ES2378918T3 - Composición de liberación sostenida que contiene SDF-1 - Google Patents

Abstract

Una composición de liberación sostenida que contiene (1) SDF-1 y (2) un hidrogel que contiene gelatina modificada que tiene un grupo carboxilo y/o un grupo sulfo.

Description

Composición de liberación sostenida que contiene SDF-1

5 Campo técnico

La presente invención se refiere a una composición de liberación sostenida que contiene SDF-1 que es un tipo de quimoquina. Más específicamente, la presente invención se refiere a una composición de liberación sostenida que contiene SDF-1 y un hidrogel de gelatina succinada o un hidrogel de gelatina sulfoacetilada.

Antecedentes de la técnica

El SDF-1 (factor-1 obtenido de células estromales) es una proteína que pertenece a una familia de quimoquina CXC que contiene 4 restos de cisteína conservados y se reconoce que tiene una pluralidad de isoformas incluyendo a, β y

15 γ. Desde 1993 hasta 1994, se descubrió SDF-1 como una proteína secretora novedosa producida por células estromales de la médula ósea y adicionalmente como una proteína que tiene una función promotora del crecimiento de clones de células progenitoras linfoides-B. A partir de entonces en 1996, se reveló que SDF-1 es una proteína que inhibe un receptor necesario para la invasión del virus de inmunodeficiencia humano (VIH) en una célula hospedadora.

Se ha sabido que ratones sin SDF-1 mueren inmediatamente después del nacimiento y presentan anormalidades en la hematopoyesis en la médula ósea, formación del tabique interventricular o formación de tejido neural. Adicionalmente, se ha revelado que el receptor del SDF-1 es CXCR4 y que el primer SDF-1 entre las quimoquinas forma una relación de ligando-receptor junto con CXRC4.

25 Una de las acciones fisiológicas del SDF-1 es una acción de inducción de la angiogénesis. La acción de inducción de la angiogénesis de SDF-1 se basa en una acción de reclutamiento de células progenitoras vasculares a un sitio isquémico y ha atraído la atención ya que es un mecanismo diferente de la actividad inductora de angiogénesis debido a factores del crecimiento que tienen una actividad inductora de la angiogénesis intrínseca tal como factor del crecimiento de fibroblastos básico (FGFb) o factor del crecimiento endotelial vascular (VEGF).

Hasta la fecha, los documentos que vinculan SDF-1 con la angiogénesis han informado que la producción de SDF-1 está inducida por el factor 1 inducible por hipoxia (HIF-1) producido en el sitio isquémico usando modelos animales de elevación de piel dorsal y por consiguiente se provoca la acumulación de células progenitoras vasculares en el

35 sitio isquémico (por ejemplo, véase Nature Medicine, volumen 10(8), páginas 858-864 (2004)). Adicionalmente, se ha informado que el trasplante de fibroblastos que se han modificado genéticamente para producir SDF-1 en sitios de infarto de miocardio acumula células progenitoras vasculares obtenidas de la médula ósea en los sitios de infarto y adicionalmente mejora la función cardíaca (por ejemplo, véase Lancet (volumen 362, páginas 697-703 (2003)). También se ha informado que la administración de genes de SDF-1 a sitios de isquemia de extremidades inferiores ha dado como resultado la observación de angiogénesis y un aumento del volumen del flujo sanguíneo (por ejemplo, refiérase a Circulation, volumen 109, páginas 2454-2461, (2004)).

Los ejemplos de composiciones de liberación sostenida que contienen factores de crecimiento que tienen una actividad de angiogénesis incluyen una formulación que combina FGFb con un gel de gelatina reticulado (por

45 ejemplo, véase la Publicación Internacional Nº WO 94/27630) o una formulación que combina un factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) con un hidrogel de gelatina (por ejemplo, véase la Publicación Internacional Nº WO 2003/007982).

Sin embargo, ambas de las técnicas anteriores no muestran la administración externa continua de SDF-1 y no ha existido ninguna composición de liberación sostenida segura que posibilite la manifestación eficaz de una acción farmacológica de SDF-1 y que se pueda administrar a un organismo viviente.

Divulgación de la invención

55 Problemas a solucionar por la invención

En general, cuando se administra una proteína a un organismo viviente en una forma de solución acuosa, se puede obtener un efecto biológico no deseado debido a que la proteína se degrada rápidamente. Con el fin de resolver un problema de este tipo, se han investigado diversas técnicas de liberación sostenida en los últimos años y se ha informado de varias composiciones de liberación sostenida que contienen sustancias fisiológicamente activas. Sin embargo, debido a las estructuras diversas y a las acciones farmacológicas diversas de las proteínas, es extremadamente difícil diseñar preparaciones que puedan impartir eficazmente únicamente una acción farmacológica específica de una proteína determinada a un organismo viviente. Debido a que el mecanismo de trabajo de SDF-1 difiere de factores de crecimiento conocidos previamente que tienen una actividad de angiogénesis 65 y no existe ejemplo de administración externa continua a un organismo viviente, no está para nada claro con respecto a qué concentración local (o concentración en sangre) durante qué duración de acción induciría un efecto

farmacológico deseable para un organismo viviente o qué vehículo de liberación sostenida se podría usar con el fin de estabilizar SDF-1 in vivo.

Es decir, un objeto de la presente invención es proporcionar una composición de liberación sostenida que contenga 5 SDF-1, adecuada para inducir una acción fisiológica local y posibilitar la administración segura a un organismo viviente.

Medios para resolver los problemas

En base a las investigaciones diligentes que usan numerosos vehículos de liberación sostenida, los presentes inventores han observado que un hidrogel de gelatina succinada o un hidrogel de gelatina sulfoacetilada muestra excelentes efectos de liberación sostenida de SDF-1 y que cuando cada hidrogel se administra a un organismo viviente junto con SDF-1, se obtiene un efecto inductor de la angiogénesis visiblemente excelente que no se observa cuando se usan otros vehículos de liberación sostenida. Los presentes inventores condujeron investigaciones

15 adicionales basándose en la apreciación anterior y de esta manera completaron la presente invención.

Por tanto, la presente invención proporciona:

[1] Una composición de liberación sostenida que contiene (1) SDF-1 y (2) un hidrogel que contiene gelatina modificada que tiene un grupo carboxilo y/o un grupo sulfo;

[2] La composición de liberación sostenida de acuerdo con [1], en la que el hidrogel que contiene gelatina modificada que tiene un grupo carboxilo y/o un grupo sulfo es un hidrogel de gelatina succinada, un hidrogel de gelatina sulfoacetilada o una mezcla de los mismos en una proporción arbitraria;

[3] La composición de liberación sostenida de acuerdo con [2], en la que el hidrogel de gelatina succinada, el

25 hidrogel de gelatina sulfoacetilada o la mezcla de los mismos en una proporción arbitraria se produce reticulando gelatina succinada, gelatina sulfoacetilada o una mezcla de las mismas en una proporción arbitraria al punto isoeléctrico de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 5,0 usando un agente de reticulación;

[4] La composición de liberación sostenida de acuerdo con [2], en la que el hidrogel de gelatina succinada, el hidrogel de gelatina sulfoacetilada o la mezcla de los mismos en una proporción arbitraria se produce reticulando gelatina succinada, gelatina sulfoacetilada o una mezcla de las mismas en una proporción arbitraria a la proporción de modificación de aproximadamente el 15% a aproximadamente el 30% usando un agente de reticulación;

[5] La composición de liberación sostenida de acuerdo con [2], en la que el hidrogel de gelatina succinada, el hidrogel de gelatina sulfoacetilada o la mezcla de los mismos en una proporción arbitraria se produce reticulando gelatina succinada, gelatina sulfoacetilada o una mezcla de las mismas en una proporción arbitraria que tiene un

35 peso molecular promedio de aproximadamente 90.000 a aproximadamente 110.000 usando un agente de reticulación;

[6] La composición de liberación sostenida de acuerdo con [1], en la que SDF-1 es SDF-1α, SDF-1β o una mezcla de los mismos en una proporción arbitraria;

[7] La composición de liberación sostenida de acuerdo con [1] para inyección, administración transnasal, administración transdérmica, administración rectal o implante;

[8] La composición de liberación sostenida de acuerdo con [7] para implante;

[9] La composición de liberación sostenida de acuerdo con [8], que tiene una proporción de contenido de agua de desde aproximadamente el 95% hasta aproximadamente el 98%;

[10] La composición de liberación sostenida de acuerdo con [8], en la que SDF-1 se libera durante al menos 1 45 semana;

[11] La composición de liberación sostenida de acuerdo con [10] en la que SDF-1 se libera durante aproximadamente 1 mes a aproximadamente 2 meses;

[12] La composición de liberación sostenida de acuerdo con [7], en la que la inyección es inyección subcutánea de microesferas;

[13] La composición de liberación sostenida de acuerdo con [1] para el tratamiento y/o supresión de progresión de síntomas de enfermedad isquémica o enfermedad ósea;

[14] Un método para producir la composición de liberación sostenida de acuerdo con [8], que incluye las etapas de:

(1) mezclar una solución acuosa de gelatina modificada que tiene un grupo carboxilo y/o un grupo sulfo con una

