ES2344932B1 - Metodo para la deteccion de cancer de vejiga. - Google Patents
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Abstract
Método para la detección de cáncer de
vejiga.
La presente invención se refiere a un método y
kit para la detección de cáncer de vejiga mediante la determinación
del nivel de expresión de la cadena beta de la proteína del
complemento C4A.
Description
Método para la detección de cáncer de
vejiga.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La presente invención se encuadra en general en
el campo de la biomedicina y en particular se refiere a un método y
kit para la detección del cáncer de vejiga.
El cáncer de vejiga es uno de los tipos de
cáncer más frecuentes, siendo el cuarto cáncer más frecuente en
hombres y el octavo en mujeres, representado aproximadamente el 5%
del total de los cánceres diagnosticados en Estados Unidos (A.
Jemal, T. Murray, A. Samuels, A. Ghafoor, E. Ward, M.J. Thun, CA
Cáncer J Clin 53 (2003) 5). De éstos, más del 90% son carcinomas
transicionales (TCC) (E.M. Messing, T.B. Young, V.B. Hunt, K.W.
Gilchrist, M.A. Newton, L.L. Bram, W.J. Hisgen, E.B. Greenberg, M.E.
Kuglitsch, J.D. Wegenke, Urology 45 (1995) 387), (J.P. Stein, G.D.
Grossfeld, D.A. Ginsberg, D. Esrig, J.A. Freeman, A.J. Figueroa,
D.G. Skinner, R.J. Cote, J Urol 160 (1998) 645). Alrededor del 75%
de los casos diagnosticados son superficiales y pueden ser
extirpados sin demasiadas complicaciones mientras que el 25%
restante son de carácter invasivo (V.B. Lokeshwar, M.G. Selzer, Urol
Oncol 24 (2006) 528). En estos casos la detección precoz
condicionaría el tratamiento y mejoraría las expectativas de los
pacientes. Además, el índice de recurrencia del cáncer de vejiga es
del os más elevados por lo que los. pacientes suelen ser sometidos a
controles periódicos tras la primera aparición. La detección precoz
de los tumores invasivos así como de los recurrentes, que
frecuentemente revisten mayor gravedad que los primariamente
detectados, sería de una enorme utilidad para aumentar las
expectativas de los pacientes.
En la actualidad, el diagnóstico más seguro se
realiza mediante cistoscopia y biopsia. Ambos métodos son invasivos,
complicados y costosos. Es por ello que el coste por paciente de
cáncer de vejiga desde su detección hasta su muerte sea el más alto
de todos los tipos de cáncer (G.F. Riley, A.L. Potosky, J.D. Lubitz,
L.G. Kessler, Med.Care 33 (1995) 828), (H. Hedelin, S. Holmang, L.
Wiman, Scand J Urol Nephrol 36 (2002) 344), (M.F. Botteman, C.L.
Pashos, A. Redaelli, B. Laskin, R. Hauser, Pharmacoeconomics 21
(2003) 1315). El diagnóstico no invasivo más utilizado es la
citología de orina. Aunque tiene una alta especificidad presenta una
baja sensibilidad y alta variabilidad dependiendo del patólogo que
realice en examen (M. Burchardt, T. Burchardt, A. Shabsigh, A. De La
Taille, M.C. Benson, I. Sawczuk, Clin Chem 46 (2000) 595).
Recientemente se han descrito nuevos marcadores, algunos de ellos
aprobados por la Food and Drug Administration de Estados
Unidos, que han mostrado una alta sensibilidad (V.B. Lokeshwar, M.G.
Selzer, Urol Oncol 24 (2006) 528), (M. Burchardt, T. Burchardt, A.
Shabsigh, A. De La Taille, M.C. Benson, I. Sawczuk, Clin Chem 46
(2000) 595), (V.B. Lokeshwar, T. Habuchi, H.B. Grossman, W.M.
Murphy, S.H. Hautmann, G.P. Hemstreet, 3rd, A.V. Bono, R.H.
Getzenberg, P. Goebell, B.J. Schmitz-Drager, J.A.
Schalken, Y. Fradet, M. Marberger, E. Messing, M.J. Droller, Urology
66 (2005) 35), (H.B. Grossman, M. Soloway, E. Messing, G. Katz, B.
