KR20100031320A - 혈류 내 순환시간 증가를 위한 단백질로 결합된 리포솜 및 이의 제조방법 - Google Patents

혈류 내 순환시간 증가를 위한 단백질로 결합된 리포솜 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 혈류 내 순환시간을 증가시킨 단백질로 결합된 리포솜 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 단백질을 음이온성 리포솜 표면에 정전기적 상호인력으로 결합시키고, 리포솜 표면에 결합된 단백질을 변성시켜 리포솜과의 결합력을 강화시킴으로써 리포솜이 혈류 내에서 순환할 때 혈장 내 단백질의 흡착을 방지하여 혈류 내에서 리포솜의 안정성을 강화하는 한편, 체내 순환시간을 증가시키는 리포솜 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
단백질, 결합, 리포솜, 이온 결합, 체내 순환시간

Description

혈류 내 순환시간 증가를 위한 단백질로 결합된 리포솜 및 이의 제조방법{Liposome coated with protein to prolong circulation time in bloodstream and preparation method thereof}
본 발명은 혈류 내 순환시간을 증가시킨 단백질로 결합된 리포솜 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
리포솜은 체내에 존재하는 인지질과 동일한 화학구조를 갖는 천연 또는 합성 인지질을 주성분으로서 사용하기 때문에 생체적합성이 우수하고 세포와의 융합이나 세포내 이입을 통해 약물을 전달할 수 있는 효율적인 약물 전달체로서 많이 응용되어 왔다[A.D. Bangham, M. Standish, J. C. Watkis, J. Mol. Biol., 13, 238(1965)]. 또한, 독성이 강한 항암약물 등을 리포솜 내부에 봉입하여 항암세포에 약물을 전달하는 전달체로서 약물 고유의 독성을 감소시켜 항암약물에 대한 부작용을 방지할 수 있는 장점을 가지고 있다[D. Needham, M. W. Dewhirst, Adv. Drug Deliver. Rev., 53, 285(2001)]. 일반적으로 항암약물은 암세포뿐만 아니라 정상세포에까지 영향을 미쳐 심각한 부작용을 나타내는 특성이 있기 때문에 이러한 항암약물을 효율적으로 암 조직까지 운반하기 위해 리포솜을 이용함으로써 약 물의 독성을 감소시키고 약리학적 효능을 증가시킬 수 있다는 보고가 있다[D.J.A. Crommelin, L. van Bloois, Int. J. Pharm., 17, 135(1983)]. 그러나, 이와 같은 리포솜은 체내 주입 시 혈장 단백질의 흡착과 효소들에 의한 지질의 분해 등의 이유로 인하여 리포솜의 구조적인 불안정성이 관찰됨으로써 현재 약물 전달체로서 응용이 많이 부족한 형편이다. 따라서, 리포솜의 안정성을 향상시키기 위한 여러 가지 방법들이 도입되고 있는 실정이다. 특히, 리포솜의 표면에 생체적합성 고분자 물질을 결합시켜 혈장 단백질과 흡착을 방지하고, 혈액 내에서 리포솜의 안정성과 순환 시간을 증가시키기 위한 연구가 진행되고 있다[H. Takeuchi, H. Kojima, H. Yamamoto, Y. Kawashima, J. Control. Release, 75, 83(2001)].
최근 리포솜 개발 사례 중에서 폴리에틸렌글리콜을 인지질에 결합시킨 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시-(폴리에틸렌글리콜)-2000] (DSPE-mPEG2000)으로 구조적으로 안정한 리포솜을 제조하는 것에 관한 연구결과가 발표되었다[B. Ceh, M. Winterhalter, P. M. Frederik, J. J. Vallner, D. D. Lasic, Adv. Drug Deliv. Rev., 24, 3356(1997)]. 종래 기술들에 의한 메톡시 폴리에틸렌글리콜2000-지질 복합체를 도입한 리포솜의 제조는 제형적인 안정성과 순환시간을 향상시키기에 적합한 방법이었다[B. Ceh, M. Winterhalter, P. M. Frederik, J. J. Vallner, D. D. Lasic, Adv. Drug Deliv. Rev., 24, 3356(1997)]. 그러나, 메톡시 폴리에틸렌글리콜 2000을 이용한 리포솜은 생체 내 효소에 의하여 분해되지 않고 세포에 축적되어 세포 기능 장애를 유발할 수 있고, 표적부위에서 약물의 방출을 저해하기 때문에 결과적으로 치료 효능이 감소되는 단점을 가질 수 있다는 보고가 있다[Boomer, J.A., Inerowicz, H.D., Zhang, Z., Bergstrand, N., Edwards, K., Kim, J.M., Thompson, D.H., Langmuir, 19, 6408(2003)].
미국 특허 제5,922,350호는 리포솜의 탈수반응 이전에 트레할로스 및 수크로스와 같은 당류를 첨가함으로써, 인지질 등에 기초한 리포솜들의 안정성을 강화 방법을 기술하고 있다. 그러나, 상기 특허는 제형의 입자크기가 약 100 ~ 500 nm로 제형이 균일하게 제조되지 못하고 200 nm 이상의 입자크기로 제조될 경우 체내 순환 시 간이나 비장의 세망내피계에 흡수되어 리포솜이 소실될 수 있다.
미국 특허 제7,179,484호와 한국 특허 출원 제2005-0071641호는 단백질을 이용하여 리포솜의 안정성을 증가시키고 혈류 내 순환시간을 향상시키는 방법을 기술하고 있다. 그러나, 상기 특허는 리포솜에 결합된 단백질이 생리학적 활성을 갖고 있기 때문에, in vivo에서 효소에 의해 분해되어 혈류 순환이 저해될 수 있다. 또한, 상기 특허는 리포솜 제조 시에 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시-(폴리에틸렌글리콜)-2000](DSPE-mPEG2000)을 도입하기 때문에 체내 투여 시 효소에 의해 분해되지 않고 세포에 축적되므로 세포 기능 장애를 유발할 수 있다. 이에, 본 발명에서는 양전하를 갖는 단백질과 음전하를 갖는 리포솜을 이온결합에 의해 결합시켰다. 이는 상기 특허와 달리 이온결합을 이용하여 단백질과 리포솜을 결합시켰고, 결합된 단백질을 변성시킴으로 단백질의 소수성 아미노산 그룹과 리포솜 형성 지질의 소수성 그룹과 추가적으로 결합되어 리포솜과 단백질의 결합력이 더욱 강화되므로 혈장 단백질의 흡착이 억제시키고 혈류 내에서 리포솜의 순환을 향상시킬 수 있다. 또한, 세포 기능 장애를 유발 할 수 있는 폴리에틸린글리콜을 도입하지 않고 동등 이상의 효력을 얻기 위하여 리포솜에 단백질을 결합하였고, 미국 및 한국식품의약안전청에 허가된 지질로만 리포솜을 제조하여 실용성을 증대하는 한편, 결합된 단백질을 물리ㆍ화학적으로 변성시킴으로써 리포솜의 안정성을 강화하여 체내 순환시간이 향상됨을 확인하였다.
