ES2387358B1 - Procedimiento para la determinación de la predisposición genética a la enfermedad de parkinson. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la determinación de la predisposición genética a la enfermedad de Parkinson.#La presente invención proporciona un procedimiento para predecir la predisposición de un individuo a padecer la enfermedad de Parkinson (PD) a partir de una muestra de sangre aislada de dicho individuo. Dicho procedimiento comprende el empleo combinado de 36 nuevos SNPs con capacidad para predecir pre-clínicamente la aparición de PD compleja. Del mismo modo, la presente invención proporciona un método que comprende el empleo de una combinación digénica de SNPs del loci SIL1 x chr6, que confiere a sus portadores un mayor riesgo de padecer la enfermedad de Parkinson.

Description

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE LA PREDISPOSICIÓN GENÉTICA A LA ENFERMEDAD DE PARKINSON

Campo técnico

La presente invención se enmarca dentro de los procedimientos para ayuda al diagnóstico de enfermedades complejas. En concreto, la presente invención pertenece la los procedimientos basados en marcadores genéticos indicativos de la predisposición de un sujeto a sufrir la enfermedad de Parkinson. Más concretamente, el procedimiento, in Vitro, se centra en la detección, individual o conjunta, de SNPs en diversos genes para el pronóstico de dicha predisposición, en base al genoma de un individuo.

Estado de la técnica

La enfermedad de Parkinson (PD) es un desorden neurodegenerativo del sistema nervioso central que a menudo es incapacitante desde un punto de vista motriz afectando, también, al habla y otras funciones neurológicas.

Desde un punto de vista epidemiológico PD afecta al 1% de la población a los 50 años y a un 4% de la población a los 85 años (1).

Desde un punto de vista clínico, PD pertenece a un grupo de trastornos denominado quot;del movimientoquot; y se caracteriza por la presencia de rigidez muscular, temblores, lentitud de movimientos (bradicinesia) e incluso la pérdida completa de movimientos (aciniesia) en los casos más extremos. Los síntomas observados son resultados de una disminución de la estimulación de la corteza cerebral motora proveniente de los ganglios basales. Los síntomas secundarios pueden incluir alteraciones cognitivas y trastornos del lenguaje. El curso de la enfermedad es crónico y progresivo.

Desde un punto de vista patogénico observamos un defecto de estimulación de la corteza cerebral que es debido a una deficiencia funcional y/o anatómica (pérdida física de neuronas dopaminérgicas) en la sustancia negra que genera, en consecuencia, un déficit de la acción de la dopamina que es el principal neurotransmisor producido en dicha región cerebral.

Al contrario que ocurre en la patogénesis de PD, las bases etiológicas de la enfermedad no están bien establecidas. La mayoría de los casos de PD se consideran

idiopáticos (de causa desconocida). No obstante, hay descritas una minoría de formas familiares de la patología que son debidas a defectos discretos (mutaciones) en genes autosómicos ya identificados como PARK2 (parkin, NM_004562), SNCA (alfa-sinucleína, NM 000345), LRRK2 (leucine-rich repeat kinase 2, NM 198578), UCHL1 (ubiquitin carboxyl-terminal esterase L1, NM O O 4181) , GBA (glucocerebrosidase precursor, NM 000157), FGF20, (fibroblast growth factor 20, NM_019851), ó MAPT (microtubule-associated protein tau (NM 001123066) entre otros (para una revisión detallada de los genes m e n d e 1 i a n o s v é a s e O M I M n ú m e r o 1 6 8 6 O O

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/168600; consulta realizada el 10 de enro de 2011). Aunque la existencia de fenocopias de PD (individuo o grupo de individuos de una población que, careciendo de un genotipo dado posee el mismo fenotipo (PD) que aquél que si posee dicho genotipo) debidas a intoxicaciones e infecciones del sistema nervioso central tampoco debe descartarse, el grueso de los casos de PD se consideran formas quot;complejasquot; de la enfermedad cuya etiología sería debida a procesos de integración lineales y no lineales de multitud de factores genéticos (alelos de baja penetrancia) y no genéticos (factores ambientales, básicamente tóxicos o agentes infecciosos).

En otras enfermedades neurodegenerativas, como el síndrome de Marinesco-Sj orgren (MSS), se ha demostrado que las mutaciones del gen sil1 (homólogo de SIL1 protein precursor, NM 022464) causan el fenotipo neurodegenerativo woozy (wz) de ratón (34). Este hallazgo es importante pues estableció un vínculo directo entre una disfunción del retículo endoplásmico (ER) y la neurodegeneración (32, 33) . Se sospecha que el estrés del ER podría ser una de las causas principales de las enfermedades neurodegenerativas comunes

(Enfermedad de Alzheimer y Enfermedad de Parkinson) pero hasta la fecha ninguna variante genética del gen SIL1 ha sido relacionada con el riesgo de ninguna de estas enfermedades.

Evidentemente, el conocimiento actual de los factores genéticos y no genéticos que determinan la susceptibilidad a padecer PD es muy escaso, lo que dificulta el diagnóstico temprano de la patología, la identificación de las poblaciones en riesgo de padecer PD y el desarrollo de más y mejores métodos de diagnóstico y terapias.

Para solucionar este difícil problema, la comunidad científica ha invertido considerables esfuerzos en las siguientes estrategias:

a. Genética aplicada a PD compleja

Existen numerosos trabajos que emplearon las técnicas genéticas para tratar de elucidar las bases etiológicas de PD compleja. Las enfermedades complejas son poligénicas o multifactoriales o el resultado final de efectos complejos de varios (o muchos) genes interaccionando con los factores ambientales. Para efectuar un rastreo sistemático de los estudios genéticos de PD compleja contamos con una base de datos (PDgene database, http://www.pdgene.org/; fecha de consulta 11 de Enero de 2 O 11) que recoge la mayoría de los estudios de asociación genética. Actualmente, se contabilizan 764 estudios independientes que han analizado 2407 marcadores

genéticos en 547 genes independientes con resultados muy dispares. En la actualidad los diez genes más consistentemente asociados a la PD compleja son SNCA (alpha-synuclein, NM 000345) (3), la región de MAPT (microtubule-associated protein tau, NM 001123066) (4), NUCKS1 (nuclear e a s e i n k i n a s e a n d e y e 1 i n-dependent, NM O2 2 7 31) ( 5) , PM20D1(peptidase M20 domain containing 1 precursor, BC063477) (6), SLC41A1 (solute carrier family 41 member 1, NM 1 7 3 8 5 4 ) ( 7 ) BST1 (marrow stromal cell antigen 1 precursor, NM_004334) (8), LRRK2 (leucine-rich repeat kinase

2,

NM 198578) (9), USP24 (ubiquitin specific protease 24,

NM

015306) (10), SLC6A3 (solute carrier family 6,

NM

001044) (11) y GBA (glucocerebrosidase precursor,

NM

000157) (12). Es interesante destacar que si bien la

mayoría de los estudios realizados hasta la fecha han utilizado como estrategia el análisis de genes candidatos

(candidate gene approach), los resultactos más consistentes han sido obtenidos utilizando técnicas de rastreo completo del genoma (GWAS, genomewide association studies). No obstante, la inconsistencia y variabilidad de resultados demuestra la dificultad que supone tratar de elucidar las bases genéticas de PD compleja (forma más común de PD y que es debida a la conjunción de varios genes y factores ambientales). Es importante aclarar que la base de datos PDgene sólo recoge estudios univariantes (de un solo marcador genético) y no contiene resultados de estudios de interacción gen-gen (epistasis), de interacción gen-ambiente o modelos causales multivariantes de la enfermedad.

b. Análisis multilocus en la enfermedad de Parkinson.

La integración de múltiples elementos causales en un modelo multivariante (multilocus en el caso de tratarse de genes) es una asignatura pendiente de la genética molecular humana en la actualidad. Existen intentos tempranos de la

aplicación de modelos multivariantes a la enfermedad de Parkinson. En concreto, Lesnick y colaboradores ( 2 O O 7) (13) utilizaron una combinación del rastreo completo del genoma

(GWAS) junto con un abordaje de rutas bioquímicas para tratar de demostrar que la maquinaria bioquímica encargada del enrutamiento de axones neuronales estaba involucrada en la etiología de PD. Sin embargo el modelo desarrollado no superó tan siquiera la primera replicación independiente (es decir que no se pudieron reproducir los resultados obtenidos cuando se aplicaron los mismos métodos y marcadores genéticos a otra población diferente) (14). Además, los datos genéticos de PD compleja que se han hecho públicos y están disponibles para investigación se han utilizado para explorar el fenómeno de la epistasis y desarrollar nuevas técnicas de análisis multivariante (1, 15-19) . Los estudios mencionados son exploratorios y no incluyen las series de replicación que son fundamentales para la confirmación de los hallazgos obtenidos.

La idea básica subyacente a todos los estudios de asociación genética es que tanto las características fenotípicas normales, como los rasgos clínicos de las enfermedades, son debidos a una interacción o combinación de factores ambientales que operan sobre un fondo genético particular e individual.

Actualmente, se considera que la mejor estrategia para los estudios de asociación genética es la identificación de genes empleando el rastreo completo del genoma (quot;shot gun approachquot;, junto con estudios de asociación en el genoma completo) En esta estrategia, que depende del desequilibrio de unión (Cuando un marcador genético está muy cerca, dentro de la secuencia de un cromosoma, de la mutación causante de una enfermedad, habitualmente se heredan conjuntamente. Este fenómeno es conocido como desequilibrio de unión, LD), se

emplean múltiples marcadores a lo largo del genoma comparando individuos no relacionados pero que presentan el rasgo en estudio, contra controles que no presentan dicho rasgo. En la actualidad es posible el examen del genoma completo de un individuo empleando productos comerciales de investigación genética basados en microdispositivos de oligonucleótidos que detectan SNPs a lo largo de todo el genoma con capacidad de identificación y genotipado de 10.000 o más SNPs en cada individuo, pudiendo revelar qué SNPs están presentes o ausentes en enfermos y en controles de un determinado estudio de asociación genética. Los datos generados en estos estudios pueden ser conceptualizados como una tabla de valores en la que cada columna representa un genoma individual, cada línea un determinado SNP en dichos genomas, con un símbolo + ó -en cada celda representando la presencia o ausencia del citacto SNP en cada genoma investigado. Múltiples programas informáticos como por ejemplo Sumstat (Ott J, Hoh J., 2003),

o PLink (Purcell et al., American Journal of Human Genetics, 81) pueden analizar estos datos con objeto de aislar loci correlacionados estadísticamente con el rasgo en estudio. Estos mismos programas, además, pueden calcular la probabilidad de que dicha asociación sea real o un artefacto de los datos. Finalmente, recurriendo al mapa del genoma humano es posible delinear una hipótesis más refinada basada en la información sobre los genes cercanos al marcador asociado y diseñar estrategias de confirmación o validación de los resultados obtenidos. Este abordaje se ha utilizado en el estudio de rasgos monogénicos. Pero también es posible aplicarlo a rasgos complejos (poligénicos) incluyendo aquellos en los que un gen individual tiene sólo un efecto muy pequeño e incluso indetectable por sí solo. Véanse como ejemplos: Hoh et al, 2003; o Marchini et al, 2005.

La aplicación informática HFCC (W02008010195) permite determinar asociaciones genéticas e identificar genes que influyen en la aparición de un rasgo fenotípico cualquiera, de forma individual o conjunta. Esta aplicación permite filtrar, eliminar y seleccionar aquellas asociaciones que se validarán posteriormente en grupos de mayor tamaño.

Al margen de los problemas relacionados con la exploración de las interacciones empleando datos de genoma completo, entre los que destacan la multidimensionalidad del análisis (el alto número de combinaciones a explorar conlleva un alto riesgo de falsos positivos por azar derivados de las múltiples combinaciones analizadas), la ausencia de consenso en cuanto a los modelos de interacción génica susceptibles de ser explorados y los problemas de interpretación de los resultados pues nuestro conocimiento sobre las relaciones moleculares es parcial, existen un buen número de ejemplos de trabajos que tratan de explorar la epistasis (efecto debido a interacción no lineal de dos mutaciones) entre dos genes y su relación con PD compleja. La mayoría de estos estudios tratan de establecer una conexión molecular o estadística entre dos genes independientes y la enfermedad en cuestión. Como en el caso anterior, los estudios suelen carecer de las series de replicación y sin ellas, el estudio no puede considerarse concluyente. Respecto a las interacciones moleculares, tal vez los trabajos más destacados en este campo sean los que establecieron la relación molecular entre dos genes asociados a PD familiar (20-23) y el establecimiento de una ruta interactiva de elementos génicos relacionados con el control de la toxicidad del manganeso y que incluía los genes SNCA (alpha-synuclein, NM 000345) y PARK9 (ATPase type 13A2 isoform, NM 022089), ambos previamente asociados a PD (24). También merecen destacarse los estudios moleculas que confirmaron que PINKl (PTEN

induced putative kinase 1 precursor, NM 0324 O9) era

epistático respecto de HtrA2 (HtrA serine peptidase 2 isoform 1 preproprotein, NM_013247) ( 2 5) . Respecto a las interacciones gen-gen estadísticas destacamos los estudios de interacción digénica entre variaciones raras de los genes PRKN y LRRK2 (26). También se ha publicado estudios de interacción de variaciones comunes para PD compleja. Por ejemplo, se ha descrito que los genes FGF2 O y MAOB interaccionan para provocar PD (27). Igualmente se ha descrito que USP24 puede actuar sinérgicamente con USP40 ó UCHL1 (28). Hay también descripciones de combinaciones genotípicas de SNCA y MAPT que incrementan el riesgo de padecer PD (29) Otros autores han observado la interacción de IL-6 y ESR2 a nivel genético ( 3 O) • Finalmente, se ha sugerido que la combinación de variantes genéticas en loci de detoxificación hepática como CYP2D6 y GSTM1 podría conferir un riesgo diferencial de padecer PD (31). Es prudente comentar nuevamente que ninguno de los estudios mencionados incluye replicaciones en series independientes.

Según todo lo anteriormente expuesto, no existen actualmente marcadores para la PD compleja, que puedan predecir anticipadamente la susceptibilidad a padecer la enfermedad. La presente invención proporciona nuevos métodos para predecir, preclínicamente, la susceptibilidad a padecer PD de etiología compleja, mediante el empleo de nuevos marcadores genéticos (Polimorfismos de un único Nucleótido, SNPs) o combinaciones de estos. Además, la presente invención proporciona un nuevo método de puntuación genética, basado en el genotipo específico de los loci de dichos marcadores genéticos y de otros asociados a la edad de comienzo de la enfermedad, que permite la clasificación de individuos en pacientes afectados de PD compleja sin necesidad de factores adicionales.

Breve descripción de las figuras. Figura 1: Representación gráfica mediante un plot de Forest del efecto del diplotipo TT/CT de los marcadores rs869026 y rs10945364 en la Enfermedad de Parkinson. Pooled: efecto conjunto de las tres series. Y: Riesgo Relativo; X Meta-análisis. OR=1,780 [1,081-2,930], p=0,036. Análisis Conjunto: OR=1,66[1,36-2,01], p=3,66xE7

Figura 2: Curva COR para el análisis conjunto. Línea recta continua: línea de referencia; Línea curva punteada: variables; Línea curva discontinua: SNPs; Línea curva continua: series de sexo y edad. Y: Sensibilidad; X: Especificidad (por 0=0%, 1=100%, 0.5=50%). Los segmentos diagonales son producidos por los empates (un empate en el

análisis

discriminante acontece cuando un miembro del grupo

de

casos tiene la misma puntuación que otro del grupo

de

controles).

Descripción detallada de la invención

Los inventores emplearon la tecnología bioinformática de meta-análisis HFCC (Hypothesis Free Clinical Cloning, W02008010195) para seleccionar combinaciones de marcadores genéticos distribuidos por todo el genoma que se asocian con la enfermedad de Parkinson.

El esquema general para la identificación de parejas de marcadores asociadas a la enfermedad de Parkinson, ha sido el siguiente: Durante el primer paso (Stage I) se realizó un rastreo completo del genoma con HFCC aplicado a 272 casos y 272 controles. Las parejas mejores conformadas por 384 marcadores independientes se evalúaron en la población Española y Norte-americana (Stage I I y I I I) . Sólo aquellas parejas que muestran un efecto consistente en los tres

estudios se someten a un metaanálisis (un estudio basado en la integración estructurada y sistemática de la información obtenida en diferentes estudios clínicos, sobre un problema de salud determinado, consistente en identificar y revisar los estudios controlados sobre un determinado problema, con el fin de dar una estimación cuantitativa sintética de todos los estudios disponibles.) (stage IV).

A efectos de la presente invención, la expresión quot;marcador genéticoquot; y su plural, se refiere a polimorfismos de un cambio de nucleótido único (SNPs), a partir de ahora se hará referencia a ellos también como marcadores de la invención o SNPs de la invención indistintamente. El análisis individual o combinado de los SNPs de la invención no había sido vinculado anteriormente con la susceptibilidad a padecer

PD.

A

diferencia de estudios anteriores, la presente

invención

utiliza el meta-análisis de tres series

independientes

de casos de PD compleja y controles no

relacionados. Dos de las series son norteamericanas y se obtuvieron de los repositorios públicos del Centro Nacional de Investigación Biotecnológica (NCBI). La serie restante es española y fue obtenida gracias a una colaboración con el Hospital Clinic de Barcelona. En total se emplearon para este estudio los genotipos obtenidos del ADN de 2697 individuos independientes (1305 casos de PD compleja y 1391 controles).

-

HFCC aplicado a PD.

La tecnología HFCC puede aplicarse para seleccionar un conjunto de marcadores genéticos diplotípicos (combinaciones de genotipos de dos SNPs independientes) para explicar el riesgo diferencial que tienen los individuos a padecer PD. Estos marcadores, aunque seleccionados por parejas, conservan el grado de asociación individualmente, por lo que pueden

utilizarse tanto individualmente, como en parejas, o en conjunto.

Para seleccionar el conjunto de marcadores asociados a PD, se pueden utilizar los datos públicos de genomas completos. Los repositorios que custodian dichos datos, habrán sido los responsables de realizar el genotipado de las muestras de los individuos. La tecnología HFCC se aplica mediante la utilización de dispositivos o soportes sólidos que contienen oligonucleótidos capaces de hibridar con los SNPs conocidos. Estos dispositivos se conocen en el campo de la técnica como chips de SNPs o SNP Arrays y estan disponibles comercialmente. Utilizando estos materiales de partida, puede explorarse el genoma de los individuos seleccionados para identificar todas las combinaciones diplotípicas posibles. En la aplicación HFCC se seleccionan los filtros adecuados. HFCC utiliza sistemáticamente tres filtros en diferentes fases del estudio: un filtro de ruido, que es una comparación control-control para eliminar asociaciones espúreas debidas a mala randomización del diplotipo en el grupo de controles, un filtro de direcciones que selecciona sóla aquellas combinaciones en las que la dirección del efecto es concordante y un filtro alelos tractores (tracking allele filter) que identifica marcadores fuertemente desviados que introducen falsos positivos. Se incluyen, además, los parámetros estadísticos deseados, para lo cual el HFCC dispone de un algoritmo de computación paralela. La selección de los marcadores deseados, se efectua automáticamente y posteriormente se ordenan y priorizan dichos SNPs bien utilizando un software adecuado a tal efecto

o bien mediante estrategias de análisis condicional en función de genes previamente asociados a PD. De esta manera se pueden seleccionar las mejores parejas de SNPs para diseñar un ensayo de validación, que se realiza en series

independientes para depurar la selección, eliminar falsos positivos y retener los SNPs consistentemente asociados a PD. Diseño de un ensayo para la validación de los SNPs

seleccionados.

Para validar los SNPs seleccionados, se determinan las secuencias génicas que han de sintetizarse para el ensayo de genotipación múltiple (Oligonucleotide Pooling Assay; OPA) . Estas secuencias deben ser aptas para su lectura simultánea en el Sistema BeadXpress. La tecnología BeadXpress (Illumina inc, EEUU) consiste un lector láser de dos canales simultáneos no confocales de resolución de 30nm que permite leer los cilindros hológráficos que se emplean en la tecnología Veracode (Illumina inc, EEUU) (véase a continuación) .

-

Genotipación (tecnología Veracode)

Los SNPs de la invención pueden genotiparse mediante una muestra aislada de un individuo, poniendo en contacto sondas para los SNP con ADN genómico aislado de dicha muestra, bajo condiciones apropiadas para la hibridización de dicha sonda a dicho gen. Dicha sonda puede ser un ADN de tipo salvaje (es decir, el SNP que se investiga no está presente en la sonda, y la hibridización tiene lugar cuando el SNP según la invención no se encuentra en el ADN en la muestra), o un mutante (es decir, transportando el SNP que se busca, y la hibridización sólo tiene lugar si el SNP se encuentra en el ADN en la muestra) A efectos de la presente invención se entiende el término quot;muestraquot; como una porción de tejido o volumen de fluido corporal, preferentemente sangre periférica, pero que puede ser también cualquier otro tejido aislado del cuerpo, por ejemplo mediante una biopsia, o muestra de fluido corporal que contenga el ADN del individuo en estudio.

Un experto en la materia conoce los procedimientos para determinar las sondas alélicas específicas a utilizar, sus longitudes, preferentemente de entre 50-300 bases, o las condiciones de hibridización. Pueden utilizarse secuencias que flanqueen al SNP y que el experto encontrará en el listado de secuencias de la presente invención.

