ES2336754A1 - Metodo para mejorar la expresion de proteinas en cloroplastos. - Google Patents

Abstract

Método para mejorar la expresión de proteínas en cloroplastos. La presente invención pertenece al campo de la tecnología de plantas transgénicas que expresan proteínas. Concretamente, se refiere a un nuevo método para incrementar la expresión de proteínas en plantas, preferentemente enzimas celulolíticas y más concretamente se centra en la producción de las endoglucanasas CelY y Cel1Z de Dickeya dadantii en los cloroplastos de tabaco mediante la integración de genes en el genoma del cloroplasto vegetal. La presente invención es útil en cualquier proceso industrial que necesite utilizar gran cantidad de enzimas como por ejemplo en la conversión de biomasa de celulosa en etanol.

Description

Método para mejorar la expresión de proteínas en cloroplastos.

Sector técnico de la invención

La presente invención pertenece al campo de la tecnología de plantas transgénicas que expresan proteínas. Concretamente, se refiere a un nuevo método para incrementar la expresión de proteínas en plantas, preferentemente enzimas celulolíticas y más concretamente se centra en la producción de las endoglucanasas CelY y Cel1Z de Dickeya dadantii en los cloroplastos de tabaco mediante la integración de genes en el genoma del cloroplasto vegetal. La presente invención es útil en cualquier proceso industrial que necesite utilizar gran cantidad de enzimas como por ejemplo en la conversión de biomasa de celulosa en etanol.

Antecedentes de la invención

Las plantas tienen un gran potencial para su utilización como biofactorías para obtener diversos productos de interés comercial. El potencial de las plantas radica en la posible reducción en los costes de producción y en la escalabilidad de la producción. La presente invención se refiere a la producción de enzimas en plantas genéticamente modificadas (PGMs) para uso industrial y se ha enfocado en la producción de una serie de celulasas, enzimas implicadas en la hidrólisis de biomasa celulósica, que tienen diversas aplicaciones en las industrias de combustibles, alimentación, producción animal, textil y papelera.

Un método para la expresión de enzimas, y en general de cualquier proteína, en plantas se basa en la integración de genes en el cloroplasto (Svav y col., 1991, Svav y Maliga, 1993). Se han descrito numerosos ejemplos de integración estable de genes en cloroplastos de tabaco con unos niveles de expresión génica muy elevada (Por ejemplo: McBride y col., 1995, Khan y Maliga, 1999, Kota y col., 1999, Staub y col., 2000, Kuroda y Maliga, 2001a y 2001b, Lutz y col., 2001, Ye GN y col., 2001). Estos ejemplos sugieren que esta tecnología tiene un potencial muy elevado para la producción de enzimas en plantas.

En los últimos años se han multiplicado los estudios orientados a analizar la viabilidad de la producción de enzimas en plantas utilizando diversas estrategias y con resultados muy diversos. El objetivo principal es el abaratamiento de la producción de enzimas para usos industriales.

Las celulasas son un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis de la celulosa, transformándola en glucosa. Fundamentalmente las celulasas se producen en hongos, bacterias y protozoos aunque también se encuentran en plantas y animales.

Otros nombres para denominar las celulasas son: endoglucanasas, endo-1,4-beta-glucanasa, CMCasa, carboximetil-celulasa, endo-1,4-beta-D-glucanasa, beta-1,4-glucanasa, beta-1,4-endoglucan hidrolasa, celudextrinasa, y avicelasa.

Uno de los ejemplos mejor estudiados es la producción de la endoglucanasa E1 de Acidothermus cellulolyticus en tabaco, Arabidopsis, maíz o patata. En el documento WO 00/05381 A2 se describe un constructo que se puede producir en las células de una planta y codifica una enzima capaz de degradar la celulosa. También se describe un método para alterar el contenido de celulosa en el tejido de una planta; dicho método comprende hacer crecer una planta cuyas células han sido transformadas con una construcción que presenta los siguientes componentes que operan en conjunto en la dirección 5' a 3' de transcripción: i) un promotor funcional en una célula de planta; ii) una secuencia de DNA que codifica la celulasa E1 de Acidthermus cellulolyticus; y iii) una región de terminación de la transcripción, bajo las condiciones en las que dicha enzima se expresa en las células de la planta, resultando que la celulosa de dicha planta se degrada parcialmente y, por tanto, disminuye su contenido. El método describe la expresión de la celulasa E1 en plastidos de plantas para la producción de enzimas que hidrolizan los polisacáridos, concretamente en cloroplastos. Así, utilizando técnicas de integración de genes en el genoma nuclear de las plantas se han obtenido plantas que acumulan en el apoplasto de tabaco la subunidad catalítica de E1 de forma que esta constituye hasta un 1,6% de la proteína soluble total (Ziegelhoffer y col., 2001). Es un nivel de acumulación aceptable pero insuficiente para algunas aplicaciones industriales y tiene el inconveniente de que, para alcanzar este nivel de expresión, se eliminó el dominio de unión a celulasas del gen E1, lo que puede reducir su utilidad en ciertas aplicaciones. En otros ejemplos (Ziegglehoffer y col. 2001, Jin y col. 2003) se obtuvieron PGMs en las que el producto del gen E1 se produce en el citoplasma y se acumula en el cloroplasto, pero no se obtuvieron niveles significativamente elevados de expresión. Ziegler y col., (2000) obtuvieron plantas de Arabidopsis thaliana que acumulan, en promedio, un 7,5% de endoglucanasa E1 pero esta especie vegetal no es un huésped apropiado para la producción de enzimas a gran escala, por la baja capacidad de producción de biomasa. También se han obtenido plantas de maíz que acumulan hasta un 2,1% de endoglucanasa E1 en maíz (Biswas y col., 2006) que tienen interés por tratarse de uno de los cultivos más extendidos y por tanto, una fuente importante de biomasa para la producción de enzimas o su transformación en combustibles. En general, los trabajos realizados con otros genes que codifican enzimas hidrolíticas integrados en el genoma nuclear de la planta no han proporcionado resultados alentadores (Ziegelhoffer 1999, Dai, 1999).

El documento WO 01/16338 A2 se refiere a la producción de celulasas utilizando construcciones génicas cuya expresión da lugar a una proteína de fusión que comprende endoglucanasa E1 y un péptido transitorio. Dichas plantas producen celulasa por medio de la expresión de la construcción génica. El documento menciona que la celulasa producida se puede recoger y purificar pero no menciona la cantidad ni la actividad enzimática de la misma.

El documento de patente WO 03/012094 A1 describe un procedimiento para la producción de xilanasa termoestable en plantas (XynA de Thermospora fusca) que se basa en la expresión del gen en el cloroplasto de tabaco. En este trabajo se clonó el gen de la xilanasa bacteriana bajo el control del promotor de transcripción del RNA16S del arroz y la secuencia líder del gen psbA de arroz. Las secuencias de terminación de transcripción derivan del gen psbA o rbcL de arroz. Se describe que la xilanasa se acumula en plantas de tabaco y constituye aproximadamente un 11% de la proteína soluble, mencionándose que la xilanasa se recupera de un extracto que ha sido sometido a tratamiento térmico, desnaturalizando al menos parte de las proteínas del tejido pero manteniendo la xilanasa estable, recuperándose actividad enzimática significativa después de secar el material vegetal.

Los vectores de integración en el cloroplasto, contienen segmentos de ADN derivados del cloroplasto que determinan el lugar de integración del gen de interés en el genoma del cloroplasto (cpADN) mediante recombinación homologa. Estas secuencias flanquean los genes de interés de manera que éstos quedan integrados en el cpADN tras la recombinación. Además del gen de interés, los vectores de transformación contienen un gen adicional necesario para la selección positiva de células que contienen cpADN recombinante. El más utilizado es el gen aadA, que proporciona resistencia a espectinomicina y estreptomicina (Svav y Maliga 1993). La expresión de genes exógenos requiere que éstos estén operativamente ligados a una serie de secuencias de ADN que funcionan como elementos de control de expresión en el cloroplasto. Dichos elementos incluyen, al menos, un promotor de transcripción que contiene elementos reconocidos por las ARN-polimerasas del cloroplasto (ya sean de origen nuclear o plastidial) que determinan el inicio de la transcripción, una secuencia líder del mRNA mensajero inmediatamente anterior a la secuencia codificante del gen de interés, un triplete de inicio de la traducción en fase de lectura con la secuencia codificante del gen de interés, un triplete de terminación de la traducción, y una región no codificante que contiene señales de terminación de la transcripción reconocidas en el cloroplasto. Los elementos de control de expresión génica más corrientemente utilizados derivan de secuencias génicas del propio cloroplasto (Svav y Maliga, 2003 y otros).

La acumulación de una enzima de interés en el cloroplasto depende de una serie de factores entre los que se incluyen los siguientes: i) transcripción eficiente del gen y estabilidad del ARN mensajero (ARNm), ii) inicio correcto y de la traducción en el triplete correspondiente iii) velocidad de elongación durante la traducción, iv) plegamiento adecuado de la proteína en el estroma del cloroplasto y v) estabilidad del producto en el estroma. Podemos agrupar estos factores en dos clases: factores que influyen en la expresión génica y factores que influyen en la actividad y estabilidad del producto.

Factores que influyen en la expresión génica en el cloroplasto

Los estudios de regulación de la expresión génica en cloroplastos de algas y plantas superiores indican que el factor más influyente en el control de la expresión de genes endógenos del cloroplasto es el inicio de la traducción (Choquet y Vollman 2002). Numerosos estudios indican que factores probablemente implicados en el inicio de la traducción determinan la eficiencia de la expresión de genes exógenos en el cloroplasto (Kuroda y Maliga, 2001a y 2001b). La expresión de un gen particular depende de que el contexto de inicio de la traducción sea favorable (Esposito y col., 2001). Este contexto está determinado en parte por la secuencia líder del ARNm y en parte por la propia secuencia codificante del gen de interés (Kuroda y Maliga, 2001b). Se ha observado que la secuencia líder del gen psbA de tabaco promueve la traducción eficiente de ARNm exógenos in vitro (Hirose & Sugiura, 1996) e in vivo, y da lugar a la expresión eficiente de una serie de genes integrados en el cpADN de tabaco (Staub y Maliga 1994, Eibl y col., 1999, Daniell y col., 1998, Kota y col., 1999, Daniell y col., 2001, De Cosa y col. 2001). Sin embargo, los niveles de expresión alcanzados son variables dependiendo del gen de interés y no siempre se observa expresión eficiente del gen introducido (Whitney y col., 2001).

Esta variabilidad observada está relacionada en parte con el hecho de que la secuencia inmediatamente posterior al triplete de iniciación es también un determinante de la expresión génica, lo que introduce un factor de incertidumbre en la expresión de cualquier gen en el cloroplasto (Kuroda y Maliga 2001b). En algunos casos se han desarrollado estrategias que permiten proporcionar un contexto de inicio de traducción que favorece la expresión génica. Estas se basan en la fusión del gen de interés a una corta secuencia codificante de manera que se produce una proteína quimérica que contiene un corto péptido añadido a la proteína de interés en su extremo aminoterminal. Estas secuencias añadidas proporcionarían un contexto que favorece la expresión génica. Para ello se han utilizado secuencias derivadas de genes del propio cloroplasto (Kuroda y Maliga, 2001b), de la proteína fluorescente verde (GFP) de la medusa (Ye, Staub y col., 2001) que se menciona a continuación, o simplemente una secuencia sintética que codifica un pentapéptido (Herz y col. 2005).

La solicitud de patente internacional WO 01/04331 A2 (de ahora en adelante D1) y el correspondiente artículo de literatura no patente (Ye, Staub y col., 2001) describen secuencias de ácidos nucleicos útiles para promover la expresión de amplia variedad de genes, tanto eucarióticos como procarióticos. En particular, la invención se centra en la fusión traduccional de 14 aminoácidos derivados de la proteína fluorescente verde (GFP) (Seq Id No. 26) de medusa al dominio N-terminal de una proteína. A pesar de que el documento presenta la invención como útil para aumentar el nivel de expresión de cualquier enzima, en concreto, realiza la fusión traduccional de dicha secuencia de la GFP a la enzima EPSPS, dando lugar a altos niveles de expresión de dicha proteína; presenta una construcción que comprende la secuencia de DNA correspondiente a los 14 aminoácidos de la GFP (Seq Id No. 27) fusionada al dominio N-terminal del gen de la proteína C4. Dicha construcción es expresada en : plástidos. Los altos niveles de expresión obtenidos a través de la invención se refieren a niveles de más del 10% del total de la proteína soluble. La solicitud de patente reivindica la célula que comprenda al menos, aproximadamente el 12% de proteína de interés, del total de proteína soluble de la célula. La publicación correspondiente a la solicitud de patente, además de lo anterior, se refiere a la adaptación de los codones del gen CP4 a los codones del cloroplasto. Para ello, llevan a cabo una inspección de la secuencia nativa de CP4, observando que solamente presenta un 45% de codones preferidos por plástidos. Con el fin de comprobar el efecto del empleo de codones preferidos para la expresión en plástidos, construyen un gen CP4 sintético que presenta predominantemente (el 77%) codones preferidos por plástidos. Los resultados obtenidos demuestran que la optimización mediante el uso de codones plastídicos da lugar a un aumento de la acumulación de proteína de aproximadamente un 10% más (es decir, unas 50 veces más que sin la optimización de codones).

El notable incremento de expresión de esta enzima se observó en el contexto de la secuencia líder G10L del bacteriófago T4 y no se ha analizado en el contexto de la secuencia líder de psbA. Esto es relevante ya que se ha demostrado que los efectos de mutaciones en las secuencias inmediatamente posteriores al triplete de inicio varían mucho dependiendo de la secuencia líder (Kuroda y Maliga 2001b).

Hay pocos datos en la literatura científica sobre la influencia de la velocidad de elongación en la eficiencia de la expresión genética en el cloroplasto. La velocidad de elongación puede depender del sesgo de tripletes del gen que se pretende expresar, del contenido en pares GC del ADN y de la estructura secundaria del ARNm, que a su vez es un determinante de la estabilidad del mensajero (Stern y col., 1991). La expresión eficiente de genes exógenos en un organismo heterólogo puede requerir la adaptación de la secuencia primaria del gen al sesgo de tripletes característico del organismo hospedador y la alteración de elementos estructurales del ARNm. El sesgo en el uso de tripletes de un organismo es un indicador de la frecuencia relativa de los distintos tripletes que codifican un aminoácido o una señal de terminación. Se han observado diferencias significativas en el sesgo en el uso de tripletes entre distintos organismos, que están relacionados a su vez con la frecuencia de nucleótidos en el ADN (frecuencia de pares GC o AT en el ADN). En algunos casos se ha observado que la frecuencia relativa de tripletes "raros" es limitante en la eficiencia de la traducción, pero en otros casos no. Este efecto del sesgo de tripletes empleado puede estar relacionado con la frecuencia de los ARN de transferencia (ARNt) complementarios en el citoplasma (revisado por Gustafsson y col., 2004). En cloroplastos de tabaco se ha observado que la adaptación parcial del gen que codifica el fragmento C de la toxina colérica al contenido en GC característico del cloroplasto, favorece la expresión del gen: el producto del gen adaptado se acumuló entre 2 y 3 veces más que el del gen nativo (Tregoning y col., 2003). En otro ejemplo, un gen que codifica para una enzima que proporciona resistencia a un herbicida, se acumuló 2-3 veces más en cloroplastos que contenían una versión sintética adaptada que en los que contenían la versión nativa del mismo gen (Ye y col., 2001). La sobre-expresión de genes nativos de distintos orígenes (humanos, bacterianos etc.) en cloroplastos de tabaco sugiere que el sesgo de uso de tripletes no es un determinante importante para la expresión génica en éste sistema, pero la ausencia de expresión detectable de otros genes puede estar relacionada con factores tales como el contenido en pares GC y/o la estructura secundaria del ARNm, que pueden influir en la elongación de la proteína naciente durante la traducción.

