ES2379915A1

ES2379915A1 - Procedimiento para el recubrimiento y funcionalización de nanopart�?culas mediante reacción de michael.

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Publication number: ES2379915A1
Application number: ES201031493A
Authority: ES
Inventors: Rafael Piñol Lacambra; �?Ngel Mill�?N Escolano; Fernando Palacio Parada; Lierni Gabilondo Ugarte
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date: 2010-10-07
Filing date: 2010-10-07
Publication date: 2012-05-07
Anticipated expiration: 2030-10-07
Also published as: EP2626329A4; US20130266509A1; ES2379915B1; EP2626329A1; WO2012045902A1

Abstract

Procedimiento para el recubrimiento y funcionalización de nanopartículas mediante reacción de Michael.La presente invención describe un procedimiento para el recubrimiento de nanopartículas para conseguir dispersiones estables de dichas partículas en un medio líquido y de su funcionalización superficial con grupos que poseen actividad física, como luminiscencia, actividad química, como capacidad catalítica, y/o actividad biológica, como capacidad de unión selectiva con un ente biológico.

Description

Procedimiento para el recubrimiento y funcionalización de nanopartículas mediante reacción de Michael.

La presente invención se refiere a un procedimiento para el recubrimiento de nanopartículas para conseguir dispersiones estables de dichas partículas en un medio líquido y de su funcionalización superficial con grupos que poseen actividad física, como luminiscencia, actividad química, como capacidad catalítica, y/o actividad biológica, como capacidad de unión selectiva con un ente biológico.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Las aplicaciones de las nanopartículas se extienden a muchas áreas en la industria, dado que presentan muchas y diversas ventajas respecto a materiales macroscópicos y microscópicos. En materiales estructurales, como cerámicas y composites, mejoran las prestaciones mecánicas. En materiales funcionales ofrecen prestaciones únicas y capacidad de modulación basadas en el hecho de que las propiedades físicas de los materiales (eléctricas, magnéticas, ópticas, químicas, biológicas, estéricas, etc.) cambian cuando su tamaño entra en la escala nanométrica y esta variación se produce de forma gradual al ir disminuyendo el tamaño. En sus aplicaciones las nanopartículas se presentan en forma masiva, en películas, en polvos, dispersas en un fluido o en aerosoles, Una de las primeras aplicaciones en el campo de la biomedicina fue en el área de la biotecnología en los años 70 como transportadores de enzimas y luego en separación, purificación, análisis, biocatálisis y bioprocesado (Magnogel, Dynabeads y Estapor). Sobre los años 80 empezaron a usarse como agentes de contraste en imagen por resonancia magnética (MRI). Y más recientemente se han descrito una gran variedad de utilidades tales como administración dirigida de drogas, inmunoensayos, biología molecular, purificación de ácidos nucleicos ADN, separación celular, terapia mediante hipertermia, y otras. En cuanto a sus aplicaciones industriales de suspensiones de nanopartículas, se ha descrito su utilidad en impresión magnética, tintas magnéticas, lubricación y sellado en sistemas de vacío, sistemas de amortiguación, sensores magnéticos, actuadores, recuperación de metales y purificación de aguas, y otras. Estas aplicaciones se basan en su alta superficie específica, en su capacidad para atravesar barreras biológicas, capacidad de adsorción de iones, y principalmente en sus exclusivas propiedades magnéticas, ópticas y eléctricas que sólo aparecen en el nivel nanométrico tales como superparamagnetismo, magnetoresistencia, anisotropía magnética, luminiscencia, etc.

Existen varios tipos de suspensiones de nanopartículas orgánicas e inorgánicas con aplicaciones tecnológicas. En los últimos tiempos se ha despertado un gran interés por el uso de suspensiones acuosas de nanopartículas magnéticas y entre ellas las de óxidos de hierro son altamente atractivas por su biocompatibilidad y por su utilidad en aplicaciones biomédicas [Laurent, S. Chem Rev. 2008, 108, 2064]. El primer requisito en la fabricación de estas suspensiones es lograr la estabilidad de las mismas. Un segundo punto es la incorporación de una o varias funcionalidades en la superficie de las partículas. Para ambas cosas es necesario recubrir las nanopartículas con el material adecuado. Existen varias estrategias para el recubrimiento de nanopartículas que se pueden clasificar según el tipo de compuestos usados en el recubrimiento como sigue:

1) Recubrimientos que contienen silicio. Es la técnica más utilizada, se basa en el uso de precursores organosilanos y consiste en la adsorción de estos en la superficie y su posterior hidrólisis para formar capas de silicio u organo-sílice, que a su vez se pueden activar por reacción con compuestos alcoxisilanos funcional izados [W02008/058678]. En [US6514481, Prasad] se describen nanopartículas de óxido de hierro recubiertas de sílice a la que se une un péptido mediante un espaciador y en la solicitud de patente W02006/055447 se describe un procedimiento similar para realizar recubrimientos de organo-sílice funcionalizados con oligonucleótidos. Un sistema muy utilizado en el recubrimiento de partículas que consiste en realizar la hidrólisis de los precursores organosilanos en el seno de micelas [US200711 0816].

2) Recubrimientos poliméricos. En esta técnica el recubrimiento se realiza bien por combinación de las nanopartículas con polímeros solubles en el medio líquido, y sintetizados previamente, que contienen grupos funcionales capaces de interaccionar con la superficie de las partículas de forma que las partículas quedan encapsuladas en el interior del polímero; o bien por adsorción de monómeros o de iniciadores de polimerización y posterior polimerización in situ, normalmente en el seno de sistemas micelares. Polímeros ampliamente usados en recubrimiento de nanopartículas son el dextrano [US4452773], proteínas [US201010029902,], alginatos; y polímeros sintéticos como poliestirenos funcionalizados, polipirrol, polímeros fenólicos, polímeros de ácidos carboxílicos [W02005/112758], copolímeros bloque [Sohn et al. L Aeel. Polvm Sci. 2004, 91,3549], polietileniminas [W02009/135937] y otros. Una de las técnicas preferidas para aumentar la estabilidad del recubrimiento consiste en el entrecruzamiento de las cadenas poliméricas [W02003/005029]. También se han descrito procedimientos para recubrir nanopartículas con una doble capa orgánica en los que la unión entre las dos capas se realiza mediante enlaces amida [US2008/0226895]. La funcionalización se puede llevar a cabo por absorción física de un segundo polímero como en [US2003185757], en un primer polímero, el carboxidextrano, se utiliza como estabilizador y un segundo polímero, carboxidextrano funcionalizado con enzimas, se usa para añadir la funcionalidad. Un procedimiento que permite el recubrimiento biocompatible y la funcionalización de nanopartículas consiste en el uso de proteínas barnase y barstar, pero su alto coste puede limitar su aplicación [Nikitin et al. Proc. Na!. Acad. Sci. USA 2010 (Idoi/10.1073/pnas.1001142107)]. También se han descrito procedimientos de

3) Otra estrategia utiliza compuestos de bajo peso molecular con grupos capaces de unirse a la superficie de la partícula unidos a residuos con afinidad por el solvente. Por ejemplo, en la patente WO 03/016217 se recubren nanopartículas metálicas y en particular de óxidos metálicos con derivados de ácido fosfórico, ácido fosfónico o fosfinas. Sin embargo es más habitual utilizar como recubrimiento moléculas anfifílicas que pueden disponerse en forma de capas sencillas o dobles, como por ejemplo en [Shen et al. Langmuir 2000, 16, 9907] aunque en este caso las suspensiones solo son estables a pH superior a 7,4.