Veracode es la tecnología de elección para la validación de resultactos de HFCC. Esta tecnología emplea el poder del código holográfico digital para ofrecer un sistema de detección robusto y es ideal para múltiples ensayos que requieren alta precisión, reproducibilidad y rapidez. El sistema emplea unas microesferas diferenciadas por una marca holográfica de alta densidad (24-bit). Cuando las microesferas VeraCode son excitadas mediante un láser, cada una emite un código de imagen único, lo que permite una detección rápida y específica por el sistema de lectura denominado quot;BeadXpress Reader Systemquot;(Illumina inc, EEUU). De acuerdo con el nivel de multiplex requerido, los ensayos son creados mediante la mezcla de diferentes micro-esferas

(cilindros) con distintos códigos, que pueden ir desde uno a varios cientos. Cada tipo de micro-esfera lleva en la superficie unida covalentemente especies de oligonucleótidos específicos de la región que contiene el polimorfismo. Previamente dicha región es detectada en cada uno de los genomas a estudiar mediante el sistema GoldenGate de Illumina (Illumina Inc, EEUU). De esta forma el sistema puede interrogar simultáneamente hasta 384 polimorfismos de un único nucleótido (SNP) por muestra de ADN. Brevemente, el sistema Goldengate permite la genotipación de SNPs mediante un proceso de extensión y ligación del ADN quot;secuencia-específicoquot;. El sistema permite ligar sólo aquellos oligos hibridados correctamente. Los fragmentos correctos, una vez ligados, son amplificados con primers universales. En el

sistema GoldenGate el ADN problema se activa mediante una reacción química con la biotina. Después se elimina el exceso de biotina mediante una purificación en columna. Para iniciar el ensayo, la OPA (tabla 1) que contiene los oligonucleotidos se añade y se efectúa una hibridación con el ADN activado con la biotina. La mezcla de ADN activado-OPA se liga a unas partículas paramagnéticas conjugadas con estreptavidina ( SA-PMPs). Una vez finalizada la hibridación se procede a la eliminación del exceso de oligonucleotidos no hibridados y los mal apareados. El siguiente paso es la realización de la extensión y ligación alelo-específica que produce un molde sintético de cada alelo detectado. Estos moldes se someten a una reacción de PCR con primers universales fluorescentes que contienen unos códigos de secuencias reconocibles por los cilindros holográficos que detecta el BeadXpress. La cadena fluorescente del producto de PCR se aísla y se hibrida a los cilindros holográficos. Como conclusión, después de un proceso de lavado, los cilindros hibridados se escanean en el sistema y se analizan los resultados con el software BeadStudio (Illumina Inc, EEUU). La interpretación de los resultados y la anotación de los genotipos obtenidos también se realizan con el software BeadStudio (Illumina)

Empleando la tecnología descrita y dos series de validación, la presente invención provee un total de 36 nuevos SNPs (de ahora en adelante SNPs de la invención) útiles para predecir la predisposición a padecer PD compleja Tabla 1) . Por lo tanto, un primer objeto de la presente invención es un procedimiento in Vitro para determinar la predisposición a padecer la enfermedad de Parkinson en una muestra aislada de un individuo, que comprende el análisis genotípico de al menos un SNP a elegir del grupo formado por: rs577562, rs2986574, rs11119097, rs4658673, rs4490160, rs10496075, rs12987286, rs847126, rs9036, rs6805546,

rs4505714, rs7650598, rs10155062, rs218280, rs869026, rs3094694, rs1549355, rs7747934, rs4583999, rs10945364, rs1156143, rs1888349, rs12353255, rs7027515, rs332185, rs763373, rs10750861, rs11564173, rs2332631, rs1039189, rs3936139, rs8109493, rs761267, rs6518223, rs1364658, rs353111, y combinaciones de los mismos.

Tabla l. Relación entre los SNPs de la invención y la lista de secuencias de la invención.

SNP

Variación (símbolo En el listado de secuencias) SEQ ID No

rs577562

[A/G] (r) 1

rs2986574

[A/G] (r) 2

rs11119097

[A/G] (r) 3

rs4658673

[A/G] (r) 4

rs4490160

[A/G] (r) 5

rs10496075

[T/C] (y) 6

rs12987286

[T/G] (k) 7

rs847126

[T/C] (y) 8

rs9036

[T/C] (y) 9

rs6805546

[T/G] (k) 10

rs4505714

[A/G] (r) 11

rs7650598

[A/G] (r) 12

rs10155062

[A/G] (r) 13

rs218280

[T/G] (k) 14

rs869026

[T/G] (k) 15

rs3094694

[A/G] (r) 16

rs1549355

[T/G] (k) 17

rs7747934

[T/C] (y) 18

rs4583999

[A/G] (r) 19

rs10945364

[T/C] (y) 20

rs1156143

[T/C] (y) 21

rs1888349

[T/G] (k) 22

rs12353255

[A/G] (r) 23

rs7027515

[T/C] (y) 24

rs332185

[T/C] (y) 25

rs763373

[C/G] (s) 26

rs10750861

[T/C] (y) 27

rs11564173

[A/G] (r) 28

rs2332631

[T/G] (k) 29

SNP

Variación (símbolo En el listado de secuencias) SEQ ID No

rs1039189

[A/C] (m) 30

rs3936139

[T/C] (y) 31

rs8109493

[T/C] (y) 32

rs761267

[A/C] (m) 33

rs6518223

[T/C] (y) 34

rs1364658

[C/G] (s) 35

rs353111

[T/G] (k) 36

La Tabla 2 muestra la localización cromosómica, el nombre del gen y el número de acceso de los SNPs de la invención mientras que en la Tabla 1 se muestra la relación

5 entre los SNPs de la invención, la variación que presentan, y la lista de secuencias de la invención, que incluyen las secuencias nucleotídicas que los flanquean.

En una realización preferente, el procedimiento in Vitro de la invención es útil para predecir el riesgo de padecer PD 10 compleja a partir de una muestra aislada de un individuo.

En otra realización preferente, el procedimiento in Vitro de la invención utiliza los SNPs rs869026 y rs10945364, situados en los cromosomas 5 y 6 respectivamente. Según este método, cuando el genotipo obtenido de la muestra aislada de

15 un individuo presenta homocigosis de alelo T de rs869026 combinado con la presencia en heterocigosis del alelo e de rs10945364 (diplotipo TT /CT de los marcadores), dicho individuo tiene un 66-72% más de riesgo de padecer la enfermedad de Parkinson respecto a los no portadores (Tabla

20 3) •

El análisis detallado del grado de asociación de los SNPs individuales con la enfermedad, resultó en la identificación de 14 nuevos SNPs con una probabilidad de asociación altamente significativa (Ejemplo 3). Por lo tanto 25 otro aspecto de la presente invención provee de un procedimiento in vitro para determinar la predisposición a

padecer la enfermedad de Parkinson en una muestra aislada de un individuo, que comprende el análisis genotípico de al menos un SNP a elegir del grupo formado por: rs1039189, rs12987286, rs1364658, rs1549355, rs218280, rs2332631,

rs353111,

rs3936139, rs4490160, rs577562 rs6805546, rs761267,

rs7650598,

rs869026 y sus combinaciones.

Una

manera diferente de demostrar la capacidad

diagnóstica de los SNPs de la invención es la elaboración de un panel de marcadores (SNPs) con capacidad predictiva. Para la construcción de dicho panel, se emplea una combinación de SNPs asociados al quot;statusquot; de casos (estos son los marcadores presentes en la Tabla 5) a los que se añade, además, un pequeño subconjunto de marcadores que presentan indicios estadísticamente significativos de asociación con la edad de comienzo de la enfermedad (AAO, age-at-onset) (Tabla 6) . El ejemplo 4 muestra la creación de dicho panel predictivo, que puede utilizarse como un sistema de puntuación genético basado en los genotipos de los loci, que permite la clasificación de individuos afectados de PD compleja sin que haga falta tener en cuenta ningún otro factor.

Según lo anterior, en una realización preferente, de la presente invención es un procedimiento in Vitro basado en un sistema de puntuación genético que comprende el análisis genotípico conjunto de los SNPs: rs57 7 5 62, rs2 98 65 7 4, r s 1111 9O9 7 , r s 4 6 5 8 6 7 3 , r s 4 4 9 O1 6 O , r s 1 O4 9 6 O7 5 , r s 12 9 8 7 2 8 6 ,

rs847126,

rs9036, rs6805546, rs4505714, rs7650598,

rs10155062,

rs218280, rs869026, rs3094694, rs1549355,

rs7747934,

rs4583999, rs10945364, rs1156143, rs1888349,

rs12353255,

rs7027515, rs332185, rs763373, rs10750861,

rs11564173,

rs2332631, rs1039189, rs3936139, rs8109493,

rs761267, rs6518223 y sus combinaciones, preferentemente, la combinación de todos ellos.

Con el objeto de analizar conjuntamente los SNPs de la invención en un ensayo múltiple, es también objeto de la presente invención un conjunto de reactivos o kit para la determinación de la predisposición a padecer la enfermedad de parkinson en una muestra aislada de un individuo, caracterizado porque comprende un ácido nucleico que detecta al menos un SNP a elegir del grupo formado por: rs577562, rs2986574, rs11119097, rs4658673, rs4490160, rs10496075, rs12987286, rs847126, rs9036, rs6805546, rs4505714, rs7650598, rs10155062, rs218280, rs869026, rs3094694, rs1549355, rs7747934, rs4583999, rs10945364, rs1156143, rs1888349, rs12353255, rs7027515, rs332185, rs763373, rs10750861, rs11564173, rs2332631, rs1039189, rs3936139,

rs8109493,

rs761267, rs6518223, rs1364658, rs353111, y

combinaciones

de éstos, preferentemente, la combinación de

todos

ellos.

Ejemplo l. HFCC aplicado a PD

Para llevar a cabo la presente invención se utilizaron datos de genoma completo públicos que se obtuvieron de los repositorios del centro de recursos de SNPs, ADN y líneas celulares que el Instituto Nacional de Investigación de Enfermedades Neurológicas de los Estados Unidos (NINDS) mantiene en la empresa Coriell (http://ccr.coriell.org/ninds, datos consultados en Diciembre de 2006). El genotipado de las muestras empleadas para realizar HFCC se efectuó en el Instituto Nacional de Envejecimiento (NIA, Bethesda, MD, EEUU) (35). El HFCC se realizó con genotipos de 270 casos no relacionados de PD idiopático y 271 controles poblacionales normales desde un punto de vista neurológico y no relacionados entre ellos, ni con los controles. Los 541 individuos disponibles se genotiparon para 396.591 SNPs diferentes distribuidos en los 22 autosomas. Para ello se

emplearon dos chips (SNP arrays Infinium I y II) de la compañía Illumina (Illumina Inc, EEUU). Con estos datos de partida se utilizó la tecnología HFCC para explorar todas las combinaciones diplotípicas posibles de los 396.591 marcadores SNPs genotipados. Se efectuó, en consecuencia, un rastreo exhaustivo de todos los patrones diplotípicos existentes. De esta manera, se divide la base de datos disponible en tres grupos de replicación de 90 casos y 90 controles (una de ellas llevaba un control más) y se ejecutó el software HFCC programando la evaluación estadística de todos los diplotipos (modelos 2-loci M1,M2 y M16 de acuerdo con Li y Reich 2000 (7)). La evaluación de estos nueve modelos genéticos, correspondientes a los diplotipos, supone el cálculo de unos 78,6 billones de test estadísticos (Test de Wald ;S. D. Silvey quot;The Lagrangian Mul tiplier Test,quot; Annals of Mathematical Statistics, 30, (1959), pp. 389-407. para lo que se emplea el algoritmo de computación paralela programado en HFCC (36). El punto de corte para pre-seleccionar diplotipos candidatos se estableció en un Test de Wald mayor o igual a

6,64 puntos que equivale, aproximadamente, a un valor plt;0,01. Es importante destacar que este valor ha de ser alcanzado en los tres grupos de replicación anteriormente mencionados. Con lo cual los positivos suministrados por HFCC tienen un valor de p quot;agregadoquot; (valor de significación empleado en HFCC: se calcula usando el punto de corte establecido para cada grupo de comparación y estrato elevado al número de grupos de comparación empleados durante el estudio) de Pquot;'O, 000001 o inferior.

Después de aplicar los filtros de HFCC, el sistema seleccionó un 4,4% de los marcadores (17825 SNPs) que formaban 26371 combinaciones diplotípicas. Éstas se ordenaron y priorizaron empleando bien el software Alambique (21) o bien estrategias de análisis condicional (buscando parejas de

marcadores que al menos contuviesen SNPs dentro de genes previamente asociados a PD) . Los 384 SNPs seleccionados más prometedores (tabla 2) fueron correspondientemente validados en series independientes (ver más adelante) .

Tabla 2. SNPs seleccionados mediante HFCC. Datos de la cadena sentido o quot;forwardquot;. CV: clase de validación; BV: Bandeja de validación, LGR: Localización Relativa al Gen.

SNP

Cr Coord cv BV Gen Nombre Gen Número de Acceso Localización LRG

rs1003167

6 43963001 3 goldengate 7422 VEGFA NM_001033756.1 adyacente a_3UTR -100799

rs10046663

8 2983419 3 goldengate 64478 CSMD1 NM_033225.3 intron -3975

rs10053056

5 96069176 2 two-hit or HapMap 831 CAST NM_173060.1 intron -4801

rs10078721

5 92446445 2 two-hit or HapMap 391811 LOC391811 XR_016127.1 adyacente a_5UTR -182298

rs1008577

19 46879134 2 two-hit or HapMap 1087 CEACAM7 NM_006890.1 intron -422

rs10094702

8 89403625 3 goldengate 4325 MMP16 NM_005941.3 intron -4795

rs10096279

8 3212285 2 two-hit or HapMap 64478 CSMD1 NM_033225.3 intron -109

rs10121215

9 26159347 3 goldengate 441390 -99 NM_001004352.1 adyacente a_3UTR -50941

rs10155062

4 7184806 2 two-hit or HapMap 728529 LOC728529 XM_001127674.1 adyacente a_3UTR -55088

rs10201616

2 75529368 3 goldengate 84141 TMEM166 NM_032181.1 adyacente a_3UTR -43584

rs1022242

12 69492622 2 two-hit or HapMap 5801 PTPRR NM_002849.2 intron -47797

rs1035316

2 224848397 3 goldengate 79843 FAM124B NM_024785.2 adyacente a_3UTR -103262

rs10496075

2 57762864 2 two-hit or HapMap 7444 VRK2 NM_006296.3 adyacente a_5UTR -364360

rs10511001

3 70715884 2 two-hit or HapMap 401072 -99 NM_001013679.1 adyacente a_3UTR -29555

rs10511680

9 20277623 2 two-hit or HapMap 4300 MLLT3 NM_004529.1 adyacente a_3UTR -57345

rs10512174

9 88076394 3 goldengate 81689 ISCA1 NM_030940.3 intron -348

rs10516970

4 96529259 2 two-hit or HapMap 8633 UNC5C NM_003728.2 intron -53454

rs1060545

9 116861439 3 goldengate 3371 TNC NM_002160.1 intron -391

rs10747874

12 59144947 2 two-hit or HapMap 390335 LOC390335 XM_001129525.1 adyacente a_3UTR -652323

rs10750861

11 56937983 2 two-hit or HapMap 29015 SLC43A3 NM_017611.2 intron -681

rs10796886

1 36787398 3 goldengate 1441 CSF3R NM_172313.1 adyacente a_5UTR -66302

rs10797007

1 156562253 3 goldengate 910 CD1B NM_001764.1 adyacente a_3UTR -2150

rs10801705

1 89272970 3 goldengate 2635 GBP3 NM_018284.1 adyacente a_5UTR -11838

rs10853282

18 2372165 3 goldengate 64863 METIL4 NM_022840.2 adyacente a_3UTR -155364

rs10916407

1 227216444 3 goldengate 677790 TMEM78 NM_001040079.1 adyacente a_5UTR -235562

rs10935844

3 152611585 3 goldengate 116931 MED12L NM_053002.3 intron -171

rs10945364

6 169193728 3 goldengate 7058 THBS2 NM_003247.2 adyacente a_3UTR -164072

rs11008264

10 31129838 3 goldengate 220929 ZNF438 NM_182755.1 adyacente a_3UTR -43731

rs1106145

3 87631095 3 goldengate 643766 LOC643766 XR_016476.1 adyacente a_3UTR -131046

rs11081496

18 9716631 2 two-hit or HapMap 11031 RAB31 NM_006868.2 intron -18190

rs11088449

21 39107267 2 two-hit or HapMap 2114 ETS2 NM_005239.4 intron -359

rs11119097

1 206813021 3 goldengate 5362 PLXNA2 NM_025179.2 adyacente a_5UTR -329282

rs11196543

10 115684622 2 two-hit or HapMap 374354 NHLRC2 NM_198514.2 adyacente a_3UTR -26180

rs114305

12 5118252 3 goldengate 3741 KCNA5 NM_002234.2 adyacente a_3UTR -92042

rs1150996

12 31960144 2 two-hit or HapMap 55196 C12orf35 NM_018169.2 adyacente a_5UTR -43476

rs11564252

12 39100000 2 two-hit or HapMap 283463 MUC19 XM_ 497341.3 intron -276

SNP

Cr Coord cv BV Gen Nombre Gen Número de Acceso Localización LRG

rs11655589

17 58961895 2 two-hit or HapMap 81033 KCNH6 NM_173092.1 intron -260

rs11674954

2 1262038 3 goldengate 54221 SNTG2 NM_018968.2 adyacente a_3UTR -8114

rs11691934

2 86018954 3 goldengate 8869 ST3GAL5 NM_003896.2 adyacente a_5UTR -49306

rs11694263

2 237855128 2 two-hit or HapMap 728245 LOC728245 XM_001126970.1 adyacente a_5UTR -14194

rs11715563

3 83873910 3 goldengate 643665 LOC643665 XM_931729.2 adyacente a_5UTR -1214935

rs11738500

5 114525871 2 two-hit or HapMap 55521 TRIM36 NM_018700.3 intron -1243

rs11860440

16 1697619 2 two-hit or HapMap 23162 MAPK81P3 NM_001040439.1 intron -960

rs11893869

2 106032330 3 goldengate 84417 C2orf40 NM_032411.1 adyacente a_5UTR -16215

rs1203638

1 13994479 3 goldengate 7799 PRDM2 NM_015866.3 intron -7320

rs12081567

1 151467611 3 goldengate 391102 LOC391102 XR_016996.1 adyacente a_3UTR -2505

rs12119878

1 9141308 2 two-hit or HapMap 727721 LOC727721 XM_001123441.1 adyacente a_3UTR -17730

rs12144940

1 99705926 3 goldengate 9890 LPPR4 NM_014839.3 adyacente a_3UTR -158198

rs12353255

9 20911332 3 goldengate 54914 KIAA1797 NM_017794.2 intron -2327

rs12412945

10 54468113 2 two-hit or HapMap 4153 MBL2 NM_000242.1 adyacente a_5UTR -266647

rs12434638

14 89679833 2 two-hit or HapMap 56659 KCNK13 NM_022054.2 intron -40375

rs12495688

3 147525535 3 goldengate 440981 LOC440981 XM_ 496663.3 adyacente a_3UTR -66302

rs12520264

5 7698474 2 two-hit or HapMap 108 ADCY2 NM_020546.1 intron -19045

rs12575639

11 109869510 2 two-hit or HapMap 2230 FDX1 NM_004109.3 adyacente a_3UTR -28695

rs12672177

7 101813787 3 goldengate 79706 PRKRIP1 NM_024653.1 adyacente a_5UTR -10028

rs1267658

15 81011209 2 two-hit or HapMap 64506 CPEB1 NM_030594.2 intron -702

rs12929690

16 81693979 2 two-hit or HapMap 1012 CDH13 NM_001257.3 intron -22512

rs12976749

19 43811334 2 two-hit or HapMap 27335 EIF3K NM_013234.2 intron -2752

rs12987286

2 148380038 3 goldengate 92 ACVR2A NM_001616.3 intron -6101

rs1329580

9 81776189 3 goldengate 347119 LOC347119 XM_928399.1 adyacente a_3UTR -105858

rs1364658

2 148324278 3 goldengate 92 ACVR2A NM_001616.3 intron -5032

rs1365461

18 34356804 3 goldengate 388474 LOC388474 XM_371115.5 adyacente a_3UTR -811939

rs1366545

16 76022537 2 two-hit or HapMap 170692 ADAMTS18 NM_199355.1 intron -156

rs1370699

2 86025785 3 goldengate 8869 ST3GAL5 NM_003896.2 adyacente a_5UTR -56137

rs1385331

3 197835612 3 goldengate 375387 LRRC33 NM_198565.1 adyacente a_5UTR -15441

rs1397053

11 56267270 2 two-hit or HapMap 283189 OR9G4 NM_001005284.1 coding [390/593]

rs1447665

3 127444361 3 goldengate 644662 LOC644662 XM_933903.2 adyacente a_5UTR -23968

rs1480691

8 14808735 2 two-hit or HapMap 137868 SGCZ NM_139167.2 intron -330730

rs1499005

3 20895844 3 goldengate 728976 LOC728976 XM_001128967.1 adyacente a_3UTR -23063

rs150858

17 3479419 2 two-hit or HapMap 23729 CARKL NM_013276.2 intron -829

rs1511241

11 78746402 2 two-hit or HapMap 729746 LOC729746 XM_001131186.1 adyacente a_5UTR -281322

rs1521937

2 53515720 3 goldengate 51130 ASB3 NM_145863.1 adyacente a_3UTR -234902

rs1527101

12 77063452 2 two-hit or HapMap 89795 NAV3 NM_014903.3 intron -828

rs1537685

10 116894953 3 goldengate 26033 ATRNLl NM_207303.1 intron -14838

rs1549355

6 124849888 3 goldengate 154215 NKAIN2 NM_001040214.1 intron -131696

rs1573465

21 34871068 3 goldengate 1827 RCAN1 NM_203417.1 intron -37379

rs162216

3 7833048 2 two-hit or HapMap 2917 GRM7 NM_000844.2 adyacente a_3UTR -74831

rs1667059

2 2925338 3 goldengate 729897 LOC729897 XM_001134159.1 adyacente a_3UTR -189426

rs1675247

18 3608506 3 goldengate 649446 FU35776 NM_001039796.1 adyacente a_3UTR -20156

rs1708694

18 32321976 3 goldengate 80206 FHOD3 NM_025135.2 intron -13917

rs1725265

1 7480780 2 two-hit or HapMap 23261 CAMTA1 NM_015215.1 intron -30232

rs17714109

4 28900684 2 two-hit or HapMap 645641 LOC645641 XM_928656.1 adyacente a_5UTR -466370

