ES2337696T3 - Metodos para aumentar la eficacia de la terapia contra el cancer. - Google Patents

Metodos para aumentar la eficacia de la terapia contra el cancer. Download PDF

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Abstract

Uso de un agente antitumoral para la fabricación de un medicamento para el tratamiento en combinación con un retinoide de un tumor de un cáncer humano seleccionado entre cáncer de ovario, cáncer endometrial, tumor de riñón de Wilm, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer gástrico, cáncer de pulmón, cáncer hepatocelular, melanoma o feocromocitoma, donde dicho agente antitumoral es un anticuerpo, una molécula antisentido, una ribozima o un ADN de triple hélice que se une a una proteína diana seleccionada del grupo que consiste en autotaxina, ligando 4-1BB, efrina b1, ISLR, M-ras, y ZO-1 o a un ácido nucleico que codifica dicha proteína diana.

Description

Métodos para aumentar la eficacia de la terapia contra el cáncer.
Antecedentes de la invención Campo de la invención
La presente invención se refiere a la identificación de dianas de fármacos para la terapia del cáncer. En particular, la presente invención se refiere a la identificación de antígenos de tumores, la expresión de los cuales aumenta selectivamente mediante el tratamiento con retinoide, y a los métodos de tratamiento de reconocimiento de dichos antígenos.
Descripción de la técnica anterior
Una aproximación para entender la base molecular del cáncer y para idear estrategias de tratamiento eficaces es identificar diferencias en la expresión génica entre células cancerosas y células normales. Se han utilizado estrategias basadas en suposiciones de que los niveles de ARNm en estado estacionario diferirán entre células normales y células malignas para clonar genes diferencialmente expresados (Zhang et al., Science 276: 1268-1272 (1997)), y han conducido a la identificación de nuevas dianas de fármacos.
El crecimiento aberrante y la supervivencia de células neoplásicamente transformadas se atribuyen a defectos genéticos subyacentes que alteran la homeostasis celular normal. La señalización de Wnt representa un mecanismo que contribuye a la progresión en un alto porcentaje de cánceres humanos para los que existen modelos animales y modelos de cultivo celular apropiados. La \beta-catenina, un componente clave del mecanismo de señalización de Wnt, interacciona con la familia TCF/LEF de factores de transcripción y activa la transcripción de genes diana de Wnt. Estudios recientes han revelado que un conjunto de proteínas, tales como el supresor del tumor de la poliposis adenomatosa (APC) y la axina están implicadas en la regulación del mecanismo de señalización de Wnt. Además, se han hallado mutaciones en APC o \beta-catenina que son responsables de la génesis de muchos cánceres humanos.
Por ejemplo, en el caso del cáncer colorrectal, la inactivación del supresor de tumores APC aparece de manera temprana en la progresión del tumor y proporciona una ventaja en el crecimiento resultante de la activación inapropiada de genes, tales como la ciclina D y c-myc (He et al., Science 281: 1509-1512 (1998)); Tetsu y McCormick, Nature 38: 422-426 (1999)). Estos genes son dianas de los factores de transcripción LEF/TCF que son activados por su interacción con \beta-catenina, una proteína que normalmente disminuye su expresión mediante APC (Barker et al, Adv Cancer Res 77: 1-24 (2000); Polakis, Genes Dev 14: 1837-1851 (2000)). El favorecimiento de la expresión de este mecanismo de señalización en el cáncer también puede resultar de mutaciones sin sentido en el gen de \beta-catenina (Rubinfeld et al., Science 275: 1790-1792 (1997)); Korinek et al., Science 275: 1784-1787 (1997)). Estas mutaciones hacen que la proteína \beta-catenina sea resistente a la disminución de la expresión por APC. Recientemente se han identificado mutaciones en \beta-catenina en una amplia variedad de tumores humanos y son particularmente frecuentes en cánceres hepatocelulares humanos (Polakis, 2000, supra). La activación de una señalización de \beta-catenina también aparece cuando los receptores frizzled de la superficie celular son estimulados por ligandos Wnt secretados (Wodarz and Nusse, Annu Rev Cell Dev Biol 14: 59-88 (1998)). Aunque no se sabe si los ligandos Wnt per se contribuyen a los cánceres humanos, experimentos previos demostraron que su sobreexpresión en tejido mamario murino era tumorigénico (Nusse and Varmus, Cell 31: 99-109 (1982)). Se ha implicado el mecanismo de señalización de Wnt en la patogénesis de una variedad de cánceres, incluyendo el cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer de pulmón, y melanoma. De este modo, la gran mayoría de los tumores colorrectales contienen mutaciones en los genes que codifican para el supresor de tumores APC o \beta-catenina (Polakis, Curr. Opin. Genet. Dev. 9: 15-21 (1999)). También se han identificado mutaciones activantes en la \beta-catenina en cánceres de ovario y endometrio, tumores de riñón de Wilm y melanomas, demostrando que defectos en la señalización de Wnt-1 contribuye a la progresión de estos cánceres (Kobayashi et al., Jpn J Cancer Res 90: 55-9 (1999); Koesters et al, Cancer Res 59: 3880-2 (1999); Palacios and Hamallo, Cancer Res 58: 1344-7 (1998); Rimm et al., Am J Pathol 154: 325-9 (1999); Rubinfeld et al., Science 262: 1731-1734 (1993); Wright et al, Int J Cancer 82: 625-9 (1999)).
Se cree que las señales que provienen de los receptores Wnt continúan a través de la activación de "disheveled", que a su vez, regula de manera negativa de la glicógeno sintasa quinasa 3b (GSK3b) (Peifer and Polakis, Science 287: 1606-1609 (2000)). Esta quinasa fosforila normalmente la secuencia reguladora de \beta-catenina que dirige la proteína a la degradación dependiente de ubiquitina (Miller and Moon, Genes & Dev. 10: 2527-2539 (1996)). La regulación negativa de GSK3b incrementa de este modo la estabilidad de \beta-catenina y prolonga su activación de los factores de transcripción TCF/LEF (Molenaar, et al, Cell 86: 391-399 (1996); Behrens, et al., Nature 382: 638-642 (1996)). Aunque la activación de los factores de transcripción TCF/LEF por \beta-catenina está bien establecida, aún existen mecanismos adicionales independientes de estos factores de transcripción por los que la \beta-catenina podría iniciar la activación génica. Uno de estos mecanismos alternativos fue recientemente propuesto por Byers y colaboradores en un estudio que investiga el potencial por "cross-talk" entre la señalización por receptores de ácido retinoico (RAR) y \beta-catenina (Easwaran, et al., Curr Biol 9: 1415-1418 (1999)). Se activó un gen informador sintético que contenía un elemento de respuesta a ácido retinoico de manera más robusta mediante retinoides siguiendo la sobreexpresión de \beta-catenina en una línea celular cultivada.
El uso de anticuerpos monoclonales como agentes terapéuticos ha ganado una mayor aceptación con diversos anticuerpos monoclonales (mAbs) aprobados para uso humano o en la ultima fase de las pruebas clínicas. El primer mAb aprobado por la Administración de Alimentación y Fármacos (FDA) de Estados Unidos para el tratamiento del rechazo de aloinjertos fue anti-CD3 (OKT3) en 1986. Desde entonces, la pauta de progreso en el campo de los mAbs se ha acelerado considerablemente, particularmente desde 1994 en adelante, que condujo a la aprobación de siete mAbs adicionales para el tratamiento humano. Entre éstos se incluyen ReoPro® para el tratamiento de complicaciones de la angioplastia coronaria en 1994, Zenapax® (anti-CD25) para la prevención de rechazo de aloinjertos en 1997, Rituxan® (anti-CD20) para el tratamiento de linfomas de células B no de Hodgkin en 1997, Infliximab® (anti-TNF-\alpha) inicialmente para el tratamiento de la enfermedad de Crohn en 1998 y posteriormente para el tratamiento de la artritis reumatoide en 1999, Simulect® (anti-CD25) para la prevención del rechazo de aloinjerto en 1998, Synagis® (proteína anti-F del virus sincitial respiratorio) para el tratamiento de infecciones respiratorias en 1998, y Herceptin® (anti-HER2/neu) para el tratamiento de tumores de mama metástasicos que sobreexpresan HER2 en 1998 (Glennie and Johnson, Immunol Today 21: 403-410 (2000)).
La utilidad demostrada de los anticuerpos terapéuticos en el tratamiento del cáncer humano en clínicas ha incitado recientemente una actividad intensa dirigidas al desarrollo y mejora de agentes inmunoterapéuticos. Idealmente, estas terapias requieren la presencia de antígenos de la superficie celular expresados en las células cancerosas a niveles significativamente más elevados que los presentes en tejidos normales en el cuerpo. Dicho criterio para la expresión diferencial en tumores en relación al tejido normal limitará obviamente el número de antígenos considerados deseables como dianas para el tratamiento del cáncer, tal como la inmunoterapia. Por lo tanto, sería deseable encontrar vías de aumentar selectivamente la expresión de antígenos de la superficie celular en células tumorales. En particular, los reactivos que selectivamente aumentarían el nivel de expresión de antígenos de células cancerosas en relación a células normales tendrían un gran potencial en la mejora del índice terapéutico para el tratamiento, tal como agentes inmunoterapéuticos dirigidos contra estos antígenos.
Descripción resumida de la invención
Se pueden identificar nuevas dianas de fármacos mediante análisis diferencial de transcritos de ARN aislados de líneas de células de cáncer y tejidos. En el trabajo que subyace la presente invención, esta estrategia se ha extendido mediante el análisis de las diferencias en la expresión de genes resultantes del tratamiento con fármacos de células cancerosas transformadas y no transformadas. Una línea de células epiteliales de mama, que condicionalmente expresa el protooncogén Wnt-1, se dejó sin tratar o se trató con ácido 9-cis retinoico en presencia o ausencia de la expresión de Wnt-1. Se favoreció selectivamente la expresión de un conjunto de genes, incluyendo varios antígenos de la superficie celular, mediante la combinación de Wnt-1 y ácido retinoico. Esta observación indica que la eficacia del tratamiento del cáncer, y en particular, la inmunoterapia de cánceres caracterizados por el desarrollo de mecanismos de señalización de Wnt, se puede aumentar mediante la administración simultánea de ácido retinoico u otros retinoides.
Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención se refiere al uso de un agente antitumoral para la fabricación de un medicamento para el tratamiento combinado con un retinoide de un tumor de un cáncer humano seleccionado entre cáncer de ovario, cáncer de endometrio, tumor de riñón de Wilm, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer gástrico, cáncer de pulmón, cáncer hepatocelular, melanoma o feocromocitoma, donde dicho agente antitumoral es un anticuerpo, una molécula antisentido, una ribozima o un ADN de triple hélice que se une a una proteína diana seleccionada del grupo que consiste en autotaxina, ligando 4.1BB, efrina b1, ISLR, M-ras, y ZO-1 o a un ácido nucleico que codifica una proteína diana.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un retinoide y un agente antitumoral para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un tumor de un cáncer humano seleccionado entre cáncer de ovario, cáncer de endometrio, tumor de riñón de Wilm, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer gástrico, cáncer de pulmón, cáncer hepatocelular, melanoma o feocromocitoma, donde dicho agente antitumoral es un anticuerpo, una molécula antisentido, una ribozima o un ADN de triple hélice que se une a una proteína diana seleccionada del grupo que consiste en autotaxina, ligando 4.1BB, efrina b1, ISLR, M-ras, y ZO-1 o a un ácido nucleico que codifica una proteína diana.
El tratamiento se puede realizar con cualquier retinoide, incluyendo ácido retinoico.
El retinoide se puede administrar antes, conjuntamente con, o después de la administración del agente anti-
tumoral.
En una realización preferida, el agente antitumoral es un anticuerpo. A lo largo de la descripción, el término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio, e incluye fragmentos de anticuerpo, tales como Fab, Fab', F(ab')_{2} y fragmentos Fv, diabodies, moléculas de anticuerpo de cadena sencilla y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. El anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico, humanizado, o humano, incluyendo fragmentos de anticuerpos.
El tratamiento puede incluir opcionalmente un tratamiento adicional, por ejemplo con un agente quimioterapéutico y/o un tratamiento con radiación.
\newpage
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para el diagnóstico de un tumor de un cáncer humano seleccionado entre cáncer de ovario, cáncer de endometrio, tumor de riñón de Wilm, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer gástrico, cáncer de pulmón, cáncer hepatocelular, melanoma o feocromocitoma, que comprende:
a) poner en contacto una muestra biológica obtenida de dicho paciente con ácido retinoico; y
b) detectar la expresión aumentada de una proteína diana en la muestra biológica tratada con el retinoide en relación con un tejido normal, donde la proteína diana se selecciona del grupo que consiste en autotaxina, ligando 4.1BB, efrina b1, ISLR, M-ras, y ZO-1.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un retinoide y un agente antitumoral, donde el agente antitumoral es un anticuerpo, una molécula antisentido, una ribozima o un ADN de triple hélice que se une a una proteína diana seleccionada del grupo que consiste en autotaxina, ligando 4.1BB, efrina b1, ISLR, M-ras, y ZO-1 o a un ácido nucleico que codifica la proteína diana.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un agente antitumoral para el uso en el tratamiento combinado con un retinoide de un tumor de un cáncer humano seleccionado entre cáncer de ovario, cáncer de endometrio, tumor de riñón de Wilm, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer gástrico, cáncer de pulmón, cáncer hepatocelular, melanoma o feocromocitoma, donde dicho agente antitumoral es un anticuerpo, una molécula antisentido, una ribozima o un ADN de triple hélice que se une a una proteína diana seleccionada del grupo que consiste en autotaxina, ligando 4.1BB, efrina b1, ISLR, M-ras, y ZO-1 o a un ácido nucleico que codifica una proteína diana.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 1) de un ADNc que contiene una secuencia de nucleótidos (nucleótidos 1-2732) que codifica la secuencia PR010282 (stra6) nativa, donde la secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 1) es un clon designado aquí como "DNA148380-2827". También se presentan en letra negrita y subrayadas las posiciones de los codones de inicio y parada respectivos.
La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 2) de un polipéptido PR010282 (stra6) de secuencia nativa derivado de la secuencia codificante de SEC ID NO; 1. También se muestran las localizaciones aproximada de otros dominios de polipéptidos importantes.
Las figuras 3A-D muestran ejemplos hipotéticos para el uso del siguiente método descrito en el % de identidad de secuencia de aminoácidos determinada (Figuras 3A-B) y el % de identidad de la secuencia de ácidos nucleicos (Figuras 3C-D) utilizando el programa de comparación de secuencias ALIGN-2, donde "PRO" representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido PRO10282 hipotético de interés. "Proteína de comparación" representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido contra el que se compara el polipéptido "PRO" de interés. "PRO-DNA" representa una secuencia de ácido nucleico de interés que codifica un PRO10282 hipotético. "ADN de comparación" representa la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico contra la que se compara la molécula de ácido nucleico PRO-DNA de interés. "X", "Y" y "Z" representan cada uno residuos de aminoácidos diferentes y "N", "L" y "V" representan cada uno diferentes nucleótidos hipotéticos.
Las figuras 4A-Q proporcionan el código fuente completo para el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. Este código fuente se puede compilar de manera rutinaria para su uso en un sistema operativo UNIX para proporcionar el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2.
La figura 5 muestra la secuencia de nucleótidos designada aquí como DNA100038 SEQ ID NO: 3.
La figura 6 muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 4) de un ADNc que contiene una secuencia de nucleótidos (nucleótidos 1-2778) que codifica una variante del polipéptido Stra6 humano de secuencia nativa, donde la secuencia de nucleótidos (SEC ID No. 4) es un clon designado aquí como "DNA148389-2827-1." También se presentan en letra negrita y subrayadas las posiciones de los codones de inicio y parada respectivos.
La figura 7 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC ID No. 5) de una variante del polipéptido Stra6 humano de secuencia nativa derivada de la secuencia codificante de SEC ID No. 4. También se muestran las localizaciones aproximadas de otros dominios de polipéptidos importantes.
La figura 8 es una representación esquemática de Stra6 de ratón y la proteína Stra6 humana codificada por DNA148380.2827 (PRO10282 humano nativo).
La figura 9 muestra la representación de la hidrofobicidad de la proteína Stra6 humana de secuencia nativa codificada por DNA 148380-2827 (PRO10282 humano nativo).
La figura 10 muestra el perfil de expresión de ARN relativo para la proteína Stra6 humana de secuencia nativa codificada por DNA148380-2827 en varios tejidos humanos normales.
La figura 11 muestra la expresión de pliegue de ARN para la proteína Stra6 humana de secuencia nativa codificada por DNA 148380-2827 en tejido de tumor de colon humano en relación con la expresión de ARN en mucosa normal del mismo paciente analizado mediante PCR cuantitativa. Los datos son de un experimento realizado por triplicado. El experimento se repitió al menos dos veces con un grupo diferente de cebadores de PCR.
La figura 12A muestra la expresión de ARN para la proteína Stra6 humana de secuencia nativa codificada por DNA 148380-2827 en tejido de tumor de colon humano en relación con la expresión de ARN en mucosa normal del mismo paciente utilizando el gen constitutivo, GADPH como control.
La figura 12B muestra la localización de Stra6 en las células tumorales epiteliales en un adenocarcinoma de colon mediante hibridación in situ.
La figura 13 muestra la expresión de ARN para la proteína Stra6 humana nativa codificada por DNA148380-2827 en líneas celulares de tumor de mama, riñón, colon y pulmón humano, en relación con las correspondientes líneas celulares normales.
La figura 14 ilustra la expresión de fragmentos de péptidos derivados de la proteína Stra6 humana de secuencia nativa codificada por DNA148380-2827 en E. coli.
La figura 15 ilustra la expresión de ARN de Stra6 en células de carcinoma de colon humano en presencia y ausencia de ácido todo-trans-retinoico (ATRA) y ácido 9-cis-retinoico (9cRA), respectivamente.
Figura 16. Hibridación in situ para Stra6 en secciones de tumores. Se muestran imágenes en campo oscuro que demuestran granos de plata (A, C, E, G) con las correspondientes imágenes de campo brillante (B, D, F, H) teñidas con hematoxilina-eosina. Densidades moderadas de granos de plata recubren las células tumorales, pero no un vaso sanguíneo en un melanoma maligno (A, B). El epitelio neoplásico en un adenocarcinoma endometrial está marcado de forma moderada, mientras que el estroma tumoral es negativo (C, D). Las regiones blastémicas en un tumor de Wilm muestran niveles de expresión elevados, mientras que el estroma tumoral es negativo (E, F). Un feocromocitoma muestra una expresión de ARNm de Stra6 muye elevada, mientras que el córtex adrenal normal adyacente es negativo (g, H). Barras de la escala = 100 micras.
Figura 17 (A) Inducción de la expresión de ARNm de Stra6 en respuesta a 9-c es RA (ácido retinoico) o todo-trans-RA en células C57MG/Parentales y C57MG/Wnt-1. (B) Inducción de la expresión de ARNm de Stra6 en células C57MG/Parentales en respuesta a un medio condicionado con Wnt-3A y 9-cis-RA. (C) Inducción de la expresión de ARNm de Stra6 después del tratamiento con ácido retinoico en células de adenocarcinoma de colon HCT116 y WiDr. (D) Imágenes de campo oscuro que demuestran la expresión de Stra6 mediante hibridación in situ en células HCT116 antes (panel superior) y después (panel inferior) del tratamiento con ácido retinoico. Expresión de la proteína Stra6 en células WiDr antes (-RA) y después (+RA) del tratamiento con ácido retinoico tal como se visualiza mediante transferencia Western con un anticuerpo monoclonal dirigido contra el péptido B de Stra6 humano. (F) Localización de la membrana de Stra6 en células WiDr no tratadas (panel izquierdo) o tratadas (panel derecho) con ácido retinoico. Se realizó inmunohistoquímica con un sobrenadante del cultivo de hibridomas monoclonales anti-péptido B de Stra6 humano (clon 12F4.2H9.1D5). Para los experimentos mostrados en A-F, las células se trataron con ácido retinoico durante 48 horas. Los productos Stra6 obtenidos después de completar las reacciones de PCR cuantitativa (cada una de 40 ciclos) se muestran en cada gráfico A-C.
Figura 18 (A) Wnt-1 induce la expresión de RAR\gamma-1. Se sometieron cantidades equivalentes de proteína de lisados de células completas provenientes de células C57MG/Wnt-1 represibles con tetraciclina en ausencia de tetraciclina durante 0, 24, 48, ó 72 horas a SDS-PAGE y se inmunotransfirieron para RAR\gamma-1 y ERK2. (B) La expresión de ARNm de RARg-1 en glándulas mamarias hiperplásicas y tumores de glándulas mamarias de atones transgénicos Wnt-1. La expresión de ARNm se determinó mediante RT-PCR cuantitativa y los datos se expresaron como la cantidad de expresión en relación a la expresión de ARNm en glándulas mamarias de tipo salvaje.
La figura 19 ilustra la inducción sinérgica de stra6 mediante el tratamiento con ácido retinoico (RA) y Wnt-1 (Wnt).
La figura 20 ilustra la inducción sinérgica de autotaxina mediante el tratamiento con ácido retinoico (RA) y Wnt-1 (Wnt).
La figura 21 ilustra la inducción sinérgica del ligando 41 BB (41 bb) mediante el tratamiento con ácido retinoico (RA) y Wnt-1 (Wnt).
La figura 22 ilustra la inducción sinérgica de efrinb1 mediante el tratamiento con ácido retinoico (RA) y Wnt-1 (Wnt).
La figura 23 muestra que el gen de ISRL es sensible al ácido retinoico (RA), pero no a Wnt-1 (Wnt), mientras que la combinación de ambos agentes da lugar a una activación que supera a la del ácido retinoico solo.
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La figura 24 muestra que la proteína de unión estrecha ZO-1 y el gen M-ras no responden significativamente ni a ácido retinoico (RA) ni a Wnt-1 (Wnt) solos, pero se activan mediante un tratamiento combinado.
La figura 25A ilustra la activación de un elemento de respuesta a RAR (RARE) por \beta-catenina, determinada mediante el aumento de la producción de luciferasa.
La figura 25B muestra que el elemento de respuesta a LEF TopFlash es activado no sólo por \beta-catenina, sino también por la coexpresión de LEF con \beta-catenina.
La figura 26 muestra el favorecimiento de la expresión del ARNm de stra6 en tumores y glándulas mamarias normales mediante dosis varias de ácido todo-trans retinoico (ATRA).
La figura 27 muestra el favorecimiento del ARNm de stra6 en xenoinjertos de WiDr de ratones dosificados oralmente con 400 mg/kg de ATRA.
Descripción detallada de la realización preferida A. Definiciones
A menos que se defina lo contrario, los términos técnicos y científicos del presente documento tienen el mismo significado que el entendido habitualmente por un técnico en la materia al que pertenece la invención. Véase, por ejemplo, Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed, J. Wiley & Sons (New York, NY 1994); Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989). Para los objetivos de la presente invención, se definen los siguientes términos.
Los términos "polipéptido PRO10282", "proteína PRO10282", "PRO10282", "polipéptido Stra6", "proteína stra6" y "Stra6" se utilizan indistintamente, y comprenden PRO10282 de secuencia nativa (Stra6) y variantes del polipéptido PRO10282 (Stra6) (que se definen posteriormente aquí). El polipéptido PRO10282 (stra6) se puede aislar de una variedad de fuentes, tales como tipos de tejido humano o de otra fuente, o se pueden preparar mediante métodos recombinantes y/o sintéticos.
Un "PRO10282 de secuencia nativa" o "Stra6 de secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un PRO10282 derivado de la naturaleza. Dicho PRO10282 (stra6) de secuencia nativa se puede aislar de la naturaleza o se puede producir mediante medios recombinantes y/o sintéticos. El término "PRO10282 de secuencia nativa" o "Stra6 de secuencia nativa" comprende específicamente formas truncadas o secretadas de forma natural (por ejemplo, una secuencia de dominio extracelular), formas variantes naturales (por ejemplo, formas de corte y empalme alternativo) y variantes alélicas naturales del PRO10282. El PRO10282 se secuencia nativa puede ser un PRO10282 de secuencia nativa maduro o de longitud completa que comprende los aminoácidos 1 a 667 de la figura 2 (SEC ID NO: 2). El polipéptido PRO10282 de secuencia nativa puede ser un polipéptido PRO19578 maduro o de longitud completa que comprende los aminoácidos 1 a 658 de SEC ID NO: 5, que se cree que es una forma de corte y empalme alternativa del polipéptido PRO10282 de secuencia nativa de Sec Id No. 2. Además, mientras que los polipéptidos PRO10282 descritos en la figura 2 (SEC ID NO: 2) y en la Figura 7, SEC ID NO: 5 se muestran que empiezan con el residuo de metionina designado aquí como aminoácido de posición 1, es concebible y posible que otro residuo de metionina localizado en dirección 5' o dirección 3' de la posición de aminoácido en la figura 2 (SEC ID NO: 2) o en la figura 7 (SEC ID NO: 5) se pueda utilizar como residuo de aminoácido de partida para el polipéptido PRO10282. Todas las moléculas Stra6 que se pueden cortar y empalmar de forma alternativa en su extremo 5' están incluidas específicamente en la definición de la presente invención.
El "dominio extracelular" o "ECD" del polipéptido PRO10282 (stra6) o hace referencia a una forma del polipéptido PRO10282 (Stra6) que es esencialmente libre de los dominios transmembrana y citoplasmático. Generalmente, un ECD del polipéptido PRO10282 tendrá menos de aproximadamente un 1% de dichos dominios transmembrana y/o citoplasmáticos y preferentemente, tendrá menos de aproximadamente un 0,5% de dichos dominios. Se entenderá que cualquier dominio transmembrana identificado para los polipéptidos PRO10282 de la presente invención se identifican siguiendo los criterios utilizados habitualmente en la materia para la identificación del tipo de dominio hidrofóbico. Los límites exactos de un dominio transmembrana pueden variar, pero probablemente en no más de 5 aminoácidos por cualquier extremo del dominio tal como inicialmente se identificó. Por tanto, en una realización de la presente invención, el dominio extracelular de un polipéptido PRO10282 comprende los aminoácidos 1 a X, donde X es cualquier aminoácido desde el aminoácido 49 a 59 de la figura 2 (SEC Id No. 2) o de la figura 7 (SEC ID NO: 5).
"Polipéptido variante de PRO10282" o "polipéptido variante de Stra6", cuyos términos se utilizan indistintamente, significa un polipéptido PRO10282 (Stra6) activo tal como se define a continuación que tiene por lo menos aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de (a) residuos 1 a 667 del polipéptido PRO10282 mostrado en la figura 2 (SEC ID No. 2) o residuos 1 a 658 de la figura 7 (SEC Id No. 5), (b) 1 a X de la figura 2 (SEC Id No. 2) o la figura 7 (SEC ID No. 5), donde X es cualquier aminoácido del aminoácido 49 al aminoácido 59 de la figura 2 (SEC ID No. 2) o de la figura 7 (SEC ID No. 5) o (c) otro fragmento específicamente derivado de la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEC ID No. 2) o la figura 7 (SEC ID No 5). Dichos polipéptidos variantes de PRO10282 incluyen, por ejemplo, polipéptidos PRO10282 (Stra6) en los que uno o más residuos de aminoácidos se añaden, o delecionan, en los extremos N y/o C-terminal, así como en uno o más dominio internos de la secuencia de la figura 2 (SEC ID No. 2) o la figura 7 (SEC ID No. 5). Normalmente, un polipéptido variante de PRO10282 tendrá por lo menos aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 81% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 82% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 83% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 84% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 85% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 86% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 87% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 88% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 89% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 91% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 92% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 93% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 94% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 95% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 96% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 97% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 98% de identidad en la secuencia de aminoácidos, y aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 99% de identidad en la secuencia de aminoácidos con (a) los residuos 1 a 667 del polipéptido PRO10282 mostrado en la figura 2 (SEC ID No. 2) o los residuos 1 a 658 del polipéptido PRO19578 de la figura 7 (Sec Id No. 5), (b) 1 a X de la figura 2 (SEC Id No. 2) o la figura 7 (SEC ID No. 5), donde X es cualquier aminoácido de aminoácido 49 al aminoácido 59 de la figura 2 (SEC ID No. 2) o la figura 7 (SEC ID No. 5), o (c) otro fragmento específicamente derivado de la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEC ID No. 2) o la figura 7 (SEC ID No. 5). Los polipéptidos variantes de PRO10282 no comprenden la secuencia del polipéptido PRO10282 nativo. Normalmente, los polipéptidos variantes de PRO10282 tienen por lo menos aproximadamente 10 aminoácidos de longitud, frecuentemente por lo menos aproximadamente 20 aminoácidos de longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 30 aminoácidos de longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 40 aminoácidos de longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 60 aminoácidos de longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 70 aminoácidos de longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 80 aminoácidos de longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 90 aminoácidos de longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 150 aminoácidos de longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 200 aminoácidos de longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 250 aminoácidos de longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 300 aminoácidos de longitud, o más, y son diferentes de los fragmentos de la secuencia de Stra6 murina, descrita en Bouillet et al., Mechanisms of Development 63, 173-186 (1997). Las variantes de otros polipéptidos descritos en la presente invención se definen de manera análoga.
El "porcentaje (%) de identidad en la secuencia de aminoácidos" se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos con los residuos de aminoácidos en una secuencia de referencia (por ejemplo, polipéptido nativo), después de la alineación de las secuencias y la introducción de espacios, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad en la secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de la secuencia. La alineación con el objetivo de determinar el porcentaje de identidad en la secuencia de aminoácidos se puede conseguir de varias maneras que están dentro de la técnica, por ejemplo, utilizando software informático disponible públicamente, tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir el máximo de alineamiento sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Para los objetivos de la presente invención, sin embargo, los valores en % de la identidad en la secuencia de aminoácidos se obtienen tal como se describe a continuación utilizando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2, en el que el código fuente completo para el programa ALIGN-2 se proporciona en las figuras 4A-Q. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 era propiedad de Genentech, Inc. y el código fuente mostrado en las figuras 4A-Q se ha presentado con la documentación del usuario en la U.S. Copyright Office, Washington D.C. 20559, donde está registrado bajo el U.S. Copyright Registration No. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente mediante Genentech Inc., South San Francisco, California o se puede compilar a partir del código fuente proporcionado en las figuras 4A-Q. El programa ALIGN-2 debería compilarse para su utilización en un sistema operativo UNIX, preferiblemente UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de las secuencias son fijados en el programa ALIGN-2 y no varían.
Para los objetivos de la presente invención, el % de identidad en la secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos determinada A a, con, o contra una secuencia de aminoácidos determinada B (que se puede escribir alternativamente como una secuencia de aminoácidos determinada A que tiene o comprende un cierto % de identidad en la secuencia de aminoácidos a, con, o contra una secuencia de aminoácidos determinada B) se calcula tal y como se indica a continuación:
100 veces la fracción X/Y
donde X es el número de residuos de aminoácidos identificados como emparejamientos idénticos por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en dicha alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos de aminoácidos en B. Se comprenderá que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad en la secuencia de aminoácidos de A a B no será igual al % de identidad en la secuencia de aminoácidos de B a A. Como ejemplos de los cálculos del % de identidad en la secuencia de aminoácidos, las figuras 3A-B demuestran cómo calcular el % de identidad en la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos denominada "Proteína de comparación" a la secuencia de aminoácidos denominada "PRO".
A menos que se afirme específicamente lo contrario, todos los valores del % de identidad en la secuencia de aminoácidos utilizados en la presente invención se obtienen tal y como se describe anteriormente utilizando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. Sin embargo, el % de identidad en la secuencia de aminoácidos también se puede determinar utilizando el programa de comparación de secuencias NCI-BLAST-2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997)). El programa de comparación de secuencias NCI-BLAST2 se puede descargar de http://www.ncbi.nlm.nih.gov. NCI-BLAST2 utiliza diversos parámetros de búsqueda, donde todos estos parámetros de búsqueda se fijan a los valores por defecto, incluyendo, por ejemplo, "unmask (desenmascarado) = yes (sí)", "strand (hebra) = all (todas)", "expected occurrences (sucesos esperados) = 10", "minimum low complexity length (longitud mínima de complejidad baja) = 15/5", "multi-pass e-value (e-valor de multipaso) = 0,01", "constant for multi-pass (constante de multi-paso) = 25", "dropoff for final gapped alignment (disminución para alineación con espacios final) = 25" y "scoring matrix (matriz de puntuación) = BLOSUM 62".
