ES2371379T3 - Prueba de diagnóstico para vaginosis bacteriana. - Google Patents

Prueba de diagnóstico para vaginosis bacteriana. Download PDF

Info

Publication number
ES2371379T3
ES2371379T3 ES09166010T ES09166010T ES2371379T3 ES 2371379 T3 ES2371379 T3 ES 2371379T3 ES 09166010 T ES09166010 T ES 09166010T ES 09166010 T ES09166010 T ES 09166010T ES 2371379 T3 ES2371379 T3 ES 2371379T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
sample
test
sialidase
chloro
color change
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES09166010T
Other languages
English (en)
Inventor
Michael Millar
Tony Corfield
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Bristol
Original Assignee
University of Bristol
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Bristol filed Critical University of Bristol
Application granted granted Critical
Publication of ES2371379T3 publication Critical patent/ES2371379T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
    • C12Q2334/50—Indoles
    • C12Q2334/52—5-Bromo-4-chloro-3-indolyl, i.e. BCI
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • G01N2333/926—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) acting on alpha -1, 4-glucosidic bonds, e.g. hyaluronidase, invertase, amylase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/36—Gynecology or obstetrics
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/805—Test papers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/968—High energy substrates, e.g. fluorescent, chemiluminescent, radioactive
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/975—Kit

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)

Abstract

Un método para el diagnóstico de la vaginosis bacteriana que comprende la detección de la actividad de la sialidasa en una muestra, cuyo método comprende las etapas siguientes: (a) contactar la mencionada muestra con un reactivo de prueba que comprenda el acido neuramico acetilo 5- bromo-4-cloro-3 indolyl α-D-N o bien una sal del mismo; y (b) detectar un cambio en el reactivo de prueba.