SNP

Cr Coord cv BV Gen Nombre Gen Número de Acceso Localización LRG

rs17740213

8 24430274 2 two-hit or HapMap 8756 ADAM7 NM_003817.1 adyacente a_3UTR -8103

rs178214

14 26015206 2 two-hit or HapMap 4857 NOVAl NM_006491.2 intron -3769

rs1792358

11 92040229 2 two-hit or HapMap 120114 FAT3 XM_926199.2 intron -29969

rs1828034

4 148309936 3 goldengate 83894 TIC29 NM_031956.1 adyacente a_5UTR -223497

rs1836726

2 211892263 3 goldengate 2066 ERBB4 NM_005235.1 adyacente a_3UTR -62797

rs1861960

7 154977896 2 two-hit or HapMap 285888 CNPYl XM_001129537.1 intron -1900

rs1874404

6 165012190 3 goldengate 728275 LOC728275 XM_001127046.1 adyacente a_3UTR -333408

rs1887279

1 182176783 3 goldengate 23127 GLT25D2 NM_015101.2 intron -239

rs1888349

7 138314672 2 two-hit or HapMap 92092 ZC3HAV1L NM_080660.2 adyacente a_3UTR -46320

rs1898111

15 45679590 2 two-hit or HapMap 80031 SEMA6D NM_020858.1 adyacente a_5UTR -118388

rs1901818

16 79761626 2 two-hit or HapMap 114780 PKD1L2 NM_052892.2 intron -423

rs1931704

10 129229799 3 goldengate 1793 DOCKl NM_001380.2 adyacente a_3UTR -89029

rs1940814

18 14061989 3 goldengate 162655 ZNF519 NM_145287.1 adyacente a_3UTR -32735

rs1952198

14 69409508 2 two-hit or HapMap 64093 SMOCl NM_022137.4 adyacente a_5UTR -6388

rs1953866

14 51387587 3 goldengate 54331 GNG2 NM_053064.2 adyacente a_5UTR -26473

rs1962293

9 2100744 3 goldengate 6595 SMARCA2 NM_139045.2 intron -327

rs1979541

6 159025401 3 goldengate 94120 SYTL3 NM_001009991.1 intron -1392

rs2011207

3 104449957 3 goldengate 644681 LOC644681 XM_927781.2 adyacente a_3UTR -290967

rs2026690

13 46381178 2 two-hit or HapMap 3356 HTR2A NM_000621.2 adyacente a_5UTR -13002

rs2041611

18 14077956 3 goldengate 162655 ZNF519 NM_145287.1 adyacente a_3UTR -16768

rs2047214

4 11150840 3 goldengate 9957 HS3ST1 NM_005114.2 adyacente a_5UTR -111205

rs2053380

7 12367362 2 two-hit or HapMap 221806 FU14712 XM_371878.5 coding [64/40]

rs2057525

13 92755817 3 goldengate 10082 GPC6 NM_005708.2 intron -77947

rs2063239

12 81798372 3 goldengate 160335 TMTC2 NM_152588.1 intron -15356

rs2070862

17 1595044 2 two-hit or HapMap 5345 SERPINF2 NM_000934.1 coding [4/58]

rs207620

13 32011403 3 goldengate 10443 RP11-298P3.3 NM_014887.1 adyacente a_5UTR -484

rs2077066

1 23650949 3 goldengate 55616 DDEFLl NM_017707.2 intron -341

rs2113447

18 51827201 3 goldengate 642484 FU45743 NM_001039759.1 intron -5068

rs2129530

11 11354861 2 two-hit or HapMap 374378 GALNTL4 NM_198516.1 intron -444

rs214506

6 18329450 3 goldengate 221656 AOFl NM_153042.2 intron -669

rs2163307

8 4293028 2 two-hit or HapMap 64478 CSMDl NM_033225.3 intron -28033

rs218280

4 55119046 3 goldengate 3815 KIT NM_000222.1 adyacente a_5UTR -99872

rs2219925

18 47717831 3 goldengate 1630 DCC NM_005215.1 adyacente a_5UTR -403325

rs2220971

13 96826076 2 two-hit or HapMap 10150 MBNL2 NM_144778.2 intron -9268

rs222717

14 23161964 2 two-hit or HapMap 10202 DHRS2 NM_005794.2 adyacente a_5UTR -13458

rs2233568

9 35947355 3 goldengate 56656 OR252 NM_019897.1 coding [219/710]

rs2235490

16 1683512 2 two-hit or HapMap 90861 HNlL NM_144570.2 intron -1525

rs2235616

20 48002534 2 two-hit or HapMap 55905 ZNF313 NM_018683.3 3UTR [448/1295]

rs2241780

3 14495168 2 two-hit or HapMap 6533 SLC6A6 NM_003043.2 intron -88

rs2242330

4 68129844 2 two-hit or HapMap 26228 STAPl NM_012108.1 intron -60

rs2242383

12 75962738 2 two-hit or HapMap 144455 E2F7 NM_203394.1 intron -32

rs2253729

7 139589358 2 two-hit or HapMap 80853 JHDMlD NM_030647.1 adyacente a_5UTR -66148

rs2285914

7 10714209 2 two-hit or HapMap 4697 NDUFA4 NM_002489.2 adyacente a_3UTR -225131

rs2288034

16 77803457 2 two-hit or HapMap 729251 LOC729251 XM_001133651.1 adyacente a_3UTR -673

rs2332631

14 25562376 2 two-hit or HapMap 4857 NOVAl NM_006489.2 adyacente a_3UTR -422553

rs2333660

14 29464817 2 two-hit or HapMap 5587 PRKDl NM_002742.1 intron -1389

SNP

Cr Coord cv BV Gen Nombre Gen Número de Acceso Localización LRG

rs2337970

22 46405112 3 goldengate 400932 RP11-191L9.1 NM_001001693.1 5UTR [1267/870]

rs2368940

11 119575980 2 two-hit or HapMap 220323 OAF NM_178507.2 adyacente a_5UTR -10977

rs2381628

9 7508656 3 goldengate 158345 LOC158345 XR_017130.1 adyacente a_5UTR -30022

rs2419117

1 166855806 3 goldengate 6375 XCLl NM_002995.1 adyacente a_3UTR -37867

rs2439553

6 13433258 2 two-hit or HapMap 51256 TBC1D7 NM_016495.2 intron -47

rs2470378

12 69512747 2 two-hit or HapMap 5801 PTPRR NM_002849.2 intron -59979

rs2505513

10 42953543 3 goldengate 55454 GALNACT-2 NM_018590.3 adyacente a_5UTR -397

rs2545391

5 66434867 2 two-hit or HapMap 4064 CD180 NM_005582.1 adyacente a_3UTR -79005

rs2555605

13 32731810 3 goldengate 90627 STARD13 NM_178008.1 intron -25797

rs256996

5 114943989 2 two-hit or HapMap 353376 TICAM2 NM_021649.3 3UTR [1742/155]

rs2593693

11 22324877 2 two-hit or HapMap 57084 SLC17A6 NM_020346.1 intron -3390

rs2648774

1 197382785 3 goldengate 647201 LOC647201 XR_017465.1 adyacente a_5UTR -222021

rs265603

12 128701943 2 two-hit or HapMap 121256 TMEM132D NM_133448.1 intron -48365

rs2736000

8 127469169 3 goldengate 157638 FAM84B NM_174911.3 adyacente a_3UTR -164700

rs2745443

6 133063075 2 two-hit or HapMap 8876 VNN1 NM_004666.1 intron -6061

rs2749928

6 131900472 3 goldengate 383 ARG1 NM_000045.2 adyacente a_5UTR -35586

rs2761843

13 50191038 3 goldengate 220107 DLEU7 NM_198989.1 intron -5661

rs2801640

5 65640474 2 two-hit or HapMap 401191 FU46010 NM_001001703.1 intron -9374

rs2834684

21 35234217 3 goldengate 861 RUNX1 NM_001754.3 intron -47087

rs2836392

21 38727745 3 goldengate 2078 ERG NM_182918.2 intron -10392

rs285550

12 40244561 2 two-hit or HapMap 29951 PDZRN4 NM_013377.2 intron -843

rs286002

5 55742226 2 two-hit or HapMap 441073 LOC441073 XR_016376.1 adyacente a_3UTR -93937

rs286007

5 55739933 2 two-hit or HapMap 441073 LOC441073 XR_016376.1 adyacente a_3UTR -96230

rs2869872

4 77410136 2 two-hit or HapMap 8987 STBD1 NM_003943.1 adyacente a_5UTR -36687

rs2922051

11 41356666 2 two-hit or HapMap 387761 LOC387761 XM_373495.4 adyacente a_3UTR -809203

rs294634

3 14875555 2 two-hit or HapMap 152273 FGD5 NM_152536.2 intron -5084

rs2953676

3 115765942 3 goldengate 26137 ZBTB20 NM_015642.2 intron -64014

rs2976501

8 93045739 3 goldengate 862 RUNX1T1 NM_175636.1 intron -3818

rs2986574

1 182173237 2 two-hit or HapMap 23127 GLT25D2 NM_015101.2 3UTR [1648/1280]

rs2992630

12 113757258 2 two-hit or HapMap 6926 TBX3 NM_005996.3 adyacente a_5UTR -150906

rs3094694

6 30559883 3 goldengate 3133 HLA-E NM_005516.4 adyacente a_5UTR -5367

rs324454

5 55238308 2 two-hit or HapMap 133396 IL31RA NM_139017.3 intron -435

rs332185

10 28953315 3 goldengate 51322 WAC NM_100264.1 adyacente a_3UTR -3837

rs353111

2 165845275 3 goldengate 643397 LOC643397 XR_016377.1 adyacente a_5UTR -4677

rs3731714

2 201769065 3 goldengate 843 CASP10 NM_001230.3 intron -149

rs3731818

2 86222315 3 goldengate 55037 PTCD3 NM_017952.4 3UTR [4121/476]

rs37389

5 35120937 2 two-hit or HapMap 5618 PRLR NM_000949.2 intron -439

rs3740808

11 89531857 2 two-hit or HapMap 10003 NAALAD2 NM_005467.2 intron -198

rs3752958

14 99252440 2 two-hit or HapMap 10858 CYP46A1 NM_006668.1 intron -151

rs3756616

5 179333453 2 two-hit or HapMap 55819 RNF130 NM_018434.4 intron -3341

rs3763131

5 179666918 2 two-hit or HapMap 9945 GFPT2 NM_005110.1 intron -9

rs3764333

16 83350762 2 two-hit or HapMap 9100 USP10 NM_005153.1 intron -183

rs376691

21 19278409 3 goldengate 653214 PPIAL3 XM_926499.2 adyacente a_3UTR -125703

rs3771910

2 175455713 3 goldengate 1123 CHN1 NM_001822.3 intron -4611

rs3775866

4 68126775 2 two-hit or HapMap 26228 STAP1 NM_012108.1 intron -1203

rs3777981

6 117841948 3 goldengate 6098 R051 NM_002944.2 intron -2166

rs3816334

2 233417050 3 goldengate 26058 TNRC15 NM_015575.2 coding [50/159]

SNP

Cr Coord cv BV Gen Nombre Gen Número de Acceso Localización LRG

rs3817269

1 15928951 3 goldengate 23207 PLEKHM2 XM_290944.5 coding [72/60]

rs3827494

3 46577235 3 goldengate 79442 LRRC2 NM_024512.2 intron -5436

rs383673

16 77789947 2 two-hit or HapMap 729251 LOC729251 XM_001133651.1 adyacente a_3UTR -14183

rs3848079

13 31324730 3 goldengate 122042 RXFP2 NM_130806.2 adyacente a_3UTR -49721

rs3891371

5 113862562 2 two-hit or HapMap 3781 KCNN2 NM_170775.1 adyacente a_3UTR -2466

rs3898966

12 33972394 2 two-hit or HapMap 84920 ALG10 NM_032834.2 adyacente a_SUTR -94089

rs3903470

3 24483025 2 two-hit or HapMap 644990 LOC644990 XM_932564.2 adyacente a_SUTR -27371

rs3935670

2 235076947 3 goldengate 10123 ARL4C NM_005737.3 adyacente a_SUTR -6515

rs3936139

19 2538576 2 two-hit or HapMap 2788 GNG7 NM_052847.1 adyacente a_SUTR -32390

rs408265

6 2787424 2 two-hit or HapMap 1992 SERPINB1 NM_030666.2 adyacente a_SUTR -344

rs4142602

13 92733503 3 goldengate 10082 GPC6 NM_005708.2 intron -55633

rs4339871

1 217499653 3 goldengate 127018 LYPLALl NM_138794.1 adyacente a_3UTR -47870

rs4396907

3 83989494 2 two-hit or HapMap 643665 LOC643665 XM_931729.2 adyacente a_SUTR -1099351

rs4407980

9 36942743 3 goldengate 5079 PAXS NM_016734.1 intron -13803

rs4432612

3 43675296 2 two-hit or HapMap 51099 ABHDS NM_016006.3 adyacente a_SUTR -32083

rs4438696

3 31900672 2 two-hit or HapMap 114884 OSBPL10 NM_017784.3 intron -4346

rs4477896

2 33805917 2 two-hit or HapMap 151325 MYADML XR_017840.1 3UTR [1090/858]

rs4490160

2 38582415 2 two-hit or HapMap 220717 RPLPO-Iike XR_017813.1 adyacente a_3UTR -18830

rs4495512

9 29908652 3 goldengate 401497 LOC401497 XM_376822.3 adyacente a_3UTR -470281

rs4505714

3 84573028 2 two-hit or HapMap 643665 LOC643665 XM_931729.2 adyacente a_SUTR -515817

rs4658673

1 243108935 3 goldengate 3192 HNRNPU NM_004501.3 adyacente a_SUTR -14485

rs4663726

2 237925851 2 two-hit or HapMap 1293 COL6A3 NM_004369.2 intron -53

rs4666167

2 29208807 3 goldengate 79745 CLIP4 NM_024692.3 intron -192

rs4691340

4 157569429 2 two-hit or HapMap 646865 hCG_1814936 XM_933981.2 adyacente a_3UTR -205667

rs4724620

7 47757437 2 two-hit or HapMap 168507 PKD1L1 NM_138295.2 adyacente a_3UTR -23378

rs4761829

12 50367232 2 two-hit or HapMap 6334 SCN8A NM_014191.1 coding [90/38]

rs4782497

16 87546780 2 two-hit or HapMap 863 CBFA2T3 NM_175931.1 intron -11671

rs4821359

22 33802273 3 goldengate 91464 ISX NM_001008494.1 intron -6238

rs485499

3 161228557 3 goldengate 730109 LOC730109 XM_001132464.1 intron -1242

rs4856541

3 84815560 3 goldengate 643665 LOC643665 XM_931729.2 adyacente a_SUTR -273285

rs4861960

4 182609327 2 two-hit or HapMap 728081 hCG_2025798 XM_001127776.1 adyacente a_SUTR -292031

rs4888984

16 78066835 2 two-hit or HapMap 4094 MAF NM_005360.3 adyacente a_3UTR -118897

rs4889197

16 71952116 2 two-hit or HapMap 388289 C16orf47 NM_207385.1 adyacente a_SUTR -216269

rs4917076

7 49678523 2 two-hit or HapMap 727813 LOC727813 XM_001125862.1 adyacente a_3UTR -8606

rs4917690

10 97224981 3 goldengate 10580 SORBS1 NM_024991.1 intron -15801

rs4968656

17 58970691 2 two-hit or HapMap 81033 KCNH6 NM_030779.2 intron -936

rs4982704

14 22433377 2 two-hit or HapMap 55147 RBM23 NM_018107.3 adyacente a_3UTR -6438

rs562966

11 119581326 2 two-hit or HapMap 220323 OAF NM_178507.2 adyacente a_SUTR -5631

rs573320

15 52465606 2 two-hit or HapMap 440279 UNC13C XM_930037.2 intron -6932

rs5755467

22 33695091 3 goldengate 91464 ISX NM_001008494.1 adyacente a_SUTR -97039

rs577562

1 67038563 2 two-hit or HapMap 10022 INSLS NM_005478.3 intron -755

rs588036

6 150740367 2 two-hit or HapMap 389434 IYD NM_203395.1 intron -8329

rs6014133

20 52734118 2 two-hit or HapMap 55816 DOKS NM_018431.3 adyacente a_3UTR -33001

rs6021658

20 50105671 3 goldengate 55734 ZFP64 NM_199427.1 adyacente a_3UTR -28286

rs6021668

20 50110836 3 goldengate 55734 ZFP64 NM_199427.1 adyacente a_3UTR -23121

rs6021688

20 50126404 3 goldengate 55734 ZFP64 NM_199427.1 adyacente a_3UTR -7553

rs6121904

20 60137102 3 goldengate 149986 LSM14B NM_144703.1 intron -274

SNP

Cr Coord cv BV Gen Nombre Gen Número de Acceso Localización LRG

rs617206

18 6975631 2 two-hit or HapMap 284217 LAMA1 NM_005559.2 coding [105/11]

rs635647

9 3252803 3 goldengate 5991 RFX3 NM_002919.2 intron -132

rs6427916

1 199907444 3 goldengate 89796 NAV1 NM_020443.2 intron -22268

rs6449558

5 61121309 2 two-hit or HapMap 643307 LOC643307 XR_016336.1 adyacente a_3UTR -42219

rs6518223

21 45538977 2 two-hit or HapMap 257103 C21orf86 NM_153454.1 coding [497/0]

rs6583661

10 82553590 3 goldengate 642666 LOC642666 XM_931000.2 adyacente a_3UTR -150122

rs6592852

11 78921073 2 two-hit or HapMap 646112 LOC646112 XR_017652.1 adyacente a_5UTR -455131

rs6596293

5 135544606 2 two-hit or HapMap 4090 SMAD5 NM_005903.5 3UTR [3538/1715]

rs6656554

1 213954552 3 goldengate 7399 USH2A NM_206933.1 intron -13443

rs670310

11 69889222 2 two-hit or HapMap 8500 PPFIA1 NM_003626.2 intron -2980

rs6780332

3 29193263 2 two-hit or HapMap 131572 LOC131572 XR_016841.1 adyacente a_3UTR -88380

rs6805546

3 72168842 2 two-hit or HapMap 642802 CCDC137P XR_016200.1 adyacente a_5UTR -49889

rs6821156

4 154491352 3 goldengate 84057 MND1 NM_032117.2 intron -621

rs6859143

5 103418563 2 two-hit or HapMap 83594 NUDT12 NM_031438.2 adyacente a_5UTR -492174

rs6907551

6 114199657 3 goldengate 4082 MARCKS NM_002356.4 adyacente a_5UTR -85592

rs7004457

8 87096982 3 goldengate 85481 PSKH2 NM_033126.1 adyacente a_3UTR -32825

rs7014552

8 143408330 3 goldengate 203062 TSNARE1 NM_145003.1 intron -1839

rs7020507

9 1705820 2 two-hit or HapMap 6595 SMARCA2 NM_139045.2 adyacente a_5UTR -299522

rs7023487

9 16142308 3 goldengate 203238 C9orf93 NM_173550.2 adyacente a_3UTR -180411

rs7036414

9 35953556 3 goldengate 56656 OR252 NM_019897.1 adyacente a_5UTR -5491

rs7121784

11 119664262 2 two-hit or HapMap 25833 POU2F3 NM_014352.1 intron -9922

rs7131721

12 59202879 2 two-hit or HapMap 390335 LOC390335 XM_001129525.1 adyacente a_3UTR -710255

rs7225575

17 42663046 2 two-hit or HapMap 4635 MYL4 NM_002476.2 adyacente a_3UTR -7002

rs7227797

18 44377669 3 goldengate 9811 KIAA0427 NM_014772.1 intron -22238

rs722827

4 174334592 2 two-hit or HapMap 51809 GALNT7 NM_017423.1 intron -7905

rs724479

1 102047645 2 two-hit or HapMap 118427 OLFM3 NM_058170.1 intron -3319

rs7251154

19 46997781 2 two-hit or HapMap 1084 CEACAM3 NM_001815.1 intron -4061

rs7254214

19 47060578 2 two-hit or HapMap 6223 RPS19 NM_001022.3 intron -3457

rs729829

1 9081584 3 goldengate 80045 GPR157 NM_024980.4 adyacente a_3UTR -5479

rs7299117

12 126267913 2 two-hit or HapMap 121296 LOC121296 XR_016630.1 adyacente a_3UTR -340640

rs7318830

13 81035524 3 goldengate 647313 LOC647313 XM_934711.2 adyacente a_3UTR -719804

rs7325070

13 83079295 3 goldengate 114798 SLITRK1 NM_052910.1 adyacente a_3UTR -270049

rs733182

22 41984895 3 goldengate 80274 SCUBE1 NM_173050.1 intron -610

rs7465573

8 61311677 3 goldengate 767 CA8 NM_004056.4 intron -4185

rs7515996

1 192591449 2 two-hit or HapMap 647167 LOC647167 XR_017690.1 adyacente a_3UTR -165354

rs7554157

1 191755792 3 goldengate 79577 CDC73 NM_024529.3 adyacente a_3UTR -268113

rs7560961

2 35803292 3 goldengate 51232 CRIM1 NM_016441.1 adyacente a_5UTR -633609

rs756634

22 21728638 3 goldengate 27156 RTDR1 NM_014433.2 adyacente a_3UTR -2955

rs763373

11 12796918 2 two-hit or HapMap 7003 TEAD1 NM_021961.3 intron -43455

rs7649851

3 6255410 2 two-hit or HapMap 2917 GRM7 NM_181875.1 adyacente a_5UTR -622517

rs7650598

3 172622161 3 goldengate 23043 TNIK NM_015028.1 intron -38329

rs7701284

5 145908423 2 two-hit or HapMap 134391 GPR151 NM_194251.2 adyacente a_5UTR -32554

rs7737236

5 116663689 2 two-hit or HapMap 728342 LOC728342 XM_001129097.1 adyacente a_5UTR -115415

rs7747934

6 156521972 3 goldengate 57492 ARID1B NM_020732.2 adyacente a_5UTR -618806

rs7801303

7 40884595 2 two-hit or HapMap 79783 C7orf10 NM_024728.1 adyacente a_3UTR -17713

rs7842021

8 23135149 3 goldengate 8797 TNFRSF10A NM_003844.2 intron -3065

rs7897163

10 18454226 2 two-hit or HapMap 729183 LOC729183 XM_001129594.1 adyacente a_5UTR -14559