En las situaciones en las que se utiliza NCBI-BLAST2 para comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad en la secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos determinada A a, con, o contra una secuencia de aminoácidos determinada B (que se puede escribir alternativamente como una secuencia de aminoácidos determinada A que tiene o comprende un cierto % de identidad en la secuencia de aminoácidos a, con, o contra una secuencia de aminoácidos determinada B) se calcula tal y como se indica a continuación:
100 veces la fracción X/Y
donde X es el número de residuos de aminoácidos identificados como emparejamientos idénticos por el programa de alineación de secuencias NCBI-BLAST2 en dicha alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos de aminoácidos en B. Se comprenderá que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad en la secuencia de aminoácidos de A a B no será igual al % de identidad en la secuencia de aminoácidos de B a A.
Los términos "ligando 4-1BB" y "4-1BBL" se utilizan indistintamente y se refieren a una proteína de membrana de secuencia nativa que pertenece a la superfamilia de los factores de necrosis tumoral, habitualmente expresada en células que presentan antígenos, y sus variantes. El ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos deducidas de un ligando 4-1BB humano nativo se describen en Zhou et al, Immunol Lett 45: 67-73 (1995). Las variantes en la secuencia de aminoácidos de los ligandos 4-1BB de secuencia nativa se definen en la analogía de la proteína stra6 descrita anteriormente, utilizando el mismo algoritmo para determinar la identidad de secuencia. Se ha observado que los anticuerpos para el receptor de 4-1BBL (4-1BB) pueden erradicar los tumores establecidos en ratones y el mecanismo de estimulación de células T de 4-1BB está implicado en la amplificación de una respuesta inmune antitumoral.
El término "efrina b1" se utiliza en la presente invención para describir las moléculas de efrina b1 de secuencia nativa (también conocidas como "lerk2") y sus variantes, que se definen al igual que antes para Stra6. La efrina b1 humana es un polipéptido glicosilado de 346 aminoácidos de 45 kDa, que contiene una secuencia señal de 24 aminoácidos, una región extracelular de 211 aminoácidos, una región transmembrana (TM) de 26 aminoácidos, y un segmento citoplasmático de 83 aminoácidos (Davis, et al., Science 266: 816 (1994); Beckmann, et al., EMBO J 13: 3657 (1994)). Existe una identidad en la secuencia de aminoácidos de aproximadamente un 95% entre las regiones extracelulares de los polipéptidos de efrina b1 de ratón y humana. Se ha identificado un potencial sitio de división proteolítica en la efrina b1 (Beckmann et al., supra). El papel de las efrinas en la angiogénesis y en el progreso tumoral se describe, por ejemplo, en L'Allemain et al., Bull Cancer 87: 529-530 (2000).
Los términos "ISLR", "superfamilia de inmunoglobulina que contiene una repetición rica en leucina", y "superfamilia de inmunoglobulina que contiene LRR", se utilizan indistintamente, y se refiere a proteínas ISRL de secuencia nativa y sus variantes, tal como se ha descrito anteriormente. La clonación y secuenciación de una ISLR humana nativa fue descrita por Nagasawa et al., Genomics 44: 173-179 (1997). Más genes de ISLR humana y de ratón se describen en Nagasawa et al., Genomics 61: 37-43 (1999).
Los términos "autotaxina" y "ATX" se utilizan indistintamente, y se refieren a moléculas de autotaxina de secuencia nativa de cualquier especie animal, y variantes de autotaxina, tal como se ha descrito anteriormente en la presente invención. La autotaxina es un factor de motilidad autocrino relacionado con el cáncer, que muestra una homología significativa con el antígeno de diferenciación de la membrana de células plasmáticas PC-1. La autotaxina humana es una glicoproteína de 915 aa y 125 kDa aislada originalmente de una línea celular de melanoma humano (Murata et al., J Biol Chem 269: 30479-84 (1994)). La clonación de la autotaxina de células de teratocarcinoma humano se ha descrito por Lee et al, Biochem Biophys Res Commun 218: 714-719 (1996). Se ha descrito que la autotaxina cataliza la hidrólisis del enlace fosfodiéster en cualquier parte de la beta-fosfato de ATP y también que cataliza la hidrólisis de GTP a GDP y GMP, de AMP o Ppi a Pi, y la hidrólisis de NAD a AMP. Cada uno de estos sustratos puede servir como dador de fosfato en la fosforilación de autotoxina. Se cree que la autotoxina es un potente motógeno tumoral, lo cual aumenta el potencial invasivo y metastático de las células ras-transformadas (Nam et al., Oncogene 19: 241-247 (2000)).
El término "retinoide" se utiliza en el sentido más amplio e incluye específicamente, sin limitación, ácido retinoico (también conocido como tretinoína, vitamina A ácida o vitamina A1) y derivados de ácido retinoico que consisten en cuatro unidades de isoprenoide unidos de una manera de cabeza con cola, tal como retinol, retinal, retinoides sustituidos, seco-, nor- y retro-retinoides. Todos los retinoides pueden derivar formalmente de un compuesto parental monocíclico que contiene cinco dobles enlaces carbono-carbono y un grupo funcional en el extremo de la parte acíclica. Para la nomenclatura de los retinoides, véase Moss, G.P., Arch. Biochem. Biophys., 224: 728-731 (1983); Eur. J. Biochem., 129: 1-5 (1982); J. Biol. Chem., 258: 5329-5333 (1983); Pure Appl. Chem., 55: 721-726 (1983); Biochemical Nomenclature and Related Documents, 2nd edition, Portland Press, 1992, pages 247- 251. El término "retinoide" incluye específicamente molécula que parecen en la naturaleza y sus derivados, siempre y cuando mantengan la actividad biológica de retinoide.
El término "actividad biológica de retinoide", tal como se define aquí, se refiere a la implicación en la embriogénesis, la proliferación celular (epitelial), la diferenciación celular y/o la carciogénesis, especialmente el efecto oncogénico asociado con cánceres caracterizados por una señalización de Wnt aberrante.
El término "Wnt" se refiere a una familia de glicoproteínas secretadas, ricas en cisteína, altamente conservadas que están implicadas en aspectos críticos del desarrollo embrionario temprano. Los genes de Wnt también están implicados en el cáncer. "Wnt" tal se utiliza en la presente invención, incluye específicamente genes de Wnt de todas las especies animales humana y no humanas, incluyendo, pero sin limitación, mamíferos, tales como humanos, ratones, ratas y otros roedores, etc. El término "Wnt" incluye específicamente genes de Wnt humanos nativos y los polipéptidos codificados, incluyendo Wnt-1 humano (previamente denominados int-1) (van Ooyen et al., EMBO J 4: 2905-9 (1985)); Wnt-2 (previamente denominado Dint-1) (Wainwright et al., EMBO J 7: 1743-1748 (1988)); Wnt-13 (Katoh et al., Oncogene 13: 873-876 (1996)); Wnt-3 (Roelink et al., Genomics 17: 790-792 (1993)); Huguet et al., Cancer Res 54: 2615-2521 (1994)); Wnt-4 (Huguet et al., 1994, supra); Wnt-5A (Clark et al., Genomics 18: 249-260 (1993)); Wnt-6 (Rankin et al., Cytogenet Cell Genet 84: 50-52 (1999)); Wnt-7A (Ikegawa et al., Cytogenet Cell Genet 74: 149-152 (1996)); Wnt-7B (Huguet et al., 1994, supra); Wnt-8B (Lako et al., Genomics 35:386- 388 (1996)); Wnt-10B (Bui et al., Oncogene 14:1249-1253 (1997)); Wnt-11 (Lako et al., Gene 219: 101-110 (1998)); Wnt-14 (Bergstein et al., Genomics 46: 450-458 (1997)); y Wnt-16 (McWhirter et al., Proc Natl Acad Sci USA 96: 11464-11469 (1999); Fear et al., Biochem Biophys Res Commun 278: 814-820 (2000)), y sus variantes, en particular variantes de secuencias de aminoácidos, que tienen por lo menos aproximadamente un 80%, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 85%, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 90%, incluso más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 95%, incluso más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 98%, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 99% de identidad en la secuencia de aminoácidos con un polipéptido Wnt nativo, donde la identidad en la secuencia se determina tal como se ha definido anteriormente. En una realización preferida, el término "Wnt" se refiere a cualquier polipéptido Wnt transformante (oncogénico), tal como se describe en Wong et al., Mol Cell Biol 14: 6278-86 (1994).
Un cáncer está "caracterizado por una señalización de wnt aberrante" si alberga defectos genéticos y/o muestra patrones de expresión alterada (incluyendo mutaciones, amplificación, sobreexpresión y/o supresión) de cualquier miembro de un mecanismo de señalización de Wnt. Wnts ejercen sus efectos a través de la interacción con los receptores de la superficie celular, denominados "Frizzled". Estructuralmente, los receptores Frizzled presentan un dominio de unión a Wnt extracelular, siete regiones transmembrana y una cola C-terminal intracelular. Los componentes adicionales del mecanismo de interacción receptor Frizzled-Wnt son inhibidores de Wnt solubles que consisten en proteínas secretadas que contienen un dominio rico en cisteína (CRD) similar al de un dominio de unión a ligando de los receptores Frizzled. A las proteínas inhibidoras de Wnt se les refiere colectivamente como Proteínas de tipo Receptor Frizzled (FRPs). Dado que los receptores Frizzled no presentan motivos enzimáticos en sus dominios intracelulares, se cree que las señales de Wnt se transmiten a través del receptor que se acopla a proteína Dishevelled (dsh). La siguiente etapa en la cascada de señalización de Wnt es la inhibición de la serina/treonina quinasa, glicógeno sintetasa quinasa-3b (GSK-3b) por Dishevelled. La consecuencia de la inhibición inducida por Wnt de la actividad de GSK-3b es que se estabiliza la siguiente proteína en la cascada, \beta-catenina. La región central de la proteína \beta-catenina contiene un surco cargado positivamente que se cree que interacciona con regiones ácidas en la proteína codificada por el locus de poliposis adenomatosa coli (APC), el factor de transcripción TLF/LEF1, y la familia de la cadherina de moléculas de adhesión celular dependiente del calcio. Los miembros del mecanismo de señalización de Wnt, incluyendo APC y \beta-catenina, están implicados en la patogénesis de una serie de cánceres humanos, incluyendo cáncer de colon, cáncer de mama, cánceres hepatocelulares, y melanoma (Morin et al., Science 275: 1787-1790 (1997)). Las mutaciones en regiones específicas de cualquier gen provocan la estabilización y acumulación de \beta-catenina citoplasmática, que se cree que contribuye a la carcinogénesis humana mediante la activación de genes diana, tales como los genes WISP (Pennica et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 14717-14722 (1998)). Las mutaciones en el gen de Wnt-1 están también implicadas en el desarrollo de los tumores de Wilm, un cáncer de riñón hallado en niños. Tal como se ha descrito anteriormente, los miembros adicionales del mecanismo de señalización de Wnt incluyen, sin limitación, otros miembros de la familia de genes de Wnt, receptores Frizzled, la proteína citoplasmática Dishevelled (Dsh), glicógeno sintasa quinasa-3\beta (GSK-3\beta), el factor de transcripción TCFILEF1, y los componentes del mecanismo en cascada activados trancripcionalmente, tales como el gen 3 relacionado con nodal, los genes Xnr3, genes homeobox, engrailed, goosecoid, twin (Xtwn), y siamois, c-myc, y los genes de WISP, por ejemplo, WISP-1 y WISP-2. El término "caracterizado por una señalización de Wnt aberrante" incluye defectos genéticos y/o patrones de expresión alterada (incluyendo mutaciones, amplificación, sobreexpresión y/o supresión) de cualquiera de estos miembros del mecanismos de señalización de Wnt, o cualquier otro miembro, conocido actualmente o identificados posteriormente aquí.
El aumento de la expresión de un antígeno en un tumor, por ejemplo, cáncer, es "selectivo", si el aumento del nivel de expresión de dicho antígeno en células tumorales es significativamente superior que en células normales. Preferiblemente, el aumento del nivel de expresión de un antígeno diana (por ejemplo, un antígeno de la superficie celular) en células tumorales da lugar a por lo menos aproximadamente tres veces, incluso más preferiblemente por lo menos aproximadamente cinco veces, más preferiblemente por lo menos aproximadamente diez veces de sobreexpresión en células o tejidos tumorales en relación con las células o tejidos correspondientes normales (no tumorigénicos).
"Tumor", tal como se utiliza aquí, se refiere al crecimiento y proliferación de células neoplásicas, tanto malignas como benignas, y todas las células y tejidos precancerosas y cancerosas.
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen la afección fisiológica en mamíferos que se caracteriza habitualmente por un crecimiento celular no regulado. Ejemplos de cáncer incluyen, pero sin limitación, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen el cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer de pulmón de célula no pequeña, cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, glioblastoma, cáncer de cérvix, cáncer de ovarios, cáncer hepático, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio, carcinoma de glándulas salivares, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello. Los cánceres particularmente susceptibles de tratamiento según la presente invención incluyen cáncer de ovario, cáncer de endometrio, tumor de riñón de Wilm, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer gástrico, cáncer de pulmón, cáncer hepatocelular, y melanoma.
"Tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas, donde el objetivo es prevenir o ralentizar (disminuir) la afección o trastorno patológico reconocido. Entre los necesitados del tratamiento se incluyen aquellos que ya tienen el trastorno, así como aquellos que son propensos a tener el trastorno o aquellos en los que se previene el trastorno. En el tratamiento de un tumor (por ejemplo, un cáncer), un agente terapéutico puede disminuir directamente la patología de las células tumorales, o convertir el tumor en más susceptible al tratamiento por otros agentes terapéuticos, por ejemplo, la radiación y/o la quimioterapia.
La "patología" del cáncer incluye todos los fenómenos que comprometen el bienestar del paciente. Esto incluye, sin limitación, un crecimiento celular anormal o incontrolado, metástasis, interferencia con el funcionamiento normal de las células vecinas, la liberación de citoquinas u otros productos secretores a niveles anormales, la supresión o el agravamiento de la respuesta inflamatoria o inmunológica, etc.
Administración "crónica" se refiere a la administración del agente o agentes de un modo continuo en oposición a un modo agudo, para mantener el efecto (actividad) terapéutica inicial durante un periodo de tiempo largo. Administración "intermitente" es el tratamiento que no se realiza consecutivamente sin interrupción, sino que es cíclico por naturaleza.
El término "mamífero" con el propósito de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo el hombre y otros animales superiores, animales domésticos y de granja, y animales del zoo, deportivos o de compañía, tales como perros, gatos, ganado, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos etc. Preferiblemente, el mamífero es el hombre.
La administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales, o "coadministración", cuyos términos se utilizan indistintamente, incluye la administración simultánea (a la vez) y la administración consecutiva en cualquier orden.
"Anticuerpos" (Abs) e "inmunoglobulinas" (Igs) son glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Aunque los anticuerpos muestran una especificidad de unión por un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas de tipo anticuerpo que carecen de especificidad de antígeno. Los polipéptidos de este último tipo son, por ejemplo, producidos a niveles bajos por el sistema linfático y a niveles elevados por mielomas.
"Anticuerpos e inmunoglobulinas nativas" son habitualmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera se une a una cadena pesada mediante un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de uniones disulfuro varía entre las cadenas pesadas de isotipos de inmunoglobulinas diferentes. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro entre cadenas regularmente separadas. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de un grupo de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que los residuos de aminoácidos particulares forman una interfase entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada (Chothia et al., J. Mol. Biol. 186: 651 [1985]; Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 4592 [1985]; Chothia et al., Nature 342: 877-883 [1989]).
El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas partes de los dominios variables difieren extensamente en la secuencia entre los anticuerpos y se utilizan en la unión y la especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida uniformemente entre los dominios variables de los anticuerpos. Está concentrada en tres segmentos denominados regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) o regiones hipervariables tanto en los dominios variables de cadena ligera como de cadena pesada. Las partes más altamente conservadas de los dominios variables se denominan las regiones de armazón ("framework") (FR). Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan mayoritariamente una configuración en lámina \beta, conectadas por las tres CDRs, que forman bucles de conexión y en algunos casos forman parte de la estructura en lámina \beta. Las CDRs en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por medio de las regiones FR y, con las CDRs de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al., (1991) supra). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo con el antígeno, pero presentan diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente del anticuerpo.
Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrados pueden asignarse a uno de los dos tipos claramente distintos, denominados kappa (K) y lambda (\lambda), según las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.
Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varios de éstos se pueden dividir en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3}, IgG_{4}, IgA_{1}, e IgA_{2}. Los dominios constantes de las cadenas pesadas que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan \delta, \varepsilon, \gamma y \mu, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.
El término "anticuerpo" incluye todas las clases y subclases de inmunoglobulinas intactas. El término "anticuerpo" también abarca fragmentos de anticuerpos. El término "anticuerpo" abarca específicamente anticuerpos monoclonales, incluyendo clones de fragmentos de anticuerpos.
Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una parte de un anticuerpo intacto que contiene la región de unión el antígeno o región variable del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen Fab, Fab', F(ab')_{2} y los fragmentos Fv; los diabodies; moléculas de anticuerpos de cadena única, incluyendo moléculas Fv de cadena única (scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
El término "anticuerpo monoclonal", tal como se utiliza aquí, se refiere a un anticuerpo (o fragmento de anticuerpo) obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos a excepción de posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en pequeñas cantidades. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, ya que están dirigidos contra un único sitio antigénico. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales), que incluyen habitualmente anticuerpos diferentes dirigidos contra determinantes (epítopos) diferentes, cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales presentan la ventaja de que son sintetizados por el cultivo de hibridomas, y no están contaminados por otras inmunoglobulinas. El calificativo "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo al obtenerse de una población esencialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse que se requiere un procedimiento particular para su producción. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se usan de acuerdo con la presente invención pueden obtenerse por el procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 256:495 [1975], o por procedimientos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también incluyen clones de fragmentos de anticuerpos (clones Fv) que contienen sitios de unión de reconocimiento y unión a antígeno aislados de bibliotecas de anticuerpos en fagos usando las técnicas descritas en Clackson y et al., Nature, 352:624-628 [1991] y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por ejemplo.
Los anticuerpos monoclonales de la presente invención incluyen específicamente anticuerpos (inmunoglobulinas) "quiméricos" en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes de anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase particular de anticuerpo, mientras el resto de la cadena o cadenas es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes de anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos particulares, así como los fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que muestren la actividad biológica deseada (Patente de Estados Unidos No. 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 6851-6855 [1984]).
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de éstas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2}) u otras subsecuencias de unión a antígeno de los anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Para la mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpos receptores) en los que los residuos de parte o toda de una región determinante de la complementariedad (CDR) del receptor son sustituidos por los residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo dador), tal como de ratón, rata o conejo, con la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de armazón (FR) de Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los correspondientes residuos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de CDR o armazón importadas. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente y optimizar la acción del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de por lo menos uno, y habitualmente dos, dominios variables, en que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente por lo menos una parte de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, habitualmente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986), Reichmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992); y Clark. Immunol. Today 21: 397-402 (2000). El anticuerpo humanizado incluye un anticuerpo PRIMATIZADO^{TM} en el que la región de unión al antígeno deriva de un anticuerpo producido por inmunización de monos macacos con el antígeno de interés.
Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena única" o "sFv" comprenden los dominios V_{H} y V_{L} del anticuerpo, en los que estos dominios están presentes en una única cadena de polipéptido. Preferiblemente, el polipéptido scFv comprende además un polipéptido enlazador entre los dominios V_{H} y V_{L} que permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de sFv véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, páginas 269-315 (1994), Dall'' Acqua y Carter, Curr. Opin. Struct. Biol. 8: 443-450 (1998), y Hudson, Curr. Opin. Immunol. 11: 548-557 (1999).
El término "diabodies" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena ligera (V_{L}) en la misma cadena de polipéptido (V_{H}-V_{L}). Utilizando un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crean dos sitios de unión a antígeno. Los diabodies se describen más detalladamente en, por ejemplo, EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993).
Un anticuerpo "aislado" es aquel que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su medio natural. Los componentes contaminantes de su medio natural son materiales que interferirían con las utilizaciones de diagnóstico y terapéuticas del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteináceos y no proteináceos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificará (1) hasta más de un 95% en peso de anticuerpo según se determina por el método de Lowry, y más preferiblemente más de un 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante la utilización de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de las células recombinantes ya que por lo menos un componente del medio natural del anticuerpo no estará presente. Normalmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará mediante por lo menos una etapa de purificación.
Por "anticuerpo neutralizante" se entiende una molécula de anticuerpo que es capaz de eliminar o reducir significativamente una función efectora de un antígeno diana al que se une.
"Portadores" tal como se utiliza aquí, incluyen los portadores, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables, que no son tóxicos a la célula o al mamífero que se expone a dicho portador en las dosificaciones y concentraciones utilizadas. A menudo, el portador fisiológicamente aceptable es una solución acuosa de pH tamponado. Ejemplos de portadores aceptables fisiológicamente incluyen tampones como los fosfatos, el citrato, y otros ácido orgánicos; los antioxidantes incluyendo el ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (inferiores a aproximadamente 10 residuos); proteínas, como la albúmina sérica, la gelatina o las inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como la polivinilpirrolidona; aminoácidos como la glicina, la glutamina, la asparagina, la arginina o la lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo la glucosa, la manosa, o las dextrinas; los agentes quelantes como el EDTA; los alcoholes de azúcar como el manitol o el sorbitol; los contraiones formadores de sales como el sodio; y/o los tensoactivos no iónicos como el TWEEN^{TM}, el polietilenglicol (PEG) y el PLURONICS^{TM}.
La palabra "marcador", cuando se usa aquí, se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente al anticuerpo para generar un anticuerpo "marcado". El marcador puede ser detectable por sí mismo (por ejemplo, marcadores radioisotópicos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición sustrato que son detectables.
Por "fase sólida" se entiende una matriz no acuosa a la que se puede adherir el anticuerpo de la presente invención. Ejemplos de fases sólidas comprendidas en la presente invención incluyen aquellas formadas parcial o completamente de vidrio (por ejemplo, vidrio de poro controlado), de polisacáridos (por ejemplo, agarosa), de poliacrilamidas, de poliestireno, de polivinil alcohol y de siliconas. En ciertas realizaciones, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pocillo de una placa de ensayo; en otras, es una columna de purificación (por ejemplo, una columna de cromatografía por afinidad). Este término también incluye una fase sólida discontinua de partículas discretas, tal como las descritas en la patente de Estados Unidos no. 4.275.149.
Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensoactivos que es útil para la liberación de un fármaco (tal como un polipéptido PRO10282 o anticuerpo para el mismo) a un mamífero. Los componentes del liposoma se disponen habitualmente en una formación de bicapa, similar a la disposición de los lípidos de las membranas biológicas.
Una "molécula pequeña" se define aquí con un peso molecular por debajo de aproximadamente 500 Daltons.
El término "favorecer la expresión" se utiliza en el sentido más amplio y se refiere a la inducción y/o aumento de la expresión génica medida, por ejemplo, mediante cuantificación de niveles de ARNm.
Las frases "amplificación génica" y "duplicación génica" se utilizan indistintamente y se refieren a un proceso mediante el cual se forman múltiples copias de un gen o fragmento de gen en una célula o línea celular particulares. A la región duplicada (un tramo de ADN amplificado) se hace referencia a menudo como "amplicón". Normalmente, la cantidad de ARN mensajero (ARNm) producido, es decir, el nivel de expresión génica, también aumenta en la proporción del número de copias realizadas del gen particular expresado.
El término "agente antitumoral" o "agente anticanceroso" se utiliza en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula útil en el tratamiento del cáncer. Dichas moléculas incluyen, sin limitación, polipéptidos (incluyendo proteínas), tales como anticuerpo, péptidos, moléculas pequeñas orgánicas e inorgánicas, moléculas de ADN y ARN, etc.
El término "agente citotóxico" tal como se utiliza aquí hace referencia a una sustancia que inhibe o previene la función de las células y/o causa la destrucción de las células. Sin limitación, el término pretende incluir isótopos radioactivos (por ejemplo, I^{131}, I^{125}, Y^{90} y Re^{186}), agentes quimioterapéuticos, y toxinas, tales como las toxinas activas enzimáticamente derivadas de bacterias, hongos, plantas o animales o fragmentos de los mismos. El término incluye específicamente maitansinas y maitansinoides, BCNU, estreptozoicina, vincristina y la familia de agentes descrita en las Patentes de Estados Unidos Nos. 5.053.395 y 5.770.710, así como la esperamicina (Patente de Estados Unidos No. 5.877.296).
Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen adriamicina, doxorubicina, epirubicina, 5-fluorouracilo, citosina arabinósido ("Ara-C"), ciclofosfamida, tiotepa, busulfán, citoxina, taxoides, por ejemplo, paclitaxel (Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ), y doxetaxel (Taxotero, Rhone-PoulencRorer, Antony, Francia), toxotero, metotrexato, cisplatino, melfalan, vinblastina, bleomicina, etopósido, ifosfamida, mitomicina C, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, carboplatino, tenipósido, dauromicina, carminomicina, aminopterina, dactinomicina, mitomicinas, esperamicinas (véase la patente de Estados Unidos No. 4.675.187), 5-FU, 6-tioguanina, 6-mercaptopurina, actinomicina D, VP-16, clorambucil, melfalan y otras mostazas nitrogenadas relacionadas. También se incluyen en esta definición agentes hormonales que actúan para regular o inhibir la acción de las hormonas sobre los tumores, tales como el tamoxifeno y la onapristona.
Un "agente inhibidor del crecimiento", cuando se utiliza aquí, se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente de células cancerosas que sobreexpresan cualquiera de los genes aquí identificados, ya sea in vitro o in vivo. Por tanto, el agente inhibidor del crecimiento es aquel que reduce significativamente el porcentaje de células que sobreexpresan dichos genes en la fase S. Ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un momento distinto a la fase S), tales como agentes que inducen la detención en fase G1 y fase M. Los bloqueantes típicos de fase M incluyen las vincas (vincristina y vinblastina), taxol, y los inhibidores de la topo II, tal como la doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etopósido y bleomicina. Estos agentes que bloquean la fase G1 también afectan a la detención en la fase S, por ejemplo, los agentes alquilantes del ADN, tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo, y ara-C. Puede hallarse información adicional en The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo 1, titulado "Cell Cycle Regulation, oncogens and antineoplastic drugs" por Murakami y et al., (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente en la página 13.
La "doxorubicina" es un antibiótico de antraciclina. El nombre químico completo de la doxorubicina es (8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-tridesoxi-\alpha-L-lixo-hexapiranosil)oxi]-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,11-trihidroxi-8-(hidroxiacetil)-1-metoxi-5,12-naftacenodiona.
El término "citoquina" es un término genérico para las proteínas liberadas por una población celular que actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de dichas citoquinas son las linfocinas, las monoquinas y las hormonas polipeptídicas tradicionales. Se incluyen entre las citoquinas, la hormona del crecimiento, tal como la hormona del crecimiento humano, la hormona N-metionil del crecimiento humano y la hormona del crecimiento bovino; la hormona paratiroidea; la tiroxina; la insulina; la relaxina; la prorelaxina; las hormonas glicoproteicas, tales como la hormona estimulante del folículo (FSH), la hormona estimuladora de la tiroides (TSH), y la hormona luteinizante (LH); el factor de crecimiento hepático, el factor de crecimiento de fibroblastos; la prolactina; el lactógeno placentario; el factor \alpha y \beta de necrosis tumoral; la sustancia inhibidora mülleriana; el péptido asociado a la gonadotropina de ratón; la inhibina; la activina; el factor de crecimiento endotelial vascular; la integrina; la trombopoyetina (TPO); los factores de crecimiento nervioso, tales como NGF-\beta; el factor de crecimiento de plaquetas; los factores de crecimiento transformantes (TGFs), tales como TGF-\alpha y TGF-\beta; los factores I y II de crecimiento de tipo insulina; la eritropoyetina (EPO); los factores osteoinductivos; los interferones, tales como los interferones \alpha, \beta y \gamma, los factores estimuladores de colonias (CSFs), tales como el CSF de macrófagos (M-CSF); el CSF de granulocitos-macrófagos (GM-CSF); y el CSF de granulocitos (G-CSF); las interleuquinas (ILs), tales como la IL-1, la IL-1 a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; un factor de necrosis tumoral, tal como TNF-\alpha o TNF-\beta; y otros factores polipeptídicos incluyendo el LIF y el ligando kit (KL). Tal como se utiliza aquí, el término citoquina incluye proteínas de fuentes naturales o del cultivo de células recombinantes y los equivalentes biológicamente activos de las citoquinas de secuencia nativa.
El término "profármaco", tal como se utiliza en esta solicitud, se refiere a un precursor o forma derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica para las células tumorales en comparación con el fármaco parental y es capaz de ser activado enzimáticamente o convertido en la forma parental más activa. Véase, por ejemplo, Willman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy, Biochemical Society Transactions", 14:375-382, 615th Meeting, Belfast (1986), y Stella y et al., "Prodrugs: A Chemical approach to targeted drug delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt y et al., (ed.) pág. 147-267, Humana Press (1985). Los profármacos de la presente invención incluyen, pero sin limitación, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiosfosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos modificados por D-aminoácidos, profármacos glicosilados, profármacos que contienen \beta-lactama, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que pueden convertirse en el fármaco libre citotóxico más activo. Ejemplos de fármacos citotóxicos que pueden derivarse en forma de profármaco para su utilización en la presente invención, pero sin limitación, son los agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente.
Una "cantidad eficaz" de un polipéptido descrito aquí o un antagonista del mismo, respecto a la inhibición del crecimiento de células neoplásicas, el crecimiento tumoral o el crecimiento de células cancerosas, es una cantidad capaz de inhibir, en cierta magnitud, el crecimiento de células diana. El término incluye una cantidad capaz de invocar un efecto inhibidor del crecimiento, citostático y/o citotóxico y/o la apoptosis de las células diana. Una "cantidad eficaz" de un polipéptido para los objetivos de inhibir el crecimiento de células neoplásicas, el crecimiento del tumor o el crecimiento de células cancerosas, puede determinarse empíricamente y de forma rutinaria.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz", en referencia al tratamiento del tumor, se refiere a una cantidad capaz de provocar uno o más de los efectos siguientes: (1) inhibición, en cierta magnitud, del crecimiento tumoral, incluyendo, la ralentización y la completa detención del crecimiento; (2) la reducción en el número de células tumorales; (3) la reducción en el tamaño del tumor; (4) la inhibición (es decir, la reducción, la ralentización o la completo detención) de la infiltración de células tumorales en los órganos periféricos; (5) la inhibición (es decir, la reducción, la ralentización o la completa detención del crecimiento) de metástasis; (6) aumento de la respuesta inmune antitumoral, que puede, aunque no necesariamente, dar como resultado la regresión o el rechazo del tumor; y/o (7) alivio, en cierta magnitud, de uno o más de los síntomas asociados con el trastorno. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente antitumoral puede determinarse empíricamente y de forma rutinaria.
Una "cantidad inhibidora del crecimiento" de un agente antitumoral es una cantidad capaz de inhibir el crecimiento de una célula, especialmente tumoral, por ejemplo, las células cancerosas, ya sea in vitro o in vivo.
Una "cantidad citotóxica" de un agente antitumoral es una cantidad capaz de causar la destrucción de una célula, especialmente tumoral, por ejemplo las células cancerosas, ya sea in vitro o in vivo. La "cantidad citotóxica" con el propósito de inhibir el crecimiento de células neoplásicas puede determinarse empíricamente y de forma rutinaria.
