ES2356536B1 - Una composición de uso como prebiótico que contiene un extracto de granada y un alimento que incluye dicha composición. - Google Patents

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Abstract

Una composición de uso como prebiótico que contiene un extracto de granada y un alimento que incluye dicha composición.
La presente invención reivindica el uso de extractos vegetales de olivo (Olea europaea L.) y granado (Punica granatum) y de diversas combinaciones de dichos extractos, algunas adicionalmente incluyendo un probiótico, que posibilitan un efecto sinérgico entre los componentes bioactivos de los mismos, para la preparación de suplementos dietarios, alimentos/bebidas funcionales, aditivos alimentarios y medicamentos para su uso en el cuidado de la salud humana.

Description

Una composición de uso como prebiótico que contiene un extracto de granada y un alimento que incluye dicha composición.
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Campo de la invención
La presente invención reivindica el uso de extractos vegetales y de diversas combinaciones de dichos extractos, algunas adicionalmente incluyendo un probiótico, que posibilitan un efecto sinérgico entre los componentes bioactivos de los mismos, para la preparación de suplementos dietarios, alimentos/bebidas funcionales, aditivos alimentarios y medicamentos para su uso en el cuidado de la salud humana.
Más concretamente, la invención describe el uso de un extracto de oliva estandarizado a hidroxitirosol
(MEDITEANOX®) y de un extracto de granada estandarizado a punicalaginas (POMANOX®) como ingredientes prebióticos. Dentro del alcance reivindicado se describe también el uso de los extractos de granada y oliva mencionados con propiedades prebióticas en combinación con un probiótico para la producción de un simbiótico (se define como aquel alimento que contiene una mezcla específica de bacterias probióticas y sustancias prebióticas). Además, la invención describe las combinaciones de los extractos de granada y/o oliva con efecto prebiótico o bien de otros prebióticos o de una fibra dietaria con un extracto vegetal conteniendo glucosinolatos, ej. un extracto de brócoli, al encontrar que una estimulación selectiva de determinadas poblaciones de la microflora del colon, ej géneros Bifidobacterium y Lactobacillus, mejora la biodisponibilidad en nuestro organismo de isotiocianatos formados en el colon a partir de sus precursores, los glucosinolatos.
Se ha de hacer constar que cuando en esta invención se hace referencia al uso de un alimento, se entiende comprendido en esta acepción igualmente un suplemento dietario, un alimento funcional, un aditivo alimentario o un medicamento.
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Antecedentes de la invención
El tracto digestivo de un adulto contiene una flora compuesta aproximadamente por 10^{14} microorganismos, con alrededor de 400-500 especies bacterianas distintas. La población dominante se compone de bacterias anaerobias estrictas: Bacteroides, Bifidobacterium, Eubacterium y Peptostreptococcus. La flora subdominante comprende bacterias que pertenecen a los géneros Streptococcus y Lactobacillus, y en menor medida, Enterococcus, Clostridium y levaduras. La mayoría de estas especies tiene un papel beneficioso, pero otras son potencialmente patógenas, como algunas especies de Clostridium, aunque su reducido número y competencia con otras bacterias impiden su proliferación y su acción patógena.
La flora gastrointestinal realiza en el organismo diversas funciones. Su importancia es principalmente defensiva, ya que previene la colonización por microorganismos patógenos y modula el sistema inmune mediante la inducción de tolerancia y la producción de inmunoestimulantes no inflamatorios. Por otra parte, el metabolismo de la flora supone una importante fuente de energía para la pared intestinal debido a la fermentación de carbohidratos a ácidos orgánicos, además produce la síntesis de algunas vitaminas, como K y algunas B. No menos importante, es el papel que ejercen los microorganismos en la regulación del tránsito intestinal.
La estabilidad de la flora gastrointestinal depende de diversos parámetros: fisiológicos, como la edad, la menopausia y las situaciones de estrés; ciertas enfermedades, en especial diarrea, colitis y enfermedad de Crohn y el consumo de fármacos, en especial los antibióticos; y nutricionales. En este último aspecto es donde entra en juego el consumo de probióticos, prebióticos y simbióticos.
Los probióticos son microorganismos no patógenos que, cuando se ingieren, ejercen una influencia positiva sobre la salud o fisiología del huésped. Las preparaciones comerciales de probióticos están formadas principalmente por bacterias de los géneros Bifidobacterium y/o Lactobacillus.
Un prebiótico se define como un ingrediente alimenticio no digerible que tiene el potencial de mejorar la salud del huésped, por estimular selectivamente el crecimiento y/o actividad de una o un número limitado de bacterias en el colon (Gibson y col., 2004). Para que un ingrediente sea considerado como prebiótico debe cumplir tres requisitos (Collins y Gibson, 1999): i) que no sea absorbido ni hidrolizado en el estómago; ii) que sea un sustrato selectivo para una o un limitado número de bacterias potencialmente beneficiosas en el colon, estimulando el crecimiento y/o la actividad metabólica de la/s misma/s; iii) que como consecuencia de las anteriores, sea capaz de alterar la composición de la flora intestinal hacia una composición más rica en bacterias beneficiosas.
Un simbiótico se define como aquel alimento que contiene una mezcla específica de bacterias probióticas y sustancias prebióticas.
Diversas sustancias han demostrado su actividad como prebióticos, entre las que destacan la inulina y los fructooligosacáridos (FOS). Estos afectan significativamente la composición de la flora intestinal, reducen la incidencia de infecciones gastrointestinales, respiratorias y de la dermatitis atópica y además producen un aumento de la población de Bifidobacterium en el colon. Otros oligo y polisacáridos pueden actuar como prebióticos.
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Existe una amplia bibliografía que define los efectos beneficiosos para la salud del consumo de ingredientes prebióticos (véase revisión de Venter, 2007), en ensayos desarrollados in vitro, así como in vivo con modelos animales y en humanos. La investigación ha derivado en la identificación de marcadores biológicos capaces de demostrar los efectos de los prebióticos. Estos marcadores son: i) cambios en la flora gastrointestinal y en el metabolismo global del ambiente gástrico, destacando la producción de ácidos orgánicos; ii) modulación del sistema inmune, valorando procesos inflamatorios e inmunoglobulinas; iii) incremento de la absorción de minerales en el colon, como calcio, zinc o magnesio; iv) regulación del metabolismo lipídico, disminuyendo el nivel de colesterol; v) prevención de cáncer de colon. Éste último punto ha despertado enorme interés en los últimos años y diversas publicaciones demuestran el efecto preventivo de los prebióticos en este cáncer (véanse las revisiones de Pool-Zoobel, 2005 y Liong,
2008).
En ocasiones parte del efecto puede producirse a nivel del propio intestino, pero esto no implica que el efecto no pueda transmitirse a otros órganos diana del organismo humano. Como ejemplo, la fibra alimentaria, (Ej: fibra soluble) puede actuar secuestrando ácidos biliares en el propio intestino, lo que lleva a que no puedan ser reabsorbidos y en consecuencia el hígado responde utilizando el colesterol endógeno para sintetizar más ácidos grasos biliares in enviarlos al intestino. Pero un segundo mecanismo de acción implica que cuando la fibra soluble sufre fermentación en el intestino incrementa la producción de ácidos grasos de cadena corta como el propionato. El propionato es absorbido en el colon a través de la vena portal y se ha demostrado que inhibe a la HMGR en el hígado.
La aplicación ES 2 198 126 T3 describe el uso del carbohidrato D-tagatosa como componente alimenticio prebiótico. Su consumo induce la producción de butirato en el colon, lo que posiblemente tenga un efecto protector frente al cáncer de colon.
La aplicación ES 2 278 021 T3 describe el empleo de una composición que comprende un prebiótico para disminuir el proceso inflamatorio y activación anormal de parámetros inmunológicos no específicos. El prebiótico comprende un oligosacárido producido a partir de glucosa, galactosa, xilosa, maltosa, sucrosa, lactosa, almidón, xilano, hemicelulosa, inulina, goma (por ejemplo goma acacia) o una mezcla de los mismos.
La aplicación ES 2 320 988 T3 describe un método para prevenir o aliviar los síntomas de malabsorción a través del tracto gastrointestinal mediante la administración de un prebiótico que puede ser inulina, inulina modificada, inulina hidrolizada, fructo-oligosacáridos, galactomanano y sus hidrolizados, arabinogalactano y sus hidrolizados, trans-galacto-oligosacáridos, ramnosa, pectina e hidrolizados de pectina, almidón resistente e hidrolizados del mismo, dextrina indigerible e hidrolizados de la misma, polidextrosa indigerible, beta-glucano e hidrolizados del mismo, y combinaciones de estos oligo y polisacáridos.
La aplicación WO 02/091833 describe una composición farmacéutica que comprende un prebiótico, un prebiótico y un microorganismo con estabilidad a pH alcalino y elevada actividad ureasa. El prebiótico descrito es oligosacárido, inulina, lactulosa y otras fibras vegetales.
La aplicación US 2009/0022849 A1 describe el efecto prebiótico de la fruta roja y zumos de fruta roja, como grosella, arándano y granada, y su uso para promover el crecimiento de bacterias beneficiosas de la flora gastrointestinal, como Bifidobacterium y Lactobacillus, así como inhibir el crecimiento de bacterias nocivas de la flora gastrointestinal, como Clostridium y Bacteroides. No obstante los autores no indican cuáles son los compuestos presentes en las frutas rojas y en sus zumos que les proporcionan las propiedades para promover el crecimiento de bacterias beneficiosas e inhibir el crecimiento de bacterias nocivas, ni por tanto proponen la estandarización de los zumos a los compuestos capaces de promover dichos efectos.
Se ha descrito que los elagitaninos, entre los que se encuentran las punicalaginas, y el ácido elágico, que puede ser liberado por la hidrólisis de las punicalaginas, son metabolizados en parte por la microbiota del colon en humanos. Como resultado de su metabolismo por la microbiota del colon se producen una serie de compuestos que químicamente son dibenzopiranonas de las cuales las de mayor significancia in vivo son las conocidas como urolitinas A y
B.
Sin embargo, se desconoce por completo que microorganismos de la microbiota son responsables de la producción de urolitinas y sin duda es de gran interés su identificación y uso como probióticos para potenciar la producción de urolitinas en vista de que se ha descrito el efecto de las urolitinas en la quimioprevención del cáncer.
En el contexto de la quimioprevención, entendido como el uso de medicamentos, u otras sustancias para tratar de reducir el riesgo de cáncer, retardarlo o evitar que retorne, la patente US5411986 describe que los isotiocianatos tales como el sulforafano, que fue aislado por los autores a partir del brócoli, un potente inductor de las principales enzimas de la fase II de la detoxificación hepática, pueden ser usados en el campo de la oncología por sus propiedades quimiopreventivas.
La patente US5725895 describe un método para preparar alimentos ricos en glucosinolatos y/o isotiocianatos a partir de semillas de crucíferas y los germinados obtenidos a partir de las mismas.
Las crucíferas y destacadamente el brócoli contienen un elevado contenido en glucosinolatos (químicamente son tioglucósidos) y están acompañados en estos vegetales de la enzima mirosinasa (presenta actividad tioglucosidasa). Cuando el vegetal se corta o se mastica la enzima de la planta cataliza la conversión de los diferentes glucosinolatos en sus correspondientes agliconas que son denominadas isotiocianatos y son productos bioactivos. Así por ejemplo, la glucorapanina es hidrolizada por la mirosinasa para formar el sulforafano. No obstante, durante la hidrólisis de los glucosinolatos por la mirosinasa de las plantas se forman también nitritos, epitionitrilos y ciano-epitioalkanos. Son las proteínas denominadas ESP (epithioespecifier proteins) las responsables de la formación de estos nitritos y epitionitrilos. Estos compuestos son inactivos para la quimioprevención del cáncer o incluso poco saludables para los humanos. Las proteínas ESP requieren Fe para su actividad y se desnaturalizan con el calor, por ejemplo al cocinar las verduras ricas en glucosinolatos.
En general consumimos los vegetales de la familia de las crucíferas tras su procesamiento. La mirosinasa y las ESP se desnaturalizan por el calor que se aplica al cocinar estos alimentos lo cual tiene importantes implicaciones para la biodisponibilidad de los isotiocianatos. Cuando se consumen en crudo estos vegetales, la propia mirosinasa del vegetal produce una rápida hidrólisis de los glucosinolatos y la liberación de los isotiocianatos tiene lugar en la parte superior del aparato digestivo. En esta situación los isotiocianatos son absorbidos y se excretan rápidamente como conjugados en la orina. El consumo de estos vegetales tras cocinarlos con aplicación de calor y desnaturalizarse la mirosinasa, permite que los glucosinolatos lleguen intactos hasta el colon, donde pueden sufrir hidrólisis por la microbiota del colon liberando los isotiocianatos en el propio colon. El sitio del tracto digestivo donde se hidrolizan los glucosinolatos y el sitio donde se absorben los isotiocianatos tienen implicaciones para las propiedades de protección contra el cáncer que se asocian a los vegetales ricos en glucosinolatos.
Algunos géneros de la microbiota del colon en humanos (ej. Bifidobacterium, Lactobacillus y Bacteroides) poseen una actividad similar a la mirosinasa. Incubación in vitro de heces humanas con un alimento conteniendo glucosinolatos cocinado para desnaturalizar por completo a la mirosinasa da lugar a la aparición de isotiocianatos. Así pues, determinadas bacterias del colon pueden hidrolizar los glucosinolatos consumidos en una comida con vegetales cocinados ricos en glucosinolatos y liberar los productos de hidrólisis directamente en el lumen del colon. Debido a la disponibilidad de suplementos prebióticos y probióticos y al potencial para expresar actividad similar a la mirosinasa de algunas bacterias de los géneros Lactobacillus y Bifidobacterium, una investigación sobre el efecto de la estimulación de algunas poblaciones bacterianas del colon, en el metabolismo de los glucosinolatos en humanos es de extraordinario interés.
Es por ello que en la presente invención se describe las combinaciones de los extractos de granada y/o oliva con efecto prebiótico o bien de otros prebióticos o de una fibra dietaria con un extracto vegetal conteniendo glucosinolatos, ej. un extracto de brócoli, al encontrar que una estimulación selectiva de determinadas poblaciones de la microflora del colon, ej géneros Bifidobacterium y Lactobacillus, mejora la biodisponibilidad en nuestro organismo de isotiocianatos formados a partir de sus precursores, los glucosinolatos, en el colon.
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Descripción de la invención
Los polifenoles de la oliva, mayoritariamente el hidroxitirosol, han demostrado unos beneficios potenciales sobre la salud en varios aspectos: prevención de enfermedades cardiovasculares, prevención de enfermedades degenerativas, disminución del riesgo de enfermedades cancerígenas, propiedades antiinflamatorias, reducción de las consecuencias producidas por el estrés oxidativo inducidas por el tabaco y protección de daños en la piel.