Estabilidad del producto

Otro factor a tener en cuenta si se quiere obtener una acumulación eficiente de celulasas de uso industrial en cloroplastos de tabaco es la estabilidad del producto en el estroma del cloroplasto. La estabilidad depende de que la proteína naciente adopte una conformación estable y funcional, y depende de la sensibilidad y accesibilidad del producto a la maquinaria de degradación del cloroplasto. En la literatura científica se han descrito algunos procedimientos que pueden favorecer la acumulación de productos génicos en el cloroplasto influyendo en la estabilidad. En un primer ejemplo se observó que la acumulación de la somatotropina bovina en cloroplastos de tabaco aumenta considerablemente cuando se expresa como proteína de fusión de la ubiquitina (Staub y col., 1999), aunque el incremento observado puede estar relacionado tanto con la expresión génica como con la estabilidad del producto. Otros productos de fusión como los anteriormente mencionados (Ye, Staub y col., 2001) pueden tener también efectos combinados sobre la expresión y estabilidad del producto. El mejor ejemplo que demuestra la importancia de la estabilidad del producto es el de la acumulación de un insecticida en cloroplastos de tabaco (De Cosa y col., 2001). La elevada acumulación del producto en este caso concreto (se estimó en hasta un 45% de la proteína extraíble) se debe a la estabilización del insecticida gracias a la co-expresión de una chaperona que facilita el plegamiento del insecticida.

La traducción de genes exógenos integrados en el cloroplasto y operativamente ligados a las secuencias 5' y 3' no codificantes del gen psbA se induce fuertemente por la luz (Eibl y col 1999).

En el artículo de Gil y col., 2006 (de ahora en adelante D2) se desarrolla un procedimiento de estabilización que se basa en la formación de estructuras complejas (polímeros de las enzimas individuales) y más estables que las estructuras simples. La formación de estructuras complejas reduce la accesibilidad del producto a la maquinaria de degradación del cloroplasto y, por tanto, la velocidad de degradación, permitiendo una mayor acumulación del producto expresado en el cloroplasto. El mencionado artículo presenta una estrategia para aumentar la expresión de antígenos en el citoplasma vegetal mediante su fusión a un fragmento de 41 aminoácidos que contiene el dominio de tetramerización (TD) del factor de transcripción humano p53 (Seq Id No. 35). Para ello se lleva a cabo la fusión traduccional de 21 aminoácidos derivados del dominio N-terminal de la proteína altamente inmunogénica 2L21, derivada de la proteína VP2 del parvovirus canino (CPV), al dominio de tetramerización (TD) del factor transcripcional p53, de 41 aminoácidos de longitud, demostrando que dicha construcción puede ser eficientemente expresada en plantas transgénicas. Esta fusión permite la obtención de tetrámeros de la proteína en cuestión alcanzando niveles por encima de los rendimientos habituales para péptidos obtenidos en plantas por transformación nuclear (0,01-0,4% del TSP). Estos resultados demostraron que la multimerización dirigida a través del dominio de tetramerización (TD) contribuye a la estabilización en el citoplasma y, consecuentemente, a la acumulación del péptido 2L21 en plantas transgénicas, sin alterar su antigenicidad e inmunogenicidad nativas. También muestran que el dominio de tetramerización de la p53 media la oligomerización del péptido 2L21, produciendo tetrámeros peptídicos estables acumulados en más del 1% de la proteína total extraída de las hojas transgénicas. La aplicación de la invención se centra en el campo de las vacunas.

Producción de celulasas de Dickeya dadantii

En el artículo de Zhou y col., (2000) se expone la importancia que la hidrólisis de la celulosa en azúcares solubles mediante sistemas microbianos supone en la producción de materias primas renovables para la producción de combustible y químicos. Este artículo se centra en examinar la efectividad de las endoglucanasas CelY y Cel1Z solas o en combinación usando carboximetilcelulosa y celulosa amorfa como sustratos. Así, se comprueba en ambos sustratos que se produce sinergismo al combinar ambas enzimas. El documento especifica que, aunque Cel1Z y CelY (muy útiles en la maceración de las paredes celulares de las plantas) son producidas por Erwinia chrysanthemi (Dickeya dadantii), Cel1Z representa aproximadamente el 95% de la actividad carboximetil celulasa.

Para poder llevar a cabo dichos experimentos construyen plásmidos que expresan niveles altos de CelY en E. coli recombinante. Sorprendentemente, el 90% de la actividad CelY es excretada como producto extracelular mediante el sistema de secreción nativo de E. coli. Proceden a la amplificación por PCR de la región codificante (sin promotor) de CelY y posteriormente la clonan en el plásmido pCR2.1-TOPO, bajo el promotor lac. El remplazamiento del promotor nativo por el promotor lac incrementó la expresión de CelY aproximadamente 10 veces, pasando de 165 a 1800 IU/litro. Aproximadamente el 90% de la actividad CelY se encontró en el medio extracelular. Estudios anteriores de los mismo autores describen la expresión de Cel1Z por E. coli transformada con el plásmido pLOI1620 (es decir el plásmido en el que se ha clonado el gen Cel1Z junto con su promotor nativo).

Aunque este artículo muestra la importancia y el interés en la obtención de endoglucanasas para su aplicación industrial, lleva a cabo la obtención de dichas enzimas por un método que difiere del objeto de la presente invención, tanto en la metodología como en la cantidad obtenida.

Por lo tanto, todavía existe la necesidad de un método para incrementar la cantidad de proteínas/enzimas funcionales en plantas, concretamente de celulasas en cloroplastos, sin disminuir su actividad, de forma que se puedan utilizar en cantidades industriales.

Objeto de la invención

La solución aportada por la presente invención se centra en la fusión traduccional de una versión modificada (con bajo contenido en pares GC) de los primeros 15 aminoácidos de la proteína fluorescente verde (GFP) (Seq Id No. 28, 29), así como la fusión del dominio de tetramerización de la proteína p53 (Seq Id No. 35, 36) (fusión que puede realizarse entre dominios funcionales o en el extremo C-terminal), a la secuencia de la proteína en cuestión cuya producción se desea incrementar. Con la construcción obtenida se transforman cloroplastos que expresaran la proteína de interés de forma incrementada y con una estabilidad mejorada de forma que en tejidos maduros el producto de interés puede ser la proteína extraíble más abundante, recuperándose dicha proteína en un rango entre el 25-30% del total de la proteína extraíble de la planta.

Como proteína de interés se entiende cualquier proteína de interés, preferentemente un enzima, de origen animal o vegetal, como pueden ser las enzimas implicadas en la hidrólisis de celulosa y otros componentes de la pared celular vegetal -endoglucansas, celobiohidrolasas, betaglucosidasas, endoxilanasas, arabinofuranosidasas etc-, y otras enzimas de uso industrial como pueden ser proteasas, fitasas, lipooxigenasas, lacasas, fitasas y otras.

La presente invención se refiere a un método para incrementar la producción de proteínas funcionales, y más concretamente enzimas funcionales en cloroplastos. Concretamente de celulasas y más concretamente de las endoglucanasas CelY (Seq Id No. 30) y Cel1Z (Seq Id No. 48)para su uso industrial, ya que su productividad es el principal factor limitante en su utilización industrial debido a las grandes cantidades de enzima necesarias en su utilización.

Para alcanzar el objeto de la invención consistente en aumentar la producción de celulasas se utiliza la combinación simultánea de dos estrategias:

\bullet

Estrategia que favorece la expresión de un producto génico: fusión traduccional de una versión modificada de la secuencia que codifica para los primeros 15 aminoácidos de la GFP (Seq Id No. 28).

\bullet

Estrategia que favorece la estabilización del producto: fusión/sustitución del dominio de tetramerización de la p53 (Seq Id No. 35)(en el dominio C-terminal o en el brazo espaciador en el caso de proteínas con dominios estructurales-funcionales diferenciados).

Considerando que el documento anteriormente mencionado como D1 describe la estrategia de llevar a cabo la fusión traduccional de los 14 primeros aminoácidos de la secuencia de la GFP (Seq Id No. 26) al dominio N-terminal de una proteína, consiguiendo niveles de expresión de dicha proteína en plantas (concretamente plantas de tabaco) del orden del 12% del total de la proteína soluble de la célula, y que en el documento D2, también mencionado anteriormente, se presenta la fusión de un fragmento de 41 aminoácidos (TD) (Seq Id No. 35) que contiene el dominio de tetramerización del factor de transcripción humano p53 a una secuencia de 21 aminoácidos de la proteína 2L21 derivada de VP2 del parvovirus canino, consiguiéndose de esta manera (en las plantas de A. thaliana transformadas con la construcción a la que la fusión da lugar) la obtención de tetrámeros de la proteína en cuestión (2L21), alcanzando niveles por encima de los rendimientos habituales para péptidos obtenidos en plantas por transformación nuclear (0,001-0,4% del TSP), parece que la combinación de ambas estrategias sea una solución obvia al problema planteado, Sin embargo, sorprendentemente se ha encontrado que la combinación de ambas estrategias, de la forma llevada a cabo en la presente invención, da lugar a un efecto sinérgico totalmente inesperado ya que se consigue un incremento de la producción de las proteínas, ejemplificado en la presente invención a través de celulasas, de aproximadamente un 25%-30% del TSP, sensiblemente superior al de la suma de los incrementos obtenidos como resultado de dichas estrategias aplicadas individualmente, siendo en D1 de un 12% del TSP y en D2 de un 1,2% del TSP, es decir, a través de la estrategia de la invención se consigue un incremento sinergístico en la producción de proteínas.

Por otro lado, el documento D2 no indica posibles efectos del dominio de tetramerización de la p53 (Seq Id No. 35) sobre cualquier funcionalidad de la proteína de interés diferente a su utilización como antígeno, ni otros posibles efectos de dicho dominio sobre la expresión de genes en el cloroplasto. Los resultados del documento D2, indican la estabilización de péptidos de pequeño tamaño, y por tanto, altamente susceptibles a la degradación proteolítica, pero sus resultados no son directamente extrapolares a la producción de proteínas de mayor tamaño y con dominios estructurales estables como las endoglucanasas CelY o Cel1Z.

Así, adicionalmente, las proteínas/enzimas obtenidas en la presente invención presentan propiedades mejoradas de estabilidad del producto durante la reacción, indicando que se trata de productos nuevos, con propiedades diferenciadas respecto a las enzimas nativas.

Por lo tanto, de esta manera se consigue:

\bullet

una actividad endoglucanasa mayor que la obtenida por únicamente la fusión traduccional de GFP o el gen nativo sin fusionar. Diferencia que se acentúa en la maduración de los tejidos.

\bullet

que la proteína extraíble de la planta más abundante corresponda al producto de interés, con una acumulación diferencial respecto a otra proteína muy abundante y estable en las plantas (Ribulosa carboxilasa, RUBISCO) o respecto a la misma proteína carente del dominio de tetramerización. Esta estabilización diferencial del producto de interés, frente a otras proteínas endógenas de la planta, observada mediante comparación de tejidos en distinto estado de maduración, es un fenómeno nuevo proporcionado por la presente invención y anteriormente no descrito.

En las construcciones génicas a las que la implementación de estas estrategias da lugar, la secuencia de DNA quimérico de interés (secuencia del gen de interés simultáneamente fusionada a la versión modificada de la secuencia que codifica para los primeros 15 aminoácidos de la GFP (Seq Id No. 28) y al dominio de tetramerización de la p53, Seq Id No. 35) está operativamente ligado al promotor de transcripción (Seq Id No. 2), secuencia líder (Seq Id No. 3)y secuencia de terminación de transcripción derivados del gen psbA.

El método que constituye el objeto de la invención implica la transformación de las células de planta con las construcciones génicas mencionadas, el posterior crecimiento de las células y/o plantas y la recuperación de la proteína quimérica expresada en los cloroplastos.

Dicha metodología promueve la expresión (eficiencia de la traducción) así como la estabilización de los productos en la planta mediante la expresión de genes introducidos en un organismo genéticamente manipulado, concretamente la manipulación mediante introducción de genes en el genoma del cloroplasto vegetal.

Las plantas de la invención presentan un incremento en la acumulación en cloroplastos de la proteína en cuestión de hasta el 30% de la TSP, que es superior a la suma de los incrementos obtenidos a través de las estrategias de fusión individuales de dichas secuencias.

Además estas plantas, que presentan la proteína de interés codificada por el DNA quimérico como producto mayoritario extraíble, presentan dicha acumulación en todas las hojas de la planta independientemente de su estado de maduración, siendo especialmente mayor la acumulación en hojas maduras, entre un 5 y un 10% mayor en términos relativos al contenido total de proteínas que en las hojas jóvenes.

Un objeto de la presente invención se refiere a la construcción nucleotídica caracterizada por comprender

a.

Una secuencia de DNA quimérico que comprende una secuencia de DNA o proteína simultáneamente fusionada a dos fragmentos sintéticos de ADN codificante que consisten en i) una versión modificada de la secuencia que codifica para los primeros 15 aminoácidos de la GFP (Seq Id No. 28) y ii) la secuencia que codifica para el dominio de tetramerización de la p53 (Seq Id No. 35).

b.

precedida por un triplete de inicio de la traducción en fase de lectura,

c.

clonada bajo el control de un promotor y secuencia líder funcionales en plastidios,

d.

un triplete de terminación de la traducción y

e.

una región no codificante que contenga señales de terminación de la transcripción reconocidas en el cloroplasto.

En una realización particular la proteína es un enzima, preferentemente una celulasa, más preferentemente una endoglucanasa y en concreto CelY y/o Cel1Z, o dichas proteínas carentes del péptido de secreción.

En dicho objeto de invención, los fragmentos sintéticos de ADN codificante de la etapa a) presentan bajo contenido en pares GC, preferentemente el contenido en GC es del 40%.

En dicho objeto de invención, la secuencia que codifica para los primeros 15 aminoácidos de la GFP consiste en Seq Id No. 28, llevándose a cabo en el extremo N-terminal de la proteína o secuencia de DNA cuya expresión se desea incrementar, y la secuencia del dominio de tetramerización de la p53 consiste en Seq Id No. 35, realizándose la fusión dentro del brazo de separación, en sustitución del brazo de separación o en C-terminal, específicamente en el extremo C-terminal cuando el enzima a expresar no presenta dominios funcionales separados y en el brazo de separación o en sustitución del mismo cuando el enzima a expresar presenta dominios funcionales separados.

En una realización particular el promotor (Seq Id No. 2) y secuencia líder (Seq Id No. 3) son los del gen psbA.