"Oligodesoxinucleótidos antisentido" u "oligonucleótidos antisentido) (cuyos términos se utilizan indistintamente se definen como moléculas de ácido nucleico que pueden inhibir la transcripción y/o traducción de genes diana de una manera específica de secuencia. El término "antisentido" se refiere al hecho de que el ácido nucleico es complementario a la secuencia genética codificante ("sentido") del gen diana. Los oligonucleótidos antisentido se hibridan en una orientación antiparalela con respecto a ARNm naciente a través del emparejamiento de bases de Watson-Crick. Mediante la unión del molde de ARNm diana, los oligonucleótidos antisentido bloquean la traducción satisfactoria de la proteína codificada. El término incluye específicamente agentes antisentido denominados "ribozomas" que han sido designados para inducir la división catalítica de un ARN diana mediante la adición de una secuencia que tiene actividad de auto-empalme natural (Warzocha y Wotowiec, "Antisense strategy" biological utility and prospects in the treatment of hematological malignancies." Leuk. Lymphoma 24: 267-281 [1997]).
El término "índice terapéutico" se refiere a la proporción entre la concentración tóxica y la concentración eficaz de un fármaco, tal como un anticuerpo terapéutico.
B. Descripción detallada
Tal como se ha descrito anteriormente, se han implicado varios componentes del mecanismo de señalización de Wnt en tumores humanos o modelos de cáncer experimentales. Se encontró Wnt-1 como un oncogén activado por el Virus del tumor Mamario de Ratón (MMTV) en cáncer de mama murino (Nusse y Varnus, Cell 31; 99- 109 (1982)). Otro miembro del mecanismo de Wnt, el supresor del tumor de la poliposis adenomatosa coli (APC) se aisló por primera vez en cáncer de colon (revisado en Polakis, Biochem. Biophys. Acta 1332 (3): F127-47 (1997)). Después de establecer que la APC y la \beta-catenina se unen entre sí, se observaron mutaciones activantes en el gen de \beta-catenina humano en cáncer de colon humano y melanomas (Morin et al., Science 275: 1752-53 (1997)). Para una revisión del papel de la señalización de Wnt en cáncer, véase, por ejemplo Polakis, Genes Dev. 14; 1837-51 (2000) y Bienz and Clevers, Cell 103: 311-20 (2000)).
La presente invención se refiere al aumento de la eficacia del tratamiento, tal como la inmunoterapia de tumores impulsados por la señalización de Wnt.
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1. Identificación de genes diana para el tratamiento de tumores
Las dianas de fármacos para el tratamiento de tumores se pueden identificar mediante el análisis de diferencias en la expresión génica resultante del tratamiento con retinoides de células tumorales. En particular, la presente invención se refiere a la identificación de antígenos que preferentemente favorecen la expresión mediante el tratamiento de células transformadas por Wnt con retinoides, tales como ácido retinoico, como dianas para la terapia del cáncer. Los genes dianas preferidos son aquellos que expresan proteína de superficie celular y que favorecen la expresión de manera sinérgica mediante el tratamiento con retinoides y la señalización de Wnt.
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Perfil de la expresión génica
Los métodos utilizados más habitualmente conocidos en la técnica para cuantificar la expresión de ARNm en una muestra incluyen la transferencia Northern y la hibridación in situ (Parker & Barnes, Methods in Molecular Biology 106:247-283 (1999)); los ensayos de protección de ARNasa (Hod, Biotechniques 13:852-854 (1992)); y la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) (Weis et al., Trends in Genetics 8:283-264 (1992)). Alternativamente, se pueden emplear anticuerpos que pueden reconocer cadenas dobles específicas, incluyendo las cadenas dobles de ADN, las cadenas dobles de ARN y las cadenas dobles de híbridos de ADN-ARN o las cadenas dobles de ADN-proteína.
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PCR de Transcriptasa Inversa (RT-PCR)
De las técnicas que se han mencionado anteriormente, el método cuantitativo más sensible y más flexible es la RT-PCR, que se puede usar para comparar los niveles de ARNm en poblaciones de muestras diferentes, en tejidos tumorales y normales, tratamiento con o sin fármacos para caracterizar patrones de la expresión génica, para discriminar entre los ARNm estrechamente relacionados y para analizar la estructura de ARN.
El primer paso es el aislamiento de ARNm de una muestra diana. El material de partida es habitualmente ARN total aislado de tumores humanos o de líneas de células tumorales, y los tejidos o líneas celulares normales correspondientes, respectivamente. Por lo tanto, se puede aislar el ARN de una variedad de tumores primarios, incluyendo los tumores de mama, pulmón, colon, próstata, cerebro, hígado, riñón, páncreas, brazo, timo, testículos, ovarios, útero, etc., o las líneas de las células tumorales, con el ADN extraído de donantes sanos. Si la fuente de ARNm es un tumor primario, se puede extraer el ARNm, por ejemplo, de las muestras de tejido fijados (por ejemplo, fijados a formalina) e insertados en parafina congeladas o guardadas.
Las líneas de las células tumorales incluyen, por ejemplo, las líneas de células de la carcinoma pulmonar humano, tales como A549 (SRCC768), Calu-1 (SRCC769), Calu-6 (SRCC770), H157 (SRCC771), H441 (SRCC772), H460 (SRCC773,), SKEMS-1 (SRCC774), SW900 (SRCC775), H522 (SRCC832), y H810 (SRCC833), todas disponibles de ATCC. Normalmente, las células tumorales de pulmón humano primarias provienen de adenocarcinomas, carcinomas de células escamosas, carcinomas de células grandes, carcinomas de células no pequeñas, carcinomas de células pequeñas, carcinomas bronco alveolares, e incluyen, por ejemplo, SRCC724 (adenocarcinoma, abreviado como "AdenoCa") (LT1), SRCC725 (carcinoma de células escamosas, abreviado como "SqCCa") (LT1a), SRCC726 (adenocarcinoma) (LT2), SRCC727 (adenocarcinoma) (LT3), SRCC728 (adenocarcinoma) (LT4), SRCC729 (carcinoma de células escamosas) (LT6), SRCC730 (carcinoma de células adeno/escamosas) (LT7), SRCC731 (adenocarcinoma) (LT9), SRCC732 (carcinoma de células escamosas) (LT10), SRCC733 (carcinoma de células escamosas) (LT11), SRCC734 (adenocarcinoma) (LT12), SRCC735 (carcinoma de células adeno/escamosas) (LT13), SRCC736 (carcinoma de células escamosas) (LT15), SRCC737 (carcinoma de células escamosas) (LT16), SRCC738 (carcinoma de células escamosas) (LT17), SRCC739 (carcinoma de células escamosas) (LT18), SRCC740 (carcinoma de células escamosas) (LT19), SRCC741 (carcinoma de células pulmonares, abreviada como "LCCa") (LT21), SRCC811 (adenocarcinoma) (LT22), SRCC825 (adenocarcinoma) (LT8), SRCC886 (adenocarcinoma) (LT25), SRCC887 (carcinoma de células escamosas) (LT26), SRCC888 (carcinoma adeno-BAC) (LT27), SRCC889 (carcinoma de células escamosas) (LT28), SRCC890 (carcinoma de células escamosas) (LT29), SRCC891 (adenocarcinoma) (LT30), SRCC892 (carcinoma de células escamosas) (31), SRCC894 (adenocarcinoma) (LT33). También se incluyen los tumores de pulmón humano denominados SRCC1125 [HF-001295], SRCC1127 [HF-000641], SRCC1129 [HF-000643], SRCC1133 [HF-000840], SRCC1135 [HF-000842], SRCC1227 [HF-001291], SRCC1229 [HF-001293], SRCC1230 [HF-001294], SRCC1231 [HF-001295], SRCC1232 [HF-001296], SRCC1233 [HF-001297], SRCC1235 [HF-001299], y SRCC1236
[HF-001300].
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Las líneas de células de cáncer de colon, por ejemplo, las líneas de ATCC SW480 (adenocarcinoma, SRCC776), SW620 (metástasis en nódulo linfático de adenocarcinoma de colon, SRCC777), Colo320 (carcinoma, SRCC778), HT29 (adenocarcinoma, SRCC779), HM7 (mucina elevada que produce una variante de línea de células de adenocarcinoma de colon ATCC, SRCC780, obtenido de Dr. Robert Warren, UCSF), CaWiDr (adenocarcinoma, SRCC781), HCT116 (carcinoma, SRCC782), Colo205 (carcinoma, SRCC828), HCT15 (carcinoma, SRCC829), HCC2988 (carcinoma, SRCC830), y KM12 (carcinoma, SRCC831). Los tumores de colon primarios incluyen las adenocarcinomas de colon designados CT2 (SRCC742), CT3 (SRCC743), CT8 (SRCC744), CT10 (SRCC745), CT12 (SRCC746), CT14 (SRCC747), CT15 (SRCC748), CT16 (SRCC749), CT17 (SRCC750), CT1 (SRCC751), CT4 (SRCC752), CT5 (SRCC753), CT6 (SRCC756), CT7 (SRCC755), CT9 (SRCC756), CT11 (SRCC757), CT18 (SRCC758), CT19 (adenocarcinoma, SRCC906), CT20 (adenocarcinoma, SRCC907), CT21 (adenocarcinoma, SRCC908), CT22 (adenocarcinoma, SRCC909), CT23 (adenocarcinoma, SRCC910), CT24 (adenocarcinoma, SRCC911), CT25 (adenocarcinoma, SRCC912), CT26 (adenocarcinoma, SRCC913), CT27 (adenocarcinoma, SRCC914), CT28 (adenocarcinoma, SRCC915), CT29 (adenocarcinoma, SRCC918), CT30 (adenocarcinoma, SRCC917), CT31 (adenocarcinoma, SRCC918), CT32 (adenocarcinoma, SRCC919), CT33 (adenocarcinoma, SRCC920), CT35 (adenocarcinoma, SRCC921), y CT36 (adenocarcinoma, SRCC922). También se incluyen los tumores de colon humano denominados SRCC1051 [HF-000499], SRCC1052 [HF-000539], SRCC1053 [HF-000575], SRCC1054 [HF-000698], SRCC1142 [HF-000782], SRCC1144 [HF-000769], SRCC1148 [HF-000795] y SRCC1148 [HF-000811].
Las líneas de células de carcinoma de mama humano incluyen, por ejemplo, HBL100 (SRCC759), MB435s (SRCC780), T47D (SRCC761), MB468 (SRCC762), MB175 (SRCC763), MB361 (SRCC764), BT20 (SRCC785), MCP7 (SRCC766), y SKBR3 (SRCC767), y el centro de tumor de mama humanos denominado SRCC1057 [HF-000545]. También se incluyen tumores de mama humano denominados SRCC1094, SRCC1095, SRCC1098,
SRCC1097, SRCC1098, SRCC1099, SRCC1100, SRCC1101, y tumor de mama-met-pulmón-NS humano denominado SRCC893 [LT 32].
Los centros de tumores de riñón humano incluyen SRCC989 [HF-000611] y SRCC1014 [HF-000613].
El centro de tumor de testículos humanos incluye SRCC1001 [HF-000733] y el margen del tumor de testículo SRCC989 [HF-000716].
El tumor de paratiroides humano incluye SRCC1002 [HF-000831] y SRCC1003 [HF-000832].
Los métodos para la extracción de ARNm son bien conocidos en la técnica y se describen en libros de texto estándar de biología molecular, incluyendo Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997). Los métodos para la extracción de ARN de tejidos insertados en parafina se describen por ejemplo, en Rupp and Locker, Lab Invest. 56: A67 (1987), y De Andrés et al., BioTechniques 18: 42044 (1995). En particular, el aislamiento de ARN se puede realizar utilizando un kit de purificación, un conjunto de tampones y proteasa de fabricantes comerciales, tales como Qiagen, según las instrucciones del fabricante. Por ejemplo, el ARN total de células en un cultivo se pueden aislar utilizando mini-columnas Qiagen RNeasy. El ARN total de muestras de tejido se puede aislar utilizando ARN Stat-60 (Tel-Test). El ARN preparado a partir del tumor se puede aislar, por ejemplo, mediante centrifugación con gradiente de densidad de cloruro de cesio.
La presente solicitud describe métodos para identificar genes, preferiblemente antígenos de la superficie celular, la expresión de los cuales se aumenta selectivamente mediante tratamiento con retinoides en células tumorales impulsada por la señalización de Wnt. Por consiguiente, una fuente preferida de ARNm es una muestra de tejido o línea celular derivada de un tumor, el desarrollo y/o progresión del cual está asociado con defectos en el mecanismos de señalización de Wnt. Tal como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, se han identificado mutaciones activantes en \beta-catenina en cánceres del ovario y el endometrio, tumores del riñón de Wilm y melanomas, demostrando que los defectos en la señalización de Wnt-1 contribuyen a la progresión de estos cánceres (Kobayashi et al., Jpn J Cancer Res 90: 55-9 (1999); Koesters et al., Cancer Res 59: 3880-2 (1999); Palacios and Hamallo, Cancer Res 58: 1344-7 (1998); Rimm et al. Am J Pathol 154: 325-9 (1999); Rubinfeld et al., Science 262:1731-1734 (1993); Wright et al., Int J Cancer 82:825-9 (1989)). De manera similar, ciertos cánceres colorectales se caracterizan por una señalización de Wnt-1 defectuosa. Por consiguiente, las muestras o líneas de células tumorales congeladas o insertadas en parafina de dichos tumores son una fuente preferida de ARNm para los ensayos de la obtención de perfiles de expresión de la presente invención. Alternativamente, los tumores y células normales modificadas para expresar condicionalmente un protooncogén Wnt (por ejemplo, Wnt-1) pueden ser una fuente de ARNm, antes y después del tratamiento con retinoides y en presencia o ausencia de la expresión de Wnt (por ejemplo, Wnt-1).
Como el ARN no puede servir como molde para la PCR, la primera etapa en la obtención del perfil de expresión génica mediante RT-PCR es la transcripción inversa del molde de ARN en ADNc, seguido de su amplificación exponencial en una reacción PCR. Las dos transcriptasas inversas más utilizadas habitualmente son la transcriptasa inversa del virus de amilo mieloblastosis (AMV-RT) y la transcriptasa inversa del virus de leucemia murina Moloney (MMLV-RT). La etapa de la transcripción inversa se ceba habitualmente utilizando cebadores específicos, hexámeros aleatorios o cebadores oligo.dT, dependiendo de las circunstancias y el objetivo del perfil de expresión. Por ejemplo, el ARN extraído se puede transcribir de forma inversa utilizando un kit GeneAmp RNA PCR (Perkin Elmer, CA, USA), siguiendo las instrucciones del fabricante. A continuación, el ADNc derivado se puede utilizar como molde en la posterior reacción de PCR.
Aunque la etapa PCR puede utilizar una serie de ADN polimerasas dependientes de ADN termoestables, habitualmente se utiliza una Taq ADN polimerasa, que tiene actividad 5'-3' nucleasa pero carece de una actividad endonucleasa correctora 3'-5'. De este modo, la TaqMan PCR utiliza habitualmente la actividad 5'-nucleasa de Taq o Tth polimerasa para hidrolizar una sonda de hibridación unida a su amplicón diana, pero se puede utilizar cualquier enzima con actividad 5' nucleasa equivalente. Se utilizan dos cebadores de oligonucleótidos para generar un amplicón típico de una reacción PCR. Se diseña un tercer oligonucleótido, o sonda, para detectar la secuencia de nucléotidos entre los dos cebadores de PCR. La sonda no es extendible mediante la enzima Taq ADN polimerasa y se marca con colorante fluorescente informador y un colorante fluorescente desactivador. Cualquier emisión inducida por láser a partir del colorante informador es desactivado por el colorante desactivador cuando los dos colorantes se localizan de forma próxima a como lo están en la sonda. Durante la reacción de amplificación, la enzima Taq ADN polimerasa corta la sonda de forma dependiente del molde. Los fragmentos resultantes de la sonda se disocian en solución, y la señal del colorante informador liberado se libera del efecto desactivador del segundo fluoróforo. Una molécula del colorante informador se libera de cada nueva molécula sintetizada, y la detección del colorante reportero no desactivado proporciona la base para una interpretación cuantitativa de los datos.
Se puede realizar TaqMan RT-PCR utilizando equipos disponibles comercialmente, tales como, por ejemplo, ABI PRIZM 7700^{TM} Sequence Detection System^{TM} (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), o Lightcycler (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania). En una realización preferida, el procedimiento de la 5' nucleasa se desarrolla en un dispositivo de PCR cuantitativo de tiempo real, tal como el ABI PRIZM 7700^{TM} Sequence Detection System^{TM}. El sistema consiste en un termociclador, un láser, un dispositivo acoplado a carga (CCD), una cámara y un ordenador. El sistema amplifica muestras en un formato de 96 pocillos en un termociclador. Durante la amplificación, la señal fluorescente inducida por láser se recoge a tiempo real a través de cables de fibra óptica para los 96
pocillos y se detecta en el CCD. El sistema incluye software para desarrollar el instrumento y para analizar los datos.
Los datos de los ensayos con 5'-nucleasa se expresan inicialmente como C_{t} o ciclo umbral. Tal como se ha descrito anteriormente, los valores de fluorescencia se registran durante cada ciclo y representan la cantidad de producto amplificado hasta ese punto en la reacción de amplificación. El punto en el que la señal fluorescente se registra pro primera vez como estadísticamente significativo es el ciclo umbral (Ct). Los valores \DeltaCt se utilizan como la medida cuantitativa del número relativo de copias de partida de una secuencia diana particular en una muestra de ácido nucleico cuando se compara la expresión de ARN en una célula cancerosa con la de una célula normal.
Para minimizar los errores y el efecto de la variación de muestra a muestra, se realiza habitualmente una RT-PCT utilizando un patrón estándar. El patrón estándar ideal se expresa a un nivel constante entre tejidos diferentes y no está afectado por el tratamiento experimental. Los ARNs utilizados más frecuentemente para normalizar patrones de expresión génica son ARNs para los genes "housekeeping" de gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GADPH) y \beta-actina.
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Microarrays
La expresión génica diferencial también se puede identificar, o confirmar, utilizando la técnica de microarrays. En este método, las secuencias de nucleótidos de interés se emplacan, o se agrupan, en un sustrato microchip. Las secuencias en grupos se hibridan a continuación con sondas de ADN específico de células o tejidos de interés. Los genes reconocidos por la presente invención se pueden identificar mediante la construcción de bibliotecas de ADNc normalizadas o sustraidas de ARNm extraído de células o tejidos tumorales, de sujetos sanos; purificación del ADN del ADNc; tratamiento de muestras con tumor y sanas en condiciones en cualquier caso idénticas con un retinoide; "microarray" el ADN purificado para el análisis de expresión; y el sondeo de los microarrays para identificar los genes de los clones que favorecen la expresión de manera selectiva mediante el tratamiento con retinoides en las células o tejidos tumorales, en relación a las correspondientes células o tejidos normales. Sólo en el método de RT-PCR, la fuente de ARNm es habitualmente el ARN total aislado de tumores o líneas de células tumorales humanas, y los correspondientes tejidos y líneas celulares normales. De este modo, el ARN se puede aislar de una variedad de tumores o líneas de células tumorales primarias, incluyendo las indicadas anteriormente. Si la fuente de ARNm es un tumor primario, el ARNm se puede extraer, por ejemplo, de muestras de tejido insertadas en parafina y fijadas (por ejemplo, fijadas en formalina) congeladas o guardadas, que se preparan y conservan habitualmente en la práctica clínica diaria.
En una realización específica de la técnica de microarray, se aplican los insertos de clones de ADNc amplificados por PCR en un sustrato en un "array" denso. Preferiblemente, se aplican por lo menos 10.000 secuencias de nucleótidos al sustrato. Los genes en microarrays, inmovilizados en el microchip con 10.000 elementos en cada uno, son adecuados para la hibridación en condiciones astringentes. Se pueden generar sondas de ADNc marcadas por fluorescencia mediante la incorporación de nucleótidos fluorescentes por transcripción inversa de ARN extraído de tejidos de interés. Las sondas de ADNc marcadas aplicadas al chip se hibridan con especificidad a cada punto de ADN en el "array". Después del lavado astringente para eliminar las sondas no unidas específicamente, el chip se rastrea mediante microscopía de láser confocal. La cuantificación de la hibridación de cada elemento en "arrays" permite la valoración de la correspondiente abundancia de ARNm. Con una fluorescencia de color dual, las sondas de ADNc marcadas por separado generadas de dos fuentes de ARN se hibridan por parejas al "array". La abundancia relativa de los transcritos de las dos fuentes correspondientes a cada gen especificado se determina por tanto simultáneamente. La escala miniaturizada de la hibridación permite obtener una evaluación conveniente y rápida del patrón de expresión para amplias cantidades de genes. Se ha observado que dichos métodos presentan la sensibilidad requerida para detectar transcritos extraños, que se expresan en unas pocas copias por célula, y que detectan de manera reproducible diferencias por lo menos aproxi-
madamente dos veces en los niveles de expresión (Schena et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 93 (20): 106-49 (1996)).
La metodología de hibridación de ácidos nucleicos y la tecnología de "microarray" son bien conocidas en la técnica. En un ejemplo, la preparación específica de ácidos nucleicos para la hibridación y sondas, portaobjetos y condiciones de hibridación se detalla en la solicitud PCT de serie No. PCT/US01/10482, solicitada el 30 de marzo de 2001.
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b. Tratamiento con retinoide
Independientemente del método elegido para la obtención del perfil de expresión de ADN y para cuantificar la transcripción de ARNm, el quid que subyace en la presente invención es la identificación de genes, la expresión de los cuales se aumenta selectivamente mediante tratamiento con retinoides en células cancerosas impulsada por la señalización de Wnt, en relación a células normales. En particular, el perfil de expresión génica de células tumorales caracterizado por la implicación del mecanismo de señalización de Wnt se determina en presencia y ausencia de Wnt, por ejemplo, la expresión de Wnt-1, y en presencia y ausencia del tratamiento con retinoides. Después de cuantificar los datos de la expresión génica, se identifican los genes, la expresión de los cuales se favorece selectivamente mediante el tratamiento con retinoides de las células tumorales que expresan Wnt, en relación a células normales tratadas con el mismo retinoide, y, preferiblemente, también en relación con las células tumorales que no expresan Wnt, con o sin el tratamiento con retinoides. Tal como se ha descrito anteriormente, el retinoides puede ser un ácido retinoico (también conocido como tretinoína, vitamina A ácida o vitamina A1), incluyendo tanto el ácido todo-trans-retinoico (todo-trans-RA) como el ácido 9-cisretinoico (9-cis-RA) y derivados del ácido retinoico que consisten en cuatro unidades de isoprenoides unidos de forma de cabeza a cola, tal como retinol, retinal, retinoides sustituidos, seco-, nor- y retro-retinoides. Todos los retinoides pueden derivar formalmente de un compuestos parental monocíclico que contiene cinco dobles enlaces carbono-carbono y un grupo funcional en el extremo de la parte acíclica.
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c. Ensayos tumorales basados en células
Las dianas de genes identificadas y los métodos de la presente invención se pueden validar adicionalmente en ensayos de tumores basados en células. El papel de los genes y los productos génicos identificados aquí en el desarrollo y la patología de un tumor o cáncer puede analizarse usando células tumorales primarias o líneas celulares que han sido identificadas por amplificar los genes de la presente invención. Dichas células incluyen, por ejemplo, células de cáncer de mama, colon y pulmón y las líneas celulares indicadas anteriormente.
En una estrategia diferente, se transfectan células de un tipo celular del que se conoce su implicación en un tumor en particular con los ADNcs que codifican las proteínas de la superficie celular identificadas aquí y se analiza la capacidad de estos ADNcs de inducir un crecimiento desmedido. Entre las células adecuadas se incluyen, por ejemplo, líneas celulares tumorales estables tales como la línea celular B104-1-1 (línea celular NIH-3T3 estable transfectada con el protooncogén neu) y células NIH-3T3 transfectadas con res, que pueden ser transfectadas con el gen deseado y controladas respecto a su crecimiento tumorigénico. Dichas líneas celulares transfectadas pueden ser usadas para analizar la capacidad de agentes antitumorales, tales como anticuerpos policlonales o monoclonales o composiciones de anticuerpos combinados con retinoides para inhibir el crecimiento celular tumorigénico al ejercer una actividad citostática o citotóxica sobre el crecimiento de las células transformadas, o mediante la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC), en presencia o ausencia del tratamiento con retinoides. Las células transfectadas con las secuencias codificantes de los genes identificados aquí pueden usarse además para la identificación de fármacos candidatos para el tratamiento del cáncer.
Además, pueden usarse cultivos primarios derivados de tumores en animales transgénicos (tal como se describe más adelante) en los ensayos basados en células aquí descritos, aunque se prefieren las líneas celulares estables. Son bien conocidas en el área las técnicas para derivar líneas celulares continuas a partir de animales transgénicos (véase, por ejemplo, Small et al., Mol. Cell. Biol. 5:642-618 [1985]).
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d. Modelos animales
Es posible utilizar una variedad de modelos animales bien conocidos para entender en mayor profundidad el papel de los genes identificados aquí en el desarrollo y la patogénesis tumoral, y para analizar la eficacia del tratamiento con retinoides en combinación con anticáncer, por ejemplo, terapia con anticuerpos. La naturaleza in vivo de dichos modelos los hace particularmente útiles para predecir las respuestas en pacientes humanos. Entre los modelos animales de tumores y cánceres (por ejemplo, cáncer de mama, de colon, de próstata, de pulmón, etc.) se incluyen tanto animales no recombinantes como recombinantes (transgénicos). Entre los modelos animales no recombinantes se incluyen, por ejemplo, roedores, por ejemplo, modelos murinos. Dichos modelos pueden generarse introduciendo células tumorales en ratones singénicos usando técnicas habituales, por ejemplo, inyección subcutánea, inyección en la vena de la cola, implantación en el bazo, implantación intraperitoneal, implantación bajo la cápsula renal, o implantación de ortopina, por ejemplo, células de cáncer de colon implantadas en un tejido colónico (véase, por ejemplo, la publicación PCT WO97/33551, publicada el 18 de Septiembre de 1997).
Probablemente las especies animales utilizadas más frecuentemente en los estudios oncológicos son los ratones inmunodeficientes y, en particular, los ratones desnudos. La observación de que el ratón desnudo con hipoaplasia puede actuar con éxito como huésped para los xenoinjertos de tumor humano ha conducido a su utilización generalizada con este propósito. El gen recesivo autosómico nu ha sido introducido en un número muy grande de cepas congénitas diferentes de ratón desnudo, incluyendo, por ejemplo, ASW, A/He, AKR, BALB/c, B10.LP, C17, C3H, C57BL, C57, CBA, DBA, ODD, l/st, NC, NFR, NFS, NFS/N, NZB, NZC, NZW, P, RIII y SJL. Además, se han criado y utilizado como receptores de xenoinjertos tumorales una amplia diversidad de otros animales con defectos inmunológicos heredados diferentes del ratón desnudo. Para más detalles ver, por ejemplo, The Nude Mouse in Oncology Research, E. Boven y B. Winograd, editores, CRC Press, Inc., 1991.
Las células introducidas en estos animales pueden derivarse de líneas celulares tumorales/cancerosas conocidas, tales como, por ejemplo, la línea celular epitelial de mama C57MG murina transfectada con Wnt-1 utilizada en los ejemplos de la presente invención, expresando de la manera estable Wnt-1 (véase también Diatchenko et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 93:6025-6030 (1996)), o a partir de las siguientes líneas celulares humanas ATCC después de la transfección con Wnt-1: SW40, COL0320DM, HT-29, WiDr y SW403 (adenocarcinomas de colon), SW620 (metástasis de nódulos linfaticos, adenocarcinoma de colon), HT117 (carcinoma de colon), SK-Co-1 (adenocarcinoma de colon, ascitos), y HM7 (una variante de la línea celular de adenocarcinoma de colon ATCC LS174T). Las muestras de células tumorales o cancerosas pueden obtenerse también de pacientes sometidos a cirugía utilizando condiciones estándar que implican la congelación y el almacenamiento en nitrógeno líquido (Karmali et al., Br. J. Cancer 48:689-696, 1983), o a partir de muestras fijadas con formalina e insertadas en parafina.
Las células tumorales pueden introducirse en animales, tales como los ratones desnudos, mediante una diversidad de procedimientos. El espacio subcutáneo (s.c.) en ratones resulta muy adecuado para la implantación de tumores. Los tumores pueden trasplantarse s.c. en forma de bloques sólidos, como biopsias con aguja mediante la utilización de una aguja de punción, o en forma de suspensiones celulares. Para la implantación de un bloque sólido o mediante una aguja de punción, se introducen fragmentos de tejido tumoral de tamaño adecuado en el espacio s.c. Las suspensiones celulares se preparan frescas a partir de tumores primarios o de líneas celulares tumorales estables, y se inyectan subcutáneamente. Las células tumorales también pueden inyectarse como implantes subdérmicos. En esta localización, el inóculo se deposita entre la parte inferior del tejido conectivo dérmico y el tejido s.c. (Boven y Winograd, 1991, supra).
Pueden generarse modelos animales de cáncer de mama, por ejemplo, mediante la implantación de células de neuroblastoma de rata (a partir de los que se aisló inicialmente el oncogén neu) o células NIH-3T3 transformadas con neu en ratones desnudos, esencialmente tal como describen Drebin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9129-9133, 1986.
De manera similar, pueden generarse modelos animales de cáncer de colon subcultivando células de cáncer de colon en animales, por ejemplo ratones desnudos, conduciendo a la aparición de tumores en estos animales. Se ha descrito un modelo de trasplante ortotópico de cáncer de colon humano en ratones desnudos, por ejemplo en Wang et al., Cancer Research 54:4726-4728, 1994, y en Too et al., Cancer Research 55:681-684, 1995. Este modelo se basa en el denominado "METAMOUSE" comercializado por AntiCancer, Inc. (San Diego, California).
Los tumores que surgen en los animales pueden extirparse y cultivarse in vitro. Las células procedentes de cultivos in vitro seguidamente pueden subcultivarse en animales. Estos tumores pueden servir como dianas para el ensayo adicional o para el cribado de fármacos. Alternativamente, los tumores resultantes del subcultivo pueden aislarse y el ARN de las células pre-subcultivo y las células aisladas tras una o más rondas de subcultivos, pueden analizarse para la expresión diferencial de genes de interés. Estas técnicas de subcultivo pueden llevarse a cabo con cualquier línea celular tumoral o cancerosa conocida.
Por ejemplo, Meth A, CMS4, CMS5, CMS21 y WEHI-164 son fibrosarcomas inducidos químicamente de ratones BALB/c hembra (DeLeo et al., J. Exp. Med. 146:720, 1977) que proporcionan un sistema modelo altamente controlable para estudiar las actividades antitumorales de diversos agentes (Palladino et al., J. Immunol. 138:4023-4032, 1987). En resumen, las células tumorales se propagan in vitro en cultivo celular. Previamente a la inyección en los animales, las líneas celulares se lavan y se suspenden en tampón, a una densidad celular de aproximadamente 10 x 10^{8} a 10 x 10^{7} células/ml. Los animales seguidamente se infectan subcutáneamente con 10 a 100 \mul de la suspensión celular, dejando una a tres semanas para que aparezca un tumor.
Además, el carcinoma pulmonar (3LL) de Lewis de ratón, que es uno de los tumores experimentales estudiado más a fondo, puede utilizarse como un modelo experimental de tumor. La eficacia en este modelo tumoral se ha correlacionado con efectos beneficiosos en el tratamiento de los pacientes humanos diagnosticados con carcinoma de células pequeñas del pulmón (SCCL). Este tumor puede introducirse en ratones normales tras la inyección de fragmentos de tumor de un ratón afectado o de células mantenidas en cultivo (Zupi et al., Br. J. Cancer 41, suppl. 4:309, 1980) y la evidencia indica que los tumores pueden iniciarse a partir de la inyección de incluso una sola célula y que sobrevive una proporción muy elevada de células tumorales infectadas. Para más información sobre este modelo tumoral ver Zacharski, Haemostasis 16:300-320, 1986.