이와 더불어 리포솜에 결합한 생체적합성 단백질인 알부민은 간에서 생성되고 혈청에 존재하는 단백질 중에서 50 ~ 55%를 차지하고 있는 가장 풍부한 혈청 단백질로서, 혈액의 삼투압을 유지하는 역할을 하는 물질이다. 알부민과 같은 이러한 단백질은 아미노산으로 구성되어 있으며, 펩티드 결합에 의해 연결되는 일차 구조 이외에 알부민 분자 내에 존재하는 수많은 유기 아미노기 또는 카르복실기에 의해 이황화 결합, 수소결합, 소수성 결합으로 이루어져 있다. 또한, 모든 세포에 존재하는 단백질 군집인 샤프론에 의해 단백질 접힘이 일어나 알부민 고유형태인 삼차원의 입체구조를 이루고 있다. 단백질의 접힘은 아미노산의 서열에 의하여 결정되고 샤프론 군집에는 접힘이 안되어 있는 단백질과 결합하여 단백질의 활성이 감소되는 역할을 하는 분자적 샤프론과 단백질과의 접힘이 일어나도록 유도하는 샤프로닌이 있다. 또한, 알부민은 양전하와 음전하를 동시에 가지고 있는 쯔비터 이온으로 4.7의 등전점을 나타내는 특성이 있어 pH 1∼4에서는 강한 양이온성을 나타내고 pH 6∼9에서는 강한 음이온성을 나타내며 생체 내에서 분해가 가능하고 열에 의한 물리적 작용이나 산ㆍ알칼리와 같은 화학적인 변화에 의해 변성되는 특성을 가지고 있다. 특히, 알부민과 같은 단백질은 열에 의하여 에너지를 가하면 단백질 고유의 입체 구조를 안정시키는 수소 결합과 소수성 결합이 끊어져 서 단백질 접힘이 풀어지는 일차 구조의 형태로 변성되어 진다[Drummond, I.A.S., Steinhardt, R.A. Exp. Cell Res. 173 , 439(1987)]. 또한, 변성된 단백질은 펩티드 결합의 아미드기와 카르보닐기에 의해 형성된 새로운 수소 결합과 소수성 그룹이 경계면을 형성하여 유체역학적으로 자유에너지가 최소화가 되므로 효소작용, 호르몬의 생리작용, 독성, 그리고 면역성 등의 단백질 고유의 활성을 잃게 되는 특성이 있다[Pelham, H. Nature, 332, 776(1988)]. 이러한 변성된 단백질을 이용하여 수용성 또는 난용성 약을 전달할 목적으로 나노스피어와 마이크로스피어를 제조하는 방법 등의 약물전달시스템으로의 적용 사례가 연구, 보고되고 있다[Burgess. D.J., Davis. S.S., Tomlinson. E., Int. J. Pharm., 43, 167(1988)].
본 발명자들은 양이온성 리포솜과 음이온성 단백질을 결합시켜 혈류 내 순환시간을 향상시킨 리포솜을 개발하여 특허 출원한 바 있다[한국 특허 출원 제2008-0019750호]. 상기 특허는 단백질을 결합시키기 위해 양이온성 지질인 1,2-다이스테아로일-3-트리메틸암모늄 프로판을 리포솜 형성에 도입하여 양이온성 리포솜을 제조하였으나, 사용된 1,2-다이스테아로일-3-트리메틸암모늄 프로판은 미국 및 한국식품의약안전청에 허가되어 있지 않은 부형제로 실용성에서 취약할 수 있다.
또한, 미국 특허 제6,749,868호는 디테르페노이드 계열 난용성 약물인 파클리탁셀을 수용성인 알부민과 결합시켜 제조한 알부민-나노입자에 관한 내용이 기술되어 있다. 상기 특허는 유기용매 상에 용해시킨 파클리탁셀과 물에 용해시킨 알부민을 오일과 같은 계면활성제를 사용하여 소수성 결합에 의한 파클리탁셀이 봉입된 알부민-나노입자를 제조하였으나, 상기 특허는 난용성 약물에만 제한적으로 적용되어 진다. Abraxis Bioscience, Inc.는 상기 특허에서 기술된 내용을 기반으로 변성된 알부민을 이용하여 제조한 제형을 주사제로 도입한 Abraxane®을 개발하였다. Abraxane®은 순수 파클리탁셀을 가용화하여 주사제로 도입한 Bristol-myers squibb co.의 Taxol®과 약동력학적으로 비교하였을 때, 체내 순환시간이 향상됨이 보고되었고 이러한 결과로 변성된 단백질을 이용한 제형은 기존의 제형 보다 혈류 내에서 안정성과 체내 순환시간이 향상됨이 증명되었다. 그러나, 난용성 약물뿐만 아니라 수용성 약물까지 봉입할 수 있고 허가된 부형제로 제조된 리포솜에 대한 개발 사례는 보고된 바가 없어 현재 의료적으로 사용하고 있는 리포솜에 비하여 안정성을 월등히 향상시키고 체내 순환시간을 증가시켜 종양 조직 이외의 조직에 대하여 약물의 생체 분포를 낮출 수 있는 리포솜 제형의 개발이 시급한 실정이며, 혈류에서 혈장 단백질에 대하여 안정성을 유지하여 체내에서 약물의 유효치료 농도를 지속적으로 유지하며, 표적으로 하는 종양 조직으로만 약물을 전달할 수 있도록 하는 제형의 개발이 무엇보다도 시급한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 체내에서 단백질의 흡착이 억제되어 안정성이 향상되고, 지속적으로 순환되는 리포솜을 개발하기 위하여 연구한 결과, 혈류 내에서의 순환시간을 증가시키기 위하여 리포솜을 형성하는 지질 중에서 미국 및 한국 식품의약품안전청에 허가되어 있는 음이온성 인지질을 일 정량 포함하고, 이러한 음이온성 리포솜의 표면에 양이온성을 나타내는 pH 조건에서의 단백질을 정전기적인 인력으로 이온 결합시켰고, 리포솜 표면에 결합된 단백질을 변성시켜 단백질의 소수성 아미노산 잔기들이 리포솜의 소수성 그룹과 결합하여 리포솜과 단백질과의 결합력을 강화하는 한편, 소수성 그룹으로 경계면이 형성되어 유체역학적으로 최소화된 자유에너지를 갖는 변성된 단백질로 인하여 혈류 내에서 안정성이 증가되고 체내순환속도가 향상되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 단백질을 리포솜 표면에 결합한 후, 이를 변성시켜 혈류 내에서 단백질의 흡착을 억제하고 체내순환속도가 향상되는 안정화-체내순환 지속형 리포솜 및 이의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 음이온성 지질을 포함하는 리포솜 표면에, 단백질이 이온 결합된 혈류 내 순환시간이 증가된 리포솜 및 이의 제조방법을 그 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 단백질을 음이온성 리포솜 표면에 정전기적 상호인력으로 결합시키고, 리포솜 표면에 결합된 단백질을 변성시켜 리포솜과의 결합력을 강화시킴으로써 리포솜이 혈류 내에서 순환할 때 혈장 내 단백질의 흡착을 방지하여 혈류 내에서 리포솜의 안정성을 강화하는 한편, 체내 순환시간을 증가시키는 리포솜 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 리포솜에 이온 결합한 단백질은 다양한 동물조직과 식물조 직에서 분리 추출하거나, 재조합 단백질(recombinant protein)을 사용하는 것도 가능하며, 중량 평균 분자량이 2,000 ~ 1,500,000 Da인 단백질 또는 그 유도체가 바람직하다. 예를 들어, 알부민, 글로불린, 글루테닌, 프롤라민, 알부노이드 등의 단순 단백질; 핵단백질, 당단백질, 인단백질, 지단백질, 색소단백질 등의 복합 단백질; 및 단백질이 가수분해되는 중간 산물들인 젤라틴, 프레테오스, 펩톤, 다이펩티드, 트라이펩티드 등의 유도 단백질; 중에서 1종 이상을 사용할 수 있다.
특히, 본 발명에 사용된 단백질인 알부민은 달걀, 동물의 혈청, 젖, 간, 그리고 근육으로부터 분리된 동물성 알부민과 보리씨, 완두콩, 그리고 피마자 씨에서 분리된 식물성 알부민이 있으며, 가수분해 단계 및 알부민의 추출단계를 포함하고 본 발명에 사용된 알부민의 분자량은 2,000 ~ 1,500,000 Da 범위이다. 이하, 본 명세서에서 사용하는 "알부민"은 상기 알부민, 상기 알부민의 분절(Fragments), 상기 알부민의 염 또는 상기 알부민의 유도체를 포함하는 의미이다.
본 발명에서는 단백질로 리포솜의 표면을 결합하고 상기 단백질을 변성시켜 혈류 내 안정성 및 순환시간이 향상된 안정화-체내순환 지속형 리포솜을 제공한다. 본 발명에서 사용하는 "표면 결합"은 음이온성 리포솜 표면에 양이온성을 나타내는 생체적합성 단백질이 리포솜 표면에 이온결합을 통해 결합된 것을 의미한다. 또한, 본 발명에서 사용하는 "안정화-체내순환 지속형" 리포솜은 생체적합성 단백질이 리포솜 표면에 결합되고 열에 의해 결합된 단백질을 변성시킨 리포솜으로 혈류에서 혈장 단백질의 흡착을 억제하여 체내순환시간을 향상시키는 리포솜을 의미한다.