Otro objeto de invención se refiere al fragmento sintético de ADN codificante, caracterizado por consistir en una versión modificada de la secuencia que codifica para los primeros 15 aminoácidos de la GFP , específicamente (Seq Id No. 28).

Otro objeto de invención se refiere al fragmento sintético de ADN codificante, caracterizado por consistir en el dominio de tetramerización de la p53, concretamente Seq Id No.35.

Otro objeto de invención se refiere al método para incrementar la expresión de proteínas en plantas, mediante la integración de genes en el genoma del cloroplasto vegetal caracterizado porque comprende las etapas de:

a.

Transformación de una célula y/o planta con la construcción nucleotídica según reivindicaciones 1 a 13.

b.

Hacer crecer dichas células y/o plantas bajo condiciones en las que la secuencia de DNA obtenida en la etapa a) se transcriba.

c.

Si se desea, recuperar la proteína quimérica, codificada por la construcción nucleotídica de a), expresada.

En dicho método, las proteínas quiméricas cuya expresión se ha visto incrementada se mantienen funcionalmente activas y el incremento de la expresión génica es superior al obtenido a través de la suma de los incrementos obtenidos al fusionar los fragmentos sintéticos de ADN codificante (GFP y p53). En una realización particular, la acumulación de la proteína de interés expresada es del 25-30% del TPS. Específicamente, dicho incremento es al menos dos órdenes de magnitud superior que al expresar el producto génico nativo, dos veces mayor que al expresar el producto génico fusionado a GFP, y 10 veces mayor que al expresar el producto génico fusionado a p53.

Otro objeto de invención se refiere a la célula, específicamente una célula de planta caracterizada por comprender la construcción nucleotídida anteriormente definida. En una realización particular la célula ha sido obtenida a través del método de la invención.

En dicho objeto de invención la proteína quimérica expresada a partir de la secuencia de DNA quimérico de la construcción nucleotídica corresponde a un porcentaje entre el 25% y el 30% del total de proteína soluble comprendida en dicha célula.

Otro objeto de invención se refiere a la planta transgénica que comprende la construcción nucleotídica de la invención, específicamente la obtenida por el método de la invención.

En dicho objeto de invención, la planta transgénica presenta como producto mayoritario extraíble la proteína de interés codificada por la secuencia de DNA quimérico de la construcción nucleotídica descrita, preferiblemente entre el 25% y el 30% del total de proteína soluble, produciéndose dicha acumulación en todas las hojas de la planta independientemente de su estado de maduración, siendo especialmente mayor la acumulación en hojas maduras, entre un 5 y un 10% mayor en términos relativos al contenido total de proteínas que en las hojas jóvenes.

Otro objeto de invención se refiere a la semilla producida por las plantas descritas.

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Otro objeto de invención se refiere a la proteína quimérica obtenida por el método descrito. En una realización particular, dicha proteína quimérica es un enzima, preferentemente CelY quimérica (Seq Id No. 30) o Cel1Z quimérica (Seq Id No. 43).

Otro objeto de invención se refiere al uso de las plantas descritas como biofactorías, para la producción masiva de enzimas de interés industrial, en la industria del biodiesel.

Otro objeto de invención se refiere al uso del fragmento sintético que codifica para la p53 para la obtención de productos quiméricos de fusión en el cloroplasto cuya expresión es más estable respecto a variantes que carecen de este fragmento.

Otro objeto de invención se refiere al uso del fragmento sintético derivado de GFP para, incrementar la expresión génica y acumulación del producto en el cloroplasto.

Otro objeto de invención se refiere al método descrito, para la producción de proteínas quiméricas en plantas genéticamente modificadas (PGMs). Dichas proteínas se caracterizan por presentar propiedades mejoradas de estabilidad, y actividad sobre un sustrato insoluble respecto a la enzima nativa, En una realización particular, dicha proteína quimérica es CelY quimérica (Seq Id No. 42) o Cel1Z quimérica (Seq Id No. 56).En otra realización particular dichas enzimas quiméricas no requieren ser purificadas.

Otro objeto de invención se refiere al uso del método en las industriáis de combustibles, alimentación, producción animal, textil y papelera.

Otro objeto de invención se refiere al uso del método para la generación de bioetanol de segunda generación.

Otro objeto de invención se refiere al uso de las proteínas quiméricas Cely y/o Cel1Z para la conversión de celulosa en etanol.

Breve descripción de las figuras

Leyenda de las figuras: Con el fin de facilitar la lectura y entendimiento de las figuras 1, 5, 6, 9,10, 13 y 14 se ha empleado en ellas la misma tipografía y subrayado para distinguir las distintas regiones y/o dominios de las secuencias de las figuras.

Así, la distinta tipografía y subrayado empleada corresponde a:

100

Fig 1: Muestra secuencias de los vectores intermedios empleados, la secuencia completa del vector pPLAg (A1), y las secuencias parciales de pPLAg (A2), pPLAf (B) y pPLA (C), indicando en cada uno de ellos la parte de la secuencia que representa los elementos de control de la expresión. Así, en estas figuras se señala: promotor psbA (cursiva subrayado simple), Secuencia líder psbA (cursiva simple), Sitios de restricción (subrayado simple), Gen resistencia a Kanamicina (subrayado intercalando puntos y rayas simple), sitio de inicio de la traducción (sombreado gris), y las modificaciones introducidas en pPLAg y pPLAf. Las modificaciones corresponden a secuencia derivada GFP (negrita doble subrayado), secuencia derivada ferredoxina (negrita subrayado interrumpido).

Fig 2: Oligonucleótidos empleados en las distintas fases del desarrollo. A Muestra los distintos oligonucleótidos utilizados para la construcción de pPLA, pPLAg y pPLAf, distinguiendo entre los empleados para A.1 amplificación de del promotor y secuencia líder del gen psbA, A.2 construcción del linker sintético de GFP y A.3 de la ferredoxina. B Muestra los oligonucleótidos empleados para llevar a cabo el análisis de integración de genes mediante PCR. C y D muestran los distintos oligoucleótidos empleados para las construcciones con CelY y Cel1Z respectivamente.

Fig 3: Análisis de homoplasmia mediante RFLP (polimorfismo de fragmentos de restricción) en 1% de agarosa. En cada carril se cargó, aproximadamente, un microgramo de ADN genómico de plantas individuales digerido 3 horas con NcoI. Los fragmentos resultantes, se separaron mediante electroforesis en TBE-agarosa y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se hibridaron con una sonda de ADN marcado con biotina que híbrida con los segmentos de ADNcp adyacentes al sitio de integración de pAF. La sonda detecta un fragmento de 6425 pb en plantas normales, mientras que en plantas que integran pAF-CelY, se detectan dos fragmentos de 495 y 4857pb (debido a que se introduce una diana NcoI con el vector). Las plantas heteroplásmicas muestran un patrón que combina los tres fragmentos en proporciones variables.

Fig 4: Diferencias en la secuencia de la GFP utilizada en Ye y col.(2001) y en este trabajo. Las posiciones que difieren se representan en minúsculas. ATG (sombreado gris) Representa el codón de inicio de la traducción.

Fig 5: Secuencia del producto de PCR del gen CelY (999 nucleótidos) clonado en pGEM-T Easy. En dicha secuencia se destacan distintas zonas: codones de Inicio (ATG) y fin de traducción (ATT), inicio de transcipción (A) (sombreado gris), Secuencia del péptido de secreción de CelY (negrita subrayado simple) (nucleótidos 1-69), Secuencia de la enzima madura CelY (nucleótidos 70-996) (negrita). El resto, los primeros 7 nucleótidos y los últimos 100 representan regiones no codificantes que flanquean el marco de lectura abierto de CelY.

Fig 6: Representa las distintas construcciones de CelY en plásmidos intermedios. A) pPLA-Yi, B) pPLA-Yg, C) pPLA-Yf, pPLA-Yt. En dichas construcciones se destaca: Promotor psbA (cursiva subrayado simple), Secuencia líder psbA (cursiva simple), Sitios de restricción (Subrayado simple), Codones de Inicio (ATG) y fin de traducción (ATT), inicio de transcipción (A)(sombreado gris), Secuencia del dominio catalítico CelY (primeros 27 nucleótidos y los últimos 23) (negrita), secuencia codificante GFP (aminoácidos 2-15) (negrita doble subrayado), secuencia codificante ferredoxina (aminoácidos29-48) (negrita subrayado interrumpido), secuencia codificante del dominio de tetramerización de p53 (negrita subrayado ondulado) separado de los últimos 23 aminoácidos del dominio catalítica de CelY por una secuencia espadadora (negrita, cursiva subrayado intercalando puntos y rayas) que contiene el hexanucleótido TCTAGA que corresponde a la diana de restricción XbaI utilizada en el ligamiento del dominio de tetrame-
rización.

Fig 7: Visulización de Yf, Yg e Yt en 10% de acrilamida. A) Se observa que las plantas que integran pAF-Yg, pAF-Yf, pero no las que integran pAF-Yi p pAF-Yt, muestran una banda protéica cuyo peso molecular es de unos 36KDa (que corresponde aproximadamente con el peso molecular deducible di producto del gen CelY) indicando que la expresión de estas construcciones es muy eficiente B) Caso de pAF-Yt, en el que se observa una banda específica de peso molecular aparente de 38 kDa, aunque no de forma tan evidente como en el caso anterior.

Fig 8: Comparación de la acumulación de Yg e Ygt en hojas de distinta edad en A) geles con tinción azul de coomassie y B) zimograma. Las calles del zimograma (B) corresponden a las mismas que se han empleado en el gel (A). En el apartado A se observa que la proteína más intensamente teñida es la ribulosa carboxilasa del cloroplasto (RUBISCO) con un peso molecular aparente de 54 kDa. En hojas jóvenes de plantas Yg ó Ygt se detecta otra proteína muy abundante con un peso molecular aparente aproximado de 36 kDa (Yg, carriles 2 y 3) y 39 kDa, (Ygt, carriles 4 y 5) que corresponde al peso molecular esperable de las respectivas variantes quiméricas de CelY. El apartado B muestra que las bandas protéicas identificadas como proteínas Yg e Ygt tienen actividad endoglucanasa por lo que deben corresponder a los productos del gen CelY.

Fig 9: Secuencia (A) y proteína madura (B) de Cel1Z y sus distintos dominios funcionales respectivamente. En dicha secuencia se destacan los siguientes dominios: Codones de Inicio (ATG) y fin de traducción (ATT), inicio de transcipción (A) (sombreado gris), Secuencia del péptido de secreción de CelZ (nucleótidos 4-129) (negrita, cursiva, subrayado simple), Dominio catalítico de CelZ (nucleótidos 130-996) (negrita, cursiva), Brazo de unión a celulosa de CelZ (nucleótidos 1100-1282) (negrita, cursiva, subrayado punteado).

Fig 10: Secuencia de DNA (A) y (B) secuencia deducida de aminoácidos de Endoglucanasa Z quimérica y sus distintos dominios funcionales respectivamente. Se destacan los siguientes dominios: Codones de Inicio (ATG) y fin de traducción (ATT), inicio de transcipción (A)(sombrado gris), Secuencia del péptido de secreción de CelZ (negrita, cursiva, subrayado simple), Dominio catalítico de CelZ (negrita, cursiva), dominio de tetramerización (negrita subrayado ondulado), Brazo de unión a celulosa de CelZ, dominio de unión a celulosa (negrita, cursiva, subrayado punteado), Sitios de restricción (Subrayado simple).

Fig 11: Zimograma de extracto de plantas que expresan Zg y Zgt separados en un 8% acrilamida-SDS. Se observa, tanto en extractos de Zg como de Zgt varias bandas con actividad catalítica, algunas con una movilidad electroforética inferior al peso molecular esperable de la endoglucanasa Z. En el caso de Zgt, y no en Zg, se detectan bandas discretas de actividad endoglucanasa de alto peso molecular (indicadas con flechas blancas) que pueden corresponder a complejos multiméricos de Zgt estables durante la extracción y electroforesis.

Fig 12: Actividad endoglucanasa sobre celulosa. Esta gráfica comparan las cinéticas de reacción de las proteínas quiméricas Zg y Zgt a 37ºC. La reacción se cuantifica mediante la medición de azúcares reductores liberados por el método de Nelson-Somogyi. Los valores que se representan an cada corresponden al promedio de 3 reacciones independientes.

Fig 13: Secuencia de nucleótidos de la Endoglucanas Ygt quimérica. En dicha secuencia se destaca: Secuencia codificante GFP (nucleótidos 1-48) (negrita doble subrayado), Codones de Inicio (ATG) y fin de traducción (ATT), inicio de transcipción (A) (sombrado gris), Secuencia del dominio catalítico CelY (nucleótidos 52-980) (negrita), Sitio de restricción (Subrayado simple), Secuencia codificante del dominio de tetramerización de p53 (nucleótidos 988-1107) (negrita subrayado ondulado).

Fig 14: Secuencia de nucleótidos de la Endoglucanasa Zgt quimérica. En dicha secuencia se destaca: Codones de Inicio (ATG) y fin de traducción (ATT), inicio de transcipción (A) (sombreado gris), Secuencia codificante GFP (nucleótidos 1-48) (negrita doble subrayado), Secuencia del péptido de secreción de CelZ (negrita, cursiva, subrayado simple), Dominio catalítico de CelZ (nucleótidos 52-918) (negrita, cursiva), brazo de separación CelZ (nucleótidos 919-969) (negrita, cursiva subrayado intercalando puntos y rayas), dominio de tetramerización (nucleótidos 976-1095) (negrita subrayado ondulado), brazo de separación CelZ (nucleótidos 1096, 1146) (negrita, cursiva subrayado intercalando puntos y rayas), Brazo de unión a celulosa de CelZ (negrita, cursiva, subrayado punteado),Secuencia de restricción (Subrayado simple).

Descripción detallada de la invención

La tecnología que se pretende patentar se refiere a la manipulación genética de plantas, concretamente la manipulación mediante introducción de genes en el genoma del cloroplasto vegetal. El desarrollo se ha realizado utilizando tabaco (Nicotiana tabacum var. Petit Havanna) como planta modelo.

La presente invención describe la combinación de dos métodos para aumentar la producción de proteínas en el cloroplasto. La invención se refiere preferentemente a enzimas, mas preferentemente endoglucanasas llevando a cabo las realizaciones prácticas concretamente con CelY y Cel1Z.

Uno de los métodos se basa en estrategias para aumentar la expresión de genes en el cloroplasto y el segundo se basa en estrategias que incrementan la estabilidad de las proteínas producidas en plantas. Si bien los métodos que se describen se aplican a la producción proteínas, preferentemente enzimas, y particularmente endoglucanasas, el método es aplicable para la producción de cualquier proteína que se mantiene funcionalmente activa.