Description

Prueba de diagnóstico para vaginosis bacteriana
Esta invención está relacionada con un método para la detección de vaginosis bacteriana. Se expone también un dispositivo para su uso en dicho método y un conjunto que comprende dicho dispositivo.
La vaginosis bacteriana (VB) es un estado en el cual la mayor parte de los numerosos microorganismos que pueblan la vagina (Lactobacilli) son desplazados por otro microorganismo tal como la Gardnerella vaginalis. La VB está asociada con el parto pretérmino (PPT). El mecanismo responsable de esta asociación se piensa a que es debido a la flora relacionada con la VB que consigue el acceso al útero y que provoca la liberación de mediadores de inflamatorios que inician el parto.
Se había pensado previamente que en la VB, la infección bacteriana en sí misma daba lugar al PPT. Los antibióticos se han utilizado comúnmente para el tratamiento de la VB, por ejemplo para prevenir el PPT, pero dicho tratamiento obtiene rara vez el éxito. Además, los antibióticos pueden eliminar las bacterias no patógenas, incluyendo las cepas beneficiosas tales como el Lactobacilli.
En el momento actual, la presencia de la VB se detecta sobre la base de un examen clínico y por la tinción de Gram por la característica de las bacterias de la enfermedad. Se requieren unos pocos días con el fin de conseguir un resultado, utilizando la tinción de Gram, de forma que no se puede informar al paciente del resultado en el instante de la visita a la clínica.
Durante el embarazo, no existe ninguna barrera membranosa entre la vagina y el útero para poder prevenir una infección bacteriana ascendente. No obstante, el tapón de moco cervical se cree que actúa como una barrera física en la infección intra-útero.
El tapón de moco está construido sobre una infraestructura de glicoproteinas ricas en carbohidratos, denominadas mucinas. Las mucinas están compuestas por cadenas laterales de oligosacáridos unidas a un núcleo central de proteínas. Los residuos del ácido sialico están presentes en los extremos terminales de las cadenas laterales del carbohidrato.
Los altos niveles de la actividad de la sialidasa bacteriana se han encontrado en las secreciones de la vagina de las mujeres con VB, en oposición a las mujeres sin VB (MacGregor y otros (1994) Am. J.Obstet. Gynaecol. 170 10481060; Briselden y otros (1992) J. Clin. Microbiol. 30 663-666).
Las sialidasas bacterianas son enzimas que se unen a los residuos del ácido siálico de los glicolipídos y glicoproteinas. Hasta la fecha actual, la actividad de la sialidasa se ha ensayado por técnicas de colorimetría, fluorimetría, y técnicas radioactivas utilizando una amplia variedad de substratos sialoglicoconjugados sintéticos. Los substratos que se han utilizado previamente en los ensayos de la actividad de la sialidasa incluyen: mucina de la glándula submandibular bovina y glicoproteina ácida a-1 humana (Howe y otros (1999) en prensa); ácido 2’-(4-metilumbeliferilo)-a-D-N-acetilo neuraminico (Paupermpoonsiri y otros (1996) Clin.Inf. Dis. Vol. 23 748-752; Brieselden y otros (1992) supra) Moncla y otros (1989) J. Clin. Microbiol, 27, 182-184; ácido 4-nitrofenilo-a sialico, y ácido 2-(3metoxifenilo)-N-acetilo-D neuramínico (MacGregor y otros (1994) supra). La sensibilidad de muchos de los substratos de sialidasa conocidos es baja.
Los substratos de sialidasa descritos hasta la fecha se utilizan en una amplia variedad de ensayos. Por ejemplo, pueden utilizarse ensayos de colorimetría o fluorimétricos con substratos sintéticos, los cuales detectan la fracción no siálica del substrato (por ejemplo, 4-metil umbeliferona ó 4-nitrofenol). Alternativamente, la cantidad de ácido siálico liberado a partir de un substrato sialoglicoconjugado puede ser detectada por HPLC o un ensayo de colorimetría. Así mismo, los ensayos radioactivos se utilizan algunas veces, lo cual incluye la introducción de un radiomarcaje dentro del substrato sialoconjugado y la detección del ácido siálico liberado por el cómputo de centelleo líquido. Se ha descrito en el documento JP5339283 un método para preparar ácido 5-bromo-4-cloro-3indoilo a-D-N-acetilo neuramínico, para su utilización en la recuperación de la enzima similar a la sialidasa. El documento WO00/24753 (disponible como una referencia bajo el Articulo 54(3) EPC)) describe unos materiales y metodos para el diseño, síntesis, y evaluación bioquímica de los compuestos de substratos cromogénicos para las sialidasas de origen bacteriano, viral, protozoito y vertebrado (incluyendo seres humanos). Se describe una clase de compuestos como los substratos cromogénicos de estas sialidasas, que generan productos cromogénicos después de las reacciones catalizadas por las sialidasas. Se describen también unos métodos de obtención de estos compuestos de los substratos, métodos de diagnosis y prognosis de sialidasa en relación con las enfermedades que utilizan estos compuestos de los substratos.
Los presentes inventores han descubierto que la conexión entre PPT y VB es debido a la actividad de la sialidasa bacteriana, más bien que a la propia infección bacteriana. Se cree que la actividad de la sialidasa está incluida en la
E09166010 08-11-2011
degradación del tapón de moco, lo cual da lugar a un acceso bacteriano en incremento dentro del tracto reproductor superior.
Los grupos carboxílicos de los ácidos siálicos en los extremos de las cadenas laterales de los carbohidratos de las moléculas de mucina confieren una carga iónica negativa, provocando rigidez en las cadenas laterales de azúcar. La unión del ácido siálico destruye la carga mutuamente repelente entre las moléculas de mucina, provocando una pérdida de viscosidad del tapón de moco. El acceso bacteriano al interior del tracto reproductor superior se incrementa como resultado de esta acción por dos razones. En primer lugar, la mucina y por tanto la organización de la matriz del moco se pierde después de la degradación, y las propiedades mecánicas y bacterioestáticas de la matriz del moco se convierten en menos efectivas como mecanismos de barrera. En segundo lugar, la desintegración de la capa del moco facilita la adherencia bacteriana al epitelio subyacente, lo cual altera las respuestas del reconocimiento inmunológico, y reduce la probabilidad de que las bacterias puedan ser lavadas y eliminadas por el movimiento del fluido vaginal. Se deduce de este descubrimiento que los inhibidores de sialidasa tienen que ser útiles para tratar y prevenir condiciones tales como la vaginosis bacteriana, y serán útiles en terapias para prevenir PPT. Se deduce también que los ensayos de la actividad de la sialidasa serán útiles para detectar enfermedades tales como la VB.
