuelto. Esto permite que cada paciente sirva como su “propio control”. Los criterios de inclusión fueron pacientes con una diagnosis de cáncer de pulmón en Fase de desarrollo I o II, que es reseccionable quirúrgicamente. Fueron excluidos si habían tenido cánceres, quimioterapia, radiación o cirugía de cáncer con anterioridad. Se recogieron datos sobre 16 pares de muestras de pre- frente a post- cirugía que fueron analizadas sobre la plataforma Illumina. Estos estudios mostraron una pérdida de signatura de tumor post cirugía en 13 de los 16 pares comprobados que soportan la detección de una signatura inducida por tumor en las muestras de sangre periférica monitorizadas.

B. Sujetos de control

En vez de usar controles sanos emparejados (no fumadores o fumadores “sanos”), el grupo de control fue extraído principalmente de pacientes con riesgo pulmonar emparejados (fumadores y ex-fumadores) con enfermedad pulmonar no maligna y pacientes con nódulos pulmonares benignos (por ejemplo, granulomas o hamartomas). El grupo de control se menciona en la presente memoria como “controles no sanos” (NHC). Estos pacientes fueron evaluados en clínicas pulmonares, o se sometieron a cirugía torácica por un nódulo de pulmón. Todas las muestras fueron recogidas con anterioridad a la cirugía. Los criterios de inclusión para los pacientes fueron pacientes entre 5080 años de edad, con un uso del tabaco > de 10 años, y con una exploración por CT o rayos X del pecho dentro de los últimos seis meses que no mostrara ninguna evidencia de cáncer de pulmón ni de ningún otro cáncer en los 5 años anteriores. Los sujetos de control fueron emparejados con los sujetos de paciente en base a la edad, la raza, el género, y el estado de fumador. De ese modo, la mayoría de los controles eran fumadores o ex-fumadores mayores de 50 años de edad. Otro grupo de control incluía pacientes que se sometieron a cirugía para nódulos de pulmón en los que el nódulo se comprobó que era benigno. Los NCHs son una población que pudo beneficiarse significativamente de la monitorización regular debido a su riesgo incrementado en cuanto al desarrollo de cáncer de pulmón.

Ejemplo 2: Protocolos de recogida de muestra y procesamiento

Las muestras de sangre fueron recogidas en la clínica por parte de un técnico en la adquisición de tejido. La sangre fue recogida en dos tubos CPT® (Becton-Dickenson). Los tubos CPT eran tubos vacíos de recogida de sangre que contenían reactivo FICOLL por debajo de un inserto de gel y un anticoagulante por encima del gel. Ésta es una forma muy fácil y eficaz de aislar directamente la PBMC. La sangre se recogió a partir de los mismos pacientes durante su visita de 2-6 meses a la clínica tras la cirugía. Las muestras de sangre fueron recogidas en tubos PAXgene a partir de un subconjunto de pacientes y de sujetos de control. Todas las muestras codificadas, incluyendo bloques de tejido y componentes sanguíneos (PBMC, suero y plasma), fueron almacenadas en base a la identificación del sujeto en cajas de almacenamiento marcadas de un congelador, a -80 ºC.

Las muestras recogidas fueron procesadas mediante una diversidad de etapas rutinarias que han sido altamente estandarizadas. Las muestras fueron procesadas como lotes (normalmente 20-50 muestras) de ambos casos y controles en vez de cómo las muestras individuales que fueron recogidas. En cada etapa, fueron aleatorizadas de modo que ninguna clase particular de pacientes o controles fuera procesada como grupo separado. La purificación de ARN se llevó a cabo utilizando TRI-REAGENT (Molecular Research) según lo recomendado. El ADN y el ARN fueron extraídos a partir de cada muestra, y el ADN fue archivado para estudios futuros. Las muestras de ARN

fueron controladas en cuanto a calidad utilizando el Bioanalizador, y solamente se utilizaron muestras con relaciones 28S/16S de >0,75 para estudios adicionales. Las muestras con relaciones más baja fueron archivadas puesto que las mismas eran aún adecuadas para estudios de validación de PCR. La misma cantidad (250 ng del ARN total) fue amplificada (aARN) utilizando el kit de amplificación de ARN (Ambion). Esto proporcionó material amplificado suficiente (5-10 μg) para múltiples repeticiones de las matrices y para estudios de validación de PCR. Todas las muestras fueron amplificadas una sola vez.

Un esquema alternativo de recogida de muestras emplea el Sistema PAXgene de ARN sanguíneo (Preanalytix – una compañía Qiagen/BD) para estabilizar el ARN en muestras de sangre total. Puesto que el PAXgene no requiere ningún procesamiento especial de las muestras de sangre, permite el desarrollo más fácil de estándares para la recogida de muestras. Para optimizar la recogida uniforme de muestras recogidas en múltiples sitios de un ensayo clínico, el Sistema PAXgene de ARN Sanguíneo (Preanalytix- una compañía de Qiagen/BD) integra las etapas clave de recogida global de sangre, estabilización de ácido nucleico y purificación de ARN. Éste utiliza tecnología BD VacunatainerT estándar que contiene un reactivo del propietario que estabiliza inmediatamente el ARN intracelular durante días a temperatura ambiente, semanas a 4 ºC, y que puede ser almacenado al menos un año a menos 80 ºC con anterioridad a la purificación del ARN. Los tubos PAXgene pueden ser expedidos durante la noche y almacenados a -80 ºC hasta su utilización. Todos los tubos se mantienen a temperatura ambiente durante 2-4 horas antes de la congelación puesto que ello aumenta la producción de ARN. La capacidad de minimizar la urgencia del procesamiento aumenta considerablemente la eficacia de laboratorio. Para más detalles, véase http://www.preanalytix.com/RAN.asp.

De muchos modos, éste es el mejor método para conservar inmediatamente las poblaciones de mensaje de ARN presentes en el instante de la recogida. Sin embargo, la gran cantidad de mensaje de globina presente en las tres muestras interfirió con la determinación del mensaje sobre micro-matrices, a pesar de los esfuerzos por superar este problema. Si se emplea un ensayo de PCR para los perfiles de expresión genética descritos en la presente memoria, se prefiere el uso de PaxGene, puesto que el mensaje de globina no interfiere con los ensayos de PCR.

Ejemplo 3: Métodos de procesamiento de datos para obtención de perfil de expresión genética

El BeadChip ILLUMINA es un método relativamente nuevo de llevar a cabo múltiples análisis genéticos. El elemento esencial de la tecnología de BeadChip es la fijación de oligonucleótidos a perlas de sílice. Las perlas fueron depositadas a continuación aleatoriamente en pocillos sobre un substrato (por ejemplo, una placa de vidrio). La matriz resultante fue descodificada para determinar qué combinación de oligonucleótido-perla se encontraba en cada pocillo. Las matrices descodificadas pueden ser usadas para un número de aplicaciones, incluyendo análisis de expresión genética. Estas matrices tienen la misma cobertura de gen que las matrices Affymetrix (47.000 sondas para 27.000 genes incluyendo las variantes de partición) pero utilizan oligonucleótidos de 50-mer en vez de 25-mer y de ese modo proporcionan una mayor especificidad.

Los procedimientos de línea de análisis de datos que utilizan funciones de Matlab, el PDA y SVM codificados con RFE y SVM-RCE, fueron utilizados rutinariamente y exitosamente como había sido puesto de manifiesto por las publicaciones y según se ha descrito en la presente memoria.

A. Pre-procesamiento de datos y control de calidad de matriz

Los datos fueron procesados según ha sido descrito de manera general1 y los niveles de expresión para la señal y las sondas de control fueron exportados. Se utilizó un conjunto de sondas de control negativas para calcular el nivel medio de fondo y para determinar el umbral de detección de señal. Los datos de expresión de sonda fueron normalizados utilizando normalización cuantil. Los datos fueron comprobados en cuanto a resultados atípicos calculando una puntuación atípica para cada una de las muestras. En primer lugar, se calcularon los coeficientes de correlación de Spearman para cada par de muestras. Se calculó la correlación media para cada muestra (Ms), la correlación media para todos los pares de muestras (Mp) y la desviación media absoluta a partir de Mp (MADp). La puntuación atípica (de manera similar a la puntuación-Z) para la muestra i fue calculada a continuación como (Msi – MP)/MADp. Las puntuaciones atípicas fueron estudiadas para elegir un umbral que marque los potenciales resultados atípicos. Normalmente, las muestras con puntuaciones atípicas de más de 5, fueron consideradas como resultados técnicos atípicos. La identificación adicional de resultados atípicos se hace mediante estadísticas multivariantes tal como diagramas de componentes principales (PCA), escalado multidimensional, y PCA robusto.

Con el fin de reducir el ruido experimental, los datos se filtran eliminando sondas no informativas, es decir, sondas que no fueron detectadas en la mayoría de las muestras (más del 95%) o sondas que no cambian en al menos 1,2 veces entre al menos dos muestras. Si una muestra tenía réplicas, se tomó la última réplica para el análisis.

B. Revisión no supervisada

Cuando fue apropiado, se aplicó agrupamiento jerárquico utilizando correlación o distancia Euclídea, y se utilizó escalado multidimensional para inspeccionar conjuntos de datos en cuanto a evidencia de resultados atípicos o subclases. Se utilizó VISDA (53) para este propósito con buen éxito.

C. Clasificación supervisada

La Máquina de Vector de Soporte (SVM) puede ser aplicada a conjuntos de datos de expresión de gen para descubrir y clasificar la función genética. Se ha encontrado que la SVM es la más eficiente para distinguir los casos y controles relacionados de forma más próxima que residen en los márgenes. Principalmente, la SVM-REF (48, 54) fue utilizada para desarrollar clasificadores de expresión genética que distinguen clases definidas clínicamente de pacientes a partir de clases definidas clínicamente de controles (fumadores, no fumadores, COPD, granuloma, etc.). La SVM-RFE es un modelo basado en SVM utilizado en el estado de la técnica que retira genes, basada recursivamente en su contribución a la discriminación, entre las dos clases que van a ser analizadas. Los genes de puntuación más baja por pesos de coeficientes, fueron retirados y los genes restantes fueron puntuados de nuevo y el procedimiento fue repetido hasta que solamente permanecieron unos pocos genes. Ese método ha sido usado en varios estudios para realizar tareas de clasificación y de selección de gen. Sin embargo, eligiendo valores apropiadas de los parámetros del algoritmo (parámetro de penalización, función de núcleo) se puede con frecuencia influir en el rendimiento.

La SVM-RCE es un modelo relacionado basado en SVM, ya que el mismo, al igual que la SVM-RFE, evalúa las contribuciones relativas de los genes al clasificador. La SVM-RCE evalúa las contribuciones de grupos de genes interrelacionados en vez de genes individuales. Adicionalmente, aunque ambos métodos retiran los genes menos importantes en cada etapa, la SVM-RCE puntúa y retira grupos de genes, mientras que la SVM-RFE puntúa y retira un único, o unas pequeñas cantidades de genes en cada recorrido del algoritmo.

El método de SVM-RCE se va a describir aquí brevemente. Los genes de expresión baja (expresión media menor de 2 x fondo) fueron retirados, se realizó normalización cuantil, y a continuación se retiraron las matrices “de resultados atípicos” cuyos valores de expresión medios difieren en más de 3 sigma del valor medio del conjunto de datos. Las muestras restantes fueron sometidas a SVM-RCE utilizando diez repeticiones de validación cruzada de 10 pliegues del algoritmo. Los genes fueron reducidos mediante prueba-t (aplicada al conjunto ejercitante) respecto a un valor óptimo determinado experimentalmente que produce una precisión más alta en el resultado final. Estos genes de partida fueron agrupados mediante K-medios en grupo de genes correlacionados cuyo tamaño medio es de 3-5 genes. Se llevó a cabo la puntuación de la clasificación de SVM en cada grupo utilizando un re-muestreo de 3 pliegues repetido 5 veces, y los grupos de peor puntuación fueron eliminados. Se determinó la precisión sobre la agrupación de genes supervivientes utilizando el 10% de muestras de la izquierda (conjunto de prueba) y se registraron los 100 genes de puntuación superior. El procedimiento fue repetido a partir de la etapa de agrupamiento hasta un punto final de 2 grupos. El panel genético óptimo fue tomado como el número mínimo de genes que proporciona la máxima precisión a partir del gen más frecuentemente seleccionado. La identidad de los genes individuales de este panel no es fija, puesto que el orden refleja el número de veces que un gen dado fue seleccionado entre los 100 genes informativos superiores, y este orden está sujeto a alguna variación.

Utilizando la SVM-RCE, la evaluación inicial del rendimiento de cada grupo de gen individual, como característica separada, permitió la identificación de aquellos grupos que contribuyeron como mínimo a la clasificación. Éstos fueron retirados del análisis aunque aquellos grupos que presentaron un rendimiento de clasificación relativamente mejor fueron extraídos. Se permitió que el re-agrupamiento de genes después de cada etapa de eliminación permitiera la formación de nuevos grupos, potencialmente más informativos. Los grupos de genes más informativos fueron retenidos durante rondas adicionales de averiguación hasta que se identificaron los grupos de genes con la mejor precisión de clasificación.

La utilización del método que usa grupos de genes, en vez de genes individuales, aumentó la precisión de clasificación supervisada de los mismos datos en comparación con la precisión cuando se usó SVM o bien Análisis Discriminante Penalizado (PDA) con eliminación de característica recursiva (SVM-RFE y PDA-RFE) para extraer genes en base a sus pesos discriminantes individuales. El método permitió también la determinación arbitraria del número de grupos y del tamaño del grupo al principio del análisis por el investigador y, según avanzaba el algoritmo, los grupos menos significativos fueron progresivamente retirados. El método proporcionó además los n grupos superiores requeridos para diferenciar de la manera más precisa las dos clases predefinidas. Estos dos métodos están mejor definidos en los ejemplos que siguen.

D. Selección de biomarcador

Los genes que puntúan más alto (mediante SVM) en la discriminación de pacientes a partir de controles, fueron examinados en cuanto a su utilidad para pruebas clínicas. Los factores considerados incluyen diferencias más altas en niveles de expresión entre clases, y variabilidad baja dentro de las clases. Cuando se seleccionan biomarcadores para su validación, se ha realizado un esfuerzo para seleccionar genes con perfiles de expresión distintos para evitar la selección de genes correlacionados (55) y para identificar genes con niveles de expresión diferencial que fueran robustos mediante técnicas alternativas que incluyen PCR y/o inmuno-histoquímica.

E. Validación

Se consideraron tres métodos de validación.

Validación cruzada: Para minimizar el sobre-ajuste dentro de un conjunto de datos, se utilizó validación cruzada K veces (K es normalmente igual a 10), cuando el conjunto de datos se partió en K partes aleatoriamente y se usaron K-1 partes para la ejercitación y 1 para la prueba. Así, para K = 10, el algoritmo fue ejecutado sobre una selección aleatoria del 90% de pacientes y el 90% de los controles, y a continuación se probó el 10% restante. Esto se repitió hasta que todas las muestras habían sido empleadas como sujetos de muestra y el clasificador acumulado hizo uso de todas las muestras, pero no se probó ninguna muestra usando un conjunto de ejercitación del que la misma formara parte. Para reducir el impacto de la aleatorización, la separación de K pliegues se repitió M veces produciendo combinaciones diferentes de pacientes y controles en cada uno de las K pliegues, cada vez. Por lo tanto, para el conjunto de base de datos individuales, se utilizaron M*K rondas de selección permutada de ejecución y de conjuntos de prueba por cada conjunto de genes.

Validación independiente: Para estimar la reproducibilidad de los datos y la generalidad del clasificador, se necesita examinar el clasificador que se construyó utilizando un conjunto de datos y se probó utilizando otro conjunto de datos para estimar el rendimiento del clasificador. Para estimar el rendimiento, se llevó a cabo una validación en el segundo conjunto utilizando el clasificador desarrollado con el conjunto de datos original.