Las punicalaginas de la granada han demostrado unos beneficios potenciales sobre la salud en diversos aspectos: prevención de enfermedades cardiovasculares, prevención de enfermedades degenerativas, disminución del riesgo de enfermedades cancerígenas, propiedades antiinflamatorias, actividad antiparasitaria, antiviral y antimicrobiana, tratamiento de individuos con baja cantidad y/o calidad de esperma y tratamiento de disfunción eréctil.
Cabe destacar que los extractos de oliva conteniendo hidroxitirosol y los extractos de granada conteniendo punicalaginas presentan actividad antimicrobiana. Sorprendentemente, los autores han encontrado que los extractos vegetales estandarizados en cuanto al contenido de estos mismos compuestos, el hidroxitirosol y las punicalaginas, tienen la capacidad de promover específicamente el crecimiento de ciertas bacterias beneficiosas de la flora gastrointestinal en humanos, lo cual no se había demostrado hasta el momento.
Mediante la presente invención se ha demostrado que un extracto de oliva rico en hidroxitirosol y un extracto de granada rico en punicalaginas, preferiblemente los obtenidos según las aplicaciones WO 2008/090460 A1 y EP 1 967 079 A1 (siendo el aplicante Probelte Pharma y ambas se incluyen aquí por referencia) respectivamente, actúan como prebióticos promoviendo el crecimiento de bacterias beneficiosas de la flora gastrointestinal e inhibiendo el crecimiento de bacterias potencialmente patógenas de la misma.
Un objeto de la presente invención es el uso como prebiótico de un extracto de granada conteniendo punicalaginas y ácido elágico libre, en el cual el contenido en punicalaginas es de al menos un 2% (p/p) y el contenido de ácido elágico libre es tal que la relación punicalaginas/ácido elágico libre (%p/p), se sitúa en el rango de 10/1 a 35/1, y adicionalmente el contenido en fenoles totales es de al menos un 5% (p/p) (expresado como ácido gálico equivalente), y la solubilidad en agua es de al menos un 3% (p/p) (30 g extracto granada/L), teniendo en cuenta que dicho extracto de granada no es un zumo de granada tal y como se conoce en el arte previo.
La composición del extracto de granada arriba indicado es especialmente útil para su uso como prebiótico, debido a su riqueza en punicalaginas que pueden estimular selectivamente en el colon el crecimiento de bacterias de los géneros Bifidobacterium y Lactobacillus, y al bajísimo contenido que presentan de ácido elágico libre, tal que la relación punicalaginas/ácido elágico libre (%p/p), se sitúa en el rango de 10/1 a 35/1. Varios autores han descrito que entre las distintas fracciones que componen el extracto de granada, el ácido elágico es una de las moléculas que más inhibía el crecimiento microbiano. Por lo tanto, es deseable que los extractos de granada que se desarrollen para su uso como prebióticos presenten una relación punicalaginas/ácido elágico libre (%p/p), lo más alta
posible.
El zumo de granada de mejor calidad disponible comercialmente contiene entre 2400-4000 mg/L de polifenoles totales (expresados como ácido gálico equivalente) de los cuales el contenido en punicalaginas está en el rango 500-2000 mg/L. El mencionado zumo presenta un grado Brix de 16 pudiéndose concentrar posteriormente unas 5 veces con lo cual en contenido en punicalaginas no alcanza nunca más de 10 g/L (1% p/p). Respecto de la relación punicalaginas/ácido elágico libre, en los zumos de granada no superan 8/1 e incluso durante la concentración es habitual que se reduzca debido a la hidrólisis que sufren los elagitaninos complejos como las punicalaginas con la consiguiente liberación de ácido elágico en forma libre.
Otro objeto de la invención es el uso de un extracto de oliva, solo o combinado con una fibra dietética, como prebiótico, teniendo en cuenta que dicho extracto de oliva no es un aceite de oliva.
Más particularmente, un extracto de oliva preferido es aquel obtenido mediante el proceso de acuerdo a la aplicación WO 2008/090460 A1, y que tiene un contenido en hidroxitirosol de al menos un 0.5% (p/p), y una pureza del hidroxitirosol de al menos un 40% (por HPLC a 280 nm). Este extracto está libre de disolventes orgánicos (el contenido residual de disolventes orgánicos es menor de 1ppb y preferiblemente es de 0 ppm) y sustancialmente libre de sales, y el contenido de hidroxitirosol de dicho extracto es de al menos un 0,5% (p/p) y la pureza del hidroxitirosol es de al menos un 40% (por HPLC a 280 nm). Preferiblemente el contenido en hidroxitirosol es de al menos un 10% (p/p), y más preferiblemente de al menos un 35% (p/p). y preferiblemente la pureza del hidroxitirosol es un 80% y más preferiblemente un 90% (por HPLC a 280 nm).
Otro extracto de granada preferido es aquel obtenido de acuerdo a la aplicación EP 1967079, y que tiene un contenido en punicalaginas de al menos un 5% (p/p), preferiblemente de al menos un 20% (p/p) y más preferiblemente de al menos un 30% (p/p), siendo la pureza de las punicalaginas de al menos un 55%, y un contenido de ácido elágico libre tal que la relación punicalaginas/ácido elágico libre (% w/w), se sitúa en el rango de 10/1 a 35/1, el contenido en fenoles totales es de al menos un 10% (p/p) preferiblemente de al menos un 20% (p/p) y más preferiblemente de al menos un 50% (p/p) (expresado como ácido gálico equivalente), la solubilidad en agua es de al menos un 3% (p/p) (30 g extracto granada/L). Preferiblemente, el extracto tiene un contenido residual de disolventes orgánicos menor de 1 ppb y más preferiblemente es de 0 ppm).
Otro extracto de granada preferido en la presente invención para su uso como prebiótico es aquel obtenido de acuerdo a la aplicación EP 1967079 (donde en un escenario de la invención a partir de un extracto rico en punicalaginas se obtiene, mediante el uso de una enzima capaz de hidrolizar las punicalaginas, un extracto rico en punicalinas) caracterizado por ser un extracto de granada conteniendo al menos un 1.5% (p/p) de punicalinas, y que presenta una relación punicalinas/ácido elágico libre (% p/p), en el rango de 10/1 a 35/1.
La ausencia sustancial de incluso mínimas trazas de disolventes orgánicos tales como metanol, etanol, isopropanol que son empleados en las etapas de purificación comúnmente empleadas en el arte, resulta ser de gran importancia para el uso de los extractos arriba mencionados.
Adicionalmente, algunos de los polifenoles presentes en las olivas son responsables de su amargor, siendo los que mejor correlacionan con este atributo la oleuropeina y la forma aldehído de la oleuropeina aglicona. De este modo, el uso de extractos de oliva conteniendo oleuropeina y/o la forma aldehído de la oleuropeina aglicona puede modificar el sabor de los alimentos en los que dicho extracto es incorporado, provocando una menor aceptación por los consumidores.
El extracto de oliva rico en hidroxitirosol, obtenido según la WO 2008/090460 A1, está virtualmente libre de oleuropeina y de la forma aldehído de la oleuropeina aglicona, siendo la suma de ambos compuestos menor de 5 ppm, debido a que no se emplea ningún disolvente orgánico, donde estás moléculas mucho más hidrofóbicas que el hidroxitirosol son más solubles, durante la obtención del extracto, y a la combinación de etapas de purificación empleadas, columnas cromatográficas, para la obtención del extracto.
Una ventaja adicional de los extractos arriba mencionados, tanto de granada como de oliva, es la purificación frente a los residuos de los compuestos fitosanitarios presentes en la materia prima, o sea en las olivas y las granadas. De este modo, sustancias potencialmente tóxicas como insecticidas, herbicidas, fungicidas, rodenticidas, etc, como por ejemplo: diuron, terbutilazina, simazina, \alpha-endosulfan, y \beta-endosulfan pueden estar presentes en el material de
partida.
Todos estos pesticidas presentan estructuras moleculares (ejemplo: el núcleo de las triazinas) capaces de interaccionar con las resinas de absorción y ser a continuación eluídas de la resina junto con el resto de componentes del extracto cuando se emplean disolventes orgánicos. De este modo los procedimientos de preparación de extractos de oliva y/o granada basados en el uso de una resina absorbente y su posterior elución con disolventes orgánicos, deben de extremar el control de calidad de la materia prima respecto de los residuos de pesticidas, pues la resina de absorción puede actuar como una trampa de estos pesticidas, concentrarlos en la resina y posteriormente eluirlos cuando un disolvente orgánico es empleado para recuperar el hidroxitirosol o las punicalaginas presentes en los extractos de oliva y de granada respectivamente.
El problema arriba mencionado fue solucionado en la preparación de un extracto de oliva rico en hidroxitirosol y un extracto de granada rico en punicalaginas obtenidos según las aplicaciones WO 2008/090460 A1 y EP 1 967 079 A1, dado a que se seleccionaron específicamente las resinas de absorción no iónicas para que fuera posible eluir los compuestos activos de los mencionados extractos mediante el solo uso de agua o de una solución acuosa basificada y no mediante el empleo de disolventes orgánicos.
Adicionalmente, es importante considerar otro punto importante. Vahos autores han encontrado que ciertos alcaloides tóxicos (ej. peletierina, isopeletierina y pseudopeletierina) pueden estar presentes, cuando se utilizaban alcoholes para la obtención de los extractos de granada, sin embargo no se detectan alcaloides cuando los extractos de granada son preparados utilizando solo agua tal y como sucede cuando el extracto de granada rico en punicalaginas es obtenido según la aplicación EP 1 967 079 A1.
El extracto de granada rico en punicalaginas, obtenido según la aplicación EP 1 967 079 A1, está libre de alcaloides debido a que no se emplea ningún disolvente orgánico en ninguna de las etapas de producción del extracto.
En concreto, el extracto de oliva y el extracto de granada promueven el crecimiento de bacterias de los géneros Bifidobacterium y Lactobacillus e inhiben el crecimiento de bacterias de los géneros Clostridium y Bacteroides.
Sorprendentemente, los extractos de granada y de oliva pueden actuar a dosis más bajas (menos de 1 g de extracto por día) que los prebióticos clásicos (ej: inulina, FOS etc precisan entre 4-20 g día para ser efectivos) e incluso presentan menos efectos secundarios (Ej: flatulencia, sensación de hinchazón, diarrea, etc.), al tiempo que presentan una elevada especificidad, lo cual supone una ventaja adicional de las composiciones prebióticas basadas en estos extractos.
En otro escenario la presente invención se demuestra que es posible la incorporación de un extracto de oliva rico en hidroxitirosol y/o un extracto de granada rico en punicalaginas, en una matriz alimentaria para producir alimentos que actúan como prebióticos promoviendo el crecimiento de bacterias beneficiosas de la flora gastrointestinal e inhibiendo el crecimiento de bacterias potencialmente patógenas de la misma. Tal y como se describe en los correspondientes ejemplos de la invención la incorporación del extracto no altera las propiedades organolépticas del alimento, y el hidroxitirosol o las punicalaginas presentan una estabilidad adecuada en las diferentes matrices alimentarias, para lo cual en algunas matrices alimentarias se seleccionó el uso de aditivos alimentarios corrientemente utilizados como el ácido ascórbico y el ácido cítrico.
Entre las matrices alimentarias preferidas destaca una bebida refrescante de frutas, con un contenido de al menos un 12% de zumo de uva, combinado o no con otros zumos de frutas, con un contenido de ácido ascórbico desde 0 a ppm a 9000 ppm, con un contenido de ácido cítrico entre 0% y 5% y con un contenido de extracto de granada, entre 50 ppm y 10000 ppm.
Ante la sorprendente mejora de la estabilidad de los componentes bioactivos del extracto de granada, como las punicalaginas, cuando este era incorporado en bebidas de frutas donde se añadía ácido ascórbico y ácido cítrico en las proporciones adecuadas comparativamente a cuando no se añadían los mencionados aditivos, se estudio como influía la adición de ácido ascórbico y ácido cítrico en la estabilidad del extracto de granada obtenido según el proceso descrito en la aplicación EP 1 967 079 A1 mejorado ahora con la adición de ácido ascórbico (entre el 0.01% y el 5%) y ácido cítrico (entre el 0.1% y el 10%) al extracto de granada en forma de líquido concentrado justo en la etapa previa a su secado en forma de polvo mediante atomización. Los resultados se describen en uno de los ejemplos posteriores y por su excepcional interés, los extractos de granada en polvo conteniendo ácido cítrico entre un 0.5% y un 10% (p/p) y ácido ascórbico entre un 0.05% y un 5% (p/p) constituyen también uno de los objetos de la presente
invención.
Adicionalmente la incorporación de los extractos con propiedades prebióticas a los alimentos consigue una importantísima mejora de la estabilidad oxidativa de los mismos, lo cual lleva a los autores a revindicar el uso de los mencionados extractos para la producción de aditivos alimentarios antioxidantes con propiedades prebióticas.
En otro escenario de la presente invención se discute el uso como aditivos alimentarios del extracto de granada rico en punicalaginas y del extracto de oliva rico en hidroxitirosol como alternativa a otros aditivos alimentarios obtenidos mediante síntesis química y que se están demostrando como potencialmente perjudiciales para la salud, tales como los antioxidantes butilhidroxianisol, BHA, butilhidroxitoluol, BHT, y terbutilhidroxinona, TBHQ, o los conservantes como el ácido benzoico, los benzoatos y sus derivados, los nitratos, nitritos y sus derivados, y también para la sustitución de colorantes como tartracina y eritrosina. Tal y como se comentó previamente, los extractos de granada y de oliva presentan propiedades antioxidantes y antimicrobianas, pero además en la presente invención se demuestra su efecto prebiótico. La combinación de estás propiedades lleva a que sorprendentemente se puedan emplear como aditivos alimentarios bioactivos, de manera que podrían actuar de acuerdo a un modo bifuncional. De este modo durante la preparación y el almacenaje del alimento tendrían una primera función como aditivo alimentario de origen natural en sustitución de aditivos de síntesis química como los arriba mencionados, y una vez ingerido el alimento desarrollarían su segundo nivel de función como prebióticos con los consiguientes beneficios para la salud
humana.
En otro escenario la presente invención se demuestra que es posible la incorporación de un extracto de oliva rico en hidroxitirosol o un extracto de granada rico en punicalaginas, conjuntamente con una bacteria probiótica o una mezcla de bacterias probióticas, en una matriz alimentaria para producir alimentos que actúan como simbióticos. Dentro de estos simbióticos, podemos encontrar casos en los que el prebiótico favorece selectivamente al componente prebiótico, si bien el sentido de la invención es más amplio refiriéndose también al efecto sinérgico que pueden ejercer el componente prebiótico y el componente prebiótico para conseguir su efecto beneficioso sobre la salud. Tal y como se describe en los correspondientes ejemplos de la invención la incorporación del extracto prebiótico y del probiótico no alteran la estabilidad del hidroxitirosol o de las punicalaginas cuando se almacenan en condiciones
adecuadas.
