CN107722200B - 多重刺激响应的Fe3O4接枝共聚物杂合体及其制备方法和应用 - Google Patents

多重刺激响应的Fe3O4接枝共聚物杂合体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多重刺激响应的Fe3O4接枝共聚物杂合体及其制备方法和应用。本发明杂合体由磁响应的Fe3O4、pH敏感的聚丙烯酸及氧化还原敏感的聚甲基丙烯酸二茂铁甲酰氧乙酯组成。其制备过程涉及Fe3O4表面链转移剂的引入，最后通过两步连续的可逆加成‑断裂链转移聚合将聚丙烯酸及聚甲基丙烯酸二茂铁甲酰氧乙酯接枝到Fe3O4表面，得到Fe3O4接枝丙烯酸‑甲基丙烯酸二茂铁甲酰氧乙酯嵌段共聚物杂合体。本发明杂化体可在水中自组装为球形核‑壳胶束，表现出磁、pH及氧化还原刺激响应性；并对抗癌药物紫杉醇表现出多重刺激响应的释放特性，可作为疏水药物的载体用于癌症的靶向治疗。

Description

多重刺激响应的Fe3O4接枝共聚物杂合体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医用高分子材料技术领域，具体涉及到一种多重刺激响应的Fe3O4接枝丙烯酸-甲基丙烯酸二茂铁甲酰氧乙酯嵌段共聚物杂合体及其制备方法和在药物控制释放中的应用。
背景技术
刺激响应性药物输送***(DDS)是一类功能性纳米药物输送***。作为药物释放的载体，刺激响应性嵌段共聚物胶束由于其独特的性质和广泛的生物医学纳米技术应用而引起广泛的关注。这种药物释放载体可以通过体内/体外一些特殊生物环境刺激载体的结构、构象和构型的改变，或者受到物理或化学因素如光、温度、pH、超声波、机械应力、还原/氧化、酶、离子、葡萄糖、磁场、溶剂、电压和电化学而迅速输送药物。刺激反应性DDS具有减少或避免药物过早释放的优点，能够提高药物在目标区域的释放效率。到目前为止，对外界环境因素敏感的刺激响应性药物载体材料已成为靶向制剂研究的热点。然而，大多数研究者研究的是单一刺激反应型药物输送***。通常，肿瘤微环境和/或病理环境中的刺激因子不是单次刺激的结果，而是包括pH、温度、还原物质、酶浓度、活性氧(ROS)和腺苷-5'-三磷酸(ATP)。因此，单一刺激响应药物载体不能很好地适应生命***复杂的功能和环境，容易遭受低释放准确度和一些副作用的问题，而且不能达到最佳的治疗效率和满足整体治疗的要求。尽管已经做出了一些努力来开发双重刺激反应性药物释放***，例如温度/pH、磁场/pH、光/温度、磁场/温度双重刺激反应性DDS，治疗疗效仍然有限，并且在癌症微环境中更精确的药物释放仍有待改进。因此，设计和开发具有多种刺激反应性的新型(聚合物)材料仍然是一项具有挑战性和重要性的任务。
多种刺激响应(聚合物)材料作为一种新型的“智能”材料，拥有传感、信息处理和执行功能，能在微小环境刺激触发时显示出更显著的物理化学性质。由于其独特的特性，广泛应用于药物输送、诊断、组织工程、“智能”光学***、生物传感器、微机电***(MEMS)、涂层和纺织品等领域。特别是多刺激响应智能材料通过在DDS中并入三个或更多的刺激响应元件，提供了抗癌药物输送的良好载体平台，具有独特的优势和巨大的发展潜力。因此，可以对多种刺激的特定变化作出反应的新材料的制备对于获得更好的药物控制释放特征和获得更好的治疗效果和更***的释放动力学是非常有益的。多重刺激响应智能材料包括水凝胶、磁性纳米颗粒和/或微球、嵌段共聚物和有机-无机杂化物等。其中，氧化还原电位、pH、温度、酶、ATP、光学和磁响应智能材料尤为有吸引力，因为更多的参数可以实现更多的功能和更好的调制。通过引入或组合各种响应部分，即通过组合具有pH、温度、电、光和磁响应等的单体单元，可以获得多刺激响应聚合物材料。然而，文献中很少有信息是研究具有多刺激反应性的材料，特别是多种刺激反应性微胶束。吴等(Wu,G.；Chen,S.C.；Liu,C.L.；Wang,Y.Z.Direct aqueous self-assembly of an amphiphilic diblock copolymertoward multistimuli-responsive fluorescent anisotropic micelles.ACS Nano2015,9,4649–4659)报道了聚合酸与低聚苯胺，三苯胺和氟基团的多重刺激响应荧光行为。严等(Yan,Y.；Sun,N.；Li,F.；Jia,X.；Wang,C.；Chao,D. Multiple stimuli-responsivefluorescence behavior of novel polymeric acid bearing oligoaniline,triphenylamine and fluorine groups.ACS Appl.Mater.Interfaces 2017,9, 6497–6503.)研究了两亲二嵌段共聚物自组装多分子响应荧光各向异性胶束。几位研究人员报道了微胶囊的形成，并检查了对温度和光线的响应，以及链长对胶束形成性能的影响，改善了难溶性药物的口服吸收问题。