Re-muestreo (permutación): Para demostrar la dependencia del clasificador del estado de enfermedad, los pacientes y los controles del conjunto de datos fueron elegidos de manera aleatoria (permutada) y se repitió la clasificación. La exactitud de la clasificación utilizando muestras aleatorizadas fue comparada con la exactitud del clasificador desarrollado para determinar el valor p del clasificador, es decir, la posibilidad de que el clasificador pudiera haber sido elegido por azar. Con el fin de probar la generalidad de un clasificador desarrollado de esa manera, se utilizó el hecho de clasificar conjuntos independientes de muestras que no fueron usadas en el desarrollo del clasificador. Las precisiones de validación cruzada del clasificador permutado y original, fueron comparadas sobre conjuntos de prueba independientes para confirmar su validez en cuanto a la clasificación de nuevas muestras.

F. Rendimiento de clasificador

El rendimiento de cada clasificador fue estimado mediante diferentes métodos y se usaron varias mediciones de rendimiento para comparar clasificadores entre sí. Estas mediciones incluyen la precisión, el área bajo curva de ROC, la sensibilidad, la especificidad, la tasa positiva verdadera y la tasa negativa verdadera. En base a las propiedades requeridas de la clasificación de interés, se pueden usar diferentes mediciones de rendimiento para elegir el clasificador óptimo, por ejemplo el clasificador a usar en la protección de la población total podría requerir una mejor especificidad para compensar una pequeña prevalencia (~1%) de la enfermedad y evitar por tanto un gran número de falsos aciertos positivos, mientras que un clasificador de diagnóstico de pacientes en hospital debería ser más sensible.

G. Aplicación del clasificador

Una construcción de clasificador lineal por parte de la SVM para un conjunto de genes en base a un conjunto de ejercitamiento, puede ser usado para asignar una puntuación de SVM a cualquier muestra. Matemáticamente, el clasificador es un conjunto de g+1 coeficientes, en el que g es un número de genes presentes en el conjunto. Si E1, ..., E0 son valores de expresión de estos genes para una muestra, y C1, ..., Cg+1 son los coeficientes correspondientes, entonces la puntuación de SVM para la muestra se calcula fácilmente como C1E1 + ... + CgEg + Cg+1.

H. Análisis de ROC

El análisis de ROC fue realizado con vistas a estimar la eficacia de cada clasificador que toma en consideración tanto la sensibilidad como la especificidad. La curva de ROC para un clasificador se construye variando el punto de corte de la puntuación de SVM y calculando la sensibilidad y la especificidad correspondientes. Se calculó el área bajo la curva de ROC (AUC) para usarla como medición de rendimiento de clasificador. Puesto que el clasificador aleatorio de muestras podría tener una AUC de 0,5 y el clasificador perfecto podría tener una AUC de 1,0, el valor de AUC calculado puede ser usado e informado como expresión de porcentaje de la eficacia del clasificador.

I. Valores predictivos positivos y negativos

El cálculo de valores predictivos positivos (PPV) y de valores predictivos negativos (NPV) tiene en cuenta no solo la especificidad y la sensibilidad, sino también una prevalencia p de la enfermedad:

sens · p PPV = ----------------------------------------- sens · p + (1 – spec) · (1 –p)

spec(1 – p) NPV = ---------------------------------------- spec(1 – p) + (1 – sens) · p

Así, PPV es similar a la tasa positiva cierta y muestra una fracción de sujetos que realmente tienen enfermedad entre muestras clasificadas positivamente, mientras que NPV es similar a la tasa negativa cierta, y muestra una fracción de sujetos que realmente no tienen las muestras de enfermedad clasificadas negativamente.

Los valores PPV y NPV fueron calculados a partir de cada punto de corte de puntuación de SVM posible para diversos valores de prevalencia (1%, 5% y 50%). Adicionalmente a direccionar el uso de los valores PPV y NPV, esto permite identificar un punto de corte de puntuación de SMV para su uso en la clasificación con el fin de conseguir un valor predictivo de clasificador especificado.

Ejemplo 4: Clasificaciones supervisadas de SVM

(i)

El proceso de SVM-RFE fue aplicado a un conjunto de ejercitación de muestras, como sigue. Se realizó una prueba-T sobre genes procedentes del conjunto de ejercitamiento para determinar los 1000 mejores genes que separan dos clases de muestras, Para cada etapa de reducción de gen se ejecutó SVM utilizando el número de genes restantes. Los coeficientes para estos genes procedentes del clasificador ejercitado, fueron comparados a continuación para eliminar genes con el impacto menor en la puntuación discriminante. El diez por ciento de los genes menos significativos fueron retirados y el proceso fue repetido hasta que se dejó solamente 1 gen. El rendimiento de los clasificadores para cada número de genes fue calculado utilizando el clasificador correspondiente en el conjunto de prueba. Cada gen recibió una puntuación que se corresponde con la etapa de iteración en la que el gen fue eliminado. Para eliminar el sobre-ajuste dentro de un conjunto de datos, se utilizó validación cruzada K pliegues (normalmente, K es igual a 10). Los datos fueron divididos en K partes (pliegues) y el algoritmo fue ejercitado sobre k-1 pliegues de los grupos de caso y de control, y a continuación probado sobre el resto 1 vez. Esto garantizó que cada muestra fuera empleada como sujeto de prueba. La partición aleatoria sobre K-pliegues fue repetida 10 veces, dando como resultado 100 pares diferentes de subconjuntos de ejercitamiento-prueba. Cada partición de datos de ejercitamiento-prueba fue analizada mediante SVM-RFE por separado. A continuación se calculó una puntuación final de gen para todos los genes que estuvieron involucrados en el ejercitamiento de al menos un clasificador. La puntuación fue igual a la puntuación genética media a través de todas rondas de re-muestreo, dividida por el número de iteraciones de eliminación, De ese modo, el gen hipotético que alcance la etapa de iteración de eliminación máxima en la totalidad de las 100 ejecuciones de SVM-RFE, recibirá una puntuación de 1, mientras que el gen que fue siempre eliminado en la primera etapa recibirá una puntuación de 0. Se utilizaron diferentes cantidades de genes superiores con puntuaciones más altas para calcular el rendimiento de la formación clasificadora de estos genes. El clasificador con el mejor rendimiento indica el número óptimo de genes a usar para la clasificación.

(ii)

El algoritmo central del método de SVM-RCE ha sido descrito como diagrama de flujo (en la Figura 3 de referencia 1), el cual consiste en tres etapas principales aplicadas sobre la parte ejercitante de los datos:

Etapa de agrupamiento para el agrupamiento de los genes; etapa de puntuación de SMV para calcular la Puntuación(X(si), f, r) de cada agrupamiento de genes, y etapa de RCE para retirar grupos con baja puntuación. El método de SVM-RCE fue realizado de acuerdo con lo siguiente:

Se ha supuesto que el conjunto de datos D tiene S genes (todos los genes son genes n_g superiores mediante prueba-t) y que los datos fueron divididos en dos partes: una para el ejercitamiento (90% de las muestras) y la otra (10% de las muestras) para la prueba. X indica un conjunto de datos de ejercitamiento de dos clases que consiste en muestras y en S genes. Se definió la medición de puntuación para cualquier lista S de genes como la capacidad para diferenciar las dos clases de muestras mediante aplicación de SVM lineal. La puntuación fue calculada realizando una partición aleatoria sobre el conjunto X de muestras de ejercitamiento en f subconjuntos no solapantes de iguales tamaños (fpliegues). La SVM lineal fue ejercitada sobre f-1 subconjuntos y el subconjunto restante fue utilizado para calcular el rendimiento. El procedimiento fue repetido r veces para tomar en consideración un particionado diferente posible.

La Puntuación (X(S), f, r) fue definida como la precisión media de la SVM lineal sobre los datos X representados por los S genes calculados como validación cruzada de f-pliegues repetida r veces. Los valores por defecto son r = 3 y r = 5. Si los S genes están agrupados en sub-grupos de genes S1, S2, ..., sn, se definió la Puntuación(X(si), f, r) para cada sub-grupo mientras que los datos X estaban representados por los genes de Si. n = número inicial de agrupamientos, m = número final de agrupamientos, d = parámetro de reducción. Mientras que (n < m) hacer que: 1. Agrupar los S genes dados en n agrupamientos S1, S2, ..., Sn utilizando K-medios (etapa de agrupamiento); 2. Para cada grupo i = 1, ..., n, calcular su Puntuación(X(si), f, r) (etapa de cálculo de puntuación de SVM); 3. Retirar el d% de grupos con puntuación más baja (etapa de RCE); 4. Reunir genes supervivientes de nuevo en un grupo S; 5. Reducir n en un d%.

La alternativa básica de la SVM-RCE fue agrupar en primer lugar los perfiles de expresión genética en n agrupamientos, utilizando K-medios. Se asignó una puntuación (Puntuación (X(si), f, r)) a

cada uno de los grupos mediante SVM lineal, indicando su éxito en la separación de muestras en la tarea de clasificación. El d% de grupos (o d grupos) con las puntuaciones más bajas, fueron apartados a continuación del análisis. Las etapas 1 a 5 fueron repetidas hasta que el número n de grupos se redujo a m. Se indica con Z el conjunto de datos de prueba. En la etapa 4, se formó un clasificador de SVM a partir del conjunto de datos de ejercitamiento utilizando los genes S supervivientes. Este clasificador fue probado sobre Z para estimar el rendimiento. Véase la Figura 3 referenciada con anterioridad de (1), el panel de “Prueba” en el lado derecho.

Para la versión actual, las opciones de n y m fueron determinadas por el investigador. En esta implementación, el valor por defecto de m fue 2, lo que indica que se necesitó el método para capturar los 2 agrupamientos (grupos) significativos superiores de genes. Sin embargo, la precisión fue determinada después de cada ronda de eliminación de agrupamiento y un grupo más alto de agrupamientos pudo ser más preciso que los dos finales. El paquete de gist-svm fue utilizado para la implementación de SVM-RFE, con función de núcleo lineal (producto escalar), con parámetros por defecto. En gist-svm, la SVM emplea un margen suave de dos normas con C = 1 como parámetro de penalización. La SVM-RCE fue codificada en MATLAB mientras que la emisión de Bioinformatics Toolbox 2.1 fue utilizada para la implementación de SVM lineal con margen suave de dos normas con C = 1 como parámetro de penalización. La puntuación de PDA-RFE fue implementada en lenguaje de programación C utilizando una interfaz de usuario JAVA.

Con el fin de asegurar una comparación razonable y para reducir el tiempo de cálculo, los 300 genes superiores (n_g = 300) fueron seleccionados mediante prueba-t en el conjunto de ejercitamiento para todos los métodos. Sin embargo, el uso de estadísticas-t para reducir el número de de genes iniciales sometidos a SVM-RFE no sólo fue eficiente, sino que también aumentó el rendimiento del clasificador. Para todos los resultados presentados, se usó un 10% (d = 0,1) para la reducción de agrupamiento de gen para SVM-RCE y el 10% de los genes con SVM-RFE y PDA-RFE. Para la SVM-RCE, el experimento se inició utilizando 100 agrupamientos (n = 100) y cesó cuando quedaban 2 agrupamientos (m = 2). Se utilizaron 3 pliegues (f = 3) repetidos 5 veces (r = 5) en el método de SVM-RCE para evaluar la puntuación de cada agrupamiento (etapa de puntuación de SVM en la Figura 3 de referencia 1). Se pueden usar parámetros de evaluación más rigurosos incrementando el número de validaciones cruzadas repetidas, mientras se incrementa simultáneamente el tiempo de cálculo.

(iii) Para evaluar el rendimiento global de SVM-RCE y SVM-RFE (y de PDA-RFE), se empleó validación cruzada de 10 pliegues (9 pliegues para ejercitamiento y 1 pliegue para prueba), repetida 10 veces. Después de cada ronda de reducción de característica o de agrupamiento, se calculó la precisión sobre el conjunto de prueba extendido. Para cada muestra del conjunto de prueba, una puntuación asignada mediante SVM indicó su distancia desde el híper-plano de discriminación generado a partir de las muestras de ejercitamiento, en el que un valor positivo indicaba un miembro de la clase positiva y un valor negativo indicaba un miembro de la clase negativa. La etiqueta de clase para cada muestra de prueba fue determinada mediante el promediado de un total de 10 de sus puntuaciones de SVM, y la muestra fue clasificada en base a este valor. Este método para calcular la precisión proporcionó una medición más precisa del rendimiento, puesto que no sólo capturó el hecho de que una muestra específica esté clasificada positivamente (+1) o negativamente (-1), sino también cómo ha sido clasificada en cada categoría, según se determina mediante una puntuación asignada a cada muestra individual. La puntuación sirvió como medición de la confianza de la clasificación. La gama de puntuaciones proporcionó un intervalo de confianza.

Los métodos de agrupamiento son técnicas no supervisadas en las que no están asignadas las etiquetas de las muestras. K-medios67 es un algoritmo de agrupamiento ampliamente utilizado. Éste constituye un método iterativo que agrupa genes con perfiles de expresión correlacionados en k agrupamientos mutuamente exclusivos, siendo k un parámetro que necesita ser determinado al comienzo. El punto de partida del algoritmo K-medios consiste en iniciar k agrupamientos activos generados aleatoriamente. Cada perfil de gen está asociado al agrupamiento con distancia mínima (se podrían usar diferentes métricas para definir la distancia) a su “centroide”. El centroide de cada agrupamiento es re-calculado a continuación como la media de todos los perfiles de los miembros de gen del agrupamiento. El procedimiento se repite hasta que no se detecten cambios en los centroides, para varios agrupamientos. Finalmente, este algoritmo tiene por objeto minimizar una función objetiva con k agrupamientos;

k t

F(datos, k) = 22||gij – cj||2, donde t es el número de genes, donde || ||2 es la distancia medida entre el perfil gi de

j=1 i=1

gen y el centroide cj del agrupamiento. La medición de distancia de “correlación” fue utilizada como métrica para la alternativa de SVM-RCE. La distancia de correlación entre los genes gr y gs se define como:

K-medios es sensible a la elección de los agrupamientos activos (centroides iniciales) y se pueden considerar diferentes métodos para la elección de los agrupamientos activos. En la etapa de K-medios, es decir, la etapa de agrupamiento de la Figura (3) de (1), de SVM-RCE, k genes son seleccionados aleatoriamente para formar los agrupamientos activos, y este proceso se repite varias veces (u veces) con el fin de alcanzar el valor óptimo, con el valor más bajo de la función F(datos; k) objetiva.

El método de SVM-RCE difiere de los métodos de clasificación relacionados en el estado de la técnica en que el método de SVM-RCE agrupa en primer lugar genes en agrupamientos de gen correlacionados mediante K-medios, y a continuación evalúa las contribuciones de cada uno de esos agrupamientos a la tarea de clasificación por SVM.

Ejemplo 5: Uso de algoritmos de Máquina de Vector de Soporte (SVM) y de Eliminación Recursiva de Agrupamiento (RCE) para seleccionar genes significativos para expresión genética comparativa en cáncer de pulmón

En este ejemplo, el algoritmo de SVM-RCE para la selección y clasificación de gen fue mostrado utilizando dos (2) conjuntos de datos. Según se ha indicado anteriormente, este novedoso algoritmo combina el algoritmo K-medios para agrupamiento genético y el algoritmo de aprendizaje de máquina (SVM) para identificar y clasificar (ordenar) esos agrupamientos de genes con el propósito de clasificación y categorización de agrupamiento de gen. La eliminación recursiva de grupo (RCE) fue aplicada a continuación para extraer iterativamente esos agrupamientos de genes que contribuyen menos al rendimiento de la clasificación.