Los presentes inventores han desarrollado un ensayo de diagnóstico para enfermedades tales como la VB, que detecta la presencia de actividad de la sialidasa. Un resultado de este ensayo ha encontrado la correlación significativa con la incidencia de VB utilizando la diagnosis convencional de la tinción de Gram. El método del ensayo incluye la toma de una muestra en el paciente y poner en contacto la muestra con el substrato de sialidasa. Después de la incubación, se observa un cambio detectable tal como un cambio del color en caso de detectar la actividad de la sialidasa. En una realización preferida, el ensayo es un ensayo rápido (o test spot), es decir que la muestra se aplica al substrato de sialidasa, el cual está soportado en sí por un medio sólido adecuado, tal como un papel de filtro.
El ensayo hace uso de substratos en los que se ha encontrado una sensibilidad muy alta en la detección de la VB, indicado posiblemente un entorno óptimo para la unión de sialidasas a partir de la flora de la VB. El substrato utilizado en el presente ensayo es una sal de ácido neuramínico 5-bromo-4-cloro-3-indoil a-D-N-acetilo, en particular el ciclohexilamina (X-a-NAMA), que se encuentra disponible a través de Rose Scientific Ltd., Edmonton, Canadá.
El método del ensayo de la presente invención para detectar la actividad de la sialidasa es altamente sensible, de bajo costo de ejecución rápido y sencillo de utilizar. El ensayo es especialmente útil para la prueba de la actividad de la sialidasa como un indicador de la VB, y por tanto un predictor de la probabilidad de nacimiento pretérmino. El ensayo puede llevarse a cabo en la misma sala del paciente o bien una clínica general o de cirugía menor, puesto que el método de la invención no requiere el uso de unidades de equipamiento costoso o bien materiales distintos a los que están disponibles normalmente. Por ejemplo, en contraste con los métodos convencionales, no hay necesidad de un equipo de tinción de Gram o bien un microscopio básico. Además de ello, el método de la invención exige menos trabajo que una tinción de Gram.
Así mismo, el ensayo rápido (spot) de sialidasa tiene una ventaja sobre las pruebas de colorimetría, fluorimetria o radioactividad, las cuales se utilizan normalmente para detectar la VB porque puesto que la actividad de la sialidasa no está siempre presente en la orina de la VB o bien toda la flora de la VB, su presencia puede ser un indicador de que el estado es más perjudicial para el huésped en algunos casos que en otros.
De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un método para el diagnostico de las vaginosis bacteriana que comprende la detección de la actividad de la sialidasa en una muestra, cuyo método comprende los pasos siguientes:
(a)
contactar la mencionada muestra con un reactivo de prueba que comprende ácido 5-bromo-4cloro-3-indoyl a-D-N-acetilo neuramínico, o bien una sal del mismo; y
(b)
detectar un cambio en el reactivo de prueba.
El reactivo del ensayo puede comprender, por ejemplo, un medio de fase sólida, líquida o un gel, en donde se encuentra soportado el ácido neuramínico 5-bromo-4-cloro-3-indoyl a-D-N-acetilo o una sal del mismo, aplicado, absorbido o bien contenido de otra forma.
El ácido 5-bromo-4-cloro-3-indoyl a-D-N-acetilo neuramínico es preferiblemente de la forma de la sal ciclohexilamina. Preferiblemente, el ácido 5-bromo-4-cloro-3-indoyl a-D-N-acetilo neuramínico ciclohexil amina está soportado o absorbido sobre un substrato sólido, por ejemplo un papel de filtro. De esta forma, el compuesto reactivo puede estar inmovilizado sobre el substrato, para facilitar la realización del ensayo del diagnóstico. Dicho ensayo del diagnóstico en donde el compuesto reactivo es absorbido sobre un medio sólido se denomina con frecuencia como un ensayo de tipo mancha, puesto que el ensayo del diagnóstico en sí se realiza por el “manchado” de la muestra
E09166010 08-11-2011
(sobre un extracto de la muestra), sobre el medio sólido en la zona en donde se haya absorbido el compuesto reactivo.
La muestra puede obtenerse directamente a partir de un sujeto mamífero, típicamente un sujeto humano, por ejemplo como un tampón de algodón, o un lavado utilizando un tampón adecuado. Después de haber tomado la muestra, puede aplicarse o ponerla en contacto directamente con el reactivo del ensayo. Alternativamente, por ejemplo cuando la muestra es un tampón de algodón, los contenidos de la muestra pueden extraerse en un medio líquido, por ejemplo una solución tampón tal como un tampón de Tris, y aplicándose después al reactivo del ensayo. Esta puede ser la aplicación del método del ensayo más conveniente.
El método de prueba es para la detección de la VB, y en una realización preferida, la muestra se toma como un tampón de algodón vaginal o muestra del paciente humano mujer.
Después de que la muestra haya sido puesta en contacto con el reactivo de prueba, se observará cualquier cambio en el reactivo de prueba. En el caso en que el reactivo de prueba comprenda la amina ciclohexil del acido neuraminico 5-bromo-4-cloro-3-indoyl a-D-N-acetilo, el cambio es un cambio de color, desde el incoloro al azul. Este cambio puede ser observado visualmente, o bien puede llevarse a cabo utilizando un equipamiento adecuado, tal como un colorímetro de pruebas de tira, o bien un espectrofotómetro, el cual podría utilizarse para cuantificar el resultado. Se prefiere que la parte del fondo del substrato no tenga un color que pudiera oscurecer o enmascarar el cambio de color en el compuesto del reactivo. Se prefiere también que el reactivo de prueba sin reaccionar sea de un color que no se muestre sobre el fondo del substrato. Preferiblemente el reactivo de prueba no reaccionado sea incoloro.
Se describe también un conjunto que puede ser utilizado en el primer aspecto de la presente invención, que comprende un reactivo de prueba, que comprende el acido neuraminico 5-bromo-4-cloro-3-indoyl a-D-N-acetilo o bien una sal del mismo.
El reactivo de prueba es preferiblemente un dispositivo en la forma de un medio solido en el cual está soportado o absorbido el acido neuraminico 5-bromo-4-cloro-3-indoyl a-D-N-acetilo o bien una sal del mismo.