SNP

Cr Coord cv BV Gen Nombre Gen Número de Acceso Localización LRG

rs7930843

11 109456617 2 two-hit or HapMap 728579 LOC728579 XM_001127833.1 adyacente a_3UTR -11784

rs7955850

12 6045840 2 two-hit or HapMap 7450 VWF NM_000552.3 intron -1140

rs7970928

12 69902492 2 two-hit or HapMap 7103 TSPAN8 NM_004616.2 adyacente a_5UTR -64446

rs798332

7 77746864 3 goldengate 9863 MAGI2 NM_012301.3 intron -23030

rs7989372

13 40819933 3 goldengate 79612 NARGlL NM_018527.2 intron -7347

rs7999382

13 96739498 3 goldengate 10150 MBNL2 NM_144778.2 intron -12834

rs8006322

14 78724765 2 two-hit or HapMap 9369 NRXN3 NM_138970.2 intron -90670

rs8015746

14 51028062 2 two-hit or HapMap 729335 LOC729335 XM_001133397.1 adyacente a_5UTR -94459

rs8049155

16 52912715 2 two-hit or HapMap 728792 LOC728792 XM_001128492.1 intron -1776

rs8051512

16 83338602 2 two-hit or HapMap 9100 USP10 NM_005153.1 intron -1822

rs8083791

18 63596654 3 goldengate 92126 DSEL NM_032160.2 adyacente a_5UTR -261707

rs809193

6 112127107 3 goldengate 2534 FYN NM_153047.1 intron -304

rs8109493

19 14464932 2 two-hit or HapMap 10755 GIPC1 NM_202467.1 intron -208

rs837511

12 123613242 2 two-hit or HapMap 9612 NCOR2 NM_006312.2 adyacente a_5UTR -44449

rs842796

1 191169038 3 goldengate 730190 LOC730190 XM_001132852.1 adyacente a_3UTR -61180

rs847126

2 176645080 3 goldengate 344191 EVX2 XM_292968.6 adyacente a_3UTR -8001

rs869026

5 138604699 2 two-hit or HapMap 9782 MATR3 NM_199189.1 adyacente a_5UTR -32992

rs878472

13 81069137 3 goldengate 647313 LOC647313 XM_934711.2 adyacente a_3UTR -686191

rs879772

3 193928757 3 goldengate 2257 FGF12 NM_004113.3 adyacente a_5UTR -691

rs882169

11 61448706 3 goldengate 728718 LOC728718 XM_001128272.1 adyacente a_5UTR -3659

rs886090

9 135189324 3 goldengate 6838 SURF6 NM_006753.3 coding [119/93]

rs9036

3 14505725 3 goldengate 6533 SLC6A6 NM_003043.2 adyacente a_3UTR -1751

rs910545

22 26276986 3 goldengate 4330 MN1 NM_002430.2 adyacente a_3UTR -197279

rs911064

20 61370750 3 goldengate 55738 ARFGAP1 NM_175609.1 adyacente a_5UTR -3860

rs9322114

6 148333734 2 two-hit or HapMap 23328 SASH1 NM_015278.3 adyacente a_5UTR -371688

rs936056

17 71099379 2 two-hit or HapMap 728272 -99 XM_001127042.1 coding [87/9]

rs938372

2 88780884 3 goldengate 22934 RPIA NM_144563.2 intron -187

rs9390613

6 149166809 3 goldengate 10090 UST NM_005715.1 intron -56303

rs952656

8 124196776 3 goldengate 93594 WDR67 NM_145647.1 intron -4700

rs9568036

13 47869937 3 goldengate 10161 P2RY5 NM_005767.3 adyacente a_3UTR -13338

rs9651511

10 125546364 2 two-hit or HapMap 119587 CPXM2 NM_198148.1 intron -1118

rs9788864

16 22921056 2 two-hit or HapMap 57478 USP31 NM_020718.2 adyacente a_3UTR -65812

rs9818995

3 84306747 2 two-hit or HapMap 643665 LOC643665 XM_931729.2 adyacente a_5UTR -782098

rs9822040

3 127410451 3 goldengate 10840 ALDH1L1 NM_012190.2 adyacente a_5UTR -28276

rs9842818

3 147550430 2 two-hit or HapMap 440981 LOC440981 XM_ 496663.3 adyacente a_3UTR -41407

rs9855978

3 80171732 3 goldengate 6091 ROB01 NM_002941.2 adyacente a_5UTR -449981

rs9869315

3 177037998 3 goldengate 254827 NAALADL2 NM_207015.1 adyacente a_3UTR -31876

rs9978582

21 46312815 3 goldengate 1292 COL6A2 NM_001849.2 adyacente a_5UTR -29655

rs885782

6 161909893 2 two-hit or HapMap 5071 PARK2 NM_004562.1 intron -484

rs2723264

12 38938787 2 two-hit or HapMap 120892 LRRK2 NM_198578.2 intron -762

rs2022991

6 162168159 3 goldengate 5071 PARK2 NM_013988.1 intron -41229

rs4709517

6 161759771 2 two-hit or HapMap 5071 PARK2 NM_004562.1 intron -31872

rs9347686

6 163091960 2 two-hit or HapMap 135138 PACRG NM_152410.1 intron -22547

rs3016563

6 162112846 2 two-hit or HapMap 5071 PARK2 NM_013988.1 intron -13948

rs3733449

4 90791345 2 two-hit or HapMap 6622 SNCA NM_000345.2 adyacente a_3UTR -74383

rs9456734

6 162394883 3 goldengate 5071 PARK2 NM_004562.1 intron -230

rs1893098

6 162196867 3 goldengate 5071 PARK2 NM_013988.1 intron -69937

SNP

Cr Coord cv BV Gen Nombre Gen Número de Acceso Localización LRG

rs6926642

6 162190971 3 goldengate 5071 PARK2 NM_013988.1 intron -64041

rs6942109

6 161706684 3 goldengate 5071 PARK2 NM_013988.1 intron -5457

rs7298930

12 39005767 2 two-hit or HapMap 120892 LRRK2 NM_198578.2 intron -2392

rs11964284

6 161732616 2 two-hit or HapMap 5071 PARK2 NM_004562.1 intron -4717

rs11564173

12 39036738 2 two-hit or HapMap 120892 LRRK2 NM_198578.2 intron -482

rs9347654

6 162840827 2 two-hit or HapMap 5071 PARK2 NM_004562.1 adyacente a_SUTR -56332

rs6906519

6 161811378 3 goldengate 5071 PARK2 NM_013988.1 intron -78498

rs10878246

12 38918366 2 two-hit or HapMap 120892 LRRK2 NM_198578.2 intron -194

rs11175655

12 38909994 2 two-hit or HapMap 120892 LRRK2 NM_198578.2 intron -2349

rs11564203

12 39010848 2 two-hit or HapMap 120892 LRRK2 NM_198578.2 intron -2319

rs11829088

12 39014046 2 two-hit or HapMap 120892 LRRK2 NM_198578.2 intron -990

rs10878307

12 38958256 2 two-hit or HapMap 120892 LRRK2 NM_198578.2 coding [96/74]

rs12525605

6 163628328 3 goldengate 135138 PACRG NM_152410.1 adyacente a_SUTR -25473

rs1907632

12 38936769 2 two-hit or HapMap 120892 LRRK2 NM_198578.2 intron -548

rs2000594

6 162161095 3 goldengate 5071 PARK2 NM_013988.1 intron -34165

rs10857057

4 119182533 3 goldengate 9348 NDST3 NM_004784.1 intron -7338

rs11134974

5 175714565 2 two-hit or HapMap 57179 KIAA1191 NM_020444.2 intron -615

rs12589063

14 88507193 2 two-hit or HapMap 123016 TIC8 NM_198310.2 adyacente a_3UTR -93105

rs1329579

9 81749779 3 goldengate 347119 LOC347119 XM_928399.1 adyacente a_3UTR -79448

rs281357

17 19683106 2 two-hit or HapMap 9706 ULK2 NM_014683.2 intron -618

rs2862909

13 23999167 3 goldengate 143 PARP4 NM_006437.2 adyacente a_SUTR -14219

rs3764286

16 83298844 2 two-hit or HapMap 9100 USP10 NM_005153.1 intron -7626

rs4350947

3 123227539 3 goldengate 286676 ILDR1 NM_175924.2 adyacente a_SUTR -3819

rs7146193

14 88516549 2 two-hit or HapMap 123016 TIC8 NM_198310.2 adyacente a_3UTR -102461

rs7218605

17 74323398 2 two-hit or HapMap 57602 USP36 NM_025090.2 intron -1169

rs7539016

1 231556122 2 two-hit or HapMap 84451 KIAA1804 NM_032435.1 intron -54

rs761267

20 41896884 2 two-hit or HapMap 728240 LOC728240 XM_001126959.1 adyacente a_SUTR -79534

rs7653784

3 14848798 2 two-hit or HapMap 152273 FGDS NM_152536.2 intron -10691

rs7924316

11 2130023 2 two-hit or HapMap 51214 IGF2AS NM_016412.1 adyacente a_3UTR -3553

rs9382517

6 55586555 3 goldengate 54511 HMGCLLl NM_019036.1 adyacente a_SUTR -34611

rs5760103

22 22578781 2 two-hit or HapMap 4282 MIF NM_002415.1 adyacente a_3UTR -11372

rs4865845

5 53913691 2 two-hit or HapMap 112574 SNAG1 NM_052870.1 adyacente a_3UTR -62265

rs7667015

4 42634138 2 two-hit or HapMap 389207 LOC389207 XM_371694.4 intron -25528

rs7830101

8 39527585 3 goldengate 1587 ADAM3A NR_001569.1 adyacente a_SUTR -28061

rs4583999

6 156527609 2 two-hit or HapMap 57492 ARID1B NM_020732.2 adyacente a_SUTR -613169

rs741365

12 5554582 2 two-hit or HapMap 57101 TMEM16B NM_020373.1 intron -679

rs11235935

11 69856226 2 two-hit or HapMap 8500 PPFIA1 NM_003626.2 intron -378

rs1740377

6 112149811 2 two-hit or HapMap 2534 FYN NM_153048.1 intron -1853

rs11070178

15 37329814 2 two-hit or HapMap 400360 C15orf54 NM_207445.1 adyacente a_SUTR -397

rs886016

9 135545450 2 two-hit or HapMap 1757 SARDH NM_007101.2 coding [127/20]

rs4813430

20 21484958 3 goldengate 4821 NKX2-2 NM_002509.2 adyacente a_SUTR -42294

rs3128501

9 89518960 3 goldengate 1612 DAPK1 NM_004938.2 adyacente a_3UTR -5591

rs7105372

11 8700795 2 two-hit or HapMap 6764 STS NM_213618.1 intron -3401

rs6508999

19 47014387 2 two-hit or HapMap 1084 CEACAM3 NM_001815.1 adyacente a_3UTR -6958

rs1532763

11 121010533 2 two-hit or HapMap 6653 SORLl NM_003105.3 adyacente a_3UTR -4912

rs1039189

18 49731452 2 two-hit or HapMap 8932 MBD2 NM_003927.3 adyacente a_3UTR -203121

rs6047472

20 21478788 2 two-hit or HapMap 4821 NKX2-2 NM_002509.2 adyacente a_SUTR -36124

SNP

Cr Coord cv BV Gen Nombre Gen Número de Acceso Localización LRG

rs6592941

7 51642120 2 two-hit or HapMap 642663 LOC642663 XM_926118.1 adyacente a_3UTR -224163

rs7027515

9 126213030 3 goldengate 5695 PSMB7 NM_002799.2 intron -1422

rs4267850

5 77683520 2 two-hit or HapMap 727723 LOC727723 XM_001125292.1 adyacente a_5UTR -6313

rs4072198

3 62187107 2 two-hit or HapMap 5793 PTPRG NM_002841.2 intron -4832

rs11753244

6 165013078 2 two-hit or HapMap 728275 LOC728275 XM_001127046.1 adyacente a_3UTR -334296

rs1156143

7 136740077 2 two-hit or HapMap 9162 DGKI NM_004717.2 intron -3084

rs2399095

3 107605293 2 two-hit or HapMap 728784 LOC728784 XM_001128470.1 adyacente a_5UTR -19073

rs4285366

6 8839136 3 goldengate 389365 LOC389365 XM_371797.3 adyacente a_5UTR -147723

rs902074

5 163173200 2 two-hit or HapMap 391844 LOC391844 XR_016645.1 adyacente a_5UTR -45558

rs1634079

4 150007154 2 two-hit or HapMap 4306 NR3C2 NM_000901.1 adyacente a_5UTR -424181

rs10153012

15 92684286 2 two-hit or HapMap 55784 MCTP2 NM_018349.2 intron -146

rs1934115

9 23093266 3 goldengate 402360 LOC402360 XR_017263.1 adyacente a_5UTR -578629

rs1559854

11 83741948 2 two-hit or HapMap 1740 DLG2 NM_001364.2 intron -101966

rs10497933

2 211849925 2 two-hit or HapMap 2066 ERBB4 NM_005235.1 adyacente a_3UTR -105135

rs4433214

9 120542512 3 goldengate 442434 LOC442434 XR_016936.1 adyacente a_5UTR -99

rs10244108

7 55119831 3 goldengate 1956 EGFR NM_201282.1 intron -57642

rs7023309

9 137587676 3 goldengate 654089 LOC654089 XM_939055.1 adyacente a_5UTR -3107

rs10465957

1 155632002 3 goldengate 729853 -99 XM_001134256.1 adyacente a_3UTR -117789

rs2056777

3 25515395 3 goldengate 5915 RARB NM_016152.2 intron -2282

rs11927332

3 70689611 3 goldengate 401072 -99 NM_001013679.1 adyacente a_3UTR -55828

rs11071896

15 64608304 2 two-hit or HapMap 55055 ZWILCH NM_017975.2 coding [60/45]

Diseño de un ensayo multiplex (Oligonucleotide Pooling Assay; OPA) con los SNPs seleccionados para la validación en la población española

5 El panel de marcadores seleccionados durante HFCC (Tabla 2) se envió a la empresa Illumina Inc para efectuar un análisis bioinformático y determinar las secuencias génicas que se sintetizarán para el ensayo de genotipación múltiple (OPA, oligonucleotide pooling assay) .

10 Genotipación: Se realizó utilizando la tecnología Veracode (ver más arriba)

Ejemplo 2. Identificación de la pareja de marcadores ChrS rs869026 X chr6 rs10945364 como factor de 15 susceptibilidad genética para la enfermedad tras la

realización de un rastreo completo bi-variante de genoma completo y dos tandas de validación.

Para identificar parejas de marcadores genéticos

vinculados

a la enfermedad en estudio se emplearon,

sucesivamente,

el HFCC (stage I) y dos validaciones

independientes.

En cada fase se calculó el efecto con la

estimación de la Odds ratio (OR) de los diplotipos. Este término inglés de se ha traducido como razón de posibilidades, razón de momios, razón de odds y es el cociente de dos razones: el numerador es la razón de la probabilidad de que un evento suceda y la probabilidad de que no suceda bajo ciertas condiciones y el denominador es la razón de la probabilidad de que dicho evento suceda y la probabilidad de que no suceda bajo las condiciones complementarias. Es una medida de tamaño de efecto. Finalmente se efectuó un análisis conjunto y meta-análisis de las mejores parejas. Inicialmente HFCC seleccionó combinaciones de los marcadores moleculares descritos en la tabla 2 (que son los mejores candidatos encontrados para explicar el riesgo a padecer la enfermedad) Las dos validaciones independientes posteriores (stage II y III) permitieron depurar todos los falsos positivos. Concretamente, después de dos rondas de validación, tan sólo se detectó una pareja asociada al fenotipo de manera consistente en todas las poblaciones (tabla 3 y Figura 1).

Más concretamente se detectó que evaluando el efecto conjunto de una combinación diplotípica de los alelos más frecuentes de marcadores rs869026 y rs10945364 se encontraba una asociación consistente a la enfermedad en las tres series. De hecho observamos que los individuos portadores en homocigosis de alelo T de rs869026 combinado con la presencia en heterocigosis del alelo e de rs1O94 53 64 (diplotipo TT /CT de los marcadores) tienen un 66-72% más de riesgo de padecer la Enfermedad de Parkinson respecto a los no portadores (Tabla 3) .

Tabla 3: Efecto (OR) del diplotipo TT/CT en los marcadores rs869026 y rs10945364 en la Enfermedad de Parkinson. OR: odds ratio. Ci95-i/s: intervalo de confianza inferior y superior al 95%.

Estudio NIH 1 NXC 1 NIH2 Meta-análisis (efecto Aleatorio)

OR 3.26 1.3 1.32 1.728 ll 2.06 0.92 0.99 1.035 LS 5.16 1.83 1.77 2.886 ln(OR) 0.54 V(ln(OR)) 0.068 Peso Relativo 0.3 0.34 0.36 1

P de Homogeneidad:

0.003

El análisis conjunto de las tres series (n=2697) demostró que el efecto observado es altamente significativo desde un punto de vista estadístico (p=2, 66E-07) El meta-

10 análisis de las tres series (empleando un modelo de efectos a 1 e a t o r i o s ) t a mb i é n re s u 1 t ó s i g n i f i e a t i v o ( p = O , O 3 6 ) . Lo s marcadores que confeccionan dicha pareja (rs869026 y rs10945364) nunca han sido asociados a la enfermedad de Parkinson y su efecto individual o combinado tampoco ha sido

15 descrito previamente.

Desde un punto de vista funcional el marcador genómico rs10945364 se encuentra en un desierto génico (aquella región del genoma donde no hay secuencias codificantes conocidas) 20 del brazo largo del cromosoma 6 (6q27). Por ello, no puede establecerse ninguna hipótesis acerca de la plausibilidad biológica de esta región cromosómica respecto a la enfermedad de Parkinson puesto que se desconoce qué funciones contiene dicha región. Por contra, el marcador rs869026, localizado en 25 5q31. 2, se encuentra en región 5' del gen SILl. Este gen es

responsable

del Síndrome de Marinesco-Sjogren y es un

candidato

muy contundente para los trastornos

neurodegenerativos

complejos. No obstante es importante

indicar que, hasta la fecha, nunca había sido estudiado o asociado este gen para la enfermedad de Parkinson.

Ejemplo 3. Evaluación individual de los marcadores seleccionados por HFCC en tres series independientes

Sabemos que parte de los resultados de HFCC son debidos a la aparición de marcadores genéticos que tienen un efecto individual per se sin ningún efecto sinérgico con otro marcador. Para valorar esta posibilidad en los marcadores identificados por HFCC, construimos matrices con los genotipos y fenotipos para el software PLINK(PLINK: a tool set for whole-genome association and population-based linkage analyses. Purcell S, Neale B, Todd-Brown K, Thomas L, Ferreira MA, Bender D, Maller J, Sklar P, de Bakker PI, Daly MJ, Sham PC. Am J Hum Genet. 2007 Sep;81(3) :559-75) El software permite la evaluación genética de múltiples marcadores y la realización de diferentes test genéticos que sirven como medida de heterogeneidad. Inicialmente aplicamos el comando -assoc de PLINK (que efectúa un test de asociación alélica comparando la frecuencia de los marcadores en casos y controles) a cada serie de forma independiente

(stage I, II y III) y a una matriz compuesta con todos los genotipos e individuos de las tres series (análisis conjunto) De esta forma se efectuó el análisis sistemático del efecto univariante de los 384 marcadores incluidos en el panel de HFCC midiendo las diferencias de frecuencias alélicas entre casos y controles (tabla 4) Se observaron 66 marcadores que tenían diferencias estadísticamente significativas de frecuencia alélica entre casos y controles (plt;0.05). No obstante, no es suficiente que observemos

asociación en el análisis combinado (tabla 4) sino que el efecto observado en las tres series ha de ser consistente (en la misma dirección la OR). Para evaluar de manera pormenorizada la ausencia de heterogeneidad entre los tres estudios empleamos diferentes estrategias. i) Los SNPs deben mantener su asociación cuando efectuamos el cálculo de su efecto con una regresión logística ajustada por edad y sexo, ii) deben soportar un análisis estratificado por estudio (Stages 1, 2, 3) iii) debe existir ausencia de heterogeneidad

(índice de Breslow gt; O, 05) y iv) el meta-análisis ajustado por edad y sexo debe ser positivo. Por tanto, para depurar aún más los resultados se procedió al ajuste de efectos individuales de cada SNP en estudio por edad y sexo mediante el comando -logistic, al cálculo de índice de Breslow-Day mediante el comando --within y meta-análisis (--meta-analysis) de los 384 marcadores seleccionados. Gracias a este método combinado identificamos un total de 20 marcadores SNPs que cumplen todos los requisitos de asociación prefijados. Así estos SNPs mostraban significación estadística en el análisis conjunto ajustado por edad y sexo (plt;O, 05), asociación estadísticamente significativa en el análisis estratificado por series

(plt;0,05), test de Breslow-Day neutro (no significativo, pgt;O, 05) y meta-análisis ajustado significativo (plt;O, 05). La aplicación de estos requisitos estadísticos permite reducir la aparición de falsos positivos.