Para llevar a cabo la integración de los genes en el cloroplasto se utilizó un vector de integración en el cloroplasto denominado pAF que dirige la integración en el cloroplasto de tabaco entre los genes trnI y trnA (Fernandez-San Millán y col, 2008). Los genes de interés se clonan primero en un plásmido intermedio, denominado pPLA (Seq Id No. 1), de forma que quedan operativamente ligados al promotor (Seq Id No. 2) y la secuencia líder (Seq Id No. 3) del gen psbA de tabaco (Figura 1a). La secuencia correspondiente al promotor y líder de psbA representa los nucleótidos 1594-1780 del genoma del cloroplasto de tabaco (accesión Z00044). El vector pPLA (Seq Id No. 1) se construyó mediante amplificación por la reacción de la polimerasa en cadena (PCR) del fragmento 1594-1780 del cloroplasto utilizando como molde una preparación de ADN genómico de tabaco y los oligonucleótidos Ppsba-D (Seq Id No. 6) y Lpsba-R (Seq Id No. 7) (Figura 2). El producto de PCR se clonó en el plásmido pGEM-T Easy (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante y se determinó su secuencia. En la figura se muestra la secuencia correspondiente al promotor de psbA y se marcan el sitio de inicio de la transcripción y el sitio de inicio de traducción que está incluido en una secuencia que representa la diana de restricción NcoI. Los elementos de control de expresión derivados de psbA promueven la expresión eficiente de genes exógenos in vivo (por ejemplo, De Cosa y col. 2001, Fernandez-San Millán y col. 2008) e in vitro (Hirose & Sugiura, 1996). El cassette constituido por gen de interés, el promotor y la secuencia líder de psbA subclona en el vector pAF, entre el gen aadA y el terminador de transcripción de psbA, formando una unidad transcripcional operativa.

Los experimentos de integración de genes en el cloroplasto se realizan como se describe en Svab y Maliga, 1993. Se parte de una preparación de ADN del vector con el gen de interés y se cubre con ella una suspensión de partículas de oro de 0,6 mieras. Las partículas se disparan sobre hojas de plantas de tabaco cultivadas en condiciones de esterilidad. Las hojas sometidas a disparo con partículas de oro se cultivan en medio RMOP, en presencia de espectinomicina (500 mg/litro), y se seleccionan brotes verdes, resistentes a espectinomicina, que crecen entre 3 y 8 semanas después del disparo de genes. Los brotes que se obtienen en ésta primera ronda de selección suelen ser heteroplásmicos (contienen células con ADN cloroplástico recombinante junto a células con ADN cloroplástico sin modificar, Svab y Maliga, 1990 y 1993), y se someten a una segunda ronda de selección en medio RMOP con espectinomicina (500 mg/litro). Los brotes que se obtienen en la segunda ronda de selección se cultivan en medio de enraizamiento esterilizado y en presencia de espectinomicina a 500 mg/litro. El medio de enraizamiento es Murashigue-Skooge pH5.7 con 30% sacarosa) Una vez que se desarrolla la raíz, las plántulas cultivadas in vitro se pasan a tierra y se llevan a cabo los siguientes análisis: i) la integración del vector en el cloroplasto mediante la reacción de la polimerasa en cadena (PCR) sobre extractos de ADN de la planta, utilizando un oligonucleótido que anilla en el ADNcp pero no en el ADN del vector pAF junto a un segundo oligonucleótido que anilla en pAF pero no en el cpADN (Respectivamente oligonucleótidos Int-R (Seq Id No. 13) e Int-D (Seq Id No. 12), Figura 2). Sólo las plantas recombinantes que hayan integrado el vector dan resultado positivo en esta reacción. La condición de homoplasmia se analiza mediante ensayos de RFLP (polimorfismo de fragmentos de restricción) utilizando una sonda que híbrida con el cpADN próximo a la zona de inserción. Se digieren extractos de ADN de plantas problema con una diana de restricción apropiada que origina diferentes fragmentos en el cpADN nativo y en el recombinante (Figura 3). La expresión de endoglucanasas se ensaya mediante reacciones con extractos crudos de plantas homplásmicas, en presencia de carboximetil celulosa al 1% (CMC, sustrato específico de endoglucanasas) en tampón 50 mM NaOAc pH5,2. La actividad CMCasa se cuantifica mediante la medición de azúcares reductores liberados por el método de Nelson Somogyi. También se analiza la expresión de endoglucanasas mediante zimogramas. Los zimogramas consisten en visualización de la actividad endoglucanasa de proteínas previamente separadas electroforéticamente. Tras la separación, los geles se incuban en presencia de 1%CMC y se tiñe con rojo Congo, de manera que las bandas protéicas correspondientes a endoglucanasas se visualizan como zonas claras en un gel teñido de rojo.

En los dos ejemplos que ilustran este trabajo, genes CelY y Cel1Z de Dickeya dadantii, se han clonado en el vector de la transformación (pAF) operativamente ligados al promotor (Seq Id No. 2), secuencia líder (Seq Id No. 3) y secuencia de terminación de la transcripción del gen psbA de tabaco. Otros vectores y promotores conocidos del estado de la técnica pueden ser empleados. Se han clonado versiones modificadas de los genes nativos, que carecen de la región que codifica el péptido de secreción (nucleótidos +4 a +69 del marco de lectura abierta de CelY y nucleótidos +4 a +130 de Cel1Z). La función del péptido de secreción en Dickeya dadantii es promover la secreción del producto al medio de cultivo en un proceso que incluye la eliminación proteolítica de dicho péptido y que da lugar al péptido maduro. Puesto que la acumulación en el estroma del cloroplasto no requiere ningún proceso de secreción, se clonaron solamente las secuencias correspondientes a los péptidos maduros a continuación del triplete de inicio de la traducción. Como control, se obtuvo una construcción que contiene el gen CelY nativo completo. Dicha construcción dio lugar a plantas seleccionadas mediante cultivo in vitro pero los brotes resultaron ser inviables en ausencia de una fuente de carbono añadida. Al pasar las plántulas de esta construcción particular a macetas, en ausencia de sacarosa añadida, amarillearon y se detuvo el crecimiento, probablemente por efectos de interferencia del péptido de secreción bacteriano con la fisiología del cloroplasto. Se ha descrito que los cloroplastos tienen sistemas de secreción homólogos a los sistemas bacterianos y este resultado sugiere que el péptido de secreción de CelY podría interferir con la fisiología normal del cloroplasto probablemente por la interacción con estos elementos comunes (Mori y Cline, 2001).

Se obtuvieron plantas recombinantes que contienen los genes CelY (Seq Id No. 30) o Cel1Z (Seq Id No. 43) nativos, sin péptido de secreción, integrados en el cloroplasto. La actividad endoglucanasa recuperable de estas plantas es muy baja (CelY) o indetectable (Cel1Z), indicando que la acumulación de producto funcional es muy reducida en ambos casos. La acumulación ineficiente de CelY y Cel1Z puede estar relacionada con una expresión (traducción) ineficiente, con la inestabilidad del producto expresado en el cloroplasto o con ambos factores. La acumulación eficiente de genes en el cloroplasto puede requerir, por tanto, el desarrollo de los métodos que se proponen para estimular la expresión genética e incrementar la estabilidad del producto.

Para promover una acumulación más eficiente de CelY y Cel1Z, se analizó, en una primera aproximación, la posibilidad de promover la expresión eficiente de los genes alterando el contexto de inicio de la traducción. Para ello, se emplearon segmentos sintéticos de ADN codificante fusionados en el extremo aminoterminal de los genes nativos, de manera que se modifica el contexto inmediatamente posterior al tríplete de inicio de la traducción, de forma similar a como se ha descrito en Ye et al, 2001, Kuroda Y Maliga 1991b. En esta solicitud de patente se compara la utilización de dos fragmentos, comprobándose que la fusión simultánea de estos dos fragmentos derivados de GFP y p53 promueven una acumulación más eficiente de ambos enzimas, más eficiente aun que la suma de la acumulación producida por la fusión individual de cada una de las secuencias por separado. Ambos fragmentos tienen en común que su secuencia codificante tiene un contenido en pares GC relativamente bajo y un uso de tripletes similar al del cloroplasto de tabaco. El objetivo de ésta selección es proporcionar un contexto inmediatamente posterior al triplete de inicio de la traducción rico en pares AT, y por tanto, con una probabilidad reducida de que el ARN mensajero forme estructuras secundarias estables que interfieran con el inicio de la traducción. El primer fragmento utilizado representa los primeros 15 aminoácidos de la proteína fluorescente verde de la medusa (GFP) (Seq Id No. 28), y se asemeja al fragmento utilizado en Ye y col (2001) (Seq Id No. 26) con la diferencia de que el fragmento utilizado en la presente invención tiene una composición de pares CG (40%) similar a la del cloroplasto de tabaco (Figura 4). Éste fragmento, difiere del fragmento utilizado por Ye y col. 2001 en 15 posiciones sobre 45 nucleótidos totales, en el contenido en GC (40% frente a 62%), y en el primer aminoácido que codifica, que ha sido alterado (glicina por serina) para poder introducir una diana de restricción NcoI adecuada para el clonaje de CelY y Cel1Z (Figura 4). El segundo fragmento sintético que se propone, codifica un péptido derivado de la ferredoxina de tabaco, adaptado también al uso de tripletes y el contenido en pares GC del cloroplasto de tabaco (Figura 1). En este caso se pretende cambiar el contexto de inicio de traducción de las celulasas introduciendo un corto fragmento que podría ser eliminado por proteasas del cloroplasto (Richter y Lamppa 2003). Los dos fragmentos que se describen en esta invención son sintéticos. Se construyeron utilizando dos pares de oligonucleótidos fosforilados y complementarios entre sí. El par de oligonucleótidos fosforilados LGFP-D(Seq Id No. 8) y LGFP-R (Seq Id No. 9) y el par de oligonucleótidos LFd-D (Seq Id No. 10)y LFd-R (Seq Id No. 11) (Figura 2) se incubaron a una concentración de 50 pmoles/microlitro en 20 mM TrispH8.0, 1 mM EDTA durante 2 minutos a 100ºC y 30 minutos a 37ºC para favorecer su anillamiento. El anillamiento de cada pareja origina un fragmento de ADN de doble cadena con extremos cohesivos compatibles con los que deja la diana de restricción NcoI y fosforilados. Estos fragmentos se ligaron al plásmido pPLA (Seq Id No. 1) digerido con NcoI utilizando Rapid DNA Ligation Kit (Roche Cat nº 11635379001) obteniéndose los vectores intermedios pPLAg (Seq Id No. 4 y 57) y pPLAf (Seq Id No. 5) cuya secuencia se muestra en la Figura 1a y 1b.

Los extractos de plantas que integran en el cloroplasto éstas fusiones traduccionales tienen una actividad endoglucanasa hasta 100 veces superior a la de las plantas que contienen la versión nativa de CelY o Cel1Z dependiendo del fragmento y del gen. El fragmento derivado de la GFP (Seq Id No. 28) promueve la traducción de CelY y Cel1Z de forma 50-100 veces más eficiente respecto a las construcciones nativas y 2-3 veces más eficiente que el fragmento derivado de la ferredoxina en el contexto del promotor, líder y terminador de psbA de tabaco. En esta patente se propone la utilización de la secuencia que se describe (Figura 4) y que se diferencia de los trabajos de Ye y col. (2001) (Seq Id No. 26)en los que se utilizó un fragmento similar, en la secuencia (15 de 45 posiciones), contenido en pares GC, y en el contexto de la secuencia líder. Es importante destacar que, como demostraron Kuroda y Maliga, (2001b), el efecto en la eficiencia de la expresión de cambios en las secuencias inmediatamente posteriores al triplete de inicio varía dependiendo del tipo de secuencia líder. Según estos autores, la eficiencia de la expresión de genes operativamente ligados a secuencias que carecen de un elemento consenso de unión a ribosomas (denominado rbs, ribosome binding site), como es el caso de psbA, tiene una dependencia del contexto de secuencia inmediatamente posterior al triplete de inicio de traducción relativamente baja. Sin embargo, este trabajo demuestra que en el contexto de la secuencia líder de psbA, que carece de un rbs canónico, la secuencia inmediatamente posterior al triplete de inicio tiene gran importancia en la modulación de la expresión génica. El trabajo de Ye y colaboradores (2001) muestra, similarmente a la presente solicitud, un efecto notable de la fusión una secuencia que codifica los primeros 15 aminoácidos de la GFP sobre la expresión de la enzima EPSPS en el cloroplasto, pero en ese caso la fusión se realiza en el contexto de las secuencias líder rbcL y G10L, que contienen sitios canónicos de unión a ribosomas. La presente invención demuestra por primera vez un efecto superior y en un contexto de inicio de traducción que se regula de manera diferente (Staub & Maliga, 1994b, Yohn y Col. 1998) respecto a los que se describen en el trabajo anteriormente citado.

De gran importancia para esta invención es la observación de que la actividad endoglucanasa extraíble de plantas que integran CelY y Cel1Z decae con la edad de las hojas que se muestrean. En plantas que integran las versiones nativas de CelY o Cel1Z, sólo se detecta actividad endoglucanasa significativa en las hojas jóvenes y en las primeras hojas completamente expandidas. En plantas que contienen la fusión aminoterminal derivada de la GFP, la actividad extraíble de hojas maduras se reduce a la mitad respecto a las hojas expandidas más jóvenes. Se han observado fenómenos similares en otros casos de genes clonados bajo el promotor y líder de psbA (Molina y Col. 2004) que indican que este patrón de expresión es característico de genes integrados en el cloroplasto bajo el control de la secuencia líder de psbA. La estabilidad de los productos durante la maduración de las hojas es un factor limitante para la producción de enzimas de uso industrial en plantas.

La presente invención describe la utilización de un elemento, el dominio de tetramerización de la proteína p53, en adelante denominado DTp53 (Seq Id No. 35), para favorecer la estabilidad de las enzimas producidas en plantas, de forma similar al empleo del mismo dominio para favorecer la acumulación de un antígeno en plantas tal como se describe en la patente D2. El dominio de tetramerización favorece la formación de estructuras multiméricas (dímeros y tetrámeros) por la interacción que se establece entre los dominios DTp53 de distintas subunidades. Dicha interacción da lugar a complejos muy estables cuya estructura se ha analizado detalladamente en el caso de la p53, y que dejan expuestos los diferentes dominios efectores de la proteína en posiciones espacialmente definidas
(Tidow y col. 2007).

Con el fin de evitar interferencias del dominio de tetramerización con la eficiencia de la traducción de CelY o Cel1Z, se diseñaron construcciones en las que DTp53 se fusiona a los genes de interés en regiones distales respecto al inicio de traducción. En el caso concreto de la celulasa CelY, el DTp53 se fusionó operativamente al extremo carboxiterminal del péptido nativo, ya que la inserción en otras regiones puede alterar el plegamiento adecuado del único dominio estructural de esta proteína. La formación de dímeros o tetrámeros dejaría expuesto el único dominio catalítico de CelY de forma análoga al dominio aminoterminal de la p53. En el caso de Cel1Z hay más posibilidades. El péptido maduro de Cel1Z, y el de muchas otras celulasas, está constituido por dominios estructurales y funcionales separados por cortos brazos peptídicos (brazo espaciador) que separan estos dominios y, probablemente, proporcionan una estructura flexible que reduce las interferencias esféricas entre los dominios funcionales (Brun y col. 1997). Cel1Z, al igual que muchas celulasas descritas, consta de un dominio catalítico grande (Seq Id No. 50), implicado en la actividad enzimática de interés, y un segundo dominio de menor tamaño, con afinidad por el sustrato, que se denomina dominio de unión a celulosa (Seq Id No. 47), y favorece el acceso del dominio catalítico al sustrato. Algunas celulasas tienen dominios estructurales adicionales. En el caso de Cel1Z, el dominio de tetramerización se fusionó en el brazo de separación (Seq Id No. 46) de manera que las hipotéticas estructuras multiméricas resultantes tienen una disposición espacial análoga a los diferentes dominios estructurales y funcionales de la p53: un dominio aminoterminal grande, que en el caso de Cel1Z corresponde al dominio catalítico (Seq Id No. 50), separado del dominio de unión a celulosa (Seq Id No. 52) por DTp53 (Seq Id No. 36) y el péptido de separación nativo (Seq Id No. 51). En el caso de que la proteína resultante formara complejos multiméricos, esperaríamos obtener estructuras análogas a la de la p53, probablemente sin interferencias estéricas entre los dominios funcionales.