55 solución acuosa de un agente de reticulación para preparar un hidrogel que contiene gelatina modificada que tiene un grupo carboxilo y/o un grupo sulfo;

(2)

liofilizar el hidrogel que contiene gelatina modificada obtenido en la etapa (1); y

(3)

poner en contacto una solución acuosa de SDF-1 con el cuerpo liofilizado del hidrogel que contiene gelatina modificada obtenido en la etapa (2) para preparar de ese modo el hidrogel que contiene gelatina modificada soporte de SDF-1;

[15] El método de producción de acuerdo con [14], en el que aproximadamente 10 mmol a aproximadamente 50 mmol de SDF-1 con relación a 1 mol de gelatina modificada que tiene un grupo carboxilo y/o un grupo sulfo se soporta en el hidrogel que contiene gelatina modificada que tiene un grupo carboxilo y/o un grupo sulfo;

65 [16] Una preparación farmacéutica que contiene la composición de liberación sostenida de acuerdo con [1]; [17] La preparación farmacéutica de acuerdo con [16] para el tratamiento y/o supresión de progresión de síntomas de enfermedad isquémica o enfermedad ósea;

[18] Un método para el tratamiento y/o supresión de progresión de síntomas de enfermedad isquémica o

enfermedad ósea, que comprende administrar una cantidad eficaz de la preparación farmacéutica de acuerdo con 5 [16] a un mamífero;

[19] Uso de una preparación farmacéutica de acuerdo con [16] para la producción de un agente para el tratamiento y/o supresión de progresión de síntomas de enfermedad isquémica o enfermedad ósea; y

[20] Un método de liberación sostenida de SDF-1 in vivo, que comprende una etapa de preparación de un hidrogel que contiene gelatina modificada que tiene un grupo carboxilo y/o un grupo sulfo soporte de SDF-1.

Efectos de la invención

Debido a que la presente invención posibilita que la quimoquina SDF-1 se libere in vivo de una manera sostenida, la misma posibilita que SDF-1 induzca la angiogénesis o reproducción de diversos tejidos incluyendo cartílago,

15 músculo o tejidos dérmicos mediante, por ejemplo, inyección, administración nasal, administración transdérmica, administración rectal o implante de la composición. También, por ejemplo, la invención posibilita el tratamiento y/o la supresión de progresión de síntomas de enfermedad isquémica o enfermedad ósea. El hidrogel que contiene gelatina modificada que tiene un grupo carboxilo y/o grupo sulfo usado en la composición de la presente invención mejora la estabilidad in vivo de SDF-1 y por lo tanto puede ser útil como un agente estabilizante in vivo de SDF-1.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra la liberación sostenida de SDF-1 a partir de diversos hidrogeles de gelatina. La Fig. 2 muestra la liberación sostenida de SDF-1 a partir de un hidrogel de gelatina succinada.

25 La Fig. 3 muestra el efecto de inducción de angiogénesis de la administración de un hidrogel de gelatina succinada que contiene SDF-1.

La presente memoria descriptiva incluye el contenido descrito en la memoria descriptiva de la Solicitud de Patente Japonesa Nº 2007-289598 presentada el 7 de noviembre de 2007, que es la base de prioridad de la presente invención.

Mejor modo para realizar la invención

En la presente invención, SDF-1 puede incluir las isoformas y formas maduras del mismo tales como SDF-1β, SDF

35 1γ, SDF-1δ, SDF-1ε y SDF-1Φ además de SDF-1α o una forma madura de los mismos o una mezcla de los mismos en una proporción arbitraria o similar. El SDF-1 preferido en la presente invención incluye el SDF-1α, SDF-1β, una mezcla de los mismos en una proporción arbitraria o similar. SDF-1 también se puede denominar CXCL-12 o PBSF.

En la presente invención, siempre y cuando SDF-1 tenga actividad como una quimoquina, SDF-1 se puede sustituir, suprimir y/o añadir por uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos. De forma similar, el mismo se puede sustituir, suprimir y/o añadir por una cadena de azúcar. SDF-1 puede formar una sal (preferentemente, una sal de adición de ácido) con un ácido fisiológicamente aceptable (por ejemplo, un ácido inorgánico o un ácido orgánico) o una base (por ejemplo, una sal de metal alcalino). Los ejemplos de sales incluyen una sal con un ácido inorgánico (por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido fosfórico, ácido bromhídrico o ácido sulfúrico) y una sal con un ácido

45 orgánico (por ejemplo, ácido acético, ácido fórmico, ácido propiónico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico ácido tartárico, ácido cítrico, ácido málico, ácido oxálico, ácido benzoico, ácido metanosulfónico o ácido bencenosulfónico).

El tipo de SDF-1 no está limitado en la presente invención. El SDF-1 usado en la presente invención se puede obtener a partir de mamíferos tales como ser humano o animales no humanos tales como mono, oveja, vaca, caballo, cerdo, perro, gato, conejo, rata o ratón. Normalmente, las especies diana se pueden seleccionar para aplicación de “una composición de liberación sostenida que contiene (1) SDF-1 y (2) un hidrogel que contiene gelatina modificada que tiene un grupo carboxilo y/o un grupo sulfo” como se divulga en la presente invención (en lo sucesivo en el presente documento se puede abreviar algunas veces como la “composición de la presente

55 invención”). Por ejemplo, cuando la composición de la presente invención se aplica a un ser humano, la composición de la presente invención se puede producir usando SDF-1 humano (por ejemplo, SDF-1α (Nº de Acceso de GenBank NP_954637) o SDF-1P (Nº de Acceso de GenBank NP_000600)).

En la presente invención, SDF-1 se puede purificar hasta un nivel en el cual la acción de SDF-1 no está inhibida por otros contaminantes. Preferentemente, SDF-1 se puede purificar para ser utilizable como una preparación farmacéutica.

En la presente invención, SDF-1 se puede obtener a partir de fuentes naturales o producirse mediante una técnica de ingeniería genética. Cuando se obtiene a partir de fuentes naturales, SDF-1 se puede extraer a partir de diversos 65 órganos tales como el bazo de mamíferos tales como un ser humano o un animal no humano (por ejemplo, mono, oveja, vaca, caballo, perro, gato, conejo, rata o ratón), en el que ya se conoce que existe SDF-1. Para proporcionar

un ejemplo específico de un órgano en el cual se conoce que existe SDF-1, por ejemplo, SDF-1 se conoce que está presente en una gran cantidad en órganos en los cuales las células tumorales que expresan CXCR4, un receptor de SDF-1, se transfieren con frecuencia elevada. Por otra parte, cuando se produce mediante una técnica de ingeniería genética, un gen que codifica SDF-1 a partir de un mamífero tal como un animal humano o no humano (por ejemplo,

5 mono, oveja, vaca, caballo, cerdo, perro, gato, conejo, rata o ratón) se incorpora en un vector adecuado, que se introduce en una célula hospedadora adecuada para transformación, para ser capaz de ese modo de obtener el SDF-1 recombinante diana a partir de un sobrenadante de cultivo del transformante. La célula hospedadora en el presente documento no está limitada y se pueden usar diversas células hospedadoras tales como E. coli, células de levadura, diversas células de insecto, tales como células del gusano de la seda y diversas células animales, que se han usado normalmente en las técnicas de ingeniería genética.

En la presente invención, el “hidrogel que contiene gelatina modificada que tiene un grupo carboxilo y/o un grupo sulfo” (en lo sucesivo en el presente documento se puede abreviar sencillamente como “hidrogel usado en la presente invención”) significa un hidrogel producido usando “gelatina modificada que tiene un grupo carboxilo y/o un 15 grupo sulfo”. En el presente documento, la “gelatina modificada que tiene un grupo carboxilo y/o un grupo sulfo” (en lo sucesivo en el presente documento, se puede abreviar sencillamente como la “gelatina modificada usada en la presente invención”) puede ser gelatina en la cual se introduce externamente un grupo carboxilo y/o un grupo sulfo en una molécula de gelatina y puede tener cualquier otro grupo además de un grupo carboxilo y/o un grupo sulfo. El grupo carboxilo y/o el grupo sulfo se pueden unir directamente a la molécula de gelatina o el grupo carboxilo y/o el grupo sulfo se pueden unir no directamente a la molécula de gelatina. Adicionalmente, el número de grupos carboxilo y/o de grupos sulfo introducidos en la molécula de gelatina no está limitado particularmente. El número de grupos carboxilo y/o grupos sulfo introducidos en la molécula de gelatina se puede representar por un índice denominado la “proporción de modificación”. La “proporción de modificación” representa la proporción del número de grupos carboxilo y/o grupos sulfo introducidos en los grupos amino en la molécula de gelatina al número total de

25 grupos amino en la molécula de gelatina usada como un material de partida. En otras palabras, si cuando la molécula de gelatina usada como un material de partida tiene 100 grupos amino, el número de grupos carboxilo y/o de grupos sulfo introducidos en los grupos amino es 10, la proporción de modificación es el 10%. En la presente memoria descriptiva, grupo carboxilo significa “-COOH” o “-COO-”, una forma deprotonada de los mismos y el grupo sulfo significa “-SO3H” o “-SO3-”, una forma deprotonada del mismo.