Una manera de evaluar la eficacia de un compuesto de ensayo en un modelo animal en un tumor implantado es medir el tamaño del tumor antes y después del tratamiento. Tradicionalmente, el tamaño de los tumores implantados se ha medido con un calibrador pie de rey en dos o en tres dimensiones. La medida limitada a las dos dimensiones no refleja con exactitud el tamaño del tumor, por lo tanto habitualmente se convierte al volumen correspondiente utilizando una fórmula matemática. Sin embargo, la medición del tamaño del tumor resulta muy inexacta. Los efectos terapéuticos de un fármaco candidato pueden describirse mejor como el retraso del crecimiento y el retraso específico del crecimiento inducidos por el tratamiento. Otra variable importante en la descripción del crecimiento tumoral es el tiempo de duplicación del volumen tumoral. También se encuentran disponibles programas de ordenador para el cálculo y la descripción del crecimiento tumoral, tales como el programa indicado por Rygaard y Spang-Thomsen, Proc. 6th Int. Workshop on Immune-Deficient Animals, Wu y Sheng, editores, Basel, 1989, 301. Se indica, sin embargo, que la necrosis y las respuestas inflamatorias tras el tratamiento pueden dar lugar en realidad a un incremento del tamaño tumoral, por lo menos inicialmente. Por lo tanto, estos cambios deben seguirse cuidadosamente, mediante una combinación de un procedimiento morfométrico y análisis de citometría de flujo.
Los modelos animales recombinantes (transgénicos) pueden manipularse introduciendo la parte codificante de los genes identificados en la presente invención en el genoma de los animales de interés utilizando técnicas estándar para producir animales transgénicos. Entre los animales que pueden servir como diana para la manipulación transgénica se incluyen, sin limitarse a ellos, ratones, ratas, conejos, cobayas, ovejas, cabras, cerdos y primates no humanos, por ejemplo babuinos, chimpancés y monos. Entre las técnicas conocidas en la técnica para introducir un transgén en estos animales se incluyen la microinyección pronucleica (Hoppe y Wagner, patente US nº 4.873.191), la transferencia génica a líneas germinales medida por retrovirus (por ejemplo Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6148-615, 1985), el direccionamiento génico en células madre embrionarias (Thompson et al., Cell 56:313-321, 1989); la electroporación de embriones (Lo, Mol. Cell Biol. 3:1803-1814, 1983); la transferencia génica mediada por esperma (Lavitrano et al., Cell 57:717-73, 1989). Para una revisión ver, por ejemplo, la patente US nº 4.736.866.
Para el propósito de la presente invención, entre los animales transgénicos se incluyen aquellos que portan el transgén únicamente en parte de sus células ("animales mosaico"). El transgén puede integrarse o en forma de transgén único, o en concatámeros, por ejemplo en tándems cabeza-a-cabeza o cabeza-a-cola. La introducción selectiva de un transgén en un tipo celular particular también resulta posible siguiendo, por ejemplo, la técnica de Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-636, 1992.
La expresión del transgén en animales transgénicos puede seguirse mediante técnicas estándar. Por ejemplo, puede utilizarse análisis de transferencia southern o amplificación por PCR para verificar que se ha producido la integración del transgén. A continuación, puede analizarse el nivel de expresión en ARNm utilizando técnicas tales como la hibridación in situ, el análisis de transferencia northern, PCR, o inmunocitoquímica. Los animales se examinan adicionalmente para indicios de desarrollo de tumor o de cáncer.
Alternativamente, se pueden construir animales "knock out" que presentan un gen defectuoso o alterado que codifica una proteína identifica aquí (por ejemplo, una proteína de superficie celular), como resultado de la recombinación homóloga entre el gen endógeno que codifica la proteína y el ADN genómico alterado que codifica la misma proteína introducida en una célula embrionaria del animal. Por ejemplo, el ADNc que codifica dicha proteína se puede utilizar para clonar ADN genómico que codifica la proteína según las técnicas establecidas. Una parte del ADN genómico que codifica una proteína particular se puede eliminar o sustituir por otro gen, tal como un gen que codifica un marcador seleccionable que se puede utilizar para el seguimiento de la integración. Habitualmente, se incluyen en el vector varias kilobases de ADN flanqueante inalterado (en ambos extremos 5' y 3') (véase, por ejemplo, Thomas and Capecchi, Cell, 51: 503 (1987) para una descripción de vectores recombinantes homólogos). El vector se introduce en una línea de células madre embrionarias (por ejemplo, mediante electroporación) y se seleccionan las células en las que el ADN introducido se ha recombinado homólogamente con el ADN endógeno (véase, por ejemplo, Li et al., Cell, 69: 915 (1992)). Las células seleccionadas se inyectan a continuación en un blastocito de un animal (por ejemplo, un ratón o una rata) para formar quimeras de agregación (véase, por ejemplo, Bradley, in Teratocarcinomes and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152]. A continuación, se puede implantar un embrión quimérico en un animal adoptado hembra pseudopreñada adecuada y nació el embrión para crear un animal "knock out", La progenie que alberga el ADN recombinado homólogamente en sus células germinales se puede identificar mediante técnicas estándar y se utiliza para criar animales en los que todas las células del animal contienen ADN recombinado homólogamente. Los animales knockout se pueden caracterizar, por ejemplo, por su capacidad de defenderse contra ciertas patologías y por su desarrollo de patologías debido a la ausencia de la proteína ausente.
La eficacia de los anticuerpos que se unen específicamente a las proteínas identificadas en la presente invención y otros fármacos candidatos, también puede someterse a ensayo en el tratamiento de tumores animales espontáneos. Una diana adecuada para estos estudios es el carcinoma de células escamosas (SCC) oral felino. El SCC oral felino es un tumor maligno altamente invasivo que es el cáncer oral más frecuente de los gatos, representando más del 60% de los tumores orales descritos para esta especie. En raras ocasiones se produce la metástasis a sitios distantes, aunque esta baja incidencia de la metástasis podría ser meramente un reflejo de los reducidos tiempos de supervivencia de los gatos que presentan este tumor. Estos tumores habitualmente no son susceptibles a la cirugía, principalmente debido a la anatomía de la cavidad oral felina. En la actualidad no existe ningún tratamiento eficaz para este tumor. Previamente a la entrada en el estudio, cada gato se sometió a un examen clínico completo, a biopsia y se escaneó mediante tomografía computerizada (CT). Los gatos diagnosticados con tumores de células escamosas orales sublinguales se excluyeron del estudio. La lengua puede resultar paralizada como resultado de este tumor, e incluso si el tratamiento elimina el tumor, los animales pueden no ser capaces de alimentarse por sí mismos. Cada gato se trató repetidamente, a lo largo de un periodo más largo de tiempo. Se tomaron fotografías de los tumores diariamente durante el periodo de tratamiento, y en cada nueva comprobación posterior. Tras el tratamiento, cada gato se sometió a otro escaneo de CT. Posteriormente, los escanéos de CT y los radiogramas torácicos se evaluaron cada 8 semanas. Los datos se evaluaron por las diferencias de supervivencia, respuesta y toxicidad en comparación con los grupos de control. La respuesta positiva podría requerir evidencia de regresión tumoral, preferentemente con mejora de la calidad de vida y/o una esperanza de vida incrementada.
Además, también pueden someterse a ensayo otros tumores animales espontáneos, tales como fibrosarcoma, adenocarcinoma, linfoma, condroma, leiomiosarcoma de perros, gatos y babuinos. De estos, el adenocarcinoma mamario en perros y en gatos es un modelo preferente debido a que la apariencia y el comportamiento son muy similares a los en el ser humano. Sin embargo, la utilización de este modelo se ve limitada porque este tipo de humor se da raramente en los animales.
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2. Agentes que reconocen los antígenos de tumores identificados
Los antígenos de tumores identificados aquí son dianas deseables para la terapia contra el cáncer, ya que se espera que el aumento selectivo de su expresión mediante el tratamiento con retinoides en relación a células normales mejore la eficacia y el índice terapéutico de los agentes terapéuticos contra el cáncer dirigidos contra estos antígenos. Esto es cierto generalmente para cualquier antagonista de un antígeno de tumor identificado según la presente invención.
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a. Antagonistas
Los antagonistas incluyen oligonucleótidos que se unen a un antígeno de tumor y, en particular, a anticuerpos que incluyen, sin limitación, anticuerpos policlonales y monoclonales, y fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de cadena única, anticuerpos anti-idiotípicos, y versiones quiméricas o humanizadas de dichos anticuerpos o fragmentos, así como anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos. Alternativamente, un potencial antagonista puede ser una proteína estrechamente relacionada, por ejemplo, una forma mutada del antígeno de tumor que reconoce su receptor pero que no comunica ningún efecto (por ejemplo, stra6, efrina b1, ligando 4.1BB, autotaxina o la variante ISRL), inhibiendo así competitivamente la acción del antígeno del tumor.
Otro antagonista puede ser una construcción de ARN o ADN antisentido preparada utilizando tecnología antisentido, donde, por ejemplo, una molécula de ARN o ADN antisentido actúa para bloquear directamente la traducción de ARNm mediante la hibridación a ARNm reconocido y evitar la traducción de proteínas. La tecnología antisentido se puede utilizar para controla la expresión génica a través de la formación de triples hélices o ADN o ARN antisentido, ambos métodos basados en la unión de un polinucleótido a ADN o ARN. Por ejemplo, la parte codificante 5' de la secuencia de polinucleótidos, que codifica un antígeno de tumor maduro de la presente invención, se utiliza para diseñar un oligonucleótido de ARN antisentido de desde aproximadamente 10 a 40 pares de bases de longitud. Se diseña un oligonucleótido de ADN para que sea complementario a una región del gen implicado en la transcripción (triple hélice - véase Lee et al., Nucl. Acids Res., 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991)), evitando de este modo la transcripción y la producción del polipéptido objetivo. El oligonucleótido de ARN antisentido se hibrida al ARNm in vivo y bloquea la traducción de la molécula de ARNm en el polipéptido diana (antisentido - Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988). Los oligonucleótidos descritos anteriormente también se pueden liberar a células, de manera que el ARN o ADN antisentido se puede expresar in vivo para inhibir la producción del polinucleótido diana. Cuando se utiliza ADN antisentido, se prefieren oligodesoxirribonucleótidos derivados del sitio de inicio de la traducción, por ejemplo aproximadamente las posiciones -10 y +10 de la secuencia de nucleótidos del gen diana.
Las moléculas de ARN o ADN antisentido tiene generalmente por lo menos aproximadamente 5 bases de longitud, aproximadamente 10 bases de longitud, aproximadamente 15 bases de longitud, aproximadamente 20 bases de longitud, aproximadamente 25 bases de longitud, aproximadamente 30 bases de longitud, aproximadamente 35 bases de longitud, aproximadamente 40 bases de longitud, aproximadamente 45 bases de longitud, aproximadamente 50 bases de longitud, aproximadamente 55 bases de longitud, aproximadamente 60 bases de longitud, aproximadamente 65 bases de longitud, aproximadamente 70 bases de longitud, aproximadamente 75 bases de longitud, aproximadamente 80 bases de longitud, aproximadamente 85 bases de longitud, aproximadamente 90 bases de longitud, aproximadamente 95 bases de longitud, aproximadamente 100 bases de longitud, o más.
Entre los potenciales antagonistas se incluyen pequeñas moléculas que se unen al sitio activo, el sitio de unión al receptor, o factor de crecimiento u otro sitio de unión relevante de un antígeno de tumor identificado aquí, que bloquean de este modo su actividad biológica normal. Ejemplos de pequeñas moléculas incluyen, pero sin limitación, péptidos pequeños o moléculas de tipo péptido, preferiblemente péptidos solubles y compuestos orgánicos o inorgánicos no peptídicos sintéticos. Estas moléculas pequeñas se pueden identificar mediante técnicas de cribado conocidas por un experto en la materia.
Las ribozimas son moléculas de ARN enzimático capaces de catalizar la división específica de ARN. Los ribozimas actúan mediante hibridación específica de secuencia al ARN diana complementario, seguido de la división endonucleolítica. Los sitios de división por ribozima específicos en un ARN diana potencial se pueden identificar mediante técnicas conocidas. Para más detalles véase, por ejemplo, Rossi, Current Biology, 4: 469-471 (1994), y la publicación PCT No. WO 97/33551 (publicada el 18 de septiembre de 1997).
Las moléculas de ácido nucleico en formación de triple hélice utilizados para inhibir la transcripción deberían ser de cadena sencilla y compuestos de desoxinucleótidos. La composición base de estos oligonucleótidos se diseña de manera que promueve la formación de triples hélices mediante las reglas de emparejamiento de bases de Hoogsteen, que requieren generalmente tramos adecuados de purinas o pirimidinas en una cadena de una doble cadena. Para más detalles véase, por ejemplo, la publicación PCT No. WO 97/33551, supra.
En una realización preferida, los antagonistas para su uso en los métodos de tratamiento de la presente invención son anticuerpos que son capaces de unirse específicamente a un antígeno de tumor identificado según la presente invención. El tratamiento con retinoides (por ejemplo, ácido retinoico favorecerá la expresión de manera selectiva del antígeno de tumor identificado y mejorará la eficacia y el índice terapéutico de los anticuerpos dirigidos contra los antígenos de tumores.
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b. Anticuerpos
Los procedimientos de preparación de anticuerpos policlonales son conocidos para el experto en la materia. Los anticuerpos policlonales se pueden desarrollar en un mamífero, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante. Habitualmente, el agente inmunizante y/o adyuvante se inyectarán en el mamífero mediante inyecciones múltiples subcutáneas o intraperitoneales. El agente inmunizante puede incluir el polipéptido identificado según la presente invención o una proteína de fusión del mismo. Puede ser útil conjugar el agente inmunizante a una proteína conocida por ser inmunogénica en el mamífero que se inmuniza. Entre los ejemplos de dichas proteínas inmunogénicas se incluyen, pero sin limitación, hemocianina de la lapa californiana, albúmina de suero, tiroglobulina bovina, e inhibidor de tripsina de soja. Entre los ejemplos de adyuvantes que se pueden utilizar se incluyen el adyuvante completo de Freund y el adyuvante MPL-TDM (monofosforil Lípido A, dicorinomicolato de trehalosa sintético). El protocolo de inmunización se puede seleccionar por un experto en la materia sin una gran experimentación.
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Anticuerpos monoclonales
Alternativamente, los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar utilizando procedimientos de hibridoma, tales como los descritos por Kohler y Milstein, Nature, 256: 495 (1975). En un procedimiento de hibridoma, se inmuniza habitualmente un ratón, un hámster u otro animal huésped apropiado con un agente inmunizante para obtener linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro.
El agente inmunizante incluirá habitualmente el polipéptido al que el anticuerpo se une o una proteína de fusión del mismo. Generalmente, se utilizan linfocitos de sangre periférica ("PBLs") si se desean células de origen humano, o células de bazo o células de nódulos linfáticos si se desean fuentes de mamíferos no humanos. A continuación, los linfocitos se fusionan con una línea celular inmortalizada utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma [Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academia Press, (1986), páginas 59-103]. Las líneas celulares inmortalizadas son habitualmente células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de origen roedor, bovino y humano. Habitualmente, se utilizan líneas celulares de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma se pueden cultivar en un medio de cultivo adecuado que preferiblemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá habitualmente hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"), cuyas sustancias evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT.
Las líneas celulares inmortalizadas preferidas son aquéllas que se fusionan de manera eficaz, promueven un nivel de expresión elevado estable de anticuerpos por las células productoras de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio, tal como medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son líneas de mieloma murino, que se pueden obtener, por ejemplo, del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Se han descrito también líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, (1987) páginas, 51-63].
A continuación, el medio de cultivo en el que las células de hibridoma se cultivan se pueden analizar para la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra PRO 10282. Preferiblemente, la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA). Dichas técnicas y ensayos se conocen en el sector. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal se puede determinar, por ejemplo, mediante el análisis Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107: 220 (1980).
Después de identificar las células de hibridoma deseadas, los clones se pueden subclonar mediante procedimientos de dilución limitante y se pueden desarrollar mediante procedimientos estándar [Goding, supra]. Entre los medios de cultivo adecuados para este objetivo se incluyen, por ejemplo, medio de Eagle modificado por Dulbecco y medio RPMI-1640. Alternativamente, las células de hibridoma se pueden desarrollar in vivo como fluido ascítico en un mamífero.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se pueden aislar o purificar del medio de cultivo o fluido ascítico mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas, tales como, por ejemplo, proteína A-sefarosa, cromatografía en hidroxilapatito, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.
Los anticuerpos monoclonales también se pueden fabricar mediante procedimientos de ADN recombinante, tales como los descritos en la Patente de Estados Unidos No. 4.816.567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la presente invención se pueden aislar fácilmente y secuenciar utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante la utilización de sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas ligeras y pesadas de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma de la presente invención sirven como una fuente de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que a continuación se transfectan en células huésped, tales como células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen de otro modo proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. Los huéspedes procariotas, tales como E. coli, también son adecuados para la producción recombinante de los anticuerpos de la presente invención. El ADN también se puede modificar, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante para los dominios constantes de cadena pesada y ligera humanos en lugar de las secuencias homólogas murinas [Patente de Estados Unidos No. 4.816.567; Morrison et al., supra] o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de la inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante para un polipéptido que no es inmunoglobulina. Dicho polipéptido que no es inmunoglobulina se puede sustituir por los dominios constantes de un anticuerpo de la presente invención, o se pueden sustituir por los dominios variables de un sitio de combinación a antígeno de un anticuerpo de la presente invención para crear un anticuerpo quimérico bivalente.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Los procedimientos para preparar anticuerpos monovalentes son conocidos en la técnica. Por ejemplo, un procedimiento implica la expresión recombinante de la cadena ligera y la cadena pesada modificada de la inmunoglobulina. La cadena pesada se trunca generalmente en cualquier punto en la región Fc para evitar el entrecruzamiento de la cadena pesada. Alternativamente, los residuos de cisteína pertinentes se sustituyen por otro residuo de aminoácido o se eliminan para evitar el entrecruzamiento.
Los procedimientos in vitro también son adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente, fragmentos Fab, se puede realizar utilizando técnicas rutinarias conocidas en el sector.
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Anticuerpos humanos y humanizados
Los anticuerpos adecuados para su uso en los métodos de tratamiento de la presente invención pueden comprender además anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de unión a antígeno de los anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Entre los anticuerpos humanizados se incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor se sustituyen por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo dador), tal como ratón, rata o conejo que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos del armazón de Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de la CDR o el armazón importados. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de por lo menos uno, y habitualmente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones de FR son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá por lo menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), habitualmente la de una inmunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332 : 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)].
Los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos son conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en el mismo de un origen no humano. Estos residuos de aminoácidos no humanos se indican frecuentemente como residuos "importados", que se adquieren habitualmente de un dominio variable "importado". La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)], mediante la sustitución de CDRs o secuencias de CDR de roedor por las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de Estados Unidos No. 4.816.567), en los que sustancialmente menos de un dominio variable intacto humano ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son habitualmente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.
Los anticuerpos humanos también se pueden producir utilizando varias técnicas conocidas en el sector, incluyendo las bibliotecas de expresión en fagos [Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)]. Las técnicas de Cole et al. y Boerner et al. están también disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, página 77 (1985) y Boerner et al., J. Inmunol., 147(1): 86-95 (1991). De forma similar, los anticuerpos humanos se pueden fabricar mediante la introducción de loci de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los que los genes endógenos de inmunoglobulina han sido parcial o completamente inactivados. Tras la estimulación, se observa la producción de anticuerpos humanos, que se parecen mucho a los observados en humanos en todos los aspectos, incluyendo el reajuste de genes, el ensamblaje, y el repertorio de anticuerpos. Esta estrategia se describe, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nos. 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, y en las siguientes publicaciones científicas: Marks et al., BioTechnology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368, 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51, (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995).
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Anticuerpos biespecíficos
Los anticuerpos biespecíficos son monoclonales, preferiblemente humanos o humanizados, que tienen especificidades de unión con por lo menos dos antígenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de unión es para la proteína diana, la otra es para cualquier otro antígeno, y preferiblemente para una proteína o receptor o subunidad del receptor de la superficie celular.
Los procedimientos para fabricar anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. Habitualmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos parejas de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina, en las que las dos cadenas pesadas tienen especificidades diferentes [Millstein y Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)]. Debido a la variedad aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez moléculas diferentes de anticuerpos, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta se realiza habitualmente mediante etapas de cromatografía de afinidad. En WO 93/08829, publicada el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991) se describen procedimientos similares.
Los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se pueden fusionar a secuencias de dominios constantes de inmunoglobulinas. La fusión preferiblemente es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de la bisagra, CH2, y regiones CH3. Se prefiere que la primera región constante de cadena pesada (CH1) contenga el sitio necesario para la unión a cadena ligera presente en por lo menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Para mayores detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos, véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzimology, 121: 210 (1986).
Según otra estrategia descrita en WO 96/27011, la interfase entre una pareja de moléculas de anticuerpos se puede diseñar para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan de cultivos de células recombinantes. La interfase preferida comprende por lo menos una parte de la región CH3 de un dominio constante del anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales pequeñas de aminoácidos de la interfase de la primera molécula de anticuerpo se sustituyen por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la cadena o cadenas laterales grandes en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo mediante la sustitución de cadenas laterales grandes de aminoácidos por más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no deseados, tales como homodímeros.
Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')_{2}. Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos biespecíficos utilizando enlaces químicos. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) describen un procedimiento en el que anticuerpos intactos se dividen proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')_{2}. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente complejante de ditiol, arsenito sódico, para estabilizar los ditioles vecinales y evitar la formación de enlaces disulfuro intermoleculares. A continuación, los fragmentos Fab' generados se convierten en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados de Fab'-TNB se reconvierte a continuación en Fab'-tiol mediante la reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden utilizar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.
Los fragmentos Fab' se pueden recuperar directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med, 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula de anticuerpo biespecífico F(ab')_{2} completamente humanizado. Cada fragmento de Fab' se secretó por separado de E. coli y se sometió a un acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico formado de esta manera era capaz de unirse a células que sobreexpresaban el receptor ErbB2 y células T humanas normales, así como de desencadenar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra dianas de tumores de mama humanos.
Se han descrito también varias técnicas para fabricar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente de cultivos de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5): 1547-1553 (1992). Los péptidos de cremalleras de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las partes Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los homodímeros de los anticuerpos se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y, a continuación, se reoxidaron para formar los heterodímeros de los anticuerpos. Este procedimiento también se puede utilizar para la producción de homodímeros de anticuerpos. La tecnología de "diabody" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para fabricar fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena ligera (V_{L}) mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios V_{H} y V_{L} de un fragmento son forzados a emparejarse con los dominios V_{L} y V_{H} complementarios de otro fragmento, formando así dos sitios de unión a antígeno. También se ha descrito otra estrategia para fabricar fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante la utilización de dímeros de Fv de cadena única (sFv). Véase Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994). Se contemplan los anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).
Los anticuerpos biespecíficos de ejemplo pueden unirse a dos epítopos diferentes en un polipéptido (por ejemplo, un antígeno de la superficie celular) de la presente invención determinado. Alternativamente, puede combinarse un brazo del anticuerpo, que se une al polipéptido diana, con un brazo que se una a una molécula activadora en un leucocito, tal como una molécula del receptor de células T (por ejemplo, CD2, CD3, CD28, o B7), o receptores Fc para IgG (Fc\gammaR), tal como Fc\gammaRI (CD64), Fc\gammaRII (CD32) y Fc\gammaRIII (CD16) para dirigir los mecanismos de defensa celular hacia la célula que expresa el polipéptido particular. Los anticuerpos biespecíficos pueden usarse también para localizar agentes citotóxicos en las células que expresan un antígeno particular identificada en la presente invención. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión a antígeno y un brazo que se une a un agente citotóxico o a un quelante radionucleido, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA, o TETA. Otro anticuerpo biespecífico de interés se une al polipéptido diana y se une además al factor tisular (TF).
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Anticuerpos heteroconjugados
El uso de anticuerpos heteroconjugados también se encuentra dentro de alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos covalentemente. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmune a células no deseadas [Patente de Estados Unidos No. 4.676.980] y para el tratamiento de la infección por VIH [WO 91/00360: WO 92/200373; EP 03089]. Se contempla que los anticuerpos se pueden preparar in vitro utilizando procedimientos conocidos en la química sintética de proteínas, incluyendo los que implican agentes de entrecruzamiento. Por ejemplo, las inmunotoxinas se pueden construir utilizando una reacción de intercambio de disulfuro o mediante la formación de un enlace tioéter. Entre los ejemplos de reactivos adecuados para este objetivo se incluyen el iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y los descritos, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos No. 4.676.980.
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Diseño de la función efectora
Se puede desear modificar el anticuerpo de la presente invención con respecto a la función efectora con el fin de aumentar, por ejemplo, la eficacia del anticuerpo en el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, el residuo o residuos de cisteínas se pueden introducir en la región Fc, permitiendo de esta manera la formación de enlaces disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico generado de esta manera puede mejorar la capacidad de internalización y/o incrementar la citólisis mediada por el complemento y la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Véase Caron et al., J. Exp. Med., 176: 1191-1195 (1992) y Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con una actividad anti-tumoral aumentada también se pueden preparar utilizando entrecruzadores heterobifuncionales tal y como se describe en Wolf et al. Cancer Research, 53: 2560- 2565 (1993). Alternativamente, se puede diseñar un anticuerpo para que tenga regiones Fc duales y, de esta manera, pueda aumentar la lisis complementaria y las capacidades de ADCC. Véase, Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989).
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Inmunoconjugados
La presente invención también incluye el uso de inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico, tal como un agente quimioterapéutico, toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado).
Anteriormente se han descrito agentes quimioterapéuticos útiles para la generación de dichos inmunoconjugados. Entre las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que se pueden utilizar se incluyen la cadena A de difteria, fragmentos activos no enlazantes de la toxina de difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenos. Existe un conjunto de radionucleidos disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados. Algunos ejemplos son ^{212}Bi, ^{131}I, ^{131}In, ^{90}Y y ^{168}Re.
Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se fabrican utilizando un conjunto de agentes bifuncionales acopladores de proteínas, tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCl), ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como toluen 2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina tal y como se describe en Vitella et al., Science, 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de radionucleótidos al anticuerpo. Véase WO94/11026.
En otra realización, el anticuerpo se puede conjugar a un "receptor" (tal como estreptavidina) para la utilización en el premarcado de tumores en los que el conjugado anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido de la eliminación de conjugado no enlazado de la circulación utilizando un agente purificador y, a continuación, la administración de un "ligando" (por ejemplo, avidina) que se conjuga a un agente citotóxico (por ejemplo, un radionucleótido).
Los inmunoconjugados preferidos son conjugados anticuerpo-maitansinoide. Los inmunoconjugados que contienen maitansinoides y su uso terapéutico se describen por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos Nos. 5.208.020; 5.416.064; y la Patente Europea EP 0 425 235 B1. Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA 93: 8618-8623 (1996) describieron inmunoconjugados que comprendían un maitansinoide designado DM1 unido al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra el cáncer colorrectal humano. Se observó que el conjugado era altamente citotóxico hacia las células cancerosas de colon cultivadas y mostró una actividad antitumoral en un ensayo de crecimiento de tumores in vivo. Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992) describen inmunoconjugados en los que un maitansinoide se conjugó a través de un enlace disulfuro al anticuerpo murino A7 que se unía a un antígeno en las líneas celulas res de cáncer de colon humano, o a otro anticuerpo monoclonal murino TA-1, que se une al oncogén HER-2/neu.
Los conjugados de anticuerpo-maitansinoide se preparan mediante la unión química de un anticuerpo a una molécula maitansinoide sin disminuir significativamente la actividad biológica del anticuerpo o la molécula maitansinoide. Conjugados con un promedio de 3-4 moléculas maitansinoide por anticuerpo han mostrado una eficacia en el aumento de la citotoxicidad de células diana sin afectar de forma negativa a la función o la solubilidad del anticuerpo, aunque se esperaría que incluso una molécula de toxina/anticuerpo aumentara la citotoxicidad sobre el uso de anticuerpo desnudo. Los maitansinoides son conocidos en la técnica y se pueden sintetizar mediante técnicas conocidas o se pueden aislar de fuentes naturales. Maitansinoides adecuados se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,208,020; 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,747; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254;
4,362,663; y 4,371,533. Los maitansinoides preferidos son maitansinol y análogos de maitansinol modificados en el anillo aromático o en otras posiciones de la molécula de maitansinol, tales como varios ésteres de maitansinol.
Otro inmunoconjugado de particular interés comprende un anticuerpo conjugado a una o más moléculas de caliqueamicina. La familia de antibióticos de caliqueamicina es capaz de producir roturas de ADN de doble cadena a concentraciones subpicomolares. Para la preparación de conjugados de la familia de caliqueamicina, véase las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,712,374; 5,714,586; 5,739,116; 5,767,285; 5,770,701; 5,773,001; y 5,877,296. Entre los análogos estructurales de caliqueamicina que se pueden utilizar se incluyen, pero sin limitación, \gamma_{1}^{1} \alpha_{2}^{1}, \alpha_{3}^{1}, N-acetil-\gamma_{1}^{1}, PSAG, y \theta_{1}^{1} (Hinman et al, CancerRes 53: 3336-3342 (1993); Lode et al., Cancerres 58: 2925-2928 (1998) y las patentes de Estados Unidos mencionadas anteriormente.
Otro fármaco antitumoral preferido al que el anticuerpo se puede conjugar es QFA, un antifolato. Tanto la caliqueamicina como QFA tienen sitios intracelulares de acción y no atraviesan fácilmente la membrana plasmática. Por lo tanto, la captación celular de estos agentes a través de la internalización mediada por anticuerpos aumenta ampliamente sus efectos citotóxicos.
El favorecimiento de la expresión de los polipéptidos diana, por ejemplo, antígenos de la superficie celular, según la presente invención, disminuye la dosis eficaz de los inmunoconjugados y, de este modo, elimina o reduce los problemas de toxicidad a menudo asociados con la administración de agentes citotóxicos o inmunoconjugados que contienen agentes citotóxicos.
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Inmunoliposomas
Los anticuerpos utilizados en los métodos de tratamiento de la presente invención también se pueden formular como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como los descritos en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 77: 4030 (1980); y las Patentes de Estados Unidos Nos. 4.485.045 y 4.544.545. Los liposomas con un mayor tiempo de circulación se describen en la Patente de Estados Unidos No. 5.013.556.
Se pueden generar liposomas particularmente útiles mediante el procedimiento de evaporación de fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol, y fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para obtener liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención se pueden conjugar a los liposomas tal y como se describe en Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982) mediante la reacción de intercambio de enlaces disulfuro. Opcionalmente, el liposoma contiene un agente quimioterapéutico (tal como Doxorubicina). Véase Gabizon et al., J. Nacional Cancer Inst., 81(19): 1484 (1989).
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Terapia de profármacos mediados por enzimas dependientes de anticuerpos (ADEPT)
Los anticuerpos de la presente invención también pueden usarse en ADEPT mediante la conjugación del anticuerpo a una enzima activadora de profármaco que convierte un profármaco (por ejemplo, un agente quimioterapéutico de tipo peptidilo, véase WO 81/01.145) en un fármaco anticanceroso activo. Véase, por ejemplo, WO88/07.378 y la patente de Estados Unidos No. 4.975.278.
El componente enzimático del inmunoconjugado útil para la ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar sobre un profármaco de manera que lo convierta en su forma citotóxica más activa.
Entre las enzimas que son útiles en el procedimiento de la presente invención se incluyen, pero sin limitación, la glicosidasa, la glucosa oxidasa, la lisozima humana, la glucuronidasa humana, la fosfatasa alcalina útil por convertir profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; la arilsulfatasa útil por convertir profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; citosina deaminasa útil por convertir la 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco anticanceroso 5-fluorouracilo; proteasas, tales como la proteasa de Serratia, la termolisina, la subtilisina, carboxipeptidasas (por ejemplo, carboxipeptidasa G2 y carboxipeptidasa A) y las catepsinas (tales como las catepsinas B y L), que son útiles por convertir profármacos que contienen péptidos en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir profármacos que contienen sustituyentes de tipo D-aminoácido; las enzimas que hidrolizan carbohidratos, tales como la \beta-galactosidasa y la neuraminidasa útiles por convertir profámacos glicosilados en fármacos libres; la \beta-lactamasa útil para convertir fármacos derivatizados con \beta-lactamas en fármacos libres; y las penicilin amidasas; tales como la penicilin V amidasa o la penicilin G amidasa, útiles para convertir fármacos derivatizados en sus nitrógenos de amina con grupos fenoxiacetilo o la fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, pueden usarse anticuerpos con actividad enzimática también conocidos en la técnica como "abzimas" para convertir los profármacos de la presente invención en fármacos activos libres (véase, por ejemplo, Massey, Nature, 328:457-458 (1987)). Los conjugados anticuerpo-abzima pueden prepararse como se describe aquí para la liberación del abzima a una población de células tumorales.