Este algoritmo fue llevado a cabo utilizando la versión Matlab™ del algoritmo de SVM-RCE que puede ser descargado en http://showelab.wistar.upenn.edu bajo la lengüeta “Tools->SVM-RCE”. En resumen, el algoritmo SVM-RCE fue evaluado en este ejemplo usando conjuntos de datos de tumores de cabeza y cuello (I) y (II) según se expone en lo que sigue.

Para el Conjunto de datos (I), la obtención del perfil de expresión genética se llevó a cabo sobre un panel de 18 muestras de tumor de cabeza y cuello (HN) y 10 cánceres de pulmón (LC) utilizando matrices Affymetrix® U133A, según se describe en Vachani et al., Accepted Cli. Cancer Res., 2001.

Para el Conjunto de datos (II), la obtención del perfil de expresión genética fue llevada a cabo sobre un panel de 52 pacientes ya sea con carcinomas de pulmón primarios (21 ,muestras) o de cabeza y cuello primarios (31 muestras), utilizando la micro-matriz68 de nucleótido Affymetrix® HG_U95Av2 de alta densidad.

Se utilizaron tres algoritmos, a saber SVM-RCE, PDA-RFE y SVM-RFE para reducir iterativamente el número de genes desde el valor de partida en estos conjuntos de datos (I) y (II) utilizando precisión de clasificación intermedia como métrica. En resumen, se determinó la precisión del algoritmo de SVM-RCE en los 2 grupos finales de genes, y dos niveles intermedios, normalmente los agrupamientos 8 y 32, que corresponden a 8 genes, 32 genes y 102 genes, respectivamente. Para los algoritmos SVM-RFE y PDARFE, se determinó también la precisión para números de genes comparables. Véase la Tabla VIII.

Tabla VIII

Tumores de Cabeza & Cuello frente a Tumores de Pulmón (I)

Tumores de Cabeza & Cuello frente a Tumores de Pulmón (II)

Algoritmo

# grupos (#c) # genes (#g) precisión (ACC) (%) # grupos (#c) # genes (#g) precisión (ACC) (%)

SVM-RCE

2 8 100 2 9 100

8

32 100 6 32 100

28

103 100 25 103 100

SVM-RFE

8 92 8 98

32

90 32 98

102

90 102 98

PDA-RFE

8 89 8 70

31

96 32 98

109

96 102 98

Los resultados que comparan el uso independiente de los algoritmos de SVM-RCE y de SVM-RFE en el conjunto de datos (I), ilustraron que el algoritmo de SVM-RCE tuvo un incremento de precisión sobre el algoritmo de SVM-RFE. Específicamente, se obtuvo un incremento de precisión de un 8%, un 10% y un 10% con alrededor de 8, alrededor de 32 y alrededor de 100 genes, respectivamente. De una manera similar, los resultados con la utilización de estos algoritmos sobre el conjunto de datos (II), mostraron un incremento de alrededor de un 2% con el algoritmo SVM-RCE, utilizando alrededor de 8, alrededor de 32 y alrededor de 102 genes (100% ACC). El algoritmo SVM-RFE, sin embargo, mostró un ACC de alrededor de un 98%. Estos resultados muestran claramente la superioridad del algoritmo SVM-RCE sobre el algoritmo SVM-RFE.

También se apreció que el tiempo de ejecución para el algoritmo SVM-RCE utilizando el código MATLAB fue mayor que el tiempo de ejecución para el algoritmo SVM-RFE, que utiliza el lenguaje de programación C. Por ejemplo, cuando se aplicó el SVM-RCE en un ordenador personal con un procesador P4-Duo-core de 3.0 GHz y 2 GB de RAM sobre el conjunto de datos (I), se obtuvieron los resultados en aproximadamente 9 horas para 100 iteraciones (10 pliegues repetidos 10 veces). Los mismos resultados fueron obtenidos utilizando el algoritmo SVM-RFE (con el paquete svm-gist) en 4 minutos. Para determinar la fiabilidad de estos resultados, se ejecutó de nuevo el algoritmo SVM-RCE sobre el conjunto de datos (I), mientras se rastreaba simultáneamente el resultado de cada iteración y sobre cada nivel de grupos de genes. Los resultados obtenidos utilizando el algoritmo SVM-RCE, con independencia de las iteraciones, tuvieron una desviación estándar de 0,04 a 0,07. Los resultados obtenidos utilizando el algoritmo SVM-RFE tuvieron una desviación estándar de 0,2 a 0,23. Estos resultados muestran que el algoritmo SVM-RCE fue más robusto y más estable que el algoritmo SVM-RFE.

La misma superioridad del algoritmo SVM-RCE fue observada cuando se comparó el algoritmo SVM-RCE con el algoritmo PDA-RFE. Véase la Tabla 11 publicada y la Figura 11 utilizando agrupamiento jerárquico y escalado multidimensional (MDS) para ayudar a ilustrar la precisión mejorada de la clasificación del algoritmo SVM-RCE para el conjunto de datos (I). Los genes seleccionados mediante el algoritmo SVM-RCE separaron claramente las dos clases mientras que los genes seleccionados mediante el algoritmo SVM-RFE colocaron una o dos muestras en el lado erróneo del margen de separación.

También se apreció que el tiempo de ejecución para el algoritmo SVM-RCE que utiliza el código MATLAB fue mayor que para el algoritmo PDA-RFE, que utiliza el lenguaje de programación C.

Se demostró también la convergencia del algoritmo en la solución óptima, y que proporciona una ilustración más visual del algoritmo SVM-RCE, En resumen, se calculó el rendimiento medio sobre todos los grupos de cada nivel de reducción para el conjunto de datos (I).Véase la Figura 11 publicada, en la que ACC es la precisión, TP es la sensibilidad, y TN es la especificidad de los genes restantes, determinados sobre el conjunto de prueba. Avd es la precisión media de los genes albergados por los agrupamientos.

En resumen, se seleccionaron 1000 genes mediante prueba-t a partir del conjunto de ejercitamiento, distribuidos en 300 agrupamientos (número inicial de agrupamientos (n) = 300, número final de agrupamientos (m) = 2, parámetro de reducción (d) = 0,3, n-g = 1000) y a continuación se redujo recursivamente a 2 agrupamientos. El rendimiento medio de clasificación sobre el conjunto de prueba por agrupamiento en cada nivel de reducción (Figura 11 publicada, AVG lineal) mejoró drásticamente desde alrededor de un 55% a alrededor de un 95% según se redujo el número de agrupamientos. La precisión media también se incrementó según se eliminaron los agrupamientos bajos en información. Estos resultados soportan la sugerencia de que los agrupamientos menos significativos fueron retirados mientras que los agrupamientos informativos fueron conservados según se empleó el algoritmo RCE.

El algoritmo SVM-RCE fue también útil en cuanto a estimación de estabilidad, como fue evidenciado por los resultados sobre el conjunto de datos (I). La estabilidad fue estimada mediante obtención de valores de u (u = número de veces que se repite el proceso) de 1, 10 y 100 repeticiones, y comparando estos valores con los 20 genes más informativos devueltos de cada experimento. Alrededor de un 80% de los genes fueron comunes a las tres ejecuciones, lo que sugirió que los resultados del algoritmo SVM-RCE fueron robustos y estables.

En resumen, estos datos ilustran que el algoritmo SVM-RCE proporciona información importante que no puede ser obtenida utilizando algoritmos del estado de la técnica que evalúan la contribución de cada gen individualmente. Aunque las observaciones iniciales estaban basadas en los 2 agrupamientos superiores necesarios para la separación de conjuntos de datos con 2 clases conocidas de muestras, es decir, los conjuntos de datos (I) y (II), el análisis puede ser extendido a la captura de, por ejemplo, los 4 agrupamientos superiores de genes.

Los resultados sugieren que la selección de genes significativos para su clasificación, utilizando el algoritmo SVM

RCE, fue más fiable que los algoritmos SVM-RFE o PDA-RFE. El algoritmo SVM-RFE utiliza el coeficiente de peso, el cual aparece en la fórmula de SVM, para indicar la contribución de cada gen al clasificador. El éxito del algoritmo SVM-RCE sugirió que las estimaciones basadas en la contribución de genes, que compartían un perfil similar (genes correlacionados), eran importantes y proporcionaban a cada grupo de genes el potencial para ser categorizados como un grupo. Además, los genes seleccionados por el algoritmo SVM-RCE tenían la garantía de ser útiles para la clasificación global puesto que la medición de los genes (grupo de genes) de mantenimiento o de retirada estaba basada en su contribución al rendimiento del clasificador. La formación de agrupamientos sin supervisar por el algoritmo SVM-RCE es también útil para identificar sub-grupos de muestras biológica o clínicamente importantes.

Ejemplo 6: Formatos de ensayo

Para proporcionar una signatura biomarcadora que pueda ser usada en la práctica clínica para diagnosticar cáncer de pulmón, se proporcionó un perfil de expresión genética con número más pequeño de genes que conservan una precisión satisfactoria, mediante el uso de tres o más genes identificados en la Tabla I, II, III o IV. Estos perfiles o signaturas genéticas permiten pruebas más simples y más prácticas que son fáciles de usar en un laboratorio clínico estándar. Puesto que el número de genes discriminantes es bastante pequeño, las plataformas PCR cuantitativas en tiempo real se desarrollan utilizando estos perfiles de expresión genética.

A. PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR)

Un ensayo diagnóstico según se describe en la presente memoria, puede emplear Matrices de Baja Densidad TAQMAN® (TLDA). Los perfiles de expresión genética descritos en la presente memoria sugieren que el número requerido de genes es compatible con estas plataformas. La RT-PCR ha sido considerada como el “estándar de oro” para validar resultados de matriz. Sin embargo, al constituir un diagnóstico basado en PCR, se incrementan los problemas de reproducibilidad con el número de genes requeridos para incrementar la diagnosis y, de forma más crítica, si las diferencias en los niveles de expresión son pequeñas.

Inicialmente, se usó una tarjeta micro-fluídica de Matriz de Baja Densidad TAQMAN® diseñara para ensayar 24 genes por duplicado utilizando ensayos TAQMAN® Multiplexados. Esta configuración particular ensaya 8 muestras diferentes que han sido cargadas en los puertos numerados de la parte superior de la tarjeta. Un perfil de 24 genes fue probado por duplicado con 8 muestras por tarjeta. Cada muestra fue ensayada por duplicado en pocillos precargados con los ensayos de gen específicos, reduciendo la variabilidad asociada a los ensayos de pocillo simple. Las reacciones de transcripción reversa para cada una de las 8 muestras fueron cargadas en los pocillos con la parte superior etiquetada como 1-8. Esta plataforma es útil tanto para validación de resultados de la matriz como para el desarrollo de una plataforma de diagnóstico que va a ser probada sobre nuevas muestras. La utilización de las tarjetas TLDA simplifica significativamente la validación de expresión de matriz, y también proporciona una alternativa razonable a las plataformas de matriz StaRT PCR y Enfocada, a efectos de validación de clasificador.

B. StaRT PCR

StaRT PCR (Expresión de Gen) es esencialmente una PCR competitiva con estándares internos tanto para el gen de interés como para el (los) gen(es) de limpieza. Disponer de controles internos para los genes experimentales y de limpieza, tiene la ventaja de proporcionar una referencia conocida en cada muestra, y una cuantificación directa de números de copia de mensaje en vez de un número de copia relativa, según se ha referenciado en una curva estándar con un ARN de referencia. Esta técnica es en la actualidad la única tecnología que cumple las guías de la FDA respecto a Métodos de Ensayo Multi-Gen para Farmacogenómica. La alta precisión absoluta de este método se sustituye en los métodos descritos en la presente memoria por el uso de múltiples genes y controles internos. Sin embargo, la matriz de diagnóstico puede ser probada frente a StaRT PCR para comparar la precisión y el coste.

C. Matriz de gen de diagnóstico enfocada

Según se desarrollaron los perfiles de diagnóstico, los resultados procedentes de matrices Illumina fueron comparados con datos RT-PCR procedentes de las TLDAs. Cualquiera de entre una matriz ILLUMINA habitual o una TDLA habitual, puede estar diseñada para uso clínico.

Ejemplo 7: Estudios que utilizan un diagnóstico de matriz y una herramienta PCR para diagnosticar cáncer de pulmón en muestras procedentes de pacientes con nódulos de pulmón pequeños, no diagnosticados

Se validó la utilidad diagnóstica de los ensayos clínicos descritos en lo que antecede. La población del estudio consistió en sujetos en los que había sido identificado un nódulo de pulmón mediante exploración ya sea de rayos X

o ya sea de CT. Este grupo de pacientes representaba una población ideal para el uso de un biomarcador por dos razones principales. En primer lugar, el riesgo global de cáncer de pulmón era relativamente alto (18-50%) en este grupo, dependiendo del tamaño del nódulo (>0,8 cm). En segundo lugar, existían riesgos y costes importantes asociados a la evaluación diagnóstica de estos pacientes, lo que en general incluye exploraciones CT serie, exploraciones PET, procedimientos de biopsia invasiva, y, en algunos casos, cirugía.

Los sujetos del estudio eran pacientes con un nódulo pulmonar solitario, no calcificado (>0,8 cm y <3 cm de

diámetro) detectado mediante exploración de rayos X o de CT. Solamente los sujetos sin síntomas específicos que fueran sugerentes de malignidad (por ejemplo, hemoptisis, pérdida significativa de peso) fueron incluidos (es decir, pacientes asintomáticos). Síntomas no específicos (por ejemplo, disnea o tos) son frecuentemente comunes en fumadores actuales o antiguos, y por lo tanto los sujetos con estos síntomas fueron incluidos. Los pacientes en los que se descubrió que tenían un nódulo de pulmón no calcificado, fueron evaluados normalmente en base a la probabilidad clínica de la malignidad. De ese modo, todos los sujetos del grupo fueron finalmente identificados como un caso de cáncer de pulmón o bien como un sujeto de control en base a los criterios patológicos y clínicos específicos que se han expuesto en lo que antecede. Los sujetos del caso utilizados para este objetivo, eran similares a los sujetos del caso que se ha descrito en los ejemplos que anteceden.

La población de control (sujetos con nódulos benignos) era diferente de la población de control descrita en los ejemplos anteriores dado que solamente se incluyeron pacientes con nódulos de alto riesgo. Los controles fueron confirmados mediante análisis radiográfico o estabilidad radiográfica durante más de dos años.

Los datos procedentes de ensayos cuantitativos de RT-PCR o de matrices de gen enfocadas, fueron evaluados como pruebas diagnósticas. El análisis principal estimó la sensibilidad y especificidad de los perfiles de expresión de gen descritos en lo que antecede. Puesto que la sensibilidad y la especificidad dependen del valor del punto de corte del valor cuantitativo de RT-PCR (para un biomarcador simple) o de la puntuación discriminante lineal (para una matriz de biomarcadores), se ejecutó un análisis de características operativas del receptor (ROC) que esquematizó la sensibilidad y la especificidad como una función del valor del punto de corte. El área bajo la curva de ROC fue estimada mediante métodos convencionales59.

Se estimó el valor predictivo positivo (PPV) y el valor predictivo negativo (NPV), es decir, la posibilidad de que un sujeto con una prueba positiva tenga realmente cáncer (el PPV) o la probabilidad de que un sujeto con una prueba negativa no tenga cáncer (el NPV). Puesto que estas cantidades dependen de la prevalencia de cáncer en el grupo que está siendo probado, así como de la sensibilidad y especificidad de la prueba, estas cantidades fueron calculadas respecto a que se mantuviera una gama de probabilidades de prevalencias posibles en diferentes poblaciones clínicas. Se llevó a cabo un análisis de subgrupo para determinar el efecto de la raza, del género, de la edad y del estado de fumar sobre la precisión de la puntuación discriminante.

