ES2349924T3

ES2349924T3 - Composición de polisacáridos reticulados.

Info

Publication number: ES2349924T3
Application number: ES04727786T
Authority: ES
Inventors: Simone Charlotte Vonwiller; Geoffrey Kenneth Heber
Original assignee: Ultraceuticals R&D Pty Ltd
Current assignee: Ultraceuticals R&D Pty Ltd
Priority date: 2003-04-17
Filing date: 2004-04-16
Publication date: 2011-01-13
Anticipated expiration: 2024-04-16
Also published as: DE602004028455D1; KR20060008906A; CN100509858C; AU2003901834A0; ATE476450T1; BRPI0409890A; JP2006523731A; EP1613663B1; JP2008133474A; CA2522232C; MXPA05011098A; EP1613663A1; CN1774450A; US8877243B2; WO2004092223A1; CA2522232A1; EP1613663A4; US20140105852A1; US20070026070A1

Abstract

Un procedimiento para producir un gel de polisacárido reticulado que comprende: a) poner en contacto un polisacárido mezclado en un medio alcalino con un epóxido bifuncional o polifuncional para proporcionar un polisacárido reticulado esencialmente epóxico donde el epóxido se enlaza sustancialmente al polisacárido mediante enlaces éter; b) secar el polisacárido reticulado epóxico sin eliminar sustancialmente epóxido del medio alcalino para formar una matriz de polisacárido reticulado; c) opcionalmente lavar la matriz de polisacárido reticulado con un disolvente miscible en agua y d) neutralizar la matriz de polisacáridos reticulados con un medio ácido para formar un gel de polisacárido reticulado.

Description

[0001] La presente invención se refiere a composiciones de polisacáridos reticulados, a procedimientos para preparar las composiciones y a usos de las composiciones en aplicaciones cosméticas, médicas y farmacéuticas.

Estado de la técnica anterior

[0002] El ácido hialurónico (HA) es un miembro de una clase de polímeros conocidos como glucosaminoglucanos. El HA es un polisacárido lineal de cadena larga y está normalmente presente como una sal sodio que tiene la fórmula molecular (C14H20NNa11)n donde n puede variar en función de la fuente del HA y el procedimiento para aislar el HA. Se han descrito pesos moleculares de HA de hasta 14 x 106. [0003] El HA y sus sales pueden aislarse a partir de muchas fuentes incluyendo el cordón umbilical humano, crestas de gallo y casi todas las matrices conectivas de organismos vertebrados. El HA es también un componente capsular de bacterias tales como estreptococos y por lo tanto puede obtenerse mediante métodos de fermentación tales como los descritos en la patente de US 5411874 (Fermentech Ltd). [0004] El HA es no inmunogénico y por lo tanto tiene un gran potencial en medicina. Debido a sus propiedades viscoelásticas, se ha encontrado que el HA de alto peso molecular (más de 1 millón) es particularmente útil en una variedad de campos clínicos, incluyendo el tratamiento de heridas, la cirugía oftálmica, la cirugía ortopédica y el suministro de fármacos. El HA también es potencialmente útil en una variedad de campos no médicos, incluyendo aplicaciones cosméticas. [0005] Sin embargo, una desventaja de administrar HA a humanos es que el HA es degradado por enzimas como por ejemplo la hialuronidasa y radicales libres encontrados en el cuerpo humano. Además, el HA es soluble en agua a temperatura ambiente, lo cual también puede hacerlo menos adecuado para ciertas aplicaciones. [0006] Se han realizado varios intentos de preparar formas más estables de HA, en particular mediante el reticulado de las moléculas de HA. Por ejemplo, los grupos hidroxilo han sido reticulados por medio de un enlace éter y los grupos carboxilo por medio de un enlace éster. El HA ha sido reticulado a valores de pH menores de 9 en los cuales se forman enlaces éster por medio de grupos carboxilo, y a valores de pH de más de 9 en los cuales se forman enlaces éter por medio de grupos hidroxilo. Los presentes inventores han encontrado que los enlaces éter pueden ser beneficiosos debido a que estos enlaces son más resistentes a la degradación fisiológica. [0007] Varios documentos describen una variedad de procedimientos para reticular geles de HA. Por ejemplo, la patente US 4582865 (Biomatrix Inc) describe geles reticulados de HA formados al reticular HA (por sí solo o mezcIado con otros polímeros hidrófilos) usando divinilsulfona como agente de reticulado.

[0008] La patente US 5827937 (Agerup) describe composiciones de geles de polisacáridos preparadas mediante la solución acuosa del polisacárido, iniciando el reticulado en presencia de un agente de reticulado polifuncional, impidiendo estéricamente que la reacción de entrelazamiento acabe antes de que ocurra la gelificación (por ejemplo, al diluir la solución) y después reintroduciendo condiciones no impedidas estéricamente (por ejemplo, al evaporar la solución) para continuar así el reticulado de tal manera que se forme un gel viscoelástico. El reticulado en este método puede llevarse a cabo bajo condiciones alcalinas o ácidas. [0009] WO 00/46253 (Fermentech Ltd) describe el reticulado de HA con otros polímeros mediante dos tipos diferentes de enlaces de reticulado. La formación de tipos diferentes de enlaces se logra mediante reticulado por medio de grupos funcionales diferentes. Por ejemplo, un tipo de enlace puede formarse mediante el reticulado por medio de grupos hidroxilo, y un enlace funcional diferente puede formarse al reticular por medio de grupos carboxilo. [0010] WO 87/07898 describe hacer reaccionar un polisacárido con un epóxido polifuncional, eliminando el exceso de epóxido y utilizando una operación de secado para reticular el polisacárido y crear una película, material en polvo o producto seco similar. [0011] La patente US 4969666 (Pharmacia) reporta un procedimiento en el cual un polisacárido es monosustituido con un agente de reticulado a baja concentración bajo condiciones alcalinas para formar enlaces éter. La mezcla se lava hasta un pH de 5.5 induciendo ciertos enlaces éster y después, en un ejemplo, se concentra mediante evaporación lenta para completar el reticulado con enlaces éster. En otro ejemplo, el pH se incrementa por la adición de amoniaco, y después se evapora lentamente para completar el reticulado principalmente con enlaces éter y algunos enlaces éster. [0012] Aunque se han realizado intentos para mejorar las propiedades del HA reticulado, sería beneficioso proporcionar geles de HA reticulados que tuvieran características de degradación mejoradas cuando fueran administrados a un paciente.