La “gelatina modificada usada en la presente invención” se puede producir acilando gelatina como un material bruto usando un reactivo para introducir un grupo hidroxilo y/o un grupo sulfo. Esta reacción de acilación se conoce y los ejemplos de la misma incluyen (1) un método que usa un agente de condensación, (2) un método que usa un anhídrido ácido (mixto) y (3) un método que usa un haluro de acilo. Estos métodos (1) a (3) se describen

35 específicamente a continuación.

(1) El método que usa un agente de condensación se conduce, por ejemplo, sometiendo a reacción ácido carboxílico (por ejemplo, ácido carboxílico alifático sustituido con un grupo carboxi, tal como ácido succínico, ácido oxálico, ácido carboxílico alifático sustituido con un grupo sulfo o ácido sulfoacético) con gelatina de aproximadamente 0ºC a aproximadamente 40ºC en un disolvente (por ejemplo, agua, dimetil sulfóxido, N,Ndimetilformamida, éster monoetílico de etilenglicol, tetrahidrofurano, metanol o etanol en solitario o un disolvente mixto de los mismos en una proporción arbitraria ) o sin un disolvente en presencia o ausencia de una base (por ejemplo, piridina, trietilamina, N,N-dimetilanilina, N,N-dimetilaminopiridina o diisopropiletilamina), en presencia o ausencia de una solución tampón (por ejemplo, una solución de tampón fosfato) usando un agente de

45 condensación (por ejemplo, 1,3-dicilohexilcarbodiimida (DCC), 1-etil-3-[3-(dimetilamino)propil]carbodiimida (EDC), 1,1’-carbonildiimidazol (CDI), 2-cloro-1-metilpiridinio yoduro, anhídrido cíclico del ácido 1-propilfosfónico

o (anhídrido cíclico del ácido 1-propanofosfónico, PPA)) con o sin el uso de 1-hidroxibenztriazol (HOBt).

(2)

El método que usa un anhídrido ácido (mixto) se conduce, por ejemplo, sometiendo a reacción ácido carboxílico (por ejemplo, ácido carboxílico alifático sustituido con un grupo carboxi tal como ácido succínico, ácido oxálico, ácido carboxílico alifático sustituido con un grupo sulfo o ácido sulfoacético) con un haluro ácido (por ejemplo, cloruro de pivaloílo, cloruro de p-toluenosulfonilo o cloruro de metanosulfonilo) o un derivado ácido (por ejemplo, cloroformato de etilo o cloroformato de isobutilo) a aproximadamente -20ºC a aproximadamente 40ºC en un disolvente orgánico (por ejemplo, cloroformo, diclorometano, dietiléter o tetrahidrofurano) o sin un disolvente en presencia de una base (por ejemplo, piridina, trietilamina, N,N-dimetilanilina, N,N

55 dimetilaminopiridina o diisopropiletilamina) y sometiendo a reacción el anhídrido ácido mixto resultante o un anhídrido ácido disponible en el mercado (por ejemplo, anhídrido succínico, anhídrido maleico o anhídrido ftálico) con gelatina a aproximadamente 0ºC a aproximadamente 40ºC en un disolvente (por ejemplo, agua, dimetil sulfóxido, N,N-dimetilformamida, éster monoetílico de etilenglicol, tetrahidrofurano, metanol o etanol en solitario o un disolvente mixto de los mismos en una proporción arbitraria) en presencia o ausencia de una solución tampón (por ejemplo, una solución de tampón fosfato).

(3) El método que usa un haluro de acilo se conduce, por ejemplo, sometiendo a reacción ácido carboxílico (por ejemplo, ácido carboxílico alifático sustituido con un grupo carboxi tal como ácido succínico, ácido oxálico, ácido carboxílico alifático sustituido con un grupo sulfo o ácido sulfoacético) con un agente de halogenación ácida (por ejemplo, cloruro de oxalilo o cloruro de tionilo) a aproximadamente -20ºC a una temperatura de reflujo en un

65 disolvente orgánico (por ejemplo, cloroformo, diclorometano, dietiléter o tetrahidrofurano) o sin un disolvente y sometiendo a reacción el haluro de acilo resultante o un haluro de acilo disponible en el mercado (por ejemplo, monocloruro de ácido succínico o cloruro de sulfoacetilo) con gelatina a una temperatura de aproximadamente 0ºC hasta aproximadamente 40ºC en un disolvente (por ejemplo, agua, dimetilsulfóxido, N,N-dimetilformamida, éster monoetílico de etilenglicol, tetrahidrofurano, metanol o etanol en solitario o un disolvente mixto de los mismos en una proporción arbitraria) en presencia de una base (por ejemplo, piridina, trietilamina, N,N

5 dimetilanilina, N,N-dimetilaminopiridina o diisopropiletilamina), en presencia o ausencia de una solución tampón (por ejemplo, una solución de tampón fosfato). El método también se puede conducir sometiendo a reacción el haluro de acilo resultante o un haluro de acilo disponible en el mercado (por ejemplo, monocloruro de ácido succínico o cloruro de sulfoacetilo) con gelatina a una temperatura de aproximadamente 0ºC hasta aproximadamente 40ºC en un disolvente (por ejemplo, agua, dimetilsulfóxido, N,N-dimetilformamida, éster monoetílico de etilenglicol, tetrahidrofurano, metanol o etanol en solitario o un disolvente mixto de los mismos en una proporción arbitraria) usando una solución alcalina acuosa (por ejemplo, una solución acuosa de carbonato de hidrógeno de sodio o una solución de hidróxido de sodio acuosa) en presencia o ausencia de una solución tampón (por ejemplo, una solución de tampón fosfato).

15 La “gelatina modificada usada en la presente invención” producida usando el método anterior se puede dializar, ultra filtrar, purificar mediante tamizado de peso molecular o similares o liofilizarse según se desee.

La gelatina usada como el material de partida para la producción de la “gelatina modificada usada en la presente invención” se puede obtener a partir de una fuente natural o se puede obtener mediante fermentación usando microbios, síntesis química u operaciones de recombinación genética. También es posible usar una mezcla adecuada de estos materiales anteriores. La gelatina natural se puede obtener desnaturalizando colágeno obtenido a partir de cada sitio recogido en diversos animales tales como seres humanos, mamíferos (por ejemplo, una vaca y un cerdo), peces (por ejemplo, tilapia, besugo, atún, bagre y tiburón) y aves (por ejemplo, un pollo y un avestruz) a través de una diversidad de tratamientos tales como hidrólisis alcalina, hidrólisis ácida o enzimólisis.

25 Los ejemplos preferidos de la “gelatina modificada usada en la presente invención” incluyen gelatina succinada y gelatina sulfoacetilada. La gelatina succinada se refiere a la gelatina en la cual uno o más grupos amino arbitrarios (-NH2) en una molécula de gelatina como un material bruto se han convertido en grupo o grupos carboxietilcarbonilamino (-NH-C(=O)-CH2-CH2-COOH). La gelatina sulfoacetilada se refiere a la gelatina en la cual uno o más grupos amino arbitrarios (-NH2) en una molécula de gelatina como un material bruto se han convertido en grupo o grupos sulfometilcarbonilamino (-NH-C(=O)-CH2-SO3-H). La gelatina succinada y la gelatina sulfoacetilada se pueden producir mediante los métodos anteriores. Más específicamente, la gelatina succinada se puede producir añadiendo gota a gota anhídrido succínico disuelto en dimetil sulfóxido deshidratado a gelatina disuelta en dimetil sulfóxido deshidratado y sometiendo a reacción la mezcla a aproximadamente 37ºC durante aproximadamente 0,5

35 horas hasta aproximadamente 24 horas. Posteriormente, la gelatina obtenida se puede dializar adicionalmente y liofilizarse según se desee. La gelatina sulfoacetilada se puede producir ajustando el pH añadiendo gota a gota ácido sulfoacético disuelto en una solución tampón acuosa a gelatina disuelta en una solución tampón acuosa y posteriormente añadiendo a la misma sal de 1-etil-3-[3-(dimetilamino)propil]carbodiimida (EDC) del ácido clorhídrico y sometiendo a reacción la mezcla a aproximadamente 37ºC durante aproximadamente 18 horas. Posteriormente, la gelatina obtenida se puede dializar adicionalmente y liofilizarse según se desee. La proporción de introducción (proporción de modificación) de grupos carboxilo o grupos sulfo en la “gelatina modificada usada en la presente invención” se puede ajustar dentro de un intervalo desde aproximadamente el 5% hasta el 80% variando de forma diversa el tiempo de reacción y la concentración de un reactivo de reacción en la producción de la “gelatina modificada usada en la presente invención”.