肿瘤细胞通常表现出各种微环境。据报道，肿瘤血管的异质结构和分布可能导致肿瘤内循环的独特特征，例如与正常细胞相比，具有相对较高的温度(>37℃)，相对较低的pH(5.8～7.1)和高ROS含量。这些肿瘤细胞外的微环境提供了增加肿瘤选择性和更有效地通过协同效应输送药物的新策略。磁性氧化铁纳米粒子广泛应用于生物医学领域，作为主要药剂和磁性靶向试剂，可以通过与磁性氧化铁纳米颗粒表面上的各种靶向部分缀合来实现多重功能，因此可以开发出高度理想的多重刺激响应(聚合物)材料。
针对以上问题，设计和合成多重刺激响应的(聚合物)材料以调节物理化学性质和组装的微胶束的药物释放行为，适应各种微环境变化的需求，以最大限度地增加病变或癌症位置处药物的释放量，从而提高药物的生物利用度和靶向药物释放效率，对于精确地打开和关闭包封的客体药物分子的释放将是非常必要和有意义的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服现有嵌段共聚物胶束单一响应性的不足，不能很好地满足人体内癌变部位复杂的环境，充分有效地利用病变环境，从而最大限度地发挥药物载体的优势，实现药物释放动力学的最优化。
为解决上述问题，本发明提供了一种具有氧化还原、pH及磁响应的多重刺激物响应性的Fe3O4接枝丙烯酸-甲基丙烯酸二茂铁甲酰氧乙酯嵌段共聚物杂合体。本发明杂合体材料可通过外磁场的引导作用，使药物通过磁靶向载体定向在癌症病变部位，并利用癌症部位高的活性氧物种浓度及pH<7.2(4.8-7.2)的弱酸性环境，最大限度地将药物释放在癌变部位，减少毒副作用，达到最佳靶向效果。
本发明所要解决的另一个技术问题在于为上述多重刺激物响应性的Fe3O4接枝丙烯酸-甲基丙烯酸二茂铁甲酰氧乙酯嵌段共聚物杂合体材料提供一种制备方法。
解决上述技术问题所采用的多重刺激物响应性的Fe3O4接枝丙烯酸-甲基丙烯酸二茂铁甲酰氧乙酯嵌段共聚物杂合体的结构如下所示：
式中m的取值为60～150，n的取值为35～140。
上述多重刺激响应的Fe3O4接枝丙烯酸-甲基丙烯酸二茂铁甲酰氧乙酯嵌段共聚物杂合体的反应流程及制备方法如下：
1、制备Fe3O4表面可逆加成-断裂链转移聚合链转移剂
以二氯甲烷为溶剂、1-羟基苯并***(HOBT)为酰胺基保护剂、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)为脱水剂，利用酰胺化反应将4-氰基 -4-(硫代苯甲酸)戊酸(CPADB)键合到胺基化Fe3O4表面，得到式Ⅰ所示的Fe3O4表面可逆加成-断裂链转移聚合链转移剂(Fe3O4@CPADB)。
2、表面RAFT聚合合成Fe3O4接枝聚丙烯酸杂合体
以1,4-二氧六环为溶剂、丙烯酸(AA)为单体、Fe3O4@CPADB为链转移剂、偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，在无水无氧、氮气保护条件下70～80℃反应 16～36小时，得到式Ⅱ所示的Fe3O4接枝聚丙烯酸杂合体(Fe3O4-g-PAA)。
3、表面RAFT聚合合成多重刺激响应的Fe3O4接枝丙烯酸-甲基丙烯酸二茂铁甲酰氧乙酯嵌段共聚物杂合体
以1,4-二氧六环为溶剂、甲基丙烯酸二茂铁甲酰氧乙酯(MAEFC)为单体、 AIBN为引发剂、Fe3O4-g-PAA为大分子链转移剂，在无水无氧、氮气保护条件下 70～80℃反应16～36小时，将MAEFC接枝聚合到Fe3O4表面，得到多重刺激响应的Fe3O4接枝丙烯酸-甲基丙烯酸二茂铁甲酰氧乙酯嵌段共聚物杂合体 (Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC)。
上述步骤2中，优选Fe3O4@CPADB、AIBN、AA的摩尔比为1:0.25:75～150。
上述步骤3中，优选Fe3O4-g-PAA、AIBN、MAEFC的摩尔比为1:0.25:50～200。