La tabla 5 muestra los marcadores SNPs seleccionados por HFCC y que se han podido validar analizando dos series independientes adicionales de casos y controles aplicando distintos métodos estadísticos. Destacamos que los marcadores localizados en el cromosoma 12 (rs11175655, rs11564173, rs11564203, rs11829088, rs1907632, rs2723264) se encuentran en el gen LRRK2. Este gen ha sido previamente

implicado en PD (9). No obstante su inclusión en la selección efectuada por HFCC demuestra la eficiencia del método aplicado. El resto de los marcadores seleccionados, incluidos en 1 a t ab1 a 4 ( r s 1 O3 91 8 9 , r s 12 9 8 7 2 8 6 , r s 13 6 4 6 5 8 , r s 1 54 9 3 55 , rs218280, rs2332631, rs353111, rs3936139, rs4490160, rs577562, rs6805546, rs761267, rs7650598, rs869026), nunca se habían asociado a PD y son completamente novedosos (tabla 4). De esta manera, se puede calcular la probabilidad de padecer la enfermedad de Parkinson en un individuo problema mediante:

1.

Extracción de una muestra de sangre o cualquier otro tejido para realizar una extracción de ADN a partir de dicho material.

2.

Una vez obtenido el ADN se procede a genotipar los marcadores identificados mediante tecnologías de genotipado convencionales com PCR-RFLP, ARMS, PCR en tiempo real o secuenciación directa de productos de PCR etc.

3.

Una vez decodificados los genotipos se determina el número de copias del alelo de menor frecuencia que contiene cada individuo y se realiza la suma de estos alelos (cada marcador debe ser ponderados mediante la tabla de coeficientes estandarizados que se suministra)

Dependiendo de la puntuación obtenida podemos conocer si el patrón de genotipos del individuo se parece a lo observado en casos o controles.

Tabla 4. Análisis sistemático del efecto univariante de los 384 marcadores incluidos en el panel de HFCC midiendo las diferencias de frecuencias alélicas entre casos y controles ID: código de identificación de Illumina. CR: cromosoma. CHISQ stagel: valor de Chi-cuadrado obtendi en el estadio 1 de validación. Pstagel: valor de p en estadio 1. ORstagel: efecto (OR) en estadio l. Idem para estadio 2 y 3 de validación. P conjunta: valor de significación de los tres

estudios tomados conjuntamente. ORconjunta: efecto promedio de cada marcador teniendo en cuenta los tres estudios efectuados.

Id

CR SNP Posición CHISQ Stage1 P stage1 OR stage1 CHISQ stage2 P stage2 OR Stage2 CHISQ P Stage3 stage3 OR stage3 CHISQ Conjunta p conjunta OR conjunta

225

10 rs2505513 42953543 15,97 6,435E-05 1,81 0,85 0,3565523 0,9 0,22 0,64 1,06 18,7 1,5E-05 1,307

100

4 rs2242330 68129844 21,61 3,341E-06 2 0,48 0,4884223 1,09 1,26 0,26 1,13 14,72 0,00012 1,305

44

2 rs12987286 148380038 9,77 0,0017738 1,51 1,64 0,2003256 1,14 4,97 0,03 1,22 14,3 0,00016 1,252

43

2 rs1364658 148324278 9,67 0,001873 1,51 1,25 0,2635527 1,12 4,86 0,03 1,22 13,56 0,00023 1,244

326

16 rs4888984 78066835 19,64 9,349E-06 2,07 1,74 0,1871389 1,19 0,6 0,44 1,09 13,5 0,00024 1,309

310

14 rs12434638 89679833 7,06 0,0078824 0,72 0,16 0,6891565 0,96 13,01 0,00031 0,7676

354

19 rs3936139 2538576 10,58 0,0011432 0,65 1,14 0,2856526 0,9 2,8 0,09 0,86 12,62 0,00038 0,8085

224

10 rs11008264 31129838 6,44 0,0111579 1,41 11,34 0,0007586 1,44 0,1 0,75 1,03 12,37 0,00044 1,244

301

14 rs2332631 25562376 7,45 0,0063436 0,65 9,35 0,0022299 0,69 0,69 0,41 0,92 12,22 0,00047 0,7846

202

9 rs2381628 7508656 1,99 0,1583409 0,81 o 1 1,01 0,01 0,93 1,01 11,65 0,00064 0,8172

39

2 rs1370699 86025785 14,07 0,0001761 1,68 2,56 0,1095986 1,18 1,7 0,19 1,13 10,62 0,00112 1,222

96

4 rs17714109 28900684 8,8 0,0030123 1,61 9,7 0,0018427 1,46 0,09 0,77 1,03 10,48 0,00121 1,264

239

11 rs1397053 56267270 12,84 0,0003393 0,59 2,88 0,089686 0,83 0,01 0,92 0,99 10,03 0,00154 0,8111

129

5 rs869026 138604699 7,69 0,0055528 0,69 2,65 0,1035499 0,85 0,85 0,36 0,92 10 0,00156 0,8336

8

1 rs577562 67038563 3,02 0,0822435 0,74 0,7 0,4027837 0,9 2,25 0,13 0,79 9,999 0,00157 0,7648

260

12 rs11175655 38909994 4,87 0,0273275 1,47 4,96 0,0259402 1,38 1,2 0,27 1,15 9,913 0,00164 1,297

105

4 rs1828034 148309936 11,34 0,0007586 1,75 0,24 0,6242061 1,08 0,63 0,43 1,1 9,585 0,00196 1,279

99

4 rs3775866 68126775 19,97 7,867E-06 1,87 0,1 0,7518296 1,03 1,78 0,18 1,13 9,548 0,002 1,208

38

2 rs11691934 86018954 16 6,334E-05 1,66 3,13 0,0768638 1,19 0,54 0,46 1,07 9,452 0,00211 1,191

90

3 rs7650598 172622161 0,58 0,4463123 1,12 2,02 0,1552392 1,17 7,5 0,01 1,3 8,971 0,00274 1,211

197

8 rs2736000 127469169 14,27 0,0001584 0,58 0,91 0,3401144 0,9 0,45 0,5 0,93 8,947 0,00278 0,821

268

12 rs11564173 39036738 5,45 0,0195683 1,57 1,49 0,2222166 1,19 2,59 0,11 1,21 8,895 0,00286 1,277

45

2 rs353111 165845275 3,53 0,0602678 0,77 8,21 0,004166 0,73 0,55 0,46 0,93 8,877 0,00289 0,8324

60

3 rs7653784 14848798 10,83 0,0009987 1,6 3,72 0,0537644 1,23 0,36 0,55 1,06 8,55 0,00346 1,203

262

12 rs1907632 38936769 4,56 0,0327271 1,42 1,81 0,1785083 1,19 3,49 0,06 1,24 8,334 0,00389 1,243

263

12 rs2723264 38938787 1,83 0,1761276 0,82 0,03 0,8624902 1,02 6,5 0,01 0,77 8,265 0,00404 0,8258

261

12 rs10878246 38918366 0,77 0,3802171 1,17 4,56 0,0327271 1,29 3,03 0,08 1,2 7,79 0,00526 1,221

34

2 rs4490160 38582415 8,26 0,0040528 1,65 0,97 0,3246802 1,13 2,8 0,09 1,21 7,719 0,00547 1,233

128

5 rs6596293 135544606 15,1 0,000102 1,68 2,6 0,1068637 1,18 0,16 0,69 1,04 7,498 0,00618 1,178

269

12 rs11564252 39100000 4,88 0,0271696 1,43 0,57 0,4502589 1,18 3,27 0,07 1,21 7,346 0,00672 1,242

146

6 rs1549355 124849888 2,56 0,1095986 1,27 2,2 0,1380108 1,19 2,18 0,14 1,16 7,307 0,00687 1,203

74

3 rs11715563 83873910 12,44 0,0004202 1,57 1,1 0,2942663 1,11 0,4 0,53 1,07 7,203 0,00728 1,188

351

18 rs1039189 49731452 7,11 0,0076655 0,66 0,21 0,6467674 0,95 2,93 0,09 0,85 6,84 0,00891 0,842

47

2 rs847126 176645080 16,45 4,995E-05 0,54 7,37 0,0066321 0,74 0,55 0,46 1,07 6,79 0,00917 0,8479

143

6 rs1740377 112149811 12,42 0,0004248 1,69 1 0,58 0,45 1,08 6,726 0,0095 1,239

75

3 rs4396907 83989494 15 0,0001075 1,7 0,01 0,9203443 0,99 0,39 0,53 1,06 6,693 0,00968 1,173

203

9 rs7023487 16142308 11,23 0,0008049 0,66 1,71 0,1909855 0,88 0,51 0,47 0,94 6,612 0,01013 0,8655

Id

CR SNP Posición CHISQ Stage1 P stage1 OR stage1 CHISQ stage2 P stage2 OR Stage2 CHISQ P Stage3 stage3 OR stage3 CHISQ Conjunta p conjunta OR conjunta

40

2 rs3731818 86222315 9,77 0,0017738 1,51 1,39 0,2384053 1,13 0,48 0,49 1,06 6,556 0,01045 1,164

35

2 rs1521937 53515720 12,82 0,0003429 0,64 1 0,3173108 0,91 0,21 0,65 0,96 6,353 0,01172 0,8706

132

5 rs11134974 175714565 4,67 0,0306939 0,77 0,71 0,3994438 0,92 0,64 0,42 0,94 6,214 0,01267 0,8716

363

20 rs761267 41896884 4,93 0,0263943 0,74 2,15 0,1425699 0,87 0,68 0,41 0,93 6,177 0,01294 0,8677

98

4 rs218280 55119046 1,89 0,169202 0,82 0,13 0,718432 0,96 4,65 0,03 0,81 6,067 0,01377 0,8531

57

3 rs162216 7833048 12,49 0,0004091 0,61 0,08 0,7772974 1,03 3,13 0,08 0,84 5,799 0,01603 0,8546

267

12 rs11829088 39014046 4,02 0,0449637 1,39 1,25 0,2635527 1,15 2 0,16 1,18 5,734 0,01664 1,196

142

6 rs809193 112127107 12,98 0,0003148 1,71 0,48 0,4884223 1,08 0,58 0,45 1,08 5,683 0,01713 1,17

266

12 rs11564203 39010848 3,81 0,0509475 1,38 1,26 0,2616513 1,15 2,04 0,15 1,18 5,609 0,01787 1,194

198

8 rs7014552 143408330 12,06 0,0005152 1,54 o 1 1 2,07 0,15 1,13 5,543 0,01856 1,142

324

16 rs383673 77789947 11,64 0,0006455 0,64 0,17 0,6801118 0,96 0,12 0,73 0,97 5,466 0,01939 0,876

177

7 rs6592941 51642120 10,19 0,001412 1,77 1 0,7 0,4 1,38 5,424 0,01986 1,442

237

11 rs2593693 22324877 15,8 7,04E-05 0,57 0,05 0,8230633 1,03 0,91 0,34 0,91 5,261 0,02181 0,8643

133

5 rs3756616 179333453 2,72 0,099098 0,81 6,67 0,0098049 0,78 0,04 0,83 1,02 5,165 0,02305 0,879

92

3 rs879772 193928757 11,29 0,0007793 0,61 1 0,26 0,61 0,95 5,158 0,02313 0,8311

80

3 rs2011207 104449957 11,32 0,0007668 1,62 1 0,02 0,9 0,99 5,059 0,0245 1,184

361

20 rs6047472 21478788 5,35 0,0207223 0,74 7,82 0,0051671 0,76 0,81 0,37 1,08 4,893 0,02696 0,8796

226

10 rs12412945 54468113 16,29 5,435E-05 0,51 1,63 0,2017031 1,18 3,91 0,05 0,81 4,852 0,02761 0,8508

315

15 rs11071896 64608304 4,3 0,0381124 0,75 2,09 0,1482661 0,86 o 0,97 1 4,768 0,02899 0,8721

217

9 rs4433214 120542512 7,39 0,0065587 0,68 1,34 0,2470341 0,88 0,000 0285 1 1 4,757 0,02917 0,8728

95

4 rs2047214 11150840 2,88 0,089686 0,78 1,13 0,2877755 0,89 0,46 0,5 0,93 4,716 0,02989 0,8687

135

6 rs408265 2787424 9,47 0,0020886 0,67 0,04 0,8414806 0,98 0,8 0,37 0,89 4,678 0,03055 0,8669

319

16 rs11860440 1697619 11,09 0,0008679 1,64 0,03 0,8624902 1,02 0,05 0,82 1,02 4,513 0,03364 1,155

312

15 rs11070178 37329814 9,54 0,0020104 1,57 0,58 0,4463123 1,09 0,8 0,37 1,12 4,109 0,04267 1,159

294

13 rs7325070 83079295 5,38 0,0203689 0,72 3,13 0,0768638 1,21 11,66 o 0,73 4,055 0,04404 0,8817

120

5 rs4267850 77683520 0,23 0,6315238 1,06 13,19 0,0002814 1,41 0,47 0,5 0,95 3,911 0,04796 1,115

271

12 rs4761829 50367232 5,79 0,0161176 1,54 1,33 0,2488054 1,17 0,26 0,61 1,06 3,908 0,04805 1,171

161

6 rs2000594 162161095 2,21 0,1371187 0,69 0,95 0,3297193 0,82 1,77 0,18 0,81 3,896 0,04841 0,8004

166

6 rs9347654 162840827 0,95 0,3297193 0,89 0,89 0,3454773 1,09 1,12 0,29 1,09 3,882 0,04882 1,114

369

20 rs6121904 60137102 3,12 0,0773368 1,31 1,76 0,1846246 1,18 o 0,99 1 3,841 0,05 1,143

26

1 rs10916407 227216444 13,84 0,0001991 0,59 1,67 0,1962586 0,87 0,94 0,33 1,1 3,65 0,05608 0,8844

245

11 rs6592852 78921073 7,21 0,0072498 0,64 0,35 0,5541131 0,93 0,02 0,9 0,99 3,621 0,05704 0,8678

9

1 rs10801705 89272970 5,16 0,0231129 0,76 0,3 0,5838824 1,05 3,19 0,07 0,86 3,608 0,05751 0,9002

29

2 rs11674954 1262038 7,8 0,0052246 0,68 6,93 0,0084762 0,74 1,17 0,28 1,11 3,601 0,05773 0,8851

304

14 rs8015746 51028062 1 0,3173108 0,88 0,73 0,3928832 1,09 8,46 0,00363 04 1,28 3,601 0,05774 1,112

231

10 rs9651511 125546364 0,07 0,7913368 0,97 4,77 0,0289598 0,8 3,569 0,05886 0,8651

46

2 rs3771910 175455713 10,55 0,0011619 1,51 1,9 0,1680784 0,87 0,77 0,38 1,08 3,552 0,05947 1,112

334

17 rs150858 3479419 3,05 0,0807372 0,75 0,01 0,9203443 1,02 0,73 0,39 0,89 3,524 0,0605 0,8625

350

18 rs2219925 47717831 3,9 0,0482861 1,32 3,44 0,0636357 1,22 o 0,99 1 3,413 0,06467 1,121

340

17 rs7218605 74323398 8,72 0,0031474 0,65 2,28 0,1310519 1,15 0,26 0,61 1,04 3,399 0,06525 0,9012

313

15 rs1898111 45679590 11,76 0,0006052 0,57 0,16 0,6891565 1,05 0,06 0,81 0,97 3,355 0,06699 0,8775

188

8 rs1480691 14808735 10,23 0,0013817 1,6 0,11 0,7401441 0,96 0,63 0,43 1,08 3,344 0,06747 1,127

Id

CR SNP Posición CHISQ Stage1 P stage1 OR stage1 CHISQ stage2 P stage2 OR Stage2 CHISQ P Stage3 stage3 OR stage3 CHISQ Conjunta p conjunta OR conjunta

4

1 rs1203638 13994479 3,11 0,077813 0,78 1 1,02 0,31 0,91 3,302 0,0692 0,8714

131

5 rs902074 163173200 2,46 0,1167788 0,8 1,51 0,2191392 0,88 0,03 0,87 1,02 3,275 0,07033 0,8924

287

13 rs2555605 32731810 0,93 0,3348629 0,89 1,51 0,2191392 0,89 0,74 0,39 0,93 3,267 0,07068 0,9018

346

18 rs2041611 14077956 3,04 0,0812359 0,79 6,47 0,0109711 0,75 0,15 0,7 1,04 3,263 0,07084 0,8923

257

12 rs7955850 6045840 2,77 0,0960462 1,36 9,26 0,0023421 1,62 1,64 0,2 0,85 3,239 0,07188 1,171

314

15 rs573320 52465606 6,73 0,0094805 0,69 0,1 0,7518296 1,03 0,52 0,47 0,93 3,228 0,07237 0,8922

167

6 rs9347686 163091960 1,48 0,2237747 1,16 4,59 0,032159 1,23 0,06 0,81 0,98 3,183 0,07439 1,104

17

1 rs1887279 182176783 19,66 9,252E-06 0,5 0,01 0,9203443 0,99 1,45 0,23 1,14 3,15 0,07594 0,8863

52

2 rs3816334 233417050 0,7 0,4027837 1,11 1,64 0,2003256 1,14 0,19 0,67 1,04 3,135 0,07662 1,109

282

12 rs7299117 126267913 4,28 0,0385634 0,74 1,24 0,2654712 0,89 0,05 0,83 1,02 3,115 0,07757 0,8941

76

3 rs9818995 84306747 12,57 0,000392 1,86 o 1 1,01 0,06 0,8 0,97 3,113 0,07769 1,148

378

22 rs756634 21728638 7,1 0,0077084 0,63 0,34 0,5598292 0,92 0,77 0,38 0,9 3,088 0,07889 0,8696

362

20 rs4813430 21484958 6,42 0,0112842 0,72 7,26 0,0070507 0,76 1,29 0,26 1,11 3,052 0,08064 0,9027

214

9 rs10512174 88076394 0,96 0,3271869 0,89 1,47 0,2253458 0,89 0,09 0,77 0,98 3,02 0,08226 0,909

91

3 rs9869315 177037998 10,79 0,0010205 1,65 1,02 0,3125193 1,12 0,14 0,7 0,96 2,971 0,08475 1,123

318

16 rs2235490 1683512 11,16 0,0008358 1,7 0,15 0,6985354 0,95 0,13 0,72 1,04 2,954 0,08567 1,132

49

2 rs10497933 211849925 3,61 0,0574331 1,31 0,38 0,5376032 1,08 0,07 0,79 1,03 2,929 0,08699 1,119

37

2 rs10201616 75529368 1,59 0,2073263 1,23 0,37 0,5430043 1,09 0,29 0,59 1,06 2,925 0,08721 1,142

32

2 rs4477896 33805917 3,4 0,0651964 0,76 0,01 0,9203443 1,01 0,92 0,34 0,88 2,909 0,08811 0,8833

195

8 rs2976501 93045739 3,93 0,047432 1,35 0,58 0,4463123 1,09 0,05 0,83 1,02 2,894 0,08891 1,116

16

1 rs2986574 182173237 19,53 9,903E-06 0,5 0,0000 119 0,9972476 1 1,39 0,24 1,13 2,881 0,08964 0,8904

138

6 rs214506 18329450 10,66 0,0010948 1,5 0,03 0,8624902 0,98 0,28 0,6 1,04 2,846 0,09161 1,098

281

12 rs837511 123613242 2,02 0,1552392 0,8 2,3 0,129374 0,82 0,52 0,47 0,93 2,827 0,09267 0,8856

328

16 rs12929690 81693979 11,2 0,000818 0,66 o 1 1 o 0,95 1,01 2,81 0,09366 0,9115

345

18 rs1940814 14061989 4,71 0,0299877 0,75 4,99 0,0254942 0,78 0,13 0,71 1,04 2,785 0,09515 0,8966

122

5 rs10053056 96069176 17,4 3,028E-05 0,6 1,57 0,2102071 0,89 1,6 0,21 1,11 2,784 0,09521 0,9121

12

1 rs12081567 151467611 1,99 0,1583409 0,83 3,7 0,0544125 0,81 0,000 0431 0,99 1 2,779 0,0955 0,9019

117

5 rs6449558 61121309 17,09 3,565E-05 1,74 0,01 0,9203443 1,01 0,11 0,73 0,97 2,749 0,09731 1,102

72

3 rs6805546 72168842 1,74 0,1871389 0,84 0,76 0,3833285 0,91 2,19 0,14 0,88 2,713 0,09953 0,9066

103

4 rs10516970 96529259 7,09 0,0077515 1,52 0,0000 903 0,9924181 1 1,73 0,19 1,15 2,702 0,1002 1,122

283

12 rs265603 128701943 0,06 0,8064959 1,03 1,6 0,2059033 1,13 1,31 0,25 1,1 2,617 0,1057 1,095