Descripción de la Invención

[0013] En una realización, la presente invención proporciona un procedimiento para producir un gel de polisacáridos reticulados. Primero, un polisacárido mezclado con un medio alcalino se pone en contacto con un epóxido bifuncional o polifuncional para formar un polisacárido reticulado esencialmente epóxico en el cual el epóxido está enlazado al polisacárido sustancialmente por enlaces éter. El polisacárido reticulado epóxico se seca a continuación sin eliminar el epóxido del medio alcalino. La matriz de polisacáridos reticulados seca resultante puede lavarse a continuación en un solvente miscible en agua adecuado, y tratada con un medio ácido para formar un gel de polisacáridos reticulados. [0014] En realizaciones de la presente invención pueden utilizarse varios materiales de partida de polisacárido. Los polisacáridos adecuados incluyen HA, pectina, xantano

o ácido algínico, así como derivados aniónicos de carboximetilcelulosa, carboximetil dextrano o carboximetil almidón. El HA puede ser un material de partida particularmente adecuado. Los epóxidos adecuados para utilizarse como el agente de reticulado incluyen éter de diglicidilo y 1,4-butanodiol, éter de diglicidilo y 1,2-etanodiol y/o pentaeritritol epoxi-sustituido. Sin embargo, se apreciará que otros epóxidos también pueden ser adecuados para la presente invención. [0015] En otra realización, la presente invención proporciona un gel de polisacáridos reticulados preparado mediante el procedimiento descrito en el presente documento. El gel puede tener características de degradación mejoradas cuando se administra a un paciente. [0016] En otra realización, la presente invención proporciona un gel biocompatible que incluye HA reticulado sustancialmente mediante enlaces éter con éter de 1,4-butanodiglicidilo que está suficientemente reticulado como para resistir la degradación. [0017] Tal como se utiliza en la presente invención, la frase "suficientemente reticulado como para resistir la degradación" se refiere a que el gel es relativamente estable al ataque de la hialuronidasa en condiciones fisiológicas durante periodos prolongados o que puede tolerar la extrusión o ser expulsado de un cilindro pequeño. En una realización, los presentes inventores han sido capaces de producir geles biocompatibles que liberan menos de 75 por ciento de ácido urónico cuando 0.4 ml del gel con una concentración de 15 mg/ml se combinan con 0.5 mg de hialuronidasa y 3 ml de solución salina con el pH regulado con fosfato, y se almacena a una temperatura de al menos 37°C durante dos días. La liberación de ácido urónico puede medirse por medio de las técnicas de absorbancia UV descritas en los Ejemplos. En ciertas realizaciones, los geles pueden liberar no más de 70 por ciento de ácido urónico, más particularmente no más de 65 por ciento de ácido urónico bajo las condiciones anteriores. [0018] En un primer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para producir un gel de polisacáridos reticulados que comprende: a) poner en contacto un polisacárido mezclado en un medio alcalino con un epóxido bifuncional o polifuncional para proporcionar un polisacárido reticulado esencialmente epóxico en donde el epóxido se enlaza sustancialmente al polisacárido por enlaces éter; b) secar el polisacárido reticulado epóxico sin eliminar sustancialmente epóxido del medio alcalino para formar una matriz de polisacáridos reticulados; c) opcionalmente lavar la matriz de polisacáridos reticulados con un solvente miscible en agua; y d) neutralizar la matriz de polisacáridos reticulados con un medio ácido para formar un gel de polisacáridos reticulados. [0019] En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un gel de polisacáridos reticulados sustancialmente resistente a la degradación por hialuronidasa preparado mediante el procedimiento de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención. [0020] En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un gel biocompatible que comprende ácido hialurónico reticulado sustancialmente por enlaces éter con éter diglicidílico de 1,4-butanodiol de tal manera que el gel está lo suficientemente reticulado como para resistir sustancialmente la degradación. [0021] En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un gel de polisacáridos reticulados de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención, una sustancia biológicamente activa y un vehículo farmacéuticamente aceptable. [0022] En un quinto aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un gel biocompatible de acuerdo con el tercer aspecto de la presente invención; una sustancia biológicamente activa y un vehículo farmacéuticamente aceptable. [0023] En un sexto aspecto, la presente invención proporciona el uso de un gel de acuerdo con el tercer aspecto de la presente invención en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir un trastorno en un sujeto que lo requiera. [0024] En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona el uso de una composición farmacéutica de acuerdo con el cuarto aspecto de la presente invención en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir un trastorno en un sujeto que lo requiera. [0025] A lo largo de esta descripción, a menos que el contexto indique lo contrario, la palabra "comprende", o variaciones tales como "que comprende" o "comprendiendo", se entenderá que implica la inclusión de un elemento, entero o etapa dado, o grupo de elementos, enteros o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, entero o etapa, o grupo de elementos, enteros o etapas. [0026] Cualquier descripción de documentos, actos, materiales, dispositivos, artículos o similares que haya sido incluida en la presente descripción es únicamente con el propósito de proporcionar un contexto para la presente invención. No se debe tomar como una admisión de que cualquiera o todos estos asuntos formen parte de la base de la técnica anterior o fueran conocimiento general común en el campo relevante a la presente invención tal como existía en Australia antes de la fecha de prioridad de cada reivindicación de esta solicitud. [0027] Para que la presente invención se entienda más claramente, se describirán realizaciones preferidas con referencia a los siguientes dibujos y ejemplos.