45 Como se describirá en el método de producción posterior, la composición de la presente invención se puede producir de diversas maneras de acuerdo con los fines (sitio de administración, el nivel de liberación sostenida (por ejemplo, el periodo de liberación de SDF-1 y la velocidad de liberación) y similares). Específicamente, los ejemplos de la composición de la presente invención que libera SDF-1 a lo largo de aproximadamente 2 semanas mediante una administración de implante in vivo incluyen la composición de la presente invención como se muestra en los siguientes ejemplos. Tomando dicha composición como un ejemplo, para producir la composición de la presente invención que libera SDF-1 a lo largo de aproximadamente 2 semanas mediante la administración de implante in vivo, se prefiere que una cualquiera de las tres propiedades (A), (B) y (C) descritas más adelante, preferentemente dos cualquiera de las propiedades y más preferentemente las tres propiedades se impartan a la gelatina succinada o

55 la gelatina sulfoacetilada que preferentemente es igual a la “gelatina modificada usada en la presente invención”; (A) un punto isoeléctrico de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 5,0; (B) una proporción de modificación de aproximadamente el 15% a aproximadamente el 30% (preferentemente, cuando se usa gelatina succinada, aproximadamente el 25% a aproximadamente el 30% y cuando se usa gelatina sulfoacetilada aproximadamente el 20%); y (C) un peso molecular promedio de aproximadamente 90.000 a aproximadamente 200.000 (preferentemente aproximadamente 90.000 a aproximadamente 110.000 y más preferentemente aproximadamente 100.000). Como se observa en los ejemplos descritos posteriormente, las composiciones de la presente invención producidas usando la gelatina succinada o la gelatina sulfoacetilada que cumple con las tres condiciones muestran efectos excelentes que coinciden con los fines de la liberación sostenida de SDF-1. El punto isoeléctrico, la proporción de modificación y el peso molecular promedio se pueden medir todos mediante un método conocido. El peso molecular promedio de

65 la “gelatina modificada usada en la presente invención” obtenida se puede calcular en base al peso molecular promedio de la gelatina usada como un material de partida y la proporción de modificación. Además de las propiedades anteriores, se prefiere que, por ejemplo, el pH satisfaga una condición de aproximadamente 4 a aproximadamente 6. El uso de la composición de la presente invención producida usando la gelatina resultante como una solución de inyección se facilita proporcionando condiciones tales como que la “gelatina modificada usada en la presente invención” tiene un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 6.

5 Los ejemplos preferidos del “hidrogel usado en la presente invención” incluyen hidrogeles producidos usando la “gelatina modificada usada en la presente invención” preferida descrita anteriormente, concretamente, el hidrogel de gelatina succinada y el hidrogel de gelatina sulfoacetilada. Una mezcla del hidrogel de gelatina succinada y el hidrogel de gelatina sulfoacetilada en una proporción arbitraria también se prefiere.

El “hidrogel usado en la presente invención” se puede producir sometiendo la “gelatina modificada usada en la presente invención” anterior a una reacción conocida. Por ejemplo, el hidrogel se puede producir reticulando la “gelatina modificada usada en la presente invención” usando un agente de reticulación (por ejemplo, glutaraldehído, carbodiimida soluble en agua tal como 1-etil-3-[3-(dimetilamino)propil]carbodiimida (EDC), óxido de propileno, un

15 compuesto diepoxi o un agente de condensación para formar un enlace químico entre un grupo hidroxilo, un grupo carboxilo, un grupo amino, un grupo tiol, un grupo imidazol o similares) o sometiendo la “gelatina modificada usada en la presente invención” a deshidratación térmica, radiación de rayos ultravioleta, radiación de rayos gamma, radiación de haz de electrones o similares. Adicionalmente, el hidrogel también se puede producir reticulando la “gelatina modificada usada en la presente invención” utilizando puente de sal, interacción electroestática, enlace de hidrógeno o interacción hidrófoba. La “gelatina modificada usada en la presente invención” que se tiene que reticular no necesita tener una composición única. Es decir, tomando la “gelatina modificada usada en la presente invención” preferida descrita anteriormente como un ejemplo, el hidrogel producido reticulando una mezcla de gelatina succinada y gelatina sulfoacetilada en una proporción arbitraria usando un agente de reticulación también se incluye en el “hidrogel usado en el presente invención”.

25 En la producción del “hidrogel usado en la presente invención” mediante la reticulación de la “gelatina modificada usada en la presente invención” con el agente de reticulación, el alcance de concentración preferido de la “gelatina modificada usada en la presente invención” y el agente de reticulación es desde aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 20% en peso y desde aproximadamente el 0,01% hasta aproximadamente el 1% en peso, respectivamente. La reacción de reticulación, que no está limitada particularmente, se puede conducir, por ejemplo, a aproximadamente 0ºC hasta aproximadamente 40ºC, preferentemente aproximadamente 25ºC hasta aproximadamente 30ºC, durante aproximadamente 1 hora a aproximadamente 48 horas, preferentemente aproximadamente 12 horas a aproximadamente 24 horas.

35 Ya que la “gelatina modificada usada en la presente invención” se vuelve insoluble en agua al reticularse y cambia al “hidrogel usado en la presente invención” el mismo será capaz de mostrar el efecto excelente de liberación sostenida de SDF-1. Como se ha descrito anteriormente, el nivel de liberación sostenida se puede ajustar usando propiedades de la “gelatina modificada usada en la presente invención” tales como el punto isoeléctrico, la proporción de modificación o el peso molecular promedio. El nivel de liberación sostenida también se puede cambiar apropiadamente ajustando el grado de reticulación a través del ajuste de la concentración de la “gelatina modificada usada en la presente invención”, la concentración del agente de reticulación y/o las condiciones de reacción de reticulación (por ejemplo, temperatura o tiempo) en la producción del “hidrogel usado en la presente invención”.

La reticulación de la “gelatina modificada usada en la presente invención” se puede ejecutar mediante

45 deshidratación térmica. La reticulación usando deshidratación térmica se puede ejecutar, por ejemplo, mediante colada de flujo de una solución acuosa (preferentemente aproximadamente el 10% en peso) de la “gelatina modificada usada en la presente invención” en una cápsula de petri de plástico y dejando que la película de gelatina obtenida se seque al aire durante aproximadamente 1 hora a aproximadamente 48 horas (preferentemente aproximadamente 6 horas a aproximadamente 24 horas) en presión reducida (preferentemente aproximadamente 10 mmHg) a una temperatura de aproximadamente 110ºC hasta aproximadamente 160ºC (preferentemente aproximadamente 120ºC hasta aproximadamente 150ºC).

La reticulación de la “gelatina modificada usada en la presente invención” también se puede ejecutar mediante radiación de rayos ultravioleta. La reticulación mediante radiación de rayos ultravioleta se puede conducir, por

55 ejemplo, dejando una película de gelatina obtenida de la misma manera que anteriormente a temperatura ambiente (preferentemente aproximadamente 0ºC hasta aproximadamente 40ºC) bajo una lámpara bactericida.

De la misma manera, la reticulación se puede ejecutar mediante radiación de rayos gamma, radiación de haz de electrones o similares. Además, se puede usar una combinación de las reacciones de reticulación anteriores.

El “hidrogel usado en la presente invención” producido mediante los métodos anteriores puede tomar cualquier configuración. Cuando se usa como una pieza de implante para implante de acuerdo con el uso de la composición de la presente invención descrita posteriormente, la configuración adecuada se puede seleccionar entre granular, cilíndrica, prismática, de lámina, de disco, de palillo, de varilla, esférica, de partículas finas o pasta. Mediante la

65 variación adecuada de los medios de reticulación, el “hidrogel usado en la presente invención” se puede producir en forma granular, cilíndrica, prismática, de lámina, de disco, de palillo, de varilla, esférica, de partículas finas o de pasta. El “hidrogel usado en la presente invención” obtenido mediante la reacción de reticulación se puede formular como un artículo formado similar a esponja mediante liofilización.

El método para producir el “hidrogel usado en la presente invención” que tiene una forma fija como se ha descrito

5 anteriormente se describirá adicionalmente con detalle. Por ejemplo, el “hidrogel usado en la presente invención” en forma de cilindro, prisma, lámina o disco se puede producir mediante la adición de una solución acuosa de un agente de reticulación a una solución acuosa de la “gelatina modificada usada en la presente invención” o mediante adición de una solución acuosa de la “gelatina modificada que tiene un grupo carboxilo y/o un grupo sulfo” a una solución acuosa del agente de reticulación y colocando las soluciones en un molde de una forma deseada para reticulación. Además, también se puede producir formando previamente una solución acuosa de la “gelatina modificada usada en la presente invención” en un gel en un molde y después añadiendo una solución acuosa de un agente de reticulación a la misma. La adición de una solución acuosa de un agente reticulación se puede conducir después de secar el gel. La reacción de reticulación se puede terminar, por ejemplo, mediante el contacto con una sustancia de peso molecular bajo que tiene un grupo amino tal como etanolamina o glicina o mediante la adición de

15 una solución acuosa que tiene un pH de 2,5 o menos. Los reactivos (el agente de reticulación o la sustancia de peso molecular bajo) usados en la reacción se pueden retirar del “hidrogel usado en la presente invención” resultante mediante el lavado del hidrogel con, por ejemplo, agua destilada, etanol, 2-propanol, acetona o similares.