상기 생체적합성 단백질은 전체 리포솜을 형성하는 지질 1000 중량부에 대하여 0.001 ~ 100 중량부를 포함하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.001 ~ 50 중량부 포함한다. 생체적합성 단백질이 상기 범위 미만으로 존재하는 경우에는 리포솜 표면에 결합되어 있는 생체적합성 단백질의 양이 너무 적기 때문에 혈류 내에서 혈장 단백질의 흡착에 의해 리포솜이 불안정해 질 수 있고, 생체적합성 단백질이 상기 범위 보다 많이 존재하는 경우 리포솜 입자크기가 증가되어 혈류 내에서의 안정성 및 체내순환시간 증가 효과가 나타나지 않는다. 단백질이 100 중량부를 초과 포함하더라도 리포솜의 표면적이 제한되어 있으므로 더 이상 리포솜의 양이온성 증대 효과는 발생하지 않는다.
이렇게 결합된 리포솜의 평균 입경은 30 ~ 400 nm, 바람직하게는 90 ~ 120 nm인 것이다. 리포솜의 평균 입경이 상기 범위를 초과하는 경우 체내 순환시 장기, 즉 간이나 비장에서 세망내피계에 의하여 흡수(uptake)가 발생하며, 리포솜이 상기 범위 미만인 경우에는 목표 부위에 전달하는 약물의 양이 불충분하다.
상기 리포솜을 형성하는 지질로서, 본 발명의 리포솜을 구성하는 지질도 특별히 한정되지 않고 공지된 지질일 수 있다. 상기 지질로는 예를 들어 인지질, 당지질, 스테롤류, 음이온성 지질 등, 폴리글리세롤알킬에테르, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 알킬글리코시드, 알킬메틸글루카미드, 알킬수크로스에스테르, 디알킬폴리옥시에틸렌에테르, 디알킬폴리글리세롤에테르 등, 폴리옥시에틸렌-폴리락트산 등의 양친매성 블록공중합체 등, 장쇄 알킬아민류 또는 장쇄 지방산 하이드라자이드류 등을 들 수 있다.
상기 인지질로는, 예를 들어 포스파티딜콜린(대두 포스파티딜콜린, 난황 포스파티딜콜린, 보바인 포스파티딜콜린, 디라우로일포스파티딜콜린, 디미리스토일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린 또는 디스테아로일포스파티딜콜린 등), 포스파티딜에탄올아민(디라우로일포스파티딜에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜에탄올아민 또는 디스테아로일포스파티딜에탄올아민, 디오레오일포스파티딜에탄올아민 등), 포스파티딜세린(디라우로일포스파티딜세린, 디미리스토일포스파티딜세린, 디팔미토일포스파티딜세린 또는 디스테아로일포스파티딜세린 등), 포스파티딘산, 포스파티딜글리세롤(디라우로일포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티딜글리세롤, 디팔미토일포스파티딜글리세롤 또는 디스테아로일포스파티딜글리세롤 등), 포스파티딜이노시톨(디라우로일포스파티딜이노시톨, 디미리스토일포스파티딜이노시톨, 디팔미토일포스파티딜이노시톨 또는 디스테아로일포스파티딜이노시톨 등), 리조포스파티딜콜린, 스핑고미엘린, 난황 레시틴, 대두 레시틴 또는 수소첨가 인지질 등의 천연 또는 합성 인지질 중에서 1종 이상이 바람직하다.
상기 당지질로는, 예를 들어 글리세로 당지질, 스핑고 당지질 등을 들 수 있다. 상기 글리세로 당지질로는, 디갈락토실디글리세리드류(디갈락토실디라우로일글리세리드, 디갈락토실디미리스토일글리세리드, 디갈락토실디팔미토일글리세리드 또는 디갈락토실디스테아로일글리세리드 등) 또는 갈락토실디글리세리드류(갈락토실디라우로일글리세리드, 갈락토실디미리스토일글리세리드, 갈락토실디팔미토일글리세리드 또는 갈락토실디스테아로일글리세리드 등) 등을 들 수 있다. 상기 스핑고 당지질로는, 예를 들어 갈락토실셀레브로시드, 락토실셀레브로시드 또는 간글로시드 등을 들 수 있다.
또한, 상기 인지질 또는 당지질은 전체 리포솜 지질 조성 중에서 30 ~ 70 몰%를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 스테롤류로는, 예를 들어 콜레스테롤, 콜레스테롤헥사숙시네이트, 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카르바모일]콜레스테롤, 에르고스테롤 또는 라노스테롤 등을 들 수 있고, 전체 리포솜 지질 조성 중에서 20 ~ 50 몰% 포함하는 것이 바람직하다. 스테롤류의 비율이 상기 범위를 벗어나는 경우에는 리포솜의 안정성이 저하되며 약물의 봉입에 문제가 있다.
상기 리포솜 형성 지질은 단독 또는 2종 이상 조합하여 사용할 수 있다.
또한, pH 1 ~ 4.7에서 양이온성인 단백질의 특성에 의해 결합되는 리포솜의 전하가 반드시 한정될 필요는 없으나, 미국 및 한국식품의약품안전청에 허가된 지질로 구성된 음이온성 리포솜이 실용적이며 바람직하다.
상기 리포솜 형성 지질 중에 생리학적 pH에서 존재할 때 0 mV 보다 작은 표면전하량을 갖는 음이온성 지질로서는, 1,2-디아실-sn-글리세로-3-포스페이트 (Monosodium salt) [예, 1,2-Dihexanoyl-sn-Glycero-3-Phosphate, 1,2-Dioctanoyl-sn-Glycero-3-phosphate, 1,2-Didecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphate, 1,2-Dilauroyl-sn-Glycero-3-Phosphate, 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphate, 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphate, 1,2-Diphytanoyl-sn-Glycero-3-Phosphate, 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphate, 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphate, 1,2-Dilinoleoyl-sn-Glycero-3-Phosphate, 1,2-Diarachidonoyl-sn-Glycero-3-Phosphate, 1,2-Didocosahexaenoyl-sn-Glycero-3-Phosphate 등], 1-아실-2-아실-sn-글리세로-3-포스페이트 (Monosodium salt) [예, 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphate, 1-Palmitoyl-2-Linoleoyl-sn-Glycero-3-Phosphate, 1-Palmitoyl-2-Arachidonoyl-sn-Glycero-3-Phosphate, 1-Palmitoyl-2-Docosahexaenoyl-sn-Glycero-3-Phosphate, 1-Stearoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphate, 1-Stearoyl-2-Linoleoyl-sn-Glycero-3-Phosphate, 1-Stearoyl-2-Arachidonoyl-sn-Glycero-3-Phosphate, 1-Stearoyl-2-Docosahexaenoyl-sn-Glycero-3-Phosphate 등], 1,2-디아실-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 [예, 1,2-Dihexanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 1,2-Dioctanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 1,2-Didecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 1,2-Dilauroyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 1,2-Diphytanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 1,2-Dipalmitoleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 1,2-Dielaidoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 1,2-Dilinoeoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 1,2-Dilinolenoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 1,2-Diarachidonoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 1,2-Docosa-hexaenoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine 등], 1-아실-2-아실-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 [예, 1-Palmitoyl-2-Oleoyl- sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 1-Palmitoyl-2-Linoleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 1-Palmitoyl-2-Arachidonoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 1-Palmitoyl-2-Docosahexaenoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 1-Stearoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 1-Stearoyl-2-Linoleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 1-Stearoyl-2-Arachidonoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 1-Stearoyl-2-Docosahexaenoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine 등], 1,2-디아실-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)] (Sodium salt) [예, 1,2-Dihexanoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-Glycerol) ], 1,2-Dioctanoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-Glycerol) ], 1,2-Didecanoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-Glycerol) ], 1,2-Dilauroyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-Glycerol) ], 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-Glycerol) ], 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-Glycerol) ], 1,2-Diphytanoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-Glycerol) ], 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-Glycerol) ], 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-Glycerol) ], 