50

2 rs1836726 211892263 1,25 0,2635527 1,17 0,21 0,6467674 1,06 0,42 0,52 1,06 2,589 0,1076 1,108

78

3 rs4856541 84815560 5,14 0,0233807 1,35 2,32 0,1277201 1,16 0,05 0,82 0,98 2,588 0,1077 1,098

106

4 rs1634079 150007154 0,26 0,6101202 1,07 1,72 0,1896931 1,15 1,02 0,31 1,1 2,486 0,1149 1,101

272

12 rs10747874 59144947 8,6 0,0033616 0,7 0,36 0,5485062 1,06 0,66 0,42 1,07 2,473 0,1158 1,09

87

3 rs9842818 147550430 9,38 0,0021937 1,56 0,28 0,5967012 1,06 o 0,99 1 2,453 0,1173 1,108

265

12 rs7298930 39005767 0,38 0,5376032 0,93 0,04 0,8414806 1,02 1,97 0,16 0,89 2,407 0,1208 0,9184

97

4 rs7667015 42634138 o 1 1 0,84 0,3593968 0,88 2,15 0,14 0,84 2,387 0,1223 0,884

248

11 rs1792358 92040229 3,83 0,0503429 1,29 0,12 0,7290345 0,96 0,93 0,34 1,09 2,359 0,1245 1,095

341

18 rs10853282 2372165 4,59 0,032159 0,71 6,21 0,0127031 0,73 1,46 0,23 1,14 2,338 0,1263 0,8974

63

3 rs3903470 24483025 14,16 0,0001679 0,62 0,02 0,8875371 1,01 0,000 0479 0,99 1 2,33 0,1269 0,9159

Id

CR SNP Posición CHISQ Stage1 P stage1 OR stage1 CHISQ stage2 P stage2 OR Stage2 CHISQ P Stage3 stage3 OR stage3 CHISQ Conjunta p conjunta OR conjunta

331

16 rs3764333 83350762 10,32 0,001316 1,62 0,14 0,708281 1,04 0,11 0,74 0,97 2,301 0,1293 1,106

330

16 rs8051512 83338602 13,8 0,0002033 1,75 0,03 0,8624902 1,02 0,1 0,75 0,97 2,267 0,1321 1,105

5

1 rs3817269 15928951 2,94 0,0864107 0,78 3,24 0,0718606 1,26 1,27 0,26 1,12 2,222 0,1361 1,106

306

14 rs1952198 69409508 o 1 1,01 1,81 0,1785083 1,14 1,02 0,31 1,09 2,209 0,1372 1,085

264

12 rs10878307 38958256 0,21 0,6467674 0,9 1,45 0,2285281 1,21 6,54 0,01 0,66 2,205 0,1376 0,8578

234

11 rs7105372 8700795 5,89 0,0152271 0,69 0,74 0,3896609 0,91 0,66 0,42 1,09 2,199 0,1381 0,9047

163

6 rs6926642 162190971 1,2 0,2733219 1,14 0,01 0,9203443 1,01 1,34 0,25 0,91 2,194 0,1385 0,9221

332

16 rs4782497 87546780 2,9 0,0885796 1,29 2,07 0,1502216 1,21 0,02 0,9 0,99 2,18 0,1398 1,107

125

5 rs11738500 114525871 0,17 0,6801118 0,95 0,29 0,5902205 1,05 3,48 0,06 0,82 2,131 0,1443 0,914

86

3 rs12495688 147525535 10,05 0,0015235 1,58 0,45 0,502335 1,08 0,2 0,66 0,96 2,097 0,1476 1,1

200

9 rs1962293 2100744 2 0,1572993 1,24 1,03 0,3101589 0,88 5,08 0,02 1,28 2,088 0,1485 1,108

253

11 rs7121784 119664262 8,81 0,0029958 1,68 2,5 0,1138463 1,24 2,09 0,15 0,85 2,055 0,1517 1,116

7

1 rs10796886 36787398 0,18 0,6713732 1,06 4,23 0,0397154 1,23 0,06 0,81 0,98 2,054 0,1518 1,086

175

7 rs4724620 47757437 8 0,0046777 1,6 0,15 0,6985354 1,06 0,21 0,65 0,95 2,054 0,1518 1,12

338

17 rs4968656 58970691 2,79 0,0948543 0,81 1,87 0,1714751 0,87 0,58 0,45 1,07 2,039 0,1533 0,9212

64

3 rs2056777 25515395 5,62 0,0177567 1,44 7,87 0,0050262 1,43 4,36 0,04 0,8 2,015 0,1557 1,109

127

5 rs7737236 116663689 0,01 0,9203443 0,99 0,18 0,6713732 0,96 2,85 0,09 0,86 1,991 0,1582 0,9181

352

18 rs2113447 51827201 2,19 0,1389094 1,24 0,58 0,4463123 1,09 0,24 0,63 1,05 1,986 0,1588 1,095

79

3 rs1106145 87631095 7,21 0,0072498 0,7 0,52 0,4708417 0,93 0,18 0,67 1,04 1,913 0,1667 0,9218

335

17 rs281357 19683106 0,75 0,3864762 1,12 1,28 0,2578992 1,12 0,13 0,72 1,03 1,874 0,171 1,082

246

11 rs1559854 83741948 2,78 0,0954482 0,79 0,31 0,5776802 0,94 0,01 0,92 1,01 1,823 0,1769 0,9172

327

16 rs1901818 79761626 11,84 0,0005797 0,64 o 1 1 0,000 0333 1 1 1,801 0,1796 0,9227

150

6 rs9390613 149166809 9,89 0,0016618 1,61 0,57 0,4502589 1,09 0,4 0,53 0,94 1,795 0,1803 1,095

190

8 rs17740213 24430274 1,6 0,2059033 1,22 0,31 0,5776802 1,08 0,04 0,85 0,98 1,791 0,1808 1,1

347

18 rs1708694 32321976 5,68 0,0171594 0,75 0,13 0,718432 1,04 0,31 0,58 0,96 1,778 0,1824 0,9291

102

4 rs3733449 90791345 6,6 0,0101979 1,48 0,13 0,718432 1,05 0,35 0,55 0,94 1,771 0,1833 1,097

18

1 rs842796 191169038 15,01 0,0001069 1,62 0,01 0,9203443 0,99 0,2 0,66 0,96 1,767 0,1838 1,077

173

7 rs2053380 12367362 7,96 0,0047822 0,68 3,58 0,0584792 1,21 1,97 0,16 0,88 1,753 0,1854 0,9234

258

12 rs1150996 31960144 o 1 0,99 2,02 0,1552392 1,15 0,29 0,59 1,05 1,737 0,1875 1,075

221

9 rs7023309 137587676 0,18 0,6713732 1,05 0,01 0,9203443 0,99 0,96 0,33 1,08 1,692 0,1933 1,075

336

17 rs7225575 42663046 2,87 0,0902449 1,24 0,02 0,8875371 1,01 1,22 0,27 1,1 1,689 0,1938 1,078

356

19 rs12976749 43811334 0,68 0,4095867 1,13 1,09 0,2964715 0,88 3,38 0,07 1,2 1,664 0,1971 1,09

159

6 rs885782 161909893 2,06 0,1512102 0,82 0,41 0,5219695 1,07 1,42 0,23 0,9 1,643 0,1999 0,9251

84

3 rs9822040 127410451 3,78 0,0518687 1,27 0,49 0,4839273 0,94 0,77 0,38 1,08 1,636 0,2008 0,9324

36

2 rs10496075 57762864 1,52 0,2176196 1,18 0,17 0,6801118 1,04 0,46 0,5 1,06 1,627 0,2021 1,079

111

5 rs12520264 7698474 0,03 0,8624902 0,98 1,34 0,2470341 1,13 0,16 0,69 1,04 1,623 0,2027 1,08

309

14 rs7146193 88516549 10,93 0,0009462 1,5 0,07 0,7913368 1,03 0,28 0,6 0,96 1,623 0,2027 1,073

349

18 rs7227797 44377669 1,8 0,1797126 1,19 0,04 0,8414806 0,98 1,71 0,19 1,12 1,623 0,2027 1,077

375

21 rs11088449 39107267 0,06 0,8064959 1,03 1,29E-06 0,9990938 1 0,81 0,37 1,08 1,612 0,2042 1,078

164

6 rs1893098 162196867 1,33 0,2488054 1,15 0,08 0,7772974 0,97 0,92 0,34 0,92 1,602 0,2057 1,072

256

12 rs741365 5554582 1,83 0,1761276 1,21 0,17 0,6801118 1,05 0,63 0,43 1,1 1,563 0,2113 1,091

289

13 rs2026690 46381178 0,37 0,5430043 0,93 9,13 0,0025145 1,33 1 0,32 0,92 1,554 0,2125 1,071

Id

CR SNP Posición CHISQ Stage1 P stage1 OR stage1 CHISQ stage2 P stage2 OR Stage2 CHISQ P Stage3 stage3 OR stage3 CHISQ Conjunta p conjunta OR conjunta

337

17 rs11655589 58961895 3,85 0,049746 0,78 1,13 0,2877755 0,9 0,88 0,35 1,09 1,531 0,2159 0,9295

280

12 rs2992630 113757258 3,58 0,0584792 0,77 4,6 0,031972 1,27 0,94 0,33 1,1 1,523 0,2171 1,082

308

14 rs12589063 88507193 9,23 0,0023808 1,46 0,16 0,6891565 1,04 0,28 0,6 0,96 1,513 0,2187 1,071

118

5 rs2801640 65640474 0,04 0,8414806 0,98 1 0,3173108 0,91 0,22 0,64 0,96 1,511 0,2189 0,9334

77

3 rs4505714 84573028 3,11 0,077813 1,26 0,07 0,7913368 1,03 0,04 0,84 0,98 1,51 0,2192 1,078

15

1 rs2419117 166855806 0,02 0,8875371 1,02 1,51 0,2191392 1,13 0,05 0,82 1,02 1,475 0,2246 1,072

134

5 rs3763131 179666918 1,61 0,2044919 1,22 0,59 0,4424191 1,09 0,48 0,49 1,08 1,46 0,2269 1,087

85

3 rs1447665 127444361 2,77 0,0960462 1,23 0,8 0,3710934 1,09 0,38 0,54 1,05 1,443 0,2297 1,068

193

8 rs7004457 87096982 0,23 0,6315238 1,06 1,09 0,2964715 0,9 1,81 0,18 0,89 1,418 0,2337 0,9348

130

5 rs7701284 145908423 9,89 0,0016618 0,66 2,33 0,1269019 1,16 0,05 0,83 0,98 1,391 0,2382 0,9332

109

4 rs722827 174334592 9,91 0,0016438 0,58 0,02 0,8875371 0,98 0,29 0,59 1,06 1,357 0,244 0,9203

364

20 rs2235616 48002534 12,78 0,0003503 0,64 0,43 0,5119889 0,94 0,65 0,42 1,07 1,345 0,2461 0,9371

368

20 rs6014133 52734118 1,53 0,2161126 0,85 0,12 0,7290345 1,04 4,65 0,03 1,21 1,343 0,2465 1,07

252

11 rs562966 119581326 2,67 0,102256 1,34 1,56 0,2116653 1,2 0,68 0,41 0,91 1,334 0,2481 1,097

174

7 rs7801303 40884595 1,64 0,2003256 1,17 0,01 0,9203443 0,99 1,49 0,22 1,11 1,302 0,2538 1,065

169

6 rs1874404 165012190 1,64 0,2003256 1,17 0,75 0,3864762 0,92 0,67 0,41 1,07 1,297 0,2547 1,065

238

11 rs2922051 41356666 8,08 0,0044756 1,46 0,38 0,5376032 0,94 0,35 0,56 1,05 1,289 0,2562 1,07

112

5 rs37389 35120937 1,36 0,2435376 0,81 0,37 0,5430043 1,09 6,59 0,01 1,43 1,269 0,26 1,102

61

3 rs294634 14875555 1,95 0,1625869 1,21 0,05 0,8230633 0,98 2,52 0,11 1,16 1,257 0,2622 1,071

121

5 rs10078721 92446445 1,98 0,1593905 0,84 0,2 0,6547208 1,04 1,26 0,26 0,91 1,237 0,2661 0,9404

384

22 rs2337970 46405112 2,44 0,1182763 1,29 0,11 0,7401441 1,04 0,16 0,69 1,05 1,216 0,2701 1,087

380

22 rs910545 26276986 9,87 0,00168 0,65 0,09 0,7641772 0,97 0,34 0,56 1,05 1,211 0,2711 0,9374

344

18 rs11081496 9716631 11,09 0,0008679 1,57 0,46 0,497624 0,93 0,2 0,65 0,96 1,199 0,2735 1,07

353

18 rs8083791 63596654 3,81 0,0509475 1,31 0,09 0,7641772 0,96 0,01 0,91 0,99 1,197 0,2739 1,072

355

19 rs8109493 14464932 0,46 0,497624 0,9 0,48 0,4884223 0,92 0,43 0,51 0,94 1,182 0,277 0,9282

232

10 rs1931704 129229799 10,57 0,0011494 1,58 0,31 0,5776802 0,94 0,29 0,59 1,05 1,138 0,286 1,066

113

5 rs4865845 53913691 2,99 0,0837802 1,28 1,15 0,2835494 1,12 0,12 0,73 0,97 1,137 0,2863 1,07

220

9 rs886016 135545450 0,01 0,9203443 0,99 1 1,61 0,2 0,9 1,129 0,288 0,9288

230

10 rs1537685 116894953 2,44 0,1182763 1,23 0,07 0,7913368 0,97 0,49 0,49 1,07 1,123 0,2893 1,067

185

8 rs10046663 2983419 5,05E-08 0,9998207 1 0,01 0,9203443 0,99 0,63 0,43 0,94 1,105 0,2931 1,059

293

13 rs878472 81069137 0,63 0,4273553 0,91 0,19 0,6629166 0,96 2,08 0,15 0,89 1,099 0,2945 1,059

88

3 rs10935844 152611585 0,53 0,4666069 1,09 3,76 0,0524926 1,2 0,7 0,4 1,07 1,066 0,3019 1,058

54

2 rs11694263 237855128 9,14 0,0025008 0,63 0,2 0,6547208 1,06 0,24 0,63 0,95 1,012 0,3144 0,9315

382

22 rs4821359 33802273 0,01 0,9203443 1,02 0,11 0,7401441 1,03 1,04 0,31 0,92 1,01 0,315 1,057

273

12 rs7131721 59202879 0,87 0,3509553 0,89 0,8 0,3710934 0,92 0,78 0,38 1,08 0,9885 0,3201 0,9462

206

9 rs1934115 23093266 3,1 0,0782923 1,29 0,29 0,5902205 0,94 1,11 0,29 1,12 0,983 0,3215 1,07

170

6 rs11753244 165013078 0,45 0,502335 1,09 0,59 0,4424191 0,93 0,83 0,36 1,08 0,9716 0,3243 1,056

20

1 rs7515996 192591449 3,22 0,0727436 1,38 3,44 0,0636357 1,28 1,63 0,2 0,86 0,9608 0,327 1,081

2

1 rs729829 9081584 0,37 0,5430043 1,08 0,03 0,8624902 0,98 0,88 0,35 0,92 0,955 0,3284 0,9455

205

9 rs12353255 20911332 0,56 0,4542602 1,11 0,05 0,8230633 0,98 0,89 0,34 1,09 0,9425 0,3316 1,06

270

12 rs285550 40244561 7,09 0,0077515 1,46 o 1 1 0,06 0,81 0,98 0,9109 0,3399 1,062

182

7 rs1888349 138314672 1,86 0,1726249 1,23 0,62 0,4310473 1,1 0,01 0,94 0,99 0,9089 0,3404 1,071

Id

CR SNP Posición CHISQ Stage1 P stage1 OR stage1 CHISQ stage2 P stage2 OR Stage2 CHISQ P Stage3 stage3 OR stage3 CHISQ Conjunta p conjunta OR conjunta

19

1 rs7554157 191755792 17,69 2,6E-05 0,59 0,2 0,6547208 0,96 3,4 0,07 1,17 0,897 0,3436 0,9477

25

1 rs4339871 217499653 6,42 0,0112842 0,72 0,28 0,5967012 1,06 0,06 0,81 0,98 0,8846 0,3469 0,9458

329

16 rs3764286 83298844 7,06 0,0078824 0,66 1,4 0,2367237 1,13 0,49 0,48 0,94 0,8683 0,3514 0,9436

104

4 rs10857057 119182533 6,39 0,0114765 1,45 0,25 0,6170751 0,95 0,07 0,79 1,03 0,8652 0,3523 1,062

115

5 rs286007 55739933 8,54 0,0034743 1,48 2,4 0,1213353 1,17 2,33 0,13 0,87 0,8539 0,3555 1,056

259

12 rs3898966 33972394 2,01 0,1562654 1,25 1,13 0,2877755 1,13 0,01 0,91 0,99 0,8334 0,3613 1,064

339

17 rs936056 71099379 0,77 0,3802171 1,12 3,65 0,0560692 1,21 0,18 0,67 0,96 0,8217 0,3647 1,053

254

11 rs1532763 121010533 1,33 0,2488054 1,15 o 1 1,01 0,11 0,74 1,03 0,8087 0,3685 1,051

381

22 rs5755467 33695091 2,29 0,13021 0,81 0,07 0,7913368 1,03 0,09 0,77 0,97 0,8082 0,3687 0,9466

165

6 rs9456734 162394883 1,85 0,1737835 1,24 3,62 0,0570889 0,78 0,41 0,52 0,93 0,8031 0,3702 0,9362

196

8 rs952656 124196776 2,02 0,1552392 0,83 0,24 0,6242061 1,06 1,78 0,18 1,13 0,7806 0,377 1,055

154

6 rs1979541 159025401 0,39 0,5322994 0,89 0,02 0,8875371 1,02 0,05 0,82 0,97 0,7781 0,3777 0,9317

107

4 rs6821156 154491352 2,33 0,1269019 1,21 0,6 0,438578 1,08 0,03 0,87 0,99 0,7771 0,378 1,05

69

3 rs4072198 62187107 0,84 0,3593968 0,89 0,35 0,5541131 1,06 0,99 0,32 0,92 0,7654 0,3816 0,952

172

7 rs2285914 10714209 0,01 0,9203443 1,01 0,15 0,6985354 0,96 1,62 0,2 1,11 0,7524 0,3857 1,049

157

6 rs4709517 161759771 0,38 0,5376032 1,08 0,22 0,6390399 0,96 0,727 0,3939 0,9377

251

11 rs2368940 119575980 3,44 0,0636357 0,77 1,28 0,2578992 1,13 0,4 0,53 0,94 0,7195 0,3963 0,9482

93

3 rs1385331 197835612 0,06 0,8064959 1,03 1,85 0,1737835 0,88 0,01 0,94 1,01 0,692 0,4055 0,9554

28

1 rs4658673 243108935 3,28 0,0701289 0,76 0,34 0,5598292 0,93 o 0,96 1,01 0,6722 0,4123 0,9448

89

3 rs485499 161228557 0,31 0,5776802 1,07 0,01 0,9203443 0,99 0,000 065 0,99 1 0,6692 0,4133 1,047

68

3 rs3827494 46577235 3,35 0,067205 0,79 1,8 0,1797126 1,16 0,08 0,78 1,03 0,6581 0,4172 1,05

235

11 rs2129530 11354861 2,31 0,1285441 1,23 0,47 0,4929872 1,08 0,06 0,81 0,98 0,6457 0,4217 1,052

13

1 rs10465957 155632002 5,97 0,0145513 1,51 0,41 0,5219695 0,87 0,35 0,56 1,07 0,6366 0,425 1,064

279

12 rs2063239 81798372 0,03 0,8624902 1,02 0,02 0,8875371 1,01 4,34 0,04 1,22 0,6353 0,4254 1,047

242

11 rs11235935 69856226 0,13 0,718432 1,05 1 0,42 0,52 1,06 0,6069 0,4359 1,057

22

1 rs6427916 199907444 0,72 0,3961439 1,11 2,11 0,1463394 1,16 0,06 0,81 0,98 0,6054 0,4365 1,045

322

16 rs4889197 71952116 0,54 0,4624327 0,91 0,1 0,7518296 1,03 4,43 0,04 1,19 0,5928 0,4414 0,9585

204

9 rs10511680 20277623 0,49 0,4839273 1,1 0,01 0,9203443 0,99 3,14 0,08 1,17 0,5771 0,4474 1,046

184

7 rs1861960 154977896 2,46 0,1167788 0,79 2,29 0,13021 1,21 0,69 0,41 1,09 0,5674 0,4513 1,055

124

5 rs3891371 113862562 1,73 0,188411 0,84 0,85 0,3565523 1,1 0,72 0,4 0,92 0,559 0,4547 0,9549

298

13 rs2220971 96826076 1,72 0,1896931 0,84 1,37 0,241812 1,13 1,03 0,31 1,1 0,5583 0,455 1,046

148

6 rs2745443 133063075 1,96 0,1615134 0,83 0,67 0,4130516 0,92 0,3 0,58 1,05 0,5489 0,4588 0,9578

162

6 rs2022991 162168159 5,92 0,01497 0,73 0,14 0,708281 1,04 0,04 0,84 1,02 0,5388 0,4629 0,9579

140

6 rs1003167 43963001 0,09 0,7641772 0,96 6,51 0,010727 0,78 0,16 0,69 0,97 0,5353 0,4644 1,041

178

7 rs10244108 55119831 0,05 0,8230633 0,97 1 0,36 0,55 0,95 0,5179 0,4718 0,9502

108

4 rs4691340 157569429 7,7 0,0055221 0,61 1,91 0,1669633 1,21 0,31 0,58 0,94 0,5151 0,4729 0,9445