El “hidrogel usado en la presente invención” esférico o granular se puede producir, por ejemplo, añadiendo una solución acuosa de la “gelatina modificada usada en la presente invención” a un aparato en el que un matraz de fondo redondo de tres bocas está provisto de un motor de agitación fijo (por ejemplo, fabricado por Shinto Scientific Co., Ltd., motor tres-uno, agitador EYELA mini D.C.) y una hélice de agitación de Teflon® y unidos entre sí, añadiendo un aceite tal como aceite de oliva al mismo, agitando la mezcla a una velocidad de aproximadamente 200 rpm a aproximadamente 600 rpm para proporcionar una emulsión W/O y después añadiendo una solución acuosa 25 de un agente de reticulación a la misma o añadiendo mediante goteo una solución acuosa pre-emulsificada previamente de la “gelatina modificada usada en la presente invención” en aceite de oliva (por ejemplo, usando un mezclador vorticial (Advantec TME-21), un homogeneizador o polytron (PT10-35)) a aceite de oliva, preparando una emulsión W/O de partículas finas, después añadiendo una solución acuosa del agente de reticulación a la misma, para permitir de ese modo una reacción de reticulación, recuperando una fracción de hidrogel mediante centrifugación, a partir de entonces lavar la fracción con, por ejemplo, acetona o acetato de etilo e inmersión en, por ejemplo, 2-propanol, etanol o similar para terminar la reacción de reticulación. Las partículas resultantes del “hidrogel usado en la presente invención” se pueden lavar adicionalmente en secuencia con 2-propanol, agua destilada que contiene Tween 80 y agua destilada, según se desee. En la etapa anterior, cuando las partículas del “hidrogel usado en la presente invención” se co-agregan, se puede conducir la adición de un tensioactivo o ultrasonicación (en

35 enfriamiento durante aproximadamente un minuto o menos). El tamaño de partícula promedio del “hidrogel usado en la presente invención” obtenido se puede variar de forma adecuada ajustando la concentración de la “gelatina modificada usada en la presente invención” durante la producción de las partículas, la proporción de volumen de la solución acuosa de la “gelatina modificada usada en la presente invención” a aceite de oliva, la velocidad de agitación o similares. En general, el tamaño de partícula es desde aproximadamente 1 μm a aproximadamente 1 mm y las partículas que tienen un tamaño necesario se pueden seleccionar apropiadamente y usarse dependiendo de los fines. Además, un “hidrogel usado en la presente invención” de partículas finas que tienen un tamaño de partículas de aproximadamente 20 μm o menos también se puede obtener mediante emulsificación previa.

El tamaño del “hidrogel usado en la presente invención” obtenido mediante las etapas anteriores se puede ajustar

45 adecuadamente según sea necesario, liofilizarse o usarse después de una esterilización adicional. La liofilización se puede conducir, por ejemplo, colocando el “hidrogel usado en la presente invención” en agua destilada y realizando la congelación en nitrógeno líquido durante aproximadamente 30 minutos o más o de aproximadamente 1 hora o más a una temperatura de aproximadamente -80ºC y después secando el hidrogel en un aparato de liofilización durante aproximadamente 1 día a aproximadamente 3 días.

La composición de la presente invención se puede producir poniendo en contacto SDF-1 con el “hidrogel usado en la presente invención”. Se puede usar cualquier método de contacto. Para dar un ejemplo específico, la composición de la presente invención se puede producir poniendo en contacto el “hidrogel usado en la presente invención” liofilizado obtenido a partir de las etapas anteriores con una solución acuosa de SDF-1 para cargar SDF-1 en el

55 “hidrogel usado en la presente invención”. Para dar un ejemplo más específico, el mismo se puede obtener añadiendo por goteo una solución acuosa de SDF-1 en el “hidrogel usado en la presente invención” liofilizado anterior o impregnando el “hidrogel usado en la presente invención” en una solución acuosa de SDF-1 para cargar SDF-1 en el “hidrogel usado en la presente invención”. Estas operaciones habitualmente se conducen a una temperatura de aproximadamente 4ºC a aproximadamente 37ºC durante aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 1 hora y preferentemente a una temperatura de aproximadamente 4ºC a aproximadamente 25ºC durante aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 30 minutos. A través de esta etapa, el “hidrogel usado en la presente invención” se hincha o SDF-1 se soporta y fija en el “hidrogel usado en la presente invención” mediante una interacción físico química.

65 La cantidad de SDF-1 soportado en el “hidrogel usado en la presente invención” preferentemente se varía de acuerdo con la cantidad de la “gelatina modificada usada en la presente invención” usada la para la producción del “hidrogel usado en la presente invención”. Más específicamente, una proporción molar preferida con relación a la “gelatina modificada usada en la presente invención” es aproximadamente 1/10.000 a aproximadamente 1, más preferentemente aproximadamente 1/1.000 a aproximadamente 1/10, aun más preferentemente aproximadamente 1/100 a aproximadamente 1/20 y lo más preferente es que sea aproximadamente 1/40. Por ejemplo, cuando se

5 soportan aproximadamente 10 mmol a aproximadamente 50 mmol de SDF-1 en el “hidrogel usado en la presente invención” producido usando 1 mol de la “gelatina modificada usada en la presente invención”, una proporción molar con relación a la “gelatina modificada usada en la presente invención” puede ser aproximadamente 1/100 a aproximadamente 1/20.

El SDF-1 soportado en la composición de la presente invención se libera gradualmente al exterior a medida que el “hidrogel usado en la presente invención” se descompone in vivo. La velocidad de liberación está determinada por

(1) el nivel de descomposición y absorción del “hidrogel usado en la presente invención” usado in vivo, (2) la fuerza de unión del “hidrogel usado en la presente invención” a SDF-1 en la composición de la presente invención y (3) la estabilidad del “hidrogel usado en la presente invención”. Como se ha descrito anteriormente, el grado de liberación 15 sostenida in vivo del “hidrogel usado en la presente invención” se ha ajustado mediante el grado de reticulación durante la preparación del “hidrogel usado en la presente invención” y el grado de reticulación se puede representar numéricamente como la “proporción de contenido de agua” como un índice. En el presente documento, la “proporción de contenido de agua” significa el porcentaje en peso de agua en el hidrogel con relación al peso del “hidrogel usado en la presente invención” hinchado en la solución acuosa de SDF-1. El grado de reticulación en el “hidrogel usado en la presente invención” disminuye y la degradabilidad aumenta a medida que la “proporción de contenido de agua” aumenta. La “proporción de contenido de agua” para mostrar el efecto de liberación sostenida preferido de la composición de la presente invención es, por ejemplo, preferentemente desde aproximadamente el 80% en peso hasta aproximadamente el 99% en peso, más preferentemente desde aproximadamente el 95% en peso hasta aproximadamente el 98% en peso y aun más preferentemente desde aproximadamente el 95% hasta

25 aproximadamente el 96% en peso.

Otros componentes se pueden añadir según se desee a la composición de la presente invención para mejora de la estabilidad del propio “hidrogel usado en la presente invención”, la estabilidad de SDF-1 y la liberación de SDF-1 continua. Los ejemplos de otros componentes incluyen azúcares de amino o formas de peso molecular elevado de los mismos, oligómeros de chitosan, aminoácidos básicos u oligómeros de los mismos o formas de peso molecular elevado de los mismos o polímeros básicos tales como polialilamina, polidietilaminoetilacrilamida o polietilenimina.

La composición de la presente invención se puede formular en una formulación mezclándola con un vehículo farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, estabilizante, conservante, solubilizante, agente de ajuste de pH o

35 espesante) según sea necesario para formular de ese modo una composición, por ejemplo, inyección, administración oral, administración transnasal, administración transdérmica, administración rectal o implante. La composición de la presente invención en una formulación de este tipo puede ser útil como una preparación farmacéutica.

Cuando la composición de la presente invención se usa como una inyección, por ejemplo, la composición se puede formular como una suspensión acuosa junto con un medio de dispersión tal como un dispersante (por ejemplo, un tensioactivo tal como Tween 80 o HCO-60 o un polisacárido tal como hialuronato de sodio, carboximetilcelulosa o alginato de sodio), un conservante (por ejemplo, metilparabeno o propilparabeno) o un agente de tonicidad (por ejemplo, cloruro de sodio, manitol, sorbitol, glucosa o prolina) o una suspensión en base de aceite junto con un 45 dispersante tal como un aceite vegetal tal como aceite de sésamo o aceite de maíz y de ese modo se puede formular una solución de inyección realmente utilizable. Cuando se usa como una suspensión inyectable, el tamaño de partícula de la composición resultante es suficiente siempre y cuando el mismo esté dentro de un intervalo en el que se satisfagan el grado de dispersión y las propiedades de penetración de agujas, por ejemplo, dentro de un intervalo desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 300 μm, preferentemente desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 150 μm y más preferentemente desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 100 μm en un tamaño de partícula promedio. Cuando la composición de la presente invención se usa como una solución de inyección, se prefiere particularmente que sea una microesfera inyectable. La composición de la presente invención como una microesfera inyectable se puede inyectar por supuesto en vasos sanguíneos tales como venas y arterias y también se puede inyectar por vía intramuscular, preferentemente por vía subcutánea para liberar SDF-1

55 de la manera sostenida local. El proceso para producir y el método de uso de la microesfera se puede referir a Masumi Koishi (ed.,), “Development and Application of Micro/Nano Capsules and Fine Particles,” CMC Publishing, (2003) según sea necesario. Además, la liberación sostenida de una sustancia fisiológicamente activa general se puede referir a Kohei Miyao, “Practical Drug Delivery Systems,” Medicine and Drug Journal (1986) según sea necesario.