Las enzimas de la presente invención pueden unirse covalentemente a los anticuerpos mediante técnicas bien conocidas en el sector, tal como el uso de agentes de entrecruzamiento heterobifuncionales descritos anteriormente. Alternativamente, pueden construirse proteínas de fusión que comprenden por lo menos la región de unión al antígeno del anticuerpo de la invención unido a al menos una parte funcionalmente activa de una enzima de la invención usando técnicas de ADN recombinante bien conocidas en el sector (véase, por ejemplo, Neuberger et al., Nature, 312:604-608 (1984)).
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Composiciones farmacéuticas
Se pueden administrar anticuerpos que se unen específicamente a los antígenos de tumores según la presente invención, así como otras moléculas que reconocen dichos antígenos de tumores identificadas para el tratamiento de varios trastornos en forma de composiciones farmacéuticas.
Si el polipéptido diana (antígeno de tumor) es intracelular y se usan los anticuerpos completos como inhibidores, se prefieren anticuerpos que se internalicen. Sin embargo, se pueden utilizar también lipofecciones o liposomas para liberar el anticuerpo, o un fragmento del anticuerpo a las células. Cuando se usan fragmentos de anticuerpos, se prefiere el fragmento inhibidor más pequeño que se una específicamente al dominio de unión de la proteína diana. Por ejemplo, se pueden diseñar moléculas peptídicas que retengan la capacidad de unirse a la secuencia proteica diana basándose en las secuencias de la región variable de un anticuerpo. Dichos péptidos pueden sintetizarse químicamente y/o producirse mediante la tecnología del ADN recombinante (véase, por ejemplo, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7889-7893 [(1993]). La formulación de la presente invención también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la patología particular en tratamiento, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan de manera adversa entre sí. Alternativamente, o adicionalmente, la composición puede comprender un agente que aumenta su función, tal como, por ejemplo, un agente citotóxico, citoquina, un agente quimioterapéutico, o un agente inhibidor del crecimiento. Dichas moléculas están presentes de manera adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para el objetivo pretendido.
Los principios activos pueden también encapsularse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed. (1980).
Las formulaciones a usar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles.
Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Entre los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida se incluyen matrices semipermeables de polímeros sólidos hidrofóbicos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Entre los ejemplos de matrices de liberación sostenida se incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), o poli(vinilalcohol)), poliláctidos (patente de Estados Unidos 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamato, copolímeros no degradables de acetato de vinilo-etileno, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico, tales como LUPRON DEPOT^{TM} (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolide), y ácido poli-D-(-)3-hidroxibutírico. Mientras que polímeros tales como el acetato de vinilo-etileno y de ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el organismo durante un tiempo prolongado, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado de la exposición a la humedad a 37ºC, lo que da lugar a una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Deben idearse estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de un enlace S-S intermolecular a través de un intercambio tio-disulfuro, la estabilización puede lograrse modificando residuos sulfhidrilos, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos adecuados, y desarrollando composiciones específicas de matrices poliméricas.
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Métodos de tratamiento
Se contempla que los anticuerpos y otros compuestos antitumorales para su uso en la presente invención pueden utilizarse para el tratamiento de varias patologías, incluyendo aquellas caracterizadas por la sobreexpresión y/o activación de los antígenos de tumores identificados aquí. Las dianas particularmente preferidas para el tratamiento con anticuerpos y otros antagonistas de la presente invención son tumores que albergan defectos genéticos en el mecanismo de Wnt-1 (por ejemplo, que conduce a la activación anormal de señalización de \beta-catenina) y/o sobreexpresan un antígeno de tumor identificado aquí. De este modo, por ejemplo, se ha observado que los cánceres humanos que albergan defectos genéticos en el mecanismo de Wnt-1 también muestran habitualmente la sobreexpresión de antígeno de tumor Stra6, pero se sabe que no todos tumores que sobreexpresan Stra6 están asociados con mutaciones en el mecanismo de Wnt-1. Los antagonistas de la presente invención presentan un gran potencial en el tratamiento de tumores caracterizados por la señalización de Wnt aberrante, especialmente cuando el antígeno diana se caracteriza por el aumento sinérgico de su expresión mediante la combinación de Wnt-1 y el tratamiento con retinoides. Los tumores para el tratamiento de la presente invención son tumores de un cáncer humano seleccionado entre cáncer colorrectal, de ovario, de endometrio, y tumor de riñón de Wilm, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer gástrico, cáncer de pulmón, cáncer hepatocelular, melanoma, y feocromocitoma (un tumor derivado de la médula
adrenal).
Los agentes antitumorales de la presente invención, por ejemplo, anticuerpos, se administran a un mamífero, preferiblemente humano, en combinación con un retinoide, por ejemplo, ácido retinoico, según procedimientos conocidos, tales como la administración intravenosa como un bolo o mediante perfusión continua durante un periodo de tiempo, mediante vía intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, o inhalatoria. Se prefiere la administración intravenosa del anticuerpo. Los retinoides se pueden administrar mediante la misma o diferentes rutas de administración. En el ejemplo 15 se ha observado que el ácido todo-trans-retinol (ATRA) es eficaz cuando se administra oralmente. En base a este hallazgo experimental, y también en vista de su conveniencia, se prefiere la administración oral de los retinoides. Alternativamente o adicionalmente, los retinoides se pueden también administrar mediante inserción peritumoral.
El tratamiento con retinoides puede preceder o seguir al tratamiento con el agente antitumoral, por ejemplo, un anticuerpo, o puede tener lugar simultáneamente. Dado que el principal objetivo del tratamiento con retinoides es favorecer la expresión del antígeno diana para aumentar la eficacia de la terapia contra el tumor, el retinoide se administra preferiblemente antes o simultáneamente con un agente antitumoral. En el caso de un tratamiento concurrente, el agente antitumoral y el retinoide se pueden formular por separado, o se pueden incluir en la misma composición farmacéutica. La cantidad eficaz de un retinoide se puede determinar ensayo de rutina, y habitualmente es entre aproximadamente 15 mg/kg y aproximadamente 400 mg/kg, preferiblemente entre aproximadamente 20 mg/kg y aproximadamente 200 mg/kg, más preferiblemente entre aproximadamente 25 mg/kg y aproximadamente 150 mg/kg de peso corporal. Además, el tratamiento puede implicar la administración de un Wnt, por ejemplo, Wnt-1, ya que la coadministración de un retinoides y Wnt, por ejemplo, Wnt-1, puede inducir sinérgicamente los genes identificados aquí. La coadministración incluye la administración simultánea o la administración consecutiva de los dos agentes en cualquier orden.
Actualmente, dependiendo de la fase de cáncer, el tratamiento de cáncer implica una o una combinación de las siguientes terapias: cirugía para extraer el tejido canceroso, terapia con radiación y quimioterapia. Los métodos de tratamiento de la presente invención mejoran el índice terapéutico de agentes antitumorales, tales como anticuerpos, y permiten de este modo la reducción de la dosis eficaz a administrar. Por consiguiente, los métodos terapéuticos de la presente invención son especialmente útiles en el tratamiento de pacientes de edad y de otros que no toleran bien la toxicidad y los efectos secundarios de la quimioterapia y en una enfermedad metastática cuando la terapia con radiación tiene una utilidad limitada.
Pueden combinarse otros regímenes terapéuticos con la administración de agentes anticancerosos, por ejemplo, anticuerpos y retinoides. Por ejemplo, el paciente a tratar con dichos agentes anticancerosos puede también recibir terapia con radiación y/o pueden someterse a cirugía. Alternativa o adicionalmente, puede administrarse al paciente un agente quimioterapéutico. La preparación y programaciones de las dosis de dichos agentes quimioterapéuticos se pueden utilizar según las instrucciones del fabricante o tal como se determina empíricamente por un técnico en la materia. La preparación y programaciones de las dosis para dicha quimioterapia también se describen en Chemotherapy Service, Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimores, MD (1992). El agente quimioterapéutico puede preceder o seguir a la administración del agente anti-tumoral, por ejemplo el anticuerpo, o pueden administrarse simultáneamente. El anticuerpo puede combinarse con un compuesto anti-estrógeno, tal como tamoxifeno o uno anti-progesterona, tal como la onapristona (véase EP 616.812) en dosificaciones conocidas para dichas moléculas.
También puede ser deseable administrar anticuerpos contra otros antígenos asociados a tumores, tales como anticuerpos que se unen al ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4, o al factor endotelial vascular (VEGF). Alternativa o adicionalmente, pueden coadministrarse al paciente dos o más anticuerpos que se unen a los mismos o dos o más antígenos diferentes descritos aquí. A veces, puede ser beneficioso administrar también una o más citoquinas al paciente. En una realización preferida, los anticuerpos de la presente invención se coadministran con un agente inhibidor del crecimiento. Por ejemplo, el agente inhibidor del crecimiento puede administrarse en primer lugar, seguido de un anticuerpo de la presente invención. Sin embargo, también se contempla la administración simultánea o la administración del anticuerpo de la presente invención. Dosis adecuadas del agente inhibidor del crecimiento son las utilizadas en la actualidad y pueden disminuirse debido a la acción combinada (sinergia) del agente inhibidor del crecimiento y del anticuerpo de la presente invención.
Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosis adecuada de un agente antitumoral, por ejemplo, un anticuerpo de la presente invención, dependerá del tipo de enfermedad a tratar, tal como se definió anteriormente, de la gravedad y de la evolución de la enfermedad tanto si el agente se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, de terapias previas, del historial clínico del paciente y de la respuesta al agente y de la discreción del médico responsable. El agente se administra de forma adecuada al paciente en una sola vez o durante una serie de tratamientos.
Por ejemplo, dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, una dosis candidata inicial para la administración al paciente es de aproximadamente 1 \mug/Kg a 15 mg/Kg (por ejemplo 0,1-20 mg/Kg) de anticuerpo, bien mediante, por ejemplo, una o más administraciones por separado, o mediante perfusión continua. Una dosis diaria habitual podría variar entre aproximadamente 1 \mug/Kg a 100 mg/Kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la patología, el tratamiento se prolonga hasta la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.
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5. Artículos de fabricación
En otra realización de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende los anticuerpos u otro antagonista de la presente invención, en combinación con un retinoides. Esta puede estar contenida en un artículo de fabricación que comprende un recipiente y una etiqueta. Entre los recipientes adecuados se incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas y tubos de ensayo. Los recipientes pueden estar formados de diversos materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es efectiva para el tratamiento de una patología reconocida y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón penetrable por una aguja de inyección hipodérmica). El agente activo en la composición es habitualmente un agente antitumoral capaz de interferir con la actividad de un producto génico identificado aquí, por ejemplo, un anticuerpo. La etiqueta sobre el recipiente, o asociado con el mismo, indica que la composición se utiliza para el diagnóstico o el tratamiento de la patología de elección. El artículo de fabricación puede comprender además, en el mismo recipiente o separado, un retinoides y opcionalmente un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede además incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con las instrucciones para su utilización.
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6. Métodos de diagnóstico
Aunque las proteínas de la superficie celular, tales como receptores del crecimiento sobreexpresados en ciertos tumores son dianas excelentes para fármacos candidatos o el tratamiento de tumores (por ejemplo, cáncer), las mismas proteínas junto con las proteínas secretadas codificadas por los genes amplificados en células tumorales son útiles adicionalmente en el diagnóstico y pronóstico de tumores. Por ejemplo, los anticuerpos dirigidos contra los productos proteicos de genes amplificados en células tumorales se pueden utilizar como diagnóstico o pronóstico de tumores.
Por ejemplo, los anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpos, se pueden utilizar para detectar cualitativamente o cuantitativamente la expresión de proteínas codificadas por los genes amplificados ("productos génicos marcadores"). El anticuerpo está equipado preferiblemente con un marcador detectable, por ejemplo fluorescente, y la unión se puede seguir mediante microscopía de luz, citometría de flujo, fluorimetría, u otras técnicas conocidas en la técnica. Estas técnicas son particularmente adecuadas, si el gen amplificado codifica una proteína de la superficie celular, por ejemplo, un factor de crecimiento. Dichos ensayos de unión se realizan esencialmente tal como se ha descrito anteriormente.
Los ensayos de diagnóstico de la presente invención presentan la ventaja del hallazgo de que los retinoides, por ejemplo, ácido retinoico, favorecen selectivamente la expresión de los antígenos de tumores identificados aquí. Por consiguiente, los ensayos de diagnóstico se realizan conjuntamente con el tratamiento con retinoides, donde el tratamiento con retinoides puede preceder, tener lugar simultáneamente, o después de la administración del agente de diagnóstico que reconoce un antígeno de tumor, tal como un anticuerpo correspondiente. Este favorecimiento selectivo de la expresión del antígeno de tumor mediante el tratamiento con retinoides mejora ampliamente la sensibilidad del ensayo de diagnóstico y puede permitir la detección de antígenos de tumor que en cualquier otro caso no sería detectable. A su vez, esto permite una detección precoz del tumor y una intervención precoz utilizando el tratamiento más adecuado, incluyendo el reconocimiento del antígeno del tumor identificado.
La detección in situ de la unión de anticuerpos a los productos génicos marcadores se puede realizar, por ejemplo, mediante inmunofluorescencia o microscopía inmunoelectrónica. Para este objetivo, se extrae una muestra histológica del paciente y se aplica el anticuerpo marcado a la misma, preferiblemente mediante el revestimiento del anticuerpo sobre la muestra biológica. Este procedimiento también permite determinar la distribución del producto génico marcador en el tejido examinado. Será evidente para los expertos en la materia que se disponen fácilmente una amplia variedad de métodos histológicos para la detección in situ.
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Ejemplos
Los reactivos disponibles comercialmente referidos en los ejemplos se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante salvo que se indique lo contrario. La fuente de las células se han identificado en los ejemplos siguientes, y a lo largo de la memoria, por los números de acceso ATCC que corresponden al American Type Culture Collection, Manassas, VA. En los siguientes ejemplos, a menos que se especifique lo contrario, "Stra6" se referirá al polipéptido PRO01282 de secuencia nativa.
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Ejemplo 1 Aislamiento de clones de ADNc que codifican los polipéptidos PRO10282 y PRO19578 humanos
Se identificaron los clones de ADNc (DNA148380-2827 y DNA148399-2827-1) que codificaban los polipéptidos PRO10282 y PRO19578 nativos humanos utilizando una cribado con levadura, en una biblioteca de ADNc de cerebro fetal humano que preferentemente representa los extremos 5' de los clones de ADNC primario.
El clon DNA148380-2827 contiene un único marco de lectura abierto con un sitio de inicio de la traducción aparente en las posiciones de nucleótidos 49-51 y que acaba en el codón de parada en las posiciones de nucleótidos 2050-2052 (Figura 1). El precursor del polipéptidos previsto tiene 67 aminoácidos de largo (figuras 2). La proteína PRO10282 de longitud completa mostrada en la figura 2 tiene un peso molecular estimado de aproximadamente 73502 daltons y un pI de aproximadamente 8,26. El análisis de la secuencia de PRO10282 de longitud completa mostrada en la figura 2 (SEC ID No. 2) pone de manifiesto la presencia de una variedad de dominios de polipéptido importantes tal como se muestra en la figura 2, donde las localizaciones indicadas para estos dominios de polipéptido importantes son aproximadamente como las descritas anteriormente. El clon DNA148380-2827 se ha depositado con ATCC el 11 de enero de 2000 y se le asignó ATCC Depósito No. PTA-1181.
El clon DNA148389-2827-1 contiene un único marco de lectura abierto con un sitio de inicio de la traducción aparente en las posiciones de nucleótidos 186-188 y que acaba en el codón de parada en las posiciones de nucleótidos 2160-2162 (Figura 6, SEC ID No. 4). El precursor del polipéptidos previsto tiene 658 aminoácidos de largo (figuras 7, SEC ID No. 5). La proteína PRO19578 de longitud completa mostrada en la figura 7 tiene un peso molecular estimado de aproximadamente 72583 daltons y un pI de aproximadamente 9,36. El análisis de la secuencia de PRO19578 de longitud completa mostrada en la figura 7 (SEC ID No. 5) pone de manifiesto la presencia de una variedad de dominios de polipéptido importantes tal como se muestra en la figura 7, donde las localizaciones indicadas para estos dominios de polipéptido importantes son aproximadamente como las descritas anteriormente. Cabe destacar la presencia de nueve dominios transmembrana potenciales y catorce residuos conservados entre la secuencia humana y la correspondiente secuencia de ratón. Aunque la Stra6 de ratón tiene tres sitios potenciales de glicosilación unidos a N, el polipéptido PRO19578 humano (Stra6 nativo humano) tiene uno. El clon 148389-2827-1 se ha depositado con ATCC el 23 de febrero de 2000 y se le asignó ATCC Depósito No. PTA-1405.
Un análisis de la base de datos Dayhoff (versión 35.45 SwissProt 35), que utiliza el análisis de alineación de secuencias ALIGN-2 de la secuencia de longitud completa mostrada en la figura 2 (SEC ID No. 2) y de la secuencia de longitud completa mostrada en la figura 7 (SEC ID No. 5), puso de manifiesto la identidad de secuencia entre la secuencia de aminoácidos de PRO10282 y las siguientes secuencias Dayhoff: AF062476, P_W88559 y HGS_RE259.
Tal como se muestra en la figura 8, la comparación de los polipéptidos PRO10282 y PRO19578 humano de longitud completa muestra que el PRO19578 contiene una deleción de nueve aminoácidos (SPVDFLAGD; SEC ID NO: 13) en las posiciones 89-97 de la secuencia de aminoácidos de PRO10282. Además, PRO19578 contiene una isoleucina (I) en el aminoácido de posición 518 en lugar de metionina (M) en la correspondiente posición (posición 527) de PRO10282, que resulta del polimorfismo G/A en esta posición. Se cree que tanto el polipéptido PRO10282 como el polipéptido PRO19578 de secuencia nativa son los homólogos humanos del polipéptido Stra6 de ratón y, por tanto, también se les hace referencia como "Stra6". El Stra6 de ratón y el polipéptido PRO10282 de longitud completa de humano de secuencia nativa codificado por DNA148340-2827 muestra aproximadamente un 74% de identidad en la secuencia de aminoácidos.
La figura 9 muestra la representación de hidrofobicidad del polipéptido PRO10282 de longitud completa humano de secuencia nativa codificado por DNA148380-2827, referido brevemente como "Stra6 humano." Tal como se muestra en la figura 9, aproximadamente el 50% de los residuos de aminoácidos en este polipéptido de 667 aminoácidos de largo son hidrofóbicos.
El gen de Stra6 humano se localizó en el cromosoma 15q23 determinado por UNIGENE. El mapeo refinado preliminar indica que Stra6 se localiza en el intervalo STS D15S124-D15S160 y la posición GeneMap'98 corresponde a 244,52 en el mapa G3.
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Ejemplo 2 Uso de RPO10282 y PRO19578 como sonda de hibridación
El procedimiento siguiente describe la utilización de una secuencia de nucleótidos que codifica PRO10282 y PRO19578 como una sonda de hibridación.
El ADN que comprende la secuencia codificante de PRO10282 o PRO19578 de longitud completa o maduros se utilizan como una sonda para cribar los ADNs homólogos (como los que codifican las variantes naturales de PRO10282 o PRO19578 en las bibliotecas de ADNc de tejido humano o las bibliotecas genómicas de tejidos humanos.
La hibridación y lavado de los filtros que contienen los ADNs de las bibliotecas se realiza en las siguientes condiciones de astringencia elevada. La hibridación de la sonda derivada de PRO10282 radiomarcada a los filtros se realiza en una solución de formamida al 50%, 5XSSC, SDS al 0,1%, pirosfosfato sódico al 0,1%, fosfato sódico 50 mM, pH 6,8, solución de 2xDenhardt y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC durante 20 horas. El lavado de los filtros se realiza en una solución acuosa de 0,1XSSC y SDS al 0,1% a 42ºC.
Los ADNs que tienen una identidad de secuencia deseada con el ADN que codifica la secuencia de PRO10282 y PRO19578 nativa de tamaño completo pueden identificarse mediante técnicas estándares conocidas en la materia.
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Ejemplo 3 Expresión de PRO10282 y PRO10978 en E. coli
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma no glicosilada de PRO10282 o PRO19578 mediante expresión recombinante en E. coli.
La secuencia de ADN que codifica PRO10282 o RPO19578 se amplifica inicialmente con cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores deben contener dianas de enzimas de restricción que corresponden a las dianas de enzimas de restricción en el vector de expresión seleccionado. Pueden utilizarse diversos vectores de expresión. Un ejemplo de un vector adecuado es pBR322 (derivado de E. coli; véase Bolivar y col., Gene, 2:95 (1977)) que contiene genes para la resistencia a ampicilina y tetraciclina. El vector se digiere con la enzima de restricción y se desfosforila. Las secuencias de PCR amplificadas se ligan a continuación en el vector. El vector incluirá preferentemente secuencias que codifican un gen de resistencia a un antibiótico, un promotor trp, una secuencia líder de poli-His (incluyendo los 6 primeros codones STII, la secuencia poli-His, y la diana de división para enteroquinasa), la región codificante de PRO10282 o PRO19578, el terminador transcripcional de lambda y un gen argU.
La mezcla de ligación se utiliza a continuación para transformar una cepa de E. coli mediante procedimientos descritos en Sambrook et al., supra. Los transformantes se identificaron por su capacidad para crecer en placas de LB y a continuación se seleccionaron las colonias resistentes al antibiótico. El ADN plasmídico puede aislarse y comprobarse por análisis de restricción y secuenciar el ADN.
Los clones seleccionados se pueden desarrollar durante toda la noche en un medio de cultivo líquido tal como el caldo LB suplementado con antibióticos. El cultivo de toda la noche se puede utilizar posteriormente para inocular un cultivo a mayor escala. A continuación, las células se desarrollan hasta una densidad óptica deseada, durante la cual el promotor de la expresión se activa.
Después de cultivar las células durante muchas más horas, las células se pueden recoger mediante centrifugación. El residuo de células obtenido mediante la centrifugación se puede solubilizar utilizando diversos agentes conocidos en la técnica, y la proteína PRO10282 solubilizada se puede a continuación purificar utilizando una columna quelante de metal en condiciones que permiten la unión fuerte de la proteína.
El PRO10282 o PRO19578 puede expresarse en E. coli en forma de etiqueta de poli-His, utilizando el siguiente procedimiento. El ADN que codifica PRO10282 o RPO19578 se amplifica inicialmente utilizando cebadores del PCR seleccionados. Los cebadores contendrán sitios para las enzimas de restricción que se corresponden con los sitios para enzimas de restricción en el vector de expresión seleccionado, y otras secuencias útiles que proporcionan una iniciación de la traducción eficaz y fiable, una purificación rápida en una columna quelante metálica, y la eliminación proteolítica con enteroquinasa. Las secuencias etiquetadas de poli-His amplificadas por PCR se unen a continuación en un vector de expresión que se utiliza para transformar un E. coli huésped basado en la cepa 52 (W3110 fuhA(tonA) Ion galE rpoHts(htpRts) clpP(laclq). Los transformantes se cultivan en primer lugar en LB que contiene 50 mg/ml de carbenicilina a 30ºC con agitación hasta alcanzar una D.O.600 de 3-5. Los cultivos se diluyen a continuación 50-100 veces en un medio CRAP (preparado mezclando 3,57 g de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,71 g de citrato de sodio\cdot2H_{2}O, 1,07 g de KCl, 5,36 g de extracto de levadura Difco, 5,36 g de Sheffield hycase SF en 500 ml de agua, además de 110 mM de MPOS, pH 7,3, glucosa al 0,55% (p/v) y 7 mM de MgSO_{4}) y se desarrollan durante aproximadamente 20-30 horas a 30ºC con agitación. Las muestras se extraen para verificar la expresión mediante un análisis SDS-PAGE, y el volumen del cultivo se centrifuga hasta que las células son residuos de centrifugación. Los residuos de centrifugación de las células se congelan hasta la purificación y el repliegue.
La masa de E. coli de fermentaciones de 0,5 a 1 L (6-10 g de residuos de centrifugación) se resuspende en 10 volúmenes (p/v) de 7 M de guanidina, 20 mM de Tris, tampón de pH 8. Se añade sulfito sódico sólido y tetrationato de sodio para que las concentraciones finales sean de 0,1 M y 0,02 M, respectivamente, y la solución se agita durante toda la noche a 4ºC. Este paso da lugar a una proteína desnaturalizada con todos los residuos de cisteína bloqueados por la sulfitolización. La solución se centrifuga a 40.000 rpm durante 30 minutos en una ultracentrífuga Beckman. El sobrenadante se diluye con 3-5 volúmenes de tampón de columna quelante metálica (6 M de guanidina, 20 mM de Tris, pH 7,4) y se filtra a través de filtros de 0,22 micras para aclarar. El extracto aclarado se carga en una columna quelante metálica Qiagen Ni-NTA de 5 ml equilibrada con el tampón de columna quelante metálica. La columna se lava con un tampón adicional que contiene 50 mM de imidazol (Calbiochem, grado Utrol), pH 7,4. La proteína se eluye con un tampón que contiene 250 mM de imidazol. Las fracciones que contienen la proteína de interés se agrupan y se guardan a 4ºC. La concentración de la proteína se estima según su absorbancia a 280 nm utilizando el coeficiente de extinción calculado en base a su secuencia de aminoácidos.
Las proteínas se repliegan mediante la dilución lenta de la muestra en tampón de repliegue preparado fresco consistente en: 20 mM de Tris, pH 8,6, 0,3 M de NaCl, 2,5 M de urea, 5 mM de cisteína, 20 mM de glicina y 1 mM de EDTA. Los volúmenes de repliegues se escogen de manera que la concentración final de proteína esté entre 50 y 100 microgramos/ml. La solución de repliegue se agita suavemente a 4ºC durante 12-36 horas. La reacción de repliegue se detiene mediante la adición de TFA hasta una concentración final del 0,4% (pH aproximadamente de 3). Antes de otra purificación de la proteína, la solución se filtra a través de un filtro de 0,22 micras y se añade acetonitrilo hasta una concentración final del 2-10%. La proteína replegada se somete a una columna de cromatografía en una columna de fase inversa Poros R1/H utilizando un tampón móvil de TFA al 0,1% con elución con un gradiente de acetonitrilo del 10 al 80%. Las alícuotas de fracciones con una absorbancia A280 se analizan en geles de SDS poliacrilamida y las fracciones que contienen proteína replegada homogénea se agrupan. Generalmente, las muestras replegadas correctamente de la mayoría de las proteínas se eluyen a las concentraciones más bajas de acetronitrilo, ya que esas muestras son las más compactas con sus interiores hidrofóbicos protegidos de la interacción con la resina de fase inversa. Las muestras agregadas se eluyen normalmente a concentraciones de acetonitrilo superiores. Además de resolver las formas desplegadas de proteínas de la manera deseada, la etapa de la fase inversa también elimina la endotoxina de las muestras.
Las fracciones que contienen el polipéptido PRO10282 o PRO19578 plegados deseado se agrupan y se elimina el acetonitrilo utilizando una corriente suave de nitrógeno dirigida a la solución. Las proteínas se formulan en 20 mM Hepes, pH 6,8 con 0,14 M de cloruro sódico y manitol al 4% por diálisis o por filtración en gel utilizando resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas en el tampón de formulación y filtradas de forma estéril.
Específicamente, se expresaron por separado dos dominios extracelulares (ECD) de la proteína Stra6 nativa
PRO10282, Pepetide A (aminoácidos 229-295) y el Pepetide B (aminoácidos 532-667) como péptidos en el cito-
plasma de E. coli con una secuencia líder de polihistidina N-terminal que tenía la secuencia de aminoácidos
MKHQHQHQHQHQHQMHQ (SEC ID NO: 12). Esta secuencia líder proporciona un inicio de la traducción óptimo, una purificación en una columna quelante de níquel, y la eliminación eficaz, si se desea, con el sistema TAGZyme (Unizyme Laboratories). La transcripción fue controlada por el promotor de fosfatasa alcalina de E. coli (Kikuchi et al., Nucleic Acids Res. 9: 5671-5678 [1981]) y el sitio de unión a ribosoma del operón trp (Yanofsky et al., Nucleic Acids Res. 9: 6647-6668 [1981]) proporcionado para la traducción. En dirección 3' del codón de terminación de la traducción se encuentra el terminador de la transcripción lto (Scholtissek and Grosse, Nucleica Acids Res. 15: 3185 [1987]) seguido por los genes de ARNT de codones raros pro2, argU, y glyT (Komine et al., J. Mol. Biol. 212:579-598 [1990]; Fournier and Ozeki, Microbiol. Rev. 49: 379.397 [1985]).
Los dos fragmentos de ADN de la secuencia codificante de ECD de Stra6 se prepararon mediante PCR a partir de un clon de ADNc de longitud completa, y se insertaron en el vector de expresión descrito anteriormente, que se designó como pST239. Después de verificar la secuencia de ADN, los nuevos plásmidos de expresión de Stra6, designados como PE148380A y PE148380B, se transformaron en la cepa de E. coli 58F3 ((fhuAD (tonAD) lonD galE rpoHts (htpRts) DclpP laclq DompTD (nmpc-fepE) DslyD). Los cultivos de caldo Luria de estos transformantes se desarrollaron en primer lugar durante toda la noche a 30ºC y a continuación se diluyeron 100 veces en medio limitante de fosfato para inducir el promotor de fosfatasa alcalina. Después de 24 horas a 30ºC con agitación, los cultivos se centrifugaron y las masas celulares se congelaron hasta el inicio de la purificación de los péptidos.
Para la purificación, se resuspendieron las masas de E. coli (residuos de 6-10 g) en 10 volúmenes (p/p) de 7 M de guanidina HCl, 20 mM Tris, pH 8, tampón. Se añadieron sulfito de sodio sólido y tetrationato de sodio para obtener unas concentraciones finales de 0,1 M y 0,02 M, respectivamente, y la solución se agitó durante toda la noche a 4ºC. La solución se aclaró mediante centrifugación y se cargó en una columna quelante metálica Ni-NTA de Qiagen equilibrada en 6 M de guanidina, HCl, 20 mM Tris, pH 7,4. La columna se lavó con tampón adicional que contenía 50 mM de imidazol (Calbiochem, Utrol grade). La proteína se eluyó con tampón que contenía 250 mM de imidazol. Las fracciones que contenía la proteína deseada se agruparon, se dializaron contra HCl 1 mM y se guardaron a 4ºC.
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Ejemplo 4 Expresión de PRO10282 y PRO19578 en células de mamíferos
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma potencialmente glicosilada de PRO10282 y PRO19578 mediante la expresión recombinante en células de mamíferos.
El vector pRK5 (véase EP 307.247, publicada el 15 de marzo de 1989) se utiliza como vector de expresión. Opcionalmente, el ADN de PRO10282 o PRO19578 está ligado en el pRK5 con enzimas de restricción seleccionadas para permitir la inserción del ADN de PRO10282 utilizando procedimientos de unión tales como los descritos en Sambrook et al., supra. El vector resultante se denomina pRK5-PRO10282 y pRK5-PRO19578, respectivamente.