Por otra parte, también se han descrito métodos mecánicos para recubrir nanopartículas [W02008/074087], aunque el control de la estructura y espesor del recubrimiento que permiten estas técnicas es insuficiente para algunas aplicaciones.

La funcionalización de nanopartículas, es decir el anclaje de agentes activos, se realiza, en la mayoría de los procedimientos existentes, sobre la superficie de la capa estabilizadora una vez recubierta la nanopartícula con dicha capa. Esta estrategia acarrea algunos inconvenientes como procesos de purificación y limitaciones en las condiciones de reacción para evitar la agregación o el deterioro de la capa estabilizadora o de la propia funcionalidad a añadir. La funcionalización se puede llevar a cabo por adsorción electrostática [Wang et al. IEEE Trans. Nanofech 2009, 8, 142] pero es preferible realizarla mediante enlaces covalentes a través de un espaciador que conecta la superficie de la partícula con el agente activo [Georgelin et al. J Nanopar! Res 2010, 12, 675]. Un procedimiento versátil se basa en la unión específica entre streptavidina y biotina, aunque su coste es elevado y requiere el uso de agentes activos biotinados.

Por otro lado, la reacción de Michael se ha utilizado en la preparación de materiales masivos como en la hidrofilización de superficies de artículos poliméricos, en especial lentes de contacto [US2008/0003259], en la fabricación de hidrogeles, en el curado de silanos [W02006/087079;], en la fabricación de materiales laminados, en la síntesis de productos farmacéuticos [US2008/0213249], yen la producción de lacas, y adhesivos.

DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN

La presente invención proporciona un procedimiento de obtención de nanopartículas recubiertas y funcional izadas, al uso de dichas nanopartículas obtenidas por dicho procedimiento para formar dispersiones estables en un medio líquido, proporciona también las dispersiones estables y además el uso de dichas dispersiones en biomedicina.

El procedimiento de la invención se basa en la utilización de la reacción de Michael. En esta invención la reacción de adición de Michael se utiliza para recubrir nanopartículas con capas solvatables por un líquido de forma que sean estables en suspensión en dicho líquido y para añadir agentes activos en la superficie de dichas nanopartículas.

Un primer aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención de nanopartículas recubiertas y funcionalizadas mediante reacción de Michael que comprende las etapas:

a) reacción de al menos una nanopartícula con un reactivo que comprende un donador (B) o un aceptor

(C) de Michael, y

b) reacción del producto obtenido en (a) con un reactivo que comprende un aceptar (C) o donador (B) de MichaeL

Si en la etapa (a) el reactivo es un donador (B) en la etapa (b) el reactivo es un aceptar (C) o viceversa.

El término "reacción de Michael" en la presente invención engloba los conceptos de reacción de Michael, adición de Michael, y reacción tipo Michael conocidos por cualquier experto en la materia. Por tanto, se entiende por "reacción de Michael" en la presente invención a la adición 1, 4 de un carbanión estabilizado por resonancia o de nucleófilos de nitrógeno, azufre u oxígeno (donador de Michael, B) a un sistema insaturado conjugado con un grupo atractor de electrones (aceptar de Michael, C).

Se entiende por "nanopartículas" en la presente invención a partículas orgánicas, inorgánicas o híbridas orgánico-inorgánicas que tienen un tamaño entre 1 nm y 100 nm.

Preferiblemente la nanopartícula se selecciona de entre metal óxido de metal o cualquiera de sus combinaciones, más preferiblemente el óxido de metal es un óxido de hierro.

En una realización preferida el reactivo de la etapa (a) además comprende un espaciador R1. siendo en una realización más preferida R1 un compuesto orgánico.

En otra realización preferida el reactivo de la etapa (b) además comprende un espaciador R2. En una realización más preferida R2 es un compuesto orgánico que comprende grupos solvatables en un líquido.

Preferiblemente el reactivo de la etapa (a) de la invención además comprende un grupo de unión (A) que se selecciona de entre un catión, un anión, precursor alcoxilano, tiol, alcohol, alcóxido, carboxilato, anhídrido carboxílico, fosfato, polielectrolito, imina, nitrilo, azida, amina, amida, fosfina o cualquiera de sus combinaciones. Más preferiblemente el catión es una amina cuaternaria. Y más preferiblemente el anión se selecciona de entre un grupo carboxilato, sulfato, fosfato o cualquiera de sus combinaciones. Este grupo de unión (A) asegura la unión directa a la nanopartícula, de forma que no quede simplemente absorbido físicamente, confiriéndole mayor estabilidad.

En una realización preferida el reactivo donador de Michael (8) se selecciona de la lista que comprende: ~-dicetona, éster malónico, ~-cetoéster, ~-cetonotrilo, nitro, ami no, ácido malónico, enamina, ami na primaria, amina secundaria, amina terciaria, imina, hidracina, guanadina, alcohol, tiol, fosfina, metileno, carbinol, organometálico, haluro y cualquiera de sus combinaciones.

En una realización preferida el reactivo aceptor de Michael (C) se selecciona de la lista que comprende: enón conjugado, carbonilo, ciano, carboxílico, carboxilato, sulfonilo, aldehído, éster, nitrilo, nitro insaturado, carboxilato, acrilato, acrilamida, metacrilato, metacrilamida, acrilonitrilo, vinilcetona, vinilsulfona y cualquiera de sus combinaciones.

Preferiblemente el reactivo de la etapa (b) del procedimiento de la invención además comprende al menos un residuo orgánico o inorgánico (O) con funcionalidad física, química o biológica.