42

2 rs11893869 106032330 1,53 0,2161126 1,24 0,32 0,5716076 0,93 1,21 0,27 0,88 0,5132 0,4738 0,9464

30

2 rs1667059 2925338 4,43 0,0353125 0,76 1,01 0,3149031 1,1 0,34 0,56 0,95 0,5127 0,474 0,9603

83

3 rs4350947 123227539 5,85 0,0155771 0,7 0,8 0,3710934 1,1 2,06 0,15 1,14 0,5026 0,4784 1,045

191

8 rs7830101 39527585 0,92 0,337475 1,14 3,5 0,0613688 1,21 1,08 0,3 0,91 0,4999 0,4795 1,042

241

11 rs882169 61448706 o 1 1,01 0,26 0,6101202 1,05 0,37 0,54 1,05 0,4922 0,4829 1,04

377

21 rs9978582 46312815 0,01 0,9203443 1,02 0,35 0,5541131 0,94 0,65 0,42 0,94 0,4899 0,484 0,9621

Id

CR SNP Posición CHISQ Stagel P stagel OR stagel CHISQ stage2 P stage2 OR Stage2 CHISQ P Stage3 stage3 OR stage3 CHISQ Conjunta p conjunta OR conjunta

3

1 rs12119878 9141308 2 0,1572993 0,83 0,12 0,7290345 0,96 0,03 0,87 1,01 0,4794 0,4887 0,9597

366

20 rs6021668 50110836 1,86 0,1726249 1,28 2,46 0,1167788 1,22 0,69 0,41 0,91 0,4787 0,489 1,054

311

14 rs3752958 99252440 3,41 0,0648025 1,4 0,18 0,6713732 0,94 0,33 0,57 1,08 0,4745 0,4909 1,058

278

12 rs1527101 77063452 1,31 0,2523948 0,87 0,09 0,7641772 1,03 0,65 0,42 0,93 0,4714 0,4923 0,9619

342

18 rs1675247 3608506 3,37 0,0663938 1,25 0,31 0,5776802 0,95 2,35 0,13 0,88 0,4708 0,4926 0,9628

82

3 rs2953676 115765942 5,36 0,0206038 1,34 1,77 0,1833821 0,87 o 0,99 1 0,4685 0,4937 1,04

276

12 rs7970928 69902492 1,49 0,2222166 1,16 0,01 0,9203443 0,99 0,18 0,67 1,04 0,4616 0,4969 1,038

153

6 rs4583999 156527609 0,06 0,8064959 0,97 2,69 0,1009798 1,22 6,39 0,01 0,77 0,46 0,4976 0,9554

316

15 rs1267658 81011209 3,92 0,0477149 0,78 2,06 0,1512102 1,15 0,19 0,66 0,96 0,447 0,5038 0,9629

323

16 rs1366545 76022537 0,33 0,5656591 0,93 0,12 0,7290345 1,03 0,75 0,39 0,91 0,4461 0,5042 1,042

152

6 rs7747934 156521972 0,27 0,6033318 0,93 2,26 0,1327541 1,19 5,01 0,03 0,8 0,4375 0,5083 0,9571

296

13 rs2057525 92755817 7,44 0,006379 1,49 0,01 0,9203443 1,01 0,29 0,59 0,95 0,435 0,5095 1,045

151

6 rs588036 150740367 0,02 0,8875371 0,98 0,05 0,8230633 0,98 0,86 0,35 1,08 0,4324 0,5108 1,037

1

1

rs1725265 7480780 0,3 0,5838824 0,94 0,3 0,5838824 0,95 1,06 0,3 0,92 0,4281 0,5129 0,9647

73

3 rs9855978 80171732 2,88 0,089686 1,3 0,01 0,9203443 1,01 0,03 0,86 0,98 0,4276 0,5132 1,046

295

13 rs4142602 92733503 7,4 0,0065224 1,49 0,13 0,718432 1,04 0,68 0,41 0,92 0,3938 0,5303 1,042

343

18 rs617206 6975631 1,63 0,2017031 1,17 0,01 0,9203443 1,01 4,68 0,03 0,83 0,392 0,5312 0,9656

383

22 rs733182 41984895 9,83 0,0017169 0,6 0,53 0,4666069 1,09 1,58 0,21 1,15 0,391 0,5318 0,9564

255

12 rs114305 5118252 1,22 0,2693608 0,86 1,26 0,2616513 1,12 0,9 0,34 1,09 0,3821 0,5365 1,038

373

21 rs2834684 35234217 0,53 0,4666069 1,1 0,01 0,9203443 0,99 o 0,94 1,01 0,3781 0,5386 1,036

277

12 rs2242383 75962738 0,02 0,8875371 0,98 0,87 0,3509553 1,09 0,02 0,88 1,01 0,3711 0,5424 1,035

320

16 rs9788864 22921056 0,02 0,8875371 0,98 1,32 0,2505922 1,12 0,28 0,6 0,96 0,3711 0,5424 1,035

291

13 rs2761843 50191038 8,87 0,002899 1,62 0,07 0,7913368 0,97 0,73 0,39 0,91 0,3553 0,5511 1,045

286

13 rs207620 32011403 1,15 0,2835494 1,17 0,16 0,6891565 0,96 1,53 0,22 1,13 0,3535 0,5521 1,038

126

5 rs256996 114943989 1,79 0,1809263 1,18 4,79 0,0286254 1,23 0,03 0,86 0,99 0,3503 0,5539 1,033

67

3 rs4432612 43675296 1,95 0,1625869 0,79 0,42 0,516937 1,09 0,46 0,5 0,93 0,3493 0,5545 0,9579

211

9 rs4407980 36942743 12,71 0,0003637 1,66 0,57 0,4502589 0,92 0,01 0,93 0,99 0,3375 0,5613 1,037

371

21 rs376691 19278409 3,97 0,0463178 1,29 0,01 0,9203443 0,99 3,79 0,05 0,85 0,3332 0,5638 0,9681

317

15 rs10153012 92684286 1,61 0,2044919 0,83 4,19 0,0406631 1,26 0,39 0,53 1,07 0,3267 0,5676 1,04

66

3 rs4438696 31900672 4,9 0,0268567 0,75 0,69 0,4061644 0,92 1,99 0,16 1,13 0,3142 0,5751 0,9679

365

20 rs6021658 50105671 1,5 0,2206715 1,26 2,56 0,1095986 1,23 0,84 0,36 0,9 0,3132 0,5757 1,045

144

6 rs6907551 114199657 0,85 0,3565523 0,89 0,05 0,8230633 1,02 0,77 0,38 1,08 0,3109 0,5771 1,031

222

10 rs7897163 18454226 3,38 0,0659921 1,32 0,86 0,3537387 0,9 1,36 0,24 0,89 0,3085 0,5786 0,963

27

1 rs7539016 231556122 0,57 0,4502589 0,91 1,5 0,2206715 1,13 0,06 0,81 1,02 0,3033 0,5818 1,031

216

9 rs1060545 116861439 0,73 0,3928832 0,9 1,29 0,2560481 1,11 2,01 0,16 0,89 0,2928 0,5885 0,9708

171

6 rs10945364 169193728 0,64 0,4237108 1,11 0,4 0,5270893 1,07 0,51 0,48 0,94 0,2863 0,5926 1,031

208

9 rs4495512 29908652 1,25 0,2635527 0,87 0,5 0,4795001 1,07 0,67 0,41 0,93 0,2757 0,5995 0,9699

71

3 rs10511001 70715884 3,8 0,0512526 1,35 1,51 0,2191392 0,87 0,11 0,74 0,97 0,2755 0,5997 0,9656

147

6 rs2749928 131900472 0,13 0,718432 1,05 2,41 0,1205624 0,86 0,08 0,78 1,02 0,2684 0,6044 0,9707

51

2 rs1035316 224848397 8,98 0,0027295 0,66 0,04 0,8414806 1,02 0,82 0,37 1,09 0,267 0,6054 0,9667

243

11 rs670310 69889222 0,03 0,8624902 1,02 0,83 0,3622725 1,09 0,37 0,54 1,05 0,2665 0,6057 1,03

48

2 rs3731714 201769065 6,14 0,0132157 0,72 0,03 0,8624902 1,02 0,14 0,71 1,03 0,2653 0,6065 0,9695

Id

CR SNP Posición CHISQ Stage1 P stage1 OR stage1 CHISQ stage2 P stage2 OR Stage2 CHISQ P Stage3 stage3 OR stage3 CHISQ Conjunta p conjunta OR conjunta

123

5 rs6859143 103418563 5,88 0,0153138 1,38 o 1 1 0,64 0,42 0,93 0,2622 0,6086 1,031

24

1 rs6656554 213954552 o 1 1,01 4,06 0,0439105 0,82 0,45 0,5 1,06 0,2527 0,6152 0,9717

223

10 rs332185 28953315 9,59 0,0019564 0,64 1,23 0,2674072 1,13 0,15 0,69 1,04 0,2522 0,6155 0,9688

210

9 rs7036414 35953556 1,51 0,2191392 1,18 0,21 0,6467674 1,05 0,24 0,62 0,96 0,2473 0,619 1,03

119

5 rs2545391 66434867 1,01 0,3149031 1,15 0,08 0,7772974 1,03 0,12 0,73 1,04 0,2429 0,6221 1,034

213

9 rs1329580 81776189 4,95 0,0260907 0,74 0,94 0,3322779 1,1 0,24 0,63 1,05 0,2404 0,6239 0,9708

179

7 rs798332 77746864 6,9 0,0086196 0,72 1,09 0,2964715 1,11 0,04 0,84 1,02 0,234 0,6286 0,9726

285

13 rs3848079 31324730 o 1 0,99 0,39 0,5322994 1,08 0,68 0,41 0,92 0,2323 0,6298 0,966

302

14 rs178214 26015206 2,66 0,1029008 1,26 0,87 0,3509553 1,1 0,05 0,83 0,98 0,2316 0,6304 1,03

215

9 rs3128501 89518960 0,67 0,4130516 0,9 1,36 0,2435376 1,12 0,14 0,7 1,03 0,2314 0,6305 1,027

186

8 rs10096279 3212285 5,69 0,0170619 0,71 2,64 0,1042036 1,21 0,65 0,42 1,08 0,2288 0,6324 1,032

236

11 rs763373 12796918 0,01 0,9203443 1,01 0,9 0,3427817 0,91 0,94 0,33 1,09 0,2257 0,6347 1,027

70

3 rs11927332 70689611 5,03 0,0249119 1,42 2,47 0,116038 0,84 0,01 0,93 0,99 0,2237 0,6362 0,9688

379

22 rs5760103 22578781 1,39 0,2384053 1,18 1,94 0,1636686 0,85 0,02 0,9 1,01 0,2173 0,6411 0,9687

250

11 rs12575639 109869510 6,31 0,0120059 0,68 2,89 0,0891309 1,24 0,39 0,53 0,94 0,2121 0,6451 0,9674

65

3 rs6780332 29193263 4,84 0,0278069 1,32 1,3 0,2542134 0,89 0,3 0,58 0,95 0,2092 0,6474 1,026

181

7 rs1156143 136740077 9,91 0,0016438 1,51 0,28 0,5967012 1,06 3,33 0,07 0,85 0,1784 0,6728 1,025

137

6 rs2439553 13433258 3,94 0,0471508 1,29 0,26 0,6101202 0,95 1,7 0,19 0,89 0,1484 0,7 0,9779

292

13 rs7318830 81035524 1,2 0,2733219 0,87 0,03 0,8624902 1,02 0,02 0,9 1,01 0,1455 0,7029 1,021

333

17 rs2070862 1595044 1,5 0,2206715 0,83 0,2 0,6547208 0,95 0,92 0,34 1,1 0,1391 0,7092 0,9748

149

6 rs9322114 148333734 1,81 0,1785083 0,81 6,08 0,0136721 1,33 0,32 0,57 0,94 0,1293 0,7192 1,025

207

9 rs10121215 26159347 7,95 0,0048087 0,67 1,72 0,1896931 1,15 0,41 0,52 1,06 0,1271 0,7214 0,9779

55

2 rs4663726 237925851 0,3 0,5838824 1,07 1 0,71 0,4 1,15 0,1261 0,7225 1,036

372

21 rs1573465 34871068 0,6 0,438578 0,9 0,22 0,6390399 1,05 0,01 0,93 1,01 0,1196 0,7295 1,021

136

6 rs4285366 8839136 3,22 0,0727436 1,3 0,09 0,7641772 0,97 0,21 0,65 0,96 0,1184 0,7308 1,023

305

14 rs1953866 51387587 1,4 0,2367237 1,2 1,61 0,2044919 1,17 2,01 0,16 0,86 0,1177 0,7315 1,024

247

11 rs3740808 89531857 14,41 0,000147 0,62 0,34 0,5598292 1,06 1,41 0,24 1,11 0,1117 0,7382 0,9809

62

3 rs1499005 20895844 1,03 0,3101589 1,18 1,16 0,2814658 1,15 5,44 0,02 0,78 0,1083 0,7421 0,9758

374

21 rs2836392 38727745 9,51 0,0020436 0,65 0,02 0,8875371 0,99 3,92 0,05 1,21 0,1081 0,7423 0,9796

94

4 rs10155062 7184806 5,12 0,0236516 1,35 o 1 1,01 1,41 0,23 0,9 0,104 0,7471 1,019

303

14 rs2333660 29464817 0,3 0,5838824 1,07 0,14 0,708281 0,96 0,53 0,47 0,94 0,1037 0,7475 0,9821

141

6 rs9382517 55586555 o 1 1,01 0,14 0,708281 1,04 0,19 0,66 0,96 0,1003 0,7515 1,018

299

14 rs4982704 22433377 0,36 0,5485062 1,08 1 0,67 0,41 0,93 0,09692 0,7556 0,9789

249

11 rs7930843 109456617 12,99 0,0003132 0,57 2,63 0,1048617 1,19 3,33 0,07 1,2 0,09499 0,7579 1,02

325

16 rs2288034 77803457 8 0,0046777 0,69 1,18 0,2773562 0,9 0,38 0,54 0,95 0,09016 0,764 0,9836

23

1 rs11119097 206813021 3,38 0,0659921 1,28 0,08 0,7772974 0,97 1,28 0,26 0,9 0,08645 0,7687 1,018

168

6 rs12525605 163628328 0,52 0,4708417 0,9 0,11 0,7401441 1,04 0,11 0,74 1,03 0,08233 0,7742 1,02

176

7 rs4917076 49678523 5,49 0,0191255 1,34 2,69 0,1009798 0,85 0,03 0,87 1,01 0,08012 0,7771 0,9843

219

9 rs886090 135189324 7,62 0,0057724 0,7 0,75 0,3864762 1,1 o 0,95 0,99 0,07671 0,7818 0,9839

58

3 rs2241780 14495168 7,43 0,0064145 1,53 1,68 0,1949246 0,86 0,99 0,32 0,91 0,07616 0,7826 0,9817

209

9 rs2233568 35947355 2,45 0,1175249 1,23 0,0000 999 0,9920253 1 0,45 0,5 0,94 0,07214 0,7883 1,016

187

8 rs2163307 4293028 2,58 0,1082217 1,33 0,51 0,4751389 0,91 0,05 0,83 0,97 0,07023 0,791 0,9799

Id

CR SNP Posición CHISQ Stage1 P stage1 OR stage1 CHISQ stage2 P stage2 OR Stage2 CHISQ P Stage3 stage3 OR stage3 CHISQ Conjunta p conjunta OR conjunta

229

10 rs11196543 115684622 3,05 0,0807372 0,78 0,53 0,4666069 1,09 o 0,99 1 0,06629 0,7968 0,9835

189

8 rs7842021 23135149 11,2 0,000818 0,66 0,75 0,3864762 0,92 1,81 0,18 0,9 0,06577 0,7976 1,014

367

20 rs6021688 50126404 4,58 0,0323472 1,44 1 0,3173108 1,13 1,78 0,18 0,86 0,06478 0,7991 1,019

218

9 rs7027515 126213030 0,62 0,4310473 1,1 0,02 0,8875371 1,01 0,73 0,39 0,93 0,06425 0,7999 1,014

155

6 rs6942109 161706684 0,63 0,4273553 0,91 2,63 0,1048617 0,85 2,61 0,11 1,15 0,06337 0,8012 0,986

360

19 rs7254214 47060578 0,01 0,9203443 1,02 o 1 1,01 0,23 0,63 0,96 0,05882 0,8084 0,9868

10

1 rs12144940 99705926 1,67 0,1962586 0,83 0,59 0,4424191 1,08 0,53 0,47 1,07 0,0584 0,809 1,015

59

3 rs9036 14505725 3,83 0,0503429 0,74 0,89 0,3454773 1,12 0,77 0,38 1,09 0,05752 0,8105 1,016

297

13 rs7999382 96739498 4,11 0,0426304 0,77 1,08 0,2986978 1,11 1,25 0,26 1,1 0,05751 0,8105 1,014

158

6 rs6906519 161811378 1,84 0,174951 1,25 0,01 0,9203443 1,02 1,31 0,25 0,88 0,05635 0,8124 1,018

114

5 rs324454 55238308 3,6 0,0577796 1,26 1,51 0,2191392 0,89 0,09 0,76 1,03 0,05612 0,8127 0,9871

240

11 rs10750861 56937983 1,62 0,2030919 0,85 4,68 0,0305158 1,24 0,83 0,36 0,93 0,05574 0,8134 1,014

284

13 rs2862909 23999167 0,45 0,502335 0,91 0,15 0,6985354 1,04 0,54 0,46 1,06 0,04872 0,8253 1,012

194

8 rs10094702 89403625 7,27 0,0070116 0,67 3,41 0,0648025 1,26 0,62 0,43 0,93 0,04256 0,8366 0,986

275

12 rs2470378 69512747 15,02 0,0001064 0,56 5,38 0,0203689 1,28 2,35 0,13 1,17 0,03948 0,8425 1,013

227

10 rs6583661 82553590 1,63 0,2017031 0,84 1,91 0,1669633 0,87 3,04 0,08 1,17 0,0389 0,8436 0,9882

183

7 rs2253729 139589358 3,24 0,0718606 1,27 2,88 0,089686 0,84 1,19 0,28 1,1 0,03784 0,8458 1,011

290

13 rs9568036 47869937 3,47 0,0624913 0,79 2,14 0,1435019 0,85 6,68 0,01 1,24 0,03471 0,8522 1,011

321

16 rs8049155 52912715 0,37 0,5430043 1,08 0,01 0,9203443 1,01 0,06 0,8 1,02 0,03458 0,8525 1,01

14

1 rs10797007 156562253 10,38 0,0012739 0,67 o 1 1 3,49 0,06 1,17 0,03376 0,8542 0,9896

192

8 rs7465573 61311677 2,03 0,1542207 0,77 0,38 0,5376032 1,1 0,12 0,73 1,04 0,02926 0,8642 1,014

370

20 rs911064 61370750 1,79 0,1809263 1,22 0,02 0,8875371 0,99 0,35 0,55 0,95 0,02896 0,8649 1,011

348

18 rs1365461 34356804 0,06 0,8064959 0,97 0,04 0,8414806 1,02 0,64 0,43 0,94 0,02801 0,8671 0,9908

21

1 rs2648774 197382785 1,96 0,1615134 0,84 3,08 0,0792605 1,18 0,08 0,78 0,98 0,02694 0,8696 1,009

110

4 rs4861960 182609327 1,28 0,2578992 1,24 0,05 0,8230633 0,97 0,09 0,76 0,96 0,02516 0,874 1,013

139

6 rs3094694 30559883 1,07 0,3009457 0,84 0,15 0,6985354 0,95 0,23 0,63 1,05 0,02302 0,8794 0,9887

11

1 rs724479 102047645 3,54 0,0599055 1,38 0,08 0,7772974 0,97 0,01 0,92 0,99 0,02279 0,88 1,011

233

11 rs7924316 2130023 17,44 2,965E-05 1,68 2,2 0,1380108 1,15 1,08 0,3 0,92 0,02193 0,8823 0,9919

359

19 rs6508999 47014387 0,12 0,7290345 0,96 0,15 0,6985354 1,04 o 0,96 1 0,01776 0,894 1,008

199

9 rs7020507 1705820 3,22 0,0727436 1,38 1,56 0,2116653 0,83 0,3 0,58 0,94 0,01698 0,8963 0,9894

145

6 rs3777981 117841948 5,64 0,0175552 1,34 0,58 0,4463123 0,93 1,33 0,25 0,91 0,01682 0,8968 0,9929

6

1 rs2077066 23650949 0,1 0,7518296 1,04 o 1 1 0,1 0,75 0,97 0,01622 0,8987 0,9926

376

21 rs6518223 45538977 0,72 0,3961439 1,11 0,1 0,7518296 0,97 0,04 0,83 0,98 0,01557 0,9007 1,007

274

12 rs1022242 69492622 12,99 0,0003132 0,58 3,91 0,0479996 1,24 1,4 0,24 1,13 0,01522 0,9018 0,9919

212

9 rs1329579 81749779 3,95 0,0468714 0,77 0,96 0,3271869 1,1 1,08 0,3 1,1 0,01379 0,9065 1,007

41

2 rs938372 88780884 2,7 0,1003483 1,25 0,21 0,6467674 0,95 0,84 0,36 0,92 0,01358 0,9072 1,007

81

3 rs2399095 107605293 1,09 0,2964715 0,88 0,72 0,3961439 0,92 0,24 0,62 0,96 0,01357 0,9073 1,006

116

5 rs286002 55742226 8,12 0,004378 1,51 o 1 1,01 1,64 0,2 0,89 0,01229 0,9117 1,007

101

4 rs2869872 77410136 7,98 0,0047297 1,51 5,45 0,0195683 0,77 0,29 0,59 1,06 0,01153 0,9145 1,007

56

3 rs7649851 6255410 1,05 0,3055074 0,84 0,05 0,8230633 1,03 0,37 0,54 1,07 0,01105 0,9163 1,008

180

7 rs12672177 101813787 1,83 0,1761276 0,81 2,93 0,0869475 1,22 0,93 0,34 0,91 0,007073 0,933 0,9943

358

19 rs7251154 46997781 0,02 0,8875371 0,98 0,06 0,8064959 1,03 0,03 0,86 0,99 0,004482 0,9466 1,004

Id

CR SNP Posición CHISQ Stage1 P stage1 OR stage1 CHISQ stage2 P stage2 OR Stage2 CHISQ P Stage3 stage3 OR stage3 CHISQ Conjunta p conjunta OR conjunta

288

13 rs7989372 40819933 8,6 0,0033616 1,52 1,54 0,2146179 0,88 0,07 0,8 0,98 0,004017 0,9495 1,004

307

14 rs8006322 78724765 0,07 0,7913368 0,97 1,9 0,1680784 1,14 0,29 0,59 0,95 0,003719 0,9514 1,003

300

14 rs222717 23161964 2,77 0,0960462 1,3 0,09 0,7641772 0,96 0,62 0,43 0,92 0,002646 0,959 1,004

31

2 rs4666167 29208807 2,42 0,119795 1,25 o 1 1,01 o 0,99 1 0,001534 0,9688 1,003

201

9 rs635647 3252803 1,2 0,2733219 1,14 0,13 0,718432 0,97 0,01 0,94 0,99 0,001437 0,9698 1,002

33

2 rs7560961 35803292 4,55 0,0329188 0,67 2,53 0,1117002 1,24 0,14 0,71 0,96 0,001387 0,9703 0,9971

244

11 rs1511241 78746402 2,53 0,1117002 0,82 0,4 0,5270893 0,94 0,22 0,64 1,04 0,001248 0,9718 1,002

53

2 rs3935670 235076947 0,93 0,3348629 0,88 0,73 0,3928832 1,1 0,01 0,93 0,99 0,000855 1 0,9767 1,002

357

19 rs1008577 46879134 2,77 0,0960462 0,82 1,09 0,2964715 1,11 0,07 0,79 0,98 0,000707 0,9788 1,001

156

6 rs11964284 161732616 0,24 0,6242061 0,92 0,15 0,6985354 0,96 1,43 0,23 1,14 0,000118 6 0,9913 0,9992

228

10 rs4917690 97224981 0,72 0,3961439 1,11 0,02 0,8875371 1,02 0,02 0,88 0,99 0,000115 4 0,9914 0,9994

160

6 rs3016563 162112846 1,33 0,2488054 1,15 0,04 0,8414806 0,98 0,16 0,69 0,97 5,424E-05 0,9941 0,9996

Tabla 5. Marcadores SNPs seleccionados por HFCC y validados

analizando dos series independientes adicionales de casos y

controles.