En una realización, las células huésped seleccionadas pueden ser células 293. Las células 293 humanas (ATCC CCL 1573) se cultivan para unirse en placas de cultivo de tejidos en un medio tal como DMEM suplementado con suero de ternera fetal y opcionalmente, componentes nutricionales y/o antibióticos. Se mezclan aproximadamente 10 \mug de ADN de pRK5-PRO10282 o pRK5-PRO19578 con aproximadamente 1 g de ADN que codifica el gen del ARN de VA [Thimmappaya et al., Cell, 31:543 (1982)] y se disuelve en 500 \mul de 1 mM de Tris-HCl, 0,1 mM de EDTA, 0,227 M de CaCl_{2}. A esta mezcla se le añade, gota a gota, 500 \mul de 50 mM de HEPES (pH 7,35), 280 mM de NaCl, 1,5 mM de NaPO_{4}, y se deja formar un precipitado durante 10 minutos a 25ºC. El precipitado se suspende y se añade a células 293 y se deja reposar durante aproximadamente cuatro horas a 37ºC. El medio de cultivo se aspira y se añaden 2 ml de glicerol al 20% en PBS durante 30 segundos. A continuación, las células 293 se lavan con medio sin suero, se añade medio nuevo y las células se incuban durante aproximadamente 5 días.
Aproximadamente 24 horas después de las transfecciones, el medio de cultivo se extrae y se reemplaza por medio de cultivo (solo) o medio de cultivo que contiene 200 \muCi/ml de ^{35}S-cisteína y 200 \muCi/ml ^{35}S-metionina. Tras una incubación de 12 horas, se recoge el medio acondicionado, se concentra en un filtro de centrifugación y se carga en un gel SDS al 15%. El gel procesado puede secarse y exponerse a una película durante un período de tiempo concreto para revelar la presencia del polipéptido PRO10282. Los cultivos que contienen células transfectadas pueden experimentar una incubación adicional (en medio sin suero) y el medio se examina en bioensayos concretos.
En una técnica alternativa, se puede introducir PRO10282 o PRO19578 en células 293 transitoriamente utilizando el procedimiento del sulfato de dextrano descrito por Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12: 7575 (1981). Las células 293 se cultivan hasta la máxima densidad en un frasco giratorio y se añaden 700 \mug de ADN de pRK5-PRO 10282 o pRK5-PRO19578. En primer lugar, las células se concentran en el frasco giratorio mediante centrifugación y se lavan con PBS. El precipitado de ADN-dextrano es incubado en el residuo celular durante cuatro horas. Las células se tratan con glicerol al 20% durante 90 segundos, se lavan con medio de cultivo de tejido, y se reintroducen en el frasco giratorio que contiene el medio de cultivo de tejidos, 5 \mug/ml de insulina bovina y 0,1 \mug/ml de transferrina bovina. Después de aproximadamente cuatro días, el medio acondicionado se centrifuga y se filtra para eliminar las células y la debris. La muestra que contiene PRO10282 o PRO19578 expresados se puede concentrar a continuación y purificar mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como la diálisis y/o cromatografía en columna.
En otra realización, PRO10282 o PRO19578 pueden expresarse en células CHO. El pRK5-PRO10282 o pRK5-PRO19578 pueden transfectarse en células CHO utilizando reactivos conocidos, tales como CaPO_{4} o DEAE-dextrano. Tal y como se ha descrito anteriormente, los cultivos celulares pueden incubarse, y el medio remplazarse por medio de cultivo (solo) o medio que contiene un radiomarcador, tal como la ^{35}S-metionina. Después de determinar la presencia del polipéptido PRO10282 o PRO19578, el medio de cultivo puede remplazarse por medio sin suero. Preferiblemente, los cultivos se incuban durante aproximadamente 6 días y, a continuación, se recoge el medio acondicionado. A continuación, el medio que contiene PRO10282 o PRO19578 expresados pueden concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado.
El PRO10282 o PRO19578 etiquetados con epítopo pueden expresarse también en células CHO huésped. El PRO10282 o PRO19578 deben subclonarse fuera del vector pRK5. El inserto del subclón puede experimentar PCR para fusionarse en el marco de lectura con una etiqueta de epítopo concreta, tal como una etiqueta de poli-his en un vector de expresión de Baculovirus. El inserto de PRO10282 o PRO19578 etiquetados con poli-his puede subclonarse a continuación en un vector impulsado por SV40 que contiene un marcador de selección, tal como DHFR, para seleccionar clones estables. Finalmente, las células CHO pueden transfectarse (tal y como se describe anteriormente) con el vector impulsado por SV40. El marcaje puede realizarse, tal y como se ha descrito anteriormente, para verificar la expresión. El medio de cultivo que contiene el PRO10282 o PRO19578 etiquetados con poli-His expresados puede a continuación concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como mediante cromatografía de afinidad de quelante-Ni^{2+}.
PRO10282 o PRO19578 pueden expresarse también en células CHO y/o COS mediante un procedimiento de expresión transitoria o en células CHO mediante otro procedimiento de expresión estable.
La expresión estable en células CHO se realiza utilizando el siguiente procedimiento. Las proteínas se expresan como una construcción IgG (inmunoadhesina), en la que las secuencias codificantes para las formas solubles (por ejemplo, los dominios extracelulares) de las proteínas respectivas se fusionan a una secuencia de región constante de IgGI que contiene la bisagra, CH2 y los dominios de CH2 y/o es una forma etiquetada con poli-his.
Tras la amplificación por PCR, los ADNs respectivos se subclonan en un vector de expresión de CHO utilizando técnicas estándar descritas en Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unidad 3.16, John Wiley and Sons (1997). Los vectores de expresión de CHO se construyen para tener sitios de restricción 5' y 3' compatibles del ADN de interés para permitir el traslado adecuado de los de ADNc. El vector utilizado en la expresión en las células CHO es tal y como se describe en Lucas et al., Nucl. Acid Res. 24:9 (1774-1779 (1996), y utiliza el promotor/potenciador temprano de SV40 para dirigir la expresión del ADNc de interés y la dihidrofolato reductasa (DHFR). La expresión de DHFR permite la selección para el mantenimiento estable del plásmido tras la transfección.
Se introducen doce microgramos del ADN plásmido deseado en aproximadamente 10 millones de células CHO utilizando reactivos de transfección Superfect® (Quiagen), Dosper® o Fugene® (Boehringer Mannheim) disponibles comercialmente. Las células se cultivan tal y como se describe en Lucas et al., supra. Se congelan aproximadamente 3 x 10^{-7} células en una ampolla para un crecimiento y producción posterior tal y como se describe a continuación.
Las ampollas que contienen el ADN plásmido se descongelan mediante un baño de agua y se mezclan mediante centrifugación. El contenido se pipetea en un tubo de centrífuga que contiene 10 mL de medio y se centrifuga a 1000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se aspira y las células se resuspenden en 10 ml de medio selectivo (PS20 filtrado a 0,2 \mum con un 5% de suero bovino fetal dialfiltrado a 0,2 \mum). A continuación, las células se fraccionan en un centrifugador de 100 mL que contiene 90 mL del medio selectivo. Después de 1-2 días, las células se transfieren a un centrifugador de 250 mL lleno con 150 mL de medio de crecimiento selectivo y se incuban a 37ºC. Después de otros 2-3 días, se siembran centrifugadores de 250 mL, 500 mL y 2000 mL con 3 x 10^{5} células/mL. El medio celular se cambia por medio fresco mediante centrifugación y resuspensión en el medio de producción. Aunque se puede utilizar cualquier medio de CHO adecuado, en realidad se puede utilizar un medio de producción descrito en la patente estadounidense No. 5.122.469, concedida el 16 de junio de 1992. Se siembra un centrifugador de 3L de producción hasta 1,2 x 10^{6} células/ml. En el día 0, se determina el pH del número de células. En el día 1, se toman muestras en el centrifugador y se inicia el burbujeo con aire filtrado. En el día 2, se toman muestras en el centrifugador, la temperatura se cambia a 33ºC, y se toman 30 mL de glucosa a 500 g/L y 0,6 mL de antiespuma al 10% (por ejemplo, emulsión de polidimetilsiloxano al 35%, Dow Coming 365 Medical Grade Emulsion). Durante toda la producción, el pH se ajusta según la necesidad manteniéndose en valores alrededor de 7,2. Después de 10 días, o hasta que la viabilidad cae por debajo del 70%, el cultivo celular se recoge mediante centrifugación y se filtra a través de un filtro de 0,22 \mum. El filtrado se guarda a 4ºC o se carga inmediatamente en columnas para la purificación.
Para las construcciones etiquetadas de poli-his, las proteínas se purifican utilizando una columna de Ni-NTA (Qiagen). Antes de la purificación, se añade imidazol al medio acondicionado hasta una concentración de 5 mM. El medio acondicionado se bombea en una columna de 6 ml de Ni-NTA equilibrada en 20 mM Hepes, pH 7,4, tampón que contiene 0,3 M de NaCl y 5 mM de imidazol a una velocidad de flujo de 4-5 ml/min. a 4ºC. Tras cargarse, la columna se lava con un tampón de equilibrio adicional y la proteína se eluye con el tampón de equilibrio que contiene 0,25 M de imidazol. La proteína altamente purificada se desala posteriormente en un tampón de almacenamiento que contiene 10 mM Hepes, 0,14 M de NaCl y manitol al 4%, pH 6,8, con una columna G25 Superfine (Pharmacia) de 25 ml y se guarda a -80ºC.
Las construcciones de inmunoadhesina (que contiene Fc) se purifican a partir del medio acondicionado tal y como se indica a continuación. El medio acondicionado se bombea a una columna Proteína A (Pharmacia) de 5 ml que ha sido equilibrada en un tampón de 20 mM de fosfato sódico, pH 6,8. Después de cargarse, la columna se lava ampliamente con tampón de equilibrio antes de la elución con 100 mM de ácido cítrico, pH 3,5. La proteína eluída se neutraliza inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en tubos que contienen 275 \muL de tampón de Tris 1M, pH 9. La proteína altamente purificada se desala posteriormente en un tampón de almacenamiento, tal como el descrito anteriormente para las proteínas etiquetadas con poli-his. La homogeneidad se calcula mediante geles de poliacrilamida SDS y mediante la secuenciación de los aminoácidos N-terminales mediante degradación Edman.
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Ejemplo 5 Expresión de PRO10282 y PRO19578 en levadura
El siguiente procedimiento describe la expresión recombinante de PRO10282 y PRO19578 en levadura.
En primer lugar, los vectores de expresión de levadura se construyen para la producción o secreción intracelular de polipéptidos PRO10282 a partir del promotor ADH2/GAPDH. El ADN que codifica el polipéptido PRO10282 (incluyendo PRO19578) y el promotor se insertan en los sitios para enzimas de restricción adecuados en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión intracelular de PRO10282. Para la secreción, el ADN que codifica PRO10282 puede clonarse en el plásmido seleccionado, junto con el ADN que codifica el promotor ADH2/GAPDH, un péptido señal de PRO10282 nativo u otro péptido señal de mamífero, o, por ejemplo, una secuencia señal/líder de factor alfa o secretora de la invertasa de levadura, y secuencias enlazadoras (si se necesitan) para la expresión de PRO10282.
Las células de levadura, tales como la cepa AB110 de la levadura, pueden a continuación transformarse con los plásmidos de expresión descritos anteriormente y cultivarse en un medio de fermentación seleccionado. Los sobrenadantes de levadura transformados pueden analizarse mediante precipitación con ácido tricloroacético al 10% y separación mediante SDS-PAGE, seguido de la tinción de los geles con azul de Coomassie.
El PRO10282 (incluyendo PRO19578) recombinante puede aislarse posteriormente y purificarse mediante la extracción de las células de levadura del medio de fermentación mediante la centrifugación y, a continuación, la concentración del medio utilizando filtros de cartucho específicos. El concentrado que contiene PRO10282 (por ejemplo PRO19578) puede purificarse adicionalmente utilizando resinas concretas de cromatografía en columna.
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Ejemplo 6 Expresión de PRO1P282 y PRO19578 en células de insecto infectadas de Baculovirus
El siguiente procedimiento describe la expresión recombinante de PRO10282 y PRO19578 en células de insecto infectadas de Baculovirus.
La secuencia que codifica PRO10282 o PRO19578 se fusiona en dirección 5' a un epítopo etiqueta contenido en un vector de expresión de baculovirus. Dichas epítopo etiquetas incluyen etiquetas de poli-his y etiquetas de inmunoglobulina (como las regiones Fc de IgG). Pueden utilizarse una variedad de plásmidos, incluyendo plásmidos derivados de los plásmidos disponibles comercialmente, tales como pVL1393 (Novagen). Brevemente, la secuencia que codifica PRO10282 o PRO19578 o la parte deseada de la secuencia que codifica PRO10282 o PRO19578, tales como la secuencia que codifica el dominio extracelular de una proteína transmembrana o la secuencia que codifica la proteína madura si la proteína es extracelular, se amplifica mediante PCR con cebadores complementarios a las regiones 5' y 3'. El cebador 5' puede incorporar sitios para enzimas de restricción flanqueantes (seleccionadas). El producto se digiere a continuación con todas esas enzimas de restricción seleccionadas y se subclona en el vector de expresión.
El baculovirus recombinante se genera mediante la cotransfección del plásmido anterior y el ADN del virus BaculoGold^{TM} (Pharmingen) en células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) utilizando lipofectina (disponible comercialmente de GIBCO-BRL). Después de 4-5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados se recogen y se utilizan para amplificaciones adicionales. La infección viral y la expresión de la proteína se realizan tal y como describe en O'Reilley et al., Baculovirus expresion vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994).
A continuación, el PRO10282 o PRO19578 etiquetado con poli-His expresado puede purificarse, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad de Ni^{2+}-quelato tal y como se indica a continuación. Los extractos se preparan a partir de las células recombinantes sf9 infectadas del virus, tal y como se ha descrito por Rupert et al., Nature, 362: 175-179 (1993). Brevemente, las células Sf9 se lavan, se resuspenden en el tampón de sonicación (25 ml Hepes, pH 7,9; 12,5 mM de MgCl_{2}; 0,1 mM de EDTA: glicerol al 10%; NP-40 a 0,1%; 0,4 M de KCl), y se sonican dos veces durante 20 segundos en hielo. Los sonicados se aclaran por centrifugación, y el sobrenadante se diluye 50 veces en el tampón de carga (50 mM de fosfato, 300 mM de NaCl, glicerol al 10%, pH 7,8) y se filtra a través de un filtro de 0,45 \mum. Se prepara una columna de agarosa Ni^{2+} -NTA (comercialmente disponible de Qiagen) con un volumen de lecho de 5 ml, se lava con 25 ml de agua y se equilibra con 25 ml del tampón de carga. El extracto celular filtrado se carga en la columna a 0,5 mL por minuto. La columna se lava hasta la línea base a A_{280} con el tampón de carga, en cuyo punto se inicia la recogida de la fracción. A continuación, la columna se lava con un tampón de lavado secundario (50 mM fosfato; 300 mM de NaCl, glicerol al 10%, pH 6,0), que eluye las proteínas unidas no específicamente. Después de alcanzar la línea base a A_{280} de nuevo, la columna se elabora con un gradiente de 0 a 500 mM de imidazol en el tampón de lavado secundario. Se recogen fracciones de un mL y se analizan mediante SDS-PAGE y tinción con plata o transferencia Western con Ni^{2+}-NTA-conjugado a fosfatasa alcalina (Qlagen). Las fracciones que contienen PRO10282 o PRO19578 etiquetados con His_{10} eluídos se agrupan y se dializan contra el tampón de carga.
Alternativamente, la purificación del PRO10282 o PRO19578 etiquetados con IgG (o con Fc) puede realizarse usando técnicas de cromatografía conocidas, incluyendo, por ejemplo, cromatografía en columna con Proteína A o proteína G.
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Ejemplo 7 Preparación de anticuerpos que se unen a PRO10282 o PRO19578
Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales que pueden unirse específicamente a PRO10282 o PRO19578.
Las técnicas para producir los anticuerpos monoclonales son conocidas en la técnica y están descritas, por ejemplo, en Goding, supra. Entre los inmunógenos que se pueden utilizar se incluyen PRO10282 y PRO19578 purificados, proteínas de fusión que contienen PRO10282 o PRO19578, y células que expresan PRO10282 o PRO19578 recombinantes en la superficie celular. La selección del inmunógeno puede realizarse según el técnico en la materia sin una gran experimentación.
Los ratones, tales como Balb/c, se inmunizan con el inmunógeno de PRO10282 o PRO19578 emulsionado en adyuvante completo de Freund y se inyecta subcutáneamente o intraperitonealmente en una cantidad de 1-100 microgramos. Alternativamente, el inmunógeno se emulsiona en el adyuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyecta en las bases de las patas traseras del animal. A continuación, los ratones inmunizados se estimulan 10 a 12 días después con inmunógeno adicional emulsionado en el adyuvante seleccionado. A continuación, durante diversas semanas, los ratones también se pueden estimular con inyecciones de inmunización adicionales. Las muestras de suero se pueden obtener periódicamente de los ratones mediante muestras de sangre retro-orbitales para ser analizadas en ensayos ELISA para detectar anticuerpos anti-PRO10282 o anticuerpos anti-PRO19578.
Después de detectar un título de anticuerpo adecuado, a los animales "positivos" para anticuerpos se les puede inyectar una inyección intravenosa final de PRO10282 o PRO19578. De tres a cuatro días más tarde, los ratones se sacrifican y las células del bazo se recogen. A continuación, las células del bazo se fusionan (usando polietilenglicol al 35%) a una línea celular de mieloma murino seleccionado, tal como la P3X63AgU.1, disponible de ATCC, No. CRL 1597. Las fusiones generan células de hibridoma que se pueden colocar a continuación en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos que contienen un medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma e híbridos de células de bazo.
Las células de hibridomas se cribarán en un ELISA para la reactividad contra PRO10282 o PRO19578. La determinación de células de hibridomas "positivas" que secretan los anticuerpos monoclonales deseados contra PRO10282 o PRO19578 está dentro de la técnica.
Las células de hibridomas positivas se pueden inyectar intraperitonialmente en ratones singénicos Balb/c para producir fluido ascítico que contienen anticuerpos monoclonales anti-PRO10282 y anti-PRO19578. Alternativamente, las células de hibridomas pueden desarrollarse en matraces de cultivos de tejidos o en botellas en rodillo. La purificación de los anticuerpos monoclonales producidos en el fluido ascítico se puede realizar usando precipitación con sulfato de amonio, seguido por cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, puede usarse la cromatografía por afinidad basada en la unión del anticuerpo a la proteína A o la proteína G.
Específicamente, se hiperinmunizaron cinco ratones Balb/c (Charles River Laboratories, Wilmington, DE) con péptido de aminoácidos conjugado a Unizyme purificados, correspondientes a los aminoácidos 532-667 de Stra6 humano, en adyuvante Ribi (Ribi Immunochem Research, Inc., Hamilton, MO). Las células B de nódulos linfáticos popliteales se fusionaron con células de mieloma de ratón (X63.Ag8.653; American Type Culture Collection, Rockville, MD) tal como se ha descrito previamente (Hongo et al., Hybridoma 14: 253-260 [1995]). Después de 10-14 días, se recogieron los sobrenadantes y se cribaron para la producción de anticuerpos mediante ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA) directo. Ocho clones positivos, que mostraban la mayor inmunounión por ELISA directo e inmunohistoquímica después de dos rondas de subclonación mediante dilución limitante, se inyectaron en ratones cebados con Pristine para la producción in vivo de mAb (Freud and Blair, J. Immunol. 129: 2826-2830 [1982]). Los fluidos ascíticos se agruparon y se purificaron mediante cromatografía de afinidad con Proteína A (Pharmacia fast protein liquid chromatography (FPLC); Pharmacia, Uppsala, Sweden) tal como se ha descrito previamente (Hongo et al., supra). Los preparados de anticuerpo purificado se filtraron de forma estéril (tamaño de poro de 0,2 \mum; Nalgene, Rochester, NY) y se guardaron a 4ºC en solución salina tamponada de fosfato (PBS).
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Ejemplo 8 Purificación de polipéptidos PRO10282 y PRO19578 usando Anticuerpos Específicos
Los polipéptidos PRO10282 y PRO19578 nativos o recombinantes se pueden purificar mediante una variedad de técnicas estándar en las técnicas de purificación de proteínas. Por ejemplo, se purifica el polipéptido pro- PRO10282 o pro-PRO19578, el polipéptido PRO10282 o PRO19578 maduro, o el polipéptido pre-PRO10282 o pre-PRO19578 mediante cromatografía de inmunoafinidad usando anticuerpos específicos para el polipéptido PRO10282 de interés. En general, una columna de inmunoafinidad está construida por acoplamientos covalentes de anticuerpos de polipéptidos anti-PRO10282 o anti-PRO19578 a una resina de cromatografía activada.
Las inmunoglobulinas policlonales se preparan a partir de sueros inmunes mediante precipitación con sulfato de amonio o mediante purificación en la Proteína A inmovilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J). Asimismo, los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de los fluidos ascíticos de ratón mediante la precipitación con sulfato de amonio o cromatografía en Proteína A inmovilizada. La inmunoglobulina parcialmente purificada se une covalentemente a una resina cromatográfica, tal como la SEPHAROSE^{TM} activada con CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology). El anticuerpo se acopla a la resina, la resina se bloquea y la resina derivada se lava de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Dicha columna de inmunoafinidad se utiliza en la purificación del polipéptido PRO10282 o PRO19578 mediante la preparación de una fracción a partir de células que contienen polipéptido PRO10282 o PRO19578 en una forma soluble. Esta preparación se deriva por solubilización de toda la célula o de una fracción subcelular obtenida mediante centrifugación diferencial por adición de detergente o mediante otros procedimientos conocidos en la técnica. Alternativamente, el polipéptido PRO10282 o PRO19578 soluble que contiene una secuencia señal podría secretarse en una cantidad útil en el medio en el que las células crecen.
Una preparación que contiene polipéptido PRO10282 o PRO19578 soluble se pasa por la columna de inmunoafinidad, y la columna se lava en condiciones que permiten la absorbancia preferencial del polipéptido PRO10282 o PRO19578 (por ejemplo, tampones de fuerza iónica elevada en presencia de detergente). A continuación, la columna se eluye en condiciones que interrumpen la unión anticuerpo/polipéptido PRO10282 o PRO19578 (por ejemplo, un tampón de pH bajo, tal como aproximadamente un pH de 2-3, o una alta concentración de caótropo, tal como urea o ión tiocianato), y se recoge el polipéptido PRO10282 o PRO19578.
Ejemplo 9 Cribado de fármacos
La presente invención es particularmente útil para cribar compuestos mediante la utilización de polipéptidos PRO10282 (Stra6) (incluyendo PRO19578) o fragmentos de unión de los mismos en cualquier variedad de técnica de cribado de fármacos. El polipéptido PRO10282 o el fragmento utilizado en dicha prueba puede estar libre en solución, fijado a un soporte sólido, adsorbido en una superficie celular o situado intracelularmente. Un procedimiento de cribado de fármaco utiliza células huésped eucariotas o procariotas, las cuales se transforman de forma estable con ácidos nucleicos recombinantes que expresan el polipéptido PRO10282 o un fragmento. Los fármacos se criban contra dichas células transformadas en ensayos de unión competitiva. Dichas células, tanto en forma viable como fija, se pueden utilizar para ensayos de unión estándar. Se puede medir, por ejemplo, la formación de complejos entre el polipéptido PRO10282 o un fragmento y el agente que se está probando. Alternativamente, se puede examinar la disminución en la formación del complejo entre el polipéptido PRO10282 y su célula diana o receptores diana causada por el agente que se está probando.
De este modo, la presente invención proporciona procedimientos de cribado para fármacos o cualquier otro agente que puede afectar una enfermedad o un trastorno asociados al polipéptido PRO10282 (stra6). Estos procedimientos comprenden el contacto de dicho agente con un polipéptido Stra6 o fragmento del mismo y el ensayo (I) para la presencia de un complejo entre el agente y el polipéptido Stra6 o un fragmento, o (II) para la presencia de un complejo entre el polipéptido Stra6 o un fragmento y la célula, mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. En dichos ensayos de unión competitiva, el polipéptido Stra6 o un fragmento está normalmente marcado. Después de una incubación adecuada, el polipéptido Stra6 o un fragmento libres se separan de la forma unida, y la cantidad de marcador libre o no complejado es una medida de la capacidad del agente concreto para unirse al polipéptido stra6 o para interferir en el complejo polipéptido Stra6/célula.
Otra técnica para el cribado de fármacos proporciona un alto rendimiento cribando compuestos que tienen una afinidad de unión adecuada a un polipéptido y se describe en detalle en WO 84/03564, publicado el 13 de septiembre de 1984. Brevemente, una gran cantidad de compuestos de diferentes péptidos pequeños de prueba se sintetizan en un sustrato sólido, tal como agujas de plástico o alguna otra superficie. Tal y como se aplica a un polipéptido PRO10282 (stra6), los compuestos de péptidos de prueba se hacen reaccionar con polipéptido Stra6 y se lavan. Se detecta el polipéptido stra6 unido mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. El polipéptido Stra6 purificado también puede recubrirse directamente en placas para utilizar en las técnicas de cribado de fármacos mencionadas anteriormente. Además, se pueden utilizar anticuerpos no neutralizantes para capturar el péptido e inmovilizarlo en el soporte sólido.
La presente invención también contempla la utilización de ensayos de cribado de fármacos competitivos en los cuales los anticuerpos neutralizantes capaces de unirse a un polipéptido Stra6 específicamente compiten con un compuesto de prueba para unirse a polipéptido Stra6 o fragmentos del mismo. De esta manera, pueden utilizarse los anticuerpos para detectar la presencia de cualquier péptido que comparte uno o más determinantes antigénicos con el polipéptido Stra6.
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Ejemplo 10 Diseño racional de fármacos
El objetivo del diseño racional de fármacos es producir análogos estructurales de polipéptidos biológicamente activos de interés (es decir, un polipéptido PRO10282 (stra6)) o de pequeñas moléculas con las cuales interaccionan, por ejemplo, agonistas, antagonistas o inhibidores. Cualquiera de estos ejemplos se puede utilizar para fármacos de moda que son formas más activas o estables del polipéptido PRO10282 o el polipéptido PRO19578 o que potencian o interfieren con la función del polipéptido PRO10282 o PRO19578 de secuencia nativa in vivo (c.f. Hodgson, Bio/Technology, 9: 19-21 (1991)).
En una estrategia, la estructura tridimensional del polipéptido, PRO10282 o PRO19578 de secuencia nativa o de un complejo polipéptido PRO10282 o PRO19578-inhibidor, se determina mediante cristalografía de rayos X, mediante modelación por ordenador o, más habitualmente, mediante una combinación de las dos estrategias. Deben comprobarse la forma y las cargas del polipéptido PRO10282 o PRO19578 nativo para elucidar la estructura y para determinar el sitio o sitios activos de la molécula. Con menor frecuencia, podría obtenerse la información útil con respecto a la estructura del polipéptido PRO10282 o PRO19578 mediante la modelación basada en la estructura de proteínas homólogas. En ambos casos, la información estructural pertinente se utiliza para diseñar moléculas análogas de tipo polipéptido PRO10282 o para identificar inhibidores eficaces. Entre los ejemplos útiles de diseño racional de fármacos se pueden incluir moléculas que han mejorado la actividad o la estabilidad, tal como se muestra por Braxton y Wells, Biochemistry, 31: 7796-7801 (1992) o que actúan como agonistas inhibidores, o antagonistas de péptidos nativos tal y como se muestra por Athauda et al., J. Biochem., 113: 742-746 (1993).
También es posible aislar un anticuerpo específico de diana, seleccionado mediante un ensayo funcional, tal y como se ha descrito anteriormente y, a continuación solucionar su estructura cristalina. Este enfoque, en principio, produce un fármaco inicial en el que puede basarse el diseño de fármacos posterior. Es posible evitar una cristalografía de toda la proteína mediante la generación de un anticuerpo anti-idiotípico (anti-ids) a un anticuerpo funcional farmacológicamente activo. Como imagen especular de una imagen especular, el sitio de unión del anti-ids se espera que sea un análogo del receptor original. A continuación, el anti-ids podría utilizarse para identificar y aislar péptidos de bancos de péptidos producidos química o biológicamente. Los péptidos aislados actuarían entonces como el fármaco inicial.
En virtud de la presente invención, se pueden fabricar cantidades suficientes de los polipéptidos PRO10282 (incluyendo PRO19578) para realizar estudios analíticos, tales como en cristalografía de rayos-X. Además, el conocimiento de la secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO10282 proporcionada en la presente invención proporcionará una guía para los usuarios de técnicas de modelación por ordenador en lugar de o adicionalmente a la cristalografía de rayos-X.
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Ejemplo 11 Distribución de la expresión en tejidos
Las sondas de oligonucleótidos se construyeron a partir de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido PRO10282 mostrada en las figuras que se acompañan, para su uso en reacciones de amplificación de PCR cuantitativa. Las sondas de oligonucleótidos se eligieron para proporcionar un fragmento amplificado de aproximadamente 200-600 pares de bases del extremo 3' de su molde asociado en una reacción PCR estándar. Las sondas de oligonucleótidos se utilizaron en reacciones de amplificación de PCR cuantitativa estándar con ARN Clontech aislado de diferentes fuentes de tejido humano adulto y se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa para obtener una determinación cuantitativa del nivel de expresión del ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO10282 en los diversos tejidos analizados. El conocimiento del patrón de expresión o la expresión diferencial del ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO10282, en varios tipos de tejidos humanos diferentes, proporciona un marcador de diagnóstico útil para la tipificación del tejido con o sin marcadores específicos de tejido, para determinar la fuente de tejido primario de un tumor metastático, y similares. Los resultados de estos ensayos (mostrados en la figura 10) demostraron que la molécula DNA148380-2827 era altamente expresada en riñón, testículo y útero adultos; se expresaba de manera significativa en mama, próstata y tráquea; se expresaba débilmente en cerebro, pulmón y timo, y no se expresaba en hígado, médula ósea, colon, músculo esquelético, intestino delgado, bazo y estómago.
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El ARN total se adquirió de Clontech (Palo Alto, California) y se analizó utilizando el siguiente conjunto de cebador/sonda para la amplificación por PCR:
h.Stra6.tmf3: 5' CACACTCGAGAGCCAGATATTTT (SEC ID NO: 6)
h.Stra5.tmr4: 5' AACAAGTTTATTGCAGGGAACAC (SEC ID NO: 7)
h.Stra6.tmp4: 5' TGTAGTTTTTATGCCTTTGGCTATTATGAAAGAGGT (SEC ID NO: 8) 
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tmf = cebador directo
tmr = cebador inverso
tmp = sonda
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La hibridación in situ, realizada tal como se describe en el Ejemplo 12 siguiente, confirmó que la expresión de Stra6 en células epiteliales tubulares de riñón, miometrio, y células estromales que rodean los conductos y lóbulos mamarios, mientras que no se observaba expresión o muy poca en secciones de cerebro, hígado, bazo, páncreas, corazón, pulmón, estómago, intestino delgado, colon, próstata, bazo, y córtex adrenal (datos no mostrados). De los tejidos normales examinados por la hibridación in situ, los niveles de expresión más elevados se observaron en placenta y médula adrenal, que no se incluían en el análisis por PCR.
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Ejemplo 12 Sobreexpresión de transcrito de PRO10282 (Stra6) humano nativo en tumores humanos
Este ejemplo muestra que el gen que codifica PRO10282 (Stra6) de longitud completa humano nativo se sobreexpresa significativamente en ciertos tumores de colon humanos y también en líneas celulares derivadas de varios tumores humanos como los de colon, pulmón, riñón y mama.
El material de partida para el cribado fue ARN total aislado de tumores de colon humanos, o varias líneas celulares de tumor de colon, riñón, mama o pulmón humanos. En tejido de tumor de colon, se determinó la expresión de ARN de Stra6 en relación con ARN de tejido de colon normal (mucosa) del mismo paciente. Se determinó la expresión de ARN de Stra6 en varias líneas celulares tumorales en comparación con varias líneas celulares normales (es decir, líneas celulares de colon, riñón y pulmón normales).