El probiótico usado para la preparación del simbiótico es preferiblemente una cepa de Lactobacillus o de Bifidobacterium. Preferiblemente, se usan cepas que solo producen ácido L (+) láctico. Algunos ejemplos de las especies preferidas de Lactobacillus son Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei y Lactobacillus reuteri. Las cepas particularmente preferidas son Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103, Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.3724, Lactobacillus reuteri ATCC 55730, Lactobacillus paracasei CNCM 1-2116 y Lactobacillus casei DN 114-001. ejemplos de las especies preferidas de Bifidobacterium son Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium breve y Bifidobacterium longum. Las cepas particularmente preferidas son Bifidobacterium animalis DN-173 010, Bifidobacterium lactis comercializado por la compañía danesa Christian Hansen bajo la marca comercial BB-12 y Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 comercializada por la compañía japonesa Morinaga Milk Industry Co. Ltd. bajo la marca comercial BB536.
La preparación simbiótica de la invención debe contener entre 10^{2} y 10^{10} UFC de la bacteria prebiótica/g de simbiótico y entre 0,001% y 1% del extracto de oliva rico en hidroxitirosol o del extracto de granada rico en punicala-
ginas.
La cepa de bacteria probiótica seleccionada puede ser cultivada de acuerdo a cualquier método adecuado, disponible en el arte previo para su incorporación a la preparación simbiótica. Alternativamente, la cepa de bacteria probiótica puede ser adquirida a un suministrador especializado como las compañías Christian Hansen y Morinaga, de manera que venga preparado de una forma adecuada para su adición al simbiótico.
De este modo la invención se refiere al uso de un extracto de oliva rico en hidroxitirosol y/o un extracto de granada rico en punicalaginas, así como de los productos producidos a partir de ellos (alimentos y bebidas enriquecidos con estos extractos, suplementos dietarios, simbióticos y aditivos alimentarios antioxidantes con propiedades prebióticas), para promover los efectos beneficiosos asociados a los ingredientes prebióticos y cambios en la flora gastrointestinal. Estos efectos beneficiosos son la regulación del tránsito intestinal, la modulación del sistema inmune, la absorción de minerales, la regulación del metabolismo lipídico y la prevención del cáncer.
Otro objeto de la presente invención es el uso de estos nuevos prebióticos, un extracto de oliva rico en hidroxitirosol y/o un extracto de granada rico en punicalaginas, y de composiciones orales que los contengan en la disminución de los factores de riesgo asociados al síndrome metabólico y a sus consecuencias, siendo las más destacadas, la aterosclerosis, las enfermedades cardiovasculares, la hipercolesterolemia y la diabetes mellitus tipo 2.
Se denomina síndrome metabólico al conjunto de alteraciones metabólicas y cardiovasculares que están relacionadas con la resistencia a la insulina y la obesidad abdominal. Uno de cada seis europeos, y hasta uno de cada tres ciudadanos en algunos países de la UE, padecen el síndrome metabólico, un trastorno que aumenta en gran medida el riesgo de sufrir diabetes de tipo 2, enfermedades cardiovasculares y puede provocar una muerte prematura. El rápido incremento del sobrepeso y la obesidad a edades cada vez más tempranas explican la gran prevalencia de este síndrome. Dentro de los factores del síndrome metabólico destacan los metabólicos (obesidad, diabetes tipo 2, dislipemia, hiperglucemia) y los no metabólicos (hipertensión arterial, inflamatorios, protrombóticos). El síndrome metabólico se diagnostica cuando una persona presenta tres o más de las siguientes características:
-
obesidad abdominal (contorno de cintura: mayor de 102 cm en hombres o mayor de 88 cm en mujeres).
-
niveles elevados de triglicéridos (mayores de 150 mg/dL).
-
niveles bajos de colesterol HDL (menores de 40 mg/dL).
-
presión arterial alta (mayores de 130 mm Hg/85 mm Hg).
-
Hiperglucemia en ayunas (mayores de 100 mg/dL).
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En los individuos obesos con historia familiar de diabetes mellitus tipo 2, es más frecuente la existencia de un aumento de la resistencia periférica a la insulina y de hiperinsulinemia posprandial. Asimismo, los marcadores biológicos de la inflamación son predictores de enfermedad cardiovascular, siendo la elevación de los niveles séricos de la proteína C reactiva (PCR), la interleuquina 6 (IL-6), el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-\alpha) y la leptina, los que presentan una mayor correlación con las alteraciones que constituyen el síndrome metabólico, así como la disminución de los niveles de adiponectina e interleuquina-10 (IL-10).
Todavía hay mucho que aprender sobre el síndrome metabólico, pero lo que sí se sabe es que la gente con síndrome metabólico tiene un mayor riesgo de sufrir un ataque cardíaco o una enfermedad arterial coronaria.
En otro escenario de la presente invención se revindica como una combinación de un extracto de granada o de un extracto de oliva puede combinarse con una fibra alimentaria para obtener composiciones prebióticas que pueden actuar sinérgicamente en el organismo humano. Así por ejemplo, la combinación de un extracto de granada con fibra dietética no solo puede reducir la hipercolesterolemia a través de la bioactividad de los compuestos del extracto de granada, sino que la fibra alimentaria, (Ej: fibra soluble) al sufrir fermentación en el intestino incrementa la producción de ácidos grasos de cadena corta como el propionato. El propionato es absorbido en el colon a través de la vena portal y se ha demostrado que inhibe a la HMGR
En otro escenario de la presente invención se describe como una combinación de un extracto de granada, estandarizado a punicalaginas, con propiedades prebióticas con una mezcla específica de bacterias probióticas (simbiótico) es de gran utilidad para potenciar la producción de urolitinas en el lumen del colon en humanos y sin duda es de gran interés en vista de su aplicación en la quimioprevención del cáncer (uso para tratar de reducir el riesgo de cáncer, retardarlo o evitar que retorne).
En otro escenario de la presente invención se investigaron combinaciones de un extracto con propiedades prebióticas capaces de estimular el crecimiento de bacterias de los géneros Bifidobacterium y Lactobacillus en el colon humano con un extracto de brócoli donde previamente se había inactivado la mirosinasa del vegetal. Se demostró que la excreción urinaria de los conjugados de los isotiocianatos presentes en el brócoli se elevaba tras un consumo del extracto de granada lo cual sorprendentemente conseguía la estimulación específica de bacterias del colon que mejoran la transformación en el lumen del colon de los glucosinolatos en los correspondientes isotiocianatos que eran absorbidos apareciendo posteriormente en la orina.
A la luz de los resultados obtenidos se plantea igualmente la utilidad de las combinaciones de una fuente vegetal rica en glucosinolatos con una fuente de fibra dietaria, como por ejemplo la fibra soluble y en un escenario preferido una fibra soluble rica en betaglucano obtenida a partir de la avena o de la cebada o de sus mezclas, o con un prebiótico seleccionado entre: oligosacáridos prebióticos (fructooligosacáridos, xilooligosacáridos, polidextrosa, galaactooligocáridos, manooligosacáridos, o sus mezclas), tagatosa, soja, inulina (obtenida de fuentes tales como achicoria, alcachofa y jicama), avena cruda, trigo sin refinar, cebada sin refinar y jicama o soja sin refinar o sus
mezclas.
Las combinaciones citadas pueden conseguir, tal y como se encontró con el extracto de granada, la estimulación específica de bacterias del colon que mejoran la transformación en el lumen del colon de los glucosinolatos en los correspondientes isotiocianatos con las implicaciones beneficiosas para la salud humana que ello conlleva.
Por tanto, en la presente invención de revindican las combinaciones de los extractos de granada y/o oliva con efecto prebiótico o bien de otros prebióticos o de una fibra dietaria con un extracto vegetal conteniendo glucosinolatos, como por ejemplo un extracto de brócoli, al encontrar que una estimulación selectiva de determinadas poblaciones de la microflora del colon, ej géneros Bifidobacterium y Lactobacillus, mejora la biodisponibilidad en nuestro organismo de isotiocianatos formados a partir de sus precursores, los glucosinolatos, en el colon.
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Descripción de las tablas y las figuras
La Tabla 1 muestra la secuencia de los oligonucleótidos empleados en las reacciones de PCR a tiempo real con SYBR Green para la cuantificación de las correspondientes bacterias en las muestras.
Las Figuras 1A y 1B muestran el crecimiento de las bifidobacterias en los ensayos realizados y descritos en los Ejemplos 1 y 2 respectivamente. En el eje de coordenadas se muestra la concentración de bifidobacterias expresada como LOG_{10}/ml. En el eje de abscisas se muestra el tiempo de incubación: 0 y 48 horas. Los números que se muestran en la gráfica corresponden a la concentración de bifidobacterias, a tiempo 0 (concentración inicial de 4,9) y a tiempo 48 horas (diversos valores para el grupo control, los tres grupos con extracto de granada y los dos grupos con extracto de oliva a distintas concentraciones).
La figura 2 muestra los resultados descritos en el Ejemplo 3, de la cuantificación de bacterias del género Bifidobacterium expresada como % con respecto al total de bacterias en la materia fecal de los ratones del ensayo. El grupo 1 corresponde al grupo control. A los grupos 2 y 3 se les administró un extracto de granada y un extracto de oliva respectivamente.
La Tabla 2 muestra los resultados descritos en el Ejemplo 4 de la cuantificación mediante PCR cuantitativa a tiempo real de la cantidad de bacterias del género Lactobacillus expresada como % con respecto al total de bacterias en la materia fecal de los individuos del ensayo.
La Tabla 3 muestra los resultados descritos en el Ejemplo 4 de la cuantificación mediante PCR cuantitativa a tiempo real de la cantidad de bacterias del género Bifidobacterium expresada como % con respecto al total de bacterias en la materia fecal de los individuos del ensayo.
La Figura 3A, muestra la relación existente entre el % de fruta en una bebida de zumo de piña preparada con extracto de granada y las pérdidas de punicalaginas durante la preparación de los productos.
La Figura 3B, muestra la relación existente entre el % de ácido cítrico incorporado en una bebida de zumo de piña (conteniendo un 50% de piña) preparada con extracto de granada y las pérdidas de punicalaginas durante la preparación de los productos.
La Figura 3C, muestra la relación existente entre el % de ácido ascórbico incorporado en una bebida de zumo de piña (conteniendo un 20% de piña, y ácido cítrico a distintas concentraciones) preparada con extracto de granada y las pérdidas de punicalaginas durante la preparación de los productos.
La Tabla 4 resume las claves empleadas para la valoración por escalas de los diferentes atributos, en el análisis sensorial de las bebidas de zumo de frutas con y sin extracto de granada preparadas y evaluadas de acuerdo a los ejemplos 6 a 9.
Las Figuras 4A y 4B muestras gráficamente los resultados descritos en el Ejemplo 7, de la prueba de diferencia y de la prueba de preferencia, respectivamente, efectuada por los catadores durante el análisis sensorial de la bebida 100% manzana.
La Tabla 5 resume la valoración por escalas de los diferentes atributos efectuada por los catadores durante el análisis sensorial de la bebida 100% manzana según lo descrito en el ejemplo 7.
Las Figuras 5A y 5B muestras gráficamente los resultados descritos en el Ejemplo 9, de la prueba de diferencia y de la prueba de preferencia, respectivamente, efectuada por los catadores durante el análisis sensorial de la bebida de Piña/Ciruela.
Las Figuras 5C y 5D muestras gráficamente los resultados descritos en el Ejemplo 9, de la prueba de diferencia y de la prueba de preferencia, respectivamente, efectuada por los catadores durante el análisis sensorial de la Bebida de Melocotón/Manzana.
La Tabla 6 resume la valoración por escalas de los diferentes atributos efectuada por los catadores durante el análisis sensorial de la bebida de Piña/Ciruela según lo descrito en el ejemplo 9.
La Figura 6 muestra la estabilidad oxidativa, de las muestras de margarina preparadas de acuerdo al Ejemplo 12, medida por el método Rancimat a 98ºC y 10 l/hora. El gráfico muestra una correlación lineal entre la estabilidad oxidativa de la matriz alimentaria y el% de extracto de oliva adicionado a la matriz alimentaria.
La Tabla 7 resume la valoración por escalas de los diferentes atributos efectuada por los catadores durante el análisis sensorial de la bebida de Melocotón/Manzana según lo descrito en el ejemplo 9.
La Tabla 8 muestra los resultados descritos en el Ejemplo 15 de la cuantificación mediante HPLC de la cantidad de isotiocianatos totales, expresada como % con respecto al total de isotiocianatos totales ingeridos en forma de extracto de brócoli, en la orina de las 24 h de los individuos del ensayo.
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Ejemplos
Ejemplo 1
Efecto bifidogénico de un extracto de granada
Se prepararon tubos Falcon estériles con un volumen final de 50 ml que contenían leche semidesnatada, 0,4 gr de un yogurt comercial que contenía 10^{8} bifidobacterias/gr y una solución estéril de extracto de granada en agua para obtener las siguientes concentraciones finales de extracto de granada: 0,5%; 0,1%; 0,05%; 0% (% p/V). Los tubos se incubaron a 30ºC durante 48 horas. Los ensayos se realizaron por duplicado.
Mediante PCR cuantitativa a tiempo real con SYBR Green se evaluó la cantidad de bifidobacterias en cada uno de los tubos Falcon utilizando los oligonucleótidos BidF y BidR (Tabla 1). La cuantificación absoluta de las bifidobacterias se calculó con una recta de regresión obtenida previamente: y = -0,3792x + 17,62, donde y es el Log_{10} de la cantidad de bifidobacterias y x es el valor Ct de la reacción de PCR cuantitativa.
La presencia del extracto de granada en las tres concentraciones evaluadas promueve el crecimiento de las bifidobacterias respecto al control (Figura 1A).
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TABLA 1 
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1 
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Ejemplo 2
Efecto bifidogénico de un extracto de oliva
Se prepararon tubos Falcon estériles con un volumen final de 50 ml que contenían leche semidesnatada, 0,4 gr de un yogurt comercial que contenía 10^{8} bifidobacterias/gr y una solución estéril de extracto de oliva en agua para obtener las siguientes concentraciones finales de extracto de oliva: 0,05%; 0,01%; 0% (% p/V). Los tubos se incubaron a 30ºC durante 48 horas. Los ensayos se realizaron por duplicado.
Mediante PCR cuantitativa a tiempo real con SYBR Green se evaluó la cantidad de bifidobacterias en cada uno de los tubos Falcon utilizando los oligonucleótidos BidF y BidR (Tabla 1). La cuantificación absoluta de las bifidobacterias se calculó con una recta de regresión obtenida previamente: y = -0,3792x + 17,62, donde y es el Log_{10} de la cantidad de bifidobacterias y x es el valor Ct de la reacción de PCR cuantitativa.