Se efectuó un análisis de regresión logística (virtualmente equivalente al análisis discriminante lineal (LDA)) de los marcadores objetivo, y se evaluaron determinadas variables clínicas utilizando la alternativa de rutina de carga60 para corregir el sobre-ajuste en la estimación de tales índices de predicción como el área bajo la curva de ROC y la estadística alfa de Cronbach. Las variables clínicas importantes (tamaño de nódulo, años de paquete, años desde que dejó de fumar, edad y género), fueron usadas para crear un modelo predictivo básico. El valor de los biomarcadores de expresión genética para predecir cáncer de pulmón fue calculado creando modelos adicionales que incorporen la puntuación discriminante lineal. Este análisis estableció el valor incremental de los biomarcadores de expresión genética como parte de la evaluación clínica de pacientes con nódulos de pulmón asintomáticos.

Para determinar si el biomarcador es útil como activador para el cambio en la intervención en un ensayo, las estimaciones de tamaño de muestra estuvieron basadas en valores objetivo en cuanto a especificidad de 0,9 y sensibilidad de 0,9. Para asegurar estos intervalos de confianza para que la sensibilidad y la especificidad no se extiendan más que un 5% de los valores estimados, se usaron al menos 138 casos y 138 controles.

Ejemplo 8: Determinación de valores predictivos positivos (PPV) y negativos (NPV) para el NSCLC frente al perfil de NHC

Los valores para el PPV y el NPV calculados respecto a la sensibilidad y la especificidad alcanzadas probando los cánceres de NSCLC combinados frente a las muestras de NHC, han sido mostrados en la Tabla IX que sigue. Los valores de prevalencia sugeridos por el Grupo Biomarcador de Cáncer de Pulmón (LCBG) de EDRN disponibles en (http//edm.nci.nih.gov/resources/simple-reference-sets) fueron adoptados con fines de protección. El valor de prevalencia es 0,01 para una población en riesgo de edad >50 y un estado de fumador >30 años, y 0,05 para un individuo que presenta una exploración de CT anormal, con un nódulo no calcificado de entre 0,5 y 3 cm. Estos valores de PPV y NPV fueron comparados con los valores considerados como útiles para su estudio adicional por el LCBG, y con los valores determinados a partir de un reciente estudio que utiliza un perfil de 80 genes obtenido a partir de raspados bronquiales, suponiendo la misma prevalencia. El clasificador de 15 genes (véase la Tabla IV, col. NSCLC/NHC) supera ya el rendimiento sugerido mediante LCBG para un buen candidato biomarcador, y también excedía el de la especificidad de biomarcador de cáncer de pulmón publicado más recientemente.

Tabla IX

Valores Predictivos Positivos y Negativos para NSCLC de 15 genes frente a perfil de NCH

Sujeto

Sensibilidad Especificidad Prevalencia PPV NPV

Clasificador de 80 genes (Spira et al., 51)

0,83 0,76 1% 0,034 0,998

5%

0,154 0,988

Biomarcador propuesto de LCBG

0,80 0,70 1% 0,026 0,997

5%

0,123 0,985

NSCLC frente a clasificador de 15 genes NCH

0,86 0,79 1% 0,040 0,998

5%

0,177 0,991

Ejemplo 9: Cálculos de potencia

Con el fin de estimar el número de muestras necesarias para conseguir una precisión especificada a partir de las clasificaciones, se utilizó el método conocido como Mujherjee52. La estimación se hizo construyendo una curva de aprendizaje empírica que expresaba una tasa de error de clasificación e como una función n del tamaño del conjunto de ejercitamiento, de acuerdo con: e(n) = an-α + b, donde a, α, b han de ser encontrados mediante ajuste de la curva a las tasas de error observadas cuando se utiliza una gama de tamaños de conjunto de ejercitamiento elaborados a partir de un conjunto de datos preliminares. El conjunto de datos preliminares consistió, en este caso, en 78 NSCLC de tipos de células mezcladas y 52 muestras de NHC, dando como resultado 130 muestras disponibles para cálculos de potencia. Éste fue el conjunto de clasificación más dificultoso. Las tasas de error fueron registradas tomando subconjuntos de ejercitamiento de tamaños de 25, 32, 38, 45, 51, 58, 64, 70 y 71 muestras (corresponden aproximadamente a un 20% a 60% de las muestras), conservando la proporción original de casos de NSCLC y de NHC.

La SVM fue ejecutada 50 veces por cada tamaño utilizando muestras aleatorias cada vez, muestras de clasificación que utilizan los 500 mejores genes seleccionados mediante prueba-t entre casos y controles. Las tasas de error medio, junto con cantidades porcentuales de un 25% y 75% por cada tamaño de conjunto de ejercitamiento, fueron utilizadas para ajustar la curva de aprendizaje. La tasa de error para esta formación clasificadora que utiliza 117 muestras (un 90%) como conjunto de ejercitamiento, puede ser observada sobre la curva de ROC con una AUC de 0,867 (no representada). La precisión de un 83% (error de un 17%) está basada en la curva calculada (no en la representada). La tasa de error real fue de 0,17 observada para el tamaño de ejercitamiento máximo disponible a partir de datos preliminares. Se detectaron aproximaciones de de tasa de error de un 25% y un 75% en un conjunto (datos no representados).

Ejemplo 10: Clasificación de adenocarcinoma (AC) de pulmón en fase de desarrollo temprana y de carcinoma de célula escamosa de pulmón (LSCC) a partir de PBMC usando matrices de cADN

Para determinar si era posible detectar una signatura de expresión de gen en la sangre periférica que pudiera estar correlacionada con NSCLC en fase temprana, se usaron muestras procedentes de pacientes de AC y de LSCC puesto que éstos representan alrededor de un 85% de todos los NSCLC. Las formas menos comunes de NSCLC (por ejemplo, un carcinoma de célula grande) pueden ser detectadas también mediante la formación de un clasificador sobre los tipos más comunes de NSCLC.

El procesamiento de todas las muestras para purificación de ARN se llevó a cabo bajo condiciones estandarizadas.

Los inventores generaron un clasificador mediante obtención de ARN de PBMC a partir de conjuntos de pacientes de control “no sanos” (NHC) y pacientes con varios tipos y fases de desarrollo de NSCLC, y realizando análisis de micro-matriz utilizando una plataforma de cADN, es decir, matrices de cADN de nailon fabricadas por la Wistar Genomics Core.

El análisis fue llevado a cabo utilizando Máquinas de Vector de Soporte con Eliminación de Característica Recursiva (SVM-RFE), según ha sido descrito en los ejemplos 4 y 5, y en otras publicaciones48. En algunos casos se utilizó el algoritmo de las Máquinas de Vector de Soporte con Eliminación de Grupo Recursivo (SVM-RCE) (Publicación de solicitud de Patente Internacional núm. WO 2004/105573). Los intentos iniciales por clasificar patrones a partir de controles procedentes de PBMC usando SVM-RFE, dieron como resultado tasas de error para algunas de las comparaciones, en particular todas las de cáncer frente a NHC, demasiado altas para ser útiles (precisión media de alrededor de un 70%). Para direccionar la baja relación señal/ruido, se desarrolló un nuevo algoritmo SVM-RCE que agrupa los genes (mediante agrupamiento de K-medios) en grupos cuya expresión diferencial está correlacionada, y que elimina recursivamente los agrupamientos menos informativos en vez de genes individuales. Esto da como resultado una selección final de grupos de genes cuya expresión diferencial cambia en conjunto. Sobre 6 conjuntos de datos1 publicados, este método demostró ser más preciso en cuanto a clasificación que la SVM-RFE o el análisis discriminante penalizado (PDA-RFE), y en algunos casos también dio como resultado un agrupamiento biológicamente significativo de muestras. Éste es el más útil en cuanto a datos con baja relación señal/ruido o alta varianza puesto que la utilización de grupos de genes como variables minimiza los efectos de ambos aspectos mencionados de los datos.

Si se aplicó SVM-RFE o SVM-RCE, con el fin de eliminar en sobre-ajuste dentro de un conjunto de datos, se utilizó validación cruzada de M-pliegues (siendo M igual a 10). El algoritmo fue ejercitado sobre M-1 pliegues del caso y del grupo de control, y a continuación probado sobre el restante 1 pliegue. Esto garantiza que cada muestra se emplee

como sujeto de prueba. Se calculó la puntuación media para cada paciente y también la puntuación media para cada gen. El (los) gen(es) menos informativo(s) fue (fueron) eliminado(s), y se repitió el proceso. Las Tablas XA y XB muestran la precisión de clasificación y la sensibilidad (tasa positiva verdadera) y la especificidad (tasa negativa verdadera) frente al número de genes utilizados para la clasificación. Las alternativas analíticas están descritas con detalle en lo que sigue.

Los datos para los 208 pacientes y controles listados en la Tabla XA, han sido mostrados en la Tabla XB. Estos datos fueron procesados en tres “lotes” diferentes denominados conjuntos 3, 4 y 5. Según se describe en la Tabla XA, las muestras fueron agrupadas como adenocarcinomas en fase de desarrollo temprana (AC T1T2), adenocarcinomas en fase de desarrollo tardía (AC T3T4), cáncer de pulmón de célula escamosa en fase de desarrollo temprana (LSCC T1T2) y controles no sanos (NHCs). Tanto los casos como los controles eran normalmente fumadores antiguos o ex-fumadores.

En segundo lugar, aunque la clasificación de los NSCLCs en fase de desarrollo temprana fue muy difícil, se pudo conseguir una precisión muy buena comparando los ACs con los NHCs o bien los LSCCs con los NHCs solos o respecto a un clasificador combinado AC+LSCC (Tabla XB- 3 líneas superiores). La comparación de AC+LSCC con los NHCs necesitó inicialmente 287 genes para clasificar muestras combinadas en fase de desarrollo temprana con NHCs con una precisión de un 80% (línea 1). Sin embargo, estos resultados sugirieron que podía ser posible desarrollar un clasificador más general que pudiera detectar tanto ACs como LSCCs. Cuando los ACs y los LSCCs fueron segregados y clasificados por separado, se necesitaron inicialmente 160 genes para distinguir ACs en fase de desarrollo temprana de los NHCs con una precisión de un 85%, y solamente 56 genes para identificar el LSCC con la misma precisión. Se encontró entonces que la comparación entre las muestras de ACs y LSCCs en fase de desarrollo temprana requería solamente 21 genes para la discriminación, confirmando las observaciones previas de los inventores diferencias significativas entre estos 2 tipos de células de NSCLC. Finalmente, según se muestra en la Tabla IV, columna “AC/NHC”, un perfil genético de 15 genes puede distinguir AC respecto a otras formas de NSCLC. Se prevé un análisis adicional para demostrar que solamente se necesita una cantidad tan baja como 6 genes para este perfil, al igual que con el perfil de pre/post cirugía formado por los 6 genes superiores de la Tabla IV, col. Pre/Post.

TABLA XA

Sumario de Muestras Analizadas sobre Matrices de cADN

AC T1T2

59

AC T3T4

18

LSCC T1T2

36

LSCC T3T4

12

NHC

95

TABLA XB

Clases de muestras comparadas

# Genes Requer. Para Clasif./# grupos Precisión de la Clasificación Sensibilidad Especificidad

1AC+LSCC T1T2 frente a NHC

287/22 0,8 0,82 0,78

1AC T1T2 frente a NHC

160/11 0,85 0,83 0,85

2LSCC T1T2 frente a NHC

105 0,87 0,72 0,93

2LSCC T1T2 frente a NHC

56/2 0,85 0,90 0,84

2AC T1T2 frente a LSCC T1T2

21 0,88 0,92 0,81

AC T1T2 frente a LSCC T1T2

3 0,85 0,86 0,83

AC T1T2 frente a AC T3T4

10 0,92 0,98 0,72

1AC T3T4 frente a NHC

15/2 0,88 0,77 0,94

1 Se utilizó SVM-RCE para estos análisis 2 Se informaron dos precisiones en las que resulto un pequeño descenso de precisión a partir de un gran descenso en el número de genes

Puesto que las diferencias de expresión genética detectadas entre los casos y los controles podían estar causadas por un cambio en alguna fracción de la población de PBMC, se llevó a cabo un estudio de una pequeña citometría de flujo comparando fracciones de PBMC procedentes de linfocitos de 14 NHC con linfocitos de 14 pacientes con AC, 15 pacientes con LSCC, y otros 6 con NSCLC. En concordancia con los recientes hallazgos49 para pacientes con melanoma maligno, no existió diferencia estadísticamente significativa en proporciones de Células-T, Células-B

o monocitos de CD4 o CD8 entre los casos y los controles.

Ejemplo 11: Clasificación de NSCLCs en fase de desarrollo temprana (T1/T2) a partir de NHCs sobre matrices Q-PRC de ILLUMINA

Los resultados de la matriz de cADN necesitaron 287 genes para distinguir las clases combinadas de muestras de NSCLC de los NHCs (véase la Tabla XB, línea 1, que antecede). Los datos Illumina permitieron, sin embargo, el desarrollo de un clasificador más preciso y global para clasificación de AC/NHC con muchos menos genes. Los datos de Illumina disponibles para este análisis incluían 78 muestras de NSCLCs (incluyendo 51 ACs, 15 LSCCs, 12 NSCLCs sin clasificar) y 52 muestras de NHC. El análisis de SVM-RFE indicó que 15 genes podían clasificar este conjunto de datos con una precisión de un 83%. Véase la Tabla IV anterior. Las puntuaciones de SVM para los pacientes individuales y los controles, mostradas en la Figura 3, fueron generadas a partir del rendimiento del clasificador de 15 genes de la Tabla IV, columna NSCLC/NHC. Estos resultados muestran que se puede usar un clasificador más general para clasificar los dos tipos de células principales de NSCLC.

En un experimento, se utilizó la PBMC de 44 pacientes con AC pequeño (tumores de tamaño T1 o T2) frente PBMC procedente de 95 controles emparejados por la edad, el género y la acción de fumar. Se generaron puntuaciones discriminantes utilizando matrices de nailon y SVM-RCE según se ha descrito con anterioridad. Los resultados se proporcionan en la Figura 2. Una puntuación positiva indica cáncer de pulmón, y una puntuación negativa indica que no hay cáncer. Cada columna representa un paciente o muestra de control únicos. La altura de la columna es una medición de lo bien clasificada que está una muestra individual. Las muestras de control están a la derecha y se les ha dado una puntuación negativa. Los pacientes están a la izquierda. Las barras más claras con puntuación positiva son controles mal clasificados y las barras más oscuras con una puntuación negativa son casos mal clasificados. Las muestras del margen con puntuaciones cercanas a cero, podrían estar sin clasificar. Solamente se han mostrado las muestras de AC T1T2. Las muestras del centro donde las columnas cambian de positivas a negativas,

o viceversa, están mal clasificadas. Utilizando este clasificador que emplea 15 genes de la Tabla IV, col. AC/NHC, se identificó la presencia de cáncer de pulmón en fase de desarrollo temprana con una precisión de un 85%.