El reactivo de ensayo preferido es un papel de filtro impregnado en una solución de ácido 5-bromo-4-cloro-3-indoyl a-D-N-acetilo neuramínico y ciclohexilo amina. Preferiblemente, el papel de filtro está impregnado en una solución de ácido 5-bromo-4-cloro-3-indoyl a-D-N-neuramínico y ciclohexilo amina, en aproximadamente 1 mg/ml. El papel de filtro puede utilizarse directamente o bien secarse o almacenarse para un uso futuro. En consecuencia, el equipo de elementos puede comprender 5-bromo-4-cloro-3-indoyl a-D-N-acetilo acido neuramínico ciclohexilo amina (por ejemplo en solución) y un medio sólido (por ejemplo un papel de filtro) tal que el usuario pueda aplicar el substrato al medio sólido, o bien en donde el conjunto de elementos puede comprender un medio sólido al cual se haya aplicado y secado una solución de 5-bromo-4-cloro-3-indoyl a-D-N-acetilo acido neuramínico ciclohexilo amina.
El conjunto de elementos puede comprender también un medio de incubación, por ejemplo una solución tampón Tris/HCL y/o unos medios de obtención de una muestra, y pudiendo empaquetarse conjuntamente en un envase adecuado con las instrucciones adecuadas para su utilización.
El reactivo del ensayo utilizado en la presente invención puede prepararse por un proceso en el cual el compuesto reactivo se lleva a entrar en contacto con un sólido adecuado o un medio de fase de gel, de forma que el compuesto reactivo esté contenido o soportado o absorbido en el medio. Por ejemplo, el compuesto reactivo puede ser preparado en una solución adecuada, la cual se aplica entonces al medio sólido.
Una forma preferida del reactivo es un dispositivo de un substrato sólido en donde el reactivo de prueba se aplica a una superficie de un substrato sólido para formar un parche local que es donde se llevará a cabo la prueba de diagnostico.
Tal como se ha descrito anteriormente, el método del primer aspecto de la invención se utiliza para diagnosticar la vaginosis bacteriana.
Preferiblemente el sujeto mamífero es una mujer embarazada o bien una mujer que esté valorando quedarse embarazada.
La presente invención puede ser utilizada en un método para diagnosticar PPT en un sujeto humano, cuyo método comprende la etapa de ensayo de la actividad de la sialidasa bacteriana en el paciente o en una muestra tomada del paciente.
Se describe también un método de tratamiento de la VB o de prevención del PTL, cuyo método comprende la etapa de administrar un inhibido de la sialidasa al paciente.
E09166010 08-11-2011
Se describe también el uso de un inhibidor de la sialidasa en la fabricación de una composición terapeutica o profiláctica para el tratamiento de la VB o para la prevención del PTL.
Para una mejor comprensión de la presente invención, y para mostrar la forma en que la misma puede entrar en efecto, se hace referencia a continuación, a modo de ejemplo, al ejemplo siguiente.
EJEMPLO
Ensayo paralelo de tinción Gram y prueba de mancha (spot) de sialidasa para el diagnóstico de la VB.
100 mujeres en consulta en la Clínica Genito Urinaria de Milne, Hospital de Bristol Royal, fueron sometidas a pruebas de la actividad de sialidasa adicionalmente a la rutina de tinción de Gram para la detección de la VB. Se tomó una compresa por separado en el instante del examen, y se colocó inmediatamente en una solución tampón compuesta por 2 mls 25 mM Tris/HC1/Tween 20 (ph 7,0). Las compresas se colocaron en un almacenamiento frío a 4oC hasta el final del examen clínico.
El ácido del substrato de acido sialico 5-Bromo-4-cloro-3-indolyl-a-D-N-acetiloneuramínico y la sal de ciclohexilamina se pesaron hasta una concentración de 1 mg/ml en una solución tampón de 25 mM CaCl, 150 M Na acetato y 1 M NaCl (ph 5,5). Esto se mezclo debidamente y se trasladó con pipeta sobre una pieza de 10 cm de diámetro de papel de filtro, hasta que el papel de filtro quedara humedecido. Las compresas se retiraron de la solución Tris y se frotaron sobre el papel de filtro inoculado con el substrato. El papel de filtro se colocó en un disco de Petri, cerrándose la tapa y el disco incubado durante 1 hora a 37oC. Apareció una mancha azul indicando que estaba presente la actividad de la sialidasa. En caso de no existir ninguna actividad de la sialidasa, el papel permanecería sin color incluso después de un periodo de 2 horas con antelación al secado del papel de filtro.
La diagnosis del test de Gram de VB se valoró por los criterios de Spiegel (1980). El grado 2 VB según lo definido por Hay y otros (1992) es una categoría problemática, cuya relación tanto con la VB como con la flora vaginal “normal” requiere una aclaración adicional. Esta categoría no cumple con la definición de la VB, y no está claro si el Grado 2 VB es una indicación de que la colonización con los microorganismos de la VB desarrollan una progresión ascendente. En este estudio, por tanto, los Grados 1 y 2 forman un conjunto común para los fines del análisis estadístico, aunque la valoración inicial de las tinciones de Gram los divide en el Grado 1 (predominantemente Lactobacilus morfo-tipos, Grado 2 (mezclados los Lactobacilus y los organismos asociados con la VB), y Grado 3 (pocos o ningún Lactobacilli, organismos VB predominantes con la presencia de células de indicio). Los observadores fueron ciegos a los resultados del ensayo de tipo mancha, y los observadores del ensayo spot fueron ciegos a los resultados de la tinción Gram.
Resultados
Los resultados de la tinción Gram para la VB fueron correlacionados con los resultados del ensayo mancha. Los resultados de Grado 1 y Grado 2 fueron conjuntados en forma común para los análisis estadísticos, ya que el Grado 2 no se consideró como una diagnosis definitivo de la VB, y las cifras numéricas en este estudio fueron relativamente pequeñas.
Los rangos de las edades de los pacientes fueron de 16 años a 52 años con una edad media de 28,3 años, una mediana de 26 años y la moda de 25 años.
Un ensayo mancha positivo de la actividad de la sialidasa se correlacionó significativamente con la incidencia del Grado 3 de la VB en el diagnóstico de la tinción Gram al nivel de p<0,000001. La sensibilidad del ensayo mancha en la detección de la VB fue por tanto de 93,5 y la especifidad 96,3. El valor predictivo positivo fue de 95,6 y el valor predictivo negativo de 94,5. Los criterios de Amsells (1990) fueron asociados significativamente con los resultados del ensayo mancha al nivel de p=0,04, con una sensiblidad de 93,7, especifidad de 70,5, un valor predictivo positivo de 57,6 y un valor negativo de 96,2.
E09166010 08-11-2011