Más preferiblemente el residuo orgánico o inorgánico (O) con funcionalidad física se selecciona de entre fluoresceína, rodamina, complejo de tierra rara, puntos cuánticos ("quantum dots") o cualquiera de sus combinaciones.

Más preferiblemente el residuo orgánico o inorgánico (O) con funcionalidad química se selecciona de entre un catalizador o un absorbente. Y aún más preferiblemente el catalizador es un compuesto de coordinación de rodio.

En una realización más preferida el residuo orgánico o inorgánico (O) con funcionalidad biológica se selecciona de entre un compuesto con capacidad catalítica, con capacidad de reconocimiento, con capacidad curativa o cualquiera de sus combinaciones. En una realización aún más preferida el compuesto con capacidad catalítica es una enzima. El compuesto con capacidad de reconocimiento puede seleccionarse de entre anticuerpos, oligonucleótidos o cualquiera de sus combinaciones. Y en otra realización aún más preferida el compuesto con capacidad curativa es un fármaco.

Preferiblemente las etapas (a) y/o (b) se llevan a cabo en condiciones de temperatura de entre 1 ay 7aoc.

El procedimiento propuesto en esta invención ofrece varias ventajas sobre los procedimientos preexistentes que en su conjunto suponen un gran avance sobre el estado de la técnica.

La presente invención permite la estabilización de nanopartículas en un medio líquido mediante el recubrimiento de la superficie de las nanopartículas con residuos que son solvatables en este medio. La unión de los residuos solvatables a la superficie de las partículas se produce mediante enlaces covalentes lo que asegura una gran estabilidad del recubrimiento. Además, estos residuos pueden cumplir otra funcionalidad que la mera estabilización, como el control de la reactividad superficial de las nanopartículas. Este concepto se ejemplifica, sin limitar el alcance de esta invención, con la utilización de recubrimientos que contienen residuos de polietilenglicol, PEG, que además de permitir la estabilización de las nanopartículas en agua, reduce la adherencia de proteínas a las partículas.

En cuanto a la funcionalización, el procedimiento de la invención es una verdadera plataforma sintética de nanopartículas ya que permite añadir varias funcionalidades físicas, químicas y biológicas en una misma nanopartícula.

Otra de las ventajas consiste en que permite una alta densidad de recubrimiento lo que confiere una mayor estabilidad a la suspensión.

Otra de las ventajas sobre el estado de la técnica que aporta esta invención es la capacidad de controlar la cantidad de grupos funcionales en la superficie de cada partícula de una forma sencilla mediante el uso de distintas proporciones de residuos funcionalizados y sin funcionalizar.

Otra gran ventaja sobre otras técnicas que permiten el anclaje de funcionalidades mediante enlaces covalentes es que en esta invención la reacción de anclaje se lleva a cabo en condiciones muy suaves lo que permite realizar funcionalizaciones con agentes activos fácilmente degradables.

Otra gran ventaja sobre los métodos de funcionalización basados en compuestos biológicos es la sencillez de aplicación.

Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a la nanopartícula recubierta y funcionalizada obtenible por el procedimiento de la invención.

lOSeentiende por "líquido madre" en la presente invención a una disolución en un solvente de tipo acuoso u orgánico,

En un tercer aspecto la presente invención se refiere al uso de las nanopartículas descritas anteriormente, para la fabricación de productos que se seleccionan de la lista que comprende: cosméticos, pinturas, tintes, catálisis, depuración de aguas y biomedicina. Ya que dichas nanopartículas pueden formar dispersiones estables.

El procedimiento de la invención permite la funcionalización sobre la partícula ya estabilizada con la capa protectora, pero va más allá al permitir la unión de la molécula funcional al residuo que compone la capa protectora previamente al recubrimiento. De esta forma se facilita la purificación y se eliminan las restricciones en las condiciones de reacción impuestas por la estabilidad de la suspensión.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una dispersión de las nanopartículas recubiertas y funcional izadas según se ha descrito anteriormente en un medio líquido, también denominado líquido madre.

que puede contener o no aditivos como compuestos iónicos, neutros o anfifílicos. El líquido madre puede ser agua o bien un líquido fisiológico.

En una realización preferida el medio líquido de dispersión se selecciona de entre acuoso, orgánico o cualquiera de sus combinaciones.

El procedimiento de la invención permite la preparación de dispersiones denominadas ferrofluidos, entendiendo como tales suspensiones estables de nanopartículas magnéticas. En una realización más preferida de esta invención, además, las nanopartículas son de óxido de hierro magnético y tienen propiedades superparamagnéticas, como se muestra en el ejemplo 6.

A su vez el procedimiento de la invención permite la preparación de suspensiones de nanopartículas multifuncionales.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de la dispersión descrita anteriormente, para la fabricación de productos que se seleccionan de la lista que comprende: cosméticos, pinturas, tintes, catálisis, depuración de aguas y biomedicina.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción yen parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS

Fig. 1. ' H_RMN (020, 400 MHz). Espectro correspondiente al producto final obtenido según el ejemplo 1. En la parte superior izquierda se muestra una ampliación de la zona del espectro correspondiente a 3,07-3,27 ppm. El triplete observado a 3,12 ppm pertenece a los protones denotados como H1 en la figura (-CH2-CH2-NH2) y que corresponden a la amina de partida MeOPEG350-NH2. El triplete observado a 3,23 ppm se asigna a los protones denotados como H, en la figura (-CH2-CH¡-NH-CH2-CH2-C(=0)OCH3 y que corresponden al producto de reacción entre el grupo amino de MeOPEG350-NH2 y metil acrilato mediante adición de tipo Michael. La relación de intensidades entre ambas señales indica una conversión del 50%.

Fig. 2. Distribución de diámetros hidrodinámicos de suspensiones de nanopartículas antes de recubrir (FFa) fabricadas según el ejemplo 2, después de recubrir con ácido acrílico (FFa@Acr) según el ejemplo 3, y después de un segundo recubrimiento con n-amino polietilenglicol (FFa@Acr@PEG-NH2) según el ejemplo 3.

Fig. 3. ' H-RMN (020, 400 MHz). Espectro correspondiente a una muestra, fabricada según el ejemplo 4, extraida después de 20 horas de reacción a temperatura ambiente. En la parte superior izquierda se muestra una ampliación de la zona del espectro correspondiente a 4-4,35 ppm. El triplete observado a 4,27 ppm pertenece a los protones denotados como H, en la figura (CH2=CH-(0=C)-0-CH2-CH2-) y que corresponden al acrilato de partida MPEGA454. El singlete ancho observado a 4,21 ppm se asigna a los protones denotados como H1" en la figura (-NH-CH2-CH2(0=C)-0-CH¡-CH2-) y que corresponden al producto de reacción entre los grupos amino del poli mero y el acrilato de partida mediante adición de tipo Michael. La relación de intensidades entre ambas señales indica una conversión del 27%.