En otro experimento, se compararon cuarenta y cuatro (44) muestras de pacientes con AC T1T2 en fase de desarrollo temprana con 52 NHC. Los genes fueron filtrados mediante prueba-t y a continuación se aplicó SVM-RFE (véase el ejemplo 4 ó 5) y los 15 genes seleccionados por SVM-RFE fueron utilizados (Tabla IV, columna AC/NHC). Las precisiones de clasificación fueron analizadas con eliminación progresiva de gen (desde 2781 genes a 1) mediante SVM-RFE48 (datos no mostrados), midiendo Positivos Verdaderos, es decir, el número de pacientes a los que el clasificador asignó correctamente una puntuación de SVM positiva, y Negativos Verdaderos, es decir, el número de controles a los que el clasificador asignó correctamente una puntuación de SVM negativa. La puntuación fue representada gráficamente como (TP+TN)/n (n = número total de muestras). La relación s/n favorable y la varianza más baja utilizando las matrices Illumina, hicieron que el uso del algoritmo SVM-RCE fuera innecesario. Se utilizó SVM-RFE para todos los estudios Illumina puesto que la SVM-RCE necesita tiempos de ejecución mucho más largos que la SVM-RFE. El clasificador óptimo s elige en base a la mejor precisión con el número más pequeño de genes. Se encontró que niveles de expresión de sólo 15 genes (por ejemplo, los 15 genes superiores de la Tabla IV, columna etiquetada como TODOS/NHC) discriminan los ACs T1T2 en fase de desarrollo temprana de los NHCs con una precisión global de un 85%. Esta misma precisión fue encontrada con matrices de cADN, pero se necesitaron inicialmente 160 genes para este grado de separación. Estos resultados confirman que el perfil de expresión genética no es una plataforma específica. El descubrimiento del perfil de expresión genética original de los inventores fue confirmado sobre una segunda plataforma totalmente diferente.

Ejemplo 12: Cambios en signaturas asociadas a tumor en PBMC tras la extracción del tumor

Para identificar una signatura que refleje la presencia de tumor y que sea útil para la evaluación de la probabilidad de recurrencia, se compararon perfiles de PBMC procedentes del subconjunto de pacientes con cánceres de pulmón en fase temprana de los que se habían tomado muestras de sangre con anterioridad y recientes (2-6 meses) después de la cirugía “curativa”. Esto minimizó el “ruido” de fondo de modo que una signatura de expresión genética correlacionada con la presencia de un tumor puede ser identificada más fácilmente. La reversión del perfil de PBMC a un perfil de “cáncer de pulmón”, pronostica así la recurrencia.

A. Efecto de presencia de tumor

Con el fin de determinar si la diferencia en los perfiles de expresión genética apreciada entre los casos y los controles dependía de la presencia del tumor, los inventores examinaron cómo unas muestras de PBMC tomadas en el mismo paciente de NSCLC antes de la cirugía y de nuevo ∼2-6 tras meses después de la cirugía fueron clasificadas con el clasificador de 15 genes que fue seleccionado, en comparación con 78 pacientes de NSCLC y 52 NHCs (véanse las Figuras 3 y 4). Los genes seleccionados en esta comparación como muestras de pre-post fueron extraídos de pacientes con AC, con LSCC o bien con NSCLC indeterminados. Las muestras de NSCLC pre-cirugía fueron incluidas en el análisis mostrado en las Figuras 3 y 4, pero las muestras post-cirugía no fueron incluidas. Las muestras post-cirugía comprenden un conjunto de prueba independiente. La razón era determinar si las muestras de paciente recogidas en la post-cirugía conservaban la signatura de tumor, lo que en este caso se ha indicado mediante una puntuación predictiva positiva, o si la extracción del tumor podía reducir la signatura de tumor y

aquellas deberían puntuar ahora más como los controles. Las probabilidades de que esto ocurriera por casualidad son <0,01.

13 de 16 pares de pacientes presentaron una reducción en la puntuación predictiva de tumor tras la cirugía. Seis de los casos tienen puntuaciones pre-cirugía positivas y una puntuación post cirugía que es negativa, situándolos claramente en la clase de control, mientras que 4 muestras adicionales tuvieron caídas significativas en las muestras post-cirugía llevándolas a valores cercanos a cero. Dos de los casos no tuvieron ningún cambio en la puntuación de tumor tras la cirugía, y 1 caso tuvo un incremento en la puntuación de tumor. Dos de los casos tienen una puntuación pre-cirugía negativa pero incluso en este caso se hace más negativa en la muestra post-cirugía. Un seguimiento adicional del paciente determina la medida en que las puntuaciones post-cirugía son un pronóstico en cuanto a recurrencia. La observación de que la signatura de tumor disminuyó después de la extracción de la malignidad, soportó que el perfil o la signatura de expresión genética fuera una respuesta a la presencia del tumor. Véanse las Figuras 5 y 6.

B. Comparación de muestras de pre-y post- cirugía

Las muestras de pre-cirugía fueron comparadas con las muestras de post-cirugía para determinar si las 2 clases de muestras podían ser separadas en base a las diferencias intrínsecas que fueron mostradas por los análisis por parejas en la Figura 3. Las 16 muestras pre-cirugía fueron comparadas con las 16 muestras post-cirugía. Se llevó a cabo SVM-RFE a partir de los 1.000 genes identificados mediante prueba-t utilizando validación cruzada de 10 pliegues repetida 10 veces. Solamente se determinaron seis genes para distinguir las muestras pre- de las post- con una precisión de un 93%. Este clasificador de 6 genes (los genes superiores identificados en la Tabla IV (columna Pre/Post) fueron utilizados entonces para generar puntuaciones discriminantes para las muestras de pre- y postcirugía como se muestra en la Figura 3. Las muestras de pre-cirugía (sombreado oscuro) están todas clasificadas correctamente aunque una muestra tiene una puntuación cercana a cero. Una de las muestras post-cirugía tiene una puntuación negativa cercana a cero y 2 están mal clasificadas. Este resultado sugiere que se podría desarrollar un clasificador que pudiera ser eficaz en cuanto a la protección de pacientes post-cirugía respecto a recurrencia debido a que podría proporcionar la posibilidad de comparar puntuaciones post-cirugía con la puntuación pre-cirugía inicial del mismo paciente con el tiempo. Las muestras que siguen proporcionan un indicador sensible de recurrencia.

En otro estudio, utilizando datos de matriz Illumina, se seleccionaron genes por comparación de muestras de cáncer de pulmón pre-cirugía con controles de fumador con NHC. Se utilizaron cincuenta y cuatro (54) genes para clasificar las muestras post-cirugía. Se dio una puntuación discriminante a cada muestra (el positivo es indicativo de cáncer de pulmón; el negativo es indicativo de que no hay ningún cáncer). En el análisis de fase temprana (no representado) en todas menos en una comparación la puntuación post- es más baja que la puntuación de la muestra pre-cirugía, lo cual es adyacente. En tres casos, la puntuación de la muestra post-cirugía es negativa, clasificando estas muestras con los controles de COPD. Este dato soporta la detección de una signatura de expresión de gen relacionada con tumor que disminuye tras la cirugía. La extensión de estos cambios refleja la posibilidad de recurrencia.

Dados los resultados positivos del estudio piloto sobre 16 muestras emparejadas presentadas en el estudio, la utilidad de esta prueba se basa en su aplicación junto con la presencia de un nódulo de pulmón detectado mediante otros procedimientos tal como mediante exploraciones de CT. Además, se pueden diferenciar NSCLCs de diferentes tipos de células (ACs y LSCCs) mediante una signatura diseñada para hacer esta distinción.

Ejemplo 13: Comparación de los 15 genes superiores según estén clasificados, mediante SVM-RFE para los 3 clasificadores de SVM-RFE

Los 15 genes superiores por orden de SVM-RFE a partir de los 3 estudios Illumina, han sido listados en la Tabla IV que antecede. Los órdenes para cada uno de los genes según se han asignado en los estudios individuales por SVM, se mantienen en la Tabla IV. Para la comparación de AC/NHC y la comparación de todos los tipos de células de NSCLC con NHC (TODOS/NHC), los 15 genes listados son los genes utilizados para asignar las puntuaciones de SVM mostradas en las Figuras 2, 4 y 6. Los 15 genes para la comparación de TODOS/NHC fueron p<32x10-5. Los 15 genes de AC/NHC fueron p<2x10-4 y los genes de Pre/Post fueron p<6x10-43. Los primeros 6 genes de la columna PRE/POST fueron usados para generar las puntuaciones para la Figura 4. Los genes mostrados con tipos en negrita son comunes para 2 ó 3 comparaciones. Los genes que no son comunes a los 3 clasificadores no son necesariamente únicos para esa comparación sino que pueden aparecer simplemente en una posición de orden más bajo en las listas de genes ampliadas. Ocho de los 15 genes de categoría superior para la AC/NHC y la de TODOS/NHC aparecen en ambas listas. De los 6 genes superiores utilizados para la clasificación de PRE/POST, 3 están listados en cualquiera, o en ambas de las otras listas. Dos sondas para HSPA8 están listadas. La (A) indica que todos los isotipos de HSPA8 son detectados por esta sonda, (I) indica que un isotipo específico (en este caso, la variante 1 de transcripción) es detectado por la segunda sonda de HSPA8.

Los datos sobre la clasificación informada de plataforma de matriz de cADN proporcionan precisiones para las comparaciones de NSCLCs de diferentes tipos de células y de fases de desarrollo T y en NHCs, y de unos con otros. Los datos preliminares de los inventores sobre la plataforma Illumina estaban limitados a aquellos pacientes con AC en fase de desarrollo temprana frente a NHCs o NSCLCs combinados frente a NHCs. Esto fue por decisión propia, puesto que los ACs son el tipo más común de NSCLCs y era importante minimizar la heterogeneidad histológica en las muestras iniciales que iban a ser analizadas en la nueva plataforma. Un clasificador más general incluye un conjunto de muestra de casos más diversificados que incluyen LSCCs y NSCLCs indeterminados. Las muestras adicionales ensayadas sobre matrices Illumina demuestran si los subtipos particulares de cáncer de pulmón (es decir, AC frente a LSCC) tienen sus propios patrones de expresión distintos según sugieren las matrices

5 de cADN y/o si existe alguna signatura de PBMC que pueda identificar de manera precisa todos los NSCLCs en fase de desarrollo temprana.

En una realización, la columna de TODOS/NHC de la Tabla IV muestra el perfil de 15 genes para identificar un NSCLC a partir de controles. En otra realización, la columna de AC/NHC de la Tabla IV muestra el perfil de 15 genes para identificar un AD. En otra realización más, la columna de PRE/POST muestra el perfil de 15 genes para

10 identificar la eficacia de la resección quirúrgica del tumor y la prognosis respecto al futuro. Según se ha descrito anteriormente, este perfil de gen ha sido reducido con éxito a solamente los 6 genes superiores de esa columna. Se entiende que selecciones más pequeñas de genes podrán ser identificadas para los otros dos perfiles indicados también. En otra realización, las signaturas específicas del tipo de célula que utilizan genes que están presentes en las tres signaturas, se prevé que aumenten la potencia predictiva de estas puntuaciones informadas.

15 Ejemplo 14: Signatura de expresión de 29 genes

Para identificar una signatura de expresión genética de PBMCs que pudiera distinguir de forma precisa pacientes con cáncer de pulmón respecto a controles sin cáncer con factores de riesgo similares (es decir, emparejados por edad, género, raza, historia como fumador), se compararon perfiles de expresión genética de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes con NSCLC, con un grupo de control con enfermedad de pulmón no

20 maligna relacionada con el fumar. Se encontró una signatura genética distintiva y se validó sobre 2 conjuntos independientes de muestras no usadas para selección de gen. Los cambios de expresión genética fueron comparados también entre muestras de pre- y post- cirugía de 18 pacientes.

Se encontró una novedosa signatura de diagnóstico de 29 genes (genes categorizados como 1-29 en la Tabla V), que distingue individuos con NSCLC de controles con enfermedad de pulmón no maligna con una sensibilidad de un

25 91%, una especificidad de un 79% y una AUC de ROC de un 92%. Las precisiones sobre conjuntos independientes de 18 muestras de NSCLC a partir de la misma posición y de 27 muestras desde una posición independiente, fueron de un 74% y un 79%, respectivamente. La signatura de 29 genes fue reducida significativamente tras la extracción del tumor en el 83% de un subconjunto de 18 pacientes en los que se midió la expresión genética antes y después de la resección quirúrgica.

30 Aunque ambas situaciones de fumar y COPD pueden afectar, cada una de ellas, a la expresión genética de PBMC, se puede identificar la respuesta adicional a la presencia de un tumor, permitiendo la diagnosis de pacientes con cáncer de pulmón a partir de controles con alta precisión. La signatura de PBMC es particularmente útil en el algoritmo de diagnóstico para esos pacientes con un nódulo de pulmón no calcificado. La observación de que la signatura de 29 genes disminuye tras la resección quirúrgica, soporta que está relacionada con el tumor.

35 Poblaciones de estudio: Los participantes en el estudio (Tabla XVI) para los conjuntos iniciales de ejercitamiento y validación fueron reclutados en el Centro Médico de la Universidad de Pennsylvania (Penn) durante el período de 2003 a 2007: 91 sujetos con una historia de uso de tabaco sin cáncer de pulmón que incluyen 41 sujetos que tenían un nódulo de pulmón no calcificado diagnosticado como benigno después de una biopsia, y 155 pacientes con cáncer de pulmón de célula no pequeña confirmado histopatológicamente, recién diagnosticado. Los sujetos con

40 cualquier historia anterior de cáncer o en tratamiento de cáncer salvo cáncer de piel no melanoma, fueron excluidos. El estudio fue aprobado por el Penn Institutional Review Boards. 27 pacientes y controles adicionales, fueron recopilados en el Centro Médico de la Universidad de Nueva York (NYU) bajo la aprobación de IRB y también aparecen listados en la Tabla XVI.

Tabla XVI: Resumen de datos demográficos____45 Categoría Número de pacientes_ Todos NSCLC frente NHC muestras experimentos_ Total 228__________

Controles 91 Pacientes 137

50 tenían COPD 128 sin COPD 82 COPD desconocida 18 sin COPD 82 Fumadores 34

55 Dejaron de fumar 170 Nunca fueron fumadores 24__________

Pacientes de NSCLC frente a NHC experimento___ Total 137__________

AC

85

LSCC

42

NSCLC

10

tiene COPD

63

sin COPD

65

COPD desconocida

9

Fase 1A

48

Fase 1A+1B

75

Fase 4

5 __________

Pacientes de NSCLC frente NHC

experimento ____

Total

137 __________

Fase1/2

93

Fase3/4

44

Fase 2/3/4

62

AC1A

30

AC1

48

AC 2/3/4

37

LSCC 1 A

16

LSCC 1

24

LSCC 2/3/4

18

Fumadores

26

Dejaron de fumar

102

Nunca fumaron

9__________

_____________________________________________ Controles de NSCLC frente NHC experimento______ Total 91__________

COPD pura (nada más) 38 GI/NM 41 tiene COPD 65 sin COPD 17 COPD desconocida 9 Fumadores 8 Dejaron de fumar 68 Nunca fumaron 15___________

Parejas Pre-post_______________________________ Total 18___________

AC 10 LSCC 6 NSCLC 2___________

Muestras NYU________________________________ Total 27___________

AC 12 NHC 15___________

Recogida y Procesamiento de PBMC: A los pacientes con cáncer de pulmón y los pacientes con enfermedad de pulmón no maligna, se les extrajo sangre con anterioridad a la cirugía y/o con anterioridad al tratamiento con quimioterapia. A los pacientes de control se les extrajo sangre en una visita clínica. Las muestras de sangre fueron elaboradas en dos tubos “CPT” (BD). La PBMC fue aislada dentro de los 90 minutos siguientes a la extracción de la sangre, lavada en PBS, transferida a solución RNA-Later (Ambion) y almacenada a continuación a 4 ºC durante la

noche con anterioridad a su transferencia a -80 ºC. Un subconjunto de PBMCs de pacientes, fueron analizadas mediante citometría de flujo con anticuerpos anti-CD3, CD4, CD8, CD14, CD16, CD19 o CD-56 o controles de isotipo (BC Biosciences) y analizadas usando software Flo-Jo. Las muestras procedentes de NYU fueron procesadas dentro de las 2 horas siguientes a la recogida, las PBMC fueron transferidas a Trizol (Invitrogen) y almacenadas a -80 ºC. El ARN extraído fue transferido a Wistar para su procesamiento adicional.