1,2-Dielaidoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-Glycerol) ], 1,2-Dilinoleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-Glycerol) ], 1,2-Dilinolenoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-Glycerol) ], 1,2-Diarachidonoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-Glycerol) ], 1,2-Docosahexaenoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-Glycerol) ] 등], 1-아실-2-아실-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세로)] (Sodium salt) [예, 1-Palmitoyl-2- Oleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-Glycero)], 1-Palmitoyl-2-Linoleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-Glycero)], 1-Palmitoyl-2-Arachidonoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-Glycero)], 1-Palmitoyl-2-Docosahexaenoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-Glycero)], 1-Stearoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-Glycero)], 1-Stearoyl-2-Linoleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-Glycero)], 1-Stearoyl-2-Arachidonoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-Glycero)], 1-Stearoyl-2-Docosahexaenoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-Glycero)] 등] 1,2-디아실-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린] (Sodium salt) [예, 1,2-Dihexanoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-L-Serine], 1,2-Dioctanoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-L-Serine], 1,2-Didecanoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-L-Serine], 1,2-Dilauroyl-sn-Glycero-3-[Phospho-L-Serine], 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-L-Serine], 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-L-Serine], 1,2-Diphytanoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-L-Serine], 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-L-Serine], 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-L-Serine], 1,2-Dilinoleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-L-Serine], 1,2-Dierucoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-L-Serine], 1,2-Didocosahexaenoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-L-Serine] 등], 1-아실-2-아실-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린] (Sodium salt) [예, 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-L-Serine], 1-Palmitoyl-2-Linoleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-L-Serine], 1-Palmitoyl-2-Arachidonoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-L-Serine], 1-Palmitoyl-2-Docosahexaenoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-L-Serine], 1-Stearoyl-2-Oleoyl-sn- Glycero-3-[Phospho-L-Serine], 1-Stearoyl-2-Linoleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-L-Serine], 1-Stearoyl-2-Arachidonoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-L-Serine], 1-Stearoyl-2-Docosahexaenoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-L-Serine] 등] 1-아실-2-히드록시-sn-글리세로-3-포스페이트 (Sodium salt) [예, 1-Hexanoyl-2-Hydroxy-sn-Glycero-3-Phosphate, 1-Myristoyl-2-Hydroxy-sn-Glycero-3-Phosphate, 1-Palmitoyl-2-Hydroxy-sn-Glycero-3-Phosphate, 1-Stearoyl-2-Hydroxy-sn-Glycero-3-Phosphate, 1-Oleoyl-2-Hydroxy-sn-Glycero-3-Phosphate 등], 1-아실-2-히드록시-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 [1-Myristoyl-2-Hydroxy-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 1-Palmitoyl-2-Hydroxy-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 1-Stearoyl-2-Hydroxy-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 1-Oleoyl-2-Hydroxy-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine 등], 1-아실-2-히드록시-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)] (Sodium salt) [예, 1-Mytistoyl-2-Hydroxy-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-Glycerol)], 1-Palmitoyl-2-Hydroxy-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-Glycerol)], 1-Stearoyl-2-Hydroxy-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-Glycerol)], 1-Oleoyl-2-Hydroxy-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-Glycerol)] 등], 1-디아실-2-히드록시-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린] (Sodium salt) [예, 1-Oleoyl-2-Hydroxy-sn-Glycero-3-[Phospho-L-serine] 등] 중에서 선택된 1종 이상을 사용한다. 음이온성 지질을 리포솜 형성 총 지질 중에서 0.01 ~ 20 몰%를 포함하는 것이 바람직하다. 음이온성 지질이 상기 범위를 벗어나는 경우에는 양이온성을 나타내는 약물의 봉입을 저해하는 것과 같은 문제가 발생된다.
또한, 본 발명의 더욱 바람직한 조성 중 하나로 리포솜의 형성과 안정성에 효과적이기 위하여 인지질 또는 당지질 30 ~ 70 몰%, 스테롤류 20 ~ 50 몰%와 음이온성 지질 0.01 ~ 20 몰%로 구성된 리포솜 조성물을 사용하는 것이다.
본 발명의 단백질을 결합하기 전의 리포솜의 제조방법은 공지된 다양한 기술에 의해서 제조될 수 있다. 본 발명의 단백질을 결합하기 전의 리포솜을 제조하는 바람직한 방법 중 하나는 아래에 설명하는 역상증발법이나 이에 한정하는 것은 아니다.
먼저, 리포솜을 형성할 수 있는 지질 성분을 혼합한다. 상기 리포솜 형성지질에는 앞서 설명한 바와 같이 양이온성 지질을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 혼합된 지질 성분에, 클로로포름과 같이 지질의 용해가 가능한 용매에 용해시킨 후, 증발응축기를 이용하여 클로로포름을 증류시켜 제거하고 얇은 지질막을 형성한다.
이후에 농도 차이에 의한 약물 봉입 역할을 수행할 수 있는 암모늄 설페이트(Ammonium Sulfate) 등의 용액을 첨가하여 지질막을 수화시켜 리포솜을 형성한다. 상기 리포솜을 감압 압출을 통해 평균 입경을 30 ~ 400 nm인 리포솜을 제조한다.
상기 약물이 봉입된 리포솜, 바람직하게는 본 발명의 단백질을 등전점 이하인 pH 1 ~ 4.7의 완충용액에 용해시킨 뒤 약물이 봉입된 양이온성 리포솜에 혼합하여 20 ~ 40 ℃에서 1 ~ 24 시간 교반시킨다. 결합하는 단백질은 리포솜을 형성하는 전체 지질 1000 중량부에 대하여 0.001 ~ 100 중량부가 바람직하다. 상기 리포솜과 결합되지 않은 단백질은 분획 분자량 10,000 ~ 500,000로 여과를 통해 제거한다.
다음으로 리포솜 표면에 결합된 단백질에 변성을 가한다. 단백질을 변성시키는 방법은 화학적, 물리적, 열 변성법이 가능하나, 특별히 이에 한정하는 것은 아니다.
물리적인 변성법으로는 단백질을 고압, 자외선, X-선으로 변성시키는 것이며, 화학적인 변성법으로는 단백질을 유기용매, 중금속염, 요소, 염산-구이니딘(Guanidine-HCL) 등과 같은 단백질 변성 유도제를 첨가하여 변성시키는 것이다. 단백질을 변성시키는 이유는 리포솜과 단백질의 결합은 산성조건에서 이루어지고, pH 3의 리포솜 용액으로 생체 내 주사할 시에는 주사 부위에 통증을 유발할 수 있기 때문에 생체 pH 조건의 리포솜 용액으로 제조하여야 한다. 또한, 생체 pH 조건으로 변경하는 과정에서 변성되지 않은 단백질은 쯔비터 이온의 특성으로 프로토네이션이 일어나기 때문에 리포솜과의 이온결합이 끊어질 수 있기 때문에 리포솜 표면의 단백질을 변성시키는 것이 유리하다. 이와 같이 리포솜 표면에 결합되어 있는 단백질을 변성시키는 과정은 단백질과 리포솜과의 소수성 잔기의 결합력을 증대시켜 단백질이 결합된 리포솜의 안정성을 최대로 하고 생체 pH 조건의 리포솜 용액으로 혈류 내에서의 안정성을 증가시키기 위함이다. 바람직하게는 60 ~ 100 ℃로 1분 ~ 24시간 가열하여 리포솜 표면에 결합된 단백질을 변성시킨다.
다음으로 산성 조건인 리포솜을 분획분자량 12,000의 투석막을 이용하여 생체 내 pH 조건(pH 7.0 ~ 7.5)으로 변화시켜 준다.