Stein, V. Kassabian, Y. Shen, Jama 295 (2006) 299), (B.W. van Rhijn,
H.G. van der Poel, T.H. van der Kwast, Eur Urol 47 (2005) 736). No
obstante, la relativamente baja especificidad y reproducibilidad
hacen que la cistoscopia y la citología sean todavía las técnicas
más utilizadas (V.B. Lokeshwar, M.G. Selzer, Urol Oncol 24 (2006)
528), ((M. Burchardt, T. Burchardt, A. Shabsigh, A. De La Taille,
M.C. Benson, i. Sawczuk, Clin Chem 46 (2000) 595), (V.B. Lokeshwar,
T. Habuchi, H.B. Grossman, W.M. Murphy, S.H. Hautmann, G.P.
Hemstreet, 3rd, A.V. Bono, R.H. Getzenberg, P. Goebell, B.J.
Schmitz-Drager, J.A. Schalken, Y. Fradet, M.
Marberger, E. Messing, M.J. Droller, Urology 66 (2005) 35), (H.B.
Grossman, M. Soloway, E. Messing, G. Katz, B. Stein, V. Kassabian,
Y. Shen, Jama 295 (2006) 299), (B.W. van Rhijn, H.G. van der Poel,
T.H. van der Kwast, Eur Urol 47 (2005) 736), (H. Boman, H. Hedelin,
S. Holmang, J Urol 167 (2002) 80). El funcionamiento y utilidad de
estos marcadores también difiere según se trate de una detección
primaria o durante el seguimiento de los pacientes ya
diagnosticados. Hasta el momento, los resultados obtenidos no
justifican su utilización de forma generalizada ya que, si bien
suelen ser más sensibles que la citología urinaria, su grado de
especificidad está por debajo.
La búsqueda de nuevos biomarcadores de cáncer de
vejiga sigue teniendo, por tanto, un gran interés médico y de salud
pública.
La presente invención proporciona un método de
diagnóstico de cáncer de vejiga de forma sencilla y fiable, de tal
forma que puede ser incluido en la práctica clínica habitual.
Así pues en primer aspecto, la presente
invención se refiere a un método in vitro para la detección
de cáncer de vejiga que comprende
- a)
- analizar una muestra obtenida de un paciente,
- b)
- determinar el nivel de expresión de la cadena beta de la proteína de complemento C4A,
- c)
- comparar dicho nivel de expresión con un valor control,
donde la alteración del nivel de
expresión de dicha proteína es indicativo de cáncer de
vejiga.
\global\parskip1.000000\baselineskip
En un aspecto más en particular, el término
"alteración del nivel de expresión" tal y como se utiliza en la
presente invención, se refiere a la expresión anormalmente alta de
la cadena beta de la proteína de complemento C4A comparado con un
valor control. En un aspecto más en particular, la proteína expresa
de 3 a 15 veces más en las muestras tumorales que las muestras
control. En un aspecto más en particular, la proteína se expresa 10
veces más en las muestras tumorales que en las muestras control.
Por valor control en la presente invención, nos
referimos a un valor obtenido de muestras sin cáncer de vejiga y sin
ninguna otra enfermedad.
En un aspecto más en particular, en el método de
la presente invención, el nivel de expresión de la cadena beta de la
proteína de complemento C4A se determina mediante técnicas de
inmunoquímica. A título ilustrativo y sin que se limite el alcance
de la invención, el término "técnicas inmunoquímicas" tal y
como se utiliza en la presente invención, se refiere a: ELISA,
Western blot, biochips o microarrays de proteínas, o cualquier otra
técnica que incluya anticuerpos específicos frente a la cadena beta
de la proteína de complemento C4A.
En un aspecto más en particular de la presente
invención, el nivel de la cadena beta de la proteína de complemento
C4A se determina mediante anticuerpos policlonales. En otro aspecto
más en particular, el método de la presente invención se realiza
mediante anticuerpos monoclonales.
El término "muestra" tal y como se utiliza
en la presente invención se refiere pero no se limita, a tejidos y/o
fluidos (sangre, orina). En un aspecto más en particular de la
presente invención, la muestra obtenida del paciente es un fluido,
más en particular, es orina, y más en particular es la fracción
celular de la orina. En un segundo aspecto, la presente invención se
refiere a un kit para la detección de cáncer de vejiga que comprende
los reactivos necesarios para llevar a cabo el método descrito en la
presente invención.
La figura 1 muestra el gel de electroforesis
bidimensional.
La figura 2 se refiere a la cuantificación de la
cadena beta de la proteína de complemento C4A mediante el análisis
DIGE para cada una de las bandas (spots) de la proteína: 2A: Average
ratio (tumor/control). 14.35, t-test: 0.0122;
presente en 8 de 9 geles, 2B: Average ratio (tumor/control). 13.39,
t-test: 0.0134; presente en 9 de 9 geles, 2C:
Average ratio (tumor/control). 17.72, t-test:
0.0095; presente en 8 de 9 geles, 2D: Average ratio (tumor/control).