本发明Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC作为抗癌药物紫杉醇药物载体的应用，其具体使用方法如下：
将Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC、紫杉醇按质量比为10:1完全溶解于N,N-二甲基甲酰胺溶剂中，所得溶液装入截留分子量为2000Da的透析袋中，置于去离子水或 pH为7.4的PBS缓冲溶液中透析，离心分离除去未包覆的药物，然后将承载药物的聚合物杂合体胶束冷冻干燥，得到包覆紫杉醇的多重刺激响应的共聚物杂合体药物制剂。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的效果：
1、本发明Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC在水溶液中可形成高Zeta电位及高稳定性的胶束，具有敏感的pH响应性，pH相转变点在4.75～5.35。
2、本发明Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC中的二茂铁链段可以实现氧化态与还原态 (Fc+-Fc)的相互转化。因此，形成的胶束具有明显的氧化还原响应性及氧化还原的可逆性。
3、本发明Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC具有良好的超顺磁性。当有外加磁场时，共聚物杂合体胶束能与反应介质快速分离；而外加磁场消失时，通过简单的振动又能使磁性粒子重新得到分散。这种磁效应能使共聚物杂合体胶束在磁靶向治疗方面有很好的应用价值。
4、本发明Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC可用于包覆抗癌药物紫杉醇。在酸性微环境及一定浓度的H2O2刺激下，药物累积释放量远远高于单一刺激条件下的药物释放量，表现出优异的协同效应。因此，本发明Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC作为药物载体可以有效地实现对癌变病灶快速、高效、定点靶向释放。
5、本发明Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC除可用做药物控释载体外，还可用于磁分离、催化、磁共振成像、生物技术、生物医药等领域，是一种重要的多功能材料。
附图说明
图1是磁性Fe3O4纳米粒子(a)、胺基化Fe3O4(b)、Fe3O4@CPADB(c)、实施例1制备的Fe3O4-g-PAA(d)和Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC(e)的红外光谱图。
图2是实施例1制备的Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC的核磁共振氢谱图。
图3是磁性Fe3O4纳米粒子(a)、胺基化Fe3O4(b)、实施例1制备的 Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC(c)的XRD图谱。
图4是实施例1和4的Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC形成的胶束在不同pH值溶液中zeta电位值的变化。
图5是磁性纳米Fe3O4、实施例1～4制备的Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC的磁滞回线。
图6是实施例1～4制备的Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC的电化学行为(扫描速率： 0.01Vs-1)。
图7是实施例4制备的Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC在不同扫描速率下的电化学行为(溶液浓度：2mg mL-1扫描范围0.01～0.05V s-1，支持电解液浓度： (CH3CH2CH2CH2)4N(PF6)/THF(0.1M))，其中插图为电流值与扫描速率开方值υ1/2线性曲线。
图8是实施例2和4制备的Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC的紫外吸收光谱图。