La composición de la presente invención se puede formular en una inyección estéril, bajo el proceso totalmente estéril, mediante esterilización usando rayos gamma o adición de conservante, que no está limitado particularmente. Mediante la adición, por ejemplo, de un excipiente (por ejemplo, manitol, sorbitol, lactosa o glucosa) como una suspensión además de la formulación anterior para redispersión y después la liofilización o el secado por 65 pulverización para solidificación, la composición de la presente invención se puede formular en una inyección más estable (una preparación denominada liofilizada), que se puede administrar mediante la adición de agua destilada

inyectable o un dispersante adecuado antes del uso.

La composición de la presente invención se puede formular en un agente administrado por vía oral de acuerdo con un método conocido de adición de un excipiente (por ejemplo, lactosa, sacarosa o almidón), un agente disgregante

5 (por ejemplo almidón o carbonato de calcio), un aglutinante (por ejemplo, almidón, goma arábiga, carboximetilcelulosa, polivinilpirrolidona o hidroxipropilcelulosa) o lubricante (por ejemplo, talco, estearato de magnesio o polietilenglicol 6000) a la misma y formando la resultante mediante compresión y después recubriéndola de acuerdo con un método conocido para enmascaramiento del sabor o propiedad entérica o sostenibilidad según sea necesario.

Los ejemplos de un agente de recubrimiento incluyen hidroxipropilmetilcelulosa, etilcelulosa, hidrometilcelulosa, hidropropilcelulosa, polioxietilenglicol, Tween 80, Pluronic F68, ftalato de acetato de celulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, succinato acetato de hidrometilcelulosa, Eudragit (fabricado por Rohm, West Germany: un copolímero de ácido metacrílico-ácido acrílico) y agentes colorantes tales como óxido de titanio y óxido de hierro

15 rojo.

La composición de la presente invención se puede formular en un agente sólido, semisólido o líquido para administración transnasal de acuerdo con un método conocido. Por ejemplo, la composición de la presente invención se puede formular en un agente sólido para administración transnasal por sí misma o como una composición en polvo obtenida añadiendo o mezclando un excipiente (por ejemplo, glucosa, manitol, almidón o celulosa microcristalina) o un agente espesante (por ejemplo, gomas naturales, derivados de celulosa o polímeros de ácido acrílico). Además, la composición de la presente invención se puede formular en un agente líquido para administración transnasal preparando una suspensión en base oleosa o acuosa de acuerdo con la misma operación que la de la inyección anterior. Un agente semisólido para administración transnasal puede contener un agente

25 acuoso o un gel en base oleosa o un ungüento. A cualquiera de las anteriores formulaciones se puede añadir un agente de ajuste de pH (por ejemplo, ácido carbónico, ácido fosfórico, ácido cítrico, ácido clorhídrico o hidróxido de sodio), un conservante (por ejemplo, éster de p-hidroxibenzoato, clorobutano o cloruro de benzalconio) o similares.

La composición de la presente invención se puede formular en un agente para administración rectal, es decir, un supositorio, que es sólido, semisólido o líquido en base oleosa o acuosa, de acuerdo con un método conocido. Los ejemplos de la base oleosa usada en dicha composición incluyen glicéridos de ácidos grasos superiores (por ejemplo, aceite de teobroma y Witepsol (Dynamite Nobel)), ácidos grasos medios (por ejemplo, migliol (Dynamite Nobel)) y aceites vegetales (por ejemplo, aceite de sésamo, aceite de semilla de soja y aceite de semilla de algodón). Los ejemplos de la base acuosa incluyen polietilenglicol y propilenglicol y los ejemplos de la base de gel

35 acuosa incluyen gomas naturales, derivados de celulosa, polímeros de vinilo y polímeros de ácido acrílico.

Para preparar una formulación implantable, la composición de la presente invención se puede formular en diversas formulaciones por sí misma o encerrándose en una lámina biodegradable de acuerdo con el propósito. Los ejemplos de las formulaciones incluyen una formulación sólida o semisólida en forma granular, cilíndrica, en forma de prisma, lámina, disco, palillo, varilla, esférica, partícula fina o pasta. Adicionalmente, además de las anteriores, la composición de la presente invención se puede formular en una preparación transdérmica de acuerdo con un método conocido.

Como se ha descrito anteriormente, la composición de la presente invención se puede formular en, por ejemplo, una

45 formulación inyectable, oral, transnasal, transdérmica, rectal o implantable, preferentemente una formulación inyectable, transnasal, transdérmica, rectal o implantable, en particular, preferentemente una formulación implantable o una formulación inyectable de microesferas subcutánea.

Ya que la composición de la presente invención es segura y poco tóxica, la misma se puede usar como una preparación farmacéutica para mamíferos (por ejemplo, ser humano, mono, oveja, vaca, cerdo, perro, gato, ratón, rata o conejo). Aunque la dosis de la composición de la presente invención se puede variar de acuerdo con la duración de la liberación de SDF-1, la enfermedad del sujeto, el sujeto animal o similares, es suficiente siempre y cuando una dosis eficaz de SDF-1 se libere de la manera sostenida. Por ejemplo, para satisfacer un efecto farmacológico sistémico, la dosis de SDF-1 a una vez para un adulto se puede seleccionar adecuadamente entre un

55 intervalo de preferentemente desde aproximadamente 0,05 hasta aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal y más preferentemente desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal. La frecuencia de dosis se puede seleccionar adecuadamente entre una vez cada varias semanas, una vez al mes o una vez cada varios meses (por ejemplo, 2 meses, 3 meses, 4 meses o 6 meses). Además, para satisfacer un efecto farmacológico local, la dosis de SDF-1 a una vez para un adulto se puede seleccionar adecuadamente entre un intervalo de preferentemente entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal y más preferentemente desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal. Cuando el efecto de una dosis única es insuficiente, la misma se puede administrar varias veces.

Ya que la composición de la presente invención puede liberar quimoquina SDF-1 de una manera sostenida durante

65 aproximadamente al menos 1 semana, preferentemente aproximadamente 2 semanas hasta aproximadamente un mes, más preferentemente aproximadamente 1 a aproximadamente 2 meses y aun más preferentemente desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 3 meses, la misma se puede administrar, por ejemplo, por vía subcutánea, por vía intramuscular, por vía intravenosa, por vía intraluminal o por vía local en un tejido dañado o un sitio de órgano o un órgano enfermo, para acumular células obtenidas de médula ósea, ilustrativas de células progenitoras vasculares, en el sitio de administración y de ese modo inducir la angiogénesis.

5 Además, la composición de la presente invención puede inducir la regeneración de diversos tejidos tales como cartílago, músculos y tejidos dérmicos.

Además, la composición de la presente invención se puede usar, en base al mecanismo de trabajo anterior, como una preparación farmacéutica, para el tratamiento y/o supresión de progresión de síntomas de diversas enfermedades, por ejemplo, enfermedad isquémica o enfermedad ósea. Los ejemplos de la enfermedad isquémica en el presente documento incluyen úlcera por presión, úlcera dérmica, ulceración de membrana mucosa, herida, reacciones de rechazo durante trasplante, isquemia de extremidad grave, enfermedades cardíacas isquémicas (por ejemplo, infarto de miocardio, infarto de miocardio agudo, cardiomiopatía, cardioembolismo, angina cardíaca, angina 15 inestable, ateroesclerosis coronaria e insuficiencia cardíaca), enfermedad arterial periférica, ateroesclerosis obliterante (ASO), enfermedad de Buerger, daño vascular, enfermedad oclusiva arterial, trombosis arterial, enfermedad oclusiva arterial sistémica, aneurisma, lesión cerebrovascular oclusiva, infarto cerebral, trombosis cerebral, embolismo cerebral, apoplejía, hemorragia cerebral, enfermedad de Moya Moya, demencia cerebrovascular, enfermedad de Alzheimer, efectos posteriores de hemorragia intracerebral, efectos posteriores de infarto cerebral, neuropatía diabética y hemadostenosis. Los ejemplos de enfermad ósea incluyen fractura ósea traumática, fractura por estrés, fractura patológica (por ejemplo, osteoporosis (por ejemplo, osteoporosis primaria (senil, post-menopáusica o juvenil), osteoporosis secundaria (por ejemplo hipertiroidismo o síndrome de Cushing (debido a administración de esteroides), acromegalia, hipogonadismo (por ejemplo, hipopituitarismo, síndrome de Klinfelter o síndrome de Turner), disosteogénesis, hipofosfatasia, homocistinuria u osteoporosis por inmovilización)),

25 osteomalacia, tumor maligno, mieloma múltiple, osteogénesis imperfecta congénita, quistes óseos, osteomielitis supurativa, enfermedad marmórea de los huesos o fracturas asociadas con trofopatía). En la presente invención, el “tratamiento” significa conducir una patología a su curación y la “supresión de progresión de síntomas” significa detener o suprimir la progresión de la patología.