다음으로 리포솜에 약물을 봉입한다. 본 명세서에서 "봉입된(entrapping)"은 화합물이 리포솜 지질 이중막 사이 유성 공간 또는 이중막 내의 수성 공간에 봉착되는 것을 의미한다. 본 발명의 안정화-체내순환 지속형 리포솜은 소수성 약물과 수용성 약물 모두 봉입이 가능하며, 일반적으로 사용되는 안트라사이클라인계열 약물, 알칼로이드계열 약물, 디테르페노이드계열 약물이나 약리학적으로 허용되는 그들의 염 및 산 등이 봉입에 유리하고 상기 수용성 약물로는 아래와 같으나 특별히 이에 한정하는 것은 아니다. 상기 수용성 약물로는 사이클로포스파미드, 아이포스파마이드, 멜팔란, 카무스틴, 로무스틴, 스트렙토조신, 카르보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 다카르바진, 프로카르바진, 우라실무스틴, 메토트렉사트, 페메트렉세드, 랄시트렉세드, 플루다라빈, 메르캅토퓨린, 펜토스타틴, 티오구아닌, 카페시타빈, 사이타라빈, 플루오로우라실, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 아이다우루비신, 미토잔트론, 발루비신, 젬시타빈, 악티노마이신, 블레오마이신, 미토마이신, 토포테칸, 아이리노테칸, 에토포사이드, D-아미노레불리닉 엑시드, 메틸아미노레불리네이트, 엘로티닙, 제리티닙, 이메티닙, 독소루비신, 에피루비신, 하이루비신, 다우노루비신, 에소루비신, 이다루비신, 알렌드로네이트, 파미드로네이트, 졸레드로네이트, 펩타이드 약물(콘트리코트로핀, 테트라코삭티드, 티로트로핀, 소마트렘, 메카세르민, 세르모레린, 데스모프레신, 라이프레신, 테르리프레신, 오르니프레신, 아르기프레신, 데목시토신, 카르베토신, 고나도레린, 나파레린, 히스트레린, 소마토스타틴, 옥트리오타이드, 초산란레오타이드, 가니레릭스, 세트로레릭스, 페그비소만트 등) 등이 있다. 특히, 독소루 비신과 같은 안트라사이클라인계열의 약물들은 리포솜 내에서 암모늄설페이트와 만나 침전을 형성하여 약물이 봉입되는 특징을 가지고 있다.
상기 약물의 리포솜 내 봉입 효율은 80 ∼ 100% 범위를 갖는다.
상기 리포솜은 단독으로 또는 약학적 분야에서 통상적인 담체와 함께 배합하여 주사제(피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사, 흉부 주사 등)로 사용되는 것이 바람직하다. 본 발명의 체내순환 지속형 리포솜을 이용해 제조한 주사제는 순수 약물의 30 % 미만을 사용하더라도, 순수 약물과 동등하거나 뛰어난 약리 활성을 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 단백질이 결합된 리포솜을 함유하는 정제, 캡슐제(소프트캡슐, 마이크로캡슐, 장용성 캡슐 포함), 산제, 과립제, 시럽제 등의 경구제; 및 주사제(예, 피하 주사제, 정맥 내 주사제, 근육 내 주사제, 복강 내 주사제 등), 외용제(예, 직장좌제, 질좌제 등) 등의 비경구제를 들 수 있다. 본 발명에 따른 리포솜 함유 약제는 주사제의 제형을 갖는 것이 가장 바람직하다.
본 발명에 따른 약제의 투여량은 리포솜이 갖는 생리활성물질의 종류 의약의제형, 치료해야 할 병태의 종류, 증상 및 질환의 중독도, 환자의 연령, 성별 또는 체중, 투여방법 등에 따라 다르기 때문에 일률적으로는 말할 수 없지만, 의사가 상기 상황을 종합적으로 판단하여 결정할 수 있다.
본 발명에 따른 약제는, 본 발명의 리포솜에 봉입되어 있는 생리활성물질의 종류에 따라 여러 가지 질환의 예방 및 치료를 할 수 있다. 예를 들어 생리활성물질이 항종양제인 경우, 본 발명에 따른 약제는, 예를 들어 대장암, 뇌종양, 두 경부암, 유방암, 폐암, 식도암, 위암, 간암, 담낭암, 담관암, 췌장암, 췌도세포암, 융모암, 결장암, 신세포암, 부신피질암, 방광암, 정소암, 전립선암, 고환종양, 난소암, 자궁암, 융모암, 갑상선암, 악성 카르시노이드 종암, 피부암, 악성 흑색종, 골육정 연부 조직육종, 신경아세포종, 윌름 종양, 망막아세포종, 멜라노마, 편평상피암 등 종양의 예방 또는 치료에 유용하다.
본 발명에 따른 리포솜 표면에 단백질을 결합하고 결합된 단백질을 변성시킨 안정화-체내순환 지속형 리포솜은 종래의 리포솜에 비해 혈류 내 체내순환시간이 향상되고 혈장 내에서 안정성이 강화됨은 물론, 혈장 단백질과의 흡착을 억제시킨다. 이러한 혈장 단백질의 흡착을 억제하고 혈류 내 순환시간을 향상시키는 안정화-체내순환 지속형 리포솜은 체내에 투여할 경우 약물을 함유한 리포솜이 혈류 내에 오랫동안 순환할 수 있는 체류율 연장의 효과가 나타나고, 약물을 체내 목표 부위에 전달하는 효율이 향상되어 기존의 제형보다 약효를 지속적으로 나타낼 수 있는 효과가 있다.
이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 안정화-체내순환 지속형 리포솜의 제조
리포솜을 형성하는 지질 성분으로 전체 지질에 대하여 L-a-포스파티딜콜 린(HSPC) 59.3 몰%, 콜레스테롤(CHOL) 39.7 몰%, 그리고 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)] 1 몰%로 혼합하였고 총 지질 농도는 12.8 ㎎/㎖이 되도록 하였다. 이후에 클로로포름과 메탄올 혼합 용액(1 : 1, v/v)을 사용하여 L-a-포스파티딜콜린, 콜레스테롤, 그리고 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)]을 용해시킨 후, 회전증발응축기를 이용하여 용매를 제거하여 얇은 지질 막을 형성시켰다. 다음으로 500 mM 암모늄설페이트 용액을 상기 형성된 지질 막에 60 ℃에서 수화시켜 음이온성 리포솜을 제조하였고 수화과정이 끝난 후 가압 압출기를 사용하여 리포솜의 크기를 80 ~ 110 nm로 형성하였다. 봉입되지 않은 암모늄 설페이트는 막 투석을 이용하여 제거하였다.
음이온성 리포솜(총 지질농도 12.8 ㎎/㎖)의 표면에 단백질을 결합하기 위하여 제조된 리포솜 용액을 pH 3의 구연산-인산완충용액(Citric acid-phosphate buffer solution)을 이용하여 pH 3으로 변경한 후, pH 3의 구연산-인산완충용액(Citric acid-phosphate buffer solution)에 용해시킨 각각 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖, 800 ㎍/㎖, 그리고 1000 ㎍/㎖의 보바인 시럼 알부민(BSA) 수용액을 음이온성 리포솜에 20 ㎕/min의 속도로 적가하면서 37 ℃에서 1시간 동안 교반하며 결합하였고, 제조된 음이온성 리포솜과 BSA 용액은 최종적으로 1 : 1 (v/v)이 되도록 하였다. 이후 리포솜에 결합되지 않은 BSA는 분획분자량 300,000의 폴리에테르설폰 분리막을 이용하여 한외여과법으로 제거하였고, BSA와 리포솜과의 결합력을 강화함은 물론 BSA가 결합된 리포솜의 혈류 내 안정성을 강화하기 위하여 100 ℃에서 30분간 열 변성법을 실시하였다[Leucuta, S.E., Risca, R., Daicoviciu, D., Int. J. Pharm., 43, (213)1988]. 상기 과정이 끝난 리포솜은 pH 7.4의 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffer saline (HBS)로 24시간 동안 막 투석을 실시하여 pH 7.4로 변경하였다. 제조한 리포솜에 독소루비신을 1 : 1 (v/v)로 혼합한 뒤 60 ℃에서 2시간 동안 반응시켜 독소루비신을 리포솜 내부에 봉입시켰다. 상기 혼합용액에서 리포솜 내부에 봉입되지 않은 독소루비신은 4 ℃에서 48 시간동안 막 투석을 실시하여 제거하였고, 수크로스로 삼투압을 조절하여 독소루비신을 함유하고 변성된 단백질(BSA)이 결합된 리포솜을 제조하였다.
실시예 2 : 수용성 약물이 봉입된 리포솜의 제조
(1) 알렌드로네이트가 봉입된 리포솜의 제조
리포솜을 형성하는 지질 성분으로 전체 지질에 대하여 L-a-포스파티딜콜린(HSPC) 59.3 몰%, 콜레스테롤(CHOL) 39.7 몰%, 그리고 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)] 1 몰%로 혼합하였고 총 지질 농도는 12.8 ㎎/㎖이 되도록 하였다. 이후에 클로로포름과 메탄올 혼합용액 (1 : 1, v/v)을 사용하여 L-a-포스파티딜콜린, 콜레스테롤, 그리고 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)]을 용해시킨 후, 회전증발응축기를 이용하여 용매를 증류에 의해 제거하여 얇은 지질 막을 형성시켰다.