Fig. 4. La figura muestra el Espectro FT-IR correspondiente al producto obtenido mediante la adición de Michael entre PVam y MeOPEGA.54, fabricado según el ejemplo 4, tras 20 horas de reacción (línea continua) y el espectro del producto de partida MeOPEGA454 (línea discontinua). En la esquina inferior izquierda se presenta una ampliación de la zona correspondiente a 1050-750 cm-1. En la ampliación se puede observar la desaparición de la banda a 810 cm-1 correspondiente a la vibración de flexión (fuera del plano) del grupo vinílico en el espectro del producto final y si presente en el espectro del producto de partida. La ausencia de esta banda confirma la reacción de adición entre los grupos amino del polímero y el acrilato.

Fig. 5. Distribución de diámetros hidrodinámicos de suspensiones de nanopartículas antes de recubrir (FFa) fabricadas según el ejemplo 2, después de recubrir con polivinilamina (FFa@PVAm) según el ejemplo 5, y después de un segundo recubrimiento con polietilenglicolacrilato (FFa@PVAm@PEG-A) según el ejemplo 5.

Fig. 6. Imágenes TEM de la suspensión de nanopartículas recubiertas con polivinilamina (FFa@PVAm) según el ejemplo 6, y después de un segundo recubrimiento con polietilenglicolacrilato metilfluoresceina (FFa@PVAm@MeFluPEG-A) en un tampón fisiológico a pH=7,40 (PBS) fabricadas en el ejemplo 6.

Fig. 7. Variación de la susceptibilidad ac, a) en fase (X'), b) fuera de fase (X") en un campo magnético alterno de suspensiones de nanopartículas antes de recubrir (FFa) y c) y d) después de recubrir con polietilenglicolacrilato metilfluoresceina (FFa@PVAm@MeFluPEG-A) en un tampón fisiológico a pH=7,40 (PBS) fabricadas en el ejemplo

6.

Fig. 8. Imágenes de microscopía óptica de fluorescencia obtenidas mediante la técnica de imagen estructurada de una célula de musculatura lisa de aorta de rata cultivada en un medio que contiene el ferrofluido FFa@PVAm@MeFluPEG-A; (a) los puntos brillantes corresponden a las nanoparticulas funcionalizadas y aparecen en verde en la imagen en color, (b) los puntos brillantes corresponden a los lisosomas marcados con Iysotracker (Molecular Probes-Invitrogen) y aparecerían en rojo en la imagen en color, (c) imagen mezcla en la que los puntos brillantes, de mayor intensidad que en las imágenes (a) y (b) que corresponderían con coloración amarillo-naranja en la imagen en color, coinciden en el mismo campo visual de las nanopartículas internalizadas y de los lisosomas mostrados en las imágenes (a) y (b) respectivamente. Los núcleos aparecen en azul en las imágenes.

Fig. 9. Gráfica de dispersión de las emisiones de las nanopartículas funcionarizadas, eje x, y de los lisosomas marcados con una sustancia fluorescente, eje y, en el cultivo celular cuya imagen se muestra en la figura 8.

EJEMPLOS

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la especificidad y efectividad del procedimiento de la invención para la síntesis de nanopartículas recubiertas y funcionarizadas, así como la dispersión en medio líquido de dichas nanopartículas.

Ejemplo 1.

En este ejemplo se ilustra como un reactivo X que contiene un grupo de anclaje o unión A, en este caso un grupo carboxilato, y un aceptor de Michael e, en este caso un doble enlace conjugado con un carboxilato, es capaz de reaccionar mediante adición de Michael con un reactivo Y que contiene un donor de Michael B, en este caso un grupo -NH2, y un residuo hidrofílico, en este caso polietilenglicol, a temperatura ambiente y en condiciones de pH suaves, próximas a pH fisiológico, pH: 7,53, con un rendimiento de al menos un 50%.

Síntesis de MeOPEG"oOTs

'il-o-

CI-~ ~ /;

O

MeOPEG3500Ts

En un matraz de 3 bocas de 250 mi cargado con un agitador magnético se añaden 120 mi de diclorometano anhidro, 21,02 9 de metoxipolietilenglicol (MeOPEG 3500H, Mn: 350 Da, Aldrich, 60 mmol) y 9,7 mi de piridina (120 mmol). Sobre la disolución resultante se añaden 23,34 9 de cloruro de tosilo (120 mmol) lentamente, bajo atmósfera de argón y con agitación. La mezcla se mantiene en agitación a temperatura ambiente durante 70 horas, se filtra y se vierte sobre 60 mi de agua destilada fría. Se separa la fase orgánica y se lava sucesivamente con 60 mi de una disolución acuosa de piridina al 25% v/v, luego con 60 mi de agua destilada fría, posteriormente con dos fracciones de 60 mi de ácido clorhídrico 6N frío y finalmente con dos fracciones 60 mi de agua destilada fría. La fase orgánica se seca sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtra y finalmente se evapora el disolvente en el rotavapor obteniéndose 26,46 9 (52,5 mmol) de aceite incoloro. Rendimiento: 88%.

Síntesis de MeOPEG"o-NH,.

NH3 (ac)

IK

,

Acetona

En un matraz de tres bocas de 250 mi cargado con un agitador mecánico y equipado con un refrigerante se añaden 17,76 9 de ioduro de potasio (107 mmol) sobre una disolución de 25,21 9 de metoxipolietilenglicol tosilo (MeOPEG3500Ts, 50 mmol) obtenido en el ejemplo 1 en 90 mi de acetona. La mezcla se calienta a reflujo (70'C)

durante 24 horas. Tras enfriar a temperatura ambiente, se filtra y se evapora el disolvente en el rotavapor obteniéndose un aceite amarillo viscoso. El producto es utilizado en el siguiente paso sin purificación adicional. En un matraz de 1 L de dos bocas cargado con un agitador magnético se añade el ioduro metoxipolietilenglicol (MeOPEG350 1) obtenido en el paso anterior (aprox. 50 mmol) disuelto en 25 mi de agua destilada gota a gota mediante embudo de adición sobre 375 mi de amoniaco acuoso (25%, 6 moles) bajo atmósfera de argón. Tras 5 días de agitación a temperatura ambiente, la reacción se da por terminada. El producto de la reacción se extrae con 3 fracciones de 125 mi de diclorometano, las fases orgánicas combinadas se filtran a través de papel, se secan sobre sulfato de magnesio anhidro y el disolvente es evaporado en el rotavapor obteniéndose 19,05 g de un aceite amarillento. El crudo se disuelve en 50 mi de éter dietílico, tras añadir 50 mi de n-hexano y agitar la mezcla se guarda en el congelador. Al día siguiente la mezcla se separa por decantación separándose el aceite precipitado en el fondo del matraz y el disolvente sobrenadante. Tras evaporar el sobrenadante se obtienen 10,83 g de aceite incoloro (31 mmol).