Breve descripción de los dibujos

[0028]

La figura 1 muestra la curva de valoración de hialuronidasa sobre un substrato de ácido hialurónico como el descrito en los ejemplos. La figura 2 muestra una comparación de la liberación de ácido urónico (UA) entre muestras A y B como se describe en los ejemplos. La figura 3 muestra la absorción UV de UA en geles después de un día como se describe en los ejemplos. La figura 4 muestra la absorción UV de UA a 530 nm en uno, dos y doce días como se describe en los ejemplos. La figura 5 muestra la absorción UV de UA a 530 nm, después de dos días de incubación como se describe en los ejemplos. La figura 6 muestra una comparación entre diferentes como los descritos en los Ejemplos.

Descripción detallada de la invención

[0029] En una modalidad, la presente invención proporciona un procedimiento para producir un gel de polisacáridos reticulados. El procedimiento generalmente incluye las etapas de: a) formar un polisacárido reticulado epóxico al poner en contacto un material de partida de polisacárido con un epóxido bifuncional o polifuncional en un medio alcalino para formar un polisacárido esencialmente reticulado en el cual el epóxido está sustancialmente enlazado con el polisacárido mediante enlaces éter; b) secar el polisacárido reticulado epóxico sin eliminar sustancialmente el epóxido del medio alcalino; c) opcionalmente lavar el polisacárido reticulado epóxico y seco con un disolvente miscible en agua para formar una matriz de polisacáridos reticulados; y d) neutralizar el polisacárido reticulado epóxico con un medio ácido para formar un gel de polisacáridos reticulados.