En esta invención se demuestra que la fusión del dominio DTp53 afecta la estabilidad de los productos en plantas. En el caso concreto de la celulasa CelY nativa (sin fusión aminoterminal), la fusión carboxiterminal del dominio DTp53 afecta significativamente a la acumulación del producto en hojas expandidas jóvenes y viejas, pero las diferencias más significativas se observan al comparar hojas viejas. En el caso particular de CelY fusionada al fragmento derivado de la GFP, no se observan diferencias significativas en la expresión de CelY en hojas expandidas, sin embargo, la acumulación del producto y la actividad extraíble en hojas viejas es aproximadamente el doble en el caso de la variante fusionada a DTp53. Los resultados observados demuestran una estabilización diferencial de CelY-DTp53 en hojas viejas respecto a CelY no fusionada y otras proteínas del cloroplasto. La fusión carboxiterminal de DTp53 no afecta significativamente a la actividad específica de la endoglucanasa sobre CMC y favorece la obtención de mayor cantidad de producto en el conjunto de la planta, incluyendo hojas expandidas que van a entrar en senescencia. Así, queda demostrado que las plantas de la invención acumulan la proteína de interés como producto mayoritario, independientemente de su estado de maduración siendo especialmente mayor la acumulación en hojas maduras, entre un 5 y un 10% mayor en términos relativos al contenido total de proteínas que en las hojas jóvenes. Esta mejora en la estabilidad facilita la recuperación de producto y permite recolectar las hojas en un orden que no interfiere con el crecimiento del cultivo.

En el caso concreto de Cel1Z, la fusión del dominio DTp53 incrementa la extracción de endoglucanasas. El incremento es de un 300% en el caso de la Cel1Z nativa y de un 50% en el caso de Cel1Z fusionada al fragmento derivado de la GFP. Los zimogramas demuestran que Cel1Z sufre en el cloroplasto de tabaco proteolisis parcial y se observa que la fusión de DTp53 altera el patrón de proteolisis de la proteína. Sólo en el caso de Cel1Z fusionada a DTp53 se observan unas bandas de elevado peso molecular con actividad endoglucanasa que pueden corresponder a complejos multiméricos de Cel1Z. Los resultados sugieren que el brazo de separación de Cel1Z es un dominio susceptible de proteolisis en el cloroplasto y que el dominio de tetramerización protege parcialmente de la proteolisis y permite incrementar la actividad recuperable.

Una consideración importante sobre esta innovación metodológica es que la producción de proteínas en plantas favorecida por la utilización del dominio de tetramerización de la p53 no sólo permite obtener mayor cantidad de producto y actividad (en el caso de las endoglucanasas, actividad endoglucanasa medida sobre un sustrato soluble), sino que da lugar a la obtención de un producto nuevo, proteína o enzima quimérica que presenta una estabilidad mejorada respecto a la proteína/enzima original.

Así, la formación de estas estructuras multiméricas estables puede afectar a las siguientes propiedades de las enzimas:

1)

Afinidad por el substrato: en el caso de las enzimas celulósicas, que presentan dominios funcionales separados, la organización en tetrámeros altera la configuración espacial de los dominios de unión a celulosa incrementando la afinidad por el sustrato (celulosa en este caso).

2)

Estabilidad del producto durante la reacción: aunque la formación de estas estructuras puede alterar la estabilidad en diferentes condiciones de ensayo (temperatura, pH etc.), la catálisis propiamente dicha no se ve afectada.

3)

Actividad sobre un sustrato insoluble puede estar afectada también por la agregación de subunidades catalíticas en un mismo complejo. Es el caso de algunos microorganismos celulolíticos -por ejemplo las bacterias de los rumiantes- que producen enzimas que se organizan en forma agregada.

Así, el método propuesto por la invención permite la obtención de proteínas/enzimas quiméricos que, gracias a las estrategias de fusión simultánea de la versión modificada de los 15 primeros aminoácidos de la GFP, junto con la fusión del dominio de tetramerización de la p53, presentan propiedades mejoradas en cuanto a estabilidad del producto, y actividad sobre un sustrato insoluble.

Ejemplos Ejemplo 1 Expresión en cloroplastos de la endoglucanasa codificada por el gen CelY de Dickeya dadantii

El gen CelY (Accesión nº M74044) de Dickeya dadantii codifica una endoglucanasa (E.C.3.2.1.4) de pequeño tamaño que hidroliza enlaces \beta(1-4) glucosa de la celulosa favoreciendo la des-polimerización de las largas cadenas de glucosa que constituyen este polímero de la pared celular de las plantas. Esta actividad es utilizable en el proceso industrial de conversión de la biomasa celulósica en bioetanol y en otros procesos de la industria textil o papelera que utilizan endoglucanasas.

Como fuente genética se utilizó un producto de ADN amplificado mediante la reacción en cadena de la polimerasa en el laboratorio del Dr. Pablo Rodríguez Palenzuela (E.T.S.I.Agrónomos, Universidad Politécnica de Madrid) quién amablemente proporcionó el mencionado producto. El producto de PCR fue clonado en un plásmido bacteriano y secuenciado (Figura 5). La secuencia resultó ser idéntica a la publicada (accesión M74044).

A partir de este clon se obtuvieron 6 construcciones diferentes de CelY, operativamente ligadas al promotor (Seq Id No. 2) y secuencia líder (Seq Id No. 3) de psbA. Las seis construcciones se obtuvieron mediante el ligamiento de productos de PCR que representan el gen CelY completo, o una versión que carece del péptido de secreción, en las posiciones NcoI y XbaI del plásmido intermedio pPLA o las variantes pPLAg y pPLAf descritas en el anterior apartado.

1.

pPLA-Yc: se amplificó, mediante PCR, (VENT_{R} DNA polimerasa, New England Biolabs, cat nº: M0254S) un fragmento de 1010 pares de bases (PCR Yc) utilizando los oligonucleótidos celY1D (Seq Id No. 14) y celYR (Seq Id No. 15) (Figura 2) que representa el gen CelY completo y flanqueado por las dianas NcoI y XbaI. El producto de PCR se purificó mediante electroforesis preparativa en agarosa y se extrajo del fragmento de agarosa con QIAquik Extraction Kit (QIAGEN, Cat: 28704). El fragmento purificado se digirió con NcoI y XbaI (New England Biolabs) y se ligó al plásmido pPLA, similarmente digerido, usando un "kit" comercial de ligamiento rápido (Rapid Ligation Kit, Roche Cat.). Se transformaron células DH5\alpha químicamente competentes y se seleccionaron colonias que contienen el plásmido ligado al fragmento de interés y cuya secuencia coincide con la original.

2.

pPLA-Yi (Figura 6): se amplificó, mediante PCR, un fragmento de 956 pb (PCR-Yi) que representa los nucleótidos +70 a +999 del marco de lectura de CelY precedidos de un triplete de inicio de traducción y flanqueado por las dianas NcoI y XbaI. Este fragmento codifica una proteína equivalente a la celulasa CelY madura, sin péptido de secreción. Se utilizaron los oligonucleótidos celY2D (Seq Id No. 16) y celYR (Seq Id No. 17) y el fragmento de PCR se clonó en pPLA de forma similar a pPLA-Yc.

3.

pPLA-Yg (Seq Id No. 38) (Figura 6): se obtuvo mediante el clonage de la PCR-Yi, mencionada en el anterior apartado, en el plásmido pPLAg (Seq Id No. 4) utilizando las mismas dianas de restricción. En esta construcción el extremo 5' del marco de lectura abierta del gen CelY, equivalente a la celulasa madura, está precedido de un fragmento de ADN, de 45 pares de bases, que codifica los 15 primeros aminoácidos de la GFP (Seq Id No. 28). Este fragmento determina el contexto de inicio de traducción (Figura 6). El marco de lectura abierta resultante codifica una proteína de fusión que representa los 15 primeros aminoácidos de la GFP (Seq Id No. 29) seguidos de un residuo de metionina y la celulasa CelY madura.

4.

pPLA-Yf (Seq Id No. 39) (Figura 6) se obtuvo mediante el clonage de la PCR-Yi, en el plásmido pPLAf utilizando las mismas dianas de restricción. En esta construcción el extremo 5' del marco de lectura abierta del gen CelY que representa el péptido maduro (Seq Id No. 31), está precedido de un fragmento sintético de ADN, de 54 pares de bases, que codifica los aminoácidos 28-47 del péptido de tránsito de la ferredoxina de tabaco (Seq Id No. 33) y que determina el contexto de inicio de la traducción (Figura 1). El marco de lectura abierta resultante codifica una proteína de fusión que representa los aminoácidos 28-47 de la ferredoxina (Seq Id No. 34) seguidos de un residuo de metionina y la celulasa CelY madura.

5.

pPLA-Yt (Seq Id No. 40) (Figura 6) Se obtuvo en dos etapas de clonaje. Primero se amplificó, mediante PCR, un fragmento de CelY que representa la proteína CelY madura sin el triplete de parada original por eliminación del residuo 999 (timidina) del marco de lectura abierta de CelY. Se emplearon los oligonucleótidos celY2D (Seq Id No. 16) y celYTR (Seq Id No. 17). El producto de PCR se clonó en pPLA (Seq Id No. 1) digerido con NcoI y XbaI similarmente a las construcciones anteriores. En la segunda etapa se amplificó mediante PCR una secuencia que contiene el dominio de tetramerización de la p53 (amablemente provista por el Dr. José Angel Martínez-Escribano) utilizando dos oligonucleótidos TetraXX-D (Seq Id No. 19) y TetraXX-R (Seq Id No. 20), que amplifican un fragmento de 140 pb flanqueado por dianas XbaI en ambos extremos que contiene 120 pb que representan el dominio de tetramerización de la p53 humana (accesión P04637). El fragmento de PCR se clonó en el sitio XbaI situado en el extremo 3' del clon obtenido en la primera etapa y se seleccionaron las construcciones que insertaron el fragmento en el sentido apropiado. La construcción resultante contiene, bajo el promotor (Seq Id No. 2) y líder (Seq Id No. 3) de psbA, un marco de lectura que representa a la proteína CelY madura seguido de una corta secuencia espaciadora (5' TATCTAGAT 3') que codifica el triplete tyr-leu-asp y del dominio de tetramerización de la p53 (DTp53) (Seq Id No. 35).

6.

pPLA-Ygt (Seq Id No. 41): se obtuvo de forma similar a pPLA-Yt (Seq Id No. 40) con la diferencia de que los clonajes se realizaron en pPLAg (Seq Id No. 4). La construcción resultante contiene, bajo el promotor (Seq Id No. 2) y líder (Seq Id No. 3) de psbA, un marco de lectura que representa los 15 primeros aminoácidos de la GFP (Seq Id No. 28), la proteína CelY madura (Seq Id No. 31), un triplete espaciador tyr-leu-asp y el dominio de tetramerización de la p53 (DTp53) (Seq Id No. 35).

En la Figura 6 se representan las secuencias de las variantes obtenidas. Para obtener las construcciones en el vector de integración pAF que se describe en Fernandez-San Millán y col. 2008). Para los clonajes en pAF, se obtuvo un fragmento de ADN correspondiente al promotor y líder de psbA operativamente ligado al marco de lectura abierto que incluye el gen CelY (Seq Id No. 31) mediante digestión de los plásmidos intermedios con KpnI y NotI. Estos fragmentos se clonaron, utilizando los métodos descritos anteriormente, en pAF similarmente digerido, obteniéndose los siguientes clones: pAF-Yc, pAF-Yi, pAF-Yf, pAF-Yg, pAF-Yt y pAF-Ygt. Se comprobó la secuencia del fragmento integrado mediante secuenciación parcial de los plásmidos resultantes.

Integración en el cloroplasto de CelY

A partir de cultivos bacterianos de los clones pAF-Yc, pAF-Yi, pAF-Yf, pAF-Yg, pAF-Yt y pAF-Ygt se obtuvieron preparaciones de ADN plásmídico utilizando QIAprep Spin Miniprep Kit de QIAGEN (Cat: 27106). El ADN plásmídico de las preparaciones se cuantificó midiendo la densidad óptica a 260 nm. Se mezcló 1 \mug de cada preparación de ADN con 3 mg de partículas de oro (conservadas a 60 mg/ml en 50% glicerol a -20ºC) en un volumen de 60 \mul. A continuación se añadió un volumen de 2,5M CaCl2 y 0,4 volúmenes de espermidina 0,1M y la suspensión se incubó a 4ºC con agitación constante durante 20 minutos para cubrir las partículas de ADN. La suspensión se lavó 5 veces con 4 volúmenes de etanol absoluto en frío y se resuspendió en un volumen final de 30 \mul de etanol. Con estas preparaciones se dispararon hojas expandidas de tabaco (6-8 cm, Nicotiana tabacum var. Petit Havanna) cultivado en condiciones de esterilidad en medio Murashigue&Scooge (M&S) a pH5.7 con 30% sacarosa y 0,6% agar de plantas (PLANT AGAR, Duchefa, Cat:P1001). Se utilizaron 5 \mul de suspensión por cada hoja y el bombardeo de plantas se realizó siguiendo las instrucciones del aparato biolístico PDS1000/He de BIO-RAD. Se disparó el envés de las hojas de tabaco (4-5 por construcción) y éstas se cultivaron 48 h en medio RMOP con 0,6% MICRO AGAR (DUCHEFA Cat. M1002) a 27ºC en la oscuridad. A continuación se cortaron fragmentos de unos 0,5 cm de lado y se incubaron en RMOP, 0,6% agar, 500 mg/litro espectinomicina, con el envés en contacto con el medio, a 27ºC y 16 horas diarias de luz durante 4-8 semanas. En este periodo crecieron un número variable de brotes de color verde (entre 0 y 15) por cada hoja bombardeada. Cada brote se considera un clon. Se cortaron fragmentos de 0,5 cm de estos brotes y se sometieron a una segunda ronda de selección en RMOP-espectinomicina similar a la primera. Tras la segunda ronda de selección se obtuvieron numerosos brotes verdes que se pasaron a medio de enraizamiento (M&S pH5.7, 30% sacarosa, 0,6% agar) con espectinomicina a 500 mg/litro. Tras el enraizamiento, se pasaron a cultivo en tierra unos 5-10 brotes por clon.