Claims (9)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un método para el diagnóstico de la vaginosis bacteriana que comprende la detección de la actividad de la sialidasa en una muestra, cuyo método comprende las etapas siguientes:
    5 (a) contactar la mencionada muestra con un reactivo de prueba que comprenda el acido neuramico acetilo 5bromo-4-cloro-3 indolyl a-D-N o bien una sal del mismo; y
    (b) detectar un cambio en el reactivo de prueba.
  2. 2.
    Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el cambio detectado es un cambio de color.
  3. 3.
    Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el cambio de color es del incoloro al azul.
    10 4. Un método de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3, en donde el cambio de color se detecta visualmente.
  4. 5.
    Un método de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3, en donde el cambio de color se detecta utilizando un equipamiento adecuado para detectar el cambio del color.
  5. 6.
    Un método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el equipamiento es un colorímetro de tiras o bien un espectrofotómetro.
    15 7. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la muestra es una muestra biológica obtenida de un sujeto humano.
  6. 8.
    Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la muestra es un tampón de algodón vaginal o un lavado.
  7. 9.
    Un método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la muestra es un tampón de algodón vaginal y en
    20 donde los contenidos del algodón vaginal son extraídos en un medio liquido antes de contactar con la prueba.
  8. 10.
    Un método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el medio líquido es una solución tampón Tris.
  9. 11.
    Un método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde la sal del acido neuramico 5-bromo4-cloro-3-indolyl a-D-N-acetilo es una sal de ciclohexilamina
ES09166010T 1999-03-17 2000-03-17 Prueba de diagnóstico para vaginosis bacteriana. Expired - Lifetime ES2371379T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9906140.0A GB9906140D0 (en) 1999-03-17 1999-03-17 A diagnostic test
GB9906140 1999-03-17