다음으로 구연산-인산 완충용액(pH 3)을 상기 형성된 지질 막에 60 ℃에서 수화시켜 리포솜을 제조하였고, 수화과정이 끝난 후 가압 압출기를 사용하여 리포 솜의 크기를 100 nm 내외로 형성하였다. 제조된 리포솜의 표면에 BSA를 결합하기 위하여 구연산-인산 완충용액(pH 3)에 용해시킨 400 ㎍/㎖의 BSA 용액을 제조된 리포솜 용액(pH 3)에 20 ㎕/min의 속도로 적가하면서 37 ℃에서 1시간 동안 교반하며 결합하였고, 제조된 리포솜과 BSA 수용액은 최종적으로 1 : 1 (v/v)이 되도록 하였다. 이후 리포솜에 결합되지 않은 BSA는 분획분자량 300,000의 폴리에테르설폰 분리막을 이용하여 한외여과법으로 제거하였고, BSA와 리포솜과의 결합력을 강화함은 물론 BSA가 결합된 리포솜의 혈류 내 안정성을 강화하기 위하여 100 ℃에서 30분간 열 변성법을 실시하였다[Leucuta, S.E., Risca, R., Daicoviciu, D., Int. J. Pharm., 43, (213)1988]. 상기 과정이 끝난 리포솜은 pH 7.4의 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffer saline (HBS)로 24시간 동안 막 투석을 실시하여 pH 7.4로 변경하였다. 이후 제조된 리포솜과 pH 7.4의 HBS에 용해시킨 알렌드로네이트를 1 : 1 (v/v)로 혼합하여 60 ℃에서 2시간 동안 반응시켜 알렌드로네이트를 리포솜 내부에 봉입시켰다. 상기 혼합용액에서 리포솜 내부에 봉입되지 않은 알렌드로네이트는 4 ℃에서 48 시간동안 막 투석을 실시하여 제거하였고, 수크로스로 삼투압을 조절하여 알렌드로네이트를 함유하는 변성된 단백질이 결합된 리포솜을 제조하였다.
(2) 옥트리오타이드가 봉입된 리포솜의 제조
상기 실시예 2-(1)과 동일한 리포솜 형성 지질 성분으로 제조하였으며, 옥트리오타이드의 봉입은 Freeze-thaw 방법을 이용하였다. 옥트리오타이드를 용해 시킨 수용액과 리포솜 용액을 혼합하여 Freeze 과정은 -10 ℃에서 실시하였고 thaw 과정은 60 ℃에서 실시하였으며 각각의 freeze 과정과 thaw 과정에 대하여 5분의 시간 간격으로 5회 실시하여 옥트리오타이드를 리포솜에 봉입하였다.
옥트리오타이드가 봉입된 봉입된 리포솜의 표면에 단백질을 결합하기 위하여 제조된 리포솜을 구연산-인산 완충용액(pH 3)을 이용하여 pH 3으로 조절하고, 구연산-인산 완충용액(pH 3)에 용해시킨 400 ㎍/㎖의 BSA 용액을 리포솜에 20 ㎕/min의 속도로 적가하면서 37 ℃에서 1시간 동안 교반하며 결합하였고, 제조된 리포솜과 BSA 수용액은 최종적으로 1 : 1 (v/v)이 되도록 하였다. 이후 리포솜에 결합되지 않은 BSA는 분획분자량 300,000의 폴리에테르설폰 분리막을 이용하여 한외여과법으로 제거하였고, BSA와 리포솜과의 결합력을 강화함은 물론 BSA가 결합된 리포솜의 혈류 내 안정성을 강화하기 위하여 100 ℃에서 30분간 열 변성법을 실시하였다[Leucuta, S.E., Risca, R., Daicoviciu, D., Int . J. Pharm ., 43, (213)1988].
상기 과정이 끝난 리포솜은 pH 7.4의 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffer saline (HBS)로 24시간 동안 막 투석을 실시하여 pH 7.4로 변경하였고, 수크로스로 삼투압을 조절하여 옥트리오타이드를 함유하는 변성된 단백질이 결합된 리포솜을 제조하였다.
비교예 1: 대조 리포솜의 제조
리포솜을 형성하는 지질 성분으로 전체 지질에 대하여 L-a-포스파티딜콜린(HSPC) 60.3 몰%, 콜레스테롤(CHOL) 39.7 몰%로 혼합하였고 총 지질농도는 12.8 ㎎/㎖이 되도록 하였다. 이후에 클로로포름과 메탄올 혼합용액 (1 : 1, v/v)을 사용하여 L-a-포스파티딜콜린, 콜레스테롤을 용해시킨 후, 회전증발응축기를 이용하여 용매를 증류에 의해 제거하여 얇은 지질 막을 형성시켰다. 다음으로 250 mM 암모늄 설페이트 용액을 상기 형성된 지질 막에 60 ℃에서 수화시켜 리포솜을 제조하였고 수화과정이 끝난 후 가압 압출기를 사용하여 리포솜의 크기를 100 nm 내외로 형성하였다. 봉입되지 않은 암모늄 설페이트는 막 투석법을 이용하여 제거하였고, 독소루비신은 이온 구배 로딩법을 사용하여 리포솜 내부에 봉입하였고, 봉입되지 않은 독소루비신은 막 투석법을 이용하여 제거하였다.
비교예 2 : 음이온성 리포솜의 제조
상기 비교예 1과 동일하게 실시하되, 리포솜 지질 성분으로 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)] 0.2 mM을 사용하여 전체 지질에 대하여 L-a-포스파티딜콜린(HSPC) 59.3 몰%, 콜레스테롤(CHOL) 39.7 몰%, 그리고 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)] 1 몰%로 혼합하였고, 총 지질농도는 12.8 ㎎/㎖이 되도록 하였다.
비교예 3 : 폴리에틸렌글리콜이 도입된 대조 리포솜의 제조
상기 비교예 1과 동일하게 실시하되, 리포솜 지질 성분으로 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시-(폴리에틸렌글리콜)-2000](DSPE-mPEG2000)을 사용하여 전체 지질에 대하여 L-a-포스파티딜콜린(HSPC) 57.3 몰%, 콜 레스테롤(CHOL) 37.7 몰%, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시-(폴리에틸렌글리콜)-2000](DSPE-mPEG2000) 5 몰%로 혼합하였고, 총 지질농도는 16 ㎎/㎖이 되도록 하였다.
시험예 1
상기 실시예 1의 리포솜을 제조함에 있어 리포솜에 결합되는 단백질의 양이 보다 바람직하게 리포솜 전체 지질 1000 중량부 대비 0.001 ~ 100 중량부가 되도록 각각 pH 3의 구연산-인산 완충용액에 용해시킨 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖, 600 ㎍/㎖, 800 ㎍/㎖, 그리고 1000 ㎍/㎖의 BSA 용액을 이용하여 제조한 안정화-체내순환 지속형 리포솜의 입자크기와 표면전하를 각각 광산란장치(ELS-Z, Otsuka, Japan)와 제타전위측정기(ELS-Z, Otsuka, Japan)로 측정하여 다음 표 1에 나타내었다[L. Zhu, R. A. Seburg, E. W. Tsai, J. Pharm. Biomed. Anal., 8(2005)]. 또한, 96 웰 플레이트를 사용하여 상기 시험예 1에서 제조한 안정화-체내순환 지속형 리포솜 용액 0.1 ㎖에 단백질 측정 시약(Protein assay, Bio-Rad Lab., USA) 0.1 ㎖을 가한 후, 효소면역활성측정기로 595 ㎚에서 흡광도를 측정하여 리포솜에 결합된 단백질의 양을 정량하여 다음 표 1에 나타내었다[M.M Bradford J. Anal. Biochem. 72(1946)].