Procesamiento de Muestra: La purificación de ARN del primer conjunto de muestras “Penn” fue llevada a cabo utilizando TriReagent (Molecular Research) según se recomienda, y controlado en calidad utilizando el Bioanalizador. Solamente se usaron muestras con relaciones de 28S/16S que eran >0,75 para estudios adicionales. Una cantidad constante (400 ng) de ARN total fue amplificada según la recomendación de Illumina. El segundo conjunto de muestras “NYU” eran ADNs tratados con anterioridad a la hibridación. Las muestras fueron procesadas como lotes mezclados de pacientes y controles, e hibridizadas en matrices de perlas de genoma completo humano WG-6v2 de Illumina (http://www.illumina.com/paginas.ilmn?ID=197).

Control de calidad y pre-procesamiento de matriz: Todas las matrices fueron revisadas en cuanto a valores atípicos mediante cálculo a modo de gen entre correlación media de matriz y su comparación con la correlación para cada matriz. Se retiraron las sondas no informativas si su intensidad era baja en relación con el fondo en la mayoría de las muestras o si la relación máxima entre 2 muestras cualesquiera no era de al menos 1,2. Las matrices fueron a continuación normalizadas en cuanto a valor cuantil y el fondo fue substraído de los valores de expresión.

Análisis: Se realizó clasificación utilizando un Máquina de Vector de Soporte con eliminación de característica recursiva (SVM-RFE)19 utilizando validación cruzada de 10 pliegues repetida 10 veces. Las puntuaciones de clasificación para cada una de las muestras fueron registradas en cada etapa de reducción, descendente hasta un solo gen. Se calculó la precisión media para cada etapa de reducción y todos los genes en los puntos de máxima precisión formaron el discriminador inicial que se sometió después a reducción adicional para formar el discriminador final según se describe en lo que sigue.

PCR cuantitativa en tiempo real: La validación de RT-PCR de los resultados de la matriz fue llevada a cabo utilizando el Sistema TaqMan ABI según lo recomendado, en un Sistema PCR 7900HT de ABI. Cada muestra fue analizada por duplicado, y se repitieron las muestras con CVs entre réplicas que eran más de 0,5 delta de Ct.

Los resultados se informan en lo que sigue:

Las variables clínicas y demográficas de las muestras del estudio (caso y control) se han resumido en la Tabla XVI anterior para 155 pacientes de caso y 91 controles clínicos incluyendo los diagnosticados clínicamente como nódulos benignos. Los grupos fueron similares en términos de edad, raza, género e historia de fumador. El 84% del grupo de control clínico y el 93% del grupo de NSCLC eran fumadores actuales o antiguos. Estas muestras fueron recopiladas todas en el Centro Médico de la Universidad de Pennsylvania. Se utilizaron 12 pacientes adicionales y 15 controles para validación externa. Se llevó a cabo citometría de flujo sobre 35 casos de cáncer y 14 controles. No existieron diferencias significativas en los porcentajes de células-T, células CD4, células-B, monocitos, o células NK (datos no representados). El grupo de tumor tenía un porcentaje ligeramente más bajo de células CD8 (18,9%) que los controles (24,5%), lo que llegó a ser significativo.

Los perfiles de expresión genética en muestras de PBMC de 137 pacientes con NSCLC fueron comparados con 91 controles con enfermedad de pulmón no maligna (controles no sanos, NHC) para determinar si se podían detectar diferencias coherentes en cuanto a expresión genética a través de un gran conjunto de datos. Se encontró que la expresión de gen en PBMC identificaba individuos con un cáncer de pulmón, por ejemplo, NSCLC. Sobre 4.500 de

48.000 sondas (9%) fueron cambiadas significativamente (prueba-t de dos colas, p<0,5, tasa de descubrimiento falsa del 8%) entre casos y control. A efectos de comparación, los datos informados sobre tumores de pulmón identificaron 1.649 de 12.600 transcripciones (13%) que distinguen adenocarcinomas respecto al tejido pulmonar normal, y 1.886 (15%) que distinguen carcinoma de célula escamosa del pulmón de la misma importancia. La fracción de genes cambiados en la PBMC del paciente medio de NSCLC, es similar a la fracción informada de genes cambiados entre el tumor y su equivalente de tejido normal20.

Una máquina de vector de soporte con eliminación de característica recursiva (SVM-RFE) y validación cruzada de 10 pliegues, fue utilizada a continuación para encontrar el número mínimo de genes que podían distinguir los grupos de cáncer y de control de su expresión genética de PBMC. El proceso de selección de los 29 genes por SVM-RFE se describe con detalle como sigue.

Pre-Procesamiento de datos/Niveles de expresión y normalización: Se procesaron muestras como lotes mezclados (un total de 12 lotes) de pacientes y controles, y se hibridizaron en matrices de perlas de genoma completo humano WG-6v2 de Illumina. Los datos en bruto fueron procesados mediante software Bead Studio v. 3.0. Los niveles de expresión fueron exportados a sondas de control negativo y de señal. El conjunto de sondas de control negativo fue utilizado para calcular el nivel de fondo medio para un filtrado adicional y etapas de substracción de fondo. Los valores medios de los datos de expresión de sonda de señal para las matrices de muestra de los 137 pacientes (NSCLC) y los 91 controles (NHC) (resultados atípicos eliminados, véase lo que sigue), fueron usados como base para normalización y todas las matrices, incluyendo 18 muestras PRE/18 muestras POST y muestras NYU, fueron

normalizadas en valor cuantil respecto a esta base.

Control de calidad de matriz. Tras cada lote de hibridación, se calculó la correlación global de tipo gen como una correlación media de Spearman a través de todos los pares de micro-matrices procedentes de todos los lotes utilizando niveles de expresión de todas las sondas de señal (>48K). También se calculó la desviación absoluta media de la correlación global. A continuación, se calculó para cada micro-matriz una correlación media de Spearman respecto a todas las demás matrices. Las matrices cuya correlación media difiere de la correlación global en más de 8 desviaciones absolutas (el umbral fue determinado empíricamente) fueron marcadas como resultados atípicos y no fueron usadas para análisis adicionales. Se encontraron 22 resultados atípicos en varias fases de desarrollo, pero 11 de éstos proporcionaron datos válidos sobre matrices repetidas y éstos fueron incluidos en el análisis.

Substracción de fondo. Tras la normalización cuantil, el valor medio de fondo (60, según se determinó para estos datos) fue restado de cada uno de los datos de expresión de la sonda, lo que fue a continuación redondeado en descenso hasta una desviación estándar del fondo (15 para nuestros datos), el valor de expresión mínima usado en cualquier cálculo.

Filtraje de sonda. En base a las 137 matrices de muestra de paciente y las 91 de control, se definieron sondas no informativas al objeto de que fueran sondas no expresadas al menos 1,5 veces el fondo (corresponde a un valor de expresión de 30 para los datos de fondo substraídos) en más de un 25% (57) de las muestras o sondas que no cambiaron al menos 1,2 veces entre al menos dos muestras. Los datos de todas las matrices fueron filtrados eliminando estas sondas no informativas, dando como resultado datos de expresión de 15.227 sondas para el análisis. Estos procedimientos dan como resultado un valor cuantil normalizado, resultado atípico eliminado, fondo substraído, datos filtrados de sonda no informativa, que fueron analizados como sigue:

La alternativa principal incluyó un clasificador para un conjunto de datos ejercitado con la utilización del algoritmo de SVM. Se utilizó la estrategia de Eliminación de Característica Recursiva (RFE) para reducir el número de genes requeridos para la clasificación. A continuación, se empleó validación cruzada de 10 pliegues para evitar el sobreajuste de datos y proporcionar una estimación imparcial de la precisión del clasificador. El clasificador ejercitado aplicado a una muestra, proporcionó una puntuación discriminante que fue usada para pronosticar una de dos clases (enfermedad malina o no maligna, pre- o post-, etc.) para la muestra.

Validación cruzada. Se utilizó validación cruzada de 10 pliegues con 10 re-muestreos en las clasificaciones de NSCLC frente a NHC (incluyendo validaciones de exclusión y de permutación) y conjuntos de datos de PRE frente a POST. En cada una de las 10 etapas de re-muestro, los datos fueron divididos aleatoriamente en 10 partes (pliegues) mientras se conservaba la relación original de las dos clases. Cada pliegue fue usado como subconjunto de prueba una vez mientras que las otras 9 partes fueron usadas como subconjuntos de ejercitamiento. Esto dio como resultado 10 conjuntos únicos de ejercitamiento-prueba por cada re-muestreo, y se combinaron con 10 etapas de re-muestreo, 100 combinaciones únicas de 90% de muestras usadas para el ejercitamiento y 10% de muestras usadas para prueba. Esto aseguró también que cada muestra estaba involucrada en la prueba exactamente 10 veces. La prueba se hizo utilizando clasificadores que no estaban ejercitados sobre la muestra en modo alguno. Una puntuación discriminante para cada muestra fue calculada como promedio de 10 puntuaciones pronosticadas por clasificadores que no estaban ejercitados sobre un subconjunto que incluye la muestra.

RFE: Cada una de las 100 particiones únicas de ejercitamiento-prueba proporcionadas por validación cruzada, fue utilizada por SVM-RFE de manera independiente. A partir del subconjunto de ejercitamiento, se recuperaron los 1000 genes (características) superiores clasificados por medio de un valor p de la prueba-t entre las dos clases. El clasificador fue ejercitado utilizando un núcleo lineal para distinguir entre las clases utilizando niveles de expresión de esos genes. El clasificador fue aplicado a continuación a cada una de las muestras a partir del subconjunto de prueba y se registraron las puntuaciones discriminantes. A continuación, la SVM-RFE eliminó el 10% de los genes restantes que tenían coeficientes absolutos más pequeños en la función de puntuación del clasificador, es decir, aquellos genes menos importantes que afectaban a la puntuación final en lo más mínimo. El proceso se repitió (50 veces) hasta que quedó un gen para el ejercitamiento.

Rendimiento: 100 etapas de validación cruzada del proceso de SVM-RFE produjeron para cada muestra 10 puntuaciones de predicción en cada iteración de eliminación de característica. Se calculó una puntuación de muestra final como un valor medio de esas puntuaciones de predicción para cada conjunto de genes probados, desde 1000 a

1. La precisión, sensibilidad y especificidad de la clasificación fueron calculadas en base a las puntuaciones finales de las muestras, utilizando 0 como el umbral de clasificación, es decir, se clasificaron las muestras con puntuaciones >0 como de clase positiva, mientras que las muestras con puntuaciones <0 se clasificaron como negativas. Se seleccionaron los clasificadores ejercitados en tal característica de iteración de eliminación de característica que proporcionaron la mejor precisión, y un clasificador global para todas las muestras que consistía en genes de cada uno de los 100 clasificadores óptimos. Por ejemplo, 100 etapas de validación cruzada, cada una de ellas con una precisión máxima en alrededor de 8 genes, produjeron un clasificador global de 136 genes para un experimento de NSCLC frente a NHC (Tabla V anterior). Se construyó una curva de ROC de variación del umbral de clasificación desde el máximo entre puntuaciones de muestra, hasta el mínimo.

Minimización de clasificador: Para reducir el número de genes utilizados por clasificadores en todas las etapas de validación cruzada, sin re-ejercitamiento y con la condición de no reducción de precisión, los genes únicos que estuvieron involucrados en la clasificación para una iteración de RFE dada a través de todas las etapas de validación cruzada estaban clasificados por sus coeficientes absolutos promediados en la función de puntuación del clasificador. Los genes menos importantes fueron retirados, uno cada vez, de todas las funciones de puntuación. La precisión fue registrada para cada extracción y se utilizó un número mínimo de genes N que proporcionaron la misma precisión M de clasificación final. Se utilizó la notación “clasificador de N-genes que tiene una precisión de un M%” basada en estos resultados.

Aplicación de clasificador: Para nuevas muestras no utilizadas en validación cruzada, se aplicó un clasificador seleccionado en el máximo de precisión y a continuación se minimizó en genes. Este clasificador fue construido a partir de 100 sub-clasificadores recibidos en cada etapa de la validación cruzada para la iteración de RFE seleccionada. La puntuación final de la muestra fue un promedio de 100 puntuaciones proporcionadas por esos clasificadores. Obsérvese que cuando se aplica a una muestra que fue utilizada en la validación cruzada, solamente se usaron 10 de los 100 sub-clasificadores que no estaban ejercitados sobre la muestra.

137 muestras de NSCLC y 91 de NHC fueron repartidas en 5 partes. Se usó 1 parte como conjunto de exclusión y 4 partes fueron usadas como conjunto de datos que fue analizado utilizando SVM-RFE con validación cruzada de 10 re-muestreos, de 10 pliegues. El mejor clasificador final de N genes fue aplicado a continuación a la parte de exclusión. Se compararon las precisiones de la validación cruzada y de exclusión. Se generaron 10 conjuntos de datos de permutación. Las etiquetas de los 137 NSCLC y 91 HNC fueron mezcladas aleatoriamente y los datos fueron analizados utilizando SVM-RFE con validación cruzada de 10 re-muestreos, de 10 pliegues. Se seleccionó el clasificador de N genes con mejor precisión final para cada permutación, y se registró la precisión. Se calculó la precisión de permutación media a través de las 10 rondas.

El rendimiento medio de validación cruzada de SVM-RFE (figura no representada) indicó que, por término medio, se necesitaron 8 genes para obtener la mejor precisión en cada etapa durante las 100 etapas de validación cruzada. Las 100 etapas dieron como resultado 136 genes distintos informados en la Tabla V anterior. Los 136 genes que proporcionaron la mejor precisión fueron reducidos adicionalmente para la extracción por filtrado en tantos genes como fuera posible sin pérdida de precisión. Un polinomio de potencia 5 fue ajustado a la precisión para detectar el número de genes donde la precisión empieza a declinar (por ejemplo, a los 29 genes). Los genes de la Tabla V están clasificados por orden en base a su contribución a la puntuación de la clasificación final (el gen más importante está clasificado como el primero, etc.). Se han referenciado nombres y símbolos alternativos y el símbolo “NaN” indica que no se encuentra aún disponible un símbolo para el gen.

Se asignaron puntuaciones de clasificación mediante el clasificador de 29 genes a los 137 pacientes de NSCLC y los 91 pacientes con enfermedad de pulmón no maligna. Una puntuación positiva indicaba clasificación como cáncer, una puntuación negativa como enfermedad no maligna. La Tabla XI lista el número de ID del paciente, la clase de enfermedad (AC-adenocarcinoma, LSCC-carcinoma de célula escamosa de pulmón, NSCLC-sin caracterización adicional, pacientes de muestras de control No Sanos (NHC) con enfermedad de pulmón no maligna: COPD; enfermedad pulmonar obstructiva crónica solamente, Nódulos Benignos (determinados por biopsia). Otros: diversos tipos de enfermedades de pulmón sin diagnosis de COPD definida), la puntuación de clasificación de cada paciente, el error estándar del medio, el diagnóstico, y la fase de desarrollo del cáncer, si lo hay.