Se utilizó PCR cuantitativa de tiempo real (RT-PCR, por ejemplo, TAQMAN ABI PRIZM 7700^{TM} Sequence Detection System^{TM} [Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, California]), para monitorizar diferencias cuantitativas en el nivel de expresión del gen que codifica PRO10292 (Stra6) (correspondiente a DNA148380-2827) en células normales y células derivadas de ciertos cánceres o líneas celulares de cáncer, utilizando reactivos de ensayo Taqman. Las reacciones de RT-PCR de 50 \mul consistieron en 5 \mul de 10x tampón A Taqman, 300 \muM de cada dNTF, 5 mM de MgCl_{2}, 10 unidades de inhibidor de ARNasa, 12,5 unidades de transcriptasa inversa MuLV, 1,25 unidades de AmpliTaq Gold ADN Polimerasa, 200 nM de sonda, 500 nM de cebadores y 100 ng de ARN. Las condiciones de reacción consistían en trascripción inversa a 48ºC durante 30 minutos, desnaturalización a 95ºC durante 25 segundos y 65ºC durante un minuto. Se analizaron productos de reacción en geles de poliacrilamida al 4-20% (Novex). Se utilizaron curvas estándar para determinar los niveles relativos de expresión para cada gen de interés además del gen "housekeeping" de gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) para cada muestra analizada. Se obtuvieron unidades normalizadas relativas mediante la división del nivel de ARNm del gen de interés entre el nivel de ARNm de GAPDH. Se compararon las unidades normalizadas relativas entre la muestra experimental y control para determinar inducción de pliegue.
Se utilizaron los resultados para determinar si el ARNm que codifica PRO10282 se sobreexpresa en cualquiera de los cánceres de colon primario o de las líneas celulares de cáncer de colon, riñón, mama o pulmón que se cribaron. La histología de algunas muestras normales humanas y de tumor de colon emparejadas utilizada para el análisis (ver Figuras 11 y 12) se muestra a continuación:
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Las líneas celulares de pulmón humanas incluyen las líneas celulares MRC5 (CCL-171) y IMR90 (CCL-186) de fibroblasto de pulmón humano normal, la línea celular A549 (SRCC768, CCL-185) epitelial de carcinoma de pulmón humano, la línea celular Calu-1 (SRCC769; HTB-54) de carcinoma de pulmón epidermoide humano, la línea celular Calu-6 (SRCC770, HTB-56-probablemente pulmón) de carcinoma anaplásico humano, la línea celular NCI-H441 (SRCC772; HTB-174) epitelial humana que derivaba de fluido pericárdico de un paciente con adenocarcinoma papilar del pulmón, y la línea celular SW900 (SRCC775; HTB-59) de carcinoma de células escamosas humanas, todas disponibles gracias a ATCC.
Las líneas celulares de colon incluyen, por ejemplo, la línea celular CCD112Co (CRL-1541) de fibroblasto de colon normal, la línea celular CaCo-2 (HTB-37) de adenocarcinoma colorrectal humano, la línea celular WiDr (CCL-218) de adenocarcinoma colorrectal humano, la línea celular HCT116 (CCL-247) de carcinoma colorrectal humano, la línea celular SK-Co1 (HTB-39) de adenocarcinoma colorrectal humano, la línea celular COLO320 (SRCC778; CCL-220) de adenocarcinoma colorrectal humano, la línea celular HT29 (SRCC779; HTB-38) de adenocarcinoma colorrectal humano, la línea celular SW403 (CCL-230) de adenocarcinoma colorrectal humano, la línea celular NCI/HCC2998 de cáncer de colon humano, y la línea celular Colo320DM (CCL-220) de adenocarcinoma colorrectal humano, todas disponibles gracias a ATCC u otros proveedores públicos.
Las líneas celulares de carcinoma de mama humano incluyen la línea celular MCF7 (SRCC766; HTB-22) de adenocarcinoma de mama humano, y la línea celular NCI/ADR-RES de cáncer de mama humano, ambas públicamente disponibles.
Las líneas de riñón incluyen la línea celular 293 (CRL-1573) que se transforma con ADN de adenovirus 5. También se incluyeron en el análisis dos líneas celulares de tumor de Wilm, G401 (CRL-1441) y SK-NEP-1 (CRL-1573).
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Preparación de ARN
Se preparó ARN a partir de las líneas celulares cultivadas anteriores. Se realizó el aislamiento utilizando un equipo de purificación, conjunto de tampones y proteasa de Qiagen, de acuerdo con las instrucciones del fabricante y la descripción siguiente. Más específicamente, se aisló el ARN total a partir de células en cultivo utilizando mini-columnas RNeasy de Qiagen. Se aisló el ARN total a partir de muestras de tejido utilizando ARN Stat-60 (Tel-Test). Se aisló el ARN preparado a partir de tumor mediante centrifugación con gradiente de densidad de cloruro de cesio.
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Preparación y lisis de la muestra de tumor humano sólido
Se pesaron muestras de tumor y se colocaron en tubos cónicos de 50 ml y se mantuvieron en hielo. El procesamiento se limitó a no más de 250 mg de tejido por preparación (1 punta/preparación). Se preparó nuevamente la solución de proteasa mediante dilución en 6,25 ml de ddH_{2}O fría hasta una concentración final de 20 \mug/ml y se guardó a 4ºC. Se preparó tampón G2 (20 ml) mediante dilución de DNAsa A hasta una concentración final de 200 \mug/ml (a partir de stock de 100 mg/ml). Se homogenizó el tejido tumoral en 10 ml de tampón G2 durante 60 segundos utilizando la punta amplia del politrón en una campana TC de flujo laminar con el objetivo de evitar la inhalación de aerosoles, y se mantuvo a temperatura ambiente. Entre las muestras, se limpió el politrón mediante rotación a 2 x 30 segundos cada uno en 2L, ddH_{2}O, seguidos de tampón G2 (50 ml). Si el tejido aún estuviera presente en la punta del generador, se desmontaría y se limpiaría el aparato.
Se añadió proteasa Qiagen (preparada tal y como se indicó anteriormente, 1,0 ml), seguido de agitación intensa e incubación a 50ºC durante 3 horas. Se repitieron la centrifugación y la incubación hasta que los lisados fueron limpios (por ejemplo, incubando 30-60 minutos adicionales, obteniendo residuos a 3000 x g durante 10 minutos, 4º).
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Cuantificación
Los resultados obtenidos a partir del análisis de PCR a tiempo real de ARN se expresaron inicialmente como unidades delta CT. Una unidad corresponde a un ciclo de PCR o aproximadamente una amplificación de 2 veces en comparación con el normal, dos unidades corresponden a 4 veces, 3 unidades a una amplificación de 8 veces y así sucesivamente. Se convierten los datos en la diferencia en número y se presentan como tales. Inicialmente, se utilizó la transcriptasa inversa para sintetizar ADNc a partir de 100 ng de ARN total o ARN poliA+ utilizando oligo(dT) como un cebador. A continuación, se utilizó el ADNc resultante como un molde para PCR. Se obtuvo la cuantificación utilizando cebadores derivados de las regiones 3' no traducidas de la secuencia que codifica PRO10282 y una sonda fluorescente TAQMAN^{TM} correspondiente a las secuencias intermedias respectivas. Utilizando una región 3' se tiende a evitar cruzar los limites intrón-exón en el ADN genómico, un requisito esencial para un cálculo preciso de expresión de ARN utilizando este procedimiento. Las secuencias para los cebadores y las sondas (directa, inversa, y sonda) utilizando para la amplificación del gen que codifica PRO10282 fueron tal y como se indican:
Un conjunto incluía los cebadores directos e inversos y la sonda descritos en el Ejemplo 11 anteriormente como SEC ID Nº: 6, 7 y 8, respectivamente.
Otro conjunto incluía:
hStra6.tmfl1: 5' AGACCAGGTCCCACACTGA (SEC ID Nº:9)
hStra6.tmr1: 5' TTCATAATAGCCAAAGGCATAAAA (SEC ID Nº:10), y
h.Stra6.tmp1: 5' CTGCCCACACTCGAGAGCCAGAT 3' (SEC ID Nº: 11) 
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GAPDH humano:
cebador directo: 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3' (SEC ID Nº: 14)
cebador inverso: 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3' (SEC ID Nº: 15)
sonda: 5' -CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-3' (SEC ID Nº: 16) 
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La reacción de ensayo de 5' nucleasa es una técnica basada en la PCR fluorescente que hace uso de la actividad 5' exonucleasa de la enzima Taq ADN polimerasa para monitorizar la amplificación a tiempo real. Se utilizan dos cebadores de oligonucleótidos para generar un amplicón típico de una reacción PCR. Se diseñó un tercer oligonucleótido, o sonda, para detectar la secuencia de nucleótidos localizada entre los dos cebadores de PCR. La sonda es no-extendible mediante enzima Taq ADN polimerasa, y se marca con un colorante fluorescente informador y un colorante fluorescente desactivador. Se desactiva cualquier emisión inducida por láser del colorante informador mediante colorante desactivador si los dos colorantes están localizados cerca el uno del otro tal y como están en la sonda. Durante la reacción de amplificación, la enzima Taq ADN polimerasa divide la sonda de un modo dependiente del molde. Los fragmentos de sonda resultantes se disocian en solución, y la señal del colorante informador liberado está libre del efecto desactivador del segundo fluoróforo. Se libera una molécula de colorante informador por cada nueva molécula sintetizada, y la detección del colorante informador proporciona la base para la interpretación cuantitativa de
los datos.
Tal y como se indica anteriormente, el procedimiento de 5' nucleasa se procesa en un dispositivo de PCR cuantitativo a tiempo real como el ABI PRIZM 7700^{TM} Sequence Detection System^{TM}. El sistema consta de un termociclador, láser, dispositivo de acoplamiento de carga (CCD), cámara y ordenador. El sistema amplifica muestras en un formato de 96 pocillos en un termociclador. Durante la amplificación, se recoge la señal fluorescente inducida por láser a tiempo real a través de cables de fibra óptica para todos los 96 pocillos, y se detecta en el CCD. El sistema incluye software para hacer funcionar el instrumento y para analizar los datos.
Los datos de ensayo de 5'-nucleasa se expresaron inicialmente como Ct, o el ciclo de umbral. Esto se define como el ciclo en el que la señal informadora se acumula por encima del nivel de fondo de fluorescencia. Los valores de Ct se utilizan como medida cuantitativa de la cantidad relativa de copias iniciales de una secuencia diana concreta en una muestra de ácido nucleico cuando se compara la expresión de ARN en célula cancerosa con la de una célula normal.
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Resultados
El ARN de Stra6 humano (correspondiente a DNA148380-2827) muestra una fuerte sobreexpresión en tejidos tumorales de colon humano, si se compara con tejidos de colon humano normal. Tal y como se muestra en la Figura 11, se descubrió que el ARN de Stra6 humano (correspondiente a DNA148380-2827) se sobreexpresaba en los 14 tejidos de colon tumoral humano examinados, en comparación con ARN de mucosa colorrectal normal emparejada del mismo paciente. La sobreexpresión varió entre dos y 170 veces, y en 7 de cada 14 muestras de tejido tumoral fue por lo menos aproximadamente 10 veces. Los valores de umbral de ciclo obtenidos mediante PCR cuantitativa indicaron que los niveles de ARNm de Stra6 fueron extremadamente bajos o posiblemente ausentes en muchas de las muestras de mucosa normal.
Como un segundo procedimiento de detección, los productos obtenidos tras completar las reacciones de PCR cuantitativo (40 ciclos cada uno) se sometieron a electroforesis en geles de poliacrilamida y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio. Tal y como se muestra en la Figura 12A, utilizando la expresión de un gen "housekeeping", gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), como patrón, se generaron cantidades sustancialmente mayores de productos de PCR a partir de ARNm de Stra6 en muestras de tumor comparadas con sus homólogos normales. En cambio, se generó un nivel comparable de producto del ARNm de GAPDH de control interno a partir de todas las muestras.
La expresión de Stra6 en adenocarcinomas de colon se localizó en las células tumorales epiteliales mediante hibridación in situ (ISH) realizada como se indica a continuación. Se transcribieron ribosondas sentido y antisentido marcadas con ^{32}P de un producto de PCR de 874 bp correspondientes a los nucleótidos 432-1247 de la secuencia que codifica el polipéptido Stra6 humano codificado por DNA148380-2827. Se procesaron secciones de tejido fijadas con formalina e insertadas en parafina, tal y como se describe anteriormente (Pennica et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 95:14717- 22 [1998]). Los resultados se muestran en la Figura 12B.
Tal y como se muestra en la Figura 13, el ARN de Stra6 humano (correspondiente a DNA148380-2827) también se sobreexpresa significativamente en varias líneas celulares tumorales de mama, riñón, colon y pulmón. "Expresión de ARN Relativo" significa que se muestra la expresión de ARN en tejidos normales y tumorales en comparación con la expresión en una línea celular estándar SW480 elegida arbitrariamente.
Los resultados de hibridación in situ obtenidos en varias secciones tumorales también se muestran en la Figura 16. Diversos tipos de tumor aparte de los adenocarcinomas de colon también mostraron altos niveles de expresión de Stra6. Éstos incluyeron 3 de 3 melanomas (Figuras 16A y B), 3 de 4 adenocarcinomas endometriales (Figuras 16C y D), 2 de 3 adenocarcinomas ováricos, y un tumor de Wilm del riñón (Figuras 16E y F). La señal de hibridación in situ de Stra6 en estos diversos tumores fue considerablemente mayor que en adenocarcinomas de colon que concuerdan con los datos que muestran niveles de expresión relativamente altos en riñón y útero normales y niveles bajos en colon normal. Dado que Stra6 se detectó en médula adrenal normal, también se examinaron dos feocromocitomas, que son tumores derivados de este tejido. En estos tumores, la expresión de Stra6 superó la de cualquier otro tumor o tejido examinado en este estudio (Figuras 16G y H). Aunque se detectó Stra6 en riñón normal y se expresó fuertemente en el tumor de Wilm, no se detectó en carcinomas de células renales. En carcinomas de células de transición, las células estromales asociadas a tumor expresaron Stra6 más que las células epiteliales tumorales (datos no mostrados).
Dado que el ARNm DNA148380-2827 que codifica PRO10282 se sobreexpresa en varios tumores además de en un número de líneas celulares derivadas de tumor, éste se asocia probablemente con la formación y/o el crecimiento de tumores. Como resultado, se espera que los antagonistas (por ejemplo, anticuerpos, pequeñas moléculas orgánicas e inorgánicas, péptidos y polipéptidos, como variantes de Stra6, oligonucleótidos antisentido) dirigidos contra la proteína codificada por DNA148380-2827 (PRO10282) u otras variantes que se dan de forma natural, como PRO19578 codificada por DNA148389-2827-1, sean útiles en el diagnóstico, la prevención y/o el tratamiento de cáncer en concreto, sin limitación, cáncer de colon, pulmón, mama y/o riñón.
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La eficacia de antagonistas como anticuerpos terapéuticos dirigidos contra la proteína codificada por DNA148380-2827 (PRO10282) podría mejorar mediante agentes que estimulan la expresión del gen que codifica PRO10282. Por ejemplo, el tratamiento de líneas celulares de cáncer colorrectal humano con ácido 9-cis-retinoico o ácido todo-trans retinoico dio lugar a una mejora espectacular de la expresión del ARNm de Stra6 (Figura 15). De este modo, se esperaría que el tratamiento de pacientes de cáncer con anticuerpos terapéuticos dirigidos contra PRO10282 en combinación con los retinoides adecuados mejorara la citólisis del tumor mediante los anticuerpos. Lo mismo será cierto para anticuerpos dirigidos contra otros polipéptidos de Stra6 nativos sobreexpresados en varios tumores, como la variante por empalme humano codificada por DNA148389-2827-1.
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Ejemplo 13 Inducción sinérgica de Stra6 mediante Wnt-1 y retinoides Materiales y procedimientos Cultivo celular
Se desarrollaron células C57MG y C57MG/Wnt-1 en medio Eagle modificado por Dulbecco complementado con suero bovino fetal al 10%, L-glutamina 2 mM, y puromicina 2,5 \mug/ml (Edge Biosystems). Se desarrollaron células C57MG con expresión de Wnt-1 sin tetraciclina en medio completo sin puromicina, complementado con G418 400 \mug/ml (Gibco BRL), higromicina B 100 \mug/ml (Gibco BRL), y 50 ng/ml tetraciclina (Korinek et al., Mol. Cell Biol. 18:1248-56 [1998]). Para estudios de inducción de Wnt-1, se lavaron células con solución salina tamponada con fosfato, se cultivaron en medios sin tetraciclina durante 10, 24, 48, 72, y 96 horas y a continuación se recogieron. Se mantuvo una placa de control de hora 0 completamente en medios que contenían tetraciclina. Se recogieron todas las placas simultáneamente y se extrajo el ADN total en cada momento. Se llevó a cabo la RT-PCR con cebadores y sondas específicos de Wnt-1, Stra6, y GAPDH en 100 ng de ARN total de cada muestra.
Se obtuvieron células de líneas celulares HCT116 y WiDr de adenocarcinoma de colon humano de la American Type Culture Collection. Se mantuvieron células HCT116 en medios de McCoy 5A complementados con suero bovino fetal (FBS) al 10%. Se mantuvieron las células WiDr en medios esenciales mínimos de Dulbecco (DMEM) complementados con FBS al 10%. En estudios de inducción de ácido retinoico, se pusieron en placas las células a 10^{5} células/placa de 60 mm que contenía 2,5 ml de medio y se permitió que crecieran durante 24 horas. Se trataron las células con Vitamin 03, todo-trans-RA (Spectrum Laboratory Products), o 9-cis-RA (Toronto Research Chemicals Inc.) (concentración final de 1 \muM en DMSO) durante los tiempos indicados. Se trataron las células control con un volumen igual de DMSO.
Para el tratamiento de células C57MG/Parental con medios condicionados de Wnt-3a, se incubaron células en medios regulares o medios condicionados a partir de células-L o células L-W3A en presencia o ausencia de 9-cis-RA 1 \muM. Se prepararon medios condicionados tal y como se describió anteriormente (Willert et al., Genes Dev. 13:1768-73 [1999]). A las 48 horas, se recogieron las células mediante rascado en PBS que contenía fluoruro y vanadato sódico y se congeló rápidamente en nitrógeno líquido. Se preparó el ARN utilizando el equipo RNAeasy (Qiagen), incluyendo el tratamiento DNasel adicional en las columnas según las instrucciones del fabricante.
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Transferencia Western
Para la línea celular C57MG/Wnt-1 TET, se indujo la expresión de Wnt-1 mediante el cultivo de células en ausencia de tetraciclina durante 0, 24, 48 ó 72 horas. Se lisaron las células en tampón de lisis Triton X-100 [tris-HCl 20 mM (pH 8,0), NaCl 137 mM, Triton X-100 al 1%, EGTA 1 mM, glicerol al 10%, MgCl_{2} 1,5 mM, ditiotreitol 1 mM, vanadato sódico 1 mM, fluoruro sódico 50 mM, y cóctel inhibidor de proteasas completo (Boehringer Mannheim) y se sometieron equivalentes proteicos a SDS-PAGE e inmunotransferencia. Se incubaron las transferencias con anticuerpo policlonal de conejo purificado por afinidad 0,2 \mug/ml contra \beta-catenina (Rubinfeld et al., Science 262:1731-1734 [1993]), anticuerpo monoclonal anti-ERK2 0,1 \mug/ml (Transduction Laboratories), o con antisueros policlonales de conejo 1:2000 contra RAR\gamma-1 (Affinity Bioreagents). Para la línea celular WiDr, se trataron las células con todo-trans-RA 1 \muM durante 48 horas y a continuación se lisaron en tampón de lisis Triton X-100 y se procesaron tal y como se indica anteriormente. Se incubaron las transferencias con sobrenadante de cultivo de hibridoma monoclonal de péptido B anti-Stra6 1:50 (clon 12F4.2H9.1D5).
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Inmunohistoquímica
Se trataron las células WiDr con ácido 9-cis-retinoico o DMSO, a continuación se separaron y granularon mediante centrifugación de baja velocidad. Se fijaron los residuos celulares durante toda la noche en formalina tamponada neutra al 10%, se deshidrataron y se incrustaron en parafina. Se realizó immunoquímica utilizando sobrenadante de cultivo de hibridoma monoclonal de péptido B anti-Stra6 (clon 12F4.2H9.1D5) o isotipo IgG2A de ratón no específico como anticuerpos primarios, seguido de detección utilizando procedimiento de complejo avidina-biotina con diaminobenzidina como cromógeno (Vectastain Elite Kit, Vector Laboratories) tal y como se describe previamente (Eberhard et al., Am. J. Pathol. 145:640-9 [1994]). Se contratiñeron las secciones con hematoxilina.
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Ratos transgénicos Wnt-1
Ratones transgénicos que expresan el proto-oncogen de Wnt-1 en la glándula mamaria típicamente mostraron lesiones hiperplásicas y desarrollaron neoplasmas en este tejido (Tsukamoto et al., Cell 55:619-625 [1988]). Se utilizaron dichos ratones en los experimentos siguientes.
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Resultados
Anteriormente Easwaran et al. describieron la activación mejorada de un gen informador sensible a ácido retinoico sintético cuando se co-transfectaron células MSF-7 con \beta-catenina mutante y se trataron con retinoides (Easwaran et al., Curr. Biol. 9: 1415-1418 [1999]). Teniendo esto en cuenta, junto con la identificación original de Stra6 como gen inducible por ácido retinoico (Bouillet et al., Mech Dev. 63:173-186 [1997]), nos preguntamos si el ácido retinoico podría sinergizar con Wnt-1 para incrementar el nivel de Stra6 en la línea celular C57MG. El tratamiento de células C57MG parentales con 9-cis-RA o todo-trans-RA (ATRA) durante 48 horas incrementó considerablemente el nivel de ARNm de Stra6 mientras que DNSO y vitamina D3 no tuvieron efecto (Figura 17A). Tal y como se esperaba, las células C57MG/Wnt-1 tratadas con DMSO o vitamina D3 mostraron niveles mejorados de ARNm de Stra6 en comparación con la línea celular parental. El nivel de inducción de Stra6 mediante Wnt-1 fue comparable al observado en la estimulación de las células C57MG parentales con 9-cis-RA. No obstante, el tratamiento de 9-cis-RA de la línea celular C57MG/Wnt-1 indujo un incremento de más de 10 veces en el ARNm de Stra6 en comparación con la C57MG/Wnt-1 sin tratar o las células parentales C57MG tratadas con 9-cis-RA. Se obtuvieron resultados similares con todo-trans-RA.
Era posible que las variaciones clonales potenciales en la línea celular C57MG/Wnt-1, que no estaban relacionadas con la expresión de Wnt-1, justificaran su respuesta diferencial a ácido retinoico en comparación con células de control parentales. Para tratar esto, evaluamos la respuesta de las células C57MG parentales a la estimulación mediante Wnt-3a soluble en presencia o ausencia de 9-cis-RA. Wnt-3a es un homólogo de Wnt-1 que muestra propiedades de transformación similares a aquellas de Wnt-1 y puede producirse como un ligando soluble en células L de ratón. Los medios condicionados a partir de células L cultivadas que expresan Wnt-3a, pero no a partir de células L de control, indujeron la expresión de Stra6 en las células C57MG (Figura 17B). Se observó un nivel de inducción ligeramente más elevado en el tratamiento de células C57MG con 9-cis-RA. No obstante, la combinación de 9-cis-RA y Wnt-3a dio lugar a niveles de transcrito de Stra6 que superaban ampliamente a los observados con cualquier agente
solo.
Si la inducción de Stra6 en las células C57MG/Wnt-1 tratadas con ácido retinoico se potenciaba mediante niveles de \beta-catenina incrementados, entonces uno podría esperar una inducción similar de Stra6 en respuesta al ácido retinoico en células de carcinoma de colon humano que contienen mutaciones en \beta-catenina o APC. Para determinar si esto ocurre, se midieron los niveles de ARNm de Stra6 antes y después del tratamiento con ácido retinoico en células HCT116, que llevan una mutación activante en \beta-catenina, y en células WiDr, que han perdido ambas copias de APC de tipo salvaje. En ambas líneas celulares, se observó un incremento significativo en los niveles de ARNm de Stra6 después del tratamiento con ATRA o 9-cis-RA comparado con DMSO o vitamina D3 (Figura 17C). La activación del gen de Stra6 por ATRA en la línea celular HCT116 se confirmó mediante hibridación in situ (Figura 17D). La inducción de la banda de la proteína de Stra6 de 73kDa predicha en células WiDr tratadas con ATRA se detectó mediante análisis de transferencia Western con un anticuerpo monoclonal específico de Stra6 (Figura 17E). El análisis immunohistoquímico de las células WiDr reveló que el incremento en proteína Stra6 en respuesta al ácido retinoico se localizó en la membrana plasmática (Fig. 17F).
El gen de RAR\gamma ha sido propuesto como una diana para la señalización Wnt en embriones de Xenopus, y la inducción de Stra6 mediante retinoides demostró ser dependiente de la presencia de este subtipo de receptor de ácido retinoico (McGrew et al.,Mech. Dev. 87:21-32 [1999]; Taneja et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7854-8). Juntas, estas observaciones sugieren que la activación sinérgica de Stra6 por parte de Wnt y retinoides podría deberse a la activación de la expresión de RAR\gamma por la señalización de Wnt. Para determinar si la señalización de Wnt-1 tuvo alguna influencia sobre los niveles de RAR\gamma en células de mamífero, se realizaron transferencias Western para el receptor en lisados preparados a partir de células C57MG que expresan condicionalmente Wnt-1. Después de la expresión de Wnt-1, una proteína reactiva con anticuerpo específico a RAR\gamma-1, y que migra con una masa molecular aparente de 64 kDa, se indujo a las 24 horas y su expresión se incrementó a las 48 horas (Figura 18A). También analizamos las glándulas mamaria hiperplásicas y los tumores de glándula mamaria obtenidos de ratones transgénicos Wnt-1 y detectamos niveles elevados de ARNm de RAR\gamma en estos tejidos en comparación con glándula mamaria normal (Figura 18B). Se calculó el nivel de trascritos de RAR\gamma presente en cantidades equivalentes de ARN aislado de 19 adenocarcinomas mediante PCR cuantitativo. De manera destacada, aumentó la expresión de ARNm de RAR\gamma aproximadamente 2-4 veces en 14 de los 19 (74%) de los tumores de colon humano examinados comparados con tejido de colon humano normal (Figura 18C). Estos resultados demuestran que la señalización de Wnt-1 estimula la expresión de RAR\gamma que los receptores están elevados en tumores de ratón y de humano que son impulsados mediante el mecanismo de Wnt-1.
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Discusión de descubrimientos experimentales
Las estrategias de obtención de perfiles de expresión génica se basan en la detección objetiva de transcritos de ARNm y pueden por tanto conducir a la comprensión de los mecanismos por los cuales tiene lugar la activación de los genes. En la presente invención se ha demostrado que Wnt-1 estimuló la inducción del gen Stra6 sensible al ácido retinoico, sugiriendo una conexión entre los mecanismos de señalización logrados por Wnt y el ácido retinoico. Esta conexión fue apoyada adicionalmente mediante la demostración de una inducción sinérgica de Stra6 mediante una combinación de Wnt y ácido retinoico. Hay por lo menos tres explicaciones alternativas que pueden justificar esta sinergia: i) factores de transcripción directamente sensibles a Wnt como el TCF/LEFs podrían unirse a y activar elementos promotores en el gen de Stra6; ii) componentes de señalización en el mecanismo de Wnt podría interaccionar directamente con el receptor de ácido retinoico (RAR) apropiado y potenciar la activación de genes mediada por el RAR; o iii) la señalización mediante Wnt-1 podría activar la expresión del RAR apropiado, que podría a continuación sensibilizar las células al ácido retinoico. Aunque esta propuesta final está favorecida porque los datos presentados en la presente invención muestran que la señalización Wnt-1 induce rápidamente la expresión del receptor de RAR\gamma, la presente invención no está limitada por cualquier teoría particular o mecanismo de acción.
El trabajo anterior ha demostrado que la alteración específica del gen de RAR\gamma redujo enormemente la inducción del gen de Stra6 mediante retinoides, que a continuación se rescató en la re-expresión de este receptor (Taneja et al., supra). No obstante, sigue siendo posible que los mecanismos además de la expresión inducida por Wnt-1 de RAR\gamma puedan también contribuir a la sinergia observada. La propuesta de que \beta-catenina se une a receptores de ácido retinoico es atractiva, pero no hemos observado ninguna asociación específica de RAR\gamma endógeno con \beta-catenina en nuestras líneas celulares. No obstante, la unión de \beta-catenina a RAR\gamma, tal y como se demostró in vitro (Easwaran et al., 1999, supra), podría estar relacionada con la activación de Stra6 por parte de Wnt-1. El patrón de expresión de Stra6 en animales transgénicos nulos para RAR\gamma fue más extenso que el observado en los miembros de la camada de tipo salvaje, y se mejoró la inducción de Stra6 mediante ácido retinoico en células de los animales nulos en comparación con los controles (Bouillet et al, 1997, supra; Taneja et al, 1995, supra). De este modo RAR\gamma podría ser inhibidor para la expresión de Stra6, y la activación de \beta-catenina por parte de Wnt-1 podría potencialmente aliviar esta inhibición si la \beta-catenina inhibía la función de RAR\gamma.
La inducción sinérgica de un gen sensible a ácido retinoico mediante señalización Wnt-1 implica que los cánceres humanos que albergan defectos genéticos en el mecanismo de Wnt-1 mostrarían una sobreexpresión de Stra6. La inmensa mayoría de tumores colorrectales contienen mutaciones en los genes que codifican para el supresor tumoral APC o \beta-catenina (Polakis, Curr. Opin, Genet. Dev. 9:15-21 [1999]) y, por consiguiente, hemos detectado sobreexpresión del transcrito de Stra6 en 14 de 14 tumores colorrectales en comparación con tejido normal emparejado (ver Ejemplo 12). También se han identificado mutaciones activantes en \beta-catenina en cánceres de ovario y endometrio, tumores de riñón de Wilm y melanomas, demostrando que los defectos en la señalización de Wnt-1 contribuyen a la progresión de estos cánceres (Kobayashi et al. Jpn. J. Cancer Res. 90:55-9 [1999]; Koesters et al., Cancer Res 59:3880-2 [1999]; Palacios and Hamallo, Cancer Res. 58:1344-7; Rimm et al. Am. J. Pathol. 154:325-9 [1999]; Rubinfeld et al. Science 262:1731-1734 [1993]; Wright et al. Int. J. Cancer 82:625-9 [1999]). Todos estos cuatro cánceres humanos mostraron sobreexpresión de ARNm de Stra6 tal y como se determina mediante hibridación in situ (ver Ejemplo 12). El feocromocitoma, un tumor derivado de la médula adrenal, mostró niveles extremadamente altos de ARNm de Stra6, no obstante, no se ha descrito el estado de estos tumores respecto a las mutaciones en el mecanismo de señalización de Wnt-1. Es intrigante que los tipos celulares que ocasionan melanomas y feocromocitomas tengan en común una derivación embriológica de la cresta neural. En concreto, el tumor de riñón de Wilm, el feocromocitoma y los carcinomas endometriales todos surgen en órganos en los que se expresa Stra6 de forma normal. Esto sugiere que la señalización tumorigénica, como la dirigida por el mecanismo de Wnt-1, podría interaccionar con señales responsables de la diferenciación, hiperactivando de ese modo la expresión de Stra6.
La proteína Stra6 humana reside en la superficie de la célula, tal y como se determina mediante la tinción de células de cáncer colorrectal con anticuerpos monoclonales específicos para proteína Stra6 humana. Además, se incrementó la intensidad de tinción observada en la membrana celular después del tratamiento de las células con ácido retinoico. De este modo, Stra6 probablemente codifica una proteína de membrana multipaso que se localiza en la superficie celular.
Cabe indicar que se ha descubierto que ISRI, uno de los genes identificados en el cribado presente, es contiguo al gen Stra6. Se cree que cualquier otro gen que flanquee Stra6 y/o ISRL, o cualquier otro gen localizado cerca de Stra6 y/o ISRL es un buen candidato para los procedimientos de la presente invención.