La presencia del extracto de oliva en las dos concentraciones evaluadas promueve el crecimiento de las bifidobacterias con respecto al control (Figura 1B).
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Ejemplo 3
Efecto prebiótico de un extracto de granada en un modelo animal
El ensayo se realizó con tres grupos de 10 ratones cada uno. Los ratones fueron alimentados durante 20 días con pienso comercial y con una dosis diaria de 12.8 mg de extracto de granada por ratón (equivalente a una ingesta diaria de 320 mg ext. granada/Kg masa corporal) (grupo 2), o con una dosis diaria de 0.9 mg de extracto de oliva por ratón (equivalente a una ingesta diaria de 22.9 mg ext. oliva/Kg masa corporal) (grupo 3) o sin extracto de granada (grupo 1, control). Tras este periodo, la materia fecal de cada grupo se recogió para aislar ADN bacteriano a partir de 0,2 gr de la misma.
Mediante PCR cuantitativa a tiempo real se evaluó la cantidad de bacterias beneficiosas en la materia fecal, expresada de la siguiente manera: % bacterias del género Bifidobacterium/total de bacterias. Se utilizaron los oligonucleótidos BidF y BidR (Tabla 1). La cuantificación relativa se realizó mediante el método descrito por Liu y Saint, 2002, realizando cada medida por triplicado.
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A continuación, se muestran los resultados que demuestran un claro efecto en la administración del extracto de granada y del extracto de oliva en promover el crecimiento de bacterias del género Bifidobacterium. La representación gráfica de los resultados se muestra en la Figura 2.
2
En los grupos 2 y 3, hay una diferencia significativa (p< 0,05) con respecto al grupo 1 (control).
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Ejemplo 4
Efecto prebiótico de un extracto de granada en un estudio de intervención humano: cambios en la flora gastrointestinal
El ensayo se realizó con 6 individuos sanos de edad comprendida entre 28 y 53 años. Cada individuo tomó 1 cápsula diaria conteniendo 575 mg de extracto de granada a la hora de la comida. Se les indicó a los voluntarios que evitaran consumir productos de capacidad prebiótica (como fructooligosacáridos, inulina, etc), antibióticos, laxantes y especialmente productos con prebióticos (ej.: yogures sin pasteurizar, bebidas de leche fermentada, etc). Los 6 voluntarios comenzaron a seguir estas restricciones en su dieta habitual desde los 14 días previos a la fase de tratamiento del estudio de intervención, continuando con las mismas durante los 28 días del tratamiento, donde debían consumir a diario una capsula con extracto de granada.
Se tomó muestra fecal de cada uno de los individuos a tiempo 0 (tras los 14 días previos a la administración del extracto de granada) y tras los 28 días de administración. A partir de la materia fecal se realizó un aislamiento del ADN bacteriano.
Mediante PCR cuantitativa a tiempo real se evaluó la cantidad de bacterias beneficiosas en la materia fecal, expresada de la siguiente manera: % bacterias del género Lactobacillus/total de bacterias o % bacterias del género Bifidobacterium/total de bacterias. Se utilizaron los oligonucleótidos LacF, LacR, BidF y BidR (Tabla 1). Por otro lado, se evaluó la cantidad de bacterias potencialmente patógenas en la materia fecal, expresada de la siguiente manera: %bacterias de la especie Clostridium perfringens/total de bacterias o % bacterias del género Bacteroides/total de bacterias. Se utilizaron los oligonucleótidos CperF, CperR, BacF y BacR (Tabla 1). La cuantificación relativa se realizó mediante el método descrito por Liu y Saint, 2002, realizando cada medida por triplicado.
Los resultados se muestran a continuación:
A) Bacterias beneficiosas
Lactobacillus: 5 de los 6 individuos (83,3%) presentaron un aumento significativo (p< 0,05 ó p< 0,01 según el caso) en el porcentaje de bacterias de este género tras 28 días de administración de extracto de granada.
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TABLA 2
4
Bifidobacterium: 5 de los 6 individuos (83,3%) presentaron un aumento significativo (p< 0,05 ó p< 0,01 según el caso) en el porcentaje de bacterias de este género tras 28 días de administración de extracto de granada.
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TABLA 3
5 
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B) Bacterias patógenas
Clostridium perfringens: 5 de los 6 individuos (83,3%) presentaron un descenso significativo (p< 0,05 ó p< 0,01 según el caso) en el porcentaje de bacterias de este género tras 28 días de administración de extracto de granada.
Bacteroides: 4 de los 6 individuos (66,7%) presentaron un descenso significativo (p< 0,05 ó p< 0,01 según el caso) en el porcentaje de bacterias de este género tras 28 días de administración de extracto de granada.
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Ejemplo 5
Efecto prebiótico de un extracto de granada en un modelo humano: regulación del tránsito intestinal
Durante el ensayo realizado con 6 individuos descrito en el ejemplo 4 se interrogó a cada uno de ellos sobre su salud digestiva durante la administración del extracto de granada.
Todos los individuos (100%) declararon no haber tenido ningún problema digestivo durante el tratamiento.
5 individuos (83,3%) declararon haber conseguido una regularidad no habitual en ellos en el tránsito intestinal. El otro individuo declaró no haber observado cambios en sus hábitos, que de por sí ya eran regulares.
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Ejemplo 6
Preparación de un zumo o un néctar de frutas prebiótico con un extracto de granada, evaluación de la estabilidad del extracto de granada en la matriz alimentaria tras la preparación y el posterior almacenaje
Una muestra de extracto de granada con un contenido en punicalaginas del 61,12% (p/p) obtenido de acuerdo a la aplicación EP 1967079 A1 fue utilizada para preparar zumos de piña y manzana y néctar de melocotón conteniendo el mencionado extracto a la concentración de 624 mg ex. granada/kg de matriz alimentaria (381,4 mg punicalaginas/Kg de matriz alimentaria). Las materias primas empleadas fueron: concentrado de zumo de piña con 60º BRIX, concentrado de zumo de manzana con 70º BRIX y puré de melocotón. Los prototipos control (sin extracto) y prebiótico (con 624 ppm de extracto de granada) de las tres matrices alimentarias con y sin extracto de granada se prepararon de acuerdo a las siguientes recetas:
6 
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7
70 
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Los 6 prototipos fueron pasteurizados a 100ºC, durante 15 segundos y envasados asépticamente en envases de vidrio a una temperatura de 85-87ºC. Los 6 envases de vidrio conteniendo los prototipos se sumergieron en agua para enfriarlos rápidamente y seguidamente, las pérdidas del extracto de granada incorporado en los 3 tipos de zumos/néctares fue medida mediante la determinación del contenido en punicalaginas mediante método HPLC.
A continuación se muestran los resultados:
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8 
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La primera conclusión es que el extracto de granada presenta una estabilidad dependiente de la matriz alimentaria. Solo el zumo de manzana mostró un comportamiento idóneo para la aplicación del extracto de granada prebiótico. En el caso de zumo de manzana, al adicionarle extracto de granada, no se puede denominar zumo, ya que la legislación solamente permite la adición a los zumos de vitaminas y minerales, por lo que aún conteniendo un 100% de fruta, se denominará Bebida de Manzana.
Con el propósito de preparar bebidas de piña y de melocotón con extracto de granada, se llevo a cabo un estudio de los factores que influían sobre las pérdidas del extracto de granada en estas matrices alimentarias, encontrándose 3 factores importantes: % de fruta, % cítrico y [ascórbico] (ver figuras 3A, 3B y 3C referidas a la bebida de piña; los datos para la bebida de melocotón no se muestran pero resultaron en la misma línea.
Tras descubrir sorprendentemente que la incorporación estable del extracto de granada a las matrices alimentarias del tipo zumo/néctar de fruta se veía favorecida por la inclusión en la formulación de ácido cítrico, por la suplementación con ascórbico y la presencia de una base de zumo de manzana, procedimos a preparar un nuevo prototipo de néctar multifruta con extracto de granada.
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Los prototipos control (sin extracto) y prebiótico (con 624 ppm de extracto de granada) del néctar multifruta con y sin extracto de granada se prepararon de acuerdo a la siguiente receta:
9
Los 2 prototipos fueron pasteurizados a 100ºC, durante 15 segundos y envasados asépticamente en envases de vidrio a una temperatura de 85-87ºC. Los 2 envases de vidrio conteniendo los prototipos se sumergieron en agua para enfriarlos rápidamente y seguidamente, las pérdidas del extracto de granada incorporado en el néctar multifruta fue medida mediante la determinación del contenido en punicalaginas mediante método HPLC.
A continuación se muestran los resultados:
100
Las conclusiones principales son que es posible incorporar de forma estable el extracto de granada con propiedades prebióticas en matrices alimentarias del tipo de los zumos/néctares (que contienen un 100% de fruta, y al menos un 50% de fruta respectivamente) La matriz más óptima es el zumo de manzana, seguida del zumo de uva pero también las matrices con varias frutas convenientemente estabilizadas mediante la incorporación de entre 90 y 900 ppm de ascórbico y entre un 0,3 y 0,5 de ácido cítrico muestran una excelente incorporación del extracto de granada.
Adicionalmente, se almacenaron botellines con los prototipos de bebida de manzana y de néctar multifruta a 5\pm3ºC y a 25\pm2ºC. Las pérdidas del extracto de granada incorporado en la bebida de manzana y en el néctar multifruta fueron analizadas mediante la determinación del contenido en punicalaginas mediante método HPLC. Tras 6 meses de ensayo de estabilidad la pérdida de punicalaginas fue menor del 5% en las dos condiciones bajo ensayo:
a)
5\pm3ºC.
b)
25\pm2ºC con una humedad de 60\pm5 RH.
Ejemplo 7
Análisis sensorial de un zumo o un néctar de frutas prebiótico con extracto de granada
Se procedió al Análisis Sensorial del zumo de manzana y del néctar multifruta con y sin extracto de granada preparados de acuerdo al ejemplo 6. Se realizó una sesión de cata por sabor, consistente en la realización de una Evaluación Sensorial diseñada por parte del panel de jueces expertos, con el fin de identificar las características y/o atributos del producto con y sin la incorporación del extracto de granada.
\bullet
Las sesiones de cata están formadas por un panel compuesto por 10-12 catadores semientrenados en los productos.
\bullet
Las catas consistieron en:
Diseño de un cuestionario específico que comprende los atributos más significativos de apariencia, sabor, aroma y textura, así como apreciación global. Dicho cuestionario fue aprobado por catadores expertos.
\newpage
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Caracterización
Se llevó a cabo por comparación pareada de muestras que contenían el extracto de granada y muestras que no lo contenían.
En este cuestionario se evaluaron las siguientes pruebas:
\ding{51}
Prueba de diferencia, en la cual se preguntó a los catadores si detectaban alguna diferencia entre las muestras presentadas respecto a diferentes atributos.
\ding{51}
Prueba de preferencia, en la cual se preguntó a los catadores cual de las muestras le gustaba más.
\ding{51}
Pruebas de valoración de intensidad, en la que se pregunto a los catadores cuál de las muestras presentaba mayor intensidad en diferentes atributos.
\ding{51}
Pruebas de valoración por escalas de los diferentes atributos (Color, Aroma, Dulzor/Acidez, Sabor, Astringencia y Valoración General).
\ding{51}
Por último, se ha llevado a cabo el análisis estadístico y se ha elaborado un informe con los resultados que se resumen a continuación.
Las claves para las valoraciones de los atributos se resumen en la siguiente tabla:
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TABLA 4
10
Análisis sensorial de la Bebida de manzana
En la prueba de diferencia, un mayor número de catadores, en comparación con otros productos, no aprecian diferencias entre las muestras para los atributos estudiados.
En cuanto a Preferencia no hay una decantación general por ninguna de las dos muestras.
La representación gráfica de los resultados se muestra en la Figura 4A.
Los resultados de la prueba de preferencia de la caracterización de la Bebida de Manzana con y sin extracto se muestran en la Figura 4B.
En cuanto a la valoración por escalas de los diferentes atributos, se observan diferencias significativas (p\leq0.05) en las características de color.
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TABLA 5
12 
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En función de estos resultados, se puede decir que, la Bebida de Manzana que contiene el extracto de granada, es valorada de forma positiva desde el punto de vista sensorial, incluso más favorablemente que la Bebida de Manzana sin extracto.
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Análisis sensorial de la Bebida multifruta
Resultado valoración:
\bullet
Valoración General: el producto fue valorado entre "me gusta mucho" y "me gusta ligeramente".
\bullet
Astringencia: "ligeramente astringente".
\bullet
Sabor: entre "muy y moderadamente agradable".
\bullet
Dulzor/acidez: "moderadamente dulce".
\bullet
Aroma: "muy agradable".
\bullet
Color: entre "muy y moderadamente agradable".
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La incorporación del extracto de granada sobre la Bebida de Manzana, Uva, Kiwi y Ciruela no aporta colores, aromas ni sabores desagradables.
En función de estos resultados, se puede decir que, la Bebida multifruta que contiene el extracto de granada, es valorada de forma positiva desde el punto de vista sensorial.
Ejemplo 8
Preparación de una bebida de frutas/extracto de té prebiótica con un extracto de granada, evaluación de la estabilidad del extracto de granada en la matriz alimentaria
Una muestra de extracto de granada con un contenido en punicalaginas del 61,12% (p/p) obtenido de acuerdo a la aplicación EP 1967079 A1 fue utilizada para preparar bebidas de fruta con o sin extractos de té conteniendo extracto de granada a la concentración de 624 mg ex. granada/kg de matriz alimentaria (381,4 mg punicalaginas/Kg de matriz alimentaria). Los prototipos control (sin extracto) y prebiótico (con 624 ppm de extracto de granada) de varias matrices alimentarias con y sin extracto de granada se prepararon de acuerdo a las siguientes recetas:
13 
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14
Los 8 prototipos fueron pasteurizados a 100ºC, durante 15 segundos y envasados asépticamente en envases de vidrio a una temperatura de 85-87ºC. Los 8 envases de vidrio conteniendo los prototipos se sumergieron en agua para enfriarlos rápidamente y seguidamente, las pérdidas del extracto de granada incorporado en las Bebidas de frutas fue medida mediante la determinación del contenido en punicalaginas mediante método HPLC.
A continuación se muestran los resultados:
15
Las conclusiones principales son que es posible incorporar de forma estable el extracto de granada con propiedades prebióticas en matrices alimentarias del tipo de las bebidas de fruta con o sin extractos de té (que contienen desde un 5 a un 50% de fruta y desde un 0,01 al 1% de extractos de té rojo, negro, blanco, verde, etc.) Las matrices más óptimas contienen como base principal el zumo de manzana y/o el zumo de uva y la incorporación de entre 90 y 900 ppm de ascórbico y entre un 0,3 y 0,5 de ácido cítrico proporciona una excelente estabilidad para la incorporación del extracto de granada.