Tabla XI

Puntuaciones de SVM de pacientes individuales mediante clasificador de NSCLC de 29 genes

ID

Clase Puntuación Error DX Fase

NSCLC. 1519

NSCLC 1,77 0,21 AC 3A

NSCLC. 1138

NSCLC 1,65 0,07 LSCC 3B

NSCLC. 1471

NSCLC 1,64 0,32 NSCLC 3A

NSCLC. 1282

NSCLC 1,54 0,26 AC 3B

NSCLC. 1154

NSCLC 1,54 0,23 AC 3A

NSCLC. 1222

NSCLC 1,51 0,24 AC 1B

NSCLC. 1175

NSCLC 1,48 0,21 AC 1A

NSCLC. 1352

NSCLC 1,45 0,31 AC 1B

NSCLC. 1600

NSCLC 1,40 0,29 NSCLC 3B

NSCLC. 1647

NSCLC 1,39 0,23 LSCC 3B

NSCLC. 1280

NSCLC 1,38 0,30 LSCC 38

NSCLC. 1311

NSCLC 1,36 0,15 AC 1A

NSCLC. 1200

NSCLC 1,35 0,26 AC 3A

NSCLC. 1602

NSCLC 1,35 0,22 LSCC 1A

NSCLC. 1192

NSCLC 1,34 0,19 LSCC 1B

NSCLC. 1177

NSCLC 1,32 0,11 AC 1B

NSCLC. 1583

NSCLC 1,32 0,22 LSCC 3A

NSCLC. 1397

NSCLC 1,32 0,34 AC 1A

NSCLC. 1362

NSCLC 1,30 0,11 AC 3B

NSCLC. 1403

NSCLC 1,30 0,18 AC 3B

NSCLC. 1307

NSCLC 1,29 0,30 AC 1A

NSCLC. 1559

NSCLC 1,27 0,14 AC 3A

NSCLC. 1589

NSCLC 1,26 0,19 AC 28

NSCLC.1155

NSCLC 1,25 0,17 AC 3A

NSCLC. 1211

NSCLC 1,23 0,23 AC 1A

NSCLC. 1631

NSCLC 1,23 0,18 AC 2B

NSCLC. 1475

NSCLC 1,21 0,17 LSCC 1A

NSCLC. 1437

NSCLC 1,20 0,28 LSCC 3A

NSCLC. 1484

NSCLC 1,15 0,17 LSCC 3A

NSCLC. 1166

NSCLC 1,15 0,35 AC 1B

NSCLC. 1674

NSCLC 1,14 0,09 AC 3A

NSCLC. 1454

NSCLC 1,13 0,19 LSCC 28

NSCLC. 1361

NSCLC 1,12 0,28 AC 1B

NSCLC. 1569

NSCLC 1,11 0,21 NSCLC 3A

NSCLC. 1339

NSCLC 1,07 0,27 LSCC 28

NSCLC. 1264

NSCLC 1,06 0,29 LSCC 4

NSCLC. 1325

NSCLC 1,05 0,12 NSCLC 3B

NSCLC. 1632

NSCLC 1,05 0,15 AC 2A

NSCLC. 1473

NSCLC 1,03 0,30 AC 1B

NSCLC. 1402

NSCLC 1,02 0,24 AC 4

NSCLC. 1557

NSCLC 1,01 0,23 NSCLC 1B

NSCLC. 1183

NSCLC 0,98 0,25 AC 1A

NSCLC. 1455

NSCLC 0,97 0,16 LSCC 1A

NSCLC. 1194

NSCLC 0,97 0,17 AC 4

NSCLC. 1193

NSCLC 0,96 0,20 AC 1B

NSCLC. 1224

NSCLC 0,96 0,13 AC 2A

NSCLC. 1573

NSCLC 0,94 0,14 AC 3B

NSCLC. 1375

NSCLC 0,94 0,25 NSCLC 1A

NSCLC. 1214

NSCLC 0,93 0,32 LSCC 1B

NSCLC. 1630

NSCLC 0,92 0,22 NSCLC 3A

NSCLC.1343

NSCLC 0,92 0,20 AC 3A

NSCLC. 1561

NSCLC 0,91 0,21 LSCC 2A

NSCLC. 1435

NSCLC 0,89 0,25 AC 1A

NSCLC. 1221

NSCLC 0,88 0,32 AC 3A

NSCLC. 1449

NSCLC 0,87 0,14 LSCC 1A

NSCLC. 1413

NSCLC 0,85 0,21 LSCC 18

NSCLC. 1287

NSCLC 0,84 0,20 AC 1B

NSCLC. 1387

NSCLC 0,84 0,21 AC 3A

NSCLC. 1140

NSCLC 0,83 0,21 AC 38

NSCLC. 1598

NSCLC 0,83 0,31 AC 1A

NSCLC. 1415

NSCLC 0,78 0,20 AC 1A

NSCLC. 1369

NSCLC 0,77 0,21 AC 1B

NSCLC. 1591

NSCLC 0,75 0,10 AC 1A

NSCLC. 1469

NSCLC 0,75 0,25 AC 1A

NSCLC. 1141

NSCLC 0,75 0,23 AC 1B

NSCLC. 1340

NSCLC 0,74 0,37 AC 1A

NSCLC. 1178

NSCLC 0,73 0,13 LSCC 3B

NSCLC. 1604

NSCLC 0,73 0,21 AC 2B

NSCLC. 1429

NSCLC 0,70 0,15 LSCC 1A

NSCLC. 1681

NSCLC 0,67 0,26 NSCLC 3B

NSCLC. 1542

NSCLC 0,67 0,24 AC 1A

NSCLC. 1572

NSCLC 0,66 0,26 AC 1A

NSCLC. 1143

NSCLC 0,66 0,31 AC 1A

NSCLC. 1439

NSCLC 0,66 0,36 AC 38

NSCLC. 1189

NSCLC 0,61 0,27 LSCC 3A

NSCLC. 1189

NSCLC 0,61 0,27 LSCC 3A

NSCLC. 1312

NSCLC 0,61 0,27 AC 2B

NSCLC. 1323

NSCLC 0,61 0,32 AC 4

NSCLC. 1466

NSCLC 0,61 0,30 LSCC 2B

NSCLC. 1643

NSCLC 0,59 0,21 AC 3B

NSCLC. 1550

NSCLC 0,58 0,21 AC 2B

NSCLC. 1423

NSCLC 0,55 0,26 LSCC 1B

NSCLC. 1468

NSCLC 0,54 0,19 LSCC 1A

NSCLC. 1167

NSCLC 0,54 0,31 AC 1A

NSCLC. 1436

NSCLC 0,54 0,31 AC 1A

NSCLC. 1368

NSCLC 0,53 0,16 AC 1A

NSCLC. 1158

NSCLC 0,52 0,41 AC 1A

NSCLC. 1137

NSCLC 0,51 0,26 AC 2B

NSCLC. 1656

NSCLC 0,51 0,12 AC 3A

NSCLC. 1592

NSCLC 0,50 0,20 LSCC 1B

NSCLC. 1489

NSCLC 0,48 0,29 AC 2A

NSCLC. 1566

NSCLC 0,47 0,21 LSCC 3B

NSCLC. 1284

NSCLC 0,45 0,25 LSCC 1A

NSCLC. 1204

NSCLC 0,43 0,31 LSCC 1A

NSCLC. 1400

NSCLC 0,43 0,33 LSCC 1A

NSCLC. 1622

NSCLC 0,42 0,42 NSCLC 1A

NSCLC. 1482

NSCLC 0,42 0,19 LSCC 1A

NSCLC. 1390

NSCLC 0,41 0,11 LSCC 2B

NSCLC. 1597

NSCLC 0,39 0,11 AC 3A

NSCLC. 1388

NSCLC 0,36 0,27 NSCLC 3B

NSCLC. 1444

NSCLC 0,35 0,23 AC 3A

NSCLC. 1463

NSCLC 0,35 0,22 LSCC 1A

NSCLC. 1586

NSCLC 0,34 0,29 LSCC 1A

NSCLC. 1233

NSCLC 0,30 0,28 LSCC 2A

NSCLC. 1713

NSCLC 0,29 0,22 AC 3B

NSCLC. 1344

NSCLC 0,29 0,28 AC 1B

NSCLC. 1171

NSCLC 0,27 0,35 LSCC 1A

NSCLC. 1590

NSCLC 0,25 0,18 AC 3A

NSCLC. 1196

NSCLC 0,25 0,26 LSCC 2B

NSCLC. 1451

NSCLC 0,24 0,22 AC 1B

NSCLC. 1709

NSCLC 0,24 0,23 LSCC 3B

NSCLC. 1560

NSCLC 0,23 0,30 AC 3A

NSCLC. 1584

NSCLC 0,19 0,44 AC 1A

NSCLC. 1269

NSCLC 0,18 0,23 LSCC 1A

NSCLC. 1595

NSCLC 0,17 0,23 LSCC 1B

NSCLC. 1286

NSCLC 0,16 0,25 AC 1A

NSCLC. 1202

NSCLC 0,14 0,31 AC 1B

NSCLC. 1292

NSCLC 0,13 0,22 LSCC 1B

NSCLC. 1491

NSCLC 0,12 0,17 AC 1B

NSCLC. 1373

NSCLC 0,09 0,23 AC 1B

NSCLC. 1303

NSCLC 0,09 0,20 LSCC 1A

NSCLC. 1614

NSCLC 0,08 0,28 LSCC 1B

NSCLC. 1337

NSCLC 0,05 0,31 AC 1A

NSCLC. 1453

NSCLC 0,02 0,15 AC 4

NSCLC. 1227

NSCLC 0,01 0,32 AC 1A

NSCLC. 1216

NSCLC -0,01 0,38 AC 1A

NSCLC. 1254

NSCLC -0,09 0,30 LSCC 1A

NSCLC. 1136

NSCLC -0,13 0,32 AC 1A

NSCLC. 1346

NSCLC -0,15 0,21 AC 2A

NSCLC. 1445

NSCLC -0,32 0,35 AC 2A

NSCLC. 1431

NSCLC -0,34 0,29 AC 1A

NSCLC. 1582

NSCLC -0,38 0,17 AC 1B

NSCLC. 1427

NSCLC -0,43 0,24 AC 1A

NSCLC. 1430

NSCLC -0,45 0,23 AC 1A

NSCLC. 1153

NSCLC -0,51 0,27 AC 1A

NSCLC. 1262

NSCLC -0,51 0,29 AC 1A

NSCLC. 1548

NSCLC -0,61 0,31 AC 1B

NSCLC. 1386

NSCLC -0,65 0,32 AC 5B

NHC. 1218

NHC 1,13 0,36 GI 0

NHC. 1588

NHC 0,96 0,31 GI 0

NHC. 1146

NHC 0,80 0,23 HAM 0

NHC. 10062

NHC 0,77 0,33 COPD 0

NHC. 1554

NHC 0,72 0,20 NM 0

NHC. 10027

NHC 0,60 0,30 COPD 0

NHC. 1474

NHC 0,59 0,19 NM 0

NHC. 1628

NHC 0,51 0,37 GI 0

NHC. 10010

NHC 0,48 0,29 HTN 0

NHC. 1263

NHC 0,48 0,21 NM 0

NHC. 1619

NHC 0,45 0,10 GI 0

NHC. 1361

NHC 0,42 0,27 NM 0

NHC. 1575

NHC 0,38 0,19 GI 0

NHC. 1522

NHC 0,21 0,12 GI 0

NHC. 1562

NHC 0,11 0,27 NM 0

NHC. 10047

NHC 0,11 0,31 COPD 0

NHC. 1424

NHC 0,04 0,21 GI 0

NHC. 10037

NHC 0,02 0,32 COPD 0

NHC. 10063

NHC -0,01 0,22 COPD 0

NHC. 1677

NHC -0,05 0,15 GI 0

NHC. 10044

NHC -0,16 0,23 SARC 0

NHC. 1260

NHC -0,16 0,25 NM 0

NHC. 1182

NHC -0,23 0,38 PN 0

NHC. 10043

NHC -0,25 0,31 COPD 0

NHC. 10064

NHC -0,29 0,29 COPD 0

NHC. 1148

NHC -0,30 0,35 GI 0

NHC. 1184

NHC -0,30 0,26 NM 0

NHC. 1618

NHC -0,33 0,20 GI 0

NHC. 10046

NHC -0,33 0,15 COPD 0

NHC. 1657

NHC -0,37 0,25 SARC 0

NHC. 10034

NHC -0,44 0,24 COPD 0

NHC. 10036

NHC -0,45 0,21 COPD 0

NHC. 10058

NHC -0,47 0,23 COPD 0

NHC. 10054

NHC -0,49 0,20 COPD 0

MHC. 10028

NHC -0,50 0,14 COPD 0

NHC. 10004

NHC -0,52 0,32 PS 0

NHC. 10040

NHC -0,53 0,20 COPD 0

NHC. 1442

NHC -0,56 0,32 NM 0

NHC. 1438

NHC -0,61 0,25 NM 0

NHC. 10038

NHC -0,63 0,20 COPD 0

NHC. 1488

NHC -0,64 0,16 GI 0

NHC. 10042

NHC -0,65 0,22 COPD 0

NHC. 1594

NHC -0,66 0,17 GI 0

NHC. 1186

NHC -0,66 0,36 NM 0

NHC. 1399

NHC -0,66 0,29 GI 0

NHC. 1191

NHC -0,68 0,27 NM 0

NHC. 10048

NHC -0,69 0,30 COPD 0

NHC. 10061

NHC -0,69 0,35 COPD 0

NHC. 10049

NHC -0,70 0,28 COPD 0

NHC. 10055

NHC -0,70 0,25 COPD 0

NHC. 10023

NHC -0,74 0,17 CR 0

NHC. 1242

NHC -0,74 0,27 NM 0

NHC. 10003

NHC -0,77 0,34 HTN 0

NHC. 10039

NHC -0,80 0,22 COPD 0

NHC. 1697

NHC -0,84 0,14 GI 0

NHC. 1309

NHC -0,86 0,25 NM 0

NHC. 1305

NHC -0,92 0,19 GI 0

NHC. 1185

NHC -0,93 0,21 NM 0

NHC. 1289

NHC -0,94 0,28 NM 0

NHC. 1277

NHC -0,94 0,27 NM 0

NHC. 10029

NHC -0,95 0,21 COPD 0

NHC. 10053

NHC -0,97 0,18 COPD 0

NHC. 1616

NHC -1,00 0,11 NM 0

NHC. 10030

NHC -1,03 0,25 SARC 0

NHC. 10019

NHC -1,07 0,10 NHC 0

NHC. 10035

NHC -1,07 0,14 COPD 0

NHC. 10051

NHC -1,08 0,19 COPD 0

NHC. 10013

NHC -1,08 0,28 COPD 0

NHC. 1251

NHC -1,09 0,19 GI 0

NHC. 10008

NHC -1,11 0,28 GI 0

NHC. 10018

NHC -1,13 0,15 COPD 0

NHC. 10012

NHC -1,21 0,21 COPD 0

NHC. 1342

NHC -1,22 0,21 GI 0

NHC. 10052

NHC -1,25 0,25 COPD 0

NHC. 10041

NHC -1,27 0,18 COPD 0

NHC. 10031

NHC -1,32 0,27 COPD 0

NHC. 1490

NHC -1,34 0,15 NM 0

NHC. 1250

NHC -1,37 0,26 NM 0

NHC. 10005

NHC -1,40 0,13 CR 0

NHC. 1267

NHC -1,43 0,12 NM 0

NHC. 10057

NHC -1,52 0,27 COPD 0

NHC. 1450

NHC -1,56 0,34 GI 0

NHC. 10001

NHC -1,56 0,16 HTN 0

NHC. 10022

NHC -1,57 0,20 COPD 0

NHC. 10059

NHC -1,65 0,15 COPD 0

NHC. 1328

NHC -1,65 0,14 NM 0

NHC.1314

NHC -1,68 0,20 GI 0

NHC.10050

NHC -1,82 0,19 COPD 0

NHC. 10033

NHC -1,83 0,20 COPD 0

NHC. 10032

NHC -1,89 0,15 COPD 0

NHC. 10056

NHC -2,45 0,10 COPD 0

Ejemplo 15: Estudios de validación independientes sobre muestras de exclusión

Para direccionar cuestiones de sobre-ajuste de datos y para probar la generalidad del modelo de clasificación antes de aplicarlo a nuevas muestras, el análisis volvió a ser llevado a cabo, dejando a un lado el 20% de los pacientes y 5 muestras de control, incluyendo representantes de cada una de las subclases para validación y ejercitamiento sobre el 80% restante. 5 conjuntos de exclusión separados y no solapantes fueron sometidos a esta validación. La precisión media sobre los 5 conjuntos de validación fue del 81% en comparación con una precisión media de un 82% para los 5 conjuntos de ejercitamiento (datos no representados). La precisión similar de los conjuntos de ejercitamiento y de validación demostró la capacidad del algoritmo para clasificar nuevas muestras con precisión 10 pronosticada. La precisión ligeramente más baja con los conjuntos de exclusión en comparación con la validación cruzada utilizando todos los datos (81% frente a 86%) fue un reflejo del número más pequeño de muestras disponibles para ejercitamiento. Por el contrario, la precisión media del análisis con etiquetas de muestra permutadas fue sólo del 58% a través de 10 ejecuciones de permutación. Se concluyó que la signatura de 29 genes de la Tabla V puede distinguir pacientes con cualquiera de los dos tipos principales de NSCLC y cualquiera de las

15 cuatro fases de desarrollo del tumor, a partir de pacientes con enfermedades de pulmón relacionadas con el tabaco pero no malignas.