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2371379T3 true ES2371379T3 (es) 2011-12-30

Family

ID=10849813

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES00911070T Expired - Lifetime ES2329541T3 (es) 1999-03-17 2000-03-17 Prueba de diagnostico.
ES09166010T Expired - Lifetime ES2371379T3 (es) 1999-03-17 2000-03-17 Prueba de diagnóstico para vaginosis bacteriana.

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES00911070T Expired - Lifetime ES2329541T3 (es) 1999-03-17 2000-03-17 Prueba de diagnostico.

Country Status (15)

Country Link
US (1) US6607896B1 (es)
EP (2) EP2107121B1 (es)
JP (1) JP4606590B2 (es)
CN (1) CN1351670A (es)
AT (2) ATE523598T1 (es)
AU (1) AU781518B2 (es)
CA (1) CA2366949C (es)
DE (1) DE60042642D1 (es)
DK (1) DK1163361T3 (es)
ES (2) ES2329541T3 (es)
GB (1) GB9906140D0 (es)
HK (2) HK1045176A1 (es)
IL (1) IL145378A0 (es)
PT (1) PT1163361E (es)
WO (1) WO2000055354A2 (es)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1503908A (zh) * 2001-02-15 2004-06-09 妇女体液样品中涉及存在唾液酸酶或氨酰基脯氨酸二酞酶活性的病理风险确定的酶检验方法
JP4740486B2 (ja) * 2001-08-02 2011-08-03 三菱化学メディエンス株式会社 新規の細菌分析方法
US7704702B2 (en) * 2006-08-10 2010-04-27 Inverness Medical Switzerland Gmbh Test strip for lateral flow assays
US7591978B2 (en) * 2006-08-10 2009-09-22 Inverness Medical Switzerland Gmbh Solid phase test device for sialidase assay
US9034593B2 (en) 2010-11-22 2015-05-19 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Vaginal indicator to detect biomarkers of good health
CN102251022A (zh) * 2011-06-23 2011-11-23 泰普生物科学（中国）有限公司 一种***炎快速检测试剂盒
CN102251021A (zh) * 2011-06-23 2011-11-23 泰普生物科学（中国）有限公司 一种细菌性***病检测试剂盒及唾液酸酶检测方法
CN103728460B (zh) * 2014-01-17 2015-05-27 广州鸿琪光学仪器科技有限公司 一种自动化细菌性***病检测仪
GB201812331D0 (en) * 2018-07-27 2018-09-12 Mologic Ltd Bacterial vaginosis diagnostic