Adicionalmente, se almacenaron botellines con los prototipos de bebida de melocotón/manzana y de bebida de piña/ciruela a 5\pm3ºC y a 25\pm2ºC. Las pérdidas del extracto de granada incorporado en ambas bebidas de frutas fueron analizadas mediante la determinación del contenido en punicalaginas mediante método HPLC. Tras 6 meses de ensayo de estabilidad la pérdida de punicalaginas fue menor del 5% en las dos condiciones bajo ensayo:
a)
5\pm3ºC.
b)
25\pm2ºC con una humedad de 60\pm5 RH.
Ejemplo 9
Análisis sensorial de una bebida de frutas/extracto de té prebiótica con un extracto de granada
Se procedió al Análisis Sensorial, de acuerdo a lo descrito en el ejemplo 7, de la bebida de piña y ciruela y de la bebida de melocotón y manzana con y sin extracto de granada preparados de acuerdo al ejemplo 8.
Análisis sensorial de la Bebida de Piña y ciruela
En la prueba de diferencia, el 100% de los catadores identifica una diferencia entre las muestras. Estas diferencias son significativas (p\leq0.05) exclusivamente para el parámetro de Color, donde 10 de los 12 catadores identificaron la muestra con extracto de granada como más oscura. No obstante, la muestra con extracto es preferida por el 50% de los catadores.
La representación gráfica de los resultados se muestra en la Figura 5A.
Los resultados de la prueba de preferencia de la caracterización de la Bebida de Piña/Ciruela con y sin extracto se muestran en la Figura 5B.
En cuanto a la valoración por escalas de los diferentes atributos, los resultados son similares a los obtenidos en la prueba de diferencia/intensidad.
Se observan diferencias significativas (p\leq0.05) en las características de color y dulzor/acidez.
TABLA 6
16
En función de estos resultados, se puede concluir que, la Bebida de Piña y Ciruela que contiene extracto de granada se ha valorado, en todos los atributos analizados, de forma positiva desde el punto de vista sensorial.
Análisis sensorial de la Bebida Melocotón/Manzana
En la prueba de diferencia, el 100% de los catadores identifica una diferencia entre las muestras. Estas diferencias son significativas (p\leq0.05) para los parámetros de Color, Sabor y Astringencia.
No obstante, la muestra que contiene el extracto de granada es la preferida por 7 de los 11 catadores.
La representación gráfica de los resultados se muestra en la Figura 5C.
Los resultados de la prueba de preferencia de la caracterización de la Bebida de Melocotón/Manzana con y sin extracto se muestran en la Figura 5D.
En cuanto a la valoración por escalas de los diferentes atributos, los resultados son similares a los obtenidos en la prueba de diferencia/intensidad.
Se observan diferencias significativas (p\leq0.05) en las características de color, sabor y astringencia.
TABLA 7
17
En función de estos resultados, se puede concluir que, la Bebida de Melocotón y Manzana que contiene el extracto de granada, aún presentando una ligera astringencia, es valorada de forma positiva desde el punto de vista sensorial.
Ejemplo 10
Preparación de una bebida de frutas simbiótica con una cepa de bacteria probiótica y un extracto de granada, evaluación de la estabilidad del probiótico en la matriz alimentaria
Una muestra de extracto de granada con un contenido en punicalaginas del 61,12% (p/p) obtenido de acuerdo a la aplicación EP 1967079 A1 fue utilizada para preparar bebidas de fruta con extracto de granada a la concentración de 624 mg ex. granada/kg de matriz alimentaria (381,4 mg punicalaginas/Kg de matriz alimentaria). La bebida de frutas con extracto de granada se preparó de acuerdo a las siguiente receta:
18 
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La bebida de frutas con extracto de granada fue pasteurizada a 100ºC, durante 15 segundos y envasada asépticamente en envases de vidrio a una temperatura de 85-87ºC. Los envases de vidrio conteniendo los prototipos de bebida de frutas con extracto de granada se sumergieron en agua para enfriarlos rápidamente. Tras alcanzar los 25ºC, los botellines con la bebida se trasladaron a una campana de flujo laminar donde de forma completamente aséptica se adicionó en forma de producto liofilizado la bacteria probiótica Bifidobacterium lactis comercializado por la compañía danesa Christian Hansen bajo la marca comercial BB-12.
Los botellines se volvieron a cerrar herméticamente, se agitaron manualmente para conseguir la disolución del polvo liofilizado del probiótico y se almacenaron en una cámara fría a una temperatura de 5\pm3ºC. El contenido en UFC/g de bebida fue determinado mediante el método de conteo en placa a los 0 y 30 días desde el comienzo del almacenaje.
A continuación se muestran los resultados:
0 días de almacenaje
4x10^{8} UFC/ g bebida
30 días de almacenaje
9x10^{7} UFC/ g bebida.
Las conclusiones principales son que es posible incorporar de forma estable el extracto de granada con propiedades prebióticas junto con una cepa de bacteria probiótica en matrices alimentarias del tipo de las bebidas de fruta que contienen desde un 5 a un 50% de fruta y desde 0 a 9000 ppm de ácido ascórbico y desde el 0 al 5% de ácido cítrico. El contenido de bacterias probióticas vivas tras 1 mes de almacenamiento de la bebida de frutas simbiótica era superior a 10^{7} UFC/g de bebida simbiótica.
De este modo la invención contempla un alimento que comprende una bebida con un contenido de al menos un 10% de zumo de manzana, combinado o no con otros zumos de frutas, con un contenido de ácido ascórbico desde 0 a ppm a 9000 ppm, con un contenido de ácido cítrico entre 0% y 5%, con un contenido en bacterias probióticas en un rango entre 10^{2} a 10^{10} UFC/g de composición y con un contenido de extracto de granada o de extracto de oliva, entre 50 ppm y 10000 ppm.
Ejemplo 11
Preparación de un extracto de granada en polvo con estabilidad mejorada por la adición de ácido ascórbico y ácido cítrico
Ante la sorprendente mejora de la estabilidad de los componentes bioactivos del extracto de granada, como las punicalaginas, cuando este era incorporado en bebidas de frutas donde se añadía ácido ascórbico y ácido cítrico en las proporciones adecuadas comparativamente a cuando no se añadían los mencionados aditivos (véanse figuras 3B y 3C), se estudió como influía la adición de ácido ascórbico y ácido cítrico en la estabilidad del extracto. Se separan dos muestras de 10 L del extracto de granada en forma de líquido concentrado justo en la etapa previa a su secado en forma de polvo mediante atomización obtenido de acuerdo al ejemplo 7 de la aplicación EP 1 967 079 A1. A una de las muestras de 10 L se le adicionan 90 ppm de ácido ascórbico y un 0.5% de ácido cítrico y se agita para que se disuelvan por completo. La otra muestra de 10 L sirve de control y no se le adiciona ácido ascórbico ni ácido cítrico. A continuación, se obtuvieron las dos muestras de extracto de granada en forma de polvo seco siguiendo el procedimiento de secado descrito en el ejemplo 8 de la aplicación EP 1 967 079 A1. Primero se secó la muestra control sin aditivos (sublote 1) y a continuación tras limpiar el atomizador se secó la muestra con los aditivos (sublote 2). Los dos lotes de extracto de granada se envasaron en bolsas de aluminio termoselladas conteniendo 10 g por bolsa y 5 muestras de cada subióte. Todas las bolsas se colocaron en una cámara climática de incubación para llevar a cabo un estudio de estabilidad acelerada a una temperatura de 70\pm2ºC y una humedad 75\pm5%.
La estabilidad del extracto de granada en muestras de los sublotes 1 y 2 fue medida a distintos tiempos mediante la determinación del contenido en punicalaginas mediante método HPLC.
Tras 30 días de incubación en las condiciones mencionadas la pérdida de punicalaginas fue menor del 5% para el sublote 2 (muestra con los aditivos), mientras que para el sublote 1 (control sin aditivo) la pérdida de punicalaginas fue superior al 15%.
Ejemplo 12
Preparación de una margarina prebiótica con un extracto de oliva en sustitución del antioxidante químico terbutilhidroquinona, evaluación de su estabilidad oxidativa y de la estabilidad del hidroxitirosol
Una muestra de extracto de oliva con un contenido en hidroxitirosol del 23.57% (p/p) obtenido de acuerdo a la aplicación WO 2008/090460 fue utilizada para preparar margarinas conteniendo el mencionado extracto a distintas concentraciones, concretamente al 0, 0.02, 0.13 y 1.00%. Se prepararon 8 muestras de margarina cada una de aproximadamente 100 g de peso total. 4 de las muestras de una margarina contenían los ingredientes normales e iban enriquecidas con vitaminas A, D y E y calcio (Mar:Vit+Ca) y las otras 4 muestras de la otra margarina contenían los ingredientes normales e iban enriquecidas con ácidos grasos omega 3 y 6 (Mar:O3+O6). Las 8 muestras se fundieron en un baño maría a 55ºC y se les adicionó el extracto de oliva en la cantidad deseada, excepto a las dos muestras control donde en lugar de extracto de oliva se incorporó la dosis legalmente permitida, 200 mg/Kg, del antioxidante sintético terbutilhidroquinona (TBHQ). Tras homogenizar las muestras, se metieron en un arcón frío para hacerlas sólidas.
Después de esto, porciones de las muestras de margarina fueron muestreadas en tubos estériles para llevar a cabo un estudio de estabilidad a 5\pm3ºC de las 2 formulaciones de margarinas con extracto de oliva. Por otro lado, con el resto de la muestras de margarina se llevó a cabo un estudio de estabilidad oxidativa. La estabilidad oxidativa de cada una de las 8 muestras de margarina fue medida por el método Rancimat a 98ºC y 10 l/hora. La estabilidad oxidativa se expresa en horas y es un parámetro analítico que predice el tiempo que tardará un aceite de oliva en enranciarse. Una hora de estabilidad equivale a una semana aproximadamente en condiciones adecuadas de conservación. En el caso de las margarinas esa equivalencia puede ser algo distinta pero los datos obtenidos si tienen un claro valor comparativo. Cuando se preparó un gráfico con los resultados (ver figura 6) se encontró una correlación lineal entre la estabilidad oxidativa de la matriz alimentaria y el % de extracto de oliva adicionado a la matriz alimentaria. Se encontró que la margarina Mar:Vit+Ca había aumentado su estabilidad oxidativa desde las 23.8 h del control (200 mg/Kg TBHQ, 0% extracto de oliva) hasta 39.4 h, casi el doble cuando se incorporaba a la matriz alimentaria un 0.13% de extracto de oliva. Por otro lado, la otra margarina (Mar:O3+O6) había aumentado su estabilidad oxidativa desde las 9.2 h del control (200 mg/Kg TBHQ, 0% extracto de oliva) hasta 21.2 h, es decir más del doble cuando se incorporaba a la matriz alimentaria un 0.13% de extracto de oliva.
La estabilidad del extracto de oliva incorporado a las concentraciones del 0.02 y 0.13% en los 2 tipos de margarinas fue medida mediante la determinación del contenido en hidroxitirosol mediante método HPLC entre los 0 y 6 meses del estudio de estabilidad a 5\pm3ºC, encontrando que la variación del contenido en hidroxitirosol, o sea las pérdidas del ingrediente activo, en las dos margarinas al finalizar los 6 meses de ensayo era inferior del 5% en las condiciones ensayadas.
Ejemplo 13
Inhibición de enzimas implicadas en la hidrólisis de carbohidratos en el tracto digestivo mediante un extracto de granada
Una muestra de extracto de granada obtenido de acuerdo a la aplicación EP 1967079 A1 fue utilizada para estudiar la inhibición in vitro de las enzimas alfa-amilasa y alfa-glucosidasa. Las enzimas ensayadas fueron obtenidas de las siguientes fuentes: alfa-amilasa pancreática de cerdo y alfa-glucosidasa de Saccharomices cerevisiae (adquiridas en Sigma) y alfa-glucosidasa de cerdo (aislada de intestino delgado de cerdo de acuerdo a Menakshy y col. 2008).
Las medidas de las actividades alfa-amilasa y alfa-glucosidasa se llevaron a cabo de acuerdo a los procedimientos suministrados por Sigma junto a las enzimas adquiridas. Brevemente, la actividad alfa-glucosidasa se determinó espectrofotométricamente a 400 nm, con p-Nitrophenyl \alpha-D-Glucoside (PNP) como sustrato, y la actividad alfa-amilasa se determinó espectrofotométricamente a 540 nm, con almidón soluble de patata como sustrato. Como control positivo se realizaron medidas con el inhibidor acarbosa.
Se efectuaron las medidas por triplicado. En el caso de la alfa-glucosidasa porcina la concentración empleada para las medidas del control positivo con acarbosa fue 125 microgramos/ml, mientras que la concentración de extracto de granada ensayada fue de 650 microgramos/ml. En el caso de la alfa-glucosidasa de levadura la concentración de extracto de granada ensayada fue de 1.5 microgramos/ml.
Para las medidas con alfa-amilasa porcina las medidas del control positivo con acarbosa fue 35 microgramos/ml, mientras que la concentración de extracto de granada ensayada fue de 250 microgramos/ml.
Un resumen de los resultados se muestra a continuación:
19
20
21
*: Valores relativos a que el 100% es el valor de actividad enzimática obtenido sin inhibidor.
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La adición del extracto de granada en las concentraciones evaluadas inhibe las actividades alfa-amilasa y alfa-glucosidasa con respecto al control, al igual que la adición de acarbosa.
Una aproximación terapéutica para disminuir la glucosa postprandial es retardar la absorción de glucosa mediante a inhibición de enzimas implicadas en la hidrólisis de carbohidratos en el tracto digestivo, como la alfa-amilasa y la alfa-glucosidasa. La acarbosa, un potente inhibidor de la alfa-glucosidasa es el principio activo de medicamentos empleados como tratamiento de la diabetes mellitus tipo II. A la vista de los resultados obtenidos con el extracto de granada en los ensayos de inhibición in vitro se concluye que el extracto de granada puede retardar la absorción de glucosa mediante a inhibición de enzimas implicadas en la hidrólisis de carbohidratos en el tracto digestivo y por consiguiente disminuir la glucosa postprandial y por tanto ser útil para el tratamiento, cotratamiento o prevención de la diabetes mellitus tipo II. Adicionalmente el extracto de granada puede ser útil para el tratamiento, cotratamiento o prevención de la obesidad a través de la disminución de la eficiencia energética de alimentos ricos en carbohidratos.