10.51, t-test: 0.0122; presente en 9 de 9 geles.
La figura 3 muestra el resultado del Western
blot. C1, C2, C3 y C4 se refieren a las muestras control, T1, T2,
T3, T4 y T5 se refieren a las muestras obtenidas de los pacientes
con tumor de vejiga, a) muestra los resultados después de un minuto
de exposición y b) muestra los resultados tras tres minutos de
exposición.
Mediante técnicas de proteómica, en concreto
mediante la metodología DIGE detectamos que la cadena beta de la
proteína de complemento C4A tenía una expresión diferencial en
pacientes con cáncer de vejiga y en pacientes control o sanos.
Las muestras se obtuvieron en el Servicio de
Urología del Hospital Lluís Alcanyís de Xátiva (Valencia) tras la
correspondiente aprobación de su Comité Ético y el consentimiento
informado de los pacientes.
Se utilizaron muestras de orina de 10 sujetos
control, 10 pacientes diagnosticados con carcinoma transicional de
vejiga que todavía no habían recibido tratamiento y 10 pacientes con
tumores recurrentes.
Las muestras de orina recién colectadas se
fijaron añadiendo etanol al 15% (v/v final) y se mantuvieron a 4ºC
hasta su procesamiento. Posteriormente, el componente celular se
concentró mediante centrifugación a 1000 g x 45 min a 4ºC. El
sobrenadante se congeló a -20ºC hasta su utilización. El sedimento
se resuspendió en 1 ml de tampón PBS (Na_{2}HPO_{4} 4,3 mM,
KH_{2}PO_{4} 1,4 mM, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, pH 7,2.) y se pasó
a un tubo de microcentrífuga de 2 ml. A continuación se creó un
colchón de sacarosa depositando 100 \mul de sacarosa 250 mM en el
fondo del tubo y se centrifugó a 13400 g x 50 min 4ºC. En estas
condiciones, sólo el componente celular atravesó la solución de
sacarosa. Las células se lavaron nuevamente en PBS. El sedimento se
congeló a -20ºC hasta su utilización.
Las células purificadas se lisaron en tampón de
lisis (urea 7M, tiourea 2 M, CHAPS 4% y Tris 20 mM) mediante
homogeneización mecánica en un tubo microcentrífuga de 1,5 ml
seguido de varios pulsos breves de sonicación para romper el DNA. A
continuación se precipitaron las proteínas para la eliminación de
sales y otras sustancias que interfieren con el mareaje y la
electroforesis usando el kit 2-D
Clean-Up de GE Healthcare siguiendo las
instrucciones del fabricante. Las proteínas se resuspendieron en
tampón de lisis y se determinó la concentración mediante el método
de Bradford (BioRad Protein ASsay), usando immunoglobulina gamma
como estándar. El mareaje de las muestras con los fluoróforos CyDye
DIGE Fluor de GE Healthcare se realizó siguiendo el procedimiento
recomendado por el fabricante. La mitad de las muestras de cada
grupo se marcaron con Cy3 y la otra mitad con Cy5. El estándar
interno se preparó mediante mezcla a partes iguales de todas las
muestras y se marcó con Cy2. El mareaje se realizó incubando en
hielo y en oscuridad 50 \mug de proteína y 400 pmoles de
fluoróforo durante 30 minutos. La reacción de mareaje se terminó
incubando las muestras con lisina durante 10 minutos. Posteriormente
se mezclaron para cada gel 50 \mug de proteína marcada con cada
uno de los fluoróforos según la siguiente tabla (C: control; T:
tumor primario; R: tumor recurrente; S: estándar interno):
A continuación se realizó una electroforesis
bidimensional. En la 1ª dimensión, isoelectroenfoque (IEF), las
proteínas se separaron por punto isoeléctrico en tiras Immobiline
DryStrips de 24 cm, rango de pH 3-10 (NL). Para ello
primero se hidrataron las tiras durante 20 horas en urea 7M, tiourea
2M, CHAPS 4%, DeStreak (12 \mul/ml) y 1% de tampón IPG (rango de
pH 3-10). La muestra se cargó en la tira por el
procedimiento de cup loading anódico. La separación se
realizó según el siguiente protocolo: Step 300V 3h, Gradiente 1000V
6h, Gradiente 8000V 3h, Step 8000V 32000 Vh a 20ºC.