Análisis de integración

Para analizar la integración del vector en el cloroplasto de tabaco se realizaron extractos de ADN a partir de fragmentos de hoja de 0,1 g de plantas de la primera generación cultivadas en tierra. El material vegetal se pasó a un eppendorf y se homogeneizó en fresco con un buril de plástico en presencia de 0,2 ml de tampón de extracción (1% CTAB, 50 mM Tris-HCl pH8.0, 0,7M NaCl, 10 mM EDTA, 0.5% PVP y 0.1% 2-Mercaptoetanol) y el homogeneizado se incubó 1 hora a 60ºC. El extracto se extrajo en 0,5 ml de cloroformo:isoamílico (24:1) mezclando con un vorteador y se separaron las fases mediante centrifugación (5 min a 10.000 rpm). La fase acuosa se pasó a tubos nuevos y se precipitó el ADN añadiendo un volumen de isopropanol e incubando 20 minutos a -20ºC. El ADN de la planta se recuperó mediante centrifugación (10 min a 14.000 rpm), se lavó con 1 ml de 70% etanol y se resuspendió en 20 \mul de agua estéril.

Se analizó la integración del vector en la planta mediante PCR utilizando los oligonucleótidos Int-D (Seq Id No. 12) e Int-R (Seq Id No. 13) que anillan respectivamente con secuencias de pAF y del cpADN. Se obtuvieron productos de PCR de tamaño esperable en plantas que han integrado el vector. La integración y la homoplasmia se analizó también mediante análisis de polimorfismo de fragmentos de restricción que se basa en la digestión de ADN de la planta con una enzima de restricción apropiada, cuyo patrón de restricción es alterado por la integración del vector y la detección de los fragmentos mediante técnicas de hibridación molecular (Figura 3). También se analizó la presencia del gen CelY en las preparaciones de ADN de plantas mediante PCR con los oligonucleótidos celY2D (Seq Id No. 16) y celYR (Seq Id No. 15).

Todas las construcciones utilizadas dieron lugar a varios clones (brotes de primera ronda) a partir de los que se obtuvieron, tras la segunda ronda de selección plantas homoplásmicas. En general, el 50% de las plantas obtenidas tras dos rondas de selección resultaron ser homoplásmicas. Las plántulas obtenidas con la construcción pAF-Yc no son viables en cultivo en tierra. No crecen, amarillean y entran en senescencia. Deducimos que el péptido de secreción de CelY interfiere con la fisiología del cloroplasto.

Análisis de expresión génica de CelY

En el caso de CelY, los análisis de expresión se hicieron mediante ensayos de actividad enzimática recuperable de extractos crudos de planta y, en algunos casos, mediante análisis cuantitativo de proteínas separadas mediante electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE). El análisis de actividad proporciona información directa sobre la utilidad industrial del producto y sobre la actividad específica de las enzimas quiméricas.

Actividad endoglucanasa extraíble de plantas que integran CelY en el cloroplasto

En un primer ejemplo, se comparó la actividad endoglucanasa de extractos crudos de proteínas obtenidos a partir de la primera generación de plantas homoplásmicas. Se utilizaron plantas que han desarrollado al menos 6 hojas durante el cultivo en tierra. Se tomaron muestras de hoja consistentes en discos de hoja tomados con sacabocados de 8 mm de diámetro. En este particular ejemplo, se analizó cada planta por separado tomando muestras de 8 discos (unos 80 mg en promedio) procedentes de las varias hojas expandidas de cada planta. Las muestras se homogeneizaron en fresco, en tampón de extracción (0,1 M TrisClH pH6.8, 0,5M NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% 2-mercaptoetanol), utilizando buriles de plástico que se adaptan a la forma del eppendorf. La relación peso:volumen de los extractos es de 1:5 (80 mg en 0,4 ml tampón). Tras la homogeinización, las proteínas se solubilizaron mezclando 3 veces con un vorteador, durante 30 segundos, a máxima velocidad. Los extractos se centrifugaron durante 3 minutos a 12.000 rpms para separar el residuo vegetal. Se emplean diluciones seriadas del sobrenadante para medir la actividad endoglucanasa sobre carboximetilcelulosa (CMC). Las reacciones se montaron en un volumen de 0,5 ml de 1% CMC, 50 mM NaOAc pH5.2 y 2 mM MgCl2 durante 1 hora a 50ºC. La actividad se midió cuantificando los azucares reductores liberados por el método de Somogyi Nelson (colorante DNS). Se añadieron a cada reacción 0,3 ml de reactivo DNS (Somogyi Nelson Dye), 1,2 ml de agua y se incubaron 10 minutos a 100ºC. Se midió la absorbancia de la solución a 540 nm frente a un blanco incubado con tampón. Los azúcares reductores liberados se calcularon frente a una curva patrón de glucosa. Se calcularon los micromoles liberados en 60 minutos y se obtuvieron valores en Unidades Internacionales (micromoles/minuto) relativos al peso fresco de hoja equivalente utilizado en la reacción. De cada extracto se ensayaron diluciones apropiadas y, para la cuantificación se utilizó la dilución que proporciona un valor próximo a 0,3 micromoles para seleccionar el rango lineal de la reacción. Se cuantificaron los azúcares presentes en el extracto, ya que pueden interferir con la medición cuando se ensayan diluciones de 1:20 o inferiores. En su caso, se restó el promedio de azúcares reductores que se detectan en el mismo extracto incubado similarmente en ausencia de CMC.

Los resultados de actividad obtenidos con extractos de PGMs de primera generación se resumen en la Tabla 1 e indican que: i) no se detecta actividad endoglucanasa significativa en plantas normales ya que no se detectan diferencias significativas entre los micromoles medidos en presencia y en ausencia de CMC. ii) Los extractos de plantas transformadas con pAF-Yi (CelY nativa) tienen una actividad promedio de 0,3 IU/g de tejido fresco. Esto sugiere que el gen CelY nativo se expresa en el cloroplasto bajo el control del promotor y líder psbA aunque se recuperan niveles relativamente reducidos de actividad endoglucanasa. iii) En el contexto de inicio de traducción que proporcionan las secuencias sintéticas derivadas de la GFP (pAF-Yg) y de la ferredoxina (pAF-Yf), el gen CelY se expresa con mayor eficiencia ya que se recupera una actividad endoglucanasa 80 veces y 12 veces superior, respectivamente, respecto a las plantas que contienen la versión nativa de CelY y iv) la fusión carboxiterminal del dominio de tetramerización de la p53 promueve una recuperación de una actividad 2 veces superior, tanto en el contexto de CelY nativa como en el contexto de CelY fusionada al fragmento derivado de la GFP. Por tanto, los efectos observados sobre la actividad enzimática recuperable, alterando el contexto de inicio de la traducción (fusiones aminoterminales de la GFP o ferredoxina), o al fusionar el dominio de tetramerización en el extremo carboxiterminal de CelY son aditivos, en concreto, los efectos sobre actividad enzimática recuperable son sinergístico en el caso de GFP y p53. Los resultados también indican que la fusiones que propone esta solicitud de patente, no afectan a la actividad catalítica de CelY.

TABLA 1

1

En este ejemplo particular se analizó también la expresión de CelY mediante separación electroforética de proteínas de los extractos y tinción con azul de Coomassie. A partir de plantas de primera generación que han integrado pAF-Yi, pAF-Yf, pAF-Yg y pAF-Yt se obtuvieron extractos en condiciones desnaturalizantes (en presencia de 2% SDS y calentando el extracto a 100ºC), se cargaron en geles desnaturalizantes de poliacrilamida al 12% y se tiñeron con azul de Coomassie. En plantas que integran pAF-Yg, pAF-Yf, pero no en plantas que integran pAF-Yi p pAF-Yt se observó una banda protéica cuyo peso molecular es el esperable (unos 36 kDa) para las correspondientes proteínas recombinantes (Figura 7a) indicando que la expresión de estas construcciones es muy eficiente. En el caso de pAF-Yt, la visualización de una banda específica no es tan evidente pero se detecta en un gel del 10% Acrilamida-SDS (Figura 7b), y su peso molecular aparente es de unos 38 kDa. Estos resultados demuestran que las dos estrategias que se presentan en esta solicitud de patente promueven una expresión y/o acumulación más eficiente de CelY en el cloroplasto de tabaco, más eficiente aun que la suma de la expresión promovida mediante el empleo de las dos estrategias por separado.

Estabilidad de la proteína y acumulación de CelY en plantas

Los diferentes tipos de modificaciones introducidas en el gen CelY, cuya utilidad se contempla en la presente solicitud, tienen efectos sinergísticos sobre la productividad de la endoglucanasa CelY planta, lo que sugiere que su modo de acción sobre la expresión y estabilidad es diferente. Con el fin de analizar la estabilidad del producto en plantas se realizaron ensayos de actividad CMCasa con extractos de hojas de tabaco en distintos estados de desarrollo. Para ello, se tomaron muestras de las dos hojas expandidas más próximas al ápice (hojas "jóvenes") y de las dos hojas expandidas no senescentes más alejadas (hojas "maduras") del ápice en plantas de tabaco con 10-12 hojas. Se tomaron muestras procedentes de plantas transformadas con las construcciones pAF-Yi, pAF-Yt, pAF-Yg y pAF-Ygt. En este experimento cada muestra contiene 8 discos de hoja procedentes de las dos primeras o de las dos últimas hojas de 4 plantas distintas (4 discos por hoja). La extracción y medición de la actividad endoglucanasa se realizó como en el ejemplo anterior. Se ensayaron distintas diluciones de cada muestra por triplicado y se seleccionó la más apropiada para la cuantificación de azúcares reductores liberados. Los promedios de actividad medida se sumarizan en la tabla 2.

Los resultados obtenidos presentados en dicha tabla muestran que las diferencias de actividad observadas entre variantes de CelY son más acusadas en hojas maduras. La acumulación de las variantes fusionadas al dominio de tetramerización es mucho mayor en las hojas viejas. Se deduce que el efecto sinergístico de las dos modificaciones introducidas se debe a que las fusiones aminoterminales favorecen la expresión en hojas jóvenes y la fusión carboxiterminal del dominio de tetramerización favorece la estabilidad del producto durante la maduración. Las plantas que expresan CelY nativa pierden toda la actividad a medida que la hoja madura. Estos resultados están en concordancia con otras observaciones que sugieren que el promotor de psbA es especialmente activo en las hojas jóvenes (Molina y col, 2004).

TABLA 2

2

En un tercer ejemplo se analizó la estabilización de CelY mediada por la fusión con el dominio DTp53 con mayor detalle, comparando la expresión de Yg e Ygt, ya que la elevada expresión de CelY en estas plantas permite un análisis cuantitativo de la expresión. En este experimento particular se tomaron muestras de hoja "joven" (la primera hoja expandida de unos 15 cm) de 5 plantas normales, 5 plantas "Yg" y 5 plantas "Ygt" y se compararon con muestras de hoja "madura" de las mismas plantas. Cada muestra consiste en 10 discos de hoja (2 discos por hoja). Las muestras se homogeneizaron en 5 volúmenes (0,5 mi) de tampón de extracción (0,1M Tris pH6,8, 0,5M NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% 2 mercapto etanol). Se cuantificó el contenido en proteínas de los extractos por el método de Bradford (BIO-RAD PROTEIN ASSAY Cat: 500-0006) comparando frente a un estándar de BSA (albúmina sérica bovina). Se analizó el contenido en proteínas de los extractos mediante electroforesis en un gel desnaturalizante y tinción con azul de Coomassie. Se identificaron las proteínas de los extractos con actividad endoglucanasa mediante un zimograma de las proteínas separadas electroforéticamente y se analizó la actividad endoglucanasa de los extractos mediante ensayo de diluciones apropiadas sobre CMC como se describe en los ejemplos anteriores. Para la separación electroforética de proteínas, se diluyó una parte del extracto en proporción 1:5 en tampón desnaturalizante (0,1M TrisCIH pH6.8, 0,2% SDS, 20%glicerol, 0,1% azul de bromofenol) y las muestras se cargaron -sin calentar- en 2 geles idénticos de 10% acrilamida y 0,1% SDS. Uno de los geles se tiñó con azul de Coomassie y se fotografió con una cámara digital sobre un transiluminador de luz fluorescente (Figura 8a). El segundo gel se procesó para el zimograma de la siguiente manera: se lavó 3 veces 200 ml de 1% Tritón X-100 para eliminar el SDS, se equilibró en 50 mM NaOAc pH 5,2 durante 1 hora a 4ºC para favorecer la renaturalización de las proteínas, se incubó durante 1 hora en 1% CMC 50 mM NaOAc a 37ºC, se tiñó con 1% Rojo Congo (que se une a CMC) durante 20 min a Tª ambiente, y se destiñó con varios lavados en 0,5M NaCl. El resultado es un gel de color rojo con zonas desteñidas correspondientes a proteínas con actividad endoglucanasa que fue fotografiado con una cámara digital sobre un transiluminador de luz fluorescente (Figura 8b). La cuantificación de proteínas (Tabla 3) indica que las muestras de hoja "joven" tienen un contenido en proteínas mayor (alrededor de 1 mg/ml) que las hojas maduras (0,6 mg/ml). Esa diferencia se manifiesta en el gel teñido con azul de Coomassie en el que se cargaron volúmenes equivalentes de extracto, no de proteína (Fig. 8a). En hojas jóvenes de planta normal (carril 1) la proteína más intensamente teñida es la ribulosa carboxilasa del cloroplasto (RUBISCO) con un peso molecular aparente de 54 kDa. En hojas jóvenes de plantas Yg ó Ygt se detecta otra proteína muy abundante con un peso molecular aparente aproximado de 36 kDa (Yg, carriles 2 y 3) y 39 kDa, (Ygt, carriles 4 y 5) que corresponde al peso molecular esperable de las respectivas variantes quiméricas de CelY. Ambas proteínas se tiñen con intensidad similar a RUBISCO. Se observa que la cantidad de CelY extraíble de las primeras hojas expandidas es muy similar en el caso de Yg e Ygt, en concordancia con una actividad endoglucanasa observada de 53,6 y 52,0 IUs/gramo de peso fresco respectivamente en esas hojas. En hojas maduras, por el contrario, se observa una acumulación diferencial de Ygt respecto a Yg o RUBISCO. Las hojas maduras que expresan Ygt (carriles 8 y 9) acumulan, aproximadamente, el doble de producto que las hojas maduras que expresan Yg (carriles 6 y 7). El zimograma (Figura 8b) muestra que las bandas protéicas identificadas como proteínas Yg e Ygt tienen actividad endoglucanasa por lo que deben corresponder a los productos del gen CelY. Este experimento indica que el dominio de tetramerización DTp53 no altera significativamente la expresión en hojas jóvenes. La fusión a DTp53 afecta principalmente a la acumulación del gen CelY durante la maduración de las hojas, lo que sugiere una estabilización de la proteína CelY. Esta acumulación diferencial se refleja en la actividad endoglucanasa extraíble de hojas maduras, tanto en términos de actividad por gramo de tejido fresco como en términos de actividad en relación a la proteína total extraída (Tabla 3). En hojas que expresan Ygt la actividad endoglucanasa observada es de 18,3 IU de CMCasa por miligramo de proteína extraída, mientras que en plantas que expresan Yg es de 8,9 IU de CMCasa por miligramo de proteína.