Ejemplo 14
Activación de paraoxonasa 1 e Inhibición de hidroximetilglutaril-CoA-reductasa mediante un extracto de granada
Una muestra de extracto de granada obtenido de acuerdo a la aplicación EP 1967079 A1 fue utilizada para estudiar la inhibición/activación in vitro de la enzimas 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa (HMGR) y Paraoxonasa 1 (PON 1). Las enzimas ensayadas fueron obtenidas de Sigma e Invitrogen respectivamente.
Las medidas de las actividades HMRG y PON 1 se llevaron a cabo de acuerdo a los procedimientos suministrados por Sigma e Invitrogen junto a los kits enzimáticos adquiridos. Como control positivo de la HMGR se realizaron medidas con el inhibidor pravastatina.
Se efectuaron las medidas por triplicado. En el caso de la HMGR la concentración empleada para las medidas del control positivo con pravastatina fue 500 nanomolar, mientras que la concentración de extracto de granada ensayada fue de 100 microgramos/ml.
En el caso de la PON 1 las concentraciones de extracto de granada ensayadas fueron de 50 y 100 microgramos/ml.
Un resumen de los resultados se muestra a continuación:
22
*: Valores relativos a que el 100% es el valor de actividad enzimática obtenido sin inhibidor.
\vskip1.000000\baselineskip
23
*: Valores relativos a que el 100% es el valor de actividad enzimática obtenido sin activador.
La adición del extracto de granada en las concentraciones evaluadas inhibe la actividad HMGR y activa la actividad PON 1.
Una aproximación terapéutica para disminuir el colesterol en el suero sanguíneo es inhibir la biosíntesis endógena de colesterol mediante a inhibición de la enzima clave de la ruta biosintética, la HMGR. De este modo, se han desarrollado a partir de las estatinas, potentes inhibidores de la HMGR, numerosos medicamentos para tratar la hlpercolesterolemia. Es interesante remarcar de nuevo que la combinación del extracto de granada con fibra dietética no solo puede reducir la hipercolesterolemia a través de la bioactividad de los compuestos del extracto de granada, sino que la fibra alimentaria, (Ej: fibra soluble) al sufrir fermentación en el intestino incrementa la producción de ácidos grasos de cadena corta como el propionato. El propionato es absorbido en el colon a través de la vena portal y se ha demostrado que inhibe a la HMGR. Por otro lado, curiosamente las estatinas incrementan la actividad PON 1 en suero, la misma proteína de la que el extracto de granada es un activador. Se conoce que PON 1 protege a los lípidos en las lipoproteínas (Ej: en el HDL), y en macrófagos frente al estrés oxidativo que provoca su oxidación. Además PON 1 presenta otras propiedades antiaterogénicas, como reducir la formación de espumas celulares de macrófagos, que están implicadas en la progresión de la lesión aterosclerótica. A la vista de los resultados obtenidos con el extracto de granada en los ensayos de inhibición/activación in vitro se concluye que el extracto de granada puede actuar como inhibidor de HMGR y activador de PON 1 y por tanto ser útil para el tratamiento, cotratamiento o prevención de la hipercolesterolemia. Adicionalmente el extracto de granada puede ser útil para el tratamiento, cotratamiento o prevención de de la formación de una placa de ateroma en la capa media e íntima de las arterias a través de mecanismos como la activación de PON 1 entre otros.
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Ejemplo 15
Efecto de un extracto de granada sobre la biodisponibilidad de los componentes bioactivos de un extracto de brócoli en un estudio de intervención humano: cambios en la excreción urinaria de isotiocianatos totales incluyendo los ditiocarbamatos
Se adquirió una muestra comercial de semillas de brócoli de la variedad Calabrese, se tomaron 120 g de las semillas y se añadieron sobre agua hirviendo, aprox. 20 volúmenes de agua respecto del peso de las semillas, y se mantuvieron en ebullición 30 minutos. Seguidamente, se homogenizaron las semillas en el agua de cocción con un ultra-turrax modelo T25 y al termino del tratamiento de homogenización se volvió a llevar a ebullición el homogenizado manteniéndolo a 100ºC durante otros 10 minutos. A continuación, se separaron los sólidos gruesos mediante filtración del extracto y por último se clarificó el extracto mediante su centrifugación, reservando el sobrenadante aproximadamente 460 mL conteniendo 2.17 mg de glucorapanina/mL. Finalmente, se fraccionó el extracto en alícuotas de 23 mL en tubos falcon estériles y se congelaron a -20ºC hasta su consumo. Cada fracción de 23 mL contenía aproximadamente 50 mg de glucorapanina, de acuerdo a los análisis realizados mediante determinación HPLC de este analito.
El estudio de intervención humano se realizó paralelamente al estudio de intervención del efecto prebiótico de un extracto de granada descrito en el ejemplo 4. Tal y como ya se detalló, 6 individuos sanos tomaron 1 cápsula diaria de extracto de granada a la hora de la comida, lo que supone 575 mg de extracto. Se les indicó a los voluntarios que evitaran consumir productos de capacidad prebiótica (como fructooligosacáridos, inulina, etc), antibióticos, laxantes y especialmente productos con prebióticos (ej.: yogures sin pasteurizar, bebidas de leche fermentada, etc). Los 6 voluntarios comenzaron a seguir estas restricciones en su dieta habitual desde las 2 semanas previas a la fase de tratamiento del estudio de intervención, continuando con las mismas durante los 28 días del tratamiento, donde debían consumir a diario una capsula con extracto de granada.
A tiempos t=0 (antes del comienzo de la administración del extracto de granada) y t=28 (tras completas 28 días de administración del extracto de granada), se les administró, previo al almuerzo, una alícuota de 23 mL de extracto de semilla de brócoli conteniendo aproximadamente 50 mg de glucorapanina.
Se pidió que recogieran la orina de las 24 h a tiempo 0 (tras los 14 días previos a la administración del extracto de granada), y tras 28 días de administración.
Las muestras de orina fueron analizadas por HPLC tras la derivatización de los isotiocianatos totales de acuerdo al método de ciclocondensación con el 1,3-benzoditiol-2-tiona (Kristensen y col., 2007), para la determinación de la excreción urinaria de los isotiocianatos (ITCs) totales (donde se incluyen los isotiocianatos en forma libre y las formas conjugadas de los isotiocianatos con la N-acetilcisteina (denominados ditiocarbamatos, DTCs) de cada individuo en las 24 h siguientes a la ingesta de un extracto de brócoli.
Igualmente, una alícuota de extracto de brócoli de 23 mL conteniendo aproximadamente 50 mg de glucorapanina, se descongeló y se adiciono mirosinasa para obtener mediante la hidrólisis de los glucosinolatos de la muestra los correspondientes isotiocianatos. La muestra tras confirmar por HPLC que se había completado la conversión de los glucosinolatos, fue diluida convenientemente para determinar los ITCs totales de acuerdo al método de ciclocondensación con el 1,3-benzoditiol-2-tiona que se utilizó para la determinación de los ITCs totales en las muestras de orina. El valor obtenido se considero el 100% relativo de excreción total de ITCs que era posible encontrar en la orina de 24 h.
Los resultados se muestran resumidos a continuación.
TABLA 8
24
\text{*}:
\begin{minipage}[t]{138mm}
Valores relativos a que el 100% es el valor obtenido para los ITCs
totales de la ingesta de los 23 mL de extracto de brócoli.
\end{minipage}
\textdollar;
\begin{minipage}[t]{138mm}
Análisis estadístico realizado con las medidas por triplicado del
valor real de los ITCs totales en orina.
\end{minipage}
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Como se puede observar la excreción de ITCs totales, incluyendo sus formas conjugadas con N-acetilcisteina, ditiocarbamatos, en la orina de las 24 h es significativamente más alta en 5 de los 6 pacientes (83,3%) tras el consumo de un extracto de granada con propiedades prebióticas capaz de estimular en el colon determinadas poblaciones de la microbiota entre las que destacan los géneros Bifidobacterium y Lactobacillus. De lo anterior se puede concluir que el uso de un prebiótico, como por ejemplo el extracto de granada, o de un simbiótico puede mejorar la transformación en isotiocianatos de los glucosinolatos de un extracto vegetal en el colon humano, mejorando así la biodisponibilidad de los isotiocianatos, mediante la estimulación de la microflora del colon.
Ejemplo 16
Preparación de un extracto en polvo a partir de germinado de brócoli
Se adquirieron en un comercio varios sobres, comercializados para su uso en huerta, de semillas de brócoli de la variedad Calabrese, se tomaron 100 g de las semillas y se crecieron en bandejas los brotes en una cámara climática a 25ºC, una humedad del 75% y con un ciclo de 8 h luz y 16 h oscuridad. Después de 5,5 días se cosecharon los brotes, que pesaron 716 g. A continuación, los brotes se añaden sobre agua hirviendo, aprox. 10 volúmenes de agua respecto del peso de los brotes, y se mantienen en ebullición 10 minutos. Seguidamente se homogenizaba los brotes en el agua de cocción con una batidora y se dejaba el homogeneizado para que se completase la extracción acuosa durante 20-40 minutos. A continuación, se separaron los sólidos gruesos mediante filtración del extracto y por último se clarificaba el extracto mediante su centrifugación, reservando el sobrenadante que eran aproximadamente 5500 mL. A continuación, se concentró mediante rotaevaporación el extracto para obtener un extracto concentrado de aprox 300 mL conteniendo 3.12 mg de glucorapanina/mL. Por último, se disolvieron en el extracto 60 g de fibra dietaria y se seco el producto en un atomizador. Para ello se utilizó una bomba peristáltica para alimentar el atomizador previamente equilibrado con una temperatura de aire de entrada de 150ºC. La velocidad de alimentación se ajustó para obtener una temperatura de aire a la salida menor de 90ºC. Se obtienen 51.8 g de polvo con una humedad del 6.72% (termobalanza a 110ºC hasta peso constante), y una riqueza de glucorapanina del 1.69%.
Ejemplo 17
Preparación de alimentos funcionales, ricos en vegetales comestibles como componentes nutricionales, mediante la incorporación de un extracto de brócoli y de una fibra dietaria y evaluación de la estabilidad de la glucorapanina en la matriz alimentaria
Una muestra de extracto de brócoli con un contenido en glucorapanina del 1.69%. (p/p) obtenido de acuerdo al ejemplo 16 fue utilizada para preparar varias matrices alimentarias funcionalizadas con el extracto.
Se prepararon 3 matrices ajustando a 100 mg de glucorapanina por L de matriz alimentaria. Para ello se adicionó el extracto a concretamente al 0 (control), y 0.6% (matrices funcionalizadas). La fibra dietaria que se utilizó para el secado del extracto supone que al adicionar 0.6% de extracto estemos añadiendo además 5.4 g de fibra dietaria por L de matriz alimentaria. Se prepararon 6 muestras de producto cada una de aproximadamente 1 Kg de peso total.
Las matrices empleadas para el ensayo fueron:
-
gazpacho andaluz
-
bebida de frutas y verduras
-
puré de calabacín.
Los 6 prototipos fueron pasteurizados a 100ºC, durante 15 segundos y envasados asépticamente en envases de vidrio a una temperatura de 85-87ºC. Los 6 envases de vidrio conteniendo los prototipos se sumergieron en agua para enfriarlos rápidamente y seguidamente. Finalmente y de forma estéril se repartieron alícuotas de aprox. 100 ml de cada uno de los productos preparados en botellas de vidrio previamente autociavazas y se almacenaron a 5\pm3ºC para la evaluación de la estabilidad del extracto de brócoli en los productos preparados. A los 0, 1, 2 y 3 meses se abrieron muestras correspondientes a los 3 productos para evaluar las pérdidas del extracto de brócoli incorporado en las matrices alimentarias mediante la determinación del contenido en glucorapanina medido por método HPLC.
Tras 3 meses de ensayo de estabilidad la pérdidas de glucorapanina en las 3 matrices fue menor del 5% en las condiciones bajo ensayo (5\pm3ºC).
Ejemplo 18
Expresión génica diferencial en un modelo animal
El ensayo se realizó con tres grupos de 10 ratones cada uno que se alimentaron durante 30 días con pienso comercial y con una dosis diaria de 12.8 mg de extracto de granada por ratón (equivalente a una ingesta diaria de 320 mg ext. granada/Kg masa corporal) (grupo 2), o con una dosis diaria de 0.9 mg de extracto de oliva por ratón (equivalente a una ingesta diaria de 22.9 mg ext. oliva/Kg masa corporal) (grupo 3) o sin extracto de granada (grupo 1, control). Tras el periodo de administración se sacrificaron los ratones y se le extrajo el hígado a cada uno y se conservó a -80ºC. Para que los resultados fuesen representativos del grupo se realizó un pool con un fragmento del mismo peso del hígado de cada uno de los ratones de cada grupo. A partir del mismo se aisló ARN, el cual fue sometido a unos controles de calidad rigurosos de manera previa a los ensayos.
El análisis de expresión génica diferencial se realizó mediante el uso de microarrays. En concreto se utilizaron los chips GeneChip® Mouse Genome 430 2.0 Array (Affymetrix), que permite el análisis de la expresión de aproximadamente 14000 genes descritos en ratón. Los chips mostraron los datos de intensidad dependientes de la cantidad de ARN mensajero de cada gen en forma de Log_{2}. A partir de los mismos, por diferencia de señal entre cada grupo respecto al control, se calcula la expresión génica diferencial debido al tratamiento con un extracto de granada y al tratamiento con un extracto de oliva.
La interpretación biológica de los resultados de la expresión génica diferencial que se muestran en los ejemplos 18 a 22 se llevó a cabo con la información obtenida en las bases de datos siguientes: RefGene (Reference for genes, proteins and antibodies): http://refgene.com/; CTD (The Comparative Toxigenomics Database): http://ctd.mdibl.org/; MGI (Mouse Genomics Informatics): http://www.informatics.jax.org/; KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes): http://www.genome.jp/kegg/genes.html. La función biológica de los genes descritos, así como su implicación en los diversos procesos, deriva de la información tanto de los genes de ratón, como de sus homólogos en humanos.
Ejemplo 19
Propiedades del extracto de granada y del extracto de oliva, en la modulación del sistema inmune, ayudando a reforzar las defensas naturales del organismo
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación en la expresión del gen del receptor de la interleuquina 7 ( IL7R ) con respecto al grupo control de 3,21 veces.
La IL7 es producida por las células epiteliales del intestino y es esencial para la proliferación de los linfocitos T y para la organización del tejido linfoide asociado a la mucosa. Los receptores de la IL7 se encuentran en la superficie de los linfocitos intraepiteliales del intestino. La IL7 y su receptor están implicados en la regulación de la respuesta inmune en la mucosa intestinal. Además se ha demostrado el papel esencial de IL7R en la formación de las placas de Peyer, donde se inicia principalmente la respuesta inmunitaria del intestino.
Se ha demostrado una activación en la expresión del gen de IL7R en la mucosa intestinal tras la administración de un probiótico en humanos.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación en la expresión del gen Dmbt1 (deleted in malignant brain tumors 1) con respecto al grupo control de 20,27 veces.