图9是实施例4制备的Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC在H2O2浓度为0.0、1.8、3.6、 5.9wt％以及经5.9wt％H2O2氧化接着被抗坏血酸还原后的共聚物杂合体溶液的紫外吸收光谱。
图10是实施例4制备的Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC形成的胶束(a)以及该胶束被H2O2完全氧化(b)和该胶束被H2O2完全氧化后再被抗坏血酸还原(c)的透射电镜图。
图11是实施例4制备的Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC形成的胶束(a)以及该胶束被H2O2完全氧化(b)和该胶束被H2O2完全氧化后再被抗坏血酸还原(c)的扫描电镜图。
图12是以实施例3制备的Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC为载体包覆抗癌药物紫杉醇后得到的药物制剂在模拟的体内微环境下的药物释放曲线(温度37℃)：(a)pH 7.4，(b)pH 6.3，(c)pH 5.3，(d)pH 5.3和0.2％H2O2，(e)pH 5.3和0.8％H2O2。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
1、制备Fe3O4表面可逆加成-断裂链转移聚合链转移剂
按文献【Ding,Y.L.,等Mater.Sci.Eng.C.48,487-498(2015)】方法制得粉末状磁性Fe3O4纳米粒子，再按文献【Makhluf,S.B.,等Small 4,1453–1458(2008)】方法对粉末状磁性Fe3O4纳米粒子进行表面改性以引入氨基，得到胺基化Fe3O4纳米粒子(氨基含量为18.25mmol·g-1)。将胺基化Fe3O4纳米粒子(0.0105g，0.1916mmol) 超声分散于25mL干燥的二氯甲烷中，将CPADB(100mg，0.3579mmol)和HOBT (0.0394g，0.2915mmol)溶解于25mL干燥的二氯甲烷中，然后将两种溶液混合后转移到150mL三口烧瓶中，在氮气保护下，1000rpm转速机械搅拌20min。接着将EDC·HCl(0.1608g，0.8388mmol)溶解于10mL干燥的二氯甲烷后，逐滴加到上述混合溶液中，保持氮气氛围，机械搅拌，室温反应48h。反应结束后，用无水乙醇和去离子水交替冲洗至上层清液呈中性，40℃恒温真空干燥，得到粉末状 Fe3O4@CPADB。
2、表面RAFT聚合合成Fe3O4接枝聚丙烯酸杂合体
将Fe3O4@CPADB(0.0262g，0.192mmol)、AA(0.986mL，14.3718mmol)、 AIBN(0.0078g，0.0479mmol)溶于盛有8mL 1,4-二氧六环的50mL史莱克瓶中，在密闭体系中进行3次“冷冻-抽真空-解冻”循环处理确保将体系氧气和水分除尽，然后升温至80℃，在氮气氛围下反应24h。粗产物在无水***中反复沉淀5 次，将纯化产物冷冻干燥，得到固体粉末状Fe3O4-g-PAA，收率86％。经核磁估算和凝胶渗透色谱得数均分子量分别为4900和8640，记为Fe3O4-g-PAA68。
3、表面RAFT聚合合成多重刺激响应的Fe3O4接枝丙烯酸-甲基丙烯酸二茂铁甲酰氧乙酯嵌段共聚物杂合体
将Fe3O4-g-PAA68(0.04039g，2.02×10-5mol)充分溶解于2mL去离子水中，并将MAEFC(0.3448g，1mmol)、AIBN(0.0008g，4.87×10-3mmol)溶于8mL 1,4- 二氧六环中，将两种溶液充分混合后转移到史莱瓶中，将该史莱克瓶在密闭体系中进行3次“冷冻-抽真空-解冻”循环处理确保将氧气和水分除尽，然后升温至 80℃，在氮气氛围下反应24h。粗产物在正己烷中反复沉淀5次，冷冻干燥，得到固体粉末状Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC，收率86％。经核磁估算和凝胶渗透色谱测定得数均分子量分别为18270和22030，记为Fe3O4-g-PAA68-b-PMAEFC39或P2。
实施例2