TABLA 3

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Ejemplo 2 Expresión en cloroplastos de la endoglucanasa codificada por el gen Cel1Z de Dickeya dadantii Obtención y clonaje de Cel1Z en el vector de transformación pAF

En este ejemplo particular, el gen Cel1Z (Seq Id No. 43) fue clonado y aislado de forma similar a como se describe en el caso de CelY a partir de un producto de PCR amablemente cedido por el Profesor Pablo Rodríguez Palenzuela. El producto fue clonado en el vector pGEM-Teasy (Promega, Cat nº: A3610) y se obtuvo la secuencia completa del fragmento (Figura 9). La secuencia (Seq Id No. 43) resultó ser casi idéntica a la secuencia publicada de la endoglucanasa Z de Erwinia chrysanthemi (Ahora Dickeya dadantii, Accesión Y00540). Se encontraron 2 diferencias. La secuencia obtenida tiene una delección de un residuo de adenina (A) en la posición +1096 y una adición de un residuo de adenina en la posición +1162 del marco de lectura abierta de Cel1Z. Creemos que las diferencias observadas se deben a artefactos en el clon secuenciado en Y00540 ya que la secuencia deducible de aminoácidos a partir de Y00540 difiere de la secuencia publicada de la proteína Cel1Z (P07103). Por el contrario, la secuencia de aminoácidos deducible del clon utilizado en este trabajo es idéntica a la de P07103.

A partir de este clon, se amplificó, mediante la reacción de la polimerasa en cadena (PCR), un fragmento que representa los nucleótidos 130-1282 correspondientes a la endoglucanasa Z madura precedida del triplete ATG de inicio de traducción. Para ello, se utilizaron los oligonucleótidos Cel1Z-D2 (Seq Id No. 21) y Cel1Z-R2 (Seq Id No. 22) (Figura 2) que añaden dianas BspHI y XbaI flanqueando, respectivamente, los extremos 5' y 3' del marco de lectura abierto de la endoglucanasa Z. El producto de PCR fue clonado en los plásmidos pPLA (Seq Id No. 1), pPLAg (Seq Id No. 4) y pPLAf (Seq Id No. 5) previamente descritos (Figura 1), digeridos con NcoI y XbaI de forma similar a como se describe en el ejemplo 1, ya que los extremos cohesivos que generan BspHI y NcoI son compatibles entre sí. De esta manera se obtuvieron los clones pPLA-Zi, pPLA-Zg y pPLA-Zf, que de forma similar a pPLA-Yi, pPLA-Yg y pPLA-Yf, difieren en el contexto de secuencia inmediatamente posterior al triplete de inicio de la traducción determinado por la secuencia líder de psbA: i) en el caso particular de pPLA-Zi, la secuencia inmediatamente posterior al triplete de inicio de la traducción representa la secuencia nativa de la endoglucanasa Z madura (Seq Id No. 48), ii) en el caso particular de pPLA-Zg, el contexto de secuencia inmediatamente posterior al triplete de inicio de traducción corresponde a una fragmento sintético que codifica los primeros 15 aminoácidos de la GFP descrita (Seq Id No. 29) en el anterior ejemplo (Figura 1) y iii) en el caso particular de pPLAZf, el contexto de secuencia inmediatamente posterior al triplete de inicio de traducción corresponde a un fragmento sintético que codifica los aminoácidos 28-47 de la ferredoxina de tabaco (Seq Id No. 33) (Figura 1). El objeto de estas construcciones es analizar los efectos de las secuencias inmediatamente posteriores al triplete ATG en la expresión de genes bajo el control del promotor y secuencia líder de psbA.

Adicionalmente, se construyó una versión quimérica de la endoglucanasa Z fusionada al dominio de tetramerización DTp53 (Seq Id No. 53) con el objetivo de analizar sus efectos sobre la estabilidad de proteína. La endoglucanasa Z, a diferencia de CelY es una proteína de estructura modular con dominios estructurales-funcionales diferenciados (Figura 9). La proteína madura consta de un dominio aminoterminal con función catalítica (aminoácidos 1-289, Seq Id No. 50) seguido de un brazo de separación (aminoácidos 290-323 Seq Id No. 51) y un dominio con afinidad por celulosa (aminoácidos 324-383, Seq Id No. 52) (Brun y Col, 1997). En principio, el dominio DTp53 se puede fusionar en el extremo aminoterminal, en el extremo carboxiterminal, o en el brazo de separación. La fusión al extremo aminoterminal se descartó porque puede interferir con la expresión del gen. La fusión de DTp53 en el brazo de separación de la endoglucanasa Z mimetiza la estructura de la p53, que consta de un dominio aminoterminal grande y de un dominio aminoterminal de menor tamaño separados por el dominio de tetramerización (Tidow y Col. 2007). En el caso de que la proteína quimérica formara dímeros o tetrámeros equivalentes a la p53, el complejo resultante tendría una estructura que expone 2 dominios de unión a celulosa espacialmente próximos entre sí, pudiendo afectar a la afinidad del complejo por la celulosa. Esta estructura tiene gran interés ya que la afinidad por celulosa es un factor importante en la actividad de las celulasas. Esta organización de dominios es conceptualmente similar a la de los complejos multiprotéicos que forman algunas bacterias celulolíticas como Clostridium cellulovorans, que constan de subunidades catalíticas que se unen a través de un dominio "de anclaje" (dockering domain) a un "andamio" protéico (scaffold) que contiene múltiples dominios con afinidad por celulosa (Murashima y Col. 2002). Por este motivo se ha seleccionado la fusión de DTp53 (Seq Id No. 35) dentro del brazo de separación (Seq Id No. 51), o en sustitución del brazo de separación, si bien no se descarta la utilidad de fusiones carboxiterminales de DTp53 como en el ejemplo 1.

La fusión del dominio de tetramerización DTp53 (Seq Id No. 35) a la endoglucanasa Z (Seq Id No. 48) se realizó en tres etapas. En una primera etapa se amplificó el dominio catalítico de Cel1Z utilizando los oligonucleótidos Cel1Z-D2 (Seq Id No. 20) y CelZL-R (Seq Id No. 22). El producto de PCR, que representa los nucleótidos a 130-1047 del gen flanqueados por dianas BspHI y XbaI, fue clonado en pPLA (Seq Id No. 1) y pPLAg (Seq Id No. 4) de forma similar al fragmento anterior. De esta manera se obtuvieron los clones pPLA-Zcat y pPLA-Zgcat. En una segunda etapa se ligó el dominio DTp53 (Seq Id No. 35) al dominio de unión a celulosa (Seq Id No. 47) mediante PCR combinada. Este método consiste en la amplificación, por separado, de dos fragmentos de ADN que solapan parcialmente. Uno de los fragmentos de PCR (199 pb) representa el dominio DTp53 amplificado con los oligonucleótidos TXXL-D (Seq Id No. 23) y TXXL-R (Seq Id No. 24) (Figura 2) flanqueado por una diana de restricción XbaI en su extremo 5' y por una secuencia de 12 nucleótidos en su extremo 3' complementarios a los nt 1048-1059 del gen Cel1Z (Figura 9). El segundo fragmento de PCR representa los nucleótidos 1048-1285 de Cel1Z que codifican parte del brazo de separación (Seq Id No. 46) y el dominio de unión a celulosa (Seq Id No. 47), amplificados con los oligonucleótidos TCBD (Seq Id No. 25) y Cel1Z-R2 (Seq Id No. 21) (Figura 2). Este fragmento contiene, en su extremo 5', un segmento de 12 nucleótidos que representan los últimos 4 tripletes de DTp53. Los productos de PCR, que solapan en 24 pb, se purificaron de geles de agarosa y se combinaron como molde en una corta reacción de amplificación de 5 ciclos, que genera un producto que representa la fusión de ambos fragmentos por el anillamiento de sus regiones solapantes. Este producto, flanqueado por dianas XbaI, se reamplificó por PCR con VENT polimerasa (New England Biolabs) utilizando los oligonucleótidos TXXL-D (Seq Id No. 23) y Cel1Z-R2 (Seq Id No. 21) que anillan en ambos extremos y se clonó en pGEM-T Easy siguiendo las instrucciones del fabricante (Promega Cat nº A3610). Se analizó la secuencia del clon resultante comprobando la correcta fusión de los fragmentos. A partir de una preparación de ADN de este plásmido se purificó el fragmento XbaI que representa DTp53 fusionado al dominio de unión a celulosa y se ligó a los plásmidos pPLA-Zcat y pPLA-Zgcat similarmente digeridos obteniéndose pPLA-Zt y pPLA-Zgt que contienen genes quiméricos que representan la endoglucanasa Z madura de Dickeya dadantii fusionada al dominio DTp53 en el brazo de separación, cuya secuencia fue analizada (Figura 10).

Los genes quiméricos Zi, Zf, Zg, Zt y Zgt operativamente ligados al promotor (Seq Id No. 2) y secuencia líder (Seq Id No. 3) de psbA se clonaron en el vector de integración pAF (Fernández-San Millán y Col. 2008) de forma análoga al ejemplo 1, obteniéndose los plásmidos pAF-Zi, pAF-Zf, pAF-Zg, pAF-Zt y pAF-Zgt(Seq Id No. 55).

Obtención de plantas de tabaco que integran variantes de Cel1Z en el cloroplasto de tabaco

Se obtuvieron plantas de tabaco que integran Zi, Zf, Zg, Zt y Zgt (Seq Id No. 55) con la metodología que se describe en el ejemplo 1. El análisis de integración y homoplasmia de las plantas se realizó como se describe en dicho ejemplo.

Expresión y acumulación de Cel1Z en tabaco

La expresión y acumulación de las variantes de endoglucanasa Z se analizó mediante mediciones de actividad endoglucanasa a partir de extractos crudos de plantas homoplásmicas que integran las distintas variantes. Los extractos se obtuvieron como se describe en el ejemplo 1, a partir de muestras de 80 mg de tejido fresco y los ensayos de actividad endoglucanasa sobre CMC se realizaron también como se describe en el dicho ejemplo. En éste ejemplo particular, el ensayo de diluciones seriadas de extractos de planta se observó que el rango linear de actividad endoglucanasa Z es mucho más amplio que en el caso de CelY. Esto permitió realizar un análisis comparativo de la actividad endoglucanasa utilizando la misma cantidad de extracto en todos los casos. En este ejemplo particular se ensayaron muestras de plantas homoplásmicas de primera generación en estado de 8-10 hojas. Los resultados obtenidos se resumen en
tabla 4:

TABLA 4

4

A diferencia de CelY, no se observó actividad significativa en plantas que integran el gen Cel1Z nativo (Seq Id No. 48) (Zi). Similarmente a lo observado con CelY, las fusiones aminoterminales de dos fragmentos sintéticos con baja proporción de pares CG favorecieron la expresión de Cel1Z clonado bajo el promotor (Seq Id No. 2) y secuencia líder (Seq Id No. 3) de psbA. Como en el ejemplo 1, la secuencia derivada de la GFP (Zg) estimuló la expresión de la endoglucanasa en mayor cuantía que la secuencia derivada de la ferredoxina (Zf). Se observó además que la fusión del dominio de tetramerización, en el brazo de separación de la endoglucanasa Z (Zt) también favorece la acumulación de la endoglucanasa similarmente al ejemplo 1. Por último, y similarmente al ejemplo anteriormente descrito, se observó que la utilización de las dos estrategias que se describen en la presente patente tiene efectos sinergísticos. Estos resultados sugieren, que, como en el ejemplo anterior, la fusión aminoterminal del péptido sintético que codifica la GFP estimula la expresión (traducción) de la endoglucanasa Z de forma similar al efecto observado sobre CelY, y que el dominio de tetramerización actúa favoreciendo la estabilidad de la endoglucanasa.

Además, los resultados sugieren que ninguna de las modificaciones introducidas afectan la actividad catalítica sobre carboximetilcelulosa.

Expresión de la endoglucanasa Z: estabilidad de la proteína

Con el fin de analizar de forma más detallada los efectos de las modificaciones que se proponen en la presente solicitud en la expresión y/o actividad de la endoglucanasa Z, se llevaron a cabo análisis comparativos entre plantas de segunda generación que integran Zg y Zgt (Seq Id No. 56), analizando, mediante zimogramas, el tamaño de las proteínas presentes en los extractos con actividad endoglucanasa. En este experimento particular se tomaron muestras independientes de 50 mg (5 discos de hoja) de tres plantas por cada tratamiento más una planta normal. Se cuantificó el contenido en proteínas por el método de Bradford como se describe en el ejemplo 1. Se analizó la actividad extraída de cada planta y se obtuvo un promedio de las tres plantas de cada tratamiento.

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En este experimento, la actividad extraída de plantas que integran endoglucanasa Z fusionada a DTp53 fue un 25% superior en términos relativos al peso fresco extraído y un 60% en términos relativos a la proteína extraída. Las mismas muestras, extraídas en presencia de inhibidores de proteasas de plantas, se sometieron a separación electroforética en un gel desnaturalizante de acrilamida al 8%. Para evitar su desnaturalización irreversible, las muestras no se calentaron previamente a la carga en el gel. El gel fue procesado similarmente al zimograma que se detalla en el ejemplo 1 y se visualizaron las proteínas de los extractos con actividad electroforética (Figura 10). En este caso el patrón de endoglucanasas es mucho más complejo que en el caso del ejemplo 1. Se observan, tanto en extractos de Zg como de Zgt (Seq Id No. 56) varias bandas con actividad catalítica, algunas con una movilidad electroforética inferior al peso molecular esperable de la endoglucanasa Z. El resultado indica que se produce proteolisis extensiva de la endoglucanasa Z en el cloroplasto de tabaco y que el patrón resultante es alterado por la fusión de DTp53 en el brazo de separación. Además, en el caso de Zgt, y no en Zg, se detectan bandas discretas de actividad endoglucanasa de alto peso molecular (indicadas con flechas blancas en la Figura 10). Estas pueden corresponder a complejos multiméricos de Zgt estables durante la extracción y electroforesis. Los datos de actividad y los zimogramas indican que la fusión de DTp53 no evita la proteolisis de CelZ en el cloroplasto pero incrementan la estabilidad, probablemente, por la formación de estructuras complejas. Se ha descrito que los brazos que separan dominios de celulasas son susceptibles a la acción de proteasas en ausencia de glicosilación (Langsford y col. 1987). Estos resultados muestran que en el cloroplasto, carente de maquinaria de glicosilación, los brazos de separación de celulasas pueden ser una diana de proteasas por lo que es importante desarrollar estrategias que reduzcan la accesibilidad de estos segmentos separadores a las proteasas.

Actividad de las variantes de endoglucanasa Z sobre sustratos insolubles

El sustrato natural e industrial de las celulasas es de naturaleza insoluble y semicristalina. La construcción de enzimas quiméricas que forman estructuras complejas (dímeros o tetrámeros) puede afectar la actividad sobre esta clase de sustratos. En un ensayo preliminar se analizó la actividad de la endoglucanasa Z sobre celulosa microcristalina (avicel). Por un lado, la formación de estructuras multiméricas puede reducir la actividad específica de la proteína, pero esta hipotética reducción puede ser compensada por una mayor estabilidad del producto en la reacción y por una mayor afinidad por el sustrato ya que los complejos multiméricos tienen también varias copias del dominio de unión a celulosa.