Reacción de Acrilato y MeOPEG"o-NH, mediante adición de Michael

CH3(OCH2CH2),NH-CH2-CHDCOOCH3

MeOPEG350NH2

En un matraz de una boca de 20 mi se disuelven 316 mg de MeOPEG350 NH2 (0,9 mmol) obtenido en el ejemplo 2 en 5 mi de 0 20, se ajusta el pO de la disolución a 7,53 mediante a adición de OCI diluido con 0 20 en proporción 1 :20 v/v. Sobre la disolución incolora y transparente se añaden 81 1-11 de acrilato de metilo (Aldrich, 0,9 mmol) y la mezcla se mantiene en agitación durante 88h a temperatura ambiente. Se analiza la disolución resultante mediante resonancia magnética nuclear de protones CH-RMN) calculándose una conversión del 50% (Figura 1). El FT-IR del sólido obtenido tras lavar la fase acuosa con 10 mi de diclorometano y evaporar en el rotavapor confirma que el producto obtenido corresponde al producto resultante de la adición de tipo Michael de los grupos amino del polímero con el acrilato.

Ejemplo 2. Síntesis de nanopartículas de óxido de hierro

En este ejemplo se prepara una dispersión de nanopartículas en medio acuoso.

Las nanopartículas de óxido de hierro se prepararon por hidrólisis básica de una disolución de FeCb/FeCI3 en agua siguiendo el procedimiento descrito en [Kang et al, Chem. Mater. 1996, 8, 2209] con algunas modificaciones, utilizando reactivos suministrados por Aldrich. A 25 mi de una disolución que contiene 3,137 g de FeCbAH20, 5,200 g de FeCI3 y 0,85 mi de HCI conc. se le añaden gota a gota 250 mi de una disolución de NaOH 1,5 M bajo agitación magnética. La suspensión resultante se mantiene bajo agitación durante 30 min, y se separa el precipitado por decantación magnética. Se lava el precipitado dos veces mediante dispersión en agua, centrifugación y redispersión; y luego se dispersa finalmente en 300 mi de una disolución de HCI 0,01 M para dar una suspensión estable con pH=1,6 y una concentración de 1,74 gIl en Fe203, que denominaremos FFa. La distribución de tamaños hidrodinámicos medida por dispersión dinámica de luz (OLS) con un equipo Nanosizer ZS de Malvern se muestra en la figura 2. El diámetro hidrodinámico promedio es de 13 nm.

Ejem plo 3.

En este ejemplo se ilustra el recubrimiento de nanopartículas dispersadas en agua con residuos hidrofílicos mediante adición de Michael y la obtención de suspensiones de nanopartículas estables a pH fisiológico (pH=7,4) mediante un proceso que incluye el recubrimiento de las partículas con un aceptor de Michael y la posterior reacción con un donor de Michael que contiene residuos hidrofílicos.

Recubrimiento de nanopartículas con Acrilato y MeOPEG"o-NH,y mediante adición de Michael

OF° CH2=CHCOO·Na'

c-=-'--===-=--0O ·OOCCH=CH2

FFa FFa@Acr

I CH3 (OCH2 CH2 ),NH2

• (MeOPEG"oNH,)

8 ·OOCCH,-CH,-NH(CH,CH,O),CH3

FFa@Acr@P EG-NH,

Sobre 10 mi de FFa sintetizada en el ejemplo 2 se añaden 72,71 mg de acrilato de sodio (CH2=CHCOO·Na, 0,75 mmol) con agitación. Tras agitar la mezcla durante 30 minutos se obtiene una suspensión de nanopartículas con pH: 4,17 que denominaremos ferrofluido FFa@Acr. Sobre esta suspensión se añaden 262 mg de metoxipolietilenglicol amino (MeOPEG350 NH2 Mn:349, 0,75 mmol) con lo que el pH de la suspensión alcanza el valor de 8,90. Tras agitar durante 30 minutos el pH de la suspensión se ajusta a pH: 7,42 añadiendo lentamente Hel 0,25 M. La suspensión se mantiene en agitación a temperatura ambiente durante 1 hora, se somete a ultrasonidos durante 4 minutos y se filtra a través de un filtro Millex®-GS MF (Millipore) de 0,22 ~m para obtener una suspairrside nanoparticulas que denominaremos ferrofluido FFa@Acr@PEG-NH2. En la figura 2 se muestran las distribuciones de diámetros hidrodinámicos de los ferrofluidos FFa@Acr y FFa@Acr@PEG-NH2 medida por dispersión dinámica de luz (DLS) con un equipo Nanosizer ZS de Malvern. Se observa claramente un desplazamiento regular de la distribución de tamaños al pasar de FFa a FFa@Acr y luego a FFa@Acr@PEG-NH2, que demuestra la realización del recubrimiento sobre toda la población de partículas en ambos casos.

Ejemplo 4

Al contrario que en el ejemplo 1, en este ejemplo se ilustra como un reactivo Y que contiene un grupo de anclaje A, en este caso un grupo amino, y un donor de Michael B, el propio grupo amino, es capaz de reaccionar mediante adición de Michael con un reactivo X que contiene un aceptor de Michael e, en este caso un doble enlace conjugado con un grupo carboxilato, y un residuo hidrofílico, en este caso polietilenglicol, a temperatura ambiente y en condiciones de pH suaves, próximas a pH fisiológico pH: 7,5, con un rendimiento de al menos un 27%.

Síntesis por vía radicalaria de poli N-vinilformamida ([(HCONH)CHCH,l,). PNVF.