El producto del gen Dmbt1 es una glicoproteína de membrana que contiene múltiples dominios SRCR (múltiple scavenger receptor cysteine-rich) implicados en el reconocimiento de un amplio rango de bacterias patógenas. Se ha demostrado in vitro una unión a Salmonella entérica serotipo Typhimurium y una posterior agregación bacteriana, lo reduce la invasión de las células epiteliales. Además, esta glicoproteína interacciona con al menos dos tipos de virus distintos, VIH e influenza A, lo que resulta en un inhibición de la infección viral in vitro. La proteína también interacciona con varias moléculas implicadas en inmunidad, como SP-D, IgA y C1q. Por tanto, el producto del gen Dmbt1 tiene una función muy importante en la inmunidad innata.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación en la expresión del gen Tff2 (trefoil factor 2 (spasmolytic protein 1)) con respecto al grupo control de 12,65 veces.
El producto del gen Tff2 pertenece a una familia de pequeñas proteínas (TFF) que son producidas principalmente en el tracto gastrointestinal y que están implicadas en la protección y en la reparación de la mucosa, manteniendo la integridad del tracto gastrointestinal.
Se ha demostrado que la administración de una mezcla prebiótica en ratas y la administración oral de una cepa de Lactobacillus en ratón promueven la secreción gastrointestinal de las proteínas TFF.
Se ha descrito que el gen Dmbt1 podría ser un receptor del producto del gen Tff2. La activación de la expresión de ambos genes actúa de forma sinérgica en la protección de la mucosa gastrointestinal.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación del gen Cyp39a1 (cytochrome P450, family 39, subfamily a, polypeptide 1) con respecto al grupo control de 2,31 veces.
El producto del gen Cyp39a1 es una enzima oxisterol 7 \alpha-hidroxilasa que participa en el metabolismo del colesterol. Concretamente la enzima cataliza el paso de 24S-hidroxicolesterol a 7\alpha,24-dihidroxicolesterol, dentro de la ruta de conversión del colesterol en ácidos biliares en el hígado. Los ácidos biliares confieren a la mucosa intestinal protección frente a bacterias. En el intestino distal la capacidad antibacteriana de los ácidos biliares se debe a la activación del receptor FXR (Farnesoid X Receptor), lo que induce la expresión de genes cuyos productos previenen el crecimiento bacteriano y promueven la integridad del epitelio gastrointestinal.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de granada se produjo una activación en la expresión del gen Scara5 (scavenger receptor class A, member 5 (putative)) con respecto al grupo control de 2,46 veces.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación en la expresión del gen Scara5 con respecto al grupo control de 3,37 veces.
El producto del gen Scara5 es una proteína que pertenece a la familia de receptores de tipo scavenger, los cuales están implicados en la inmunidad innata relacionada con el reconocimiento de patógenos, ya que se ha demostrado su capacidad de unión a una gran variedad de éstos. El gen Scara5 se expresa en células epiteliales y también posee capacidad de unión a patógenos.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación en la expresión del gen Cfd (complement factor D (adipsin)) con respecto al grupo control de 2,57 veces.
El producto del gen Cfd es una serin proteasa (factor D del complemento) que participa en la activación del sistema del complemento, concretamente en la ruta alternativa, implicado en el reconocimiento y eliminación de patógenos. El factor D del complemento participa en la formación del complejo C3bBb (convertasa C3 de la vía alternativa). La convertasa C3 está implicada en la opsonización de microorganismos patógenos y en la neutralización de virus.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación en la expresión del gen C7 (complement component 7) con respecto al grupo control de 1,85 veces.
El producto del gen C7 es una glicoproteína (factor C7 del complemento) implicada en la activación de la vía clásica del sistema del complemento. En humanos la deficiencia de la proteína C7 provoca anomalías en procesos como la quimiotaxis de neutrófilos, la fagocitosis y la opsonización.
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Ejemplo 20
Propiedades del extracto de granada y del extracto de oliva, en la regulación del metabolismo lipídico
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación del gen Cyp39a1 (cytochrome P450, family 39, subfamily a, polypeptide 1) con respecto al grupo control de 2,31 veces.
El producto del gen Cyp39a1 es una enzima oxisterol 7 \alpha-hidroxilasa que participa en el metabolismo del colesterol. Concretamente la enzima cataliza el paso de 24S-hidroxicolesterol a 7\alpha,24-dihidroxicolesterol, dentro de la ruta de conversión del colesterol en ácidos biliares en el hígado. El ARNm de está enzima se expresa de manera constitutiva en el hígado. La biosíntesis de ácidos biliares es vía más importante de eliminación del exceso de colesterol en mamíferos.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de granada se produjo una represión del gen serpine1 (serpin peptidase inhibitor, clade E, member 1) con respecto al grupo control de 3,51 veces.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una represión del gen serpine1 (serpin peptidase inhibitor, clade E, member 1) con respecto al grupo control de 3,49 veces.
Al producto del gen serpine1 se le denomina inhibidor del activador del plasminógeno tipo 1 (PAI-1). Se ha demostrado que una dieta rica en colesterol en ratones produce una activación de la expresión de serpine1 en hígado. Los niveles de PAI-1 en plasma en humanos con hipercolesterolemia son elevados y se ha demostrado que las estatinas inhiben la expresión del gen serpine1 en células endoteliales humanas. Las estatinas son fármacos inhibidores de la enzima HMG CoA reductasa indicados para disminuir los niveles de colesterol en pacientes con hipercolesterolemia. Un inhibidor de la absorción intestinal del colesterol de la dieta (ezetimiba), indicado también en hipercolesterolemia, reprime la expresión del gen serpine1 en aorta y tejido adiposo de ratones.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación del gen Cyp17a1 (cytochrome P450, family 17, subfamily a, polypeptide 1) con respecto al grupo control de 4,27 veces.
El producto del gen Cyp17a1 es una enzima implicada en la biosíntesis de hormonas esteroides a partir de colesterol. En concreto la enzima cataliza la 17\alpha-hidroxilación de los esteroides C21, pregnolona y progesterona, y el posterior procesamiento (17,20 liasa) para obtener los esteroides C19 dehidroepiandrosterona y androstenediona, respectivamente. Niveles bajos de Cyp17a1 han sido relacionados con hipertensión.
En consecuencia es posible un cotratamiento de la hipercolesterolemia mediante la administración de una dosis activa de un extracto de granada y una estatina en dosis inferiores a las prescritas cuando el tratamiento se lleva a cabo únicamente con la estatina.
Ejemplo 21
Regulación de la absorción de minerales de un extracto de granada y un extracto de oliva
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación del gen Mt4 (metallothionein 4) con respecto al grupo control de 9,1 veces.
El producto del gen Mt4 es una proteína citoplasmática que se une a minerales como el cobre y el zinc. Las metalotioneínas intervienen en la homeostasis del Zn y del Cu y en la detoxificación de los mismos cuando alcanzan concentraciones elevadas.
Ejemplo 22
Propiedades del extracto de granada y del extracto de oliva, en el tratamiento, cotratamiento y prevención de distintos procesos/enfermedades oncológicos
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de granada se produjo una represión de los oncogenes jun , myc y fos con respecto al grupo control de 3,04, 3,27 y 6,43 veces, respectivamente.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una represión de los oncogenes jun, myc y fos con respecto al grupo control de 2,22, 3,75 y 4,31 veces, respectivamente.
Los productos de jun y fos son factores de transcripción que dimerizan para formar el complejo de transcripción denominado AP-1 (Activating Protein-1). AP-1 es un factor de transcripción que regula la expresión de genes inducidos por factores de crecimiento y promotores tumorales. La sobreexpresión de los oncogenes jun y/o fos está asociada a varios tipos de cáncer, como cáncer de mama, de ovario, de colon, osteosarcoma, cervical, de pulmón y de vejiga. Por tanto, AP-1 se utiliza como diana para el tratamiento quimioterapeútico del cáncer.
El producto del oncogen myc es una proteína que regula la expresión del factor de transcripción E2F y de la fosfatasa responsable de la activación de las ciclinas Cdc, que están implicados en la regulación del ciclo celular. El oncogén myc está sobreexpresado en numerosos cánceres humanos, como cáncer de páncreas, cervical, de mama y de colon. El producto del oncogén myc se utiliza también como diana para el tratamiento del cáncer.
En un ensayo realizado en humanos se demostró que en la mucosa intestinal se produce una represión en la expresión de los oncogenes jun, fos y myc tras la infusión de la membrana con una cepa de Lactobacillus.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de granada se produjo una represión del gen Adamts1 (a disintegrin-like and metalloprotease (reprolysin type) with thrombospondin type 1 motif) con respecto al grupo control de 2,04 veces.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una represión del gen Adamts1 con respecto al grupo control de 1,84 veces.
El producto del gen Adamts1 es una proteína que tiene un dominio metaloproteinasa y un dominio desintegrina. Está proteína está implicada en procesos inflamatorios y en el desarrollo de la caquexia cancerosa, según ensayos con modelos animales en cáncer de colon. Se ha demostrado una sobreexpresión del gen Adamts1 en cáncer de mama con alta actividad metastásica. Se ha especulado que la sobreexpresión de este gen podría promover el crecimiento tumoral mediante el reclutamiento de fibroblastos.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de granada se produjo una represión del gen ATF3 (activating transcription factor 3) con respecto al grupo control de 4,34 veces.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una represión del gen ATF3 con respecto al grupo control de 4,27 veces.
El producto del gen ATF3 es un factor de transcripción que se expresa en condiciones de estrés y daño en el ADN en diversos tejidos. En diversos tumores de mama se ha descrito una sobreexpresión del gen ATF3. Esta proteína se utiliza como un marcador del cáncer de próstata ya que se ha comprobado su implicación en el desarrollo de este tipo de cáncer y es, por tanto, una posible diana terapéutica.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación en la expresión del gen Dmbt1 (deleted in malignant brain tumors 1) con respecto al grupo control de 20,27 veces.
El producto del gen Dmbt1 es una glicoproteína de membrana con función de receptor con dominios tipo SRCR (dominios ricos en cisteina tipo scavenger) cuya falta de función se asoció a cáncer de mama. Además, se considera un gen supresor de tumores de colon, digestivo y de pulmón.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación en la expresión del gen Tff2 (trefoil factor 2 (spasmolytic protein 1)) con respecto al grupo control de 12,65 veces.
El producto del gen Tff2 pertenece a una familia de pequeñas proteínas (TFF) que son producidas principalmente en el tracto gastrointestinal y que están implicadas en la protección y en la reparación de la mucosa, manteniendo la integridad del tracto gastrointestinal. Una represión en la expresión del gen Tff2 está asociada a la proliferación del cáncer digestivo.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación en la expresión del gen Nupr1 (nuclear protein, transcriptional regulator, 1) con respecto al grupo control de 7,9 veces.
El producto del gen Nupr1 es una proteína nuclear (NURP1 o p8) que participa en diversos procesos biológicos mediante la regulación de la transcripción. Se ha demostrado in vitro que la sobrexpresión de esta proteína reduce el crecimiento de células de cáncer de próstata. Por tanto, se ha descrito la proteína p8 como supresora de tumores de próstata. Se ha demostrado una elevada sobreexpresión del gen Nurp1 mediada por la acción de la 1,25-dihidroxivitamina D3, un potente inhibidor de células de cáncer de mama in vivo e in vitro, lo que supone una participación de la proteína p8 en el mecanismo de inhibición.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación en la expresión del gen FAM107A (family with sequence similarity 107, member A) con respecto al grupo control de 7,17 veces.
El producto del gen FAM107A es una proteína nuclear denominada TU3A implicada en la regulación del ciclo celular. Se identificó como una proteína supresora de tumores en cáncer de riñón. Se ha demostrado una represión en la expresión del gen FAM107A en diversos tipos de cáncer, como cáncer de próstata.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de granada se produjo una activación en la expresión del gen Ddit4 (DNA-damage-inducible transcript 4) con respecto al grupo control de 2,92 veces.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación en la expresión del gen Ddit4 con respecto al grupo control de 6,08 veces.
El producto del gen Ddit4 es una proteína denominada RTP801 o Redd1, que inhibe la ruta mTOR/S6K1, implicada en la proliferación celular. Los inhibidores de la mencionada ruta están siendo evaluados como terapia del cáncer. En ratones se ha descrito que la deficiencia en el gen Ddti4 promueve el crecimiento tumoral, mientras que en humanos se ha descrito represión del gen en varios tipos de cáncer.
\newpage
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de granada se produjo una represión en la expresión del gen Egr1 (early growth response 1) con respecto al grupo control de 2,61 veces.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una represión en la expresión del gen Egr1 con respecto al grupo control de 1,72 veces.
El producto del gen Egr1 es un factor de transcripción implicado en diversos procesos celulares y se ha demostrado su implicación en el crecimiento y supervivencia de células de cáncer de próstata. En modelos animales de cáncer de próstata se ha demostrado que la falta del gen Egr1 retarda el crecimiento tumoral.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de granada se produjo una represión del gen Sox9 (SRY (sex determining región Y)-box 9) con respecto al grupo control de 2,45 veces.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una represión del gen Sox9 con respecto al grupo control de 3,62 veces.
El gen Sox9 produce una proteína que actúa como factor de transcripción con dominios de unión al ADN tipo HMG (High Mobility Group). Se ha demostrado una implicación del producto del gen Sox9 en la proliferación del cáncer de páncreas y una sobreexpresión del mismo en diversas líneas celulares de cáncer de colon.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de granada se produjo una represión en la expresión del gen de la interleuquina 1 alpha ( IL1\alpha ) con respecto al grupo control de 2,97 veces.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una represión en la expresión del gen de la IL1\alpha con respecto al grupo control de 2,14 veces.
La IL1\alpha es una citoquina implicada en procesos de inflamación. El gen IL1\alpha está sobreexpresado en diversos tipos de cáncer, como cáncer de pulmón, de colon y melanoma. En cáncer de colon la IL1\alpha estimula la migración celular y la angiogénesis y su expresión está inducida por la prostaglandina E2. En un ensayo realizado en humanos se demostró que en la mucosa intestinal se produce una represión en la expresión del gen IL1\alpha tras la infusión de la membrana con una cepa de Lactobacillus.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de granada se produjo una activación en la expresión de los genes Gadd45b (growth arrest and DNA-damage-inducible 45 beta) y Gadd45g (growth arrest and DNA-damage-inducible 45 gamma) con respecto al grupo control de 2,24 y 2,57 veces, respectivamente.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación en la expresión de los genes Gadd45b y Gadd45g con respecto al grupo control de 2,43 y 1,73 veces, respectivamente.