Se analizó la actividad sobre 2%-avicel de dos extractos procedentes de plantas Zgt y Zt. Los extractos se obtuvieron a partir de 2 gramos de material vegetal (hojas expandidas) homogeneizados en fresco en un mortero de cerámica en 10 ml de 100 mM Tris pH6.8, 0,5M NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% 2-mercaptoetanol. Las reacciones se incubaron durante 8h en 10 ml de 2% avicel, 50 mM pH 5.2 y 1 mM MgCl2, en un agitador orbital a 37ºC con agitación a 200 r.p.m. Cada reacción contiene 1 ml de extracto y se realizaron 3 réplicas por cada tratamiento. Se tomaron muestras de 1 ml a 1, 2, 3, 6 y 8 horas del inicio de reacción para comparar la cinética de reacción de las proteínas quiméricas. Se determinaron los azúcares reductores liberados por el método de Nelson Somogyi y se cuantificaron los micromoles liberados por mililitro:

6

Los datos se representan gráficamente en la figura 12.

Se determinó la actividad de los mismos extractos sobre CMC como se describe en el ejemplo 1. La actividad de Zg y Zgt sobre CMC fue de 8,2 y 13,6 IU/gramo de tejido fresco respectivamente. Los datos muestran que en una hora de reacción, la diferencia de actividad de extractos de Zg ó Zgt sobre avicel es mucho menor que sobre CMC lo que indica que la actividad específica de Zgt sobre sustratos sólidos es menor que la de Zg. En concreto, sobre CMC, la diferencia de actividad observada es de un 60-70%, mientras que sobre avicel, en una hora, la diferencia a favor de Zgt se reduce a un 20%. Sin embargo, en el transcurso de la reacción se observa un mayor incremento de azúcares reductores con extractos Zgt de manera que a las 8 horas la diferencia de actividad de los extractos aumenta hasta un 40%. Este resultado indica que si bien la actividad específica de extractos Zgt sobre sustratos sólidos es menor que los de Zg, la forma multimérica es más estable en reacciones largas y mantiene mejor la actividad. Esta mayor estabilidad de las formas multiméricas se asemeja a las diferencias observadas entre preparaciones de celulasas fúngicas de Trichoderma reesei (monoméricas) y preparaciones celulasas de bacterias del rumen de los bóvidos (Chlostridium cellulovorans) que forman complejos multiméricos de celulasas. La actividad de las celulasas de Chlostridium se mantiene mejor en el tiempo que las de Trichoderma (Lynd y col. 2002).

Estos datos demuestran que las nuevas proteínas recombinantes tienen diferentes propiedades y con nuevas posibilidades para su uso industrial.

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<110> PLANT BIOPRODUCTS S.L

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<120> METODO PARA MEJORAR LA EXPRESIÓN DE PROTEINAS EN CLOROPLASTOS

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<130> METODO PARA MEJORAR LA EXPRESIÓN DE PROTEINAS EN CLOROPLASTOS

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<160> 57

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<170> PatentIn versión 3.3

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<210> 1

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<211> 192

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Plásmido intermedio (secuencia parcial) pPLA

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<400> 1

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23

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<210> 2

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<211> 103

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Promotor del gen psbA

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<400> 2

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<210> 3

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<211> 89

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Secuencia líder del gen psbA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

25

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 236

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> plásmido intermedio (secuencia parcial) pPLAg

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 245

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Plásmido intermedio (secuencia parcial) pPLAf

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

28

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido Ppsba-D

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgaattcgt agagaagtcc gtattttt

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido LpsbA-R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcctctagac gccatggtaa aatcttggtt t

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Linker GFP- LGFP-D

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catgagtaaa ggtgaagaac tttttactgg agtagttcct attcgtgcca tggttcagc

\hfill

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Linker GFP- GFP-R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggccgctgaa ccatggcacg aataggaact actccagtaa aaagttcttc acctttact

\hfill

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Linker Ferredoxina LFd-D

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Linker Ferredoxina LFd-R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido Int-D

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgcgttgtt tcatcaagcc ttacg

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido Int-R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaaacccgtc ctcagttcgg attgc

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido celYlD

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcccatggga aagccaatgt ggcgttgtt

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido celYR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctctagatt atttaccgcg cgccaacatc a

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido celY2D

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcccatggcg aacggctggg aaatctataa a

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido celYTR

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcatctagat atttaccgcg cgccaacatc a

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido TetraXX-D

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtctagata aaccactgga tggagaatat tt

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido CelY TetraXX-R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtctagatt agctagcccc tggctccttc ccagcctg

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido Cel1Z-D2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctacgatca tgagcgttga accgttatcc gttaacgg

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido Cel1Z-R2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtctagatc aattagttac agctaccaac ctg

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido CelZL-R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtctagagg tggtatcggt tgacgg

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido TXXL-D

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtctagaaa accactggat ggagaa

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido TXXL-R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtggtgtca gtccctggct ccttcccagc c

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido TCBD

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaggagcca gggactgaca ccaccgttga c

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento que codifica GFP empleada en Ye y col (2001)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccatgggcaa gggcgaggaa ctgttcactg gcgtggtccc aatcctggtg

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de péptido sintético de GFP empleada por Ye y col (2001)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

310

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento que codifica de GFP en el presente trabajo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccatgagtaa aggtgaagaa ctttttactg gagtagttcc tattcgtgcc

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento de péptido sintético de GFP en el presente trabajo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1177

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> producto de PCR del gen CelY clonado en pGEM-T Easy

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 927

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Dominio catalítico de la enzima celY (nucleótidos 70-996)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

34

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia del péptido de secreción del gen CelY (nucleótidos 1-69)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia que codifica para el péptido de Ferredoxina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aatgttcaag ccttatttgg tctaaaatct gaacgaggtg gacgtataac t

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido de ferredoxina aminoácidos 29-48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia que codifica para el dominio de tetramerización p53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido del dominio de tetramerización p53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

38

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1194

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Plásmido intermedio pPLA-Yi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1176

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Plásmido Intermedio pPLA-Yg

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1185

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Plásmido intermedio pPLA-Yf

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1262

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Plásmido Intermedio pPLA-Yt

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1116

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Plásmido Ygt

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

44

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 371

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína Quimérica Ygt

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

46

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1285

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia del gen que codifica la enzima Cel1Z nativa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

48

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 129

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia que codifica el péptido de secreción Cel1Z (aminoácidos 4-129)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 867

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia que codifica el dominio catalítico de Cel1Z (nucleótidos 130-996)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

51

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia que codifica el brazo de separación de Cel1Z (nucleótidos 997-1099)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 184

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia que codifica el dominio de unión a celulosa de Cel1Z (nucleótidos 1100-1282)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 426

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido nativo Cel1Z

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

55

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> péptido de secreción Cel1Z

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 289

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido del dominio catalítico Cel1Z

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

58

59

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> péptido del brazo de separación Cel1Z

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido del dominio de unión a celulosa de Cel1Z

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1294

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Endoglucanasa Z quimérica (Zt) fusionada al dominio de tetramerización y sin péptido de secreción.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

62

63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 468

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Zt secuencia deducida de aminoácidos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

64

65

66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1333

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Plásmido Zgt

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 442

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína Quimérica Zgt

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

68

69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3290

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Plásmido intermedio (secuencia completa) pPLAg

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

70

71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 816

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Gen de resistencia a la Kanabicina

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

72

Claims (48)

1. Construcción nucleotídica caracterizada por comprender

a.

Una secuencia de DNA quimérico que comprende una secuencia de DNA o proteína simultáneamente fusionada a dos fragmentos sintéticos de ADN codificante que consisten en i) una versión modificada de la secuencia que codifica para los primeros 15 aminoácidos de la GFP y ii) la secuencia que codifica para el dominio de tetramerización de la p53.

b.

precedida por un triplete de inicio de la traducción en fase de lectura,

c.

clonada bajo el control de un promotor y secuencia líder funcionales en plastidios,

d.

un triplete de terminación de la traducción y

e.

una región no codificante que contenga señales de terminación de la transcripción reconocidas en el cloroplasto.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Construcción nucleotídica según reivindicación 1 caracterizada porque dicha proteína es una enzima.

3. Construcción nucleotídica según reivindicación 2 caracterizada porque dicha enzima es una celulasa.

4. Construcción nucleotídica según reivindicación 3 caracterizada porque dicha celulasa es una endoglucanasa.

5. Construcción nucleotídica según reivindicación 4 caracterizada porque dichas enzimas son CelY y/o Cel1Z.

6. Construcción nucleotídica según reivindicación 5 caracterizada porque CelY y Cel1Z carecen del dominio que codifica para el péptido de secreción de las mismas.

7. Construcción nucleotídica según reivindicaciones anteriores caracterizada porque los fragmentos sintéticos de ADN codificante de la etapa a) presentan bajo contenido en pares GC.

8. Construcción nucleotídica según reivindicación 7 caracterizada porque dicho contenido en GC es del 40%.

9. Construcción nucleotídica según reivindicaciones anteriores caracterizada porque la secuencia que codifica para la versión modificada de los primeros 15 aminoácidos de la GFP consiste en Seq Id No. 28.

10. Construcción nucleotídica según reivindicaciones anteriores caracterizada porque dicha fusión se lleva a cabo en el extremo N-terminal de la proteína o secuencia de DNA cuya expresión se desea incrementar.

11. Construcción nucleotídica según reivindicaciones anteriores caracterizada porque la secuencia del dominio de tetramerización de la p53 consiste en Seq Id No. 35.

12. Construcción nucleotídica según reivindicaciones anteriores caracterizada porque la fusión del dominio de tetramerización de la p53 se realiza dentro del brazo de separación, en sustitución del brazo de separación o en el extremo C-terminal.

13. Construcción nucleotídica según reivindicación 12 caracterizada porque dicha fusión se realiza en el extremo C-terminal cuando el enzima a expresar no presenta dominios funcionales separados y en el brazo de separación o en sustitución del mismo cuando el enzima a expresar presenta dominios funcionales separados.

14. Construcción nucleotídica según reivindicaciones anteriores caracterizada porque el promotor y secuencia líder son los del gen psbA.

15. Fragmento sintético de ADN codificante de la construcción nucleotídica de la reivindicación 1, caracterizado por consistir en una versión modificada de la secuencia que codifica para los primeros 15 aminoácidos de la GFP.

16. Fragmento sintético de ADN codificante según reivindicación 15 caracterizado por consistir en Seq Id No. 28.

17. Fragmento sintético de ADN codificante, caracterizado por consistir en el dominio de tetramerización de la p53.

18. Fragmento sintético de ADN codificante según reivindicación 17 caracterizado por consistir en Seq Id No. 35.

19. Método para incrementar la expresión de proteínas en plantas, mediante la integración de genes en el genoma del cloroplasto vegetal caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a.

Transformación de una célula y/o planta con la construcción nucleotídica según reivindicaciones 1 a 13.

b.

Hacer crecer dichas células y/o plantas bajo condiciones en las que la secuencia de DNA obtenida en la etapa a) se transcriba.

c.

Si se desea, recuperar la proteína quimérica, codificada por la construcción nucleotídica de a), expresada.

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20. Método según reivindicación 19 caracterizado porque las proteínas quiméricas cuya expresión se ha visto incrementada se mantienen funcionalmente activas.

21. Método según reivindicaciones 19-20 caracterizado porque el incremento de la expresión génica es superior al obtenido a través de la suma de los incrementos obtenidos al fusionar los fragmentos sintéticos de ADN codificante según reivindicaciones 15-16 o 17-18.

22. Método según reivindicaciones 20-21 caracterizado porque el incremento de la expresión génica es al menos dos órdenes de magnitud mayor que al expresar el producto génico solo, 2 veces mayor que al expresar el producto génico fusionado a GFP y 10 veces mayor que al expresar el producto génico fusionado a p53.

23. Célula caracterizada por comprender la construcción nucleotídida según cualquiera de las reivindicaciones
1-14.

24. Célula según reivindicación 23 caracterizada por ser una célula de planta.

25. Célula según reivindicación 24 caracterizada porque la proteína quimérica expresada a partir de la secuencia de DNA quimérico de la construcción nucleotídica según reivindicaciones 1-13, corresponde a un porcentaje entre el 25-30% del total de proteína soluble extraíble (TSP).

26. Planta transgénica caracterizada por comprender la construcción nucleotídica según reivindicaciones 1-14.

27. Planta transgénica según reivindicación 26 caracterizada por presentar como producto mayoritario extraíble la proteína de interés codificada por la secuencia de DNA quimérico de la construcción nucleotídica según reivindicaciones 1-14.

28. Planta transgénica según reivindicación 27 caracterizada porque la proteína quimérica expresada a partir de la secuencia de DNA quimérico constituye entre el 25-30% del total de proteína soluble extraíble (TSP).

29. Planta transgénica según reivindicaciones 26-28 caracterizada porque la acumulación de la proteína de interés codificada por la secuencia de DNA quimérico como producto mayoritario extraíble se produce en todas las hojas de la planta independientemente de su estado de maduración.

30. Planta transgénica según reivindicación 29 caracterizada porque dicha acumulación es entre un 5% y un 10% mayor en las hojas maduras que en las hojas jóvenes, en términos relativos a la proteína extraíble total.

31. Semilla de planta caracterizada por ser producida por las plantas según reivindicaciones 26-30.

32. Proteína quimérica obtenida por el método según reivindicaciones 19-22.

33. Proteína quimérica según reivindicación 32 caracterizada por ser un enzima.

34. Proteína quimérica según reivindicación 33 caracterizada por ser CelY quimérica Seq Id No. 42.

35. Proteína quimérica según reivindicación 33 caracterizada por ser Cel1Z quimérica Seq Id No. 56.

36. Uso de las plantas según reivindicaciones anteriores como biofactorías.

37. Uso de las plantas según reivindicaciones anteriores para la producción masiva de enzimas de interés industrial.

38. Uso de las plantas según reivindicaciones anteriores en la industria del biodiesel.

39. Uso del fragmento sintético según reivindicación 15 para la obtención de productos quiméricos de fusión en el cloroplasto cuya expresión es más estable respecto a variantes que carecen de este fragmento.

40. Uso del fragmento sintético según reivindicaciones 17 y 18 para incrementar la expresión génica y acumulación del producto en el cloroplasto.

41. Uso del método según reivindicaciones 19-22 para la producción de proteínas quiméricas en plantas genéticamente modificadas (PGMs).

42. Uso del método según reivindicación 41 caracterizado porque la proteína quimérica es CelY quimérica (Seq Id No. 42).

43. Uso del método según reivindicación 41 caracterizado porque la proteína quimérica es CelZ quimérica (Seq Id No. 56).

44. Uso del método según reivindicaciones 41-43 caracterizado porque dichas proteínas quiméricas presentan propiedades mejoradas de estabilidad del producto durante la reacción y actividad sobre sustrato insoluble respecto a la enzima nativa.

45. Uso del método según reivindicaciones 19-22 para la producción de enzimas quiméricas que no requieren ser purificadas.

46. Uso del método según reivindicaciones 41-45 en las industrias de combustibles, alimentación, producción animal, textil y papelera.

47. Uso del método según reivindicaciones 41-45 para la generación de bioetanol de segunda generación.

48. Uso de las proteínas quiméricas según reivindicaciones 34 y/o 35 para la conversión de celulosa en etanol.