(HCONH)CH=CH2 AIBN [(HCONH)CHCH2l, 95'C

PNVF

Una mezcla de 4 mi de N-vinilformamida ((HCONH)CH=CH2, 57,06 mmol) destilada y 50 mi de 2-propanol es introducida en un matraz de 100 mi de dos bocas equipado con refrigerante y un agitador mecánico. La mezcla es purgada borboteando argón a través de la disolución durante al menos 15 minutos. Tras añadir 187,40 mg de 2,2'Azobiisobutironitrilo (AIBN, 1,14 mmol) bajo atmósfera de argón la disolución se introduce en un baño de aceite previamente termostatizado a 95°C. La mezcla se mantiene en agitación a 95°C durante 1 hora bajo atmósfera de argón. Tras abrir el matraz a la atmósfera la mezcla se enfría a temperatura ambiente. La mezcla de reacción es filtrada a través de una placa de vidrio poroso y el sólido blanco obtenido se lava sucesivamente con 2 fracciones de 25 mi de 2-propanol frio y 25 mi de acetona. El sólido obtenido se seca a vacio a 50'C obteniéndose 3,47 g de PNVF ([(HCONH)CHCH,l,). Rendimiento: 86%

Hidrólisis de PNVF. Síntesis de polivinilamina ([(NH,)CHCH,l,). PVAm

[(HCONH)CHCH2l, NaOH/H20. [(NH2)CHCH2l, 75'C

PNVF PVAm

Sobre una mezcla de 3,20 g de PNVF (40 mmol, -NH-COH) en 30 mi de agua destilada se añaden 25 mi de una disolución de hidróxido de sodio 2M (50 mmol). La disolución resultante se mantiene en agitación a 75°C durante 60 horas. La disolución se concentra en el rotavapor hasta un volumen aproximado de 20 mi y el polímero obtenido se precipita en un exceso de acetona (250 mi) a temperatura ambiente. El polímero se disuelve en 120 mi de agua destilada y se purifica mediante diálisis contra agua destilada durante 3 días utilizando una membrana Spectra/Por® Reacción de PVAm con MeOPEGA.54 mediante adición de Michael

MeOPEGA454 PVAm

En un matraz de una boca de 20 mi se disuelven 53,84 mg de PVAm (1,25 mmol) en 10 mi de 020. Tras disolver el polímero completamente el pO de la disolución (pO: 10,57) se ajusta a pO: 7,53 añadiendo OCI diluido (1:20 v/v OCI (c)/D20) gota a gota y con agitación. Sobre la disolución incolora y transparente se añaden 0,57 g de metoxipolietilenglicol acrilato MeOPEGA¡54 (Aldrich, Mn: 4540a, 1,25 mmol). Tras agitar durante 5 minutos a 10 temperatura ambiente se toma una muestra y se analiza mediante resonancia magnética nuclear de protón CHRMN) calculándose una conversión del 10%. La disolución se mantiene en agitación a temperatura ambiente tomando muestras a distintos tiempos y analizando el progreso de la reacción mediante 1H-RMN. Tras 20 horas (ver figura 3) se obtiene una conversión cercana al 27%. El FT-IR del sólido obtenido tras lavar la fase acuosa con 10 mi de diclorometano y evaporar en el rotavapor confirma que el producto obtenido corresponde al producto resultante

15 de la adición de tipo Michael de los grupos ami no del polímero con el acrilato (ver figura 4)

Ejemplo 5

Al contrario que en el ejemplo 3, en este ejemplo se ilustra el recubrimiento de nanopartículas dispersadas en agua con residuos hidrofílicos mediante adición de Michael y la obtención de suspensiones de nanopartículas estables a pH fisiológico (pH=7,4) mediante un proceso que incluye el recubrimiento de las partículas primero con un donor de

20 Michael y luego por reacción con un aceptor de Michael que contiene residuos hidrofílicos.

Purificación de PEGA20o . CH,=CHCO(OCH,CH,),OH

15 mi de polietilenglicol acrilato (Dajac Polymers, Mn:245 Da) previamente filtrado a través de placa porosa se

disuelven en 45 mi de agua destilada obteniéndose una disolución amarillenta. La fase acuosa se extrae con 5

fracciones de 30 mi de éter dietílico. La fase acuosa se extrae posteriormente con 2 fracciones de 60 mi de una

25 mezcla de diclorometano/n-hexano (3:1). Las fases orgánicas combinadas se filtran a través de papel de filtro y tras secar con sulfato de magnesio anhidro el disolvente es evaporado en rotavapor obteniéndose 5,56 g de un aceite de color amarillo oscuro.

Recubrimiento de nanopartículas con PVAm y PEGA200 mediante adición de Michael

e203 -------~,

8e203 [(NH2)CHCH,]x PVAm

8 FFa FFa@PVAm j CH2=CHCO(OCH2CH2),OH (PEGA2••)

8 y+z=x

[(NH2)CHCH2ly[(~~)CHCH2lz

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Sobre 10 mL de FFa sintetizada en el ejemplo 2 se añaden 32,3 mg de polivinilamina (PVAm, 0,75 mmol-NH2) con agitación. Tras disolver completamente el polímero se obtiene una dispersión de nanopartículas, que denominaremos ferrofluido FFa@PVAm, con pH: 2,62. Sobre esta dispersión se añaden 190 mg de PEGA200 previamente purificado (Mn:248; 0,77 mmol). El pH de la suspensión resultante se incrementa lentamente añadiendo gota a gota y con agitación una disolución de NaOH O,5M. Tras alcanzar un pH:6,89 la mezcla se ajusta a pH:7,35 añadiendo Na2 HP04 0,1 M. La suspensión se agita durante 30 minutos a temperatura ambiente y finalmente es sometida a ultrasonidos durante 4 minutos y se filtra a través de un filtro de membrana Millex®-GS MF (Millipore) de 0,22 I-lm, resultando una suspEirrEi transparente que denominaremos ferrofluido FFa@PVAm@PEGA. Las distribuciones de tamaños hidrodinámicos de las partículas medidas por DLS después de recubrirlas con PVAm y después de recubrirlas posteriormente con PEGA se muestran en la Fig. 5. Los diámetros hidrodinámicos son 33 nm y 43 nm. El aumento de tamaño con respecto al ferrofluido de partida (13 nm) indica la consecución del primer recubrimiento con PVAm y del segundo recubrimiento con PEGA por reacción de Michael.

Ejemplo 6

En este ejemplo se ilustra el recubrimiento de nanopartículas con residuos hidrofílicos, su funcionalización con tintes fluorescentes, sus propiedades superparamagnéticas, y su utilidad en estudios biomédicos, en particular en el seguimiento de procesos de endocitosis.