Ejemplos

La presente invención se describirá con detalle en lo sucesivo en el presente documento, pero no se limita a la misma.

35 [Ejemplo 1]

(1) Producción de Gelatina Succinada

Una solución de dimetil sulfóxido deshidratado (4,5 g) de anhídrido succínico (Nacalai Tesque: Nº 324-07) (27 mg) se añadió por goteo con agitación en una solución deshidratada de dimetil sulfóxido (14 g) de gelatina pl5 obtenida de hueso bovino tratada con álcali (Nitta Gelatin) (2 g) y la mezcla se agitó a 37ºC durante 1 hora. El líquido de reacción (concentración final de gelatina: 9,76% en peso, concentración final de anhídrido succínico: 0,13% en peso) se colocó en una membrana de diálisis (Viskase Companies, Inc.: Nº UC30-32-100) y se dializó durante 3 días usando agua pura como un disolvente. Después de la diálisis, el líquido de reacción se colocó en una bandeja. Se

45 congeló a -80ºC y se liofilizó en un aparato de liofilización (EYELA: Nº FDU-830) para obtener gelatina succinada que tenía los siguientes valores de propiedad física. La gelatina succinada resultante se almacenó en condiciones selladas a 4ºC.

<Valores de Propiedad Física>

Proporción de modificación (proporción de introducción de grupos succinilo): 25 al 30% Punto Isoeléctrico: 4,72 a 4,74 Peso Molecular Promedio: aproximadamente 100.000

55 (2) Producción de Gelatina Sulfoacetilada

Solución de tampón MES de ácido sulfoacético (Aldrich: Nº 242802) (4,44 g) se añadió por goteo con agitación en tampón MES (monohidrato de ácido 2-morfolino etanosulfónico: DOJIN-DO: Nº 349-01623) (0,1 M, pH 5,0, 38 g) de gelatina pl5 obtenida de hueso bovino tratada con álcali (Nitta Gelatin) (2 g). Una solución acuosa de hidróxido de sodio (5 N) se usó para ajustar el pH del líquido de reacción a 5,0. Se añadió sal de clorhidrato de EDC (Nacalai Tesque: Nº 15022-44) (0,364 g) para ajustar la cantidad total del tampón MES a 60 ml y después la solución se agitó a 37ºC durante 18 horas. El líquido de reacción (concentración final de gelatina: 9,76% en peso, concentración final de anhídrido succínico: 0,13% en peso) se colocó en una membrana de diálisis (Viskase Companies, Inc.: Nº UC3032-100) y se dializó durante 3 días usando agua pura como un disolvente. Después de la diálisis, el líquido de 65 reacción se colocó en una bandeja, se congeló a -80ºC y se liofilizó en un aparato de liofilización (EYELA: #FDU830) para obtener gelatina sulfoacetilada que tenía los siguientes valores de propiedad física. La gelatina

sulfoacetilada resultante se almacenó en condiciones selladas a 4ºC.

<Valores de Propiedad Física>

5 Proporción de modificación (proporción de introducción de grupos sulfoacetilo): 20% Punto Isoeléctrico: 4,57 Peso Molecular Promedio: aproximadamente 100.000

[Ejemplo 2]

(1) Producción de Hidrogel de Gelatina Succinada

Una solución acuosa de hidróxido de sodio (5 N) se usó para ajustar el pH de una solución acuosa (22,8 g) de gelatina succinada (1,2 g) producida en el Ejemplo 1 (1) a 5,0 y después cada 10 ml de la solución se vertieron en

15 tubos de centrifugación. 45 μl de solución acuosa de glutaraldehído al 25% (Nacalai Tesque: Nº 17003-92) se añadieron a cada tubo de centrifugación y se agitaron suavemente durante 30 segundos. Cada 5 ml del líquido de reacción se dosificaron en una placa de equilibrio M (Bio-Bik), cubierta con papel de aluminio y se dejó a temperatura ambiente durante 30 minutos y después se gelatinizó realizando la reticulación a 4ºC durante 12 horas. El gel retirado se colocó en una solución acuosa (0,1 M, 500 ml) de glicina (Nacalai Tesque: Nº 17141-95) y la reacción de reticulación se detuvo agitando la mezcla a temperatura ambiente durante 1 hora. Para lavado, la solución acuosa de glicina se reemplazó con agua pura. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La operación anterior se repitió 3 veces con el fin de obtener un hidrogel de gelatina succinada que tenía los siguientes valores de propiedad física. El gel resultante se congeló a -80ºC y se liofilizó en un aparato de liofilización (EYELA: Nº FDU-830). La esterilización se condujo usando gas de óxido de etileno y el cuerpo liofilizado

25 esterilizado del hidrogel de gelatina succinada se almacenó en condiciones de sellado a 4ºC. La medición de la proporción de contenido de agua (% en peso) se pudo conducir usando el método descrito en Biomaterials, 19, 1781-9 (1998).

<Valores de Propiedad Física>

Proporción de Contenido de Agua: 97 al 98%

(2) Producción de Hidrogel de Gelatina Sulfoacetilada

35 Una solución acuosa de hidróxido de sodio (1 N) se usó para ajustar el pH de una solución acuosa (22,8 g) de gelatina sulfoacetilada (1,2 g) producida en el Ejemplo 1 (2) a 5,0 y después cada 10 ml de la solución se vertieron en tubos de centrifugación. 40 μl de solución acuosa de glutaraldehído al 25% (Nacalai Tesque: Nº 17003-92) se añadieron a cada tubo de centrifugación y se agitaron suavemente durante 30 segundos. Cada 5 ml del líquido de reacción se vertieron en una placa de equilibrio M (Bio-Bik), se cubrió con papel de aluminio y se dejó a temperatura ambiente durante 30 minutos y se gelatinizó realizando la reticulación a 4ºC durante 12 horas. El gel retirado se colocó en una solución acuosa (0,1 M, 500 ml) de glicina (Nacalai Tesque: Nº 17141-95) y la reacción de reticulación se detuvo agitando la mezcla a temperatura ambiente durante 1 hora. Para lavado, la solución acuosa de glicina se reemplazó con agua pura. La resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La operación anterior se repitió 3 veces con el fin de obtener un hidrogel de gelatina sulfoacetilada que tenía los siguientes valores de

45 propiedad física. El gel resultante se congeló a -80ºC, se liofilizó en un aparato de liofilización (EYELA: Nº FDU-830) y se esterilizó usando gas de óxido de etileno y después el hidrogel de gelatina sulfoacetilada liofilizado esterilizado se almacenó en condiciones de sellado a 4ºC. La proporción de contenido de agua (% en peso) se puede medir usando el método descrito en Biomaterials, 19, 1781-9 (1998).

<Valores de Propiedad Física>

Proporción de Contenido de Agua: 98%

(3) Producción de Otros Hidrogeles de Gelatina

55 Diversos hidrogeles de gelatina liofilizados y esterilizados se prepararon de acuerdo con la realización de las mismas operaciones que en el Ejemplo 2(1) o 2(2) usando materiales de partida tales como gelatina decilada, gelatina tratada con álcali, gelatina tratada con ácido, gelatina que contiene etilenodiamina y gelatina que contiene espermina producida de acuerdo con métodos conocidos.

[Ejemplo 3]

Producción de Complejo SDF-1/Hidrogel (Preparación para Formulación Implantable)

65 Un complejo de SDF-1/hidrogel (formulación implantable) se preparó añadiendo por goteo SDF-1 (SDF-1α genéticamente recombinante humano, R&D Systems Inc.) (20 μl) marcado con isótopo (125I) mediante un método de

cloramina T en diversos hidrogeles de gelatina liofilizados (2 mg) producidos en los Ejemplos 2(1), 2(2) y 2(3) y después dejando la resultante a 4ºC durante 12 horas.

[Ejemplo 4] 5 Investigación de Acción de Liberación Sostenida mediante Implante en Piel Dorsal Murina

Diversos complejos de SDF-1/hidrogel producidos en el Ejemplo 3 se implantaron en la piel dorsal de un ratón y el gel se recogió después de 24 horas. La cantidad residual de SDF-1 se calculó midiendo la radiactividad restante en el gel.

<Resultados>

Los resultados se muestran en la Figura 1. Con respecto a la liberación sostenida de SDF-1, la proporción residual

15 después de 24 horas de implante muestra que el hidrogel de gelatina sulfoacetilada y el hidrogel de gelatina succinada demuestran resultados excelentes en comparación con otros hidrogeles de gelatina. En la Figura 1, los símbolos significan lo siguiente.

sulfo: complejo de SDF-1/hidrogel de gelatina sulfoacetilada; succ: complejo de SDF-1/hidrogel de gelatina succinada; C11: complejo de SDF-1/hidrogel de gelatina decilada; pI = 5: complejo de SDF-1/hidrogel de gelatina tratado con álcali; pI = 9: complejo de SDF-1/hidrogel de gelatina tratado con ácido; E50: complejo de SDF-1/hidrogel de gelatina que contiene etilenodiamina;

25 SM50: complejo de SDF-1/hidrogel de gelatina que contiene espermina.

[Ejemplo 5]

Investigación de Acción de Liberación Sostenida (cambio temporal) mediante Implante en Piel Dorsal Murina

El complejo de SDF-1/hidrogel de gelatina succinada producido en el Ejemplo 3 se implantó en la piel dorsal de un ratón y el gel y el tejido periférico se recogieron a lo largo del tiempo. La cantidad residual de SDF-1 se calculó midiendo la radiactividad restante en el gel.