[0030] De manera ventajosa, se ha determinado que cuando el gel de polisacáridos reticulados epóxico se forma de la manera descrita arriba, el gel tiene una resistencia mejorada a la degradación cuando se compara con geles de polisacáridos reticulados convencionales. [0031] El material de partida de polisacárido puede seleccionarse de una amplia gama de polisacáridos de origen natural apropiados que contienen carboxilato, incluyendo HA, pectina, xantano o ácido algínico, así como derivados aniónicos de polisacáridos neutros tales como carboximetilcelulosa, carboximetildextrano o carboximetilalmidón. [0032] En una realización, se usa HA como el material de partida de polisacárido. El HA puede extraerse de diferentes fuentes, por ejemplo, crestas de gallo. En ciertas realizaciones, puede ser deseable usar ácidos dihalurónicos que constituyan fracciones moleculares de los ácidos integrales obtenidos directamente por extracción de materiales orgánicos con una amplia gama de pesos moleculares. Estas fracciones pueden obtenerse mediante varios procedimientos convencionales, incluyendo hidrólisis, oxidación, agentes químicos enzimáticos o procedimientos físicos tales como procedimientos mecánicos o de irradiación. La separación y purificación de las fracciones moleculares obtenidas puede lograrse mediante filtración molecular. Un ejemplo de una fracción de HA purificada y adecuada es el "hialuronato de sodio NIF-NaHA no inflamatorio" descrito por Balazs en la publicación "Healon" --A guide to its use in Ophthalmic Surgery--D. Miller & R. Stegmann, eds. John Wiley & Sons N.Y. 81983: p.5. [0033] Otros materiales de partida de HA adecuados incluyen el HA de marca "Hyalastine" y "Hyalectin". La fracción de Hyalastine tiene un peso molecular promedio de 50000 a 100000 mientras que la fracción de Hyalectin tiene un peso molecular promedio de 500000 a 730000. Una fracción combinada de estas dos fracciones también ha sido aislada y caracterizada como teniendo un peso molecular promedio de entre 250000 y 350000. Esta fracción combinada puede obtenerse con un rendimiento de 80% del ácido hialurónico total disponible en el material de partida particular, mientras que la fracción de Hyalectin puede obtenerse con un rendimiento de 30% y la fracción de Hyalastine con un rendimiento de 50% del HA de partida. La preparación de estas fracciones se describe en la publicación de patente europea No. 0138572A3. Otros materiales de partida de HA adecuados incluyen los materiales de HA fibrosos y en polvo descritos en los ejemplos más adelante. [0034] El polisacárido puede estar reticulado mediante una variedad de epóxidos polifuncionales de reticulado adecuados, incluyendo epóxidos bi-o polifuncionales, tales como epóxidos alifáticos inferiores. Ejemplos específicos de epóxidos adecuados incluyen éter diglicidílico de 1,4-butanodiol (BDDE), éter diglicidílico de 1,2-etanodiol, pentaeritritol epoxisustituido (por ejemplo, SHELL 162). En una realización, el agente de reticulado polifuncional incluye éter diglicidílico de 1,4-butanodiol. [0035] El material de partida de polisacárido puede combinarse con un agente de reticulado en un medio alcalino. En una realización se puede añadir al medio alcalino entre 1 y 5 p/v por ciento, más particularmente alrededor de 4 p/v por ciento de polisacárido. El medio alcalino puede formarse con hidróxido de sodio u otros materiales básicos adecuados. La concentración de hidróxido de sodio o de otro material básico puede ser de entre 0.1 y 1 p/v por ciento, más particularmente alrededor de 1% de la mezcla total. El agente de entrelazamiento se puede añadir a la mezcla alcalina para producir una concentración de agente de entrelazamiento de entre 0.05 y 0.5%, más particularmente aproximadamente 0.1%. El medio alcalino puede tener un pH de entre 9 y 12, más particularmente alrededor de 9. [0036] La mezcla alcalina resultante puede incubarse bajo condiciones que promuevan el reticulado del polisacárido con el epóxido. Por ejemplo, la mezcla puede incubarse en un baño de agua a aproximadamente 45°C durante alrededor de dos horas. El HA reticulado en estas condiciones incluirá sustancialmente enlaces éter que generalmente son más resistentes a la degradación fisiológica que los enlaces éster formados bajo condiciones ácidas. [0037] Después de la incubación, la mezcla reticulada puede secarse por métodos convencionales para formar una matriz de polisacáridos. Por ejemplo, la mezcla entrelazada puede secarse al agitar la mezcla vigorosamente y eliminar el agua con vacío intenso durante aproximadamente 1.5 horas a entre 35°C y 45°C. Después de secar, la matriz de polisacárido puede lavarse con un solvente miscible en agua, por ejemplo un codisolvente de alcohol isopropílico/agua, durante varias horas. Finalmente, la matriz lavada puede ser neutralizada con un medio ácido para formar un gel de polisacáridos reticulados. Por ejemplo, la matriz puede tratarse con una solución al 1-2 por ciento de ácido acético en agua para formar el gel de polisacáridos reticulados. Opcionalmente, el gel de polisacáridos reticulados puede tratarse adicionalmente con una mezcla de solución salina con pH regulado con fosfato para modificar la viscosidad del gel. [0038] Como se describe adicionalmente en los ejemplos siguientes, el gel de polisacárido formado mediante el procedimiento anterior es lo suficientemente reticulado como para resistir la degradación cuando se administra a un paciente. Gracias a las características de degradación mejoradas del gel, el gel de polisacáridos reticulados resultante puede usarse en varias aplicaciones. En una realización, el gel de polisacáridos reticulados puede usarse para incrementar tejido, tratar artritis, tratar adherencias de tejidos y para usarse en el recubrimiento de células de mamífero para reducir la inmunogenicidad. En otra realización, el gel de polisacáridos reticulados puede usarse en aplicaciones cosméticas, implantes correctivos, terapia de reemplazo hormonal, tratamiento hormonal, contracepción, lubricación de articulaciones y cirugía ocular. [0039] Ventajosamente, el gel de polisacáridos reticulados permanece sustancialmente resistente a la degradación después de su extrusión a través de una aguja de pequeño calibre. La extrusión a través de una aguja puede romper los geles en partículas pequeñas si los geles no son resistentes a la tensión por esfuerzo cortante. En particular, los geles de polisacáridos reticulados de las realizaciones de la presente invención son resistentes a la degradación después de su extrusión a través de una aguja de calibre pequeño tal como una aguja de calibre 27, 30 ó 32. De esta manera, estos geles son particularmente adecuados para su inyección en tejido o piel sin pérdida sustancial de la integridad estructural de la solución o gel. [0040] En una realización alternativa, el gel de polisacáridos reticulados puede combinarse con una sustancia biológicamente activa para su administración a un paciente. Las sustancias biológicamente activas adecuadas para usarse con la presente invención incluyen hormonas, citocinas, vacunas, células, sustancias de incremento de tejidos o mezclas de las mismas. Ejemplos de sustancias de incremento de tejidos adecuadas incluyen colágeno, almidón, dextranómero, polilacturo, poli-betahidroxibutirato y/o copolímeros de los mismos. [0041] Ejemplos adicionales de sustancias biológicamente activas se describen en la patente US 5676964, la cual se incorpora en la presente a manera de referencia con el propósito de describir sustancias biológicamente activas adecuadas, procedimientos para preparar geles de polisacáridos reticulados que incluyen estas sustancias y métodos para administrar las sustancias biológicamente activas. [0042] Las sustancias biológicamente activas adecuadas pueden incluir varios alcaloides, péptidos, fenotiazinas, benzodiazepinas, tioxantenos, hormonas, vitaminas, anticonvulsivos, antipsicóticos, antieméticos, anestésicos, hipnóticos, anorexigénicos, tranquilizantes, relajantes musculares, vasodilatadores coronarios, antineoplásicos, antibióticos, antibacterianos, antivirales, antimaláricos, inhibidores de anhidrasa carbónica, agentes antiinflamatorios no esteroides, vasoconstrictores, agonistas colinérgicos, antagonistas colinérgicos, agonistas adrenérgicos, antagonistas adrenérgicos y antagonistas narcóticos. [0043] La sustancia biológicamente activa puede combinarse con los geles de polisacáridos reticulados adecuados de la presente invención mediante el mezclado físico de la sustancia biológicamente activa con el material de partida de polisacárido. La sustancia biológicamente activa puede combinarse en forma sólida, por ejemplo como soluciones o polvo secado por congelación.