Ejemplo 16: Precisión de la clasificación para subclases de paciente y de control utilizando 29 genes

La precisión del clasificador de 29 genes fue examinada para los diferentes tipos de pacientes y controles en el conjunto de datos. La Tabla XII que sigue relaciona las precisiones para los 29 genes en la identificación de las

20 diversas clases de pacientes y controles así como las crecientes fases de desarrollo de tumor patológico. Las precisiones de clasificación individual para AC o LSCC solos fueron del 86% y 98% respectivamente en comparación con el 91% para los pacientes combinados. Había como mucho la mitad de LSCC en el conjunto de datos, pero estaban clasificados con una precisión significativamente más alta.

Las líneas 7-12 de la Tabla XII mostraron un aumento incremental en la precisión de la clasificación desde la fase de

25 desarrollo 1A (83%) hasta las fases de desarrollo 3 y 4 (100%), lo que supone que la signatura de cáncer de PBMC se vuelve más pronunciada con la enfermedad progresiva. Si solamente se consideraron los controles con COPD y sin ninguna evidencia de nódulos de pulmón, éstos se clasificaron con una precisión del 89%, mientras que los pacientes con nódulos benignos confirmados (con independencia del estado de COPD) tuvieron una precisión de clasificación del 71%. De ese modo, la precisión de clasificación estuvo influenciada por la fase de desarrollo del

30 cáncer.

Tabla XII

Rendimiento del clasificador de 29 genes sobre subclases de pacientes y controles

#

Subclase Precisión por clase Número de muestras

1

NSCLC 91% 137

2

NHC 80% 91

3

AC 86% 85

4

LSCC 98% 42

5

Nódulos 71% 41

6

COPD 89% 38

7

Fase 1A 83% 48

8

Fase 1B 89% 27

9

Fase 1 85% 75

10

Fase 2 89% 18

11

Fase 3 100% 39

12

Fase 4 100% 5

Aunque 29 genes fueron suficientes para distinguir las clases de paciente y de control, muchos genes estadísticamente más significativos fueron expresados diferencialmente (véase la Tabla V). Las funciones

5 moleculares más altamente representadas incluían regulación de expresión de gen, muerte celular y crecimiento celular y diferenciación. Los genes asociados a la generación de células T de memoria, acumulación de célula T y movilización de células NK estaban en su mayoría en el cáncer, mientras que las vías de señalización de receptor de célula B eran descendentes. Los genes asociados a la activación o la quimiotaxia de células de mieloide y de genes de señalización de receptor gluco-corticoide, eran en su mayoría descendentes en los pacientes de cáncer.

10 La aplicación clínica de la signatura de expresión genética de PBMC es clara. Suponiendo una prevalencia de cáncer de pulmón del 5% para pacientes con un nódulo de pulmón entre 0,5 y 3,0 cm, el clasificador de 29 genes (con un valor de punto de corte de cero), se entiende que consigue un valor predictivo positivo (PPV) y negativo (NPV) de 0,19 y 0,99, respectivamente, según se muestra en la Tabla XIII que sigue. Estos valores exceden los establecidos por el Grupo Biomarcador de Cáncer de Pulmón EDRN que determina si un biomarcador debe ser

15 considerado útil para un estudio adicional. Éstos son similares a los valores para el panel de expresión de 80 genes procedentes de los raspados bronquiales recientemente descritos18. De forma importante, se podría conseguir incluso una utilidad clínica más alta en muchos pacientes sacando ventaja del valor real de la puntuación predictiva en vez de usar un punto de corte de puntuación estricta positiva o negativa. En el gran conjunto de datos mostrado en la Tabla XI anterior, ningún sujeto con una puntuación SMV menor de -0,65 tenía cáncer de pulmón y solamente

20 de 5 a 91 pacientes de control de no cáncer que tuvieron una puntuación SMV >+0,65 fueron clasificados como cáncer de pulmón. De ese modo, el valor real de la puntuación SVM es útil para determinar qué pacientes requieren una intervención invasiva en oposición a una alternativa más conservadora, tal como una serie de imágenes CT.

Tabla XIII

Valor predictivo positivo y valor predictivo negativo para clasificador de NSCLC de 29 genes

Estudio

Sensibilidad Especificidad Prevalencia PPV NPV

NSCLC vs. NHC ----------------------------clasificador 29 genes

0,91 0,8 1% -------------------5% 0,044 ------------0,193 0,999 ----------0,004

Spira et al., 2007 ----------------------------clasificador 80 genes

0,8 0,84 1% --------------------5% 0,048 ------------0,208 0,998 ----------0.998

LCBG -----------------------------Biomarcador propuesto

0,8 0,7 1% --------------------5% 0,026 -----------0,123 0,997 ----------0,985

Ejemplo 17: Clasificación de muestras de paciente y de control desde un sitio independiente

Todas las muestras utilizadas para desarrollar y validar el panel de 29 genes fueron recogidas en el Hospital de la Universidad de Pennsylvania. Para una validación adicional de la utilidad del clasificador, se analizaron 27 muestras recogidas en el Centro de Biomarcadores de Cáncer de Pulmón NYU, una Clínica de Red de Investigación de

5 Detección Temprana (EDRN) y en el Centro de Validación Epidemiológica. Las 27 muestras incluían 12 NSCLC de Fase 1 (5 de los cuales nunca habías sido fumadores), y 15 controles de fumadores y ex-fumadores, incluyendo 6 controles diagnosticados mediante exploraciones de serie CT como que tenían Opacidades de Vidrio Deslustrado (GGO)21 no malignas. Ninguna de las muestras de GGO fue incluida en nuestro conjunto de ejercitamiento original.

A pesar de las diferencias en cuanto a los sitios de recogida, al procesamiento de muestra y a la distinta población

10 de control, las 27 muestras fueron clasificadas con una precisión global de un 74% (20 de 27), una sensibilidad del 67% (8 de 12) y una especificidad del 80% (12 de 15). La clasificación SMV se muestra con detalle en la Tabla XIV que sigue.

Tabla XIV

Puntuaciones de clasificación SMV mediante clasificador de NSCLC para muestras de validación NYU

ID

Clase Puntuación Error Dx

NYU. 1

NSCLC 1,07 0,06 AC

NYU. 2

NSCLC 1,01 0,07 AC

NYU. 3

NSCLC 0,95 0,06 AC

NYU. 4

NSCLC 0,81 0,07 AC

NYU. 5

NSCLC 0,71 0,08 AC

NYU. 6

NSCLC 0,48 0,06 AC

NYU. 7

NSCLC 0,29 0,08 AC

NYU. 8

NSCLC 0,18 0,09 AC

NYU. 9

NSCLC -0,25 0,09 AC

NYU. 10

NSCLC -0,29 0,10 AC

NYU. 11

NSCLC -0,37 0,10 AC

NYU. 12

NSCLC -0,94 0,08 AC

NYU. 13

NHC 1,16 0,10 GGO

NYU. 14

NHC 0,70 0,11 N

NYU. 15

NHC 0,69 0,10 GGO

NYU. 16

NHC -0,12 0,08 N

NYU. 17

NHC -0,13 0,09 GGO

NYU. 18

NHC -0,26 0,08 N

NYU. 19

NHC -0,39 0,09 GGO

NYU. 20

NHC -0,39 0,08 N

NYU. 21

NHC -0,46 0,10 N

NYU. 22

NHC -0,52 0,10 N

NYU. 23

NHC -0,58 0,07 N

NYU. 24

NHC -0,73 0,09 N

NYU. 25

NHC -0,75 0,10 N

NYU. 26

NHC -0,84 0,09 GGO

NYU. 27

NHC -0,94 0,08 GGO

Abreviaciones Dx: AC = adenocarcinoma, N = normal, GGO = Opacidades vidrio deslustrado

15 Dos de los pacientes mal clasificados nunca fueron fumadores y 2 de los controles fueron GGOs. La reducida precisión en el conjunto de validación externa resultó más probable debido a las diferencias en el procesamiento de las muestras (datos no representados).

Ejemplo 18: Clasificación de 29 genes de muestras independientes antes y después de la extracción del tumor

El clasificador de 29 genes fue probado sobre un conjunto independiente de 26 muestras procedentes de 18 pacientes de NSCLC que incluían tanto muestras de pre- como de post- resección. En primer lugar, como validación adicional, cuando se usa este clasificador, catorce de las 18 muestras pre-cirugía fueron clasificadas correctamente como cáncer, para una sensibilidad del 78%. En segundo lugar, las puntuaciones SVM para 13 de las 14 (92%) mostraron reducciones significativas en la puntuación de clasificación tras la resección quirúrgica. Siete de las muestras post-resección tuvieron puntuaciones SMV que eran negativas y fueron clasificadas como no cáncer en este análisis (datos no representados). No existió correlación obvia entre el cambio en las puntuaciones de SVM y el tiempo de recogida de PBMC de post-resección, aunque el conjunto de datos es relativamente pequeño.

Los perfiles de expresión genética cambian en la PBMC después de la extracción del tumor, según se demuestra a continuación. El análisis mostrado en la Figura 5 de las muestras pre/post emparejadas, fue realizado para determinar si el clasificador de 29 genes desarrollado sobre pacientes con enfermedad maligna frente a no maligna podía detectar una diferencia en la expresión de gen tras la extracción del tumor. Dada la observación de que esto fue cierto para la mayoría de las muestras, se examinó la magnitud de las diferencias en las clases de muestra. Los pares de muestra fueron comparados directamente para evaluar mejor los cambios en la expresión de gen que pudieran resultar de la extracción del tumor. Se encontró un efecto significativo sobre la expresión de gen de PBMC; se encontró que 2060 genes estaban expresados de manera diferente a través de los pares (prueba-t de dos colas emparejadas, p<0,05 con una tasa de descubrimiento falsa del 28%).

Se generó un clasificador SVM separado para los pacientes de pre- y post- cirugía y los 50 genes que forman ese conjunto clasificador fueron informados en la Tabla VI anterior. Un clasificador seleccionado a partir de los genes de Tabla VI fue capaz de separar perfectamente las dos clases con sólo cuatro genes. Los cuatro genes de jerarquía superior de este clasificador incluyen CYP2R1 (una hidroxilasa de vitamina D microsómica), MYO5B (3-oxoacil-Coenzima A tiolasa mitocondrial), DGUOK (Desoxiguanosina Kinasa Mitocondrial), todas ellas post-cirugía reguladas descendentemente, y DNCL1 (Doineína, citoplásmica, cadena ligera 1) que está regulada ascendentemente tras la cirugía. Dos (CYP2R1 y DGUOK) de los 4 genes fueron también validados mediante PCR Cuantitativa en Tiempo Real sobre 10 pares de muestras. Los resultados se han indicado en la Figura 6 y en la Tabla XV que sigue.

Tabla XV

Relaciones de expresión PRE/POST cirugía de PBMC para 10 pacientes según se determinó mediante matrices de expresión de gen Illumina y análisis QPCR

Paciente

CYP2R1 DGUOK

Matrices Illumina

PCR Matrices Illumina PCR

4

1,13 1,33 1.33 1,21

5

1,55 1,28 1,12 1,01

6

1,49 1,73 1,21 1,41

7

1,33 1,06 1,12 1,17

11

1,44 1,58 1,38 1,09

14

1,37 1,29 1,30 1,25

15

1,15 2,65 1,14 2,14

16

1,42 0,96 1,19 0,76

17

1,60 1,57 1,21 1,56

18

1,10 1,09 1,31 1,15

PROMEDIO

1,36 1,45 1,23 1,27

Ejemplo 19: Signatura de expresión de gen para diferenciación de pacientes con nódulos de pulmón benignos

Puesto que los pacientes con diagnosis de un nódulo benigno son la clase de control más importante para la diferenciación, se desarrolló un clasificador separado utilizando solamente los controles con nódulos benignos y se evaluó su precisión. Utilizando los 41 controles con nódulos y un grupo seleccionado aleatoriamente de 54 muestras de NSCLC, se aplicó SVM-RFE con validación cruzada, según se ha descrito con anterioridad. El clasificador resultante (Tabla VII, genes 1-24) tuvo una precisión de un 79%, con una especificidad de un 80% para los nódulos y sólo requirió 24 genes, 7 de los cuales estaban incluidos en el panel de 29 genes. La Tabla VII relaciona el rango del gen “RANGO” en NSCLC frente al clasificador NHC, el ID de Mancha Illumina “ID”, el Núm. de Adhesión “Núm. Acc.”, la descripción del gen, su símbolo, el NSCLC frente al valor p de GI.NM “valor-p”, y el cambio de pliegue de NSCLC/GI.NM “Fold Chg”.

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Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1.- Una composición para evaluar la existencia de un cáncer de pulmón en un sujeto mamífero, consistiendo dicha composición en: tres o más polinucleótidos u oligonucleóticos, en la que cada polinucleótido u oligonucleótido hibridiza un gen, fragmento de gen o transcripción de gen o producto de expresión diferente a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o de sangre total del mamífero, y

   en la que cada uno de dichos gen, fragmento de gen, transcripción de gen o producto de expresión se elige a partir de los genes 1-29 de la Tabla V.
2. 2.- La composición de acuerdo con la reivindicación 1, la cual es un reactivo que comprende un substrato sobre el que se inmovilizan dichos polinucleótidos u oligonucleótidos.
3. 3.- La composición de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una micro-matriz, una tarjeta micro-fluídica, un chip o una cámara.
4. 4.- La composición de acuerdo con la reivindicación 1, la cual es un kit que contiene dichos tres o más polinucleótidos u oligonucleótidos, en la que dichos polinucleótidos u oligonucleótidos son cada parte de un conjunto de imprimador-sonda, y dicho kit comprende tanto imprimadores como sondas, en la que conjunto de imprimadorsonda citado amplifica un gen, fragmento de gen o producto de expresión de gen diferente.
5. 5.- La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que uno o más polinucleótidos u oligonucleótidos está(n) asociado(s) a una etiqueta detectable.
6. 6.- La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dichos genes seleccionados comprenden 4 o más genes.
7. 7.- La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dichos genes seleccionados comprenden 15 o más genes.
8. 8.- La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dichos genes seleccionados comprenden 20 a 29 genes.
9. 9.- La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dichos genes seleccionados consisten en los genes 1 a 29 de la Tabla V.
10. 10.- Uso de una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para el diagnóstico in vitro de la existencia de un cáncer de pulmón, que comprende identificar cambios en la expresión de tres o más genes procedentes de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o de la sangre total de un sujeto, en el que los cambios de expresión de los genes del sujeto con respecto a una referencia están correlacionados con un diagnóstico de un cáncer de pulmón.