35 <Resultados>

Los resultados se muestran en la Figura 2. En el grupo del complejo de SDF-1/hidrogel de gelatina succinada, el SDF-1 se ha liberado incluso después de 7 a 10 días a partir del implante y el grupo mostró la actividad de liberación sostenida excelente en comparación con el grupo en el cual se administró únicamente una solución acuosa de SDF

1. En la Figura 2, los símbolos significan lo siguiente.

SDF-1/Gel: complejo de SDF-1/hidrogel de gelatina succinada; SDF-1/soln: solución acuosa de SDF-1.

45 [Ejemplo 6]

Investigación de Inducción Angiogénica mediante Implante en Piel Dorsal Murina

Una cámara provista con un orificio de visualización de vidrio se montó en el tejido dérmico dorsal de un ratón. Se creó una herida dérmica circular de 6 mm de diámetro en la piel dejando el tejido subcutáneo. Diversos complejos de SDF-1 no marcado radiactivamente (correspondiente a 5 μm)/hidrogel de gelatina producidos por separado de acuerdo con la realización de las mismas operaciones que en el Ejemplo 3 se trasplantaron y se dejaron. El tejido subcutáneo se observó en el tiempo mediante un microscopio y se contó el número de vasos sanguíneos inducidos.

55 <Resultados>

Los resultados se muestran en la Figura 3. En el grupo en el complejo de SDF-1/hidrogel de gelatina, se observaron niveles elevados de inducción angiogénica 4 días después del implante en comparación con grupos de otros hidrogeles. Las inducciones angiogénicas de los grupos de otros hidrogeles fueron del mismo nivel que el grupo en el cual se administró una solución acuosa de SDF-1 o el grupo en el cual se administró únicamente un hidrogel (sin SDF-1). En la Figura 3, los símbolos significan lo siguiente.

SDF-1/soln: solución acuosa de SDF-1; PBS/Gel: hidrogel únicamente (uso de PBS (solución de tampón fosfato) como un sustituto de SDF-1); 65 succ: complejo de SDF-1/hidrogel de gelatina succinada; C11: complejo de SDF-1/hidrogel de gelatina decilada;

pI = 5: complejo de SDF-1/hidrogel de gelatina tratado con álcali; pI = 9: complejo de SDF-1/hidrogel de gelatina tratado con ácido; E50: complejo de SDF-1/hidrogel de gelatina que contiene etilenodiamina; SM50: complejo de SDF-1/hidrogel de gelatina que contiene espermina;

5 SDF-1/Gel: complejo de SDF-1/diversos hidrogeles de gelatina.

[Ejemplo 7]

Investigación de Acción Acumulativa de Células Progenitoras Vasculares Usando Ratón Quimérico

10 Células de médula ósea se extrajeron a partir de un ratón que expresa GFP y las células se trasplantaron en un ratón normal sometido a radiación con rayos X para preparar de ese modo un ratón quimérico. El complejo de SDF-1 no marcado radiactivamente (correspondiente a 5 μm)/hidrogel de gelatina succinada producido por separado de acuerdo con la realización de las mismas operaciones que en el Ejemplo 3 se implantó en dicho ratón y se contó el

15 número de células CD34 positivas (células progenitoras vasculares) a partir de las células positivas a GFP acumuladas en la periferia del gel 48 horas más tarde.

La acumulación de células progenitoras vasculares se puede evaluar midiendo el nivel de expresión de receptor de SDF-1, CXCR4, en el tejido de acuerdo con un método de PCR conocido o un método de transferencia de northern 20 conocido.

<Resultados>

En el grupo en el cual se administró el complejo de SDF-1/hidrogel de gelatina succinada, las células CD34 positivas

25 (células progenitoras vasculares) aumentaron significativamente en comparación con el grupo en el cual se administró únicamente solución acuosa de SDF-1. Este efecto se debe al hecho de que las células angiogénicas acumuladas localmente aumentaron debido a la liberación sostenida de SDF-1 y por lo tanto dio como resultado una potenciación angiogénica.

30 [Ejemplo 8]

Investigación de Actividad Osteoblástica del Complejo de SDF-1/Hidrogel de Gelatina Succinada

Un hidrogel de gelatina succinada que tiene una proporción de contenido de agua del 97,9% se impregna con

35 solución acuosa de SDF-1 y después el resultante se implanta en una herida (20 mm) preparada en el cúbito de un conejo NZW (2,5 a 3 kg, macho). El complejo implantado se recoge 6 semanas más tarde y la densidad ósea se mide usando pQCT y después se preparan cortes transversales teñidos con hematoxilina-eosina.

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente memoria descriptiva se incorporan 40 mediante la presente por referencia en el presente documento en su totalidad.

Aplicabilidad Industrial

La composición de liberación sostenida que contiene (1) SDF-1 y (2) un hidrogel que contiene gelatina modificada

45 que tiene un grupo carboxilo y/o un grupo sulfo divulgada en la presente invención es segura y útil como una preparación farmacéutica formulándose en diversas formas. Ya que la composición puede liberar quimoquina SDF-1 de una manera sostenida in vivo, la composición se puede, por ejemplo, inyectar, administrar por vía transnasal, por vía transdérmica, por vía rectal o implantar para de ese modo ser capaz de inducir angiogénesis o inducir regeneración de diversos tejidos tales como cartílago, músculo y tejidos dérmicos. Además, la composición puede,

50 por ejemplo, tratar y/o suprimir la progresión de síntomas de enfermedad isquémica o enfermedad ósea.

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una composición de liberación sostenida que contiene (1) SDF-1 y (2) un hidrogel que contiene gelatina

   modificada que tiene un grupo carboxilo y/o un grupo sulfo. 5
2. 2. La composición de liberación sostenida de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el hidrogel que contiene gelatina modificada que tiene un grupo carboxilo y/o un grupo sulfo es un hidrogel de gelatina succinada, un hidrogel de gelatina sulfoacetilada o una mezcla de los mismos en una proporción arbitraria.

   10 3. La composición de liberación sostenida de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el hidrogel de gelatina succinada, el hidrogel de gelatina sulfoacetilada o la mezcla de los mismos en una proporción arbitraria se produce reticulando gelatina succinada, gelatina sulfoacetilada o una mezcla de las mismas en una proporción arbitraria al punto isoeléctrico de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 5,0 usando un agente de reticulación.

   15 4. La composición de liberación sostenida de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el hidrogel de gelatina succinada, el hidrogel de gelatina sulfoacetilada o la mezcla de los mismos en una proporción arbitraria se produce reticulando gelatina succinada, gelatina sulfoacetilada o una mezcla de las mismas en una proporción arbitraria a la proporción de modificación de aproximadamente el 15% hasta aproximadamente el 30% usando un agente de reticulación.

3. 5. La composición de liberación sostenida de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el hidrogel de gelatina succinada, el hidrogel de gelatina sulfoacetilada o la mezcla de los mismos en una proporción arbitraria se produce reticulando gelatina succinada, gelatina sulfoacetilada o una mezcla de las mismas en una proporción arbitraria que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 90.000 a aproximadamente 110.000 usando un agente de

   25 reticulación.
4. 6. La composición de liberación sostenida de acuerdo con la reivindicación 1, en la que SDF-1 es SDF-1α, SDF-1β o una mezcla de los mismos en una proporción arbitraria.

   30 7. La composición de liberación sostenida de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en una inyección, administración transnasal, administración transdérmica, administración rectal o implante.

5. 8. La composición de liberación sostenida de acuerdo con la reivindicación 7 para uso en implante.

   35 9. La composición de liberación sostenida de acuerdo con la reivindicación 8, que tiene una proporción de contenido de agua de desde aproximadamente el 95% hasta aproximadamente el 98%.

6. 10. La composición de liberación sostenida de acuerdo con la reivindicación 8, en la que SDF-1 se libera durante al

   menos 1 semana. 40
7. 11. La composición de liberación sostenida de acuerdo con la reivindicación 10, en la que SDF-1 se libera durante aproximadamente 1 mes hasta aproximadamente 2 meses.
8. 12. La composición de liberación sostenida de acuerdo con la reivindicación 7, en la que la inyección es inyección de 45 microesfera subcutánea.
9. 13. La composición de liberación sostenida de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento y/o supresión de progresión de síntomas de enfermedad isquémica o enfermedad ósea.

   50 14. Una preparación farmacéutica que comprende la composición de liberación sostenida de acuerdo con la reivindicación 1.
10. 15. La preparación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 14 para su uso en el tratamiento y/o supresión de

    progresión de síntomas de enfermedad isquémica o enfermedad ósea. 55