[0044] El uso del gel de polisacáridos reticulados como un vehículo para sustancias biológicamente activas puede ser particularmente útil en oftalmología, en donde existe una compatibilidad particular entre los geles de polisacáridos reticulados y el epitelio córneo. Cuando se administran sustancias biológicamente activas en forma de soluciones concentradas con características viscoelásticas o en forma sólida sobre el epitelio córneo, se forman películas homogéneas y estables que son transparentes y adherentes, y que proporcionan biodisponibilidad prolongada de la sustancia biológicamente activa. Los vehículos de gel de polisacáridos reticulados de las realizaciones de la presente invención también pueden ser adecuados para el tratamiento de enfermedades de las mucosas (por ejemplo, enfermedades de la boca) y tratamientos dermatológicos. [0045] En ciertas realizaciones, dichos geles biológicamente activos pueden formarse en preparaciones farmacéuticas para uso oral, rectal, parenteral, subcutáneo, local o intradérmico. Las preparaciones farmacéuticas adecuadas pueden estar en forma sólida o semisólida, por ejemplo píldoras, tabletas, cápsulas gelatinosas, cápsulas, supositorios o cápsulas de gelatina suave. Para usos parenteral y subcutáneo, las preparaciones farmacéuticas diseñadas para usos intramusculares o intradérmicos o infusiones o inyecciones intravenosas pueden usarse, y pueden por lo tanto ser presentadas como soluciones de los compuestos activos o como polvos secados por congelación de los compuestos activos que se mezclarán con uno o más excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Además, las preparaciones farmacéuticas en forma de preparaciones tópicas pueden ser adecuadas, por ejemplo como atomizadores nasales, cremas y ungüentos para uso tópico o emplastos adherentes preparados especialmente para administración intradérmica. [0046] Los preparados se pueden administrar a humanos o animales. En una realización, el gel de polisacáridos reticulados puede contener entre 0.01% y 10% de sustancia biológicamente activa para soluciones, atomizaciones, ungüentos y cremas, y entre 15% y 50% de sustancia biológicamente activa para las preparaciones en forma sólida. [0047] En el contexto de la presente invención, el termino "medio alcalino" incluye, pero no está limitado a, una sal hidróxido disuelta en agua, de preferencia hidróxido de sodio. [0048] En el contexto de la presente invención, el término "medio ácido" incluye, pero no está limitado a un ácido orgánico o inorgánico disuelto en agua, de preferencia ácido acético.

EJEMPLOS Síntesis de geles reticulados [0049] Muestras separadas de ácido hialurónico fibroso [Javenech HTL (PM 1.6

1.33 MD)] y en polvo [Fluka de Streptococcus equi (PM 1.69 MD)] (0.5 g) se disolvieron cada una en NaOH al 1% (12.5 ml) con agitación vigorosa durante un periodo de una hora. Se añadió éter diglicidílico de 1,4-butanodiol (BDDE) (12.5 μL) con agitación vigorosa durante 5 minutos y después la solución resultante se incubó sin agitación en un baño de agua a 45°C durante dos horas. Al final del periodo de incubación la mezcla se retiró del baño, se agitó vigorosamente durante un minuto y después se eliminó agua bajo vacío intenso durante 1.5 horas a 35-40°C. Las matrices de polisacáridos transparentes resultantes se lavaron con una mezcla de alcohol isopropílico y agua (IPA/H20) (6:4, 25 ml) durante 22 horas, y luego la mezcla de IPA/H20 se reemplazó dos veces más cada 22 horas (es decir, para un tiempo de lavado total de 66 horas). La mezcla IPA/H20 se eliminó, y después se añadió 1.3 por ciento de ácido acético en agua (25 ml) con agitación. Después de 35 minutos, ambas muestras habían producido geles completamente hinchados, con el gel "fibroso" ("Muestra A") siendo notoriamente más viscoso que el gel "en polvo" ("Muestra B"). [0050] Los geles se sometieron después a una serie de lavados con IPA (50 ml), IPA/H20 (6:4, 25 ml), IPA/H20 (8:2, 100 ml) y a continuación IPA (50 ml). Los materiales gomosos opacos resultantes fueron secados a continuación por congelación para dar hojas duras opacas. Las hojas se reconstituyeron después en solución salina de pH regulado con fosfato recién preparada durante 24 horas a concentraciones de 15 y 20 mg/ml para usarse en los siguientes ejemplos. La muestra A fue empujada bajo presión a través de una malla de 500 μm mientras que la muestra B fue empujada bajo presión a través de una malla de 300 μm. Las muestras se usaron durante un periodo de tres meses y no se degradaron durante el almacenamiento.

Ensayo de carbazol [0051] La reacción de ácidos urónicos con carbazol es un método satisfactorio para calcular la cantidad de ácidos urónicos en compuestos diferentes. Se siguió el procedimiento descrito en Bitter y Muir [T. Bitter y H. M. Muir, Anal. Biochem. 4, 330334 (1962)] para establecer una curva de titulación estándar.