Síntesis de Metil-Fluoresceina (MeFluOH)

caaH

Ha

a Ha

MeFluOH

Sobre una suspensión de 25 g de Fluoresceína en 75 mi de metanol enfriada en baño de agua-hielo se añaden cuidadosamente 18,8 mi de acido sulfúrico concentrado. La disolución de color rojo oscuro se calienta a reflujo (100°C) durante 15 horas. La suspensión se enfría a temperatura ambiente y se añade sobre 25 mi de agua muy fría en un vaso de precipitados de 500 mI. Sobre la mezcla anterior y con fuerte agitación se añaden cuidadosamente 75 g de bicarbonato de sodio. La mezcla se filtra sobre placa porosa y el sólido obtenido se lava con 150 mi de agua destilada. El sólido se resuspende en 600 mi de una disolución acuosa de bicarbonato sódico (2% en peso), tras agitar durante 15 minutos se filtra sobre placa porosa y se lava con 150 mi de agua destilada. El proceso de lavado con bicarbonato/agua se repite de nuevo utilizando los mismos volúmenes. Finalmente el sólido

se resuspende en 300 mi de una disolución acuosa de acido acético (1%), tras agitar durante 15 minutos se recupera por filtración sobre placa porosa y el sólido obtenido se lava con 150 mi de agua. El sólido rojizo obtenido se seca en la estufa durante dos horas a 125 oC. Tras secar se obtienen 14,87 g de un sólido de color naranja (42,9 mmol). Rendimiento: 57%.

Síntesis de Metil Fluoresceína-Polietilenglicol acrilato (MeFluPEGA200)

CH2=CHCO(OCH2CH2)nOH (PEGA200)

DIADfTPPfTHF

OH

MeFluOH MeFluPEGA200

Sobre una suspensión de 3,46 9 MeFluOH (10 mmol) en 50 mi de tetrahidrofurano anhidro, se añaden bajo atmósfera de argón, 2.89 9 de trifenilfosfina TPP (11 mmol) y 2,75 9 de polietilenglicol acrilato PEGA200(-11mmol, Mn: 248,27 Da) previamente purificado por extracción. Tras enfriar la mezcla en baño de agua-hielo se añaden 2,3 mi de diisopropil-azodicarboxilato DIAD (11 mmol) gota a gota via jeringa bajo atmósfera de argón. Una vez terminada la adición y tras agitar a O°C durante 15-20 minutos se elimina el baño de agua-hielo y la mezcla se mantiene en agitación a temperatura ambiente. Después de 66 horas en agitación se añade sobre la mezcla 0,25 mi de agua destilada y tras agitar durante 25 minutos la mezcla se filtra sobre papel. El disolvente es eliminado en el rotavapor y el crudo obtenido se disuelve en 50 mi de diclorometano. La fase orgánica se lava sucesivamente con 3 fracciones de 25 mi de carbonato potásico 1M, 25 mi de una disolución saturada de cloruro de sodio, se filtra a través de papel, se seca sobre sulfato de magnesio anhidro y el disolvente es evaporado en el rotavapor. El crudo se purifica dos veces por disolución en un pequeño volumen de tetrahidrofurano (1 mi x g de crudo) y precipitación en un exceso de éter dietílico frío (25 mi x g de crudo). El producto se purifica por cromatografía presión sobre gel de sílice utilizando inicialmente acetato de etilo como eluyente y aumentando progresivamente la polaridad del eluyente hasta terminar con una mezcla de acetato de etilo/metanol (9,5:0,5). 2,40 9 de producto fueron obtenidos

Recubrimiento y funcionalización de nanopartículas con PVAm, PEGA200 y MeFluPEGA200 mediante adición de Michael

8 [(NH,)CHCH'h

PVAm

FFa FFa@PVAm

CH,=CHCO(OCH,CH,),OH (PEGA,oo)

CH,=CHCO(OCH,CH,),MeFlu (MeFluPEGA200 )

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[(NH,)CHCH,Iw(N,~)CHCH,~[(N,~)CHCH,[,

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Sobre 7,5 mi de FFa sintetizada en el ejemplo 2 se añaden 25,90 mg de polivinilamina (PVAm, 0,60 mmol-NH2) con agitación. Tras disolver completamente el polímero se añaden 111,60 mg de PEGA200 previamente purificado (Mn:248, 0,45 mmol) y 86,43 mg de MeFluPEGA200 (0,15 mmol, Mn:576,20 Da). El pH de la suspensión de nanopartículas resultante se incrementa lentamente añadiendo gota a gota y con agitación una disolución de NaOH 0,5M. Tras alcanzar un pH:8,32 la suspensión es sometida a ultrasonidos durante 4 minutos, se mantiene en agitación a temperatura ambiente durante 60 horas, se somete nuevamente a ultrasonidos durante 4 minutos y se ajusta a pH: 7,43 añadiendo Na2PH04 0,1 M. Finalmente la suspensión se filtra a través de un filtro de membrana Millex®-GS MF (Millipore) de 0,22 ~m para obtener una)ns~rente que denominaremos FFa@PVAm@MeFluPEGA. Imágenes de microscopía electrónica de transmisión de la suspensión resultante se muestran en la figura 6. Se observan agrupaciones de algunas decenas de partículas que se generan probablemente al ser encapsuladas por las moléculas de polímero polivinilamina. El diámetro medio de las nanopartículas de óxido de hierro es de 5,9 nm y la desviación estándar de ±1,3 nm. Un análisis por difracción de electrones produce patrones que son compatibles con la estructura de la maghemita (OFe203).

Propiedades superparamagnéticas del ferrofluido FFa@PVAm@MeFluPEG-A

La variación con la temperatura de la susceptibilidad magnética ac en un campo magnético alterno de la muestra resultante se midió en un susceptómetro SQUID de "Quantum Design" en comparación con la de la suspensión ácida de nanopartículas antes de recubrir. Los gráficos obtenidos se muestran en la figura 7. Se puede observar que en las dos suspensiones existen sendos picos, que varían con la frecuencia de alternancia del campo, en la susceptibilidad en fase, D', y fuera dela fase, D", que corresponden a un comportamiento superparamagnético. La temperatura del máximo a 117 Hz, habitualmente denominada como temperatura de bloqueo, es de 30 K en los dos casos, o sea que no varía en el proceso de recubrimiento. Esta temperatura de bloqueo se encuentra en el rango de lo esperado para partículas de su tamaño (5.9 nm). Sin embargo, se observa que con el recubrimiento el pico de susceptibilidad fuera de fase se hace más estrecho y más uniforme y la intensidad aumenta. Es decir que la suspensión de nanopartículas recubiertas posee unas propiedades superparamagnéticas mejoradas respecto a la original a la hora de su utilización en aplicaciones como la magnetotermia que dependen de la susceptibilidad fuera de fase.