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2450877A1 (fr) 1979-03-06 1980-10-03 Inst Nat Sante Rech Med Nouveaux tests par agglutination pour la detection des virus de la grippe, et reactifs pour la realisation de ces tests
JP2904647B2 (ja) * 1992-06-12 1999-06-14 株式会社蛋白工学研究所 ５−ブロム−４−クロロインド−３−イル−２−シアル酸の製造方法
US6387650B1 (en) * 1995-06-07 2002-05-14 Biocontrol Systems, Inc. Method and composition for detecting bacterial contamination in food products
WO2000024753A1 (en) * 1998-10-27 2000-05-04 Ibbex, Inc. Chromogenic substrates of sialidase and methods of making and using the same

Also Published As

Publication number Publication date
WO2000055354A3 (en) 2000-12-21
HK1045176A1 (zh) 2002-11-15
DE60042642D1 (de) 2009-09-10
JP4606590B2 (ja) 2011-01-05
AU3306600A (en) 2000-10-04
IL145378A0 (en) 2002-06-30
GB9906140D0 (en) 1999-05-12
WO2000055354A2 (en) 2000-09-21
DK1163361T3 (da) 2009-10-05
EP2107121A3 (en) 2009-11-18
HK1131641A1 (en) 2010-01-29
AU781518B2 (en) 2005-05-26
ATE523598T1 (de) 2011-09-15
JP2003503009A (ja) 2003-01-28
PT1163361E (pt) 2009-09-01
EP1163361A2 (en) 2001-12-19
EP2107121A2 (en) 2009-10-07
ES2329541T3 (es) 2009-11-27
EP1163361B1 (en) 2009-07-29
US6607896B1 (en) 2003-08-19
CA2366949A1 (en) 2000-09-21
CN1351670A (zh) 2002-05-29
CA2366949C (en) 2012-05-29
ATE437959T1 (de) 2009-08-15
EP2107121B1 (en) 2011-09-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20070128589A1 (en) Substrates, sensors, and methods for assessing conditions in females
JP4011479B2 (ja) 早産、胎児感染及び胎児損傷の産前診断用診断試薬及びこれを含む診断キット
ES2371379T3 (es) Prueba de diagnóstico para vaginosis bacteriana.
US5223403A (en) Device for diagnosing periodontal disease
ES2436372T3 (es) Detección de Trichomonas y Candida
US5420014A (en) Rapid in vitro test for helicobacter pylori using saliva
Pastorek et al. Clinical and microbiological correlates of vaginal trichomoniasis during pregnancy
WONG et al. Urinary tract infection among women attending a clinic for sexually transmitted diseases
Platz-Christensen et al. Increased prostaglandin concentrations in the cervical mucus of pregnant women with bacterial vaginosis
Sellors et al. Chlamydial cervicitis: testing the practice guidelines for presumptive diagnosis
Demetriou et al. Evaluation of an enzyme immunoassay for detection of Neisseria gonorrhoeae in an adolescent population
McIntosh et al. Clinical application of urine antigen detection in early onset group B streptococcal disease.
THOMASON et al. Effectiveness of Gonozyme for detection of gonorrhea in low-risk pregnant and gynecologic populations
Wiggins et al. Application of a novel human cervical mucin-based assay demonstrates the absence of increased mucinase activity in bacterial vaginosis
Matsuda et al. Utility and limitations of a method for detecting Helicobacter pylori-specific antigens in the stool
Bhopale et al. Assessment of enzyme linked immunosorbent assay based diagnostic kits (Toxokit-G and Toxokit-M) for the detection of IgG and IgM antibodies to Toxoplasma gondii in human serum
JP4245767B2 (ja) 破水の検出方法
Pham et al. Clinical Characteristics and Risk Factors Associated with Chlamydia Trachomatis Infection in Women Presenting at “Da Nang Hospital for Women and Children”
UA139227U (uk) Спосіб оцінки динаміки відновлення функціонального стану канальцевого нефротелію у хворих на кальцій-оксалатний нефролітіаз на тлі застосування комплексної метафілактики
Bax Clinical characteristics, serolog and sero ar studies on Chlam dia trachomatis infections
Masangkay et al. Asian Journal of Biological and Life Sciences Original Research