Los productos de los genes Gadd45b y Gadd45g son proteínas relacionadas con el control del ciclo celular. En modelos de ratones con melanoma se ha demostrado que la falta de función de Gadd45b produce un mayor crecimiento tumoral. El producto de este gen es necesario para la activación de la quinasa p38. La proteína p38 está implicada en la supresión de tumores. La expresión de los genes Gadd45b y Gadd45g está reprimida en diversos tipos de cáncer.
Ejemplo 23
Propiedades del extracto de granada y del extracto de oliva, en el tratamiento, cotratamiento y prevención del cáncer de colon
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de granada se produjo una represión de los oncogenes jun , myc y fos con respecto al grupo control de 3,04, 3,27 y 6,43 veces, respectivamente.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una represión de los oncogenes jun, myc y fos con respecto al grupo control de 2,22, 3,75 y 4,31 veces, respectivamente.
Los productos de jun y fos son factores de transcripción que dimerizan para formar el complejo de transcripción denominado AP-1 (Activating Protein-1). AP-1 es un factor de transcripción que regula la expresión de genes inducidos por factores de crecimiento y promotores tumorales. La sobreexpresión de los oncogenes jun y/o fos está asociada a cáncer de colon.
El producto del oncogén myc es una proteína que regula la expresión del factor de transcripción E2F y de la fosfatasa responsable de la activación de las ciclinas Cdc, que están implicados en la regulación del ciclo celular. El oncogén myc está sobreexpresado en cáncer de colon. Tanto la AP-1 como el producto del oncogén myc se utiliza también como diana para el tratamiento del cáncer.
En un ensayo realizado en humanos se demostró que en la mucosa intestinal se produce una represión en la expresión de los oncogenes jun, fos y myc tras la infusión con una cepa de Lactobacillus.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de granada se produjo una represión del gen Fam84A (family with sequence similarity 84, member A) con respecto al grupo control de 2,53 veces.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una represión del gen Fam84A con respecto al grupo control de 2,52 veces.
El producto del gen Fam84A es una proteína conocida como NSE1 (neurologic sensory protein 1) que se localiza en la membrana subcelular y está implicada en movilidad celular. La expresión de este gen está activada en cáncer de colon. La proteína NSE1 podría estar implicada en la movilidad de las células de cáncer de colon y por tanto participar en la progresión de este tipo de cáncer.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de granada se produjo una represión del gen Adamts1 (a disintegrin-like and metalloprotease (reprolysin type) with thrombospondin type 1 motif) con respecto al grupo control de 2,04 veces.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una represión del gen Adamts1 con respecto al grupo control de 1,84 veces.
El producto del gen Adamts1 es una proteína que tiene un dominio metaloproteinasa y un dominio desintegrina. Está proteína está implicada en procesos inflamatorios y en el desarrollo de la caquexia cancerosa, según ensayos con modelos animales en cáncer de colon.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación en la expresión del gen Dmbt1 (deleted in malignant brain tumors 1) con respecto al grupo control de 20,27 veces.
El producto del gen Dmbt1 es una glicoproteína de membrana con función de receptor con dominios tipo SRCR (dominios ricos en cisteina tipo scavenger). Está proteína se considera un gen supresor de tumores de colon.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de granada se produjo una represión del gen Sox9 (SRY (sex determining región Y)-box 9) con respecto al grupo control de 2,45 veces.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una represión del gen Sox9 con respecto al grupo control de 3,62 veces.
El gen Sox9 produce una proteína que actúa como factor de transcripción con dominios de unión al ADN tipo HMG (High Mobility Group). Se ha demostrado una sobreexpresión del gen Sox9 en diversas líneas celulares de cáncer de colon.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de granada se produjo una represión en la expresión del gen de la interleuquina 1 alpha ( IL1\alpha ) con respecto al grupo control de 2,97 veces.
En el grupo de ratones del ejemplo 16 que tomó un extracto de oliva se produjo una represión en la expresión del gen de la IL1\alpha con respecto al grupo control de 2,14 veces.
La IL1\alpha es una citoquina implicada en procesos de inflamación. El gen IL1\alpha está sobreexpresado cáncer de colon. En cáncer de colon la IL1\alpha estimula la migración celular y la angiogénesis y su expresión está inducida por la prostaglandina E2.
En un ensayo realizado en humanos se demostró que en la mucosa intestinal se produce una represión en la expresión del gen IL1\alpha tras la infusión con una cepa de Lactobacillus.
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Ejemplo 24
Propiedades del extracto de granada y del extracto de oliva, en el tratamiento de la obesidad y diabetes mellitus
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de granada se produjo una represión del gen serpine1 (serpin peptidase inhibitor, clade E, member 1) con respecto al grupo control de 3,51 veces.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una represión del gen serpine1 con respecto al grupo control de 3,49 veces.
Al producto del gen serpine1 se le denomina inhibidor del activador del plasminógeno tipo 1 (PAI-1). En diabetes tipo 1 y tipo 2 se han observado altos niveles plasmáticos de la proteína PAI-1, más acusados en el caso de diabetes tipo 2. Los niveles tan elevados en este tipo de diabetes son debidos al efecto directo de la glucosa en la síntesis de PAI-1 en las arterias y al efecto de la Insulina en la síntesis de PAI-1 en el hígado. La proteína PAI-1 inhibe la señal de la insulina a través de su unión y estabilización con vitronectina. Las tiazolidinedionas o glitazonas son fármacos agonistas del receptor PPAR-\gamma indicados en diabetes tipo 2, y que provocan una disminución en los niveles de PAI-1. Se ha descrito una correlación entre los niveles altos de glucosa, aún dentro del rango de normalidad, en personas sanas y los niveles de PAI-1. Se ha observado una activación en la expresión de serpine1 en hígado de ratas diabéticas.
Los niveles elevados de PAI-1 en plasma son la principal causa de la inactivación de la actividad fibrinolítica, que se ha asociado desde hace muchos años a la obesidad. En casos de pérdida de peso en pacientes obesos se ha descrito un descenso en los niveles plasmáticos de PAI-1, que se recuperan en el caso de ganancia de peso.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación del gen ppargc1a (peroxisome proliferative activated receptor, gamma, coactivator 1) con respecto al grupo control de 3,14 veces.
El producto del gen ppargcla es un factor transcripcional que participa en la regulación de genes implicados en el metabolismo energético, mediante la activación del receptor PPAR-\gamma. Este receptor hormonal tiene un importante papel en la regulación del metabolismo de hidratos de carbono y lípidos, mediante el incremento de la sensibilidad a la insulina. Sustancias agonistas del receptor PPAR-\gamma están siendo utilizados como fármacos para el tratamiento de la diabetes tipo 2. Entre éstos destacan las tiazolidinedionas. Como activadores farmacológicos del receptor PPAR\gamma, las tiazolidinedionas ejercen un importante efecto metabólico mejorando el metabolismo glucídico (menor producción y mayor aclaramiento de glucosa) y disminuyendo la resistencia insulínica asociada a obesidad, síndrome metabólico y diabetes mellitus tipo 2. Además, estos fármacos tienen efectos significativos sobre los lípidos plasmáticos, siendo útiles en el tratamiento de las dislipemias. Se ha demostrado que el hidroxitirosol produce una activación del gen ppargc1a en adipocitos. La expresión del gen de este receptor está reprimida en ratones con diabetes tipo 1.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación del gen adipoq (adiponectin) con respecto al grupo control de 2 veces.
El producto del gen adipoq es una citoquina (adiponectina) sintetizada principalmente en tejido adiposo y abundante en plasma. En modelos animales y en humanos se ha demostrado un nivel bajo de adiponectina en plasma en casos de diabetes. Los niveles plasmáticos de esta citoquina se incrementan con el tratamiento de la diabetes con tiazolidinedionas.
La adiponectina también está relacionada con obesidad. En ratones obesos se ha descrito una represión del gen adipoq. En humanos, los niveles plasmáticos de la adiponectina son menores en pacientes con obesidad. Los niveles de esta citoquina en mujeres están inversamente relacionados con el índice de masa corporal.
Se ha especulado que la adiponectina, o bien sustancias que estimulen su producción, podrían ser utilizadas para el tratamiento de la diabetes tipo 2 y de la obesidad.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de granada se produjo una activación del gen Lpin1 (lipin 1) con respecto al grupo control de 2,35 veces.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una represión del gen Lpin1 con respecto al grupo control de 2,66 veces.
El producto del gen Lpin1 es una proteína de la familia de las lipinas que se describió en ratones cuya falta de función producía lipodistrofia. Esta proteína participa en la adipogénesis y en el metabolismo de los triglicéridos. Además participa, junto con el producto del gen ppargc1a, en la activación transcripcional en hígado del receptor PPAR-\gamma. Los niveles del gen Lpin1 en tejido adiposo están inversamente relacionados con resistencia a insulina. En este tejido se ha demostrado un aumento en la expresión del gen Lpin1 tras tratamiento con tiazolidinedionas, fármacos cuyo mecanismo de acción es el aumento de la sensibilidad a insulina.
En el grupo de ratones del ejemplo 18 que tomó un extracto de oliva se produjo una activación del gen lepr (leptin receptor) con respecto al grupo control de 4,25 veces.
El producto del gen lepr es el receptor de leptina, que es una hormona implicada en la regulación del metabolismo. La leptina interviene en la regulación del tejido adiposo, actuando a nivel del sistema nervioso central, donde parece disminuir la ingesta alimentaria y aumentar el gasto energético. En ensayos desarrollados en ratones que no producían leptina o su receptor se demostró que desarrollaban obesidad. En el caso de ratones obesos que no producían leptina, se realizó con éxito un tratamiento con está hormona. Tras este tratamiento se observó un aumento de expresión del gen del receptor de la leptina en hígado. Por tanto, el hígado parece tener un importante papel en la regulación de los niveles circulantes de leptina.
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Ejemplo 25
Expresión génica diferencial mediante RT-PCR cuantitativa
Los resultados mostrados en los Ejemplos 19 a 24 de expresión génica diferencial que derivan de los resultados de los microarrays (véase Ejemplo 16) se confirmaron mediante cálculo de la expresión génica diferencial mediante RT-PCR cuantitativa. A partir del mismo ARN aislado del hígado de los ratones se realizó una reacción de RT-PCR con SYBR Green. Se realizó una cuantificación relativa utilizando como gen de referencia GAPDH de ratón, de expresión constitutiva. El método utilizado para la cuantificación relativa fue el descrito por Pfaffl, 2001.
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Claims (19)

1. Una composición que contiene un extracto de granada con un contenido en polifenoles, con propiedades antimicrobianas, de al menos un 5% (p/p) (medido como fenoles totales y expresado como ácido gálico equivalente), dicha composición comprendiendo:
a.
un contenido en punicalaginas de al menos un 2%;
b.
ácido elágico; y
c.
un contenido de ácido cítrico de al menos un 0,5% (p/p),
en la cual la relación punicalaginas/ácido elágico libre (% p/p), se sitúa en el rango de 10/1 a 35/1, y la solubilidad en agua es de al menos un 3% (p/p), cual composición puede ser usada como prebiótico.
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2. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, que contiene en lugar de ácido cítrico, ácido ascórbico en al menos un 0,05% (p/p).
3. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, que contiene ácido cítrico en al menos un 0,5% (p/p) y ácido ascórbico en al menos un 0,05% (p/p).
4. Un alimento, que incluye una composición de acuerdo a la reivindicación 1.
5. Un alimento, de acuerdo a la reivindicación 4, caracterizado porque dicho alimento es una bebida refrescante de frutas, con un contenido de al menos un 10% de zumo de manzana, combinado o no con otros zumos de frutas, con un contenido de ácido ascórbico desde 0 a ppm a 9000 ppm, con un contenido de ácido cítrico entre 0% y 5% y con un contenido de extracto de granada, entre 50 ppm y 10000 ppm.
6. Un alimento, de acuerdo a la reivindicación 4, caracterizado porque dicho alimento es una bebida refrescante de frutas, con un contenido de al menos un 12% de zumo de uva, combinado o no con otros zumos de frutas, con un contenido de ácido ascórbico desde 0 a ppm a 9000 ppm, con un contenido de ácido cítrico entre 0% y 5% y con un contenido de extracto de granada, entre 50 ppm y 10000 ppm.
7. Un alimento, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 caracterizado porque contiene una cepa bacteriana probiótica.
8. Un alimento, de acuerdo a la reivindicación 7, para un uso como simbiótico.
9. Un alimento simbiótico de acuerdo a la reivindicación 8, caracterizado porque dicho alimento tiene un contenido en bacterias probióticas pertenecientes a los géneros Bifidobacterium y/o Lactobacillus en un rango entre 10^{2} a 10^{10} UFC/g de composición.
10. Un alimento simbiótico de acuerdo a la reivindicación 9 caracterizado porque la cepa probiótica contenida en dicha composición es Lactobacilluscasei DN 114-001, o Bifidobacteriumanimalis DN-173 010.
11. Un alimento de acuerdo a alguna de las reivindicaciones 4 a 10 para ser usado en un tratamiento que potencia la producción de las urolitinas A y B en el lumen del colon humano.
12. Un alimento de acuerdo a alguna de las reivindicaciones 4 a 10, que potencia la producción de las urolitinas A y B en el lumen del colon humano, para ser usado en un tratamiento, cotratamiento o prevención de enfermedades oncológicas tales como el cáncer de próstata, el cáncer de colon, y el cáncer de páncreas.
13. Un alimento, de acuerdo a alguna de las reivindicaciones 4 a 10, para ser usado en un tratamiento para estimular el crecimiento de bacterias de las géneros Bifidobacterium y Lactobacillus en el colon humano, ayudando a reforzar las defensas naturales del organismo.
14. Un alimento de acuerdo a alguna de las reivindicaciones 4 a 10, para ser usado en un tratamiento, cotratamiento o prevención del síndrome metabólico.
15. Un alimento de acuerdo a alguna de las reivindicaciones 4 a 10, para ser usado en un tratamiento, cotratamiento o prevención de uno o mas trastornos seleccionados entre la diabetes mellitus tipo II y la obesidad, en base a su capacidad de inhibición de las enzimas alfa-glucosidasa y alfa-amilasa tras su ingesta.
16. Un alimento de acuerdo a alguna de las reivindicaciones 4 a 10 para ser usado en un tratamiento, cotratamiento o prevención de la hipercolesterolemia.
17. Un alimento de acuerdo a alguna de las reivindicaciones 4 a 10 para ser usado en un tratamiento, cotratamiento o prevención de la formación de una placa de ateroma en la capa media e íntima de las arterias.
18. Un alimento de acuerdo a alguna de las reivindicaciones 4 a 10 para ser usado en un tratamiento, cotratamiento o prevención de enfermedades cardiovasculares.
19. Un alimento de acuerdo a alguna de las reivindicaciones 4 a 10 para ser usado en un tratamiento, cotratamiento o prevención del cáncer de colon.
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