En la 2ª dimensión, SDS-PAGE, la
separación se realizó en función del peso molecular. Para ello se
utilizaron geles de 25 cm x 21 cm del 12.5% acrilamida. La
electroforesis se desarrolló a 2 w/gel durante 1 hora y a 15 w/gel
durante 5 horas. Tras la electroforesis los geles se escanearon para
cada uno de los tres fluoróforos de manera independiente utilizando
un Typhoon™ 9400 Variable Mode Imager. Figura 1.
Posteriormente se llevó a cabo el Análisis DIGE.
El análisis de las imágenes de los geles se realizó con el programa
DeCyder™ Differential Analysis Software. Este análisis
incluyó la co-detección y cuantificación de los
spots de proteína marcados con cada uno de los fluoróforos. Dentro
de cada gel se calculó la abundancia relativa (respecto al estándar
interno) de cada una de las muestras a comparar.
Como resultado comprobamos que había varios
spots que de manera estadísticamente significativa estaban
aumentados con respecto al control.
El siguiente paso fue la identificación de
proteína correspondiente. Para ello se recortaron los spots
correspondientes de los geles y las proteínas se digirieron con
tripsina mediante protocolos establecidos (A. Shevchenko, M. Wilm,
O. Vorm, M. Mann, Analytical Chemistry 68 (1996) 850). Una alícuota
de los péptidos obtenidos se analizó inicialmente utilizando un
MALDI TOF/TOF 4700 (Applied Biosystems). Con los espectros de masas
obtenidos se realizó una búsqueda en la base de datos UniProt
(http://www.expasy.org/sprot/) utilizando el motor de
búsqueda Mascot (http://www.matrixscience.com/) instalado en
nuestros servidores para identificar la proteína correspondiente
mediante huella peptídica. Los resultados se muestran en la figura
1.
Los presentes ejemplos pretenden ser
ilustrativos de la invención y nunca limitativos
Con la fracción celular de las muestras de orina
se realizó una electroforesis de SDS/PAGE con 30 \mug de proteína.
Como control positivo se utilizaron distintas cantidades de proteína
"Complement C4" de Sigma (C8195). Después se transfirieron a
una membrana y se revelaron con anticuerpo C4beta
(H-300): sc-25816 (Santa Cruz
Biotechnology) a una dilución 1/200.
Los resultados mostraron que los niveles de la
cadena beta de la proteína de complemente C4A están sobreexpresados
en las muestras correspondientes a los pacientes con cáncer de
vejiga (figura 3).
Claims (8)
1. Método in vitro para la detección de
cáncer de vejiga que comprende
- d)
- analizar una muestra obtenida de un paciente,
- e)
- determinar el nivel de expresión de la cadena beta de la proteína de complemento C4A,
- f)
- comparar dicho nivel de expresión con un valor control,
donde la alteración del nivel de
expresión dicha proteína es indicativo de cáncer de
vejiga.
2. Método para la detección de cáncer de vejiga
según la reivindicación 1, donde el nivel de expresión de la cadena
beta de la proteína de complemento C4A se realiza mediante técnicas
de inmunoquímica.
3. Método para la detección de cáncer de vejiga
según la reivindicación 2, donde las técnicas de inmunoquímica se
lleva a cabo mediante la utilización de anticuerpos.
4. Método para la detección de cáncer de vejiga
según la reivindicación 3, donde los anticuerpos son anticuerpos
policlonales.
5. Método para la detección de cáncer de vejiga
según la reivindicación 3, donde los anticuerpos son anticuerpos
monoclonales.
6. Método para la detección de cáncer de vejiga
según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la
muestra a analizar es un fluido.
7. Método para la detección de cáncer de vejiga
según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la
muestra a analizar es el componente celular de la orina.
8. Kit para la detección de cáncer de vejiga que
comprende los reactivos necesarios para llevar a cabo el método
según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
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|---|---|---|---|
| ES200900373A ES2344932B1 (es) | 2009-02-10 | 2009-02-10 | Metodo para la deteccion de cancer de vejiga. |
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| WO2007035766A2 (en) * | 2005-09-19 | 2007-03-29 | The Johns Hopkins University | Biomarker for prostate cancer |
| WO2007134132A2 (en) * | 2006-05-12 | 2007-11-22 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of bladder and urinary tract tumors |
-
2009
- 2009-02-10 ES ES200900373A patent/ES2344932B1/es not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
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|---|
| LOKESHWAR, V.B. et al. "{}Urinary bladder tumor markers"{}. UROLOGI ONCOLOGY. Noviembre-Diciembre 2006. Vol. 24, N$^{o}$. 6, páginas 528-537; todo el documento. * |
Also Published As
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