在实施例1的步骤3中，将Fe3O4-g-PAA68(0.04039g，2.02×10-5mol)充分溶解于2mL去离子水中，并将MAEFC(0.6896g，2mmol)、AIBN(0.0008g，4.87×10-3 mmol)，其他步骤与实施例1相同，得到粉末状Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC，收率85％。经核磁估算和凝胶渗透色谱测得数均分子量分别为30560和37120，记为 Fe3O4-g-PAA68-b-PMAEFC75或P1。
实施例3
在实施例1的步骤2中，将Fe3O4@CPADB(0.0262g，0.192mmol)、AA(1.972 mL，28.7436mmol)、AIBN(0.0078g，0.0479mmol)溶于盛有8mL 1,4-二氧六环的50mL史莱克瓶中，其他步骤与实施例1相同，制得固体粉末状Fe3O4-g-PAA，收率86％，经核磁估算和凝胶渗透色谱测得数均分子量分别为9360和21620，记为Fe3O4-g-PAA130。接着，再按照实施例1步骤3的方法，将Fe3O4-g-PAA130(0.04039 g，2.02×10-5mol)充分溶解于2mL去离子水中，并将MAEFC(0.6896g，2mmol)、 AIBN(0.0008g，4.87×10-3mmol)，其他步骤与实施例1相同，得到Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC，收率86％。经核磁估算和凝胶渗透色谱测得数均分子量分别为36840和44700，记为Fe3O4-g-PAA130-b-PMAEFC80或P4。
实施例4
在实施例3的步骤3中，将Fe3O4-g-PAA130(0.04039g，2.02×10-5mol)充分溶解于2mL去离子水中，并将MAEFC(1.3792g，4mmol)、AIBN(0.0008g，4.87×10-3 mmol)，其他步骤与实施例3相同，得到粉末状Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC，收率86％。经核磁估算和凝胶渗透色谱测得数均分子量分别为56580和57290，记为 Fe3O4-g-PAA130-b-PMAEFC138或P3。
将上述实施例1制备的Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC用FTIR、NMR、XRD进行结构表征和确认，结果如图1～3所示。由图可见，Fe3O4和胺基化Fe3O4在2θ为18.33、 30.05、35.60、42.95、45.47、56.95、62.60和74.01°处显示特征XRD衍射峰，对应于[110]、[220]、[311]、[400]、[422]、[511]、[440]和[533]晶面。这与具有规则八面体立方尖晶石结构的结晶磁铁矿(JCPDS***85-1436或PDF#19-0629)的标准 XRD衍射图谱很好地对应一致。Fe3O4和胺基化Fe3O4的平均晶粒尺寸(D)根据 Scherrer公式(D＝Kλ/(βcosθ))计算分别为10.5nm和15.9nm。
发明人分别将50mg实施例1～4制备的Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC溶解于5mL DMF中，在搅拌条件下，滴加去离子水直到出现乳白色，即形成共聚物杂合体胶束，继续搅拌12小时，然后用1000mL去离子水室温透析48小时，透析袋截留分子量为2000，开始3小时每小时更换一次去离子水，然后每8小时更换一次去离子水，以除去DMF。采用Perkin Elmer LS55型荧光分光光度计(激发和发射波长分别为339和394nm，狭缝宽度为10nm)测试共聚物杂合体胶束的临界胶束浓度 (CMC)；采用美国装配有氩离子激光器的BI-90Plus型动态光散射仪测定在室温下胶束的流体力学直径(Dh)(波长660nm，偏转角90°，输出功率15mW)；采用美国贝克曼库尔特公司Delsa Nano S型激光粒度zeta电位分析仪分析胶束表面电荷，测试结果见表1。
表1 共聚物杂合体胶束的理化参数