Aplicación del ferrofluido FFa@PVAm@MeFluPEGAen estudios celulares

Se han realizado cultivos celulares de células de musculatura lisa de aorta de rata en presencia del ferrofluido multifuncional FFa@PVAm@MeFluPEGA. Las células se han observado mediante un microscopio de fluorescencia Axiovert 200M equipado con Apotome, que desarrolla la técnica de imagen estructurada, utilizando un objetivo 40x de inmersión en aceite. En estos experimentos se utilizan tintes con emisión azul para localizar los núcleos de las células y tintes Iysotracker (Molecular Probes-Invitrogen) para marcar la localización de los lisosomas. Se observa que las nanopartículas se pueden localizar fácilmente por su emisión de luz verde. De esta forma se ha conseguido seguir el proceso de internalización de las partículas en el citoplasma de las células y su introducción en los lisosomas. En la figura 8 se muestran imágenes de este proceso que originalmente se tomaron en color y que en la figura se han convertido en blanco y negro. La figura 8a corresponde a una célula en la que han penetrado una cantidad apreciable de nanopartículas que se distinguen como puntos brillantes que aparecen en verde en la imagen original en color. En la imagen siguiente (Fig. 8b) los puntos brillantes, en rojo en la imagen original, muestran la localización de los lisosomas en el citoplasma celular y en la siguiente (Fig. 8c) se muestra la imagen mezclada en la que los puntos brillantes, más intensos que en las imágenes anteriores y que aparecen con color amarillo-naranja en la imagen original, coinciden en localización con los de las imágenes anteriores y resultan de la mezcla de emisiones rojas y verdes con lo que se demuestra la penetración de las nanopartículas dentro de los lisosomas. La figura 9 muestra el gráfico de dispersión en el que se representa la emisión del canal 1, correspondiente a las nanopartículas, en el eje x y la emisión del canal 2, correspondiente a la emisión del marcador de lisosomas en el eje y. Como se puede apreciar en la imagen las dos emisiones muestran una superposición total lo que demuestra la colocalización de nanopartículas y lisosomas de forma inequívoca.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para la obtención de nanopartículas recubiertas y funcionalizadas mediante reacción de Michael que comprende las etapas:

a) reacción de al menos una nanopartícula con un reactivo que comprende un donador (8) o un aceptor

(C) de Michael, y

b) reacción del producto obtenido en (a) con un reactivo que comprende un aceptor (C) o donador (8) de Michael.

Si en la etapa (a) el reactivo es un donador (B) en la etapa (b) el reactivo es un aceptar (C) o viceversa.
2.

Procedimiento según la reivindicación 1, donde la nanopartícula se selecciona de entre metal, óxido de metal o cualquiera de sus combinaciones.
3.

Procedimiento según la reivindicación 2, donde el óxido de metal es un óxido de hierro.
4.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la nanopartícula tiene un tamaño de entre 1nm y 100nm.
5.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el reactivo de la etapa (a) además comprende un espaciador R1.
6.

Procedimiento según la reivindicación 5, donde R1 es un compuesto orgánico.
7.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el reactivo de la etapa (b) además comprende un espaciador R2.
8.

Procedimiento según la reivindicación 7, donde R2 es un compuesto orgánico que comprende grupos solvatables en un líquido.
9.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde el reactivo de la etapa (a) además comprende un grupo de unión (A) que se selecciona de entre un catión, un anión, precursor alcoxilano, tiol, alcohol, alcóxido, carboxilato, anhídrido carboxílico, fosfato, polielectrolito, imina, nitrilo, azida, amina, amida, fosfina o cualquiera de sus combinaciones.
10.

Procedimiento según la reivindicación 9, donde el anión se selecciona de entre un grupo carboxilato, sulfato, fosfato o cualquiera de sus combinaciones.
11.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde el reactivo donador de Michael (8) se selecciona de la lista que comprende: ~-dicetona, éster malónico, ~ -cetoéster, ~-cetonotrilo, nitro, amino, ácido malónico, enamina, amina primaria, amina secundaria, amina terciaria, imina, hidracina, guanadina, alcohol, tiol, fosfina, metileno, carbinol, oganometálico, haluro y cualquiera de sus combinaciones.
12.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde el reactivo aceptor de Michael (C) se selecciona de la lista que comprende: enón conjugado, carbonilo, ciano, carboxílico, carboxilato, sulfonilo, aldehído, éster, nitrilo, nitro insaturado, carboxilato, acrilato, acrilamida, metacrilato, metacrilamida, acrilonitrilo, vinilcetona, vinilsulfona y cualquiera de sus combinaciones.
13.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde el reactivo de la etapa (b) además comprende al menos un residuo orgánico o inorgánico (O) con funcionalidad física, química o biológica.
14.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde el residuo orgánico o inorgánico (O) con funcionalidad física se selecciona de entre fluoresceína, rodamina, complejo de tierra rara, puntos cuánticos o cualquiera de sus combinaciones.
15.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde el residuo orgánico o inorgánico (O) con funcionalidad química se selecciona de entre un catalizador o un absorbente.
16.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde el residuo orgánico o inorgánico (O) con funcionalidad biológica se selecciona de entre un compuesto con capacidad catalítica, con capacidad de reconocimiento, con capacidad curativa o cualquiera de sus combinaciones.
17.

Procedimiento según la reivindicación 16, donde el compuesto con capacidad catalítica es una enzima.
18.

Procedimiento según la reivindicación 16, donde el compuesto con capacidad de reconocimiento se selecciona de entre anticuerpos, oligonucleótidos o cualquiera de sus combinaciones.
19.

Procedimiento según la reivindicación 16, donde el compuesto con capacidad curativa es un fármaco.
20.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, donde las etapas (a) y/o (b) se llevan a cabo en condiciones de temperatura de entre 10 Y 70°C.
21.

Nanopartícula recubierta y funcional izada obtenible por el procedimiento descrito según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20.

5 22. Uso de las nanopartículas descritas según la reivindicación 21, para la fabricación de productos que se seleccionan de la lista que comprende: cosméticos, pinturas, tintes, catálisis, depuración de aguas y biomedicina.
23. Dispersión de las nanopartículas recubiertas y funcional izadas según la reivindicación 21, en un medio líquido.
24. Dispersión según la reivindicación 23, donde el medio líquido de dispersión se selecciona de entre acuoso, 10 orgánico o cualquiera de sus combinaciones.
25. Uso de la dispersión descrita según cualquiera de las reivindicaciones 23 ó 24, para la fabricación de productos que se seleccionan de la lista que comprende: cosméticos, pinturas, tintes, catálisis, depuración de aguas y biomedicina.

H,

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3,25 3,20 3,15 3,10

I I I I I I I I I I I I I

5,0 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 3,8 3,6 3,4 3,2 3,0 2,8 2,6

Fig.2 25 20

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Fig.7

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Fig.8

Fig 8a

Fig 8b

Fig 8e

Rojo

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Verde 488