SNP

Cromosoma Gen

rs577562

1 INSLS

rs4490160

2 BU172790

rs1364658

2 ACVR2A

rs12987286

2 ACVR2A

rs353111

2 SCN2A

rs6805546

3 AK097190

rs7650598

3 TNIK

rs218280

4 desert

rs869026

5 Slll

rs1549355

6 NKAIN2

rs11175655

12 LRRK2

rs1907632

12 LRRK2

rs2723264

12 LRRK2

rs11564203

12 LRRK2

rs11829088

12 LRRK2

rs11564173

12 LRRK2

rs2332631

14 CD688177

rs1039189

18 desert

rs3936139

19 GNG7

rs761267

20 AK096842/TOX2

Ejemplo 4. Construcción de un Panel Predictivo con los marcadores seleccionados con HFCC

Una manera diferente de demostrar la capacidad diagnóstica de los marcadores que selecciona HFCC, es la elaboración de un panel predictivo y la realización con dicho panel de un análisis discriminante, junto el cálculo de sensibilidad y especificidad de dicho panel, mediante la determinación del área bajo la curva que el predictor determina. Aunque resultaría tentador realizar el análisis discriminante usando los 384 SNPs seleccionados por HFCC simultáneamente, ésto no se llevó a cabo. Los motivos son la alta probabilidad de sobreajuste que tienen los análisis discriminantes si introducimos tantas variables, el ruido estadístico que sabemos acarrea el uso de la tecnología multivariante (como demuestra el ejemplo 1) y la existencia de heterogeneidad no alélica que es una característica muy común en las enfermedades complejas. Por todo ello, se decidió adoptar una estrategia más conservadora y seleccionar, para el análisis discriminante, sólo aquellos marcadores que mostraran asociación de algún modo a la patología (PD) . Así, para la construcción del panel empleamos una combinación de SNPs que habíamos asociado al quot;statusquot; de casos (estos son los marcadores presentes en la tabla 5) a los que añadimos, además, un pequeño subconjunto de marcadores que presentaban indicios estadísticamente significativos de asociación con la edad de comienzo de la enfermedad (AAO, age-at-onset) (tabla 6) Los marcadores asociados a AAO son también interesantes pues si bien no están directamente asociados a PD, pueden modificar el curso de la patología acelerando o decelerando el proceso neurodegenerativo y, en consecuencia, afectar al pronóstico de la enfermedad. La tabla 6 es fruto de esta segunda selección de marcadores y aporta un total de 21 SNPs del

panel de HFCC que se asocian significativamente (plt;0,05) a la edad de aparición de PD (AAO). Este cálculo se realizó con plink (PLINK: a tool set for whole-genome association and population-based linkage analyses. Purcell S, Neale B, Todd-

5 Brown K, Thomas L, Ferreira MA, Bender D, Maller J, Sklar P, de Bakker PI, Daly MJ, Sham PC.Am J Hum Genet. 2007 Sep;81 (3) :559-75) empleando la regresión lineal (--linear) ajustando el efecto por sexo y por la serie a la que pertenece el paciente.

10 Tabla 6. Combinación de SNPs asociados a la enfermedad con SNPs asociados a la edad de aparición de ésta. SNP: polimorfismo de un único nucleótido. CHR: cromosoma. BP: pares de bases. Al: alelo l. NMISS: número de individuos

15 disponibles para el studio. BETA: coeficiente Beta de regresión lineal. Stat: valor estadístico de la regresión lineal. P: valor de significación.

SNP

CHR BP Al TEST NMISS BETA STAT p Gen

rs2986574

1 182173237 A ADD 1305 -1,234 -1,964 0,0497 GLT25D2

rs11119097

1 206813021 G ADD 1303 1,335 2,281 0,0227 desert

rs4658673

1 243108935 A ADD 1301 1,348 2,232 0,0258 HNRNPU

rs10496075

2 57762864 e ADD 1306 1,463 2,718 0,0066 BG924755

rs847126

2 176645080 e ADD 1286 -1,262 -2,084 0,0374 EVX2

rs9036

3 14505725 e ADD 1309 -1,642 -2,742 0,0062 SLe6A6

rs4505714

3 84573028 G ADD 1285 1,105 1,984 0,0475 desert

rs10155062

4 7184806 A ADD 1307 1,168 2,169 0,0302 SOReS2

rs3094694

6 30559883 G ADD 1308 -1,424 -2,104 0,0355 81226110

rs7747934

6 156521972 e ADD 1307 -1,224 -2,096 0,0363 eB984582

rs4583999

6 156527609 G ADD 1286 -1,166 -1,965 0,0496 eB984582

rs10945364

6 169193728 T ADD 1309 1,177 2,255 0,0243 desert

rs1156143

7 136740077 T ADD 1308 1,337 2,495 0,0127 DGKI

rs1888349

7 138314672 T ADD 1309 1,535 2,394 0,0168 KIAA1549

rs12353255

9 20911332 A ADD 1305 -1,158 -2,124 0,0338 KIAA1797

rs7027515

9 126213030 e ADD 1308 1,2 2,369 0,018 PSMB7

rs332185

10 28953315 e ADD 1309 -1,207 -2,058 0,0397 BG563864

rs763373

11 12796918 e ADD 1254 1,316 2,465 0,0138 TEAD1

SNP

CHR BP Al TEST NMISS BETA STAT p Gen

rs10750861

11 56937983 e ADD 1308 1,023 2,058 0,0398 SLe43A3

rs8109493

19 14464932 e ADD 1306 -1,245 -1,994 0,0464 GIPe1

rs6518223

21 45538977 e ADD 1307 1,036 2,082 0,0376 AA307589

De manera que para efectuar el análisis discriminante con el software SPSS (Lead technologies Inc) construimos una nueva matriz de marcadores SNPs e incluimos tanto los

5 marcadores contenidos en la tabla 5 como aquellos que aparecen en la tabla 6, la edad, el sexo de los casos y controles y la serie a la que pertenecían (stage 1,2 ó 3). Es importante detallar que se eliminaron aquellos marcadores que resultaban redundantes bien porque aparecían en ambas tablas

10 o bien porque trazaban el mismo gen (como es el caso de las multiplicidades detectadas para LRRK2 o la duplicidad detectada para ACVR2). La lista de los 34 SNPs empleados en el análisis discriminante se detalla en la tabla 7 junto con los coeficientes que emplea cada uno para la construcción de

15 la función canónica que consiste en la suma ponderada de las variables incluidas en el panel predictivo. Igualmente, incluimos los coeficientes asignados a la edad, el sexo y la serie a la que pertenecen (todos estos coeficientes se calculan con SPSS)

20 Tabla 7 : Coeficientes estandarizados de las funciones discriminantes canónicas

SNP

Función

Age_global

0,933

series

0,478

rs7747934

0,153

rs2332631

0,113

rs847126

0,095

rs6805546

0,089

rs763373

0,083

rs577562

0,078

SNP

Función

rs1039189

0,078

rs3936139

0,076

rs218280

0,071

rs761267

0,071

rs11119097

0,069

rs4658673

0,068

rs869026

0,057

rs2986574

0,051

rs3094694

0,043

rs10155062

0,042

rs8109493

0,035

rs10945364

0,032

rs7027515

0,031

rs10750861

0,03

rs6518223

0,029

rs1156143

0,028

rs1888349

0,006

rs332185

0,003

rs4505714

-0,016

rs10496075

-0,035

rs12353255

-0,038

rs9036

-0,062

rs4490160

-0,067

rs11564173

-0,089

rs1549355

-0,103

SNP

Función

rs12987286

-0,11

rs7650598

-0,118

rs4583999

-0,125

sexo_12

-0,265

La tabla 8 muestra los resultados del análisis discriminante y la validación cruzada empleando la función construida y emitiendo una puntuación para cada individuo con

5 los coeficientes de la tabla 7. Los resultados demuestran una capacidad de predicción del estatus de los controles del 72,8% (validación cruzada 71, 8%) y una capacidad de predicción del estatus de casos del 77,4% con una validación cruzada resultante del 75,7%. Estas estimaciones exceden el

10 ampliamente el 50% (

se tratara de predecir la condición de enfermo PD o sano lanzando una moneda al aire (es decir por azar, tabla 8)

Tabla 8: Resultados de la clasificación (b,c)

case control

Grupo de pertenencia pronosticado Total

Controles

Casos 1

Original Validación cruzada(a)

Recuento % Recuento % Controles Casos Controles Casos Controles Casos Controles Casos 825 226 72,8 22,6 814 243 71,8 24,3 308 773 27,2 77,4 319 756 28,2 75,7 1133 999 100,0 100,0 1133 999 100,0 100,0

5 a La validación cruzada sólo se aplica a los casos del análisis. En la validación cruzada, cada caso se clasifica mediante las funciones derivadas a partir del resto de los casos. b Clasificados correctamente el 75,0% de los casos agrupados originales. e Clasificados correctamente el 73,6% de los casos agrupados validados mediante validación cruzada.

10 Para medir el efecto de la adición de los marcadores a las variables edad, sexo y obtener la significación estadística del conjunto de SNPs seleccionados se calculó el área bajo la curva (COR) que determinan per se los SNPs, las ca-variables críticas per se (edad, sexo) y ambas en conjunto (Figura 2 y

15 tabla 9) De nuevo los resultactos demuestran que los SNPs seleccionados tienen una capacidad predictiva inherente que excede lo esperable por azar (área 61,4%, plt;1,14E-19) y, además mejoran la capacidad predictiva de la ca-variables en un 2% aproximadamente (tabla 9) .

20

Tabla 9: Área bajo la curva

Variables resultado de contraste

Área Error típ.(a) Sig. asintótica(b) Intervalo de confianza asintótico al 95%

Límite inferior

Límite superior Límite inferior límite superior límite inferior

SNPs+Edad y sexo Edad y Sexo SNPs sólos

,818 ,798 ,614 ,009 ,010 ,012 1,28E-141 5,31E-125 1,14E-019 ,800 ,779 ,590 ,835 ,817 ,637

a Bajo el supuesto no para métrico b Hipótesis nula: área verdadera= 0,5

Los datos obtenidos con la presente invención indican, por tanto, que la combinación de SNPs rs577562, rs2986574, rs11119097, rs4658673, rs4490160, rs10496075, rs12987286, rs847126, rs9036, rs6805546, rs4505714, rs7650598,

10 rs10155062, rs218280, rs869026, rs3094694, rs1549355, rs7747934, rs4583999, rs10945364, rs1156143, rs1888349, rs12353255, rs7027515, rs332185, rs763373, rs10750861, rs11564173, rs2332631, rs1039189, rs3936139, rs8109493, rs761267, y rs6518223 analizados conjuntamente con el

15 algoritmo utilizado en la presente invención puede

identificar a un subconjunto de individuos de la población con riesgo de padecer la enfermedad de Parkinson esporádica incluso sin tener en cuenta su género, edad o procedencia.

20 Ejemplo 5. Primera Validación de los marcadores seleccionados (Población Española) Pacientes y controles Casos confirmados de la Enfermedad de Parkinson: Se reclutaron 372 casos confirmados de PD complejo no

25 consecutivos (es decir que no se recogieron de manera continuada) . La edad media de la serie de pacientes es 71±11,8 años y el rango de edad de 21 a 95 años. El 57,3% de

los pacientes (n=213) eran varones y 42,7% (n=159) mujeres. El promedio de la edad de comienzo de la enfermedad de Parkinson de los casos reclutados es de 55,95±12,9 años. El rango de edades de comienzo de la patología oscila entre los 8 y los 83 años. Todos los pacientes son residentes de Cataluña y se reclutaron en el servicio de Neurología del Hospital Clínic de Barcelona entre los años 1997 y 2 O O 8. Todos los pacientes estudiados son concordantes con el diagnostico de PD de acuerdo con los criterios diagnósticos comúnmente aceptados para esta enfermedad (21), (37).

Los pacientes incluidos han tenido un seguimiento longitudinal en la Unidad de Trastornos del Movimiento del Servicio de Neurología. Del mismo modo su historia familiar ha sido periódicamente actualizada en la misma Unidad. Cuando la historia familiar resultó positiva su grado de certeza se valoró con los criterios de Marder y colaboradores (38). El consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes y el comité de ética del Hospital Clínic evaluó y aprobó de forma explícita y específica esta investigación. Controles:

Seleccionamos 588 controles de la población general española del Biobanco privado de ADN perteneciente a neoCodex SL (España) . La selección fue aleatoria, tan sólo atendiendo a la condición de que el lugar de nacimiento del control y sus ancestros inmediatos fuera España. La edad media de los controles es 47,5±9 años. En el grupo control contabilizamos 213 (37,1%) varones y 351 (62,9%) mujeres. Extracción de ADN

El DNA de pacientes y controles se extrajo utilizando la tecnología automatizada MAGNApure de Roche (Suiza) siguiendo las instrucciones del fabricante a partir de 300 ul de Sangre total periférica obtenida mediante venopunción. Una vez finalizado el proceso automático de extracción se procede al

control de cantidad y de calidad del material obtenido. Para ello se emplean técnicas nano-espectrofotométricas que permiten medir las absorbancias de la muestra a 260 y 280 nm

(Nanodrop, Thermo Scientific) Con los datos se calculan tanto la concentración de la muestra como el índice 260nm/280nm que indica la pureza del material obtenido.

Ejemplo 6. Segunda serie de validación (obtenida de NCBI) Pacientes y controles

Pacientes: casos confirmados de la enfermedad de Parkinson:

Los datos genotípicos de las muestras utilizadas para la tercera replica (segunda validación) de nuestro estudio se obtuvieron directamente de NCBI (NINDS-Genome-Wide Genotyping l n P a r k l n s o n s D l s e a s e http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gap/cgibin/study.cgi?stu dy id=phs000089.v3.p2; Fecha de consulta 31 de Enero de 2010).

En concreto empleamos 661 casos del estudio NINDS

(National Institute of Neurological Disorders, NIH, EEUU) que están depositados en las bases de datos de los Laboratorios de Coriell (www.coriell.org; fecha de consulta 31 de Enero de 2010). Todos los pacientes eran blancos y norte-americanos de ascendencia norte-europea. Los pacientes tenían diagnóstico clínico de Enfermedad de Parkinson idiopática. El promedio de edad de aparición de los síntomas es 55.91 años. T o d o s 1 o s p a e i e n t e s s u f r í a n b r a d i quinesi a (trastorno caracterizado por el enlentecimiento de todos los movimientos voluntarios y el habla, como la causada por el parkinsonismo, otras alteraciones extrapiramidales y ciertos tranquilizantes) y alguno (o varios) de los siguientes hallazgos: temblor de extremidades, inestabilidad postural y respuesta al tratamieto anti-parkinsoniano adecuada. Los

detalles de estos pacientes están recogidos en el artículo publicado por J. Simón-Sánchez y colaboradores (39). Controles:

Los 532 controles de esta validación se recogieron de los paneles pre-compilados en los repositorios de Coriell. Todos los individuos seleccionados manifestaron su condición de blancos caucasianos libres de enfermedades neuro-psiquiátricas y se interrogaron acerca de enfermedades neurológicas tales como Enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amioatrófica, ataxias, autismo, depresión mayor, enfermedades cerebrovasculares, demencia, enfermedad de Parkinson y esquizofrenia. Sus padres ni sus hermanos tampoco presentaban enfermedades neurológicas. La edad media de estos controles es de 58 años (15-98 años)

Extracción SNPs desde NCBI (National Center for Biotechnological Information) :

Los genotipos pertenecientes a estos individuos se extrajeron directamente de las matrices obtenidas de NCBI aplicando tecnologías informáticas convencionales. En concreto obtuvimos los 384 marcadores mencionados en la tabla 2 aplicando sucesivamente a las matrices de NCBI los comandos -proxy-impute all (para inferir los marcadores que no estuvieran presentes), --snp (para seleccionar de la matriz la lista de SNPs de interés) y -make-bed (para generar una nueva matriz de datos exclusivamente con los marcadores seleccionados) Cálculos estadísticos:

Igualmente que en el caso anterior, los genotipos crudos obtenidos de la matrices se emplearon como input para el software HFCC y otros programas bioinformáticos, como PLINK, que se utilizan para evaluar los resultactos del estudio.

PLINK (6), y en concreto el comando -assoc, permite realizar el estudio univariante de cada SNP respecto a la enfermedad. El comando -linear permite el análisis de regresión lineal ajustado. El comando -logistic permite el análisis de 5 regresión logística ajustado por edad y sexo, los comandos -wi thin y -homog permiten el cálculo del índice de heterogeneidad y el estadístico de Breslow-Day y el análisis estratificado por series. El comando --meta-analysis permite el análisis conjunto de todos los estudios. HFCC se emplea 10 para el análisis bi-variante. El plot de Forest se realiza con el software libre episheet

(http://www.drugepi.org/links/downloads/ episheet.xls) El análisis discriminante y los cálculos de área bajo la curva se realizan con SPSS.

15

Referencias

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ES 2387358 Al

Claims (3)

1. REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento in vitro para determinar la predisposición a padecer la enfermedad de Parkinson en una muestra aislada de un individuo , que comprende el análisis genotípico en dicha muestra del conjunto de SNPs formado por : rs577562 , rs2986574 , rsl1119097 , rs4 65867 3 , rs4490160 , rsl0496075 , rs12987286 , rs847126 , rs9036 , rs6805546 , rs4505714 , rs7650598 , rsl0155062 , rs218280 , rs869026 , rs3094694 , rs1549355 , rs7747934 , rs4583999 ,

   rs l 0945364 , rsl156143 , rs1888349 , rs12353255 , rs702751S , rs332185 , rs763373 , rsl0750861 , rsl1564173 , rs2332631 ,

   rsl039189 , rs3936139, rs8109493 , rs761267 , rs6518223 , rs1364658 , rs353111 .

2. 2 . Procedimiento según la reivindicación 1 que comprende el análisis conjunto de los SNPs rs869026 y rsl0945364 , situados en los cromosomas 5 y 6, respectivamente .

3. 3 . Conjunto de reactivos o kit para la determinación de la predisposición a padecer la enfermedad de Parkinson en una muestra aislada de un individuo, caracterizado porque comprende un conjunto de ácidos nucleicos capaces de hibridar y detectar el conjunto de SNPs formado por :

   rs577562 , rs2986574 , rsl1119097 , rs4658673 , rs4490160 , rsl0496075 , rs12987286 , rs847126 , rs9036 , rs6805546 ,

   rs4505714 ,

   rs7650598 , rsl0155062 , rs218280 , rs869026 ,

   rs3094694 ,

   rs1549355 , rs7747934 , rs4583999 , rsl0945364 ,

   rs1156143 ,

   rs1888349 , rs12353255 , rs7027515 , rs332185 ,

   rs763373 ,

   rsl0750861 , rs11564173 , rs2332631 , rsl039189 ,

   rs3936139 ,

   rs8109493 , rs761267 , rs6518223 , rs1364658 ,

   rs353111 .