구 분 리포솜에 혼합한 BSA의 농도(㎍/㎖) pH 입자크기 (㎚) 표면전하 (mV) 리포솜에 결합된 단백질의 양 (㎍ BSA/㎖ liposome) 약물 봉입율(%)
실시예 시료 1 100 7.43 123.2 ± 2.5 -17.5 ± 0.4 26.4 ± 8.4 86.3 ± 3.2
시료 2 200 7.50 117.9 ± 1.1 -23.6 ± 0.3 87.1 ± 5.2 84.6 ± 2.3
시료 3 400 7.47 108.8 ± 0.3 -22.4 ± 4.5 154.5 ±13.3 83.0 ± 2.6
시료 4 600 7.32 126.7 ± 1.6 -19.2 ± 0.4 157.2 ± 35.1 82.8 ± 0.3
시료 5 800 7.41 120.6 ± 2.0 -21.3 ± 0.0 389.6 ± 19.4 81.3 ± 0.7
시료 6 1000 7.45 117.0 ± 1.4 -22.8 ± 0.5 423.9 ± 25.4 80.1 ± 3.1
시험예 2
상기 실시예 2-(1)과 (2)에서 제조된 리포솜의 입자크기와 표면전하를 상기 시험예 1과 동일한 방법으로 측정하여 다음 표 2에 나타내었다. 또한, 리포솜에 봉입된 약물의 봉입율은 자외선 분광장치를 이용하여 측정하여 다음 표 2에 나타내었다.
구 분 리포솜에 혼합한 BSA의 농도(㎍/㎖) 입자크기 (㎚) 표면전하 (mV) 리포솜에 결합된 단백질의 양 (㎍ BSA/㎖ liposome) 약물봉입율 (%)
실시예 2-(1) 400 133.0 ± 0.4 -23.8 ± 2.5 213.7 ± 12.6 80.0 ± 0.3
실시예 2-(2) 400 122.5 ± 4.3 -22.4 ± 4.5 231.2 ± 10.7 81.0 ± 2.6
시험예 3
상기 비교예 1 ~ 3에서 제조된 리포솜의 입자크기와 표면전하를 상기 시험예 1과 동일한 방법으로 측정하여 다음 표 3에 나타내었다. 상기 비교예에 따라 제조된 모든 리포솜들은 100 ~ 120 nm 범위 내의 입자크기를 나타내었다. 특히, 비교예 3에 의해 제조된 리포솜은 리포솜 형성 지질 중 폴리에틸렌글리콜-지질복합체에 결합된 PEG가 형태에 따라 약 35 ~ 50 Å정도를 나타내어 비교예 1과 2 보다 약 5 ㎚ 정도 큰 110.0 ± 2.1 nm의 입자크기를 나타내었다[Che, B., Winterhalter, M., Frederick, P.M., Vallner, J.J., Lasic, D.D. Adv . Drug Delivery. Rev. (24)1997]. 또한, 상기 비교예 1에 입각하여 제조된 리포솜은 중성의 표면전하를 나타내었고, 비교예 2는 리포솜 제조시에 도입된 이온성 지질인 DSPG 지질의 영향으로 음이온성을 나타냈다. 비교예 3에 의해 제조된 리포솜은 제조시 도입된 폴리에틸렌글리콜-지질 유도체에 포함되어 있는 DSPE 지질의 영향으로 인하여 -20 ㎷ 정도의 음이온성의 표면전하를 나타내었다[Che, B., Winterhalter, M., Frederick, P.M., Vallner, J.J., Lasic, D.D. Adv. Drug Delivery. Rev. (24)1997].
구 분 성 분 입자크기 (㎚) 표면전하 (㎷)
비교예 1 HSPC:CHOL 109.5 ± 1.6 0.3 ± 0.2
비교예 2 HSPC:CHOL:DSPG 107.1 ± 5.9 -33.4 ± 3.8
비교예 3 HSPC:CHOL:DSPE-mPEG2000 110.0 ± 2.1 -23.0 ± 2.6
시험예 4 : 약동력학 실험
본 발명의 실시예의 시료 3에 의해 제조된 안정화-체내순환 지속형 리포솜의 체내순환시간을 관찰하기 위하여 SD 랫트 실험용 쥐에 순수 독소루비신의 주사제인 (주)보령사의 Adriamycin®, 인지질을 사용한 리포솜 제형인 Alza사의 Caelyx® 본 발명의 실시예에 따라 제조된 154.5 ± 13.3 ㎍의 BSA가 결합된 시료 3의 안정화-체내순환 지속형 리포솜을 꼬리 정맥을 통하여 투여하고 시간별로 혈액을 채취함으로써 리포솜 내부에 봉입된 약물의 농도를 측정하였다. 측정되어진 약물의 농도로서 약동력학적 결과를 산출하였고, 약동력학적으로 산출된 결과를 통하여 약물의 체내순환시간을 확인하였다. 리포솜 내부의 약물의 농도는 시간별로 채취한 혈액을 헤파린 용액으로 희석하여 원심분리한 후 상층액을 메탄올을 사용하여 희석해서 측정할 용액을 제조하고, 액체크로마토그래피를 이용하여 40 ℃, 234 ㎚의 파장에서 약물의 흡광도를 측정하였다[T. Hu et al J. pharmaceutical and biomedical analysis. 43(2007)].
상기 실험에서 산출되어진 약동력학적 결과를 다음 표 4와 도 1에 나타내었다.
구분 AUC (hr*㎍/㎖) Cmax (㎍/㎖) t1/2 (hr)
Adriamycin® 10.4 8.5 3.6
실시예의 시료 3을 사용한 주사제 1617.4 100.0 17.6
상기 표 4의 AUC(Area Under the Curve)는 체류농도에 대한 면적, Cmax는 혈류 내 약물의 가장 큰 농도, t1 /2는 혈류에서 약물의 반감기이다.
상기 표 4와 도 1에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예의 시료 3의 단백질로 결합된 리포솜을 사용한 주사제는 반감기가 17.6 시간, 체류농도에 대한 면적은 1617.4 hr*㎍/㎖으로 나타났다. 그러나, Adriamycin®의 반감기는 3.6 시간으로 나타났다. 반감기가 증가한다는 사실은 혈류에서 약물의 유효농도가 계속 유지될 수 있는 50% 이상의 약물이 체류하는 시간을 시사하며 Adriamycin®과 비교 시 월등히 긴 체내순환시간을 보여주고 있다. 이상의 결과로서 리포솜의 표면에 혈장 단백질인 알부민을 결합함으로써 리포솜의 체내순환시간을 순수 독소루비신 약물 보다 체내순환시간을 증가시킬 수 있고, 기존의 독소루비신을 봉입한 리포솜 제형과 동등한 체내순환시간을 가진다는 사실을 증명한다.
시험예 5 : 혈장 내 리포솜의 안정성 비교 실험
혈장 내에서 리포솜 입자의 안정성을 측정하기 위하여, 8주령의 SD 랫트에 채혈한 혈액을 헤파린 용액과 9 : 1 (v/v)로 혼합하여 원심분리를 통해 혈장액을 제조한 뒤, 상기 실시예의 시료 3, 비교예 1 ~ 3에서 제조된 리포솜 각각과 혈장액을 1 : 1 (v/v)로 혼합한 뒤 37 ℃에서 시간 경과에 따른 리포솜 입자크기 변화를 측정하여 그 결과를 다음 도 2에 나타내었다. 도 2에서 나타낸 바와 같이, 실시예의 시료 3 리포솜의 입자크기는 약 96 시간 후 혈장 내에서 입자 안정한 상태가 유지됨이 관찰되었다. 그러나, 비교예 1과 2에서 제조된 리포솜은 시간이 지남에 따라 혈장 단백질에 의한 옵소닌화 작용에 의해 점차 입자크기가 증가가 관찰되었다. 그리고 비교예 3에서 제조된 리포솜은 친수성 고분자인 폴리에틸렌글리콜의 도입으로 인해 약 96시간동안 입자크기 혈장에서 안정한 상태가 유지되었다.
따라서, 표면이 변성된 단백질로 결합된 안정화-체내알부민으로 결합하고 결합된 알부민을 변성시킨 안정화-체내순환 지속형 리포솜은 혈장 내에서 안정하다고 할 수 있다.