Reactivos:

[0052]

A: tetraborato de sodio 0.025 M 10 H20 en ácido sulfúrico al 98%;

B: 0.125% de carbazol en etanol absoluto (estable 12 semanas a 4°C en la oscuridad);

C: 11 soluciones de glucuronolactona de 0, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75 y 100 μg/ml en agua desionizada saturada con ácido benzoico (estables durante 6 meses a 4°C). [0053] El reactivo A (5 ml) se colocó en un tubo y se enfrió a -70°C. Después se añadió la solución C (1 ml). El tubo se selló y se dejó que se calentara a temperatura ambiente. A continuación el tubo se agitó y se calentó durante 10 minutos en un baño de agua que hervía vigorosamente. El tubo se enfrió después a temperatura ambiente. Se añadieron alícuotas (0.2 ml) del reactivo B. El tubo se agitó de nuevo y se calentó durante 15 minutos. Después de volver a temperatura ambiente, se midió la absorción UV a 530 nm. La figura 1 muestra una curva de valoración de los valores de absorción UV como una función de la concentración de glucuronolactona.

Resistencia a hialuronidasa de las muestras A y B [0054] Para determinar la concentración de ácido urónico (UA) liberada por la hialuronidasa de las muestras A y B, se siguió el procedimiento descrito en X.B. Zhao,

J.E. Fraser, C. Alexander, C. Lockett, B.J. White, J. Mat. Science, Materials in Medicine 13, 11-16 (2002) con una modificación como la descrita a continuación. [0055] Un mililitro de cada gel a varias concentraciones (Muestra A a 20 mg/ml, Muestra A a 15 mg/ml. Muestra B a 20 mg/ml y Muestra B a 15 mg/ml) fue suspendido en 6 ml de solución salina de pH regulado con fosfato (pH= 7.4) que contenía 1 mg de hialuronidasa (que contenía 1010 U) y se incubó a 37°C. Después de 5 días, 0.5 ml de cada muestra se diluyeron en 2 ml de isopropanol. El gel restante, que no fue destruido por la enzima, se precipitó y se removió mediante centrifugación durante 30 minutos. Los líquidos sobrenadantes que contenían el ácido urónico se calentaron después en un baño de agua que hervía vigorosamente durante 30 minutos para desnaturalizar la enzima, y se centrifugaron de nuevo durante 30 minutos para eliminar la enzima. El volumen de cada tubo se ajustó a 3.5 ml. La concentración de UA liberado por la hialuronidasa se determinó a partir de la curva de valoración mostrada en la figura 1 midiendo la absorción UV a 530 nm. La figura 2 muestra una comparación de los diferentes valores UV. [0056] Concentraciones más bajas de UA se observaron en geles que contenían una concentración más baja de biopolímero (por ejemplo, Muestra A a 15 mg/ml comparada con Muestra A a 20 mg/ml). También la Muestra A fue significativamente menos degradada que la Muestra B a concentraciones tanto de 15 como de 20 mg/ml. [0057] La concentración de UA (en μg/ml de solución de gel) después de 5 días de incubación se determinó a partir de la curva de valoración (figura 1). Se tomó en cuenta un factor de dilución de 7 (es decir, 3.5/0.5) ya que la muestra de 0.5 ml fue diluida hasta un volumen de 3.5 ml para su análisis.

[UA]: concentración de UA en el sobrenadante del gel; [UAdil]: concentración de UA deducida a partir de la curva de valoración; y = 0.0172[UAdil] + 0.0215; [UAdil] = (y-0.0215)/0.0172 en donde y = valor de absorción máximo a 530 nm; [UA]=[UAdil] x 7=[(y-0.0215)/0.0172] x7; Muestra A, 20 mg: y=0.439, [UA]= 170 μg/ml Muestra A, 15 mg: y=0.3515, [UA]= 134 μg/ml Muestra B, 20 mg: y=0.559, [UA]= 219 μg/ml Muestra B, 15 mg: y=0.539, [UA]= 211 μg/ml

Comparación de Muestra A con geles disponibles comercialmente Restylane™ y Perlane™ [0058] Se llevó a cabo una comparación entre la Muestra A y gel Restylane™ [Q- Med AB, Uppsala, Suecia] y gel Perlane™ [Q-Med AB, Uppsala, Suecia] como se describe abajo. [0059] Muestras (0.4 ml) de cada gel se suspendieron en 3 ml de solución salina de pH regulado con fosfato (pH = 7.4) que contenía 0.5 mg de hialuronidasa (505 U) y se incubaron a 37°C. Los geles probados fueron gel Restylane™ a una concentración de 20 y 15 mg/ml, gel Perlane™ a una concentración de 20 y 15 mg/ml y Muestra A a una concentración de 20 y 15 mg/ml. Después del día 1, 0.25 ml de cada gel fueron diluidos en 2 ml de isopropanol. El gel residual, el cual no fue destruido por la enzima, se precipitó y se eliminó mediante centrifugación durante 30 minutos. Cada tubo de gel se calentó después en un baño de agua que hervía vigorosamente durante 30 minutos para desnaturalizar la enzima, y se centrifugaron de nuevo durante 30 minutos para eliminar la enzima. El volumen de cada tubo se ajustó a 2 ml. La concentración de UA liberado por hialuronidasa se determinó a partir de la curva de valoración midiendo la absorción UV a 530 nm. La curva de absorbancia UV en el día 1 para cada gel se muestra en la figura 3. [0060] Para ambas series de 15 mg/ml y 20 mg/ml, la Muestra A exhibió una degradación mejorada (es decir, una concentración más baja de UA liberado), cuando se le comparó con los geles Perlane™ y Restylane™. De hecho, la Muestra A a una concentración de 20 mg/ml se degradó menos que el gel Perlane™ a una concentración de 15 mg/ml.