采用动态光散射仪测量实施例1和4对应胶束相应pH值下的zeta电位变化(ξ) 以研究pH响应，结果如图4所示。显然注意到，由于羧基的质子化和-COOH基团之间的氢键相互作用的形成，在pH＝4.46(PAA的pKa)以下ξ几乎不变。随着pH 增加(>PAA的pKa)，PAA部分开始部分离子化，氢键逐渐被破坏。因此，ξ绝对值(除非另有说明，以下ξ是指绝对值)突然增加。羧基的去质子化或分解导致大量羧酸阴离子的形成，因此在微胶粒表面上出现大量的负电荷。当P2的pH值高于 6.03或P3(>PAA的pKa)为5.48时，丙烯酸链完全电离，并且几乎完全拉伸，负电荷充满胶束表面。结果，ξ值达到最大值(P2为-113.4mV，P3为-135mV)。这意味着所制备的共聚物杂合体胶束具有优异的pH敏感性。由图5发现，P2的pH相转变点约为5.21，P3为4.94，略高于PAA部分的pKa。P2和P3之间的ξ值和pH相变点的差异是由于在P3上接枝更多PAA链。氢键的分离和多个-COO-基团的电离分布在外层(胶束壳)。因此，P3比P2具有更高的ξ。pH＝5.21和/或4.94时高的ξ表明在模拟生理环境中胶束高的稳定性。同样，发现P1和P4具有相似的pH响应性，并且pH转变点分别约为4.75和5.35。pH诱导的响应性也可以通过DLS测定的Dh变化来证实，如表1所示。显然，对于所有制备的共聚物杂合体，pH值为4.8的 Dh值大于pH值为7.4时的Dh值，这可能是由于pH为4.8的PBS缓冲液中，质子化的羧基之间的氢键引起的胶束聚集。这将导致小的ξ电位，这与上述讨论是一致的。相比之下，在pH＝7.4的PBS缓冲液中，由于具有大比表面积的Fe3O4纳米粒子，大量的-COO-离子散布在小尺寸胶束表面上，导致相当高的ξ电位。pH响应提供了药物控制释放的新选择。
采用振动样品磁强计(VSM，300K)对实施例1～4的共聚物杂合体粉末样品进行了磁滞回线的测定。由图5可知，具有铁磁性的共聚物杂合体样品P1、P2、P3、 P4的饱和磁化强度(Ms)值依次为1.95emu g-1、4.71emu g-1、0.42emu g-1和3.08emu g-1，而纯Fe3O4的饱和磁化强度值为58.14emu g-1。很明显，这些共聚物杂合体P1、 P2、P3、P4的磁性能数据很好地说明它们具备软磁性材料的显著特征，具有良好的超顺磁性。因此，可以利用共聚物杂合体的这一特性达到与反应介质快速分离的效果；而当外加磁场消失时，通过简单的振动磁性粒子能够重新得到分散，这种磁响应性材料在磁靶向治疗领域有很好的应用价值。
用电化学工作站研究了实施例1～4的Fe3O4接枝丙烯酸-甲基丙烯酸二茂铁甲酰氧乙酯嵌段共聚物杂合体的氧化还原性。图6是聚合物P1、P2、P3、P4的循环伏安曲线(CV)。P1和P2、P3和P4的阳极氧化电位Ep依次为0.813、0.800、0.871和0.829V，通过比较P1和P2，P3和P4，以及P2和P3的阳极电位Ep可以推知， MAEFC/AA组成比的提高导致高的阳极氧化电位。在电化学循环伏安曲线中氧化电势和还原电势的移动是由于双亲嵌段聚合物中二茂铁反应端的存在，而不是因为溶剂和扩散系数的影响。Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC中高接枝量的二茂铁链段具有较低的氧化还原电势，聚合物当中二茂铁链段容易由还原态Fc到氧化态Fc+。同时，Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC中二茂铁含量越低，电极过程的可逆性越好(P1、P2、P3和P4阴阳极电势差值ΔEp(ΔEp＝Ep,阳极-Ep,阴极)依次为0.264、0.244、0.425和0.203 V)。
以实施例4中共聚物杂合体P3为模型研究不同扫描速率下循环伏安曲线的变化规律。由图7可知，扫描速率越快，氧化和还原峰值分别向阳极和阴极偏移，致使阴阳极电势差值ΔEp值越大，且改性电极的ΔEp值随着扫描速率提高线性增加，说明电极过程是准可逆的。此外发现，氧化还原峰电流值随扫描速率(v1/2)提高而线性增加，峰电流强度(Ip)与扫描速率的平方根(v1/2)呈现良好的线性关系，线性关系方程为：Ip,c＝-1.4453ν1/2+0.5748(R2＝0.9761)和Ip,a＝1.2546ν1/2+0.7655(R2＝0.9945)，这表明共聚物杂合体的氧化还原电化学过程是一个准可逆的扩散控制过程。
进一步用紫外-可见光谱(UV-vis)研究了实施例2和4制备的 Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC可逆性的氧化还原响应性，如图8和图9所示。由图8可见，由于二茂铁基团的特殊π-π共轭结构，共聚物杂合体P3在波长为442nm、349 nm、308nm处出现还原态二茂铁母体的特征峰；峰强度随着二茂铁含量或 MAEFC/AA组成比的变化而改变。经不同浓度氧化剂H2O2氧化后，二茂铁由还原态的中性Fc转变为氧化态的二茂铁盐阳离子母体Fc+，这些特征的电子谱减弱或消失，如图9所示。而当在上述溶液中加入还原剂抗坏血酸(Vc)时，Fc+阳离子转变为中性态的Fc，实现了还原态-氧化态(Fc-Fc+)与氧化态-还原态(Fc+-Fc)的相互转换过程。因此，Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC的氧化还原过程是可逆的，可以实现可逆的“智能型”开-关过程。