시험예 6 : 혈장 내 리포솜의 단백질 흡착 비교
혈장 내에서 리포솜 입자의 안정성을 측정하기 위하여, 8주령의 SD 랫트에 채혈한 혈액을 헤파린 용액과 9 : 1 (v/v)로 혼합하여 원심분리를 통해 혈장액을 제조한 뒤, 상기 실시예의 시료 3, 비교예 1 ~ 3에서 제조된 리포솜 각각과 혈장액을 1 : 1 (v/v)로 혼합한 뒤 37 ℃에서 교반하면서 일정 시간마다 샘플을 1 ㎖씩 채취하여 리포솜에 흡착된 단백질을 도 3에 나타내었다. 채취한 샘플은 300,000의 폴리에테르설폰 분리막을 이용하여 한외여과를 통해 단백질이 흡착된 리포솜만을 얻었다. 이후 단백질이 흡착된 리포솜은 효소면역활성측정기를 사용하여 595 nm에서의 흡광도를 측정하여 리포솜에 흡착된 단백질을 측정하였다. 도 3에서 나타낸 바와 같이, 비교예 1과 2에서 제조된 리포솜은 96 시간 이후 약 4 ㎎ 이상의 혈장 단백질이 흡착되는 것으로 나타났다. 실시예의 본 발명에 따른 안정화-체내 순환지속형 리포솜은 96시간 이후 단백질 흡착량이 대조군에 비해 적은 것으로 측정되어 비교예 1과 비교예 2에 의해 제조된 리포솜보다 단백질 흡착을 월등히 억제하는 것으로 나타났고, 폴리에틸렌글리콜-지질 유도체가 도입된 비교예 3과 비교하였을 때도 동등한 혈장 단백질 흡착 억제 효과가 있는 것으로 나타났다.
그러나 폴리에틸렌글리콜을 이용한 리포솜은 생체 내 효소에 의하여 분해되지 않기 때문에 세포에 축적되어 세포 기능 장애를 유발할 수 있고, 표적부위에서 약물의 방출을 저해하여 결과적으로 치료 효능이 감소되는 단점을 가질 수 있다는 보고가 있다[Boomer, J.A., Inerowicz, H.D., Zhang, Z., Bergstrand, N., Edwards, K., Kim, J.M., Thompson, D.H., Langmuir, 19, 6408(2003)].
따라서, 리포솜 표면에 결합된 변성된 단백질은 폴리에틸렌글리콜과 동등한 혈장 단백질의 흡착을 방지하며 세포 독성을 감소시킬 수 있는 제형이라 할 수 있다.
도 1은 시험예 4에서 산출되어진 약동력학적 결과를 나타낸 그래프이다[-■-; Adriamycin®, -●-; Caelyx®, -▲-; 실시예의 시료 3을 사용한 주사제].
도 2는 시험예 5에서 산출되어진 혈장 내에서 리포솜의 입자크기 변화를 관찰한 그래프이다[-■-; 비교예 1 (대조리포솜), -●-; 비교예 2 (음이온성리포솜), -▲-; 비교예 3 (폴리에틸렌글리콜이 도입된 대조리포솜), -▼-; 실시예 시료 3].
도 3은 시험예 6에서 산출되어진 혈장 내에서 리포솜에 흡착된 단백질의 양을 관찰한 그래프이다[■; 비교예 1 (대조리포솜), ●; 비교예 2 (음이온성리포솜), ▲; 비교예 3 (폴리에틸렌글리콜이 도입된 대조리포솜), ▼; 실시예 시료 3].

Claims (14)

  1. 음이온성 지질을 포함하는 리포솜 표면에, 단백질이 이온 결합된 것을 특징으로 하는 혈류 내 순환시간이 증가된 리포솜.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 단백질은 알부민, 글로불린, 글루테닌, 프롤라민, 알부노이드, 핵단백질, 당단백질, 인단백질, 지단백질, 색소단백질, 젤라틴, 프레테오스, 펩톤, 다이펩티드 및 트리펩티드 중에서 선택된 1종 이상이며, 중량 평균 분자량이 2,000 ~ 1,500,000 Da인 것을 특징으로 하는 리포솜.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 음이온성 지질은 1,2-디아실-sn-글리세로-3-포스페이트, 1-아실-2-아실-sn-글리세로-3-포스페이트, 1,2-디아실-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1-아실-2-아실-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디아실-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)], 1-아실-2-아실-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세로)], 1,2-디아실-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린], 1-아실-2-아실-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린], 1-아실-2-히드록시-sn-글리세로-3-포스페이트, 1-아실-2-히드록시-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 , 1-아실-2-히드록시-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)], 1-디아실-2-히드록시-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린] 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 리포솜.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 단백질은 리포솜에 이온결합 후 변성시키는 것을 특징으로 하는 리포솜.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 단백질은 60 ~ 100 ℃로 1분 ~ 24시간 변성시키는 것을 특징으로 하는 리포솜.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 리포솜은 평균 입경이 30 ~ 400 ㎚인 것을 특징으로 하는 리포솜.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 단백질은 상기 리포솜을 형성하는 지질 1000 중량부에 대하여 0.01 ~ 100 중량부인 것을 특징으로 하는 리포솜.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 리포솜은 전체 리포솜을 형성하는 지질에 대하여 인 지질 또는 당지질 30 ~ 70 몰%, 스테롤류 20 ~ 50 몰%와 음이온성 지질 0.01 ~ 20 몰%로 구성된 것을 특징으로 하는 리포솜.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 인지질은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딘산, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 리조포스파티딜콜린, 스핑고미엘린, 난황 레시틴, 대두 레시틴 및 수소첨가 인지질 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 리포솜.
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 당지질은 디갈락토실디글리세리드류, 갈락토실디글리세리드류, 갈락토실셀레브로시드, 락토실셀레브로시드 및 간글로시드 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 리포솜.
  11. 제 8 항에 있어서, 상기 스테롤류로는 콜레스테롤, 콜레스테롤헥사숙시네이트, 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카르바모일]콜레스테롤, 에르고스테롤 및 라노스테롤 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 리포솜.
  12. 청구항 1 내지 11 중에서 선택된 어느 한 항의 리포솜 내에 약물이 봉입된 것을 특징으로 하는 주사제.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 약물은 사이클로포스파미드, 아이포스파마이드, 멜팔란, 카무스틴, 로무스틴, 스트렙토조신, 카르보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 다카르바진, 프로카르바진, 우라실무스틴, 메토트렉사트, 페메트렉세드, 랄시트렉세드, 플루다라빈, 메르캅토퓨린, 펜토스타틴, 티오구아닌, 카페시타빈, 사이타라빈, 플루오로우라실, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 아이다우루비신, 미토잔트론, 발루비신, 젬시타빈, 악티노마이신, 블레오마이신, 미토마이신, 토포테칸, 아이리노테칸, 에토포사이드, D-아미노레불리닉 엑시드, 메틸아미노레불리네이트, 엘로티닙, 제리티닙, 이메티닙, 독소루비신, 에피루비신, 하이루비신, 다우노루비신, 에소루비신, 이다루비신, 알렌드로네이트, 파미드로네이트, 졸레드로네이트, 콘트리코트로핀, 테트라코삭티드, 티로트로핀, 소마트렘, 메카세르민, 세르모레린, 데스모프레신, 라이프레신, 테르리프레신, 오르니프레신, 아르기프레신, 데목시토신, 카르베토신, 고나도레린, 나파레린, 히스트레린, 소마토스타틴, 옥트리오타이드, 초산란레오타이드, 가니레릭스, 세트로레릭스 및 페그비소만트 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 주사제.
  14. 전체 리포솜을 형성하는 지질에 대하여 인지질 또는 당지질 30 ~ 70 몰%, 스테롤류 20 ~ 50 몰%와 음이온성 지질 0.01 ~ 20 몰%로 혼합하고 수용성 약물이 봉입된 음이온성 리포솜을 제조하는 단계;
    단백질을 pH 1.0 ~ 4.7의 완충용액에 용해시킨 다음, 상기 음이온성 리포솜에 적가하여 20 ~ 40 ℃에서 1 ~ 24시간 교반시키는 단계;
    상기 리포솜 표면에 수식된 단백질을 변성시키는 단계; 및
    완충용액을 이용하여 생체 내 pH 7.0 ~ 7.5로 조정하는 단계
    를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 하는 혈류 내 순환시간이 증가된 단백질로 수식된 리포솜의 제조방법.
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