Efecto del tamaño de la aguja en el deterioro del gel [0061] Para determinar el efecto del tamaño de la aguja en la degradación de los geles, el procedimiento descrito arriba se repitió en el gel Restylane™ expulsado o extruído a través de una aguja de calibre 32, el gel Perlane™ expulsado o extruído a través de una aguja 30G y la Muestra A (500 μm) extruída a través de una aguja 32G y una aguja 30G. La concentración del gel se fijó a 15 mg/ml. [0062] Inicialmente, se llevó a cabo un experimento de prueba para establecer cuándo se obtenía el nivel máximo de degradación de los geles en las condiciones de

5 procedimiento (0.15 g/L de hialuronidasa). [0063] Los valores obtenidos después de dos días fueron ligeramente más altos que aquellos obtenidos después de un día. En consecuencia, se tomó un tercer conjunto de mediciones después de doce días, en el cual la liberación de UA fue muy baja en comparación con las primeras 48 horas, cuando los geles se degradaron casi por

10 completo (véase figura 4). A partir de esto, se determinó que un periodo de incubación de dos días era suficiente para establecer una comparación entre la liberación de UA (es decir, degradación) de los diferentes geles. La figura 5 muestra la absorción UV a 530 nm después de dos días para cada experimento. [0064] La UV máxima y concentraciones de UA se muestran en la tabla 1.

15 Tabla 1

Máxima absorción (a 530 nm): [UA] en μg/ml*

Muestra A: 1.111 511

Muestra A, aguja 30G: 1.1193 549

Muestra A, aguja 32G: 1.24 571

RestylaneTM: 1.482 683

RestylaneTM aguja 32G: 1.617 746

PerlaneTM: 1.302 600

PerlaneTM, aguja 30G: 1.466 676

*factor de dilución: 2/0.25=8

[0065] La tabla I indica que el nivel de degradación se incrementó generalmente con

20 la reducción del tamaño de la aguja. Como se muestra en la figura 6, incluso cuando la Muestra A fue extruída a través de una aguja 32G, la concentración de UA permaneció debajo de los valores observados tanto para el gel Perlane™ como para el gel Restylane™ sin extrusión, indicando de esta manera las características de degradación mejoradas de la Muestra A.

25

Evaluación del grado de degradación de los geles [0066] Inicialmente, se estableció un nivel de degradación máximo para cada gel. La extracción de UA se llevó a cabo al llevar a reflujo las soluciones de gel en presencia de hialuronidasa durante una hora. El tratamiento con ácido (véase procedimiento de

30 ensayo de carbazol) se aplicó a la muestra de 0.25 ml sin centrifugación. Antes del análisis, el volumen de la solución se ajustó a 2 ml.

[0067] Las concentraciones de UA obtenidas a partir de los espectros UV y la curva de titulación se presentan en la tabla 2.

Tabla 2

Máxima absorción (a 530 nm): [UA]max en μg/ml*

Muestra A: 1.6979 784

RestylaneTM: 1.6985 784

PerlaneTM: 1.6826 777

5 *factor de dilución: 2/0.25=8

[0068] La similitud en las concentraciones calculadas indica que se había alcanzado un nivel de degradación máximo bajo las condiciones reportadas. [0069] Después, los resultados de la tabla 1 y tabla 2 proporcionaron la base para

10 calcular el porcentaje de UA liberado en las condiciones experimentales abajo, en relación a la liberación de UA máxima que puede esperarse medir para cada uno de los geles:

%UA. =[UA]/[UA]max x 100; Geles: 0.4 ml a 15 mg/ml; 15 Hialuronidasa: 0.5 mg; Disolvente: PBS, 3 ml; Tabla 3

[UA] en μg/ml*: %UA

Muestra A: 511 65

Muestra A, aguja 30G: 549 70

Muestra A, aguja 32G: 571 73

RestylaneTM: 683 87

RestylaneTM aguja 32G: 746 95

PerlaneTM: 600 77

PerlaneTM, aguja 30G: 676 87

[0070] Los estudios de resistencia a hialuronidasa mostraron que la Muestra A,

20 formada de acuerdo con una realización de la presente invención, mostró una degradación más baja que los dos geles de polisacáridos reticulados disponibles comercialmente. Se debe notar que el método de ensayo se basó en un método usado generalmente para probar geles duros y densos en lugar de geles de flujo suave, los cuales emplearon una alta concentración de enzima. En consecuencia, todos los geles exhibieron degradación significativa después de dos días. No obstante, los resultados indican que los geles de polisacáridos reticulados formados de acuerdo con las realizaciones de la presente invención tienen características de degradación

5 mejoradas sobre los geles disponibles comercialmente. [0071] Por lo tanto, las presentes realizaciones deben considerarse en todos aspectos como ilustrativas y no restrictivas.