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Ejemplo 14 Identificación de genes adicionales inducidos sinérgicamente por Wnt-1 y señalización del receptor de ácido retinoico (RAR)
Los datos revelados anteriormente en el Ejemplo 13 muestran que el gen de Stra6 sensible a ácido retinoico endógeno, se activó tras la expresión de Wnt-1. Además, stra6 se activó sinérgicamente mediante una combinación de ácido retinoico y Wnt-1. La activación sinérgica de stra6 no requirió la sobreexpresión de componentes de señalización intracelular y por lo tanto está mediada completamente por moléculas de señalización endógena sensibles a sus receptores correspondientes. Además, las líneas celulares de cáncer colorrectal humano que muestran señalización Wnt hiperactiva respondieron al tratamiento con ácido retinoico mediante la producción de niveles altos de proteína de Stra6. Esto sugiere que la auténtica interacción podría suceder entre los mecanismos de señalización de RAR y Wnt bajo condiciones fisiológicas o patológicas normales.
Que la inducción de la expresión de Stra6 por ácido retinoico fue más robusta en un ambiente oncogénico nos llevó a considerar aplicaciones terapéuticas potenciales en las que pudiera explotarse este efecto. Como el gen de Stra6 codifica para una proteína de superficie celular, una aplicación apropiada es la inmunoterapia en cáncer. La utilidad probada de los anticuerpos terapéuticos en el tratamiento de cáncer humano en la clínica ha despreciado recientemente la intensa actividad dirigida al desarrollo y al refinamiento de los inmunoterapéuticos. Idealmente, estas terapias requieren la presencia de antígenos de superficie celular expresados en las células cancerosas a niveles significativamente mayores que los presentes en tejidos normales en todo el cuerpo. Dichos criterios para la expresión diferencial en tumores en comparación con tejido normal limitarán obviamente el número de antígenos considerados deseables como dianas para inmunoterapia. Por tanto, se espera que los reactivos que incrementan selectivamente el nivel de expresión de antígeno de células cancerosas en comparación con células normales mejoren el índice terapéutico para inmunoterapéuticos dirigidos contra estos antígenos. Con este fin realizamos un cribado para identificar antígenos adicionales que preferentemente favorezcan la expresión mediante el tratamiento de células transformadas con Wnt-1 con ácido retinoico.
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Materiales y métodos Cultivo de células
Se diseñó una línea celular epitelial de mama C57MG murina para expresar el proto-oncogén Wnt-1 tras la extracción de tetraciclina del medio de cultivo celular (Korinek et al., Mol Cell Biol 18: 1248-56 (1998)). Las células se desarrollaron en placas de 10 cm en medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con 10% suero bovino fetal, 2 mM de L-glutamina, 100 unidades/ml penicilina/estreptomicina, 200 ng/ml tetraciclina, 400 \mug/ml G418, y 100 \mug/ml de higromicina B hasta una confluencia de aproximadamente el 60%. Las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato, se cultivaron en un medio sin tetraciclina durante 48 horas en presencia de 1 \muM de ácido todo-trans-retinoico (ATRA) o un volumen equivalente de DMSO y a continuación se recogieron. Las células de control se mantuvieron de forma completa en el medio que contenía tetracilcina en presencia de 1 \muM ATRA o DMSO. Todas las placas se recogieron simultáneamente y se extrajo el ARN total. El crecimiento y el tratamiento de las células y la purificación de ARN de las mismas se realizaron 2 veces independientes. Además de estos experimentos, se realizó la evolución con el tiempo en la que las células desarrolladas bajo las condiciones descritas anteriormente se recogieron a las 24, 48, 72 horas. Los resultados del punto de 48 horas de este experimento solo con los dos experimentos de 48 horas descritos anteriormente comprenden el grupo de datos por triplicado que se presentan en la sección de resultados.
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Extracción de ARN total
Las células se lisaron en 3,5 ml de tampón de lisis (4 M de tiocianato de guanidina, 25 mM de citrato sódico, N-lauril sarcosina al 0,5%, 2-mercaptoetanol al 0,7%) y se pudieron en capas sobre 1,5 ml de una solución de cloruro de cesio 5,7 M/EDTA 50 mM (pH 8,0). El lisado se centrífugo a 150.000xg durante la noche. EL residuo de ARN se secó, se resuspendió en agua, se extrajo en fenol: cloroformo, y se precipitó en etanol. El ARN se resuspendió en agua hasta una concentración final de 1 mg/ml y se almacenó a -70ºC.
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Grupos (array) de oligonucleótidos
Aproximadamente 10 mg de cada muestra de ARN sirvió como material de partida para la preparación de sondas requeridas para el análisis del conjunto de oligonucleótidos en el sistema de "microarray" de Affymetrix (Santa Clara, California). Las sondas se prepararon según los protocolos descritos anteriormente (Wodicka et al. Nat Biotechnol 15: 1359-1367 (1997)). Después de la hibridación, se lavaron los "arrays" y se tiñeron con estreptavidina-ficoeritrina y a continuación se escanearon con el escáner Gene Array (Agilent Technologies). Se aplicaron los parámetros por defecto dispuestos en el paquete informático de análisis de datos Affymetrix en la determinación de las intensidades de señales, referido como las diferencias promedio, y las diferencias en número para los grupos de sondas de 12.000 genes representados en el chip Affymetrix "A" Mu74. Las diferencias promedio obtenidas con las sondas derivadas de células que expresan Wnt-1 en ausencia o presencia de ATRA o tratadas con ATRA en ausencia de la expresión de Wnt-1, se señalaron en la base contra las diferencias promedio obtenidas de células de control no tratadas para generar el valor de la diferencia en número para cada conjunto de genes.
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Análisis de la PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR)
La cofirmación de la expresión génica se realizó utilizando RT-PCR utilizando los reactivos de análisis Taqman en un Detector se Secuencias ABI 7700 de Perkin-Elmer, Applied Biosystems. Las reacciones RT-PCR consistían en 100 ng de ARN, 5 \mul de 10 x tampón Taqman A, 300 \muM de cada dNTP, 5 mM de MgCl_{2}, 10 unidades de inhibidor de ARNasa, 12,5 unidades de Ranscriptasa Inversa MuLV, 1,25 unidades de AmpliTaq Gold ADN Polimerasa, 200 nM de sonda, y 500 nM de cebadores. Las condiciones de reacción consistían en la transcripción inversa a 48ºC durante 30 minutos, desnaturalización a 95ºC durante 10 minutos, y 40 ciclos de 95ºC durante 25 segundos y 65ºC durante 1 minuto. Los productos de reacción se analizaron en geles de poliacrilamida al 4-20%.
Se obtuvo la inducción del pliegue mediante la utilización del método DDCt en el que todas las muestras se normalizan primero hasta el nivel de la gliceraldehide-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) en cada muestra. A continuación, se compararon las unidades normalizadas relativas entre la muestra experimental y su control. Las secuencias del cebador y la sonda de GAPDH, Efrina B1, ligando 4-1BB e ISLR de ratón fueron los siguientes:
cebador directo GAPDH: 5'-TGCACCACCAACTGCTTAG-3' (SEC ID NO: 17);
cebador inverso: 5'-GGATGCAGGGATGATGTTC-3' (SEC ID NO: 18);
sonda: 5'-CAGAAGACTGTGGATGGCCCCTC-3' (SEC ID NO: 19).
cebador directo de Efrina B1: 5'-GTAGGCCAGGGCTATTTCTG-3' (SEC D NO: 20);
cebador inverso: 5'-TGTCTCATGAGGGTCCAAAA-3' (SEC ID NO: 21);
sonda: 5'-TGGCGCTCTTCTCTCCTCGGT-3' (SEC ID NO: 22).
cebador directo del ligando 41BB: 5'-TCGCCAAGCTACTGGCTAA-3' (SEC ID NO: 23);
cebador inverso: 5'-CTTGGCTGTGCCAGTTCA-3' (SEC ID NO: 24);
sonda: 5'-AACCAAGCATCGTTGTGCAATACAACTC-3' (SEC ID NO: 25).
cebador directo de ISLR: 5'-GCCAGTACAGGATCTGGAAAG-3' (SEC ID NO: 26);
cebador inverso: 5'-CATATCTCATCAGAGAGCATCTAAAA-3' (SEC ID NO: 27);
sonda: 5'-AAG CTT TTA GCC TGC CCA GCC A-3' (SEC ID NO: 28). 
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Transferencia Western
Siguiendo el tratamiento indicado, las células se lisaron en tampón de lisis Triton X-100 (20 mM tris-HCl (pH 8,0), 137 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM EGTA, 10% glicerol, 1,5 mM MgCl_{2}, 1 mM ditiotreitol, 1 mM de vanadato sódico, 50 mM de fluoruro sódico, y un cóctel de inhibidores de proteasas completo (Boehringer Mannheim, Mannheim Alemania)) y se sometieron equivalentes de proteínas a SDS-PAGE y se inmunotransfirieron. Las transferencias ("blots") se incubaron con 0,1 \mug/ml de anticuerpo monoclonal anti-ERK2 (Transduction Laboratories, Lexington, KY), anticuerpo monoclonal anti-etiqueta myc. Las transferencias se desarrollaron utilizando el sistema ECL (Amersham).
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Ensayo con luciferasa
Para determinar la transactivación dependiente de RAR, las células Cos-7 se cotransfectaron con los plásmidos de expresión indicados y la construcción de informador de luciferasa TREpal (Beyers) utilizando el reactivo de transfección Effectene (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Los plásmidos de expresión ya han sido descritos. Las células se trataron con 1 \muM ATRA o DMSO control en el día de la transcripción y se recogió 72 horas después mediante lisis en tampón de lisis Triton X-100. Se analizó la actividad de luciferasa en 10 \mul de lisado utilizando un luminómetro de microplaca Tropix TR717. Se normalizó la actividad para actividad de Renilla luciferasa producida mediante cotransfección con SV40-Renilla luciferasa. La activación de la transcripción dependiente de LEF/TCF se determinó mediante cotransfección con los plásmidos indicados y el plásmido de Top-tk luciferasa. La actividad se determinó tal como se ha descrito anteriormente.
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Resultados
La línea celular epitelial de mama C57MG murina experimenta una transformación morfológica en respuesta a la expresión de varios genes de Wnt (Wong et al., Mol Cell Biol 14: 6278-6286 (1994)). Se utilizó una versión de esta línea celular que se diseñó para expresar condicionalmente Wnt-1 en respuesta a la eliminación de tetraciclina del medio de cultivo para los experimentos de obtención del perfil de expresión genético. Para identificar genes que se activan preferentemente mediante la combinación de la señalización de ácido retinoico y Wnt-1, se establecieron cuatro condiciones diferentes para el tratamiento de las células. Como control, las células se dejaron en un medio que contenía tetraciclina más DMSO, el vehículo para ácido retinoico. Una segunda placa de células se trató con 100 nM de ácido todo-trans retinoico (ATRA) en presencia de tetraciclina, mientras que una tercera placa de células recibió DMSO control y se extrajo la tetraciclina para activar la expresión de Wnt-1. Finalmente, una cuarta placa de células se trató con ATRA y se extrajo la tetraciclina. Después de un periodo de incubación de cuarenta y ocho horas, se recogieron las células y se extrajo el ARN y se purificó. Las sondas sintetizadas a partir del ARN se hibridaron al Chip "A" Mu 74 de Affymetrix Mouse Gene que contenía grupos de sondas de 12.000 oligonucleótidos. El experimento, iniciado a partir del crecimiento y tratamiento de las células, se realizó tres veces independientes. Los datos se presentan para transcritos de ARNm que experimentaron un incremento de por lo menos dos veces o un descenso de un 50% en relación a las células no tratadas en los tres experimentos. Además, se realizó una evolución con el tiempo en el que el ARN se recogió a partir de las células tratadas a las 24, 48 y 72 horas. Estos datos se incluyen sólo para genes seleccionados.
El tratamiento de las células C57MG con ácido retinoico solo dio lugar a la activación robusta de numerosos genes (Tabla 1).
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Se ha descrito previamente que en algunos de estos genes, tales como decorina (Pearson, D. and Sasse, J., J Biol Chem 267: 25364-25370 (1992)), COUPTF-1 (Clotman et al., Neurotoxicol Teratol 20: 591-599 (1998)), 11-beta-hidroxilesteroide deshidrogenass (Tremblay et al., Biol Reprod 60: 541-545 (1999)), 3-0-sulfotransferasa (Zhang et al., J Biol Chem 273: 27998-28003 (1998)), Abca 1 (Wade, D. P. and Owen, J. S., Lancet 357: 161-163 (2001)) y ceruloplasmina (Koj et al., Biol Chem Hoppe Seyler 374: 193-201 (1993)) se favorece su expresión mediante ácido retinoico en otros tipos de células. La identificación de estos genes en el cribado demuestra que las células C57MG responden de manera apropiada a ácido retinoico y sugiere que los puntos finales comunes para la señalización del ácido retinoico existen en diversos tipos de células. Los genes adicionales inducidos por el ácido retinoico, tales como la retinal deshidrogenasa de cadena corta y la aldehído deshidrogenasa 3, codifican para enzimas que están implicadas en el metabolismo de los retinoides y podrían, por tanto, representar respuestas retroactivas ("feed-back") o por prealimentación ("feed-forward") al propio ácido retinoico (Duester, Eur J Biochem 267: 4315-4324 (2000)). Finalmente, varios tergenos que fueron inducidos por ácido retinoico, tales como autotaxina, tioéter S-metil transferasa y angiotensiógeno, no portan ninguna conexión obvia para la señalización o el metabolismo del ácido retinoico y no se ha descrito previamente que sean activados por receptores sensibles al ácido retinoico.
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Para identificar genes inducidos por Wnt-1, se eliminó la tetraciclina de las células en ausencia de ácido retinoico. Bajo estas condiciones, se identificaron 13 transcritos que se expresaron a niveles de 2 veces o superior en relación a las células de control en los tres experimentos. Esto es probablemente una subestimación del número de genes que realmente son inducidos por la señalización de Wnt-1 en estas células. De hecho, se identificaron numerosos genes adicionales, incluyendo ciclina D1, que es una diana de la señalización de Wnt-1 (Tetsu, O. and McCormick, F., Nature 398: 422-426 (1999)), en sólo 2 de los 3 experimentos o no alcanzaba 2 veces el corte. Dos de los genes identificados en el cribado, los factores de transcripción TCF1 y BTEB2, se describieron previamente como dianas de la señalización de Wnt (Ziemer et al, Mol Cell Biol 21: 562-574 (2001); Roose et al., Science 285: 1923-1926 (1999)).
Las variantes por corte y empalme de TCF1 que se unen a ADN, pero que carecen de los sitios de unión a \beta-catenina proporcionan un retroalimentación negativa en la señalización de Wnt y, de este modo, actúan como supresores de tumores. Además, uno de los receptores de Wnt, frizzled-2, también favorecía su expresión mediante la señalización de Wnt en la línea celular C57MG. Algunos de estos genes favorecidos en la expresión por Wnt-1, tales como GADD45 gamma y el ligando 4-1BB, podrían representar una respuesta a una señalización del crecimiento inapropiado debido a la sobreexpresión de Wnt-1. El ligando 4-1BB (CD137) es un miembro de la superfamilia de TNF que se expresa en varias líneas celulares de carcinoma humano y estimula las respuestas de las células T en el rechazo de tumores. La activación de GA0045g/CR6 sugiere que la señalización de Wnt induce errores que afectan a la fidelidad de la replicación de ADN. De hecho, las mutaciones p53 cooperan con la sobreexpresión de Wnt-1 para producir tumores en ratones que muestran una inestabilidad cromosómica (Donehower et al., Genes Dev 9: 882-895 (1995)). SE han implicado dos genes adicionales favorecidos en su expresión por Wnt-2, semaforina E y autotaxina, en la progresión de tumores humanos como factores que contribuyen a la motilidad y la expansión metastática de células cancerosas (Martin-Satue, M. and Blanco, J., J Surg Oncol 72: 18-23 (1999); Yamada et al., Proc Natl Acad Sci USA 94:14713-14718 (1997)); Nam et al., Oncogene 19:241-247 (2000)).
Tal como se ha descrito anteriormente, se identificó stra6 como un gen activado por la señalización de Wnt-1. Stra6 se identificó originalmente en un cribado diseñado APRA detectar transcritos de ARNm inducidos por la señalización de receptores de ácido retinoico (Bouillet et al., Dev Biol. 170: 420-433 (1995)). Aunque se observó que el ácido retinoico inducía la expresión de stra6, también se demostró su activación sinérgica mediante la combinación de Wnt-1 y ácido retinoico (véase el ejemplo 13 anterior). Por lo tanto, era interesante saber si los genes adicionalmente a stra6 se podían activar de un modo similar. En concordancia con los hallazgos anteriores, se activó stra6 mediante ácido retinoico o Wnt-1, mientras que la combinación de estos agentes dio lugar a niveles de expresión que superaban ampliamente a los observados con cualquier agente solo (figura 19). Se observó un patrón similar de expresión para autotaxina, que experimentó una activación modesta en presencia de ácido retinoico o Wnt-1 solo, pero una inducción más robusta en respuesta a ambos estímulos. (figura 20). La activación sinérgica de autotaxina se confirmó mediante una análisis RT-PCR sobre ARN extraído de células C57MG sometidas al mismo tratamiento que el utilizado en el cribado del perfil de expresión. El ligando 41BB y efrina b1 también fueron inducidos de forma sinérgica por Wnt-1 y ácido retinoico, aunque el ácido retinoico solo no parecía tener un efecto significativo en su expresión (Figuras 21 y 22). La activación sinérgica de estos dos genes también se confirmó mediante RT-PCR. En el caso de la efrina b1, el anticuerpo estaba disponible comercialmente y se utilizó para demostrar la activación sinérgica a nivel de la expresión de proteínas (figura 22). A diferencia de la activación de efrina b1 y el ligando 41BB, el gen ISLR era sensible al ácido retinoico, pero no a Wnt, mientras que la combinación de ambos agentes dio lugar a la activación que superaba la del ácido retinoico solo (figura 23). Algunos genes, tales como M-ras y la proteína de estrecha unión Z0-1, parecían no responder de forma significativa al ácido retinoico o Wnt-1 solos, sino que sólo se activaron por el tratamiento combinado (figura 24).
Es evidente que ciertos genes experimentan una activación sinérgica mediante la combinación de ácido retinoico y Wnt-1, aunque el mecanismos de señalización que media este efecto no se ha definido claramente. Se han observado niveles incrementados de proteína RAR\gamma en células activadas por la expresión de Wnt-1 (datos no descritos). Por lo tanto, las células activadas por Wnt podrían ser más sensibles al ácido retinoico debido a niveles más elevados de RAR\gamma. Sin embargo, la activación sinérgica de stra6 por Wnt-1 y ácido retinoico precedió a cualquier aumento observable en RAR\gamma sugiriendo que funcionaban mecanismos adicionales. Además, la capacidad de Wnt-1 solo de activar Stra6 fue inhibida por un pan-antagonista de la señalización de RAR. Esto sugiere que incluso en ausencia de RA añadido de forma exógena, Wnt-1 era dependiente de la señalización de RAR retinoico para la inducción de stra6. Por lo tanto, es concebible que Wnt facilita la señalización de RAR de manera que no implica el mecanismo de Wnt-1 canónico en el que \beta-catenina interacciona con los factores de transcripción TCF/LEF. Para examinar esto, se sobreexpresó un mutante oncogénico de \beta-catenina y se midió la activación de un elemento de respuesta RAR (RARE) en presencia y ausencia del LEF sobreexpresado. La expresión de \beta-catenina activó el RARE según se determina mediante el aumento de la producción de luciferaza (figura 25A). Sin embargo, la coexpresión de \beta-catenina no potenciaba la actividad de RARE pero, en cambio, inhibía su activación por la \beta-catenina. Éste no fue el caso para el elemento sensible a LEF TopFlash, el cual se activó después de la expresión de LEF con \beta-catenina (figura 25B). Los resultados indican que la \beta-catenina estaba implicada en la activación de algunos genes sensibles al ácido retinoico de forma que no implica a LEF. La capacidad de LEF para inhibir la activación de RARE por la \beta-catenina es muy probablemente debida a que la unión competitiva como sitio de unión a \beta-catenina en LEF era necesaria para este efecto (datos no mostrados). Este resultado sugiere que LEF se une a \beta-catenina de manera que descarta su interacción con los componentes de señalización de RAR y evita así el potenciamiento de la señalización de RAR.
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Ejemplo 15 Inducción de Stra6 en tumores de glándulas mamarias explantadas
Los resultados con la línea celular C57/MG presentada en el ejemplo 14 anterior, sugieren que los tumores inducidos por la señalización de Wnt probablemente responden a ácido retinoico mediante la expresión de niveles elevados de transcritos de ARNm que son inducidos sinérgicamente por Wnt y el ácido retinoico. Para examinar esto, los tumores mamarios derivados de ratones transgénicos Wnt-1 descritos en e el ejemplo 13, se transplantaron en la almohadilla de grasa mamaria de ratones intactos a los que posteriormente se administró ácido retinoico. La administración de ácido retinoico (ATRA), pero no vehículo de control, dio lugar a la favorecimiento de la expresión de ARNm de Stra6 en los tumores mamarios transplantados de ratón, pero no presentaban un efecto significativo en la expresión de Stra6 en tejido mamario normal.
Los datos presentados en la figura 26 muestran el efecto de la inducción de Stra6 después de la inyección peritumoral de 100 mg/kg y 400 mg/kg (aproximadamente 10 mg total/25 gramos de ratón) de ácido todo-trans retinoico. Se observó que un gen de control, DHR retinal, que es sensible al ácido retinoico solo, se indujo en tejido mamario normal (datos no mostrados). En la figura 26 "Tum" representa el tumor mamario transplantado de ratón, "MG" representa el tejido mamario normal, "PT" representa el peritumor y los números inmediatamente precedentes a "MG" y "Tum" se utilizan para designar los animales concretos de los que se extraen las muestras. Los datos presentados son los niveles de expresión de ARNm normalizados al gen "housekeeping", GAPDH. En particular, se utilizaron curvas estándar para determinar los niveles relativos de expresión para cada gen de interés, así como el gen "housekeeping" GAPDH para cada muestra analizada. Las unidades normalizadas relativas se obtuvieron dividiendo el nivel de ARNm para el gen de interés por el nivel de ARNm de GAPDH. Los tumores y glándulas mamarias adyacentes normales se recogieron 8 horas después del tratamiento.
La figura 7 muestra que la administración de ATRA a ratones desnudos que portan xenoinjertos WiDr también induce Stra6. Específicamente, se les administró a los ratones ATRA por vía oral (PO) a 400 mg/kg. Los tumores se recogieron 12 horas después del tratamiento. En este experimento, se analizó la administración oral de ATRA (PO), así como la administración peritumoral (datos no mostrados). Los datos presentados en la figura 27 muestran que la administración oral de 400 mg/kg de ATRA favorece selectivamente la expresión de ARNm de Stra6 en xenoinjertos WiDr en comparación con el control no tratado. Los niveles de expresión de ARNm se normalizaron tal como se ha descrito anteriormente.
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Depósito de material
Los siguientes materiales se han depositado con la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd.., Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC):
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El cesionario de la presente solicitud ha acordado que si un cultivo de los materiales en el depósito muriera o se perdiera o se destruyera cuando se cultiva en las condiciones adecuadas, los materiales serán inmediatamente remplazados en una notificación por otros iguales. La disponibilidad del material depositado no se interpreta como una licencia para realizar la invención contraviniendo los derechos concedidos bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patente.
La memoria escrita anterior se considera que es suficiente para permitir a un experto en la materia realizar la invención. La presente invención no se limita en su alcance por la construcción depositada, ya que la realización depositada pretende ser una ilustración individual de ciertos aspectos de la presente invención y otras construcciones que son funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de la presente invención tal y como se define en las reivindicaciones. El depósito del material de la presente invención no constituye una admisión de que la descripción escrita contenida en la presente invención sea inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el modo óptimo de la misma, ni se interpreta como limitante del alcance de las reivindicaciones a las ilustraciones específicas que representa.
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Referencias citadas en la descripción
Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto.
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\global\parskip0.000000\baselineskip
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<120> MÉTODOS PARA AUMENTAR LA EFICACIA DE LA TERAPIA CONTRA EL CÁNCER
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<130> RXT/FP6337281
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<140> EP 05023231.3
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<141> I2001-07-10
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<150> EP 01950996.7
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<151> 2001-07-10
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<150> PCT/US01/21635
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<151> 2001-07-10
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<150> 60/228, 914
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<151> 2000-08-29
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<150> 09/759,056
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2001-01-11
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 09/901,812
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2001-07-10
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<160> 28
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<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
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<210> 1
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<211> 2732
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<400> 1
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7
700 
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<212> PRT
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8
9 
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<212> ADN
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<221> misc_feature
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<222> (0)...(0)
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<223> n = A, T, C o G
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<400> 3
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10 
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<212> ADN
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11
110 
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<212> PRT
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\newpage
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cacactcgag agccagatat ttt 
\hfill
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aacaagttta ttgcagggaa cac 
\hfill
23 
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tgtagttttt atgcctttgg ctattatgaa agaggt 
\hfill
36 
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agaccaggtc ccacactga 
\hfill
19 
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<212> ADN
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<220>
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<223> Secuencia artificial = oligonucleótido sintético
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ttcataatag ccaaaggcat aaaa 
\hfill
24 
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<212> ADN
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<220>
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ctgcccacac tcgagagcca gat 
\hfill
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<212> PRT
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\hskip1cm
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tgcaccacca actgcttag 
\hfill
19 
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<213> Secuencia artificial
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<223> Secuencia artificial = oligonucleótido sintético
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ggatgcaggg atgatgttc 
\hfill
19 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Secuencia artificial = oligonucleótido sintético
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cagaagactg tggatggccc ctc 
\hfill
23 
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<223> Secuencia artificial = oligonucleótido sintético
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gtaggccagg gctatttctg 
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20 
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19 
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aaccaagcat cgttgtgcaa tacaactc 
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gccagtacag gatctggaaa g 
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catatctcat cagagagcat ctaaaa 
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aagcttttag cctgcccagc ca 
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Claims (32)

1. Uso de un agente antitumoral para la fabricación de un medicamento para el tratamiento en combinación con un retinoide de un tumor de un cáncer humano seleccionado entre cáncer de ovario, cáncer endometrial, tumor de riñón de Wilm, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer gástrico, cáncer de pulmón, cáncer hepatocelular, melanoma o feocromocitoma, donde dicho agente antitumoral es un anticuerpo, una molécula antisentido, una ribozima o un ADN de triple hélice que se une a una proteína diana seleccionada del grupo que consiste en autotaxina, ligando 4-1BB, efrina b1, ISLR, M-ras, y ZO-1 o a un ácido nucleico que codifica dicha proteína diana.
2. Uso de un retinoide y un agente antitumoral para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un tumor de un cáncer humano seleccionado entre cáncer de ovario, cáncer endometrial, tumor de riñón de Wilm, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer gástrico, cáncer de pulmón, cáncer hepatocelular, melanoma o feocromocitoma, donde dicho agente antitumoral es un anticuerpo, una molécula antisentido, una ribozima o un ADN de triple hélice que se une a una proteína diana seleccionada del grupo que consiste en autotaxina, ligando 4-1BB, efrina b1, ISLR, M-ras, y ZO-1, o a un ácido nucleico que codifica dicha proteína diana.
3. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha proteína es una proteína de la superficie celular.
4. Uso según la reivindicación 1, en el que dicha proteína se selecciona del grupo que consiste en ligando 4-1BB, efrina b1, ISLR, M-ras, y ZO-1.
5. Uso según la reivindicación 4, en el que dicha proteína se selecciona del grupo que consiste en ligando 4-1BB, efrina b1 e ISLR.
6. Uso según la reivindicación 5, en el que dicha proteína se selecciona del grupo que consiste en ligando 4-1BB y efrina b1.
7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho retinoide se administra antes de la administración de dicho agente antitumoral.
8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho retinol se administra simultáneamente con la administración de dicho agente antitumoral.
9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho retinoide se administra después de la administración de dicho agente antitumoral.
10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho retinoide es ácido retinoico.
11. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo es un fragmento de anticuerpo.
12. Uso según la reivindicación 11, en el que dicho fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en los fragmentos Fab, Fab', F(ab')_{2}, y Fv, diabodies, moléculas de anticuerpos de cadena única, y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, quimérico, humano o humanizado.
14. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el anticuerpo se conjuga a un agente citotóxico.
15. Uso según la reivindicación 14, en el que el agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste en un agente quimioterapéutico, un maitansinoide, una caliqueamicina, un antifolato, una toxina enzimáticamente activa y un isótopo radioactivo.
16. Uso según la reivindicación 14, en el que el agente citotóxico es un maitansinoide.
17. Metodo de diagnóstico de un tumor de un cáncer humano seleccionado entre cáncer de ovario, cáncer endometrial, tumor de riñón de Wilm, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer gástrico, cáncer de pulmón, cáncer hepatocelular, melanoma o feocromocitoma que comprende:
a) poner en contacto una muestra biológica obtenida de dicho paciente con ácido retinoico; y
b) detectar la expresión aumentada de una proteína diana en la muestra biológica tratada con el retinoide en relación a un tejido normal, donde la proteína diana se selecciona del grupo que consiste en autotaxina, ligando 4-1BB, efrina b1, ISLR, M-ras, y ZO-1.
18. Método según la reivindicación 17, en el que dicha proteína es una proteína de la superficie celular.
19. Método según la reivindicación 17, en el que dicha proteína diana se selecciona del grupo que consiste en ligando 4-1BB, efrina b1, ISLR, M-ras, y ZO-1.
20. Método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en el que dicha detección de la expresión aumentada en la muestra biológica comprende detectar la expresión de la proteína con un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.
21. Método según la reivindicación 21, en el que dicho fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en los fragmentos Fab, Fab', F(ab')_{2}, y Fv, diabodies, moléculas de anticuerpos de cadena única, y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
22. Método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21, en el que el anticuerpo está marcado de manera detectable.
23. Método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22, en el que dicha detección de la expresión aumentada de una proteína diana en la muestra biológica comprende detectar la expresión del ácido nucleico que codifica dicha proteína diana utilizando una sonda o cebadores.
24. Composición farmacéutica que comprende un retinoide y un agente antitumoral, en el que el agente antitumoral es un anticuerpo, una molécula antisentido, una ribozima o un ADN de triple hélice que se une a una proteína diana seleccionada del grupo que consiste en autotaxina, ligando 4-1BB, efrina b1, ISLR, M-ras, y ZO-1 o a un ácido nucleico que codifica dicha proteína diana
25. Composición farmacéutica según la reivindicación 24, en la que dicha proteína es una proteína de la superficie celular.
26. Composición farmacéutica según la reivindicación 24, en la que dicha proteína diana se selecciona del grupo que consiste en ligando 4-1BB, efrina b1, ISLR, M-ras, y ZO-1.
27. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, en la que el agente antitumoral es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en los fragmentos Fab, Fab', F(ab')_{2}, y Fv, diabodies, moléculas de anticuerpos de cadena única, y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
28. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, en la que el agente antitumoral es un anticuerpo monoclonal, humano o humanizado o un fragmento de anticuerpo.
29. Composición farmacéutica según la reivindicación 28, en la que el anticuerpo se conjuga a un agente citotóxico.
30. Composición farmacéutica según la reivindicación 29, en la que el agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste en un agente quimioterapéutico, un maitansinoide, una caliqueamicina, un antifolato, una toxina enzimáticamente activa y un isótopo radioactivo.
31. Composición farmacéutica según la reivindicación 30, en la que el agente citotóxico es un maitansinoide.
32. Agente antitumoral para su uso en el tratamiento en combinación con un retinoide de un tumor de un cáncer humano seleccionado entre cáncer de ovario, cáncer endometrial, tumor de riñón de Wilm, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer gástrico, cáncer de pulmón, cáncer hepatocelular, melanoma o feocromocitoma, donde dicho agente antitumoral es un anticuerpo, una molécula antisentido, una ribozima o un ADN de triple hélice que se une a una proteína diana seleccionada del grupo que consiste en autotaxina, ligando 4-1BB, efrina b1, ISLR, M-ras, y ZO-1 o a un ácido nucleico que codifica dicha proteína diana.
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