采用透射电子显微镜(TEM)对不同氧化还原状态下实施例4制备Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC形成的胶束的形貌进行表征，结果见图10。由图10(a) 可见，胶束呈良好的球形核壳结构，粒径分布在160～400nm之间，平均粒径为266 nm。由图10(b)可知，H2O2氧化的胶束平均粒径为420±30nm。这可能是胶束壳层结构中由中性的Cp2Fe转变为阳离子型Cp2Fe+，增强了疏水链段二茂铁盐胶束溶液溶胀能力，同时内壳阳离子型Cp2Fe+离子间强的静电排斥作用使胶束粒径增大。 H2O2是中性氧化剂，可以有效地将内壳中疏水性二茂铁基团(Cp2)转变为亲水性阳离子二茂铁盐(Cp2Fe+)，提高胶束内核PMAEFC静电排斥力、亲水性和溶胀性。当加入还原剂抗坏血酸Vc时，胶束内壳PMAEFC由阳离子Cp2Fe+转变为中性分子 Cp2Fe。此时，胶束内壳亲水性和静电排斥力减弱直至消失，图10(c)所示还原态纳米微胶束粒径缩减为260±70nm，与原胶束溶液粒径基本一致。通过TEM测定结果表明Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC胶束具有良好的氧化还原可逆性。
采用冷场发射扫描电子显微镜(FESEM)观察了各种氧化还原状态下实施例4 制备的Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC形成的胶束的微观形貌变化，如图11所示。由图 11(a)可见，未氧化的原始胶束颗粒呈球形，平均粒径分布宽，粒径范围为150～ 370nm，大部分为340～350nm。在氧化的胶束球体表面出现明显的不规则的生长，大部分胶束的尺寸扩大到约520nm，尺寸范围为480～700nm，但粒径分布变得更均匀，如图11(b)所示。这是因为在PMAEFC结构中形成亲水性二茂铁阳离子(Fc+)，增强了胶束核的溶胀和静电排斥。加入抗坏血酸还原剂后胶束的形态与氧化后的形态没有显着差异，但粒径减小，如图11(c)粒径降低到约250～450nm，平均尺寸约为350nm，接近原始的胶束尺寸和尺寸分布。从氧化还原前后胶束的形态和尺寸改变得出结论，本发明共聚物杂合体胶束具有良好的可逆的氧化还原应激反应或开关性质。
实施例5
实施例3制备的Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC作为抗癌药物紫杉醇药物载体的应用，其具体使用方法如下：
首先称取P4样品20mg和紫杉醇(PTX)2mg充分溶解于5mL DMF中，所得溶液装入截留分子量为2000Da的透析袋中，置于去离子水中透析24h，然后低速离心除去未包封的药物，将承载药物的聚合物杂合体胶束冷冻干燥，得到包覆紫杉醇的多重刺激响应的共聚物杂合体药物制剂。
对得到的包覆紫杉醇的多重刺激响应的共聚物杂合体药物制剂进行体外药物释放试验，具体试验方法及测试结果如下：
1、药物包封试验
将包覆紫杉醇的多重刺激响应的共聚物杂合体药物制剂完全溶解于DMF中，采用日本日立公司型号为U-3900/3900H的紫外可见光谱仪测定其在固定吸收波长 228nm下的吸光度，按下述公式计算药物装载量(LC)和包封效率(EE)：
LC(wt％)＝(药物制剂中药物的质量/药物制剂的质量)×100％
EE(wt％)＝(药物制剂中药物的质量/加入的药物质量)×100％
通过测定不同浓度的游离药物在DMF中的吸光度，绘制校准曲线。 Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC形成的胶束对PTX的包覆效率(EE)和载药能力(LC) 分别为42.8％和10.7％。
2、体外药物释放实验