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REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante únicamente es para comodidad del lector. Dicha lista no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores

5 u omisiones y la EPO rechaza toda responsabilidad a este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

• US 5411874 A [0003]

• US 4582865 A [0007] 10 • US 5827937 A [0008]

•: WO 0046253 A [0009]

•: WO 8707898 A [0010]

•: US 4963666 A [0011]

•: EP 0138572 A3 [0033]

15 • US 5676964 A [0041] Bibliografía no relativa a patentes citada en la descripción

•: Heaion. Ophthalmic Surgery. John Wiley & Sons, 5 [0032]

•: T. Bitter; H. M. Muir. Anal. Biochem, 1962, vol. 4, 330-334 [0051]

• X.B. Zhao; J.E. Fraser; C. Alexander; C. Lockett; B.J. White. J. Mat. Science, 20 Materials in Medicine, 2002, vol. 13, 11-16 [0054]

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un procedimiento para producir un gel de polisacárido reticulado que comprende: a) poner en contacto un polisacárido mezclado en un medio alcalino con un epóxido bifuncional o polifuncional para proporcionar un polisacárido reticulado esencialmente epóxico donde el epóxido se enlaza sustancialmente al polisacárido mediante enlaces éter; b) secar el polisacárido reticulado epóxico sin eliminar sustancialmente epóxido del medio alcalino para formar una matriz de polisacárido reticulado; c) opcionalmente lavar la matriz de polisacárido reticulado con un disolvente miscible en agua y d) neutralizar la matriz de polisacáridos reticulados con un medio ácido para formar un gel de polisacárido reticulado.
2.

El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 donde el polisacárido es ácido hialurónico, pectina, xantano o ácido algínico.
3.

El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, donde el polisacárido es un derivado aniónico de carboximetilcelulosa, carboximetildextrano, ácido hialurónico o carboximetilalmidón, preferiblemente, el polisacárido es ácido hialurónico.
4.

El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el epóxido es éter diglicidílico de 1,4-butanodiol, éter diglicidílico de 1,2-etanodiol o un pentaeritritol epoxi-sustituido, preferiblemente el epóxido es éter diglicidílico de 1,4-butanodiol.
5.

El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el medio alcalino tiene un pH de 9 a 12.
6.

El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el medio alcalino comprende entre 1 y 5 p/v por ciento de polisacárido y entre 0.05 y 0.5 p/v por ciento de epóxido.
7.

El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el epóxido se pone en contacto con el polisacárido a una temperatura de al menos 45ºC.
8.

El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde, la matriz de polisacáridos se seca al vacío a una temperatura de al menos 35°C.
9.

El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde las etapas de a) a c) se llevan a cabo en condiciones alcalinas.
10.

El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde la etapa opcional de lavado c) comprende además lavar la matriz de polisacárido reticulado con acetona.
11.

El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde la etapa de neutralización d) comprende además secar por congelación el gel de polisacárido reticulado y reconstituir el gel.
12.

El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, donde el gel de polisacárido reticulado secado por congelación es reconstituido en solución salina de pH regulado con fosfato.
13.

El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende además combinar el polisacárido con una sustancia biológicamente activa.
14.

Un gel de polisacárido reticulado sustancialmente resistente a la degradación por hialuronidasa, caracterizado porque se prepara mediante el procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
15.

El gel de acuerdo con la reivindicación 14, donde el gel libera menos de 75 por ciento de ácido hialurónico bajo tratamiento con hialuronidasa; preferiblemente no más de 70 por ciento de ácido urónico; más preferiblemente no más de 65 por ciento de ácido urónico bajo tratamiento con hialuronidasa.
16.

El gel de acuerdo con la reivindicación 14, donde el gel libera menos de 75 por ciento de ácido urónico después de haber sido extruído o expulsado desde una aguja de calibre 32; preferiblemente no más de 70 por ciento de ácido urónico después de haber sido extruído o expulsado desde una aguja calibre 30.
17.

El gel de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 que comprende además una sustancia biológicamente activa; preferiblemente la sustancia biológicamente activa es una hormona, citocina, vacuna, célula, sustancia de incremento de tejidos, o una mezcla de las mismas.
18.

El gel de acuerdo con la reivindicación 17 donde la sustancia de incremento de tejidos es colágeno, almidón, dextranómero, poliláctido, poli-beta-hidroxibutirato, o copolímeros de los mismos.
19.

El gel de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado porque la sustancia biológicamente activa es un alcaloide, péptido, fenotiazina, benzodiazepina, tioxanteno, hormona, vitamina, anticonvulsivo, antipsicótico, antiemético, anestésico, hipnótico, anorexigénico, tranquilizante, relajante muscular, vasodilatador coronario, antineoplásico, antibiótico, antibacteriano, antiviral, antimalárico, inhibidor de anhidrasa carbónica, agente antiinflamatorio no esteroide, vasoconstrictor, agonista colinérgico, antagonista colinérgico, agonista adrenérgico, antagonistas adrenérgico, antagonista narcótico o una combinación de los mismos.
20.

Una composición farmacéutica que comprende: un gel de polisacáridos reticulados de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19; una sustancia biológicamente activa; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
21.

La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 20 donde el preparado está en forma de una píldora, pastilla, cápsula, supositorio, atomización, crema, ungüento o emplasto adherente.
22.

Uso de un gel de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir un trastorno o afección seleccionado del grupo que consiste en aumento de tejidos, artritis, adherencias tisulares, inmunogenicidad, enfermedades de las mucosas, afecciones dermatológicas, afecciones hormonales, afecciones de lubricación de las articulaciones y afecciones cosméticas, o para el uso durante cirugía ocular o en el recubrimiento de células de mamífero para reducir la inmunogenicidad en un sujeto que requiera de ello.
23.

Uso de un gel de acuerdo con la reivindicación 20 o 21, en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir un trastorno o afección seleccionada del grupo que consiste en aumento de tejidos, artritis, adherencias tisulares, enfermedades de las mucosas, afecciones dermatológicas, afecciones hormonales, afecciones de lubricación de las articulaciones y afecciones cosméticas, o para el uso durante cirugía ocular o en el recubrimiento de células de mamífero para reducir la inmunogenicidad en un sujeto que requiera de ello.