将包覆紫杉醇的多重刺激响应的共聚物杂合体药物制剂3mg溶解于3mL特定条件下的PBS缓冲液中：(a)pH 7.4、(b)pH 6.3、(c)pH 5.3、(d)pH 5.3和0.2％ H2O2、(e)pH 5.3和0.8％H2O2，充分溶解后将其置于截留分子量为2000Da的透析袋中，模拟37℃不同pH值和不同浓度活性氧(ROS)的癌变细胞环境下药物释放。间隔一定时间从释放体系中取3mL溶液转移到样品管，并补充等量的新鲜缓冲液，释放时间为4天。通过紫外-可见分光光度计(UV-vis)测定样品溶液在波长210nm处的吸光度值，并按下式计算释放量：
累积药物释放％＝Mt/M0×100％
式中Mt为时间t时的药物释放量，M0为药物制剂中的药物量。结果见图12。
由图12可知，在氧化还原和pH环境中，药物制剂的药物释放量明显提高。由图12(a)-(c)可见，在pH 7.4条件下持续释放72h，PTX释放量只有7.8％。然而，在pH 5.3和pH6.3条件下，PTX释放量分别为34.1％和26.2％，PTX药物释放速率随着pH值降低而加快，因此，药物制剂具有良好的pH响应性。单一pH响应性药物释放率较低，然而当加入氧化剂H2O2后，PTX药物释放量随着H2O2双氧水浓度增大而显著提高，这一结果由图12(c)-(e)可以看出。在持续释放72h，氧化剂H2O2浓度为0.2％、0.8％时，药物累积释放量依次为52.8％和72.7％。对比可知，双刺激诱导的药物释放量远远高于单一刺激条件下药物释放量。因此，本发明Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC作为抗癌药物紫杉醇药物载体可以有效地实现药物可控释放，从而可以实现对癌变病灶快速、高效的定点释放。癌变病灶与正常细胞在 pH微环境和氧自由基H2O2浓度存在较大差异。
综合上述试验结果可见，在pH、氧化还原和磁三重刺激响应性，以本发明 Fe3O4-g-PAA-b-PMAEFC作为抗癌药物紫杉醇药物载体，可以最大限度实现可控高效药物释放。

Claims (5)

1.一种多重刺激响应的Fe3O4接枝丙烯酸-甲基丙烯酸二茂铁甲酰氧乙酯嵌段共聚物杂合体，其特征在于该杂合体的结构如下所示：
式中m的取值为60～150，n的取值为35～140。
2.一种权利要求1所述多重刺激响应的Fe3O4接枝丙烯酸-甲基丙烯酸二茂铁甲酰氧乙酯嵌段共聚物杂合体的制备方法，其特征在于它由下述步骤组成：
(1)制备Fe3O4表面可逆加成-断裂链转移聚合链转移剂
以二氯甲烷为溶剂、1-羟基苯并***为酰胺基保护剂、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐为脱水剂，利用酰胺化反应将4-氰基-4-(硫代苯甲酸)戊酸键合到胺基化Fe3O4表面，得到式Ⅰ所示的Fe3O4表面可逆加成-断裂链转移聚合链转移剂；
(2)表面RAFT聚合合成Fe3O4接枝聚丙烯酸杂合体
以1,4-二氧六环为溶剂、丙烯酸为单体、Fe3O4表面可逆加成-断裂链转移聚合链转移剂为链转移剂、偶氮二异丁腈为引发剂，在无水无氧、氮气保护条件下70～80℃反应16～36小时，得到式Ⅱ所示的Fe3O4接枝聚丙烯酸杂合体；
(3)表面RAFT聚合合成多重刺激响应的Fe3O4接枝丙烯酸-甲基丙烯酸二茂铁甲酰氧乙酯嵌段共聚物杂合体
以1,4-二氧六环为溶剂、甲基丙烯酸二茂铁甲酰氧乙酯为单体、偶氮二异丁腈为引发剂、Fe3O4接枝聚丙烯酸杂合体为大分子链转移剂，在无水无氧、氮气保护条件下70～80℃反应16～36小时，将甲基丙烯酸二茂铁甲酰氧乙酯接枝聚合到Fe3O4表面，得到多重刺激响应的Fe3O4接枝丙烯酸-甲基丙烯酸二茂铁甲酰氧乙酯嵌段共聚物杂合体。
3.根据权利要求2所述的多重刺激响应的Fe3O4接枝丙烯酸-甲基丙烯酸二茂铁甲酰氧乙酯嵌段共聚物杂合体的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述Fe3O4表面可逆加成-断裂链转移聚合链转移剂、偶氮二异丁腈、丙烯酸的摩尔比为1:0.25:75～150。
4.根据权利要求2所述的多重刺激响应的Fe3O4接枝丙烯酸-甲基丙烯酸二茂铁甲酰氧乙酯嵌段共聚物杂合体的制备方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述Fe3O4接枝聚丙烯酸杂合体、偶氮二异丁腈、甲基丙烯酸二茂铁甲酰氧乙酯的摩尔比为1:0.25:50～200。
5.根据权利要求1所述的多重刺激响应的Fe3O4接枝丙烯酸-甲基丙烯酸二茂铁甲酰氧乙酯嵌段共聚物杂合体作为抗癌药物紫杉